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Anelize Sartori Santos Bortolozzo
O efeito do inibidor de proteinase de origem vegetal CrataBL, sobre a inflamação pulmonar alérgica crônica
em camundongos Balb/c
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
para obtenção do título Mestre em Ciências
Programa: Ciências Médicas Área de concentração: Processos Inflamatórios e Alérgicos
Orientadora Profa. Dra. Iolanda de Fátima Lopes Calvo Tibério
São Paulo 2015
ANELIZE SARTORI SANTOS BORTOLOZZO
O efeito do inibidor de proteinase de origem vegetal CrataBL, sobre a inflamação pulmonar alérgica crônica
em camundongos Balb/c
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo para
obtenção do título Mestre em Ciências
Programa: Ciências Médicas
Área de concentração: Processos inflamatórios e
Alérgicos
Orientadora: Profa. Dra. Iolanda de Fátima Lopes
Calvo Tibério
(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de 2011. A versão original está disponível na Biblioteca da FMUSP)
São Paulo 2015
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito.
Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus,
não sou o que era antes.”
Martin Luther King
DEDICATÓRIA
Dedico essa dissertação de Mestrado às pessoas mais importantes da minha vida e
que estiveram efetivamente do meu lado durante a realização deste trabalho:
Aos meus pais José Ricardo Alves dos Santos e Margareti Ap. Sartori Alves dos
Santos;
Ao meu marido Maicon Vicente Bortolozzo;
À minha irmã Giovanna Sartori Alves dos Santos;
Aos meus avós Pedro Sartori Netto e Ignêz Florinda Anésio Sartori;
Aos meus avós José Alves dos Santos e Maria Isabel Fornasari Alves dos Santos;
Aos meus sogros José Roberto Bortolozzo e Edna Ap. da Silva Bortolozzo;
A minha amiga-irmã Thiane Rodrigues Mendieta.
AGRADECIMENTOS
Inicio meus agradecimentos por DEUS, por me direcionar, me motivar e colocar as
pessoas certas na minha vida, as quais foram imprescindíveis para a realização
desse trabalho!
A minha orientadora Profa. Dra. Iolanda de Fátima Lopes Calvo Tibério, por acreditar na minha capacidade desde quando nos conhecemos. Muito obrigada por sempre estar disposta a me ajudar, me nortear e contribuir para meu crescimento tanto como pesquisadora quanto pessoa. Muito obrigada por engrandecer com todo seu conhecimento esse trabalho e minha vida.
A Profa. Dra. Patricia Angeli da Silva Pigati, que teve um papel muito importante na minha vida. Além dos ensinamentos na graduação, dos momentos da vida, me direcionou ao Mestrado, despertando em mim a determinação de sempre seguir em frente e ser alguém melhor.
A minha tia Profa. Conceição Aparecida Fornasari, que despertou em mim a paixão pela área acadêmica.
A que no início era minha parceira, mas que se tornou minha companheira, Adriana Palmeira Dias Rodrigues. Isso, porque o que conquistamos foi mais que parceria. Nas disciplinas, nas técnicas, na rotina, nas vitórias, nas derrotas, em cada momento da realização desse trabalho, estivemos juntas, vibrando, chorando, cantando, estudando, festejando, dialogando e aprendendo. Gratidão pela paciência, pela dedicação, pelo carinho e pela amizade que construímos, que com certeza ficará para a vida toda.
A querida amiga Profa. Dra. Fernanda Magalhães Arantes Costa, por sempre contribuir com seu vasto conhecimento como pesquisadora, professora, mãe e mulher. Impossível descrever toda minha gratidão pelo carinho, pelos fortes abraços e pela força que me deu nesses anos. Você é um exemplo para mim.
Aos amigos Flávia Ribas e Renato Righetti que sempre estiveram dispostos a me ajudar durante toda a realização deste trabalho.
A toda equipe do LIM-20: Milton Arruda, Edna Leick, Rosana Paz, Beatriz Saraiva, Clarice Olivo, Carla Prado, Adenir Perini, Nathalia Pinheiro, Fernanda Roncon, Davi Sales, Juliana Lourenço, Daniela Brito, Tiyaki Ito, Thayse Brüggemann, Luis Afonso, Davi e Ivanildo. Muito obrigada por serem tão prestativos, pelas colaborações e soluções em TODOS os momentos que precisei da ajuda de vocês.
As pesquisadoras Dra. Fernanda Lopes e Dra. Luciana Caperuto, pela rica contribuição dedicada a essa pesquisa durante a participação na minha banca de qualificação.
A Profa. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva, Rodrigo Ferreira, Maria Tereza Correia e Patrícia Paiva laboratório de Bioquímica da UNIFESP e da UFPE, que cederam a CrataBL e colaboraram com a parte Bioquímica desse trabalho.
Ao Dr. Marlon Vilela de Brito pela ajuda em purificar a CrataBL, por me ensinar todo procedimento com muita dedicação e paciência. Obrigada pelos ensinamentos, pelas conversas nos congressos e pela vasta contribuição em sua participação na minha banca de qualificação.
A Profa. Dra. Maria Aparecida Basile, que me mostrou os caminhos além da pesquisa, os preceitos do “educar” e a importância de identificar “o que faz os olhos brilharem”.
Aos meus pais José Ricardo e Margareti, por estarem do meu lado quando precisei, que apesar das dificuldades, SEMPRE foram o alicerce e me incentivam a prosseguir com os estudos.
Ao meu marido Maicon, pela interminável paciência, por respeitar minha ausência, inclusive nos preparativos do nosso casamento. Sou grata pela força e por ser SEMPRE meu porto seguro.
Aos meus amigos que estiveram do meu lado, respeitaram minha ausência e que são indispensáveis em minha vida: Emilyn, Maria Isabela, Mayara, Monique, Priscila, Fernanda, Jonatas, Simone, Heitor, Bárbara e João.
As minhas queridas “mães”, Caroline e Gabriela, que me acolheram com o coração aberto em São Paulo e tornaram meus dias melhores, cheios de amor e cumplicidade. Minha eterna gratidão por vocês.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Commitee of Medical Journal Editors (Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviatura dos títulos e periódicos de acordo com List f Journals Indexed in Index Medicus.
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas e siglas
Lista de figuras e tabelas
Resumo
Abstract
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1 Asma brônquica ........................................................................................................ 1
1.1.1 Definição e descrição ............................................................................................ 1
1.1.2 Prevalência e epidemiologia .................................................................................. 3
1.1.3 Fisiopatologia e inflamação ................................................................................... 5
1.1.3.1 Hiperresponsividade ......................................................................................... 11
1.1.3.2 Remodelamento ............................................................................................... 13
1.1.3.3 Óxido nítrico e estresse oxidativo ..................................................................... 18
1.1.4 Manejo e tratamentos .......................................................................................... 22
1.1.5 Modelos experimentais de asma ......................................................................... 25
1.2 Inibidores de proteinases ........................................................................................ 26
1.2.1 Crataeva tapia Bark Lectin .................................................................................. 30
1.3 Justificativa para o estudo ...................................................................................... 34
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 36 3 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 38 3.1 Animais ................................................................................................................... 38
3.2 Material vegetal e purificação da CrataBL .................................................................. 38
3.3 Grupos experimentais............................................................................................... 39
3.4 Indução da inflamação pulmonar alérgica crônica ...................................................... 40
3.5 Tratamento com CrataBL .......................................................................................... 42
3.6 Avaliação da mecânica pulmonar respiratória ............................................................ 42
3.7 Avaliação do fluido do lavado broncoalveolar ............................................................. 44
3.7.1 Contagem total e diferencial de células ................................................................... 44
3.8 Estudo morfométrico ................................................................................................ 45
3.9 Avaliação das imagens para medida de densidade óptica .......................................... 47
3.10 Avaliação imunohistoquímica .................................................................................. 48
3.11 Imuno-ensaio (ELISA) ............................................................................................ 51
3.12 Anafilaxia cutânea passiva ...................................................................................... 52
3.13 Análise estatística ................................................................................................... 53
4 RESULTADOS .......................................................................................................... 55
4.1 Análise da mecânica pulmonar respiratória ................................................................ 55
4.2 Análises do fluido do lavado broncoalveolar ............................................................... 57
4.3 Análise da concentração de citocinas por ELISA ................................................... 59
4.4 Análises morfométricas .......................................................................................... 62
4.4.1 Quantificação da densidade de eosinófilos ......................................................... 62
4.4.2 Quantificação das células IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-γ positivas ................................. 64
4.4.3 Quantificação das células iNOS, NF-kβ positivas e da fração de volume de 8-iso-
PGF2ɑ...........................................................................................................................72
4.4.4 Quantificação das células MMP-9, TIMP-1 e TGF-β positivas ................................. 78
4.5 Análise por medida de densidade óptica ................................................................ 84
4.5.1 Quantificação da fração de volume das fibras colágenas e elásticas ................. 84
4.6 Análise de correlação ............................................................................................... 88
4.7 Análise da anafilaxia cutânea passiva ....................................................................... 92
4.8 Análise qualitativa ..................................................................................................... 93 5 DISCUSSÃO ........................................................................................................... 100 6 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 115 7 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 117
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
ANOVA Análise de variância BbCI Bauhinia bauhinioides Cruzipain inhibitor BBIs Família de inibidores Bowman-Birk BbKI Bauhinia bauhinioides Kallikrein inhibitor BrTI Bauhinia rufa Trypsin inhibitor BSA Bovine serum albumin BuXI Bauhinia ungulata factor-Xa inhibitor BvTI Bauhinia variegata Trypsin inhibitor Ca2+ Íon de Cálcio CAT Transporte de aminoácido catiônico cNOS Óxido nítrico sintases constitutivas COX-2 Ciclooxigenase 2 CrataBL Crataeva tapia Bark Lectin DATASUS Departamento de Informática do SUS/MS DNA Ácido desoxirribonucléico DO Densidade óptica DrTI Delonix regia Trypsin inhibitor ECRHS The European Community Respiratory Healty Survey EcTI Enterolobium contortisiliquum Trypsin inhibitor EGF Fator de crescimento epidérmico ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay eNOS Óxido nítrico sintase endotelial Ers Elastância do sistema respiratório FGF Fator de crescimento de fibroblastos FLBA Fluido do lavado broncoalveolar GINA Global Initiative National of Asthma H2O2 Água oxigenada ICAM-1 Molécula de adesão celular 1 IFN-γ Interferon Gama IgE Imunoglobulina E IL Interleucina iNOS Óxido nítrico sintase induzida ISAAC International Study of Asthma and Allergies in Childhood kDa Quilodalton KNIs Família de inibidores Kunitz LPS Lipopolissacarídeo Mg2+ Íon de magnésio MMPs Metaloproteinases de matriz
Mn2+ Íon de manganês NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NF-kB Fator nuclear kappa beta NIH National Institutes of Health nNOS Óxido nítrico sintase neuronal NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintases O2 Oxigênio O2
- Superóxido ONOO- Peroxinitrito OVA Ovalbumina PAF Fator de agregação plaquetária PAR-1 Receptor ativado por protease 1 PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas pg Picogramas ROS Espécies reativas de oxigênio RNS Espécies reativas de nitrogênio Rrs Resistencia do Sistema respiratório SUS Sistema Único de Sáude TGF-β Fator de transformação do crescimento beta Th T helper TNFɑ Fator de necrose tumoral ɑ TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinases de matriz
RESUMO
Bortolozzo ASS. O efeito do inibidor de proteinase de origem vegetal CrataBL, sobre a inflamação pulmonar alérgica crônica em camundongos Balb/c [Dissertação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2015.
INTRODUÇÃO: Os corticosteróides são considerados padrão-ouro no tratamento da asma, porém, existem asmáticos graves que não obtém controle dos sintomas, o que suscita a busca por novas terapias. Os inibidores de proteinases têm sido estudados no controle de diversos processos inflamatórios, dentre estes, encontra-se Crataeva tapia Bark Lectin (CrataBL). OBJETIVO: Avaliar se a proteina bifuncional de planta, CrataBL, que tem função lectínica e se liga a carboidratos, modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e nos septos alveolares de camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Trinta e dois camundongos machos Balb-c SPF (6-7 semanas, 25-30 g) foram divididos em 4 grupos: C (controle), OVA (sensibilizados - 50 μg de ovalbumina intraperitoneal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados – 1% de ovalbumina nos dias 22, 24, 26, 28); C+CR (controle tratados com CrataBL - 2 mg/kg/i.p dos dias 22 a 28); OVA+CR (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com CrataBL - 2 mg /kg/i.p dos dias 22 a 28). No dia 29, realizamos: (i) hiperresponsividade à metacolina - resposta máxima de resistência (Rrs) e elastância (Ers) do sistema respiratório; (ii) quantificação do número total de células, macrófagos, linfócitos e células polimorfonucleares no fluido do lavado broncoalveolar (FLBA); (iii) análise histopatológica do pulmão por morfometria para quantificação de eosinófilos, fração de volume de fibras colágenas e elásticas; (iiii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, MMP-9, TIMP-1, TGF-β, iNOS, NF-kB e fração de volume de 8-iso-PGF2α nas vias aéreas e nos septos alveolares e ELISA para quantificação da concentração de IL-4, IL-5 e IFN-γ. A significância foi considerada quando p<0,05. RESULTADOS: Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+CR comparado ao grupo OVA (p<0,05). O tratamento com CrataBL nos animais sensibilizados atenuou o número de células totais, macrófagos, linfócitos e células polimorfonucleares no FLBA, o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, iNOS, MMP-9, TIMP-1, TGF-β, NF-kB e fração de volume de 8-iso-PGF2α, fibras colágenas e elásticas tanto nas vias aéreas quanto nos septos alveolares quando comparados ao grupo OVA. O tratamento com CrataBL atenuou os níveis de concentração de IL-4, IL-5 e IFN-γ em comparação ao grupo OVA (p<0,05), a partir do método ELISA. CONCLUSÕES: CrataBL atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Contudo, mais estudos são necessários para verificar se este inibidor pode ser uma potencial ferramenta terapêutica para a asma.
