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Orchidstudium 4: 24-54 www.orchidstudium.com 16 de Agosto de 2006

CITOGENÉTICA VEGETAL ENFATIZANDO A FAMÍLIA ORCHIDACEAE

MATEUS MONDIN1 E AMERICO DOCHA NETO2

1Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo

2Bacharel em Ciências Biológicas; Ex Biologista do HCFMUSP.

Abstract Introduction on vegetal cytogenetics, emphasizing the Orchidaceae family, including chromosomic counting, cariotype and genoma; the improvement of vegetal species by means of cytogenetics counting and alterations; e review of the techniques and materials used in this process.

Resumo Introdução sobre citogenética vegetal, com ênfaze na família Orchidaceae, abordando contagem cromossômica, cariótipo e genoma; discussão a respeito do melhoramento de espécies vegetais por meio da análise e alterações citogenéticas; e apresentação das técnicas e materiais empregados neste processo.

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MONDIN E DOCHA NETO – CITOGENÉTICA VEGETAL

Índice Pág.

1. Introdução ............................................................................................................. 26

2. Número de cromossomos e genoma .................................................................... 273. Cariótipos e a evolução dos genomas .................................................................. 294. Melhoramento de plantas através de citogenética ............................................... 30

Colchicina ................................................................................................. 30Alternativa no uso da colchicina .............................................................. 31

Derivados sintéticos da colchicina .............................................. 31Outras substâncias alternativas .................................................... 31Indução de poliploidias utilizando herbicidas ............................. 31

Empregos e efeitos .................................................................................... 315. Citogenética: Técnicas ......................................................................................... 32

Reagentes químicos mais utilizados ......................................................... 32Reagentes Inorgânicos ................................................................ 32Reagentes Orgânicos ................................................................... 32Corantes ....................................................................................... 33Enzimas ....................................................................................... 33Montagem de lâminas ................................................................. 33

Equipamentos de laboratório .................................................................... 33Vidraria ........................................................................................ 33Outros utensílios .......................................................................... 33Equipamentos ............................................................................... 33

Coleta de meristemas e pré-tratamentos com inibidores do fuso mitótico .. 34Coleta de polínias imaturas ....................................................................... 35Obtenção de meristemas somáticos .......................................................... 35Pré-tratamentos ......................................................................................... 36Fixação dos tecidos ................................................................................... 38Preparação de lâminas .............................................................................. 39Sinonímia dos corantes citados ................................................................. 44

6. A Visualização dos cromossomos ........................................................................ 44A contagem dos cromossomos ................................................................. 45A manipulação da imagem digital ............................................................ 46A imagem impressa .................................................................................. 46

Contando os cromossomos diretamente na imagem impressa .... 46Fazendo o pareamento cromossômico ......................................... 47

Técnicas auxiliares para a identificação cromossômica ........................... 48Autorradiografia .......................................................................... 49Técnicas de bandeamento .......................................................... 49

Bandeamento Q .............................................................. 49Bandeamento G .............................................................. 49

7. Métodos rápidos para análise .............................................................................. 50Microdensitometria de Feulgen ............................................................... 50Citometria de fluxo ................................................................................... 50

8. Citogenética molecular ........................................................................................ 509. Referências .......................................................................................................... 51

10. Autores ................................................................................................................ 54

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1. Introdução

A citogenética é a disciplina da genética que congrega os eventos citológicos, principalmente aqueles relacionados ao comportamento cromossômico, e a genética. Dois eventos básicos são os alvos de estudo da citogenética: a mitose e a meiose.

A mitose é a divisão celular pela qual um organismo se desenvolve, ou seja, ela é capaz de formar duas células de conteúdo nuclear idêntico. Estas células também são chamadas de somáticas. Em termos evolutivos a mitose é o ancestral da meiose.

A meiose é a divisão celular que origina os gametas masculino e feminino, ou seja, as massas polínicas e os óvulos, respectivamente, no caso das orquidáceas.

As orquidáceas produzem uma quantidade considerável de gametas femininos no ovário e igualmente uma quantidade considerável de gametas masculinos na antera. Os milhares de gametas masculinos permanecem agrupados em massas polínicas denominadas polínias que geralmente variam em número de dois a dez, dependendo da espécie. Assim, a fusão de milhares de gametas de sexos opostos no carpelo, por meio da polinização, origina milhares de zigotos. Cada zigoto é considerado como sendo a primeira célula somática, que por divisões mitóticas, originará o embrião maduro no interior da cápsula. Cada embrião maduro pode ser considerado como uma diminuta semente individual, indiferenciada, que com a deiscência da cápsula, ao ser pulverizada na atmosfera, será arrastada a longas distâncias pelas correntes de ar e ao cair aleatoriamente em localidades ecologicamente adequadas, por multiplicação mitótica e diferenciação celular, irá crescer e originar o indivíduo adulto fechando o ciclo reprodutivo.

No núcleo das células somáticas de cada indivíduo existem várias moléculas de DNA, individualizadas na forma de fita. O DNA do núcleo das células somente permanece ativo quando está desespiralizado na interfase, de modo que os cromossomos não são visíveis nesta fase. Ao invés disso o núcleo interfásico se apresenta na forma de cromatina, geralmente homogênea, algumas vezes discretamente picnótico distribuído em blocos aleatórios. Nesta situação, o DNA está ativo (pouco espiralizado) sendo que as regiões correspondentes aos genes no momento da transcrição sofrem o máximo de desespiralização voltando ao estado anterior logo após a transcrição. Na medida em que a célula começa o seu ciclo mitótico, o DNA vai se compactando, espiralizando-se, dando origem aos cromossomos. A fase da mitose em que as células apresentam o máximo grau de espiralização é a metáfase. A espiralização ou condensação cromossômica é um dos fatores que permite a duplicação cromossômica. Cada planta possui um determinado número de cromossomos e uma determinada configuração morfológica e a distribuição dos genes alelos em cada um dos braços dos homólogos, bem como o seu patrimônio genético é que caracteriza a sua espécie. Este número de cromossomos pode ser agrupado e organizado pelo seu tamanho, pela sua forma e pelas suas estruturas, obtendo-se assim o cariótipo da espécie.

O cariótipo e a contagem do número de cromossomos têm muitas aplicações, principalmente para se traçar a evolução das espécies, bem como poder fazer o melhoramento genético destas espécies.

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2. Número de cromossomos e Genoma

O número de cromossomos, embora, pareça um parâmetro óbvio, possui inúmeras peculiaridades. Uma análise simplória de uma célula somática nos levaria a propor que esta célula possui 2n cromossomos. A letra n é utilizada para designar quantas cópias de um mesmo cromossomo existe na célula, também representa o número de cromossomos no gameta. Desta forma, todo o organismo deveria a princípio ser 2n, ou seja, n cromossomos vindo do gameta masculino e n cromossomos vindo do gameta feminino. Desta forma o número de cromossomos de uma espécie é mantido de geração para geração.

Entretanto, e, principalmente em plantas ocorrem eventos que provocam falhas na segregação dos cromossomos e alteram o seu número nas células. As alterações que ocorrem em células somáticas não apresentam maiores conseqüências, mas pode ser utilizado para o melhoramento das espécies, como veremos mais adiante. As alterações mais importantes são aquelas que ocorrem durante a meiose, pois estas são transmitidas para as gerações seguintes.

Existem dois tipos básicos de alterações cromossômicas: as aneuploidias, quando se altera apenas um, dois ou mais pares de cromossomos de uma espécie (um exemplo clássico seria a síndrome de Down, em humanos, onde há uma cópia a mais somente do cromossomo 21 do grupo G, também denominado de trissomia do cromossomo 21, que ocorre com uma freqüência de 1:300 a 1:600 de nascimentos). Neste caso, ao invés de dois cromossomos, como esperado, existem três, acarretando o aumento no número cromossômico somático em uma unidade (2n=47) e que normalmente teria que totalizar 23 pares (2n=46) e as poliploidias, quando há uma multiplicação de todos os cromossomos de uma determinada célula, incompatível com a vida humana, sendo raramente encontrados em fetos natimortos em abortos precoces.