Descritores: asma; inflamação; Capparaceae; inibidores de proteases; modelos animais; remodelamento das vias aéreas; estresse oxidativo.
ABSTRACT
Bortolozzo ASS. The effect of proteinase inhibitor CrataBL plant on chronic allergic pulmonary inflammation in Balb/c mice [Dissertation]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2015.
RATIONALE: Corticosteroids are considered the gold standard in the treatment of asthma, however, there are severe asthmatics who do not get control of symptoms, which raises the search for new therapies. The proteinase inhibitors have been studied in the control of various inflammatory processes, including such inhibitors is Crataeva tapia Bark Lectin (CrataBL). OBJECTIVE: To evaluate the proteinase inhibitor CrataBL modulates the bronchial responsiveness to methacholine, inflammation, remodeling and activation of oxidative stress in the airways and alveolar septa of mice with chronic allergic pulmonary inflammation. METHODS: Thirty two SPF Balb-c male mice (6-7 weeks, 25-30 g) were divided into 4 groups: control (C), OVA (sensitized - 50 μg ovalbumin intraperitoneal (i.p) on days 0 and 14 and challenged - 1% ovalbumin on days 22, 24, 26, 28); C+CR (control treated with CrataBL - 2 mg / kg / i.p of 22 to 28); OVA+CR (sensitized and challenged with ovalbumin and treated with CrataBL - 2 mg / kg / i.p from day 22 to 28). On the 29th, we held: (i) hyperresponsiveness to methacholine and maximal responses were obtained resistance (Rrs) and elastance (Ers) of the respiratory system; (ii) quantification of total cells, macrophages, polymorphonuclear cells and lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid (BALF); (iii) histopathological analysis of the lungs by morphometry to quantify the eosinophils, volume fraction of collagen and elastic fibers; (iiii) immunohistochemistry for quantification of positive IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, MMP-9, TIMP-1, TGF-β, iNOS, NFk-β cells and volume fraction of 8-iso-PGF2α in airway and alveolar septa and ELISA for quantification of concentration of IL-4, IL-5 e IFN-γ (p<0.05). RESULTS: There was attenuation of the maximal response Rrs and Ers in the OVA+CR group compared to OVA (p<0.05). Treatment with CrataBL in sensitized animals attenuated the number of total cells, macrophages, lymphocytes, and polymorphonuclear cells in BALF, the number of eosinophil positive IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, iNOS, MMP -9, TIMP-1, TGF-β, NF-kB cells and volume fraction of 8-iso-PGF2α, collagen and elastic fibers in both the airways and alveolar septa compared to OVA group. Treatment with CrataBL attenuated concentration levels of IL-4, IL-5 and IFN-γ compared to OVA group (p <0.05) from the ELISA method.CONCLUSIONS: CrataBL attenuated bronchial hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in this experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. However, more studies are needed to determine if this inhibitor can be a potential therapeutic tool for asthma.
Descriptors: asthma; inflammation; Capparaceae; protease inhibitors; models, animal; airway remodeling; oxidative stress.
1 INTRODUÇÃO
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Asma Brônquica
1.1.1 Definição e descrição
No século XX ocorreram as principais descobertas sobre os processos
alérgicos relacionados à fisiopatologia da asma, que foi considerada como uma
doença inflamatória crônica das vias aéreas. Atualmente, a definição mais
apropriada para a asma foi elaborada pela Global Initiative National of Asthma
(GINA) que a caracteriza como uma doença heterogênea, usualmente
caracterizada por inflamação crônica das vias aéreas, determinada pelo
histórico de sintomas, tais como, chiado, falta de ar, aperto no peito e tosse. Os
sintomas variam de intensidade ao longo do tempo, juntamente com a limitação
do fluxo aéreo expiratório. Essas variações podem ser desencadeadas por
diferentes fatores, dentre eles, exercício, exposição à alérgenos ou irritantes,
mudança no tempo ou infecção respiratória viral (GINA, 2015).
O indivíduo com predisposição genética somada a fatores ambientais,
quando exposto a estímulos irritantes (endotoxinas bacterianas, alérgenos,
fumaça de cigarro, epitélio descamativo de cães e gatos), apresenta grande
chance de desenvolver asma. Adicionalmente, o estilo de vida (dieta, hábitos
sociais, ambiente de trabalho) possui elevada significância para o
desenvolvimento desta doença (Aït-Khaled et al., 2001; Liu et al., 2002; Lazaar
e Panettieri, 2003; Bousquet et al., 2005).
Os fatores que desencadeiam a asma geralmente são bem tolerados por
indivíduos normais, porém, em asmáticos podem fazer com que os sintomas se
2
exacerbem (Lemanske e Busse, 2010; GINA, 2015). Sabe-se que mais de 100
possíveis genes em cromossomos identificados estão associadas à asma, os
quais podem sofrer variações em diferentes regiões do mundo (Bijanzadeh et
al., 2011).
O papel do perfil fenotípico da asma (clínico, inflamatório e genético), tem
sido amplamente discutido, pois apresenta características fundamentais para
melhor entendimento dos mecanismos fisiopatológicos da doença e da
resposta ao tratamento (GINA, 2015). Assim, a asma pode ser classificada a
partir das suas características fenotípicas, tais como, asma alérgica, asma não-
alérgica, asma de início tardio, asma com limitação fixa do fluxo aéreo e asma
com obesidade (Bell, 2004; Wenzel, 2012; GINA, 2015).
O estreitamento das vias aéreas em resposta a um estímulo não
específico representa uma das principais características da asma alérgica
(Hanazaki et al., 2008) e a hiperresponsividade brônquica parece ser
responsável pelos recorrentes episódios de sibilos, dispneia e tosse (Brannan,
2010).
A hereditariedade é outro fator importante a ser considerado na asma,
onde genes específicos podem estar envolvidos, determinando a atopia do
indivíduo, caracterizada pela produção de imunoglobulina E (IgE),
hiperresponsividade, liberação de mediadores inflamatórios, de crescimento e
diferenciação Th1-Th2 (GINA, 2015).
3
1.1.2 Prevalência e epidemiologia
A determinação da prevalência da asma evoluiu na última década a partir
do desenvolvimento de dois importantes estudos multinacionais: “International
Study of Asthma and Allergies in Childhood” (ISAAC) para crianças e
adolescentes e “The European Community Respiratory Healty Survey”
(ECRHS) para adultos (ECRHS, 1996; ISAAC, 1998). Estes trabalhos foram
elaborados pela necessidade de se obter dados confiáveis, capazes de
demonstrar de modo categórico a prevalência da asma e demais doenças
alérgicas (Solé et al., 2014).
Os estudos supracitados demonstraram elevada disparidade na
prevalência da asma ao redor do mundo, ao verificarem que em 56 países, há
variabilidade da doença de 1,6% a 36,8%, estando o Brasil em 8º lugar, com
uma prevalência média de 20% (ECRHS, 1996; ISAAC, 1998).
Os dados epidemiológicos variam de acordo com particularidades de cada
região e pesquisas apontam aumento na prevalência da asma durante a
infância. A prevalência global da doença varia entre 1 e 18% da população nos
diferentes países e estima-se que cerca de 300 milhões de pessoas são
afetadas pela asma ao redor do mundo. Projeta-se aumento de mais de 100
milhões de casos até 2025 (Bateman et al., 2008; GINA, 2015).
O aumento da prevalência e persistente mortalidade por asma nas últimas
décadas continuam sendo preocupantes, apesar dos recentes avanços no
conhecimento sobre a fisiopatologia e tratamento da doença (O'Byrne, 2010).
Aspectos ambientais, nutricionais, econômicos e psicossociais têm sido
4
sugeridos para explicar o aumento da prevalência da asma observado nas
últimas décadas (Asher, 2010; Alves et al., 2012).
A asma é considerada um problema de saúde pública tanto em países
desenvolvidos, quanto em desenvolvimento, devido ao aumento de sua
frequência e gravidade. Esta doença acarreta impacto socioeconômico, que
envolve custos diretos (hospitalizações e medicamentos) e indiretos (abstenção
no trabalho e morte prematura) (Aït-Khaled et al., 2001; Bousquet et al., 2005).
Segundo o DATASUS (Departamento de Informática do Sistema Único de
Saúde/Ministério da Saúde), estima-se que no Brasil em 2014 foram gastos
mais de 2 milhões de reais com a asma e em 2013, esta doença foi
responsável por 2.016 óbitos (Tabela 1).
Tabela 1: Número de óbitos por asma segundo as regiões do Brasil no ano de 2013. Fonte: MS/SVS/CGIAE - Sistema de Informações sobre Mortalidade (SIM).
Região Óbitos Norte 106
Centro-Oeste 117 Sudeste 356 Nordeste 628
Sul 809 Total 2.016
Nos anos de 2013 e 2014, a asma foi responsável por 247.094
internações no Brasil. Também nestes anos, em relação às faixas etárias,
notou-se que, das internações registradas pelo SUS, 59% ocorreram em
crianças até 14 anos de idade e aproximadamente 25% em indivíduos entre 15
e 59 anos - faixa etária considerada economicamente ativa (Tabela 2).
5
Tabela 2: Número de internações hospitalares por asma segundo faixa etária nos anos de 2013 e 2014. Fonte: Ministério da Saúde - Sistema de Informações Hospitalares do SUS (SIH/SUS).
Faixa etária Internações Menor 1 ano 22.972
1 a 4 72.979 5 a 9 37.168
10 a 14 14.917 15 a 19 8.661 20 a 29 14.965 30 a 39 14.047 40 a 49 13.335 50 a 59 12.945 60 a 69 13.144 70 a 79 12.905
80 anos e mais 9.056 Total 247.094
Assim, várias linhas de pesquisa necessitam ser desenvolvidas, visando
melhor avaliação da fisiopatologia e a busca de novos recursos terapêuticos
para a asma (Masoli et al., 2004).
1.1.3 Fisiopatologia e inflamação
A principal característica fisiopatológica da asma é a inflamação, que é
resultado de uma ampla e complexa interação entre mediadores e células
inflamatórias e estruturais das vias aéreas (Kumar, 2001).
A sensibilização alérgica se dá a partir do primeiro contato do indivíduo com o
antígeno, assim, a resposta inflamatória alérgica é iniciada através da interação
desses alérgenos com células que têm como função apresentá-los ao sistema
imunológico, mais especificamente os linfócitos T, que produzem citocinas
responsáveis pelo início e manutenção do processo inflamatório (Busse et al.,
6
2010). A interleucina 4 (IL-4) tem papel importante no estímulo das células B a
produzirem anticorpos específicos, tais como a IgE (Kuhl e Hanania, 2012).
Os processos alérgicos direcionados por IgE são característicos de
inflamação nas vias aéreas, sendo os mastócitos, os linfócitos Th2 e os
eosinófilos as células mais importantes na asma (Bousquet et al., 2000;
Lemanske e Busse, 2010).
Os eosinófilos caracterizam a inflamação alérgica, promovendo alteração
vascular, hipersecreção de muco, desprendimento epitelial, aumento da
hiperresponsividade das vias aéreas e obstrução do fluxo aéreo. Quando
ativados, liberam leucotrienos, fatores de crescimento e metaloproteinases de
matriz (MMPs), envolvidos no remodelamento das vias aéreas. Os leucotrienos
são potentes broncoconstritores e participam da migração dos eosinófilos para
as vias aéreas (Hendeles et al., 2004; Lemanske e Busse, 2010).
No segundo contato do indivíduo com o alérgeno, se previamente não ter
ocorrido a tolerização, a asma pode se desenvolver e assim ser determinada
por duas fases características, tais como, imediata e tardia (Rang et al., 2004).
A fase imeditada pode ter duração de 15 a 60 minutos e esse processo
ocorre quando o alérgeno que o desencadeou, faz uma ligação com a IgE
específica do antígeno, que se conectam a receptores presentes na membrana
de algumas células (macrófagos, mastócitos, eosinófilos e basófilos)
promovendo a liberação de seus grânulos. Nos grânulos podem conter
leucotrienos, histamina, prostaglandinas, triptases entre outros mediadores
(Kuhl e Hanania, 2012) que podem ocasionar a broncoconstrição das vias
aéreas (Holgate, 2010).
7
Na Figura 1 podemos observar um mastócito não-ativado e outro ativado,
sendo demonstrado o que ocorre no momento da liberação de seus grânulos
contendo mediadores inflamatórios.
Figura 1: A: Mastócitos não-ativados (apresentam mais de mil grânulos secretórios, constituídos pelos mediadores inflamatórios ionicamente ligados a matriz dos proteoglicanos). B: Mastócitos ativados (grânulos dilatados, se posicionam junto a membrana plasmática, onde ocorre a fusão e os mediadores são expostos ao ambiente extracelular. Foto de: Dra. Ann M Dvorak – Beth Israel Deaconess, Medical Center, of Harvard Medical School.