Entretanto, contrastando com os animais, a poliploidia é o fenômeno mais importante na evolução e na especiação dos vegetais. Acredita-se que pelo menos 75% das espécies já estudadas e descritas citogeneticamente tenham sofrido, pelo menos uma vez na sua história evolutiva, um evento de duplicação de todos os cromossomos. Há ainda especulações de que este número possa ser de até 95%. E isto não é diferente em orquídeas, onde certamente mais de 90% das espécies sejam poliplóides.

As plantas provavelmente surgiram de espécies com 2n=4 cromossomos, embora haja controvérsias sobre este número, sendo que existem pesquisadores que acreditam que este número seja 5 e outros que possa ser até 8, mas certamente não seria um número superior a 10. Desta forma, todas as demais espécies de plantas teriam que ter se originado pela duplicação destes cromossomos das espécies ancestrais. Devido à complexidade de como se chega a estas conclusões, resumiremos esta consideração a este ponto.

Outro fator importante na evolução das plantas é a possibilidade que há do cruzamento entre espécies aparentadas, ou seja, os cruzamentos interespecíficos. Este fenômeno também altera o número de cromossomos e traz grandes conseqüências para a evolução e a caracterização das espécies.

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Podem ocorrer dois eventos básicos de poliploidia: a autopoliploidia e a alopoliploidia. A autopoliploidia consiste na duplicação do número de cromossomos pela própria espécie, de modo que uma espécie que deveria ter duas cópias do mesmo cromossomo, uma vindo do pai e outro da mãe, passa a ter 4, 5, 6, 7 ou mais cópias do mesmo cromossomo. Por isso os autopoliplóides passam a ser designados como 3n (triplóides), 4n (tetraplóides), 5n (pentaplóides) e assim consecutivamente, pois significa que eles têm mais do que duas cópias de cada cromossomo. Este fenômeno traz grandes conseqüências para a meiose, pois todos os cromossomos que são homólogos tentarão parear-se e assim não formarão pares (bivalentes), mas sim trios (trivalentes), quadras (tetravalentes), entre outros, de tal forma que a célula não consegue distribuir número idêntico de cromossomos nas células filhas, no caso gaméticas, sendo que na maioria dos casos de autopoliploidia os gametas são inférteis. Entretanto, há casos de autopoliplóides com bom grau de fertilidade. As autopoliploidias são mais raras, ou mais difíceis de serem detectadas na natureza.

Os alopoliplóides são resultados do cruzamento de duas espécies distintas, onde posteriormente o número de cromossomos é duplicado. É o mais comum na natureza devido a sua alta fertilidade, por não apresentarem na maioria das vezes problemas meióticos. Isto ocorre, pois os cromossomos das espécies são diferentes, desta forma cada cromossomo, dos diferentes parentais, poderia ser considerado uma entidade única; no momento que há a duplicação dos cromossomos, aumentando o grau de ploidia do indivíduo, cada cromossomo passa a ter mais uma cópia, tornando-se pares e ficando parecido com um diplóide. Por esta razão os alopoliplóides também são conhecidos como anfidiplóides.

Por causa dos alopoliplóides, voltamos a falar do número de cromossomos que deu origem a todas as espécies de plantas. Neste ponto temos que inserir o conceito de numero básico de cromossomos. O número básico de cromossomos, designado pela letra x, representa o número de genomas que compõem uma espécie. Não é algo muito simples detectar o número básico de cromossomos de uma espécie, pois requer extensas análises do número cromossômico dos gêneros e às vezes até se dispõem de técnicas de genética molecular para solucionar estes casos. Mas é de fundamental importância o seu entendimento, pois é o primeiro passo para se saber como a espécie surgiu, como seus genomas estão organizados e como eles evoluíram, de onde vieram e como podemos manipulá-los.

O exemplo mais clássico de um alopoliplóide bem estudado e caracterizado é o trigo cultivado (Triticum aestivum L.). Ele é o resultado do cruzamento de outras três espécies diplóides, cada uma com 2n=14. Assim o trigo é 2n=6x=42, 2n, pois ele é um alopoliplóide que tem um comportamento meiótico parecido com o de um diplóide (anfidiplóide); o x significa que o número básico de cromossomo das espécies que no caso é x=7. A tribo Triticeae que envolve todas as espécies aparentadas do trigo e gêneros afins foi extensivamente estudada do ponto de vista citogenético por inúmeras técnicas e por isso o seu número básico de cromossomos está bem definido.

Não há infelizmente nenhum caso tão bem estudado em orquídeas, por inúmeras razões. Uma delas seria o ciclo reprodutivo muito longo da planta, outra a quantidade de espécies e o fato da botânica de orquídeas ser muito complexa. Outras razões seriam o número elevado e tamanho reduzido dos cromossomos, a dificuldade de se conseguir preparações cromossômicas de alta qualidade, entre outras.

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Entretanto, as contagens do número de cromossomos em uma grande quantidade de espécies podem servir como indicativo do provável número básico de cromossomos. Veja o caso do gênero Oncidium Sw., onde a grande maioria das espécies possui 2n=56 cromossomos, ou múltiplos deste número; estes números sugerem que provavelmente o número básico de cromossomos seja x=8, partindo do principio, como já dito anteriormente, que as plantas tiveram origem em espécies com números cromossômicos baixos (até 10 no máximo).

Desta forma podemos concluir que a maioria das espécies de orquídeas são poliplóides, embora não seja possível, atualmente, determinar sua origem ou qual o tipo de poliploidia envolvido. Isto traz sérias conseqüências e confusões quando se trata de elaborar cariótipos e traçar a filogenia destas espécies, como veremos a seguir.

3. Cariótipos e a evolução dos genomas

As espécies diplóides, por apresentarem os cromossomos aos pares, permitem que eles sejam organizados de acordo com seu tamanho e sua forma. A esta organização dos cromossomos dá-se o nome de cariótipo.

No cariótipo os cromossomos são ordenados, cada qual com seu par, sempre do maior para o menor, com os braços curtos voltados para cima. A organização do cariótipo depende de uma análise morfométrica muito detalhada de células em metáfase mitótica. Estas metáfases devem ter o mesmo grau de contração dos cromossomos para se evitar grandes distorções nas medidas. Embora se possam organizar cariótipos a partir de células meióticas, principalmente em fase de paquíteno, este procedimento é pouco usual, principalmente por limitações como o elevado número de cromossomos e o difícil espalhamento dos cromossomos.

A organização do cariótipo não é tarefa simples, pois em um genoma podem existir cromossomos de tamanho e forma parecidos o que confunde muito sua identificação. Esta tarefa se torna ainda mais difícil quando os organismos atingem altos graus de poliploidia. Outra suposição errônea, mas que é muito comum, é a de que espécies poliplóides terão cromossomos idênticos, repetidos mais de uma vez. Embora, isto possa ocorrer em alguns casos, não seria o mais comum, principalmente em espécies que sofreram processos de poliploidização a milhares ou milhões de anos.

A poliploidia, como vimos anteriormente, traz sérias complicações para o curso normal da meiose, reduzindo a fertilidade dos indivíduos. Para aumentar a fertilidade na natureza ocorre a diploidização do poliplóide que é um fenômeno que possibilita que o indivíduo fique com características de um diplóide. Este mecanismo atua nas duas formas de poliplóides, pois mesmo nos alopoliplóides, alguns ajustes no genoma devem ser feitos para que se tenha um "diplóide perfeito".

Neste caso, os cromossomos tendem a se modificar através de alterações cromossômicas e por perda de DNA. Não entraremos em detalhes destes mecanismos pela complexidade e extensão do assunto. A conseqüência deste mecanismo em

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espécies poliplóides é que os cromossomos passam a ter de serem novamente organizados em pares, de forma que a meiose possa ter um curso normal e os indivíduos aumentem sua fertilidade. Na organização do cariótipo, a principal conseqüência é que a espécie embora sendo poliplóide pode ter seus cromossomos organizados aos pares como em um diplóide.