A liberação dos mediadores inflamatórios como a histamina e espécies
reativas de oxigênio desencadearão uma resposta inflamatória, na qual
mastócitos, basófilos, eosinófilos e linfócitos CD4+ Th2 contribuirão para o
desencadeamento de sinais e sintomas característicos da asma como a
hiperresponsividade brônquica, obstrução das vias aéreas, secreção mucosa e
vasodilatação (Busse et al., 2010).
Os mediadores liberados podem gerar dano e ruptura do epitélio ciliado e
como consequência, células epiteliais e miofibroblastos (presentes abaixo do
epitélio) se proliferam e é iniciado o depósito intersticial de colágeno na lâmina
reticular da membrana basal, o que explica o espessamento da membrana e as
lesões irreversíveis que podem ocorrer em alguns asmáticos (Kumar, 2001).
8
A ação dos alérgenos, além de causar dano epitelial, pode de contribuir
para a produção de fatores de crescimento pró-fibróticos que estimulam
fibroblastos, que ao serem ativados, iniciam a produção de fatores de
crescimento e citocinas que promovem a proliferação das células do músculo
liso, aumentando a permeabilidade microvascular com extravasamento de
plasma. Assim, a integridade do epitélio fica comprometida e há dificuldade de
eliminar de muco. As proteínas plasmáticas podem promover aumento do
exsudato viscoso junto ao muco, células inflamatórias e epiteliais, contribuindo
para a piora da obstrução ao fluxo aéreo (Chung, 2000).
Na reação alérgica imediata ocorrem sintomas como tosse, sibilância e
aperto no peito, que são problemas indicativos de alterações das funções do
sistema respiratório. Após esse episódio, ocorre relaxamento da musculatura
brônquica de forma espontânea ou através do uso de medicação (Diretrizes
Brasileiras para o Manejo da Asma, 2012).
Devido ao persistente processo inflamatório, as estruturas do sistema
respiratório se danificam e outras complicações características da fase crônica
se instalam (Holgate, 2010). Nesta fase, que ocorre de 6 a 9 horas após o
contato com o alérgeno, há aumento do processo inflamatório devido às
alterações funcionais dos linfócitos T, que passam a apresentar um padrão
fenotípico do tipo 2 – Th2 (Bharadwaj et al., 2007; Brannan, 2010). As células
do perfil Th2 perpetuam a inflamação através da produção de interleucinas (IL-
4, IL-5 e IL-13), que estimulam a migração de eosinófilos, neutrófilos,
macrófagos, dentre outras células (Holgate, 2010).
A IL-4 é extremamente importante no desenvolvimento da predominância
do perfil imune Th2 e está intimamente envolvida na produção de IgE
9
(Hendeles et al., 2004; Lemanske e Busse, 2010). Já a IL-5 estimula a
produção de quimiocinas nos leucócitos e tem como principal função promover
aumento da migração e sobrevida de eosinófilos nas vias aéreas. Estas células
se apresentam em grande número nas vias aéreas, atuando no aumento da
resposta inflamatória, danos teciduais (Menzies-Gow et al., 2007) e
remodelamento brônquico (Cho et al., 2004).
A IL-13 pode ser produzida por células epiteliais, musculares lisas,
fibroblastos e monócitos / macrófagos e pode induzir características
patológicas de asma, independentemente das tradicionais células efetoras
(mastócitos e eosinófilos). A IL-13 pode contribuir para a perpetuação da
resposta alérgica, fornecendo uma explicação para a cronicidade da doença,
além de desempenhar importantes funções na inflamação das vias aéreas, na
fibrose subepitelial, na hipersecreção de muco, na hiperresponsividade
brônquica e na diminuição de metaloproteinases (Wills-Karp, 2004).
Na fisiopatologia da asma estão envolvidas muitas citocinas (Tabela 3),
que são proteínas glicosiladas que participam da sinalização e crescimento
celular, diferenciação, proliferação, quimiotaxia, imunomodulação e apoptose.
Dentre elas estão as provenientes dos linfócitos de perfil Th1 (IL-2, interferon
(IFN)-γ e IL-12); perfil Th2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 e IL-25); Th3 ou citocinas T
regulatórias [IL-10 e fator de transformação do crescimento beta (TGF-β)] e de
células Th17 (IL-17) (Hamid e Tulic, 2009).
As citocinas também podem ser representadas em classes, tais como,
pró-inflamatórias, que tendem a amplificar e perpetuar o processo inflamatório;
anti-inflamatórias, que visam atenuar o processo inflamatório; fatores de
crescimento, que promovem a sobrevida de células, resultando em mudanças
10
estruturais nas vias aéreas e as quimiocinas, as quais realizam um processo
quimiotático para o processo inflamatório (Hamid e Tulic, 2009; GINA, 2015).
Tabela 3: Descrição das classes e as principais citocinas envolvidas na asma. Classe Citocinas
Th1 IL-2, IL-12 e IFN-γ (interferon gama) Th2 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 e IL-25 Th3
(Regulatórias) IL-10,
TGF-β (fator transformador do crescimento beta) Th17 IL-17
Pró-inflamatórias IL-1β, IL-6, IL-11, TNF-ɑ (fator de necrose tumoral alfa)
Anti-inflamatórias IL-10, IFN-γ, IL-12 e IL-18 Fatores de crescimento PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas),
TGF-β (fator de transformação do crescimento beta), FGF (fator de crescimento de fibroblastos),
EGF (fator de crescimento epidérmico) Quimiocinas IL-8,
RANTES (Regulada sob ativação, expressa e secretada pelos linfócitos T)
Dentre as principais citocinas pró-inflamatórias na asma, encontra-se o
TNF-ɑ, que implica na quimiotaxia de neutrófilos e eosinófilos, no aumento do
efeito citotóxico de eosinófilos e células endoteliais, na ativação de células T e
liberação de citocinas pelas mesmas, no aumento da expressão de moléculas
de adesão, além de induzir a liberação de histamina e participar de um ciclo
autócrino que potencializa a secreção de citocinas pelo mastócito (Babu et al.,
2011).
O TNF-ɑ também tem ação na ativação de fatores de transcrição pró-
inflamatórios (fator nuclear kappa beta – NF-kB e AP-1) (Rang et al., 2004;
11
Leath et al., 2005). O NF-kB está envolvido em funções específicas na
diferenciação e maturação de linfócitos B (Larosa e Orange, 2008).
O processo inflamatório crônico das vias aéreas induzido pelas citocinas
Th2, em longo prazo, pode piorar o quadro clínico do asmático, através da
alteração da função pumonar (Van Rensen et al., 2005), do aumento da
responsividade brônquica (Bousquet et al., 2005) e de mudanças na estrutura
das vias aéreas, como aumento do músculo liso e fibrose (Al-Muhsen et al.,
2011).
1.1.3.1 Hiperresponsividade
A asma caracteriza-se por estreitamento das vias aéreas em resposta a
um estímulo inespecífico e hiperresponsividade (Chiba e Misawa, 2004; Chiba
et al., 2010), porém, esses mecanismos permanecem obscuros (Busse e
Lemanske, 2001).
A intensidade da hiperresponsividade das vias aéreas é variável em
asmáticos, considerando que graus mais elevados são normalmente
proporcionais à gravidade da asma (Busse, 2010).
Existem duas categorias de fatores que contribuem para a
hiperresponsividade das vias aéreas, tais como, persistente e variável
(Cockcroft e Davis, 2006). Os aspectos persistentes da hiperresponsividade
são atribuídos às mudanças estruturais (espessamento subendotelial,
hipertrofia da musculatura lisa, deposição de matriz e alteração dos elementos
vasculares) das vias aéreas. O aspecto variável está relacionado aos eventos
12
inflamatórios das vias aéreas que são influenciados por fatores ambientais
(alérgenos, infecções respiratórias e tratamentos) (Busse, 2010).
Wills-Karp (1999) sugeriu que a hiperresponsividade está intimamente
relacionada com o processo inflamatório na asma. Após ativação por
antígenos, as células Th2 produzem citocinas, incluindo IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13,
que orquestram o recrutamento e a ativação de outras células inflamatórias,
tais como, mastócitos e eosinófilos, os quais contribuem para o início da
hiperresponsividade.
O bloqueio do receptor de IL-4 demonstrou inibir a hiperresponsividade
induzida por metacolina em camundongos, sugerindo que a IL-4 pode
aumentar a responsividade brônquica na asma (Gavett et al., 1997; Shi et al.,
1998). Logo, a IL-5 demonstrou-se responsável pela diferenciação, maturação
e ativação de eosinófilos, além de desempenhar um importante papel na
hiperresponsividade. A IL-5, através da mobilização e ativação dos eosinófilos,
conduz à liberação de produtos pró-inflamatórios, tais como, cistenil-
leucotrienos que estão intimamente associados com a hiperresponsividade
(Rothenberg e Hogan, 2006). A IL-13 pode induzir a hiperresponsividade,
mesmo na ausência de linfócitos, mastócitos, IL-4 e IL-5 (Yang et al., 2001;
Wills-Karp, 2004).
O estreitamento das vias aéreas também foi explicado através da
anormalidade das propriedades do músculo liso presente nas vias, incluindo a
sensibilização do Ca2+, mediada por agonistas (Martin et al., 2000; Chiba et al.,
2010).
Em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica, foi
demonstrado que a inibição não específica da produção de óxido nítrico (NO)
13
potencializou a brococonstrição e o remodelamento das vias aéreas e, por
outro lado, o bloqueio do NO derivado da óxido nítrico sintase induzida (iNOS),
atenuou a constrição das vias aéreas, a inflamação e o processo de
remodelamento, sugerindo efeito pró-inflamatório da iNOS e possíveis efeitos
protetores das óxido nítricos sintases constitutivas (cNOS) (Prado et al., 2006).
Isto implica na explanação do motivo pelo qual a deficiência de NO derivado
das cNOS também pode determinar a hiperresponsividade das vias aéreas
(Boer et al., 2001; Prado et al., 2006).
De acordo com estudos anteriores, tem sido demonstrado que a ativação
selectiva do NF-kB no epitélio das vias respiratórias também pode ser
suficiente para provocar a hiperresponsividade (Pantano et al., 2008).
Além da inflamação e do estresese oxidativo, o remodelamento das vias
aéreas também pode contribuir para a hiperresponsividade (Fixman et al.,
2007). O remodelamento parece estar relacionado com a diminuição da função
pulmonar observada em pacientes asmáticos (Kariyawasam et al., 2007;
Southam et al., 2007; Kermode et al., 2011).
1.1.3.2 Remodelamento
O conceito de remodelamento das vias aéreas na asma foi proposto
somente na década de 90 (Bousquet et al., 1992). No remodelamento ocorre
modificação das propriedades normais do tecido, tanto em relação à
composição quanto em sua organização estrutural (Halwani et al., 2010). Além
disso, ocorre descamação epitelial das vias aéreas, alteração no depósito /
degradação dos componentes da matriz extracelular (fibras colágenas e elásticas),
14
espessamento da membrana basal, hipertrofia e hiperplasia da musculatura lisa e
aumento das células caliciformes e das glândulas submucosas (Kumar, 2001).
Considerado como uma importante característica em asmáticos, o
remodelamento pode contribuir para a progressão da limitação ao fluxo aéreo,
influenciar na gravidade dos sintomas e na progressão da doença, permitindo
também diferenciar pacientes com asma grave persistente daqueles com a
doença moderada (Postma e Timens, 2006).
Atualmente, uma série de evidências sugere que a inflamação das vias
aéreas e o remodelamento não ocorrem somente em vias aéreas centrais, mas
também no pulmão distal e parênquima pulmonar (Angeli et al., 2008; Righetti
et al., 2014). As vias aéreas distais são altamente reconhecidas como
determinante na obstrução ao fluxo aéreo e a inflamação distal possui papel
crucial na hiperresponsividade, na asma noturna e em exacerbações (Calhoun,
2003).
A maioria dos processos inflamatórios crônicos está comumente
relacionada a um processo de dano e cicatrização tecidual, esta última resulta
no reparo e substituição de células mortas ou danificadas por células viáveis. O
reparo envolve dois processos distintos, tais como, regeneração (substituição
das células mortas por outras do mesmo tipo) e substituição (por tecido
conjuntivo). Assim, os processos inflamatórios crônicos podem desencadear
ampla variedade de consequências, desde restituição completa ou parcial da
estrutura acometida até processos de fibrose (Vignola et al., 2003).
Assim, a inflamação persistente das vias aéreas pode ser um dos fatores
mais importantes que contribui para o remodelamento. Diversas células do
infiltrado inflamatório estão envolvidas nesse processo (eosinófilos, células T,
15
mastócitos, epiteliais, macrófagos, células musculares lisas e fibroblastos) e
participam da regulação e desregulação da lesão tecidual e processo de reparo
(Halwani et al., 2010; Cho, 2011).
As células musculares lisas podem participar da inflamação crônica das
vias aéreas por interação com derivados de citocinas Th1 e Th2 para modular
atividade quimiotática dos eosinófilos, linfócitos T ativados, monócitos e
macrófagos, além de alterar o ambiente da matriz extracelular e orquestrar
eventos importantes no remodelamento (Hirst, 1996).
A hiperplasia do músculo liso das vias aéreas e deposição de matriz
extracelular demonstraram estar evidentes em asmáticos e em modelos
animais (Woodruff et al., 2004; Fixman et al., 2007). A Figura 2 mostra o
mecanismo de hiperresponsividade brônquica baseado no remodelamento.
Figura 2: Vias aéreas normais (A) e vias aéreas onde a inflamação crônica e os mecanismos de reparo contribuem para mudanças estruturais permanentes (B). Dentre as mudanças estão: (1) aumento do muco; (2) hiperplasia epitelial brônquica; (3) fibrose subepitelial; (4) infiltrado inflamatório persistente; (5) neovascularização; (6) espessamento d músculo liso; (7) espessamento da adventícia das vias aéreas (Adaptado de Ramos-Barbón et al., 2004).
As células T participam na fibrose pulmonar por intermédio de seu efeito
sobre as células pulmonares (TCD8+). Estas células contribuem para
A B
16
mudanças estruturais das vias aéreas por direcionar o recrutamento e a
ativação de células inflamatórias (TCD4+) (Kay, 1997).
Os mastócitos estão envolvidos no processo de fibrose, pois eles liberam
uma protease, a triptase, que estimula a migração e proliferação de fibroblastos
e de células da musculatura lisa (Akers et al., 2000).
Os fibroblastos participam do processo de remodelamento produzindo
fibras colágenas, elásticas e reticulares, bem como proteoglicanos e
glicoproteínas da matriz extracelular (Sheppard e Harrison, 1992). Entre os
fatores que afetam a proliferação de fibroblastos e a produção de matriz
extracelular, encontra-se o fator de transformação do crescimento beta (TGF-β)
(Murdoch e Lloyd, 2010).
Os eosinófilos também possuem papel fundamental no remodelamento por
causar lesão epitelial e estimular a fibrogênese através da produção de TGF-β
(Vignola et al., 2003).
Os neutrófilos, por sua vez, participam desse processo por liberarem
vários tipos de enzimas, incluindo protease e elastase (que degradam a
matriz), radicais livres de oxigênio e citocinas (Lloyd e Oppenheim, 1992).
A reação rápida aos alérgenos inalatórios e a taxa de rotatividade do
epitélio também são características da asma. Além disso, o epitélio das vias
aéreas participa do remodelamento por produzir fatores de crescimento
epiteliais específicos das células e regulação da diferenciação de células
caliciformes (Fixman et al., 2007).
As células epiteliais brônquicas, inicialmente afetadas pela lesão
brônquica, podem ser capazes de iniciar a reparação da área lesada,
produzindo fatores quimiotáticos. Na asma, as células epiteliais podem
17
expressar marcadores de membrana (moléculas de adesão - HLA-DR e ICAM-
1) e liberar moléculas que participam no reparo das vias aéreas, tais como,
fibronectina, fatores de crescimento (EGF, FGF e PDGF), citocinas e
quimiocinas (Rosenberg et al., 2007; Tagaya e Tamaoki, 2007).
Além disso, em um modelo de asma com a inibição específica do NF-kB
no epitélio, foi observada redução da produção de muco, fibrose e da
responsividade das vias aéreas, sugerindo que o NF-kB desempenham um
papel central no remodelamento do epitélio das vias aéreas (Broide et al.,
2005).
Por fim, existem proteases e inibidores de proteases envolvidos no
processo de remodelamento das vias aéreas. Como parte da resposta
inflamatória na asma, enzimas proteolíticas, como as MMPs, que uma vez
ativadas são rapidamente inibidas por uma família de inibidores teciduais
específicos (TIMP), classificados em TIMP 1, 2, 3 e 4 (Gueders et al., 2006). O
desequilíbrio entre MMPs e seus inibidores contribuem para o dano tecidual e
algumas das características de remodelamento observadas na asma (Vignola
et al., 2003).
As MMP-2, MMP-8, MMP-9 e MMP-12 estão envolvidas na asma (Cataldo
et al., 2003). As MMPs 2 e 9 são conhecidas como gelatinases, por serem
capazes de degradar colágenos tipos I, IV e V, gelatina, elastina, proteínas,
fibronectina e outros componentes da matriz extracelular. A expressão de
MMP-2 e MMP-9 encontraram-se aumentadas nos quadros agudos de asma,
porém na asma grave, apenas a MMP-9 apresentou níveis elevados no sangue,
no fluido do lavado broncoalveolar (FLBA), no escarro e em biópsias de asmáticos
(Atkinson e Senior, 2003).
18
No pulmão, a MMP-9 pode ser produzida por macrófagos e por uma
variedade de células estromais e epiteliais (Kelly et al., 2000; Atkinson e Senior,
2003; Vermeer et al., 2009). A MMP-9 pode ativar mecanismos de reparo
inadequados, como a produção de TGF-β, aumentando a síntese de colágeno
pelos fibroblastos, que por sua vez, estimula os processos fibróticos (Lee et al.,
2001).
O inibidor tecidual de metaloproteinases de matriz 1 (TIMP-1) parece ser o
mais importante na asma (Cataldo et al., 2003). Autores justificam que a
degradação dos componentes da matriz extracelular, pelas MMPs e outras
proteinases, ocorre na fase imediata da asma e a produção aumentada de
TIMP-1 pode ocorrer na fase tardia deste processo (Chiappara et al., 2001;
Vignola et al., 2003).
Como vimos acima, o remodelamento aparentemente é um processo
prejudicial decorrente da asma, entretanto, outros autores têm considerado que
ele ocorra na tentativa de proteção dos pulmões (James e Wenzel, 2007).
Assim, elucidar os mecanismos envolvidos no processo de remodelamento,
incluindo a função das células estruturais na asma pode ser um importante
caminho para a busca de intervenções terapêuticas efetivas (Halwani et al.,
2010).
1.1.3.3 Óxido nítrico e estresse oxidativo
A molécula de NO, por muitos anos, foi considerada um nocivo poluente
ambiental proveniente da fumaça de cigarros (Normam e Keith, 1965). O NO era
considerado um destruidor da camada de ozônio, provável carcinógeno e
19
precursor da chuva ácida. Descobriu-se na década de 90 que o NO participava
de múltiplas funções biológicas, desde digestão e regulação da pressão
sanguínea até ação contra microorganismos (Culotta e Koshland, 1992).
O NO é considerado um radical livre e apresenta um elétron ímpar, capaz
de interagir com outras moléculas, como, oxigênio (O2), superóxido (O2-) ou
metais de transição, formando os compostos reativos nitrogenados, que
exercem funções fisiológicas e participam da destruição de microorganismos
(Ricciardolo, 2003).
Esta molécula é gerada a partir da quebra do grupo molecular guanidino
de aminoácido L-arginina por meio de oxidação enzimática onde ocorre a
liberação de NO e da L-citrulina (Chapman e Choi, 2001; Ignarro, 2002). A L-
arginina, precursora do NO, é transportada para dentro das células através do
sistema de transporte de aminoácido catiônico (CAT) e pode ser metabolizadas
através das óxido nítrico sintases (NOS) ou pela arginase (Ricciardolo et al.,
2004). A formação do NO pode ocorrer através de três isoformas das NOS, tais
como, a óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), a iNOS e a óxido nítrico sintase
endotelial (eNOS) (Rodway et al., 2009).
Os primeiros estudos relatando a presença aumentada de NO no ar
exalado de pacientes asmáticos foram publicados na década de 90 (Persson et
al., 1990; Alving et al., 1993). A partir destas descobertas, a presença de NO
no ar exalado começou a ser estudada como ferramenta de avaliação de
diversas doenças pulmonares, principalmente a asma (Pendharkar e Mehta,
2008).
Foi observado que na asma ocorre aumento da concentração de NO
exalado, consequentemente, há excesso de produção de compostos reativos
20
nitrogenados, que pode causar efeitos deletérios. As alterações são
conhecidas como estresse oxidativo, que são responsáveis por modificações
na função celular, potencializando a resposta inflamatória (Ricciardolo et al.,
2004).
O NO encontrado em altas concentrações na asma é derivado da enzima
iNOS, a qual está presente em várias células inflamatórias e determina
hiperemia, edema e exsudação, contribuindo para o estreitamento das vias
aéreas (Ricciardolo et al., 2004). Além disso, pode alterar aspectos importantes
na fisiopatologia da asma, tais como, recrutamento de células inflamatórias
(Prado et al., 2005a,b; Angeli et al., 2008; Starling et al., 2009),
hiperresponsividade das vias aéreas (Prado et al., 2005b; Marques et al., 2012)
e remodelamento (Ricciardolo et al., 2004; Prado et al., 2006 e 2011).
A iNOS é regulada por mediadores, tais como, TNF-ɑ, IFN-γ, IL-1β,
lipopolissacarídeo (LPS) e podem produzir altas quantidades de NO
comparadamente a cNOS (Sugiura e Ichinose, 2011).
Após a exposição ao estresse oxidativo, as células inflamatórias e as
células do epitélio respiratório geram O2-. Por aumento da expressão de iNOS,
altas quantidade de NO são formadas através da ativação da nicotinamida
adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH). Assim, o O2 na presença de radicais
livres reage com o superóxido produzindo peroxinitrito (ONOO-), um potente
oxidante capaz de inibir a função enzimática, causar danos em DNA, induzir
peroxidação lipídica e aumentar a susceptibilidade celular à radiação, metais
tóxicos e agentes quimioterápicos (Pryor et al., 1995; Rodway et al., 2009).
A peroxidação da membrana celular lipídica é responsável pela formação
de compostos bioativos, conhecidos como isoprostanos (Morrow, 2006). A
21
Figura 3 descreve a peroxidação lipídica, onde os fosfolipídios da membrana
celular são hidrolisados pela enzima fosfolipase, produzindo o ácido
araquidônico, que pode sofrer peroxidação por duas vias, tais como, enzimática
(ciclo-oxigenases e as lipoxigenases) e a via não-enzimática (espécies reativas
de oxigênio - ROS, espécies reativas de nitrogênio - RNS, metais de transição
e outros radicais livres). Dentre os produtos finais da peroxidação lipídica
mediada por espécies reativas estão o hidroxinonenal, o malondialdeído e os
isoprostanos (Lima e Abdalla, 2001).
Figura 3: Peroxidação lipídica - o ácido araquidônico pode ser metabolizado por via enzimática, através das ciclo-oxigenases e das lipoxigenases, ou por via não-enzimática, através de processos de oxirredução (Adaptado de Cavalcante e Bruin, 2009).
Dentre os isoprostanos, o 8-isoprostano tem sido o mais estudado por
participar de diferentes funções biológicas e mediar determinados aspectos da
lesão oxidativa (Milne et al., 2008). A via de formação dos isoprostanos tem
capacidade para produzir diferentes estruturas isoméricas, das quais o 8-iso-
PGF2ɑ é melhor caracterizado (Lawson et al., 1999).
A concentração de 8-iso-PGF2ɑ encontrou-se aumentada de 3 a 4 vezes em
asmáticos persistentes em comparação a indivíduos saudáveis, em um estudo de
22
Wood et al. (2000). Além disso, sabe-se que altas quantidades de 8-iso-PGF2ɑ
causam aumento da resistência pulmonar, indicando que este pode ser um
mediador da limitação ao fluxo aéreo na asma (Shiraki et al., 2008).
Além disso, a ROS pode induzir a formação de quimiocinas e citocinas por
intermédio da produção do NF-kB em células epiteliais brônquicas, que
independente do estímulo, participa do estresse oxidativo e do aumento de
Ca2+ intracelular para sua ativação (Xiao, 2004; Tripathi e Aggarwal, 2006).
O NF-kB tem sido implicado na patogênese da asma tanto em modelos
experimentais, quanto em pacientes asmáticos (Hart et al., 1998; Poynter et al.,
2002). Entre os vários fatores de transcrição, o NF-kB é a melhor opção dentre os
genes pró-inflamatórias e está associado a hiperresponsividade das vias aéreas em
um modelo de doença alérgica (Donovan et al, 1999).
1.1.4 Manejo e tratamentos
Os objetivos no tratamento da asma são: controle dos sintomas e redução
no risco de exacerbações. Para os sintomas serem estabilizados, deve haver
controle das limitações clínicas e redução dos futuros riscos. As limitações
clínicas devem ser primeiramente avaliadas em relação às quatro últimas
semanas e incluem sintomas, necessidade de medicação de alívio, limitação
de atividades físicas e intensidade de limitação do fluxo aéreo. A prevenção de
riscos futuros inclui redução das exacerbações, perda acelerada da função
pulmonar e efeitos adversos dos tratamentos disponíveis (Diretrizes Brasileiras
para o Manejo da Asma, 2012; GINA, 2015).
23
A asma tem importante impacto na vida dos pacientes, de seus familiares
e no sistema de saúde público, assim, é necessário que seu controle seja
adequado. Seu manejo está fundamentado em cinco pilares: 1) parceria
médico-paciente; 2) identificação e controle dos fatores de risco; 3) avaliação,
monitoramento e manutenção do controle da asma; 4) prevenção e controle de
riscos futuros e 5) consideração de situações especiais no manejo da asma.
Fazem parte do tratamento da asma, o uso correto da medicação, a
modificação dos fatores de risco e a realização de estratégias e terapias não
farmacológicas (GINA, 2015).
A terapia atual para a asma envolve o uso de anti-inflamatórios e
broncodilatadores. A combinação de corticosteróides inalatórios de curta ou longa
duração é considerada padrão-ouro para o controle de indivíduos com asma de leve
a grave (Holgate e Polosa, 2008; Bergeron et al., 2010).