Muito destas conclusões já eram supostas há muito tempo, mas somente com o advento de técnicas de genética molecular e citogenética molecular é que elas puderam ser comprovadas. Mesmo assim, a organização e o estudo de cariótipos de plantas têm se limitado a algumas espécies com menor número de cromossomos e de tamanho razoável para se realizar medidas.

4. Melhoramento de plantas através de citogenética

A descoberta de substâncias que provocam a inibição da divisão celular, mas permitindo a duplicação cromossômica, com o advento da cultura de tecidos, permitiu a indução in vitro de poliploidia nas plantas.

Com a descoberta da colchicina em meados dos anos 40, iniciaram-se as experiências para a indução de poliploidias. Esta técnica passou a ser largamente empregada como uma importante ferramenta para o melhoramento pois promove o gigantismo (efeito Giga) e a intensificação das cores dos órgãos sexuais nas plantas de interesse comercial. Outra utilização é a obtenção artificial de anfidiplóides promovendo a reversão da fertilidade em plantas estéreis.

Colchicina

Alcalóide muito tóxico, que deve ser manipulado com extremo cuidado por profissional treinado para tal, e que originalmente era extraído de um tipo de planta da mesma família do assafrão (Colchicum sativum), hoje sendo um produto sintético, com o nome químico tetrametoxi-1,2,3,10 oxo-9 tetrahidro-5,6,7,9 benzo (a) heptalenil-7)-2 acetamida, que adicionado em concentrações ideais aos meios de cultura contendo células embrionárias em divisão, promove a despolimerização dos microtúbulos de proteína responsáveis pela formação do fuso durante a divisão celular, além de ocasionar uma excessiva espiralização dos cromossomos, acarretando desta forma a endorreduplicação, levando a poliploidias.

Em concentrações menores, promove a despolimerização do fuso mitótico com ausência de endorreduplicação levando ao acúmulo de cromossomos metafásicos, onde as cromátides estão condensadas com os braços separados em conseqüência de seu natural movimento de repulsão que não é acompanhado pela divisão do centrômero, técnica essa, entre outras, que pode ser utilizada para a preparação do cariótipo.

A colchicina, em doses extremamente baixas, é utilizada em humanos para o tratamento clínico da hiperuricemia sérica. A colchicina e os seus derivados são produtos extremamente caros.

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Alternativa ao uso da colchicina

Devido ao alto custo e a alta toxicidade da colchicina vários produtos alternativos foram testados e propostos.

Derivados sintéticos da colchicina

Atualmente a colchicina para a utilização em citogenética vem sendo substituída por um derivado considerado trinta vezes menos tóxico denominado N-desacetil-N-metilcolchicina (Colcemid, Ciba-Geigy ®). O mesmo produto está registrado também sob a denominação Colchemid ®.

Outras substâncias alternativas

Outra solução, muito difundida, e que tem tomado o lugar da colchicina é a 8-hidroxiquinolina. Além destas podemos citar o α-bromonaftaleno, o paradiclorobenzeno e o óxido nitroso. A ciclo-heximida, um potente inibidor da síntese protéica, tem sido utilizado muito freqüentemente em combinação com a 8-hidroxiquinolina por apresentar a capacidade de contrair as extremidades cromossômicas de prometáfases, tornando-as como metáfases e possibilitando o seu uso nas análises.

Todas as substâncias descritas acima apresentam alto poder carcinogênico e por isso devem ser manipuladas por pessoal treinado em locais adaptados e com o máximo de segurança. Pode-se alternativamente utilizar tratamentos frios com água gelada, entretanto, nem todas as plantas apresentam resposta a este tratamento.

Indução de poliploidias utilizando herbicidas

Existem alguns compostos herbicidas que atualmente estão sendo empregados para a indução de poliploidias por serem produtos muito menos tóxicos e muito mais baratos do que a colchicina e os seus derivados. Dentre essas substâncias citamos a trifluralina ou a,a,a trifluro-2,6-dinitro-N,N-dipropil-p-toluidina comercializada com o nome de Treflan ® e a orizalina comercializada no Brasil com o nome de Surflan 750 BR ®.

Empregos e efeitos

Embora existam críticas com relação a este assunto, muito do melhoramento vegetal se deve à utilização de técnicas de citogenética. Para exemplificar este sistema citaremos dois mecanismos envolvendo a obtenção de poliplóides.

A poliploidia possui algumas características de interesse agrícola e hortícola, uma delas seria o efeito "Giga". Normalmente quando se tem o número de cromossomos duplicados, há por conseqüência um aumento do volume nuclear para acomodar todo o material genético e em muitos casos o aumento do tamanho da célula. Como principal efeito do aumento do tamanho do volume celular, observamos o aumento do tamanho dos órgãos. Embora em muitos casos o efeito Giga não seja observado, pois existem limitações para a sua expressão, este fenômeno tem sido amplamente explorado pelos floricultores para se obter flores maiores.

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A técnica mais comum para se obter um poliplóide é se tratar meristemas, ou seja regiões da planta onde estão ocorrendo divisões celulares, com substâncias que inibam a formação das fibras do fuso e, por conseqüência da sua excessiva espiralização, ocorra a duplicação do número. Este procedimento está detalhado em outra seção. Este método é utilizado principalmente em células somáticas, pela facilidade posterior de seleção, mas nada impede de que seja utilizada em células gaméticas, mas haverá limitações durante a seleção dos indivíduos.

Outro método é quando queremos cruzar duas espécies diferentes, híbrido interespecífico, para obter uma terceira planta que agregue características dos seus parentais. Isto tem sido muito aplicado em orquídeas e uma relação de híbridos pode ser facilmente encontrado em literaturas especializadas. Este método consiste em se fazer o cruzamento de espécies, que podem diferir em número e na forma de seus cromossomos. Como vimos anteriormente, se não ocorrer a duplicação dos cromossomos, estes serão entidades únicas e por conseqüência não terão meiose normal. Para solucionar este problema e obtermos plantas com razoável fertilidade, duplica-se o número de cromossomos com substâncias que inibam as fibras do fuso, tal qual como é feito para se obter autopoliplóides. Muitas vezes durante o próprio desenvolvimento do zigoto interespecífico há uma duplicação espontânea dos cromossomos, mas estes eventos, embora, não raros são difíceis de serem detectados, mas quando o são, facilitam muito a seleção de indivíduos e se reduz o custo.

5. Citogenética: Técnicas

Reagentes químicos mais utilizados

Todos os ácidos, sais e compostos orgânicos para o preparo das soluções deverão ter grau de pureza para análise.