Os corticosteróides são capazes de atravessar rapidamente a membrana
celular e se ligar a receptores de glicocorticóides no citosol ativando, assim, a
translocação dos glicocorticóides para o núcleo. No núcleo, liga-se a
reguladores de genes específicos para induzir a expressão de genes
envolvidos na regulação da inflamação das vias aéreas (Rhen e Cidlowski,
2005; Jang, 2012). Apesar do corticosteróide apresentar mecanismos anti-
inflamatórios e ser altamente eficaz no controle da asma, cerca de 10 a 15%
dos asmáticos não apresentam melhora dos sintomas (Brannan, 2010).
A asma grave é aquela que requer tratamento com a maior parte das
opções terapêuticas disponíveis para a doença. Fisiopatologicamente, na asma
grave, há aumento de neutrófilos, maior envolvimento das vias aéreas distais e
maiores mudanças estruturais (GINA, 2015). Dentre as mudanças estruturais
24
que ocorrem na asma grave, está o remodelamento das vias aéreas, que
ocorre devido ao processo inflamatório crônico, onde as MMPs, principalmente
a MMP-9, possuem papel fundamental (Mattos et al., 2002). O remodelamento
está associado à pior prognóstico clínico e risco de morbidade e mortalidade
(Bergeron et al., 2010).
Considerando que alguns dos asmáticos graves necessitam de
corticosteróides regularmente, existe uma preocupação em relação aos efeitos
colaterais sistêmicos e locais desta droga (Brannan, 2010). Dentre os efeitos
observados estão: osteoporose, hipertensão arterial, diabetes, supressão
adrenal hipotalâmico-pituitária, obesidade, catarata, glaucoma, afinamento da
pele, levando a estrias cutâneas e fraqueza muscular (GINA, 2015).
Os pacientes que não possuem controle dos sintomas, muitas vezes
necessitam de doses inalatórias maiores de corticosteróides e associação com
outras medicações de controle, como o β2-agonista, anti-leucotrienos e teofilina
(Leung e Bloom, 2003).
O β2-agonista é o broncodilatador mais importante no tratamento da
asma, dentre eles estão o de curta duração e de longa duração (Amon et al.,
2006). Eles agem em receptores β-adrenérgicos e participam na formação de
adenosina monofosfato cíclica através da ativação de proteínas G, causando o
relaxamento da musculatura lisa das vias aéreas. No entanto, há estudos que
sugerem que o tratamento regular com esse medicamento pode aumentar as
taxas de exacerbações e de morte em asmáticos (Martinez et al., 2005;
Salpeter et al., 2006).
25
Os moduladores de leucotrienos apresentam propriedades anti-
inflamatórias e são eficazes para a resposta asmática precoce e tardia, assim
como os agentes anticolinérgicos (Dykewicz, 2001; Perry et al., 2004).
Resumidamente, para a maioria dos pacientes asmáticos, a terapia com
broncodilatadores e corticosteróides é extremamente eficaz para o tratamento
da doença (Fernandes et al., 2007). Entretanto, cerca de 15% dos asmáticos
não respondem bem ao tratamento e sofrem com os sintomas incontroláveis
(Amon et al., 2006), assim, a busca por novas terapias eficazes para o
tratamento da asma se faz necessária (Fernandes et al., 2007).
1.1.5 Modelos experimentais de asma
A princípio, deve ser considerado que não há um verdadeiro “modelo de
asma”, uma vez que as complexidades da doença humana não são totalmente
reprodutíveis em nenhum animal. O que existem são modelos de inflamação
alérgica, de respostas imediatas e/ou tardias, quando associados no mesmo
animal e em cronologia adequada, constituem uma representação limitada de
características da doença (Vargaftig, 1999).
Para os modelos experimentais serem adequados no estudo da asma,
deve haver reatividade das vias aéreas, produção de IgE, perfil de citocinas,
resposta imunológica e remodelamento (Bile e Green, 2000).
Pequenas espécies, como os camundongos, estão sendo usados em
estudos de asma, pois produzem IgE que é o anticorpo anafilático primário.
Além disso, existem numerosos reagentes imunológicos e linhagens puras, são
26
de fácil criação, têm período gestacional curto e são animais relativamente
baratos (Shin et al., 2009).
Modelos experimentais de inflamação pulmonar alérgica crônica já
demonstraram ser capazes de reproduzir características relacionadas ao
processo inflamatório, reatividade de vias aéreas, estresse oxidativo e
remodelamento de matriz extracelular (Tibério et al., 1997; Prado et al., 2006;
Ruiz-Schütz et al., 2009; Prado et al., 2011).
1.2 Inibidores de proteinases
A proteinase é uma enzima que conduz a proteólise, ou seja, começa o
catabolismo protéico por hidrólise das ligações peptídicas que unem os
aminoácidos na cadeia polipeptídica, formando uma molécula de proteína.
Resumidamente, as proteinases quebram proteínas (Puente et al., 2003).
Os inibidores de proteinases vêm sendo estudados amplamente em
microorganismos, animais e plantas. Os inibidores estão presentes no plasma
de humanos em larga concentração. Cerca de 10% das proteínas plasmáticas
são capazes de bloquear a atividade das proteinases. A incapacidade de
controlar as proteinases bacterianas e parasitárias por esses inibidores pode
desencadear doenças (Richardson, 1991).
As plantas, principalmente suas sementes, possuem grande quantidade
de inibidores de proteinases, que são essenciais para a germinação, atuando
principalmente, como proteínas de reserva e na defesa contra herbívoros e
patógenos (Shewry et al., 1995).
27
Os inibidores de proteinases isolados de plantas, devido à variada
especificidade de inibição enzimática que apresentam, permitem aplicações
úteis para uma melhor compreensão de mecanismos biológicos, tais como,
coagulação sanguínea e fibrinólise. Estudos demonstraram que estas proteínas
podem desempenhar um papel importante na fisiopatologia de doenças
humanas, dentre elas, inflamações, hemorragias e câncer (Oliva et al., 2009).
Os inibidores de proteinases são compostos de origem vegetal ou animal
que bloqueiam a hidrólise por uma enzima de um determinado substrato. Logo,
os inibidores de natureza protéica são capazes de produzir complexos com
enzimas, de tal modo a inibir as atividades catalíticas. Eles atuam em grupos
específicos para cada classe de enzimas, tais como, inibidores de
cisteínoproteinases, serinoproteinases, metaloproteinases,
asparticoproteinases (Richardson, 1991).
Inibidores de serinoproteinases pertencem a uma das classes mais
estudadas e melhor caracterizadas. Deste grupo fazem parte os inibidores das
enzimas da cascata da coagulação, como a trombina e a calicreína plasmática
humana e os inibidores das enzimas digestivas, como a tripsina e a
quimotripsina (Barret et al., 2004).
Os inibidores de proteinases são classificados em famílias, segundo sua
estrutura primária molecular. As duas principais famílias de inibidores
presentes em vegetais são Kunitz (KNIs) e Bowman-Birk (BBIs). A maioria dos
inibidores do tipo Kunitz são proteínas com massa molecular em torno de 20
kDa e possuem baixo teor de cisteína, formando duas pontes dissulfeto (Oliva
et al., 2000). Apresentam uma ou duas cadeias polipeptídicas e um único sítio
reativo para proteinases, localizado na alça formada pela ponte dissulfeto
28
próxima ao N-terminal da molécula. Geralmente, este grupo de inibidores
possui o mesmo sítio reativo (Arg-Ser) e os resíduos vizinhos a este centro
mostram alto grau de similaridade (Richardson, 1991).
Foi demonstrado em estudos que alguns inibidores podem apresentar ou
não pontes de dissulfetos, além de não possuírem cisteínas, por exemplo, o
BrTI (Bauhinia rufa Trypsin inhibitor) e o BbKI (Bauhinia bauhinioides Kallikrein
inhibitor) (Nakata et al., 2006; Oliva et al., 2010).
A inibição das proteases ocorre por inibidores protéicos havendo ligação
específica e restrita ao sítio reativo, sendo irreversível ou reversível (Bode e
Humber, 2000). Shigetomi et al. (2010) observaram que inibidores de
proteinases podem prevenir a inflamação, lesões teciduais e posteriormente,
promover diminuição no remodelamento de tecidos. Em modelos de asma,
alguns inibidores de proteinases foram testados e seus potenciais efeitos anti-
inflamatórios nas vias aéreas foram demonstrados (Chen et al., 2006; Lin et al.,
2014; Oliva et al., 2015).
Neste trabalho, estudaremos um inibidor de serinoproteinase, da família
Kunitz, que apresenta massa molecular aproximada de 20 kDa. Dentre os
indibidores desta família estudados, está o EcTI (Enterolobium contortisiliquum
Trypsin inhibitor), que é capaz de inibir a tripsina, quimotripsina, calicreína
plasmática, plasmina, elastase de neutrófilos humano e fator Xlla (Batista et al.,
1996).
Recentemente (2013), no laboratório da Profa. Dra. Maria Luiza V. Oliva,
do Departamento de Bioquímica da UNIFESP/EPM foi caracterizada a
estrutura de uma proteína descrita inicialmente como lectina, denominada
Crataeva tapia Bark Lectin (CrataBL). Os estudos demonstraram que se trata
29
de uma glicoproteína que, além da atividade lectínica, é capaz de inibir
serinoproteinases e de se ligar à heparina (Ferreira et al., 2013).
As plantas têm sido fonte de medicamentos para os seres humanos desde
a pré-história e é notável que nas últimas quatro décadas reapareceu o
interesse de estudar sua utilização em medicamentos. Produtos naturais
derivados de plantas têm sido caracterizados e identificados como novos
compostos químicos com importância terapêutica. As lectinas são proteínas
que podem reconhecer e se ligar reversivelmente a hidratos de carbono ou
outras substâncias derivadas de açúcar (Correia et al., 2008).
Açúcares, apesar do seu pequeno tamanho, podem armazenar ou
transmitir informação dentro ou entre as células. Devido à sua interação
específica de hidratos de carbono, lectinas têm sido ferramentas moleculares
versáteis e úteis para o estudo de glicoconjugados sobre a superfície da célula.
Assim, as lectinas são consideradas excelentes candidatas para serem
exploradas como agente terapêutico (Neumann et al., 2004; Bitencourt et al.,
2008).
Ao interagirem com os carboidratos, as lectinas aglutinam células animais
e/ou vegetais precipitando polissacarídeos, glicoproteínas ou glicolipídeos, sem
causar alterações em sua estrutura. Com isso, foi estabelecido um método de
detecção de presença de lectina em uma amostra por ensaio de
hemaglutinação, utilizando eritrócitos de diferentes espécies de animais,
formando ligações reversíveis (Oliveira et al., 2008).
30
1.2.1 Crataeva tapia Bark Lectin
A Crataeva tapia é uma árvore (Figura 4A) pertencente à família
Capparaceae, que é conhecida popularmente como trapiá, tapiá ou pau d’alho.
Sua ocorrência vai desde o estado de Pernambuco até São Paulo, nos biomas
de mata pluvial Atlântica e no Pantanal Matogrossense. A árvore Crataeva
tapia, varia de 5 a 12 metros de altura, sua madeira é utilizada na construção
civil, para forros, caixotaria e confecção de canoas, os frutos são utilizados no
Pantanal Matogrossense como isca do peixe Pacu e suas flores são
ornamentais (Lorenzi, 1998).
Os frutos, cascas (Figura 4B) e folhas da Crataeva tapia são consideradas
de valor medicinal, sendo usados como tônico estomático, antidisentérico,
vermífugo e o fruto no combate às infecções do trato respiratório (Cruz, 1982).
O extrato de sua casca é usado popularmente para o tratamento de diabetes,
dor de estômago, febre, distúrbios do trato urinário e artrite, promovendo
diminuição do processo inflamatório (Sharon e Lis, 2001).
Figura 4: A: Árvore Crataeva tapia. B: Casca da árvore Crataeva tapia (Cruz, 1982).
A B
31
A atividade lectínica da Crataeva tapia é inibida pelos açúcares galactose
e monose e pela glicoproteína ovalbumina. Foi observado que a CrataBL
aglutina eritrócitos de humanos, galinha e coelhos e sua atividade
hemaglutinante não foi alterada após administração de Ca2+, Mn2+ e Mg2+
(Araújo et al., 2011).
As estruturas primária (Figura 5A) e a terciária (Figura 5B) da CrataBL
foram determinadas recentemente, onde ambas confirmaram similaridade com
membros da família Kunitz de inibidores de proteinases, apresentando os
mesmos resíduos de aminoácidos em posição conservadas, inclusive as
pontes de disulfetos (Ferreira et al., 2013). A sua estrutura terciária apresenta
predominantemente folhas betas, como é a característica dos inibidores de
proteinase da família Kunitz de planta (Neuhof et al., 2003).
32
Figura 5A: Estrutura primária da CrataBL – Comparação da sua sequência de aminoácidos com outros inibidores de proteinases. BvTI – Bauhinia variegata Trypsin inhibitor, BuXI – Bauhinia ungulata factor-Xa inhibitor (Oliva et al., 2003); EcTI (Batista et al., 2001); DrTI – Delonix regia Trypsin inhibitor (Pando et al., 2001); BrTI (Nakata et al., 2006); BbCI – Bauhinia bauhinioides Cruzipain inhibitor (de Oliveira et al., 2001); BbKI (Oliva et al., 2001). Os resíduos de cisteína estão destacados em cinza e os aminoácidos altamente conservados estão demonstrados em preto. Os sítios de glicosilação estão indicados com asteriscos.