1. Reagentes Inorgânicos

• Ácido clorídrico 37% HCl - MW 36.461 - D 20º ~ 1.186 • Metabissulfito de sódio Na2S2O5 - MW 190.10

2. Reagentes Orgânicos

• 8-hidroxiquinoleína: 8-hidroxi-1-azanaftaleno C9H7NO PM = 145,16 • Monobromonaftaleno: alfa-bromonaftaleno C10H7Br PM = 207,08 • Colchicina: tetrametoxi-1,2,3,10 oxo-9 tetrahidro-5,6,7,9 benzo (a) heptalenil-7)-2

acetamida C22H25NO6 PM = 399,45 • Colcemid: N-deacetil-N-metil-colchicina C21H25NO5 PM = 371,4 • Paradiclorobenzeno: C6H4Cl2 PM = 147,00 • Actidiona = Cicloheximida: 3-2-(3,5-dimetil-2-oxociclohexil)-2 hidroxietilglutarimida

C15H23NO4 PM = 281.35 • Ácido acético glacial CH3.COOH - MW 60.053 - D 20ºC ~ 1.050

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• Ácido propiônico CH3.CH3.COOH - MW 74.08 - D 20º ~ 1.38 • Etanol absoluto CH3.CH2.OH - MW 46.070 - D 20º ~ 0.8116 • Clorofórmio CH3.Cl3 - MW 119.39 - D 20º ~ 1.48 • Formaldeído 40% = formalina H.CHO - MW 30.026 - D 15º ~ 1.089 • Ácido cítrico C6H6O7.H2O MW 210.14 • Citrato de sódio dihidratado NaOOC.CH3.C(OH)(COONa).CH3.COONa.2H2O MW 294.10 • Carvão ativado purificado

3. Corantes

• Fucsina Leucobásica • Carmim

4. Enzimas

• Pectinase Calbiochem ® (4,9 U/mg) • Celulase Sigma ® C1184 (0,49 U/mg)

5. Montagem de lâminas

• Bálsamo do Canadá ou Entelam ®

Equipamentos de laboratório

1. Vidraria

• Provetas graduadas com capacidades de 50, 100, 250, 500 ml • Balões volumétricos com capacidades de 100, 500 e 1000 ml • Balões de fundo chato com capacidades de 500 e 1000 ml • Placas de Petri diâmetro 10 cm • Frascos tipo penicilina com capacidade 12 ml • Bastões de vidro • Lâminas de microscopia padrão • Lamínulas 20x20mm

2. Outros utensílios

• Geladeira • Freezer • Computador com software de tratamento de imagens • Impressora preferencialmente a laser

3. Equipamentos

• Banho Maria termostatizado • Estufa bacteriológica termostatizada

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• Destilador de água ou linha de purificação de água • Agitador magnético • Balança analítica • pH metro • Microscópio óptico comum com tubo trinocular • Máquina fotográfica digital com adaptador para trinocular

Coleta de meristemas e pré-tratamentos com inibidores do fuso mitótico

A observação de fases da mitose ou da meiose depende de tecidos que tenham uma elevada taxa de divisão celular. Estes tecidos normalmente são denominados meristemáticos e ainda não sofreram diferenciação.

Existem dois objetivos diferentes na observação dos tecidos meristemáticos. O primeiro é se observar o ciclo celular como um todo, analisando-se todas as suas fases, sendo isto válido tanto na mitose, quanto na meiose. O segundo é observar uma fase específica, principalmente aquelas que permitam uma perfeita visualização de todos os cromossomos.

Para a observação de fases específicas do ciclo celular é necessário coletar adequadamente o meristema que se pretende estudar. Por exemplo, se o objetivo é observar o pareamento cromossômico na meiose, ou verificar a presença de univalentes, são necessárias observações nas fases de paquíteno e diacinese da prófase meiótica respectivamente, sendo necessário a coleta de botões florais imaturos com a polínia ainda em fase de desenvolvimento. Além disso, é necessário o conhecimento da fenologia da inflorescência para saber a direção e a sincronia do amadurecimento floral para se estabelecer a coleta.

Se há um amadurecimento da extremidade para a base da inflorescência, certamente as flores da ponta estarão em estágios finais da meiose, enquanto as da base estarão nas fases iniciais. O mesmo é válido se o florescimento for no sentido contrário.

Se o objetivo, entretanto, for a observação de metáfases mitóticas, primeiro, devemos saber em que pontos das plantas há crescimento somático. Nos tecidos com crescimento somático os meristemas ocorrem principalmente nas pontas de raízes, gemas, em botões florais imaturos, na ponta da haste floral, no meristema apical e nos ovários imaturos para a produção das células mãe do megásporo.

Para a observação das metáfases, ainda é necessário interromper o ciclo celular antes que as fibras do fuso separem as cromátides irmãs de tal forma que além de permanecerem em metáfase, os cromossomos possam se espalhar quando for realizada a preparação da lâmina sendo possível a observação e a contagem dos mesmos. Para ambos os casos existem protocolos que maximizam a obtenção de células ótimas para a observação dos cromossomos, independentemente do objetivo final. A seguir descreveremos alguns métodos de coletas:

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Coleta de polínias imaturas

Procurar uma planta em fase de florescimento. Observar se há botões florais imaturos, de preferência em hastes onde não haja flores abertas e que também possuam botões ainda em fases iniciais de desenvolvimento. Este procedimento garante a ocorrência da meiose. É ainda importante se conhecer o desenvolvimento da inflorescência o que maximiza a obtenção da fase da meiose desejada. Nos casos em que não se conhece a fenologia da inflorescência, deve-se fazer coleta individual dos botões florais, anotando-se para cada um o ponto da inflorescência de onde foram tirados e quantos dias aquela haste tinha. Este procedimento, embora dispendioso, garante um conhecimento fenológico não só da inflorescência mas também da meiose e em futuras coletas se terá uma melhor noção do ponto de coleta dos botões para a observação da fase da meiose desejada.

Protocolo:

1. Preparar previamente tubos contendo a solução fixadora de Carnoy, mantendo os tubos fechados até o momento da coleta.

2. Escolher o botão floral imaturo desejado. Se o botão floral for pequeno, com uma agulha faça uma série de perfurações sem que a polínia seja atingida, mas que garanta uma entrada mais rápida do fixador. Se for um botão floral grande, corte com um estilete no sentido transversal, também tomando o cuidado para que a polínia não seja cortada. Pode-se ainda em alguns casos e da destreza de quem está coletando retirar a polínia e colocá-la direto na solução fixadora.

3. Após a coleta dos botões florais, manter os tubos fechados, agitando-os em intervalos de 10 minutos, durante uma ou duas horas.

4. A seguir trocar o fixador. Manter os tubos fechados à temperatura ambiente por pelo menos 18 horas.

5. Após este período trocar novamente o fixador para uma solução nova e então conservar o material a -4ºC.

6. É recomendável iniciar as preparações citológicas dois ou três dias após colocar o material à baixa temperatura. Este procedimento garante uma conservação do material durante anos. Não há necessidade de ser rigoroso com a temperatura de conservação, desde que a temperatura seja abaixo de zero e não abaixo de -20ºC.

Obtenção de meristemas somáticos

Os meristemas somáticos, como descrito anteriormente, são aqueles que apresentam divisões mitóticas e que estão relacionados com o crescimento ou o desenvolvimento de algum órgão.

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Os tipos de meristemas foram descritos anteriormente. O mais importante é que a região escolhida esteja em pleno desenvolvimento. Tecidos diferenciados apresentam baixo ou nenhum índice mitótico (células em divisão).

O meristema mais comum utilizado em citogenética vegetal é a ponta de raiz por ser abundante, na maioria dos casos. A grande dificuldade com alguns gêneros de orquídeas é o fato de apresentarem o desenvolvimento de raízes apenas uma vez ao ano. Outra dificuldade é a coleta de raízes no início do desenvolvimento, com no máximo 1 cm. As raízes aéreas, denominando-se aquelas que crescem fora do substrato, são de difícil manipulação, pois normalmente são mais rígidas e apresentam grande resistência à penetração de substâncias. Entretanto, este tipo de raiz é muito abundante.

A coleta de raízes que estão no substrato seria o mais recomendável, mas implica em se retirar às plantas freqüentemente dos vasos para verificar se estão crescendo, o que pode gerar grande estresse na planta.

Outro modo de se obter meristemas adequados para preparações citológicas é a germinação de sementes in vitro. Neste tipo de cultivo, podemos coletar material meristemático em diversas fases do desenvolvimento. Quando as plântulas recém germinadas emitem a raiz e os folíolos primários, podemos utilizar ambos para os pré-tratamentos. Porém se as plântulas já apresentam folhas razoavelmente desenvolvidas, em torno de 5mm, é mais recomendável apenas a coleta das raízes. Uma desvantagem destes meristemas é que a presença de solidificantes no meio de cultura, como o agar, altera a viscosidade celular o que dificulta as preparações citológicas.