33
Figura 5B: Estrutura terciária da Crataeva tapia Bark Lectin – CrataBL (Ferreira et al., 2013).
A função inibitória da CrataBL foi confirmada pela interferência nas
atividades das serinoproteinases tripsina (Kiapp = 43 μM) e Fator Xa (Kiapp 8,2
μM) (Ferreira et al., 2013). No entando, não interfere na atividade de calicreína
plasmática humana, calicreína plasmática porcina, elastase de neutrófilo
humano, papaína, plasmina e quimiotripsina. Os autores ainda sugerem que a
CrataBL liga-se com glicosaminoglicanos (Ferreira et al., 2013) (Figura 6), que
são compostos negativos ligados à superfície das células, gerando assim
produtos, tais como, sulfato de condroitina, ácido hialurônico e heparina (Nader
et al., 2004).
Figura 6: Ligação da CrataBL à glicosaminoglicanos e seus produtos: sulfato de condroidinta, ácido hialurônico e heparina (Ferreira et al., 2013).
34
Nesse enredo, é importante considerarmos que a heparina, além de sua
propriedade anticoagulante, amplifica a ação do inibidor de trombina (Walenga
et al., 2005) e modula a atividade de proteinases, principalmente as catepsinas
(Almeida et al., 2001).
As catepsinas podem ativar a pro-uroquinase, que irão ativar os
plasminogênios, constituindo as plasminas, que por sua vez, ativam as
proteinases, principalmente as MMP-2 e MMP-9. A plasmina também pode
ativar a elastase, que consequentemente ativa mais metaloproteinases e
catepsinas. Desta forma, a heparina tem importante papel na amplificação na
ativação da rede de proteinases superativadas em processos fisiopatológicos
(Jedeszko e Sloane, 2004).
1.3 Justificativa para o estudo
A asma é considerada um problema de saúde pública com grandes
potenciais complicadores e pertinentes da diminuição da qualidade de vida do
indivíduo. Assim, classifica-se de suma importância a busca de novas opções
terapêuticas que proporcionem melhor controle dos quadros asmáticos,
salientando que para isto, é imprescindível estabelecer bons modelos
experimentais de inflamação e remodelamento pulmonar. Nota-se que não há
trabalhos que avaliem a importância da proteína bifuncional CrataBL no
controle da inflamação pulmonar alérgica crônica. Deste modo, visamos
contribuir para a investigação de novas alternativas terapêuticas para asma, bem
como para o melhor entendimento da fisiopatologia da mesma.
2 OBJETIVOS
36
2 OBJETIVOS
Os objetivos do presente estudo foram investigar os efeitos do tratamento
com o inibidor de proteinase CrataBL em camundongos a partir de um modelo
experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica, onde realizamos:
1. Obtenção de quantidades suficientes da proteína bifuncional CrataBL;
2. Avaliação da mecânica pulmonar respiratória;
3. Avaliação do fluido do lavado broncoalveolar;
4. Avaliação da densidade de eosinófilos;
5. Avaliação das células IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-γ positivas nas vias
aéreas e nos septos alveolares;
6. Avaliação dos níveis de concentração de IL-4, IL-5 e IFN-γ a partir do
método ELISA;
7. Avaliação das alterações da matriz extracelular, incluindo a fração de
volume de fibras colágenas e elásticas, células MMP-9, TIMP-1 e
TGF-β positivas nas vias aéreas e nos septos alveolares;
8. Avaliação da resposta ao estresse oxidativo através da
quantificação de células iNOS e NF-kB positivas e fração de
volume de 8-iso-PGF2α nas vias aéreas e nos septos alveolares;
9. Avaliação da anafilaxia cutânea passiva.
Além disso, objetivamos correlacionar as alterações funcionais (Rrs e Ers)
e as respostas inflamatórias, de remodelamento e de estresse oxidativo.
37
3 MATERIAL E MÉTODOS
38
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Neste estudo foram utilizados trinta e dois camundongos Balb/c, padrão
sanitário SPF (Specific Pathogen Free), do gênero masculino, entre seis e sete
semanas, obtidos do Biotério Central da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo. Os animais foram manejados de acordo com as
orientações do “Guia de cuidados e uso de animais de laboratório” publicado
pelo National Institutes of Health (NIH, 2002).
Todos os protocolos e procedimentos utilizados neste trabalho foram
aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de São Paulo, SP, Brasil
(Protocolo de Pesquisa número 187/12).
3.2 Material vegetal e purificação da CrataBL
A casca da Crataeva tapia (Division Magnoliophyta, Class Magnoliopsida,
Subclass Dilleniidae, Order Capparales, Family Capparaceae) foi coletada na
cidade do Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. A casca foi seca
ao ar, triturada (malha 40) e armazenada a 4 ºC.
A lectina CrataBL foi purificada como descrita previamente por Araújo et
al. (2012) e foi realizada no laboratório de Bioquímica da UNIFESP, em
colaboração da Profa. Dra. Maria Luiza V. Oliva.
A casca em pó (10 g) foi suspenso em 0,15 M NaCl (100 mL). O
sobrenadante claro (extrato bruto) foi obtido após homogeneização em agitador
amagnético (16 horas a 4 ºC), seguido de filtração através de uma gaze e
39
centrifugação (4000 x g por 15 minutos). O extrato foi avaliado para
concentração de proteínas e atividade hemaglutinante. As proteínas solúveis
em extrato bruto foram fracionadas com sulfato de amônio segundo Green e
Hughes (1955).
A fração precipitada de 30-60% (30-60 F) foi submetida à diálise
(membrana cortada a 3500 Da a 4 ºC), água destilada (2 horas), seguido por
10 mM de tampão de citrato-fosfato, pH 5,5 (2 horas). Esta fração foi carregada
(11 mg de proteína, atividade hemaglutinante de 1024) numa CM-celulose
(Sigma-Aldrich, EUA), coluna (5,2 cm x 1,6 cm) equilibrada com tampão de
citrato-fosfato 10 mM pH 5,5 e taxa de fluxo de 20mLh-1.
As proteínas não absorvidas foram eluídas com uma solução de equilíbrio
até a absorvência a 280 nm ser menor que 0,05. Na sequência da atividade
adsorvida hemaglutinante (CrataBL) foi eluído com 0,5 M de NaCl.
A concentração de proteína foi avaliada de acordo com Lowry et al. (1951)
utilizando albumina de soro bovino (31,25–500 μg mL−1) como padrão. A dose
utilizada (2 mg/kg) foi a mesma que a do inibidor de proteinase BbCI que está
sendo estudado pelo grupo (Neuhof et al., 2003; Oliveira et al., 2010).
3.3 Grupos experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de acordo
com o protocolo a que foram submetidos (n = 8 para cada grupo):
1. C: duas injeções intraperitonealmente com 6 mg de Hidróxido de Alumínio e
cloreto de sódio 0,9% e quatro inalações com cloreto de sódio (0,9%);
2. OVA: duas injeções intraperitonealmente com 50 μg ovalbumina e 6 mg de
40
Hidróxido de Alumínio e quatro inalações com solução de ovalbumina a 1%
diluída em 0,9% de cloreto de sódio;
3. C+CR: duas injeções intraperitonealmente com 6 mg de Hidróxido de
Alumínio e quatro inalações com cloreto de sódio (0,9%), tratados com 2
mg/kg de CrataBL;
4. OVA+CR: duas injeções intraperitonealmente com 50 μg ovalbumina e 6
mg de Hidróxido de Alumínio e quatro inalações com solução de
ovalbumina a 1% diluída em 0,9% de cloreto de sódio, tratados com
CrataBL.
3.4 Indução da inflamação pulmonar alérgica crônica
Para reproduzir o modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica, o
antígeno (ovalbumina) foi injetado via intraperitoneal (i.p) para induzir uma
sensibilização sistêmica e o mesmo antígeno foi administrado pelas vias
aéreas, o foco do processo inflamatório, por aerossol.
O protocolo de sensibilização e indução da inflamação pulmonar
alérgica crônica por ovoalbumina teve duração de 29 dias. Os camundongos
foram primeiramente imunizados por via i.pl com 50 μg de ovalbumina (Sigma
Aldrich, St. Louis, MO) e 6 mg de Hidróxido de Alumínio – Alumen (Pepsamar,
Sanofi-Synthelabo S.A., Rio de Janeiro, Brasil) em um volume total de 0,2 mL,
nos dias 0 e 14. O hidróxido de alumínio foi utilizado como adjuvante, pelo fato
de promover uma ativação mais intensa da resposta Th2, quando o sistema
imune é exposto ao antígeno (Brewer, 1999).
41
Nos dias 22, 24, 26 e 28 os animais foram colocados em uma caixa de
acrílico (30 cm x 15 cm x 20 cm) acoplada a um nebulizador ultrassônico (US –
1000, ICEL, São Paulo, Brasil) sendo submetidos à inalação com aerossol de
ovalbumina diluída em soro fisiológico estéril a 0,9% na concentração de 10
mg/mL (1%) durante trinta minutos.
Os camundongos do grupo C receberam o mesmo adjuvante por via
intraperitoneal e foram expostos a inalação com aerossol de cloreto de sódio a
0,9%, também por trinta minutos.
Os estudos de mecânica respiratória e histopatológicos foram realizados
vinte e quatro horas após o último desafio antigênico, ou seja, no dia 29 para
os animais que receberam a última sensibilização no dia 28.
A indução da inflamação pulmonar alérgica crônica foi realizada conforme
descrito previamente (Arantes-Costa et al., 2008; Toledo et al., 2011) e o
esquema do protocolo de sensibilização dos grupos experimetais está
representado na Figura 7.
Figura 7: Descrição do protocolo experimental. No dia 0 e 14 os animais dos grupos OVA e OVA+CR receberam injeção i.p com uma solução de 50 μg/mL de ovalbumina com 6 mg de Hidróxido de Alumínio (Alumen) e nos dias 22, 24, 26, 28 receberam inalação com ovalbumina (1%) diluída em 0,9% de cloreto de sódio. Os animais dos grupos C e C+CR receberam injeção i.p com 6 mg de Hidróxido de Alumínio e nos dias 22, 24, 26, 28 receberam inalação com cloreto de sódio (0,9%). No dia 29 foi realizada a avaliação da mecânica pulmonar respiratória.
42
3.5 Tratamento com CrataBL
Os camundongos dos grupos C+CR e OVA+CR receberam injeções por
via intraperitoneal (50 μL) de CrataBL durante sete dias consecutivos, duas
horas após a primeira inalação (dias 22 a 28). A dose utilizada foi de 2 mg/kg
de peso administrada em 0,2 mL (Neuhof et al., 2003; Oliveira et al., 2010).
Figura 8: Descrição do protocolo experimental. No dia 0 e 14 os animais dos grupos OVA e OVA+CR receberam injeção i.p com uma solução de 50 μg/mL de ovalbumina com 6 mg de Hidróxido de Alumínio (Alumen) e nos dias 22, 24, 26, 28 receberam inalação com ovalbumina (1%) diluída em 0,9% de cloreto de sódio. Os animais dos grupos C e C+CR receberam injeção i.p com 6 mg de Hidróxido de Alumínio e nos dias 22, 24, 26, 28 receberam inalação com cloreto de sódio (0,9%). Dos dias 22 a 28, os animais dos grupos C+CR e OVA+CR receberam injeções i.p de CrataBL (2 mg/kg) duas horas após o desafio inalatório com ovalbumina. No dia 29 foi realizada a avaliação da mecânica pulmonar respiratória.
3.6 Avaliação da mecânica pulmonar respiratória
Vinte e quatro horas após o último desafio, no dia 29, os animais foram
anestesiados com tiopental sódico (50 mg/kg por via intraperitoneal) e
traqueostomizados. Uma cânula de metal foi inserida através do orifício da
traqueostomia e fixada com fio de algodão ao redor da traqueia. Os animais
foram ventilados mecanicamente (Harvard 687, Harvard Apparatus, Holliston,
MA) num pletismógrafo de acrílico (120 ciclos por minuto, 10 mL/kg). Os sinais
de pressão traqueal e volume pulmonar foram adquiridos através de
43
transdutores diferenciais de pressão (Honeywell 163PC01D36, Freepot, IL) e
convertidos para uma placa analógica digital (DT01EZ, Data Translation,
Marlboro, MA).
Os valores de resistência e elastância do sistema respiratório foram
calculados utilizando a equação de movimento do sistema respiratório: Ptr (t) =
Rrs.V’ (t) + Ers.V (t). Onde (t) é o tempo, Ptr é a pressão traqueal, Rrs é a
resistência do sistema respiratório, Ers é elastância do sistema respiratório, V’
é o fluxo de ar e V é o volume do pulmão (Figura 9). Os valores de Rrs e Ers
foram obtidos na linha de base após a administração aerossol de metacolina
(3, 30 e 300 mg/mL, durante um minuto). Consideramos o valor da resposta
máxima de resistência (Rrs) e elastância (Ers) o qual foi obtido após a
administração de 300 mg/mL de metacolina.