Botões florais e extremidades de inflorescência também apresentam meristemas que podem ser aproveitados para preparações citológicas. Entretanto, em ambos os casos implica-se na destruição de tal estrutura. Estas regiões ainda apresentam a desvantagem de terem tecidos diferenciados muito próximos das regiões meristemáticas. No caso dos botões florais a presença de drusas em alguns tecidos impedem a preparação de materiais citológicos com boa qualidade para observação dos cromossomos.

Outro meristema muito comum e utilizado em trabalhos de citogenética de orquídeas é o ovário imaturo. Como descrito anteriormente, este método destrói a flor, mas resulta em preparações citológicas de boa qualidade. A grande dificuldade na coleta deste meristema é isolar e pré-tratar o ovário. Neste caso é necessário um bom conhecimento sobre a anatomia e a morfologia desta região das flores.

Pré-tratamentos

Uma vez escolhido o meristema inicia-se a fase mais complexa na obtenção de preparações cromossômicas, principalmente quando o objetivo é conseguir metáfases mitóticas de alta qualidade, ou seja, com todos os cromossomos espalhados e com a sua morfologia nítida.

O pré-tratamento tem como objetivo principal a inibição do fuso mitótico, para que a célula fique estacionada na fase de metáfase e que os cromossomos possam estar espalhados pela célula. Existem inúmeras maneiras de se inibir o fuso mitótico. A

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maneira mais comum se dá através de tratamentos químicos com agentes que impedem a formação do fuso. A solução mais conhecida é a colchicina, ou seus derivados como o colchemid. A concentração ideal das soluções finais de uso da colchicina variam de acordo com a espécie e deverão ser testadas empiricamente com soluções variando entre 0,25 e 1%. De uma maneira geral a concentração média é de 0,5% para finalidades de cariotipagem. Para obtenção de poliplóides a concentração deverá ser maior e igualmente testada empiricamente.

A obtenção de células na fase de metáfase mitótica não depende exclusivamente da aplicação destas drogas, existem inúmeros fatores envolvidos tais como temperatura ambiente, temperatura do pré-tratamento, duração do pré-tratamento e das condições ambientais, principalmente por que mantemos as plantas nas condições ambientais normais.

Por exemplo, se estivermos no inverno temos uma redução na taxa de mitoses nos meristemas, as divisões ficam mais lentas e conseqüentemente teremos dificuldades em obter células no ponto desejado. O mesmo acontece com dias nublados, chuvosos ou mesmo com a hora do dia, pois há plantas que apresentam diferenças quanto ao horário em que as divisões ocorrem.

A concentração das drogas também afeta drasticamente os pré-tratamentos. Existem plantas que não respondem a certas substâncias. Por isso esta fase é a mais complexa, pois implica no teste de diferentes drogas em diferentes concentrações, com tempo variável, com coletas em diferentes horários em diferentes épocas do ano. Não há uma receita ou um protocolo padrão para o pré-tratamento dos meristemas. O que se pode fazer é dar algumas diretrizes em seqüência para se efetuar um pré-tratamento.

Seqüência comum (utilizada para qualquer tipo de pré-tratamento):

1. 1. Dentro das possibilidades manter o material a ser coletado em condição controlada de temperatura, o mais usual é manter as plantas por alguns dias em temperaturas entre 28 e 30 oC.

2. Preparar a solução inibidora do fuso mitótico com a concentração desejada.

3. Coletar o meristema. Observação: em algumas espécies de orquídeas as pontas de raízes são extremamente grossas, por isso é recomendável a perfuração ou mesmo cortar a raiz em vários pedaços para que as soluções possam penetrar melhor. Estes procedimentos podem ser os mesmos apresentados para polínias.

4. Manter os meristemas na solução inibidora do fuso mitótico sempre inteiramente mergulhado na solução, nunca boiando. Não superlotar o frasco. Agitar de vez em quando para homogeneizar e garantir que todos os meristemas afundem.

5. Marcar o tempo de pré-tratamento que pode durar de 1 hora até 18 horas dependendo da espécie. Em orquídeas os pré-tratamentos são sempre longos. Lembre-se de que as células nesta fase ainda estão vivas, portanto nunca tampe os frascos para que a solução possa se manter oxigenada.

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6. Após o pré-tratamento o meristema deve ser fixado.

Fixação dos tecidos

Estes procedimentos são válidos tanto para polínias como para meristemas somáticos. A principal função dos fixadores é matar a célula e conservar as estruturas desejadas. Existem fixadores específicos para cada tipo de finalidade. Há fixadores que conservam proteínas, há os que conservam organelas, há fixadores próprios para microscopia eletrônica de varredura e àqueles próprios para microscopia de transmissão. Os dois fixadores mais utilizados para fins citogenéticos são a solução de Carnoy e o 5:1:1:1.

• Fixador de Carnoy (ou 3:1)

3 partes de álcool etílico absoluto (por exemplo 3ml) 1 parte de ácido acético glacial (neste caso 1ml)

• Fixador 5:1:1:1

5 partes de álcool etílico absoluto (por exemplo 5 ml) 1 parte de ácido acético glacial ( neste caso 1 ml) 1 parte de clorofórmio (neste caso 1 ml) 1 parte de formalina (neste caso 1 ml)

O mais recomendável é a utilização do fixador de Carnoy, pois é menos tóxico e deixa o tecido menos rijo. O fixador 5:1:1:1 é muito tóxico e além disso deixa os tecidos extremamente duros o que dificulta as preparações citológicas.

Após o pré-tratamento devemos fazer a fixação do material, para que as células morram e possam ser conservadas. Após a fixação o material pode durar muitos anos, desde que mantidos nas condições adequadas. No caso das polínias apresentado anteriormente, coleta-se o material direto no fixador.

Protocolo de fixação:

1. Preparar a solução fixadora desejada, pouco antes de terminar o pré-tratamento. (Não é recomendável armazenar solução fixadora).

2. Com o auxílio de uma pinça transferir rapidamente os meristemas da solução inibidora do fuso mitótico para o fixador. Evitar ao máximo levar solução de um frasco para outro. Nunca escorra ou deixe o meristema secar.

3. Tampar o frasco para que as células parem de respirar. Agitar constantemente para assegurar que haja a troca das soluções no tecido.

4. Após 30 minutos trocar o fixador, pois no primeiro frasco há uma grande quantidade de solução inibidora do fuso mitótico. Continuar agitando por de vez em quando durante as primeiras duas horas.

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5. Deixar a temperatura ambiente por no mínimo 18 e no máximo 24 horas. Alternativamente podem-se transferir as polínias para álcool a 70% por 1 hora. Trocar novamente a solução de álcool a 70% e a seguir colocar no freezer a temperaturas abaixo de -4ºC e acima de -20ºC.

Preparação de lâminas

Coloração pelo método de Feulgen:

Este método de coloração é muito interessante por ter inúmeras aplicações e principalmente por ser DNA específico. A coloração é do ponto de vista químico, estequiométrica, ou seja, é passível de ser mensurada. Este método de coloração consiste em se hidrolisar o tecido meristemático, com duas finalidades, sendo um, deixá-lo mais macio para que durante a preparação da lâmina as células possam se soltar, e outro é fazer com que o ácido clorídrico despurine o DNA. São nestas regiões despurinadas do DNA que a fucsina irá reagir e desenvolver cor posteriormente. Há uma relação química neste caso entre a hidrólise ácida-despurinação-reação com a fucsina. Por esta relação é que é possível se quantificar o conteúdo de DNA de células coradas pelo método de Feulgen. Além disso, esta coloração permite que o citoplasma fique claro e sem contraste, permitindo uma nítida observação dos cromossomos ou dos núcleos.

Protocolo:

1. Retirar o material conservado em álcool 70% do freezer e deixa-lo atingir temperatura ambiente.

2. Lavar as raízes duas vezes em água destilada por 5 minutos cada uma. 3. Incubar as raízes em ácido clorídrico 1N já pré-aquecido a 60ºC por tempo

variando de 8 a 15 minutos. Obs.: é muito importante que o ácido clorídrico esteja aquecido a 60ºC e permaneça durante todo o tempo de reação a esta temperatura.