Figura 9: Esquema demonstrando realização da mecânica pulmonar respiratória, onde: Fr – frequência respiratória, VC – volume corrente, (t) – tempo, Ptr – pressão traqueal, Rrs – resistência do sistema respiratório, Ers – elastância do sistema respiratório, V’ – fluxo de ar e V – volume do pulmão.
44
3.7 Avaliação do fluido do lavado broncoalveolar
Após a mecânica pulmonar respiratória, foi realizada a exsanguinação do
animal e em seguida, por uma cânula traqueal foi conectado a um sistema
composto por uma torneira de três vias, uma seringa de 1 mL e uma seringa de
3 mL.
Os pulmões foram gentilmente lavados com três injeções de 0,5 mL de
solução salina através da cânula traqueal. Após a coleta do fluido do lavado
broncoalveolar o material foi processado para análise microscópica.
Primeiramente o fluido recolhido foi centrifugado a 790 g durante dez minutos a
4 °C.
3.7.1 Contagem total e diferencial de células
O precipitado foi ressuspendido em 0,3 mL de cloreto de sódio (0,9%).
Desta solução foi retirado 20 µL para câmara de Neubauer. Na câmara foram
contadas as células dos quatro quadrantes, a soma desse resultado foi
corrigida pelo volume de soro fisiológico (0,3 mL), sendo o resultado
multiplicado por 104, gerando o resultado final, que é o número de células
totais, segundo a fórmula descrita na Figura 10A.
Foram utilizados 100 µL do sobrenadante, que foi colocado na centrífuga
(Cytospin) a 450 rpm durante 6 minutos para a obtenção das lâminas, que
foram coradas com um reagente rápido. A contagem diferencial das células foi
determinada por 300 leucócitos/lâmina e a diferenciação seguiram os critérios
hemocitológicos para diferenciação de polimorfonucleares, linfócitos e
45
macrófagos com o auxílio de um microscópio óptico com objetiva de imersão
de 1000 x (Figura 10B).
Figura 10: A: Na câmera de Neubauer acoplada em um microscópio, foram contadas as células dos quatro quadrantes e o número de células totais se deu a partir da utilização da fórmula demonstrada na figura. B: Foto da análise para contagem diferencial das células a partir da utilização de um microscópio óptico com objetiva de imersão e aumento de 1000 x.
3.8 Estudo morfométrico
Após avaliação da mecânica do sistema respiratório, exsanguinação e
retirada do fluido do lavado broncoalveolar, a caixa torácica dos animais foi
aberta, onde o coração e o pulmão dos animais foiram retirado em bloco. Os
pulmões foram fixados com formol a 4% e após vinte e quatro horas,
transferidas para etanol a 70%. As fatias cortadas dos pulmões foram
processadas para incorporação da parafina e, posteriormente foram obtidos
cortes histológicos de 4 μm de espessura.
As lâminas foram coradas com Luna (para análise de eosinófilos),
Resorcina-fucsina (para análise das fibras elásticas) e Picrosirius (para análise
das fibras colágenas (Direct Red 80, C.I. 35780, Aldrich, Milwaukee, WI, EUA).
Foram preparadas lâminas para imunohistoquímica para ser analisada a
expressão das seguintes substâncias: IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, TGF-β, MMP-9 e
46
NF-kB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), isoprostano (Oxford
Biomedical Research, Rochester Hills, MI, EUA), TIMP-1 e iNOS (LabVision,
NeoMarkers, Fremont, CA, EUA).
A análise morfométrica foi realizada com um microscópio óptico (CH30,
Olympus, Japão) com um retículo de retas e pontos (50 retas e 100 pontos)
acoplado à ocular, totalizando uma área de 104μm2, usando a técnica de
contagem de pontos e retas (Osmanagic et al., 2010). O retículo foi
posicionado no eixo broncoalveolar, a partir da base do epitélio. Cinco vias
aéreas foram selecionadas aleatoriamente de cada animal e três campos das
vias aéreas foram avaliados (Figura 11A). O retículo foi acoplado na região do
septo alveolar onde foram escolhidos vinte campos aleatoriamente para serem
avaliados (Figura 11B).
Figura 11: A: Posicionamento do retículo na via aérea e B: no septo alveolar para realização da técnica de contagem de pontos.
Para a quantificação da densidade de eosinófilos e das células positivas
para IL-4, IL-5, IL-13, IFN-γ, iNOS, NF-kB, MMP-9, TIMP-1 e TGF-β, os cortes
dos pulmões foram analisados com um aumento de 1000 x, utilizando a técnica
de contagem de células nas vias aéreas e/ou septo alveolar. Foi obtida a
47
relação entre número de pontos que incidiam nas células positivas dentro do
campo do retículo dividido pelo número de pontos coincidindo com a área de
tecido presente nesse mesmo campo do retículo. Esta avaliação foi realizada
tanto nos três campos das paredes das vias aéreas quanto nos dez campos
que incidiam nos septos alveolares. Os resultados foram expressos como
célula por unidade de área (104µm2).
Para a análise de 8-iso-PGF2ɑ, os cortes do pulmão foram analisados no
aumento de 400 x e a avaliação da proporção nas vias aéreas e/ou septo
alveolar foi determinada dividindo o número de pontos coincidindo sobre as
fibras pelo número total de pontos coincidindo com a área de tecido ao redor da
parede da via aérea ou septo alveolar. Os resultados foram expressos em
fração de volume - % de área positiva (Angeli et al., 2008; Prado et al., 2011).
3.9 Avaliação das imagens para medida de densidade óptica
A medida da densidade óptica foi o método utilizado para a análise de
fibras colágenas e elásticas. As imagens foram obtidas utilizando um
microscópio Leica DM4000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e uma
câmera digital (Leica DFC420 Leica Microsystems) conectado a um
computador, com ampliação de 400 x. Foram fotografados vinte campos de
septos alveolares e 10 vias aéreas.
O software (ImageProPlus - Media Cybernetics, Bethesda, MD) informa
um limiar de tons de cores que representam as áreas positivas de modo a
quantificar a área predeterminada (Figura 12). Assim, a proporção de fibras de
colágenas ou elásticas por área de vias aéreas ou septos alveolares foi
48
quantificada. Os resultados foram expressos em fração de volume - % de área
positiva.
Figura 12: Exemplo da sequência de procedimentos realizados no software para quantificação de fibras colágenas e elásticas. A: Foto da via aérea e seleção da área a ser analisada; B: Áreas positivas de modo a quantificar as fibras; C: Área total do espaço selecionado.
3.10 Avaliação imunohistoquímica
A avaliação imunohistoquímica foi realizada para detecção de IL-4, IL-5,
IL-13, IFNγ, iNOS, 8-iso-PGF2ɑ, NF-kB, MMP-9, TIMP-1 e TGF-β. As lâminas
foram previamente preparadas com 3-aminopropil-trietoxisilano Silano (Sigma)
contendo os cortes histológicos dos pulmões que foram inicialmente
desparafinizados e hidratados (Xilol 60ºC, Xilol 1, 2 e 3; Etanol Absoluto 1 e 2,
Etanol 96% e Etanol 70%). Posteriormente foram lavados com água corrente e
água destilada, sendo então submetidos aos seguintes procedimentos:
• Recuperação antigênica: Para a detecção da expressão de 8-iso-PGF2ɑ
foram colocados 100 μL de solução de Tripsina 0,25% (Trypsin from porcine
pancreas, Sigma Aldrich, Missouri, EUA), sobre os cortes pulmonares por 20
minutos à 37ºC. Para a detecção da expressão de IL-4, IL-5, IL-13, IFNγ, iNOS,
NF-kB, MMP-9, TIMP-1 e TGFβ, a recuperação antigênica se deu pela
A B C
49
exposição ao vapor em panela de pressão (Dako Cytomation, California, Inc.)
por 1 minuto à 125 ºC com as lâminas imersas em solução de Citrato com pH 6
(Target Retrieval Solution, DAKO, California, EUA). Após esse procedimento,
as lâminas foram lavadas com água corrente e água destilada (3 minutos em
ambas).
• Bloqueio de Peroxidase Endógena e Ligações Inespecíficas: O bloqueio
de peroxidase endógena foi realizado com água oxigenada (H2O2) 10 V 3% (7
vezes de 5 minutos) seguida de lavagem com água corrente e água destilada
(3 minutos em ambas). Após, as lâminas foram imersas em solução de caseína
(5 minutos). Assim, houve o bloqueio das ligações inespecíficas e novamente
as lâminas foram lavadas em solução de PBS (2 vezes de 5 minutos). Para os
anticorpos de MMP-9 e IL-5 o bloqueio foi realizado com água oxigenada
(H2O2) 10V 3% e metanol (2 vezes de 10 minutos).
• Incubação com Anticorpo Primário: Os anticorpos primários foram diluídos
em solução de BSA (do inglês Bovine serum albumin) e aplicados sobre cada
lâmina. Na Tabela 4 estão descritos quais anticorpos foram utilizados, suas
diluições e suas marcas. Após, as lâminas foram incubadas overnight em uma
câmara úmida em geladeira à 4 ºC.
50
Tabela 4: Descrição dos anticorpos, das diluições e das marcas utilizados na técnica de imunohistoquíca.
Anticorpo Diluição Marca
IL-4 1:600 sc-1260
IL-5 1:500 sc-7887
IL-13 1:700 sc-1776
IFN-γ 1:200 sc-8308
iNOS 1:100 Lab Vision Products, Neo
Markers, Thermo Fisher
Scientific, Freemount, EUA
8-iso-PGF2ɑ 1:10.000 Oxford Biomedical Research,
Rochester Hill, MI, EUA
NF-kB 1:100 sc-109
MMP-9 1:500 sc-6840
TIMP-1 1:200 sc-5538
TGF-β 1:100 sc-1836
[sc: Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Inc., Califórnia, EUA]
• Incubação com Anticorpo Secundário e Complexo: As lâminas foram
lavadas em PBS (3 vezes de 5 minutos) e incubadas pelo ABCkit Vectastain
(Vector Elite) - PK-6105 (anti-goat) para IL-4 e 8-iso-PGF2ɑ; PK-6101 (anti-
rabbit) para IL-5, MMP-9, iNOS, NF-kB, TGF-β, IFN-γ e PK-6102 (anti-mouse)
para o ensaio de IL-13 e TIMP-1, por 30 minutos em estufa à 37ºC.
• Revelação: Após lavagem das lâminas com PBS (3 vezes de 5 minutos),
foi realizada a revelação pelo cromógeno diaminobenzidina (DAB)
(DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Após, as lâminas foram lavadas com
água corrente e água destilada (10 e 2 minutos, respectivamente).
51
• Contracoloração e Montagem das Lâminas: As lâminas foram
contracoradas com Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt, Alemanha)
durante 1 minuto e lavadas com água corrente e água destilada (5 e 2 minutos,
respectivamente). Após a limpeza, foram desidratadas, diafanizadas e
montadas com as lamínulas para posterior microscopia.
As maneiras pelas quais os resultados da quantificação dessas células
foram determinados estão descritos no item “Análise morfométrica”.
3.11 Imuno-ensaio (ELISA)
Para detecção das citocinas inflamatórias IL-4, IL-5 e IFN-γ no
homogenato de pulmão, foi realizado o ensaio imunoenzimatico (ELISA, do
inglês Enzyme-linked Immunosorbent Assay) utilizando o kit DuoSet para
camundongos (R&D System, Minneapolis, EUA) conforme instruções do
fabricante.
Microplacas (Costar, Cambridge, MA, USA) para cada citocina foram
sensibilizadas com anticorpos monoclonais específicos. Após lavagem e
distribuição das amostras, foram adicionados anticorpos específicos para as
diferentes citocinas conjugados à biotina.
Para a revelação, solução reveladora contendo conjugado enzimático de
estreptoavidina-peroxidase, substrato e cromógeno foi adicionada. A leitura da
densidade ótica (DO) da reação foi realizada a 450 nm em espectrofotômetro
M2 (Spectramax L, Moleculas Devices). As concentrações das amostras foram
52
calculadas com regressão linear múltipla a partir das DOs das curvas-padrão
obtidas com as citocinas recombinantes e os resultados expressos por pg/mL.
3.12 Anafilaxia cutânea passiva
Para a titulação de anticorpos IgE e IgG1 foi utilizada a técnica de Ovary
(1964), modificada por Mota e Perini (1970). Dois camundongos de cada grupo
após sete dias da última inalação foram anestesiadas com pentobarbital sódico
(50 mg/kg i.p), e 5 ml de sangue foram retirados por punção da veia cava
inferior. O sangue foi centrifugado a 1000 rpm por vinte minutos numa
temperatura de 4°C. Para a titulação de IgG1, uma parte do soro foi aquecida
em banho maria a 56° C por uma hora, para inativar os anticorpos IgE.
Para obter a PCA, os dorsos de dois ratos (IgE) e de dois camundongos
(IgG1) foram tricotomizados, tomando-se o cuidado para não irritar a pele. No
tecido subcutâneo dorsal dos ratos e dos camundongos foi injetado 0,1 ml de
cada concentração de soro (de 1:5 até 1:2560).
O desafio foi feito 2 e 24 horas após a aplicação das diluições para IgG1
e IgE respectivamente onde foi injetada na corrente sanguínea uma solução
contendo 1mg de ovoalbumina, 1ml de azul de Evans e 0,25% de solução
salina. Depois de trinta minutos os animais foram submetidos a eutanásia, sua
pele retirada e invertida e o diâmetro das reações foi analisado, considerando-
se positiva a reação com diâmetro de cinco milímetros. A titulação foi
determinada pela maior diluição de soro capaz de induzir uma reação de
anafilaxia cutânea passiva.