4. Lavar as raízes duas vezes em água destilada por 5 minutos cada uma. 5. Incubar as raízes no reativo de Schiff, em frasco escuro, e deixá-lo reagindo

por 45 minutos no escuro. Obs.: o reativo de Schiff é fotossensível por isso deve se evitar o contato com a luz para não perder a reatividade.

6. Após a reação lavar as raízes gotejando-se água constantemente, por tempo a ser determinado. O ideal é deixar até que todo o corante seja lavado. Obs.: o reativo de Schiff também reage com a água, por isso é importante o procedimento de lavagem do material.

Protocolo para a preparação do reativo de Schiff:

Fucsina Leucobásica - 1g Metabissulfito de sódio - 2g Ácido Clorídrico 1N - 10ml Água destilada - 200ml Realizar todo o procedimento em frasco escuro, ou envolvido em papel alumínio.

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1. Dissolver a fucsina na água destilada pré-aquecida a 60ºC. 2. Adicionar o ácido clorídrico, deixar agitando por alguns minutos. 3. Adicionar o metabissulfito de sódio. 4. Tampar o frasco e mantê-lo sobre agitação constante. O líquido terá uma cor

marrom-avermelhado. 5. Adicionar carvão ativado e manter agitando até que o líquido se torne incolor,

de preferência de um dia para o outro. 6. Filtre o corante através de papel de filtro Whatman Nº 1. 7. Conserve o corante em vidro protegido da luz à temperatura de 4ºC. 8. Após a coloração pode ser preparada a lâmina, pelo método do esmagamento,

ou submeter os meristemas à digestão com enzimas que irão degradar a parede celular e tornar o tecido mais friável para a preparação de lâminas.

Existem alternativas de coloração dos tecidos meristemáticos ou das lâminas diretamente, como o corante de Giemsa, as Orceínas, os Carmins, a Hematoxilina férrica, entretanto nenhum destes apresenta resultados superiores àqueles apresentados pela coloração do método de Feulgen. Em alguns casos há uma preferência pelo uso da hematoxilina por ser um corante que envolve reagentes menos tóxicos do que aqueles utilizados no método de Feulgen.

Digestão enzimática do tecido meristemático:

Este procedimento tem por objetivo degradar as celuloses, as hemiceluloses e as pectinas que envolvem as células de modo que elas fiquem somente com a membrana plasmática que permite a célula inchar e espalhar os cromossomos. Para tal procedimento utiliza-se uma combinação de celulase e pectinase.

Protocolo

1. Utilizar as células coradas pelo método de Feulgen, ou retirar os meristemas conservados em fixador do freezer e deixá-los atingir a temperatura ambiente.

2. Lavar as raízes duas vezes em tampão citrato a 0,01 M por 5 minutos cada. 3. Incubar os meristemas na solução de celulase a 2% e pectinase 3% a 37ºC (as

enzimas devem estar pré-aquecidas) por tempo variável de acordo com a espécie e o meristema que está sendo utilizado.

4. Retirar os meristemas da solução de enzima e colocá-los em um recipiente com tampão citrato gelado (já deve estar gelado) para paralisar a reação.

Se a preparação de lâminas for ser realizada no mesmo dia, os meristemas poderão ser mantidos no tampão citrato, caso contrário os meristemas deverão ser transferidos para água destilada e mantidos a 4ºC.

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Protocolo de preparação das enzimas

Pectinase Calbiochem ® (4,9 U/mg)

Concentração final deve ser de 14,7 U/ml o que equivale a 3%

1. Diluir 60 mg de Pectinase em 10 ml de tampão citrato 0,01M. A concentração desta solução é de 29,4 U/ml (6%)

2. Fazer alíquotas de 1ml e manter a temperatura abaixo de 0ºC.

Celulase Sigma ® C1184 (0,49 U/mg)

Concentração final dever ser de 18,4 U/ml o que equivale a 2%.

1. Diluir 400 mg de Celulase em 10 ml de tampão citrato 0,01M. A concentração desta solução é de 18,4 U/ml (4%).

2. Fazer alíquotas de 1ml e manter a temperatura abaixo de 0ºC.

Preparo da solução de trabalho Pectinase a 3% mais Celulase a 2%

1. Descongelar as soluções e aquecê-las a 37ºC. 2. Misturar na proporção de 1:1 as soluções estoques de Pectinase a 6% e

Celulase a 4%. 3. Manter a mistura a 37 oC para realizar a digestão enzimática.

Protocolo para preparação do tampão citrato.

Preparo da solução estoque de Tampão Citrato a 0,1 M

1. Pesar 840 mg de ácido cítrico e 1770 mg de citrato de sódio dihidratado. 2. Diluir ambos em 100 ml de água destilada. O pH da solução é 4,5 e não é

necessário ajustar. 3. Conservar a temperatura de 4ºC.

Preparo da solução de uso de Tampão Citrato a 0,01 M.

1. Retirar solução estoque da geladeira e deixá-la atingir a temperatura ambiente. 2. Diluir na proporção de uma parte da solução estoque (por exemplo, 1 ml) para

nove partes de água destilada (por exemplo, 9 ml). 3. Caso não utilize toda a solução, conservar à temperatura de 4ºC. A preparação das lâminas pode seguir a partir deste ponto duas rotinas, uma para meristemas apenas corados pelo método de Feulgen, ou um para as células tratadas com as enzimas.

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Preparação das lâminas sem digestão enzimática

1. Colocar um meristema ou um pedaço de meristema em uma solução de ácido acético a 45% por tempo variável de 5 a 30 minutos dependendo da resistência do tecido.

2. Sobre a lâmina colocar uma gota de carmim acético a 1% e nesta gota colocar o meristema que estava em ácido acético a 45%.

3. Com o auxílio de uma barrinha de ferro, macerar o tecido cuidadosamente para que as células se soltem. Esta maceração não precisa ser muito delicada, mas deve-se tomar cuidado para não macerar o tecido sempre no mesmo lugar o que causa quebra das células em divisão que são mais frágeis.

4. Com o auxílio de uma agulha enferrujada, provocar a liberação de um líquido de cor negra no carmim, movimentando delicadamente a agulha sobre a solução. Esta solução escura chama-se mordente e realça a coloração dos cromossomos.

5. A seguir cobrir com a lamínula evitando-se a formação de bolha. Deve-se tomar cuidado para que não haja excesso de líquido fazendo com que a lamínula fique boiando sobre a lâmina, o que prejudica muito a preparação das lâminas.

6. Sobre a chama de uma lamparina, aquecer a lâmina lentamente, sem deixá-la ferver. Pressionar a lamínula com o dedo entre papel de filtro retirando-se o excesso de líquido. Evite que a lamínula se movimente. Este procedimento de aquecer faz a célula inchar e com o amassamento faz-se que os cromossomos se espalhem.

A lâmina está pronta para o exame ao microscópio. Se a lâmina tiver células adequadas para análise dos cromossomos, a lamínula deve ser retirada em nitrogênio líquido, ou submersa invertida em uma solução de ácido acético a 45%. Este último procedimento, embora mais dispendioso, resulta em preparações citológicas mais limpas. As lâminas e lamínulas devem então ser secas ao ar e montadas em bálsamo do Canadá ou Entelam.

Preparação do ácido acético 45%

1. Em uma proveta medir 45 ml de ácido acético glacial. 2. Completar o volume para 100 ml com água destilada. Esta solução não se estraga, mas é recomendável sempre a preparação da solução fresca.

Preparação do ácido acético a 60%

1. Em uma proveta medir 60 ml de ácido acético glacial. 2. Completar o volume para 100 ml com água destilada Esta solução não se estraga, mas é recomendável sempre a preparação da solução fresca.

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Preparação do Carmim Acético a 1%

1. Pesar 1 g de Carmim. 2. Diluir na solução de ácido acético a 45%. 3. Deixar diluindo sobre agitação por algum tempo. 4. Aquecer a solução até a ebulição e então deixar em repouso por 24 horas. 5. Filtrar a solução em filtro de papel Whatman Nº 1 6. Conservar o corante em frascos escuros ou envolvidos em papel alumínio para

proteção contra a luz. Manter a solução a temperatura de 4ºC. Preparação das lâminas com digestão enzimática

1. Retirar um meristema do tampão citrato gelado e colocá-lo em uma solução de ácido acético a 60%, por tempo variável de alguns segundos até 5 minutos. Este tempo é extremamente dependente do tempo de digestão enzimática. Quanto mais longo for o tempo de digestão, menor será o tempo no ácido acético.

2. Colocar o tecido sobre uma lâmina com uma gota de carmim acético a 1%. 3. Com o auxílio de uma pinça soltar as células. Na maioria dos casos não é

necessário macerar o tecido. 4. A seguir cobrir com a lamínula evitando-se a formação de bolha. Deve-se

tomar cuidado para que não haja excesso de líquido para que a lamínula não fique boiando sobre a lâmina, o que prejudica muito a preparação das lâminas.

5. Pressionar a lamínula com o dedo entre papel de filtro. Não é necessário aquecer na maioria dos casos. As células sem parede permitem que a célula inche com o carmim acético.

6. Observar ao microscópio e proceder como para o item anterior. Este procedimento também pode ser utilizado para meristemas apenas fixados e sem coloração. Neste caso basta retirar os meristemas do freezer e lavá-los no tampão citrato e proceder à digestão enzimática como descrito anteriormente. Neste caso as células não têm cor e é necessário um microscópio com contraste de fase para exame das células, ou proceder coloração com Giemsa, Orceína, Hematoxilina, ou outro método.

Preparação de lâminas a partir de polínias.

1. Retirar as polínias fixadas ou conservadas em álcool a 70% do freezer e deixá-las atingir temperatura ambiente.

2. Colocar uma polínia sobre a lâmina contendo uma gota de carmim propiônico a 1%.

3. Com auxílio de uma agulha, estilete e pinça de ponta fina, romper a polínia e espalhar as células sobre a lâmina.

4. Com o auxílio de uma agulha enferrujada liberar o mordente como já descrito anteriormente.

5. Cobrir com a lamínula. Atenção para que não haja excesso de líquido.

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6. Aquecer lentamente em chama de lamparina. Não deixar entrar em fervura. 7. Pressionar a lamínula entre papel de filtro. 8. Examinar ao microscópio e proceder como anteriormente descrito.

Preparação do ácido propiônico 45%

1. Em uma proveta medir 45 ml de ácido propiônico. 2. Completar o volume para 100 ml com água destilada.

Preparação do Carmim Propiônico a 1%

1. Pesar 1g de carmim 2. Diluir o carmim na solução de ácido propiônico 45%. 3. Deixar solubilizando por algum tempo. 4. Aquecer a solução até a fervura. 5. Deixar a solução em repouso por 24 horas. Filtrar em filtro de papel Whatman

Nº 1. 6. Conservar em frasco escuro ou envolvido em papel alumínio para evitar

contato com a luz. 7. Armazenar a solução a temperatura de 4ºC.

Sinonímia dos corantes citados

Carmim: ácido carmínico, carmine. Fucsina leucobásica: Fucsina básica, Anilin Red, anilina vermelha, fucsina diamante, magenta básica, rubin basic. Giemsa: eosina e azul de metileno seg. Giemsa.

6. A visualização dos cromossomos

No microscópio, utilizando-se da objetiva seca de 40X e também a objetiva 100X de imersão em óleo, e oculares de 10X e 15X, proporcionando respectivamente aumentos de 400X e 1000X com ocular de 10X e 600X e 1500X com oculares de 15X. Utilizando-se a objetiva de imersão manter o condensador totalmente levantado.

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Figura 1. Metáfase mitótica de Oncidium maculatum (2n=56). Nota-se que há

cromossomos grandes e cromossomos muito pequenos.

A contagem dos cromossomos

Ao invés da contagem direta, sob o microscópio, esta deverá preferencialmente ser feita indiretamente. Efetua-se a micro-fotografia digital da imagem, utilizando-se de um tubo trinocular adaptado ao microscópio. Um adaptador específico para a marca da câmera que se dispõe deverá ser anexado ao tubo vertical do trinocular. As câmeras que possuem esses acessórios adaptadores, são geralmente aquelas que possuem recursos de imagem excelentes e que tenham no mínimo 4 M pixéis de resolução entre elas: Nikon Coolpix 4500, varios modelos da Canon e Olympus, entre outras. É claro que poderão ser utilizados microscópios apropriados para foto-micrografia e que já são adquiridos com todo o sistema de microfotografia completo. Inicialmente percorre-se a lâmina com a objetiva seca de 40X, com o charriot, na tentativa de se encontrar um núcleo celular ideal, com os cromossomos bem distribuídos e que não estejam sobrepostos. Uma vez selecionada a imagem cromossômica ideal, centralizar e mudar para a objetiva de imersão 100X, obtendo-se assim um aumento de 1000X, com o qual deverá ser fotografada, com a resolução máxima da câmera no modo macro. Para isto, procura-se fazer a microfocalização precisa da imagem com o parafuso micrométrico do microscópio. Poderão ser fotografados vários núcleos celulares diferentes na mesma lâmina e que possuam características ideais. Recomendamos tirar varias micro-fotografias do mesmo campo com focalizações micrométricas diferentes.

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A manipulação da imagem digital

Retira-se o cartão de memória digital da câmera, e transfere-se as imagens para o computador, ou através de um drive leitor de cartão, ou então através do cabo USB de transferência, que acompanha a câmera. Utilizando-se de um software de manipulação de imagens digitais, entre outros: Adobe Photoshop ®, Corel Photo Paint ®, ULead Photo Impact ®, etc., abrí-la no respectivo programa, ajustar as imagens com relação ao balanço de cores, brilho e contraste, se necessário, e selecionar aquelas que se consideram excepcionais. Renomear de acordo com um critério que possa relacionar a imagem com o material do espécime. Imprimir duas cópias de cada uma das imagens em papel A-4 com a máxima resolução da impressora jato de tinta, ou melhor, em uma impressora a laser.

A imagem impressa

Agora que possuímos as imagens impressas do núcleo metafásico, com os cromossomos distribuídos uniformemente, podemos utilizar dois procedimentos distintos: Contando os cromossomos diretamente na imagem impressa Neste caso, a tarefa é bem mais simples. Munido de uma caneta hidrográfica colorida, ir contando os cromossomos e fazendo uma marca com a caneta em cada cromossomo contado, no próprio impresso, para se evitar que se conte duas vezes o mesmo cromossomo. Anotar os resultados obtidos no formato 2n = 2x.

Figura 2. Representação esquemática dos tipos de cromossomos

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Fazendo o pareamento cromossômico

Este é o método de escolha, quando possível, e será necessário o conhecimento adicional de algumas terminologias relacionadas aos tipos de cromossomos com relação à localização do centrômero: metacêntricos, submetacêntricos e acrocêntricos, para que se possa emparelhá-los.

Com uma tesoura de ponta fina, recortar individualmente cada um dos cromossomos precisamente, e ir adicionando os respectivos recortes de papel em uma caixinha qualquer. Dispondo de uma folha de papel A-4 em branco, segregar os recortes de acordo com o tamanho e posição dos centrômeros. Como muitos cromossomos poderão estar dobrados no ponto dos centrômeros, será necessária uma régua para medir os braços cromossômicos para poder pareá-los corretamente. Esta fase é muito trabalhosa, e requer muita habilidade, devendo-se ter o cuidado de não confundir um homólogo com outro. Devemos começar pelo cromossomo maior, verificar a localização do seu centrômero e localizando o seu par (homólogo). Então devemos colar na folha em branco da esquerda para a direita cada par de cromossomos lado a lado de acordo com o seu tamanho e localização do centrômero em ordem decrescente, de modo que cromossomos de tamanhos semelhantes deverão formar um mesmo grupo, que freqüentemente serão denominados através de letras.

De uma maneira geral os grupos são padronizados de acordo com a espécie em questão, ou seja, indivíduos de uma mesma espécie possuem os mesmos grupos. Assim, poderemos ter um grupo de 3 pares de cromossomos de tamanhos discretamente diferentes designados pela letra A, e cada um dos pares deste grupo recebem um número. Desta forma o grupo A seria composto pelos pares de cromossomos A1, A2 e A3. Suponhamos que o grupo seguinte B, possua 4 pares. Então eles deverão ser nomeados com sendo B4, B5, B6 e B7, e assim por diante até o último grupo.

O exemplo abaixo demonstra hipoteticamente um cariótipo qualquer, sendo que a morfologia dos cromossomos pode variar de acordo com a espécie que se está estudando.

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Figura 3. Diagrama do pareamento cromossômico.

Outra anormalidade que este método detecta são as aberrações numéricas. Assim, poderemos teoricamente detectar a falta ou excesso de um determinado cromossomo homólogo (aneuploidias). Desta forma, no momento do pareamento, suponhamos, que o cromossomo B4, e só ele, possuir 3 homólogos. Então estará detectada uma trissomia. Neste caso a representação deverá ser 2n=37 e ao lado descrever que o cromossomo 4 do grupo B possui 3 representantes homólogos. Entretanto, antes de se pensar em uma aberração numérica, devemos construir varios idiogramas do mesmo indivíduo para se assegurar de que não cometemos algum engano.

Técnicas auxiliares para a identificação cromossômica

A técnica acima descrita para o pareamento cromossômico, muitas vezes pode levar a resultados errôneos, principalmente quando a executamos em espécies cujos cromossomos de um determinado grupo são muito parecidos o que dificulta ou mesmo impossibilita esta tarefa. Para contornar esta situação varias técnicas auxiliares foram apresentadas.

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Autorradiografia

A autorradiografia, surgiu em 1965, e é pouco utilizada atualmente. A vantagem desta técnica é que permite tirar proveito do fato que diferentes cromossomos se replicam em períodos diferentes da fase S do ciclo celular. O agente marcador que é adicionado é a timidina-3H (timidina triciada) à cultura de células próximo do final da fase S, de modo que os cromossomos que estiverem se duplicando nesta etapa, incorporarão a timidina radioativa. Assim, expondo-se os cromossomos a filmes fotográficos a radioatividade irá impressionar a emulsão fotográfica, que ao ser revelada demonstra os locais onde a timidina foi incorporada.

Técnicas de bandeamento

Ferramentas como o bandeamento cromossômico têm sido empregados com sucesso em plantas desde a década de 1970, embora em plantas não existam as típicas bandas-G, normalmente observadas em mamíferos e aves, e que facilitam muito o estudo do cariótipo, outros tipos de bandas têm sido observadas como as bandas-C e bandas-N.

Apesar de células vegetais não originarem bandas por hidrólise enzimática iremos citar os fundamentos desta técnica para se evitar confusões e por questões de referência. Assim as técnicas a seguir são utilizadas principalmente em citogenética animal abrangendo humana, outros mamíferos e aves.

• Bandeamento Q: A técnica de bandeamento Q, desenvolvido por Caspersson et al., 1970, é o tratamento com o fluorocromo dihidroxi-cloreto de quinacrina. Nesta técnica, a microfotografia dos cromossomos metafásicos, digeridos parcialmente pela tripsina, é feita no microscópio de fluorescência, para que posteriormente a imagem seja impressa e os cromossomos somáticos pareados conforme os arranjos das bandas de proteólise formadas.

• Bandeamento G: A técnica de bandeamento G surgiu a partir de 1971, e é feita a digestão enzimática dos cromossomos através da tripsina a 0,1% em tampão de fosfatos pH=6,8 por aproximadamente 1 a 4 minutos, logo após a obtenção das metáfases. Como a ação da enzima é restrita a porções distintas do DNA, obtêm-se desta forma bandas transversais claras correspondentes às áreas que sofreram proteólise. Estas bandas, de uma maneira geral, formam um padrão de distribuição semelhante em alguns dos homólogos, e inclusive em todos os indivíduos da mesma espécie, o que facilita o seu pareamento. Esta técnica costuma ser denominada cariotipagem por bandeamento-G, uma vez que a coloração pós-tratamento enzimático, freqüentemente, é realizado pelo método de Giemsa. Entretanto, o bandeamento com Giemsa é mais simples e barato do que o bandeamento fluorescente, fornecendo informações semelhantes, de modo que é o método mais utilizado.

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7. Métodos rápidos para análise

Devido o trabalho imenso que a contagem cromossômica demanda, sobretudo quando se necessita conhecer o conteúdo cromossômico em um grande número de indivíduos, algumas técnicas alternativas e práticas foram preconizadas. Entre estas metodologias citamos as técnicas de quantificação de DNA nuclear como a microdensitometria de Feulgen e a citometria de fluxo, que podem substituir a contagem cromossômica.

Microdensitometria de Feulgen

A microdensitometria de Feulgen baseia-se na ligação específica do DNA ao Reagente de Schiff, havendo uma proporcionalidade entre a sua concentração e a quantidade de corante incorporado.

Citometria de fluxo

A citometria de fluxo, uma técnica mais sofisticada, envolve a análise das propriedades ópticas de partículas em fluxo, e consiste basicamente no isolamento dos núcleos e a coloração com fluorocromos, para a detecção através da fluorescência emitida. A vantagem desta técnica e a precedente é a rapidez e a facilidade de preparo das amostras e o grande número de núcleos que podem ser analisados.

8. Citogenética molecular

Nos últimos anos as técnicas de citogenética molecular FISH (hibridação fluorescente in situ) e GISH (hibridação genômica in situ), com marcadores citogenéticos de DNA, revelaram ser potencialmente úteis para a caracterização cromossômica em uma grande número de espécies vegetais. Estas técnicas têm facilitado os estudos de relações de homologia dos cromossomos e avanços significativos foram feitos em várias frentes da citogenética, principalmente na estrutural e na evolutiva.

A FISH é uma técnica mista de citogenética molecular que permite o diagnóstico rápido de anomalias cromossômicas muito pequenas em metáfase e interfase. Entretanto, por ser uma técnica altamente sofisticada, é de custo elevado, pois utiliza sondas de DNA específicos marcados com diversos fluorocromos diferentes, além de utilizar um microscópio de fluorescência equipado com câmara digital e sistema de micro-cinematografia , acoplado a um computador. O resultado da observação é magnífico, pois as sondas se hibridizam com regiões específicas dos cromossomos exibindo colorações fluorescentes distintas quando iluminadas por fontes de luz excitatórias de comprimentos de onda geralmente nas

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faixas de 320 a 480 nm. Algumas das técnicas permitem até que o software incluído analise com precisão os segmentos cromossômicos coloridos facilitando destarte o pareamento.

9. Referências

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10. Autores Dr. Mateus Mondin Departamento de Genética - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" Universidade de São Paulo Contato: Laboratório de Citologia - Departamento de Genética Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" Universidade de São Paulo Av. Pádua Dias, 11 caixa postal 83 CEP 13400-970 Piracicaba SP Tel. (19) 3429-4125 ramal 3 Fax (19) 3433-6706 [email protected] ou [email protected] Americo Docha Neto Ex Biologista do HCFM - Universidade de São Paulo [email protected]

ISBN: 978-85-906365-0-X

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CITOGENÉTICA VEGETAL ENFATIZANDO A …%20Neto%20... · MONDIN E DOCHA NETO – CITOGENÉTICA VEGETAL 1. Introdução A citogenética é a disciplina da genética que congrega os