53
3.13 Análise estatística
Todos os dados são representados por média ± erro padrão e os gráficos
são apresentados na forma de barras. A significância estatística das diferenças
entre os grupos foi determinada por análise de variância simples (ANOVA)
seguido pelo método de Holm-Sidak para comparações múltiplas. Foi realizada
a análise de correlação e obtido o coeficiente de Pearson (R) para avaliar as
associações dos escores de Rrs e Ers com os marcadores inflamatórios,
remodelamento e estresse oxidativo. Todas as análises foram realizadas
usando o software SigmaPlot 12.0 (Systat Software, EUA). As diferenças foram
consideradas estatisticamente significantes quando p<0,05.
4 RESULTADOS
55
4 RESULTADOS
4.1 Análise da mecânica pulmonar respiratória
Na Figura 13A podemos observar a representação da resposta máxima da
resistência do sistema respiratório (Rrs) após o desafio com metacolina (300
mg/mL). Houve aumento da Rrs nos animais do grupo OVA (OVA: 0,94 ± 0,00
cmH2O.mL-1.s) em relação aos controles (C: 0,74 ± 0,02 cmH2O.mL-1.s; C+CR:
0,71 ± 0,02 cmH2O.mL-1.s, p<0,05). Houve diminuição da Rrs no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 0,75 ± 0,01 cmH2O.mL-1.s) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Rrs
(cm
H2O
.ml-1
.s)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Figura 13A: Gráfico de barras demostrando a média ± erro padrão da resposta máxima da resistência do sistema respiratório (Rrs) após o desafio com metacolina (300 mg/mL) dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
#
56
Podemos observar na Figura 13B a representação da resposta máxima da
elastância do sistema respiratório (Ers) após o desafio com metacolina (300
mg/mL). Houve aumento da Ers nos animais do grupo OVA (OVA: 69,56 ± 1,42
cmH2O.mL-1) em relação aos controles (C: 44,41 ± 1,74 cmH2O.mL-1; C+CR:
48,20 ± 1,20 cmH2O.mL-1, p<0,05). Houve diminuição da Ers no grupo
OVA+CR (OVA+CR: 46,89 ± 1,28 cmH2O.mL-1) em relação ao grupo OVA
(p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Ers
(cm
H2O
.ml-1
)
0
20
40
60
80
100
Figura 13B: Gráfico de barras demostrando a média ± erro padrão da resposta máxima da elastância do sistema respiratório (Ers) após o desafio com metacolina (300 mg/mL) dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
#
57
4.2 Análise do fluido do lavado broncoalveolar
Na Figura 14A podemos observar a representação do número total de
células e macrófagos no fluido do lavado broncoalveolar. Houve aumento do
número total de células nos animais do grupo OVA (OVA: 9,89 ± 1,58 x 104
células/mL) em relação aos controles (C: 1,27 ± 0,43 x 104 células/mL; C+CR:
2,65 ± 0,42 x 104 células/mL, p<0,05). Houve diminuição do número total de
células no grupo OVA+CR (OVA+CR: 4,55 ± 0,37 x 104 células/mL) em relação
ao grupo OVA (p<0,05). Houve aumento de macrófagos nos animais do grupo
OVA (OVA: 5,66 ± 0,80 x 104 células/mL) em relação aos controles (C: 1,25 ±
0,36 x 104 células/mL; o C+CR: 2,02 ± 0,34 x 104 células/mL, p<0,05). Houve
diminuição dos macrófagos no grupo OVA+CR (OVA+CR: 3,54 ± 0,49 x 104
células/mL) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
Na Figura 14B podemos observar a representação do número de células
polimorfonucleares e linfócitos no fluido do lavado broncoalveolar. Houve
aumento do número de polimorfonucleares nos animais do grupo OVA (OVA:
0,59 ± 0,05 x 104 células/mL) em relação aos controles (C: 0,03 ± 0,01 x 104
células/mL; C+CR: 0,02 ± 0,00 x 104 células/mL, p<0,05). Houve diminuição no
número de polimorfonucleares no grupo OVA+CR (OVA+CR: 0,31 ± 0,06 x 104
células/mL) em relação ao grupo OVA (p<0,05). Houve aumento de linfócitos
nos animais do grupo OVA (OVA: 0,46 ± 0,06 x 104 células/mL) em relação aos
controles (C: 0,00 ± 0,00 x 104 células/mL; C+CR: 0,01 ± 0,00 x 104 células/mL,
p<0,05). Houve diminuição dos linfócitos no grupo OVA+CR (OVA+CR: 0,11 ±
0,04 x 104 células/mL) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
58
Cél
ulas
x 1
04 (c
élul
as/m
l)
0
2
4
6
8
10
12
Figura 14A: Gráfico de barras demostrando a média ± erro padrão da quantidade das células totais e macrófagos no lavado broncoalveolar. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
Cél
ulas
x 1
04 (c
élul
as/m
l)
0
8
10
12
Figura 14B: Gráfico de barras demostrando a média ± erro padrão da quantidade das células polimorfonucleares e linfócitos no lavado broncoalveolar. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
Células totais Macrófagos
*
* * #
Polimorfonocleares Linfócitos
*
C OVA C+CR OVA+CR
*
C OVA C+CR OVA+CR
* #
#
* #
59
4.3 Análise da concentração de citocinas por ELISA
Na Figura 15 podemos observar a concentração da citocina IL-4 a partir
do método ELISA. Houve aumento da IL-4 nos animais do grupo OVA (OVA:
308,00 ± 35,80 pg/mL) em relação aos controles (C: 86,01 ± 8,71 pg/mL;
C+CR: 112,50 ± 18,43 pg/mL, p<0,05). O tratamento com CrataBL atenuou a
IL-4 no grupo OVA+CR (OVA+CR: 156,82 ± 11,73 pg/mL) em relação ao grupo
OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-4
(pg/
mL)
0
200
400
600
800
Figura 15: Gráfico de barras demonsrando média ± erro padrão da concentração de IL-4 no homogenato do pulmão, analisado pelo método ELISA dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
#
60
A Figura 16 demonstra a concentração da citocina IL-5 a partir do método
ELISA. Houve aumento da IL-5 nos animais do grupo OVA (OVA: 160,04 ±
20,60 pg/mL) em relação aos controles (C: 45,72 ± 18,42 pg/mL; C+CR: 38,90
± 20,16 pg/mL, p<0,05). O tratamento com CrataBL atenuou a IL-5 no grupo
OVA+CR (OVA+CR: 66,40 ± 9,99 pg/mL) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-5
(pg/
mL)
0
200
400
600
800
Figura 16: Gráfico de barras demonsrando média ± erro padrão da concentração de IL-5 no homogenato do pulmão, analisado pelo método ELISA dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
61
Na Figura 17 podemos observar a concentração da citocina IFN-γ a partir
do método ELISA. Houve aumento da IFN-γ nos animais do grupo OVA (OVA:
456,96 ± 32,87 pg/mL) em relação aos controles (C: 94,85 ± 13,04 pg/mL;
C+CR: 94,46 ± 12,52 pg/mL, p<0,05). O tratamento com CrataBL atenuou a
IFN-γ no grupo OVA+CR (OVA+CR: 324,47 ± 11,19 pg/mL) em relação ao
grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IFN
- γ (p
g/m
L)
0
200
400
600
800
Figura 17: Gráfico de barras demonsrando média ± erro padrão da concentração de IFN-γ no homogenato do pulmão, analisado pelo método ELISA dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* * #
62
4.4 Análise morfométrica
4.4.1 Quantificação da densidade de eosinófilos
Na Figura 18A podemos observar a representação da quantificação da
densidade de eosinófilos nas vias aéreas. Houve aumento na densidade de
eosinófilos nos animais do grupo OVA (OVA: 19,72 ± 1,34 / 104µm2) em
relação aos controles (C: 0,23 ± 0,14 / 104µm2; C+CR: 0,14 ± 0,14 / 104µm2,
p<0,05). Houve diminuição na densidade de eosinófilos no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 6,24 ± 1,31 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Eosi
nófil
os/1
04 µm2
Vias
aér
eas
0
5
10
15
20
25
30
Figura 18A: Gráfico de barras demostrando a média ± erro padrão da densidade de eosinófilos nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
* #
63
Podemos observar na Figura 18B a representação da quantificação da
densidade de eosinófilos nos septos alveolares. Houve aumento na densidade
de eosinófilos nos animais do grupo OVA (OVA: 5,67 ± 0,60 / 104µm2) em
relação aos controles (C: 0,34 ± 0,21 / 104µm2; C+CR: 0,30 ± 0,18 / 104µm2,
p<0,05). Houve diminuição na densidade de eosinófilos no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 2,45 ± 0,7 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Eosi
nófil
os/1
04 µm2
Sept
os a
lveo
lare
s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 18B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão da densidade de eosinófilos nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* # *
64
4.4.2 Quantificação das células IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-γ positivas
Na Figura 19A podemos observar a representação do número de células
IL-4 positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células IL-4 positivas nos
animais do grupo OVA (OVA: 21,74 ± 2,08 / 104µm2) em relação aos controles
(C: 2,19 ± 0,10 / 104µm2; C+CR: 1,19 ± 0,78 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células IL-4 positivas no grupo OVA+CR (OVA+CR:
9,49 ± 0,93 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-4
-cél
ulas
pos
itiva
s / 1
04 µm2
Vias
aér
eas
0
5
10
15
20
25
30
Figura 19A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IL-4 positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
65
Podemos observar na Figura 19B a representação do número de células
positivas para IL-4 nos septos alveolares. Houve aumento de células positivas
para IL-4 nos animais do grupo OVA (OVA: 12,27 ± 0,82 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 0,61 ± 0,20 / 104µm2; C+CR: 0,54 ± 0,39 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células IL-4 positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 5,22 ± 0,71 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-4
-cél
ulas
pos
itiva
s / 1
04 µm2
Sept
os a
lveo
lare
s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 19B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IL-4 positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
66
Na Figura 20A podemos observar a representação do número de células
IL-5 positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células IL-5 positivas nos
animais do grupo OVA (OVA: 19,82 ± 1,47 / 104µm2) em relação aos controles
(C: 0,62 ± 0,40 / 104µm2; C+CR: 0,74 ± 0,74 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células IL-5 positivas no grupo OVA+CR (OVA+CR:
7,88 ± 0,67 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-5
-cél
ulas
pos
itiva
s / 1
04 µm2
Vias
aér
eas
0
5
10
15
20
25
30
Figura 20A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IL-5 positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
67
Podemos observar na Figura 20B a representação do número de células
IL-5 positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células IL-5 positivas
nos animais do grupo OVA (OVA: 13,76 ± 0,93 / 104µm2) em relação aos
controles (C: 0,95 ± 0,38 / 104µm2; C+CR: 1,03 ± 0,49 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células IL-5 positivas no grupo OVA+CR (OVA+CR:
4,40 ± 0,57 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-5
-cél
ulas
pos
itiva
s / 1
04 µm2
Sept
os a
lveo
lare
s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 20B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IL-5 positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
68
Na Figura 21A podemos observar a representação do número de células
IL-13 positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células IL-13 positivas nos
animais do grupo OVA (OVA: 23,18 ± 1,92 / 104µm2) em relação aos controles
(C: 2,19 ± 0,47 / 104µm2; C+CR: 1,47 ± 0,74 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células IL-13 positivas no grupo OVA+CR (OVA+CR:
4,82 ± 0,61 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-1
3-cé
lula
s po
sitiv
as /
104 µm
2Vi
as a
érea
s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 21A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IL-13 positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
#
*
69
Podemos observar na Figura 21B a representação do número de células
IL-13 positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células IL-13
positivas nos animais do grupo OVA (OVA: 7,71 ± 1,21 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 0,90 ± 0,44 / 104µm2; C+CR: 0,48 ± 0,32 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células IL-13 positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 3,66 ± 1,49 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IL-1
3-cé
lula
s po
sitiv
as /
104 µm
2Se
ptos
alv
eola
res
0
5
10
15
20
25
30
Figura 21B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IL-13 positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
# *
70
Na Figura 22A podemos observar a representação do número de células
IFN-γ positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células IFN-γ positivas nos
animais do grupo OVA (OVA: 16,39 ± 1,22 / 104µm2) em relação aos controles
(C: 1,64 ± 0,68 / 104µm2; C+CR: 1,30 ± 0,61 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células IFN-γ positivas no grupo OVA+CR (OVA+CR:
6,02 ± 1,21 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IFN
γ-cé
lula
s po
sitiv
as /
104 µm
2Vi
as a
érea
s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 22A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IFN-γ positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
71
Podemos observar na Figura 22B a representação do número de células
IFN-γ positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células IFN-γ
positivas nos animais do grupo OVA (OVA: 14,50 ± 1,34 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 0,90 ± 0,44 / 104µm2; C+CR: 0,93 ± 0,43 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células IFN-γ positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 5,92 ± 1,30 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
IFN
γ-cé
lula
s po
sitiv
as /
104 µm
2Se
ptos
alv
eola
res
0
5
10
15
20
25
30
Figura 22B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células IFN-γ positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
72
4.4.3 Quantificação das células iNOS, NF-kβ positivas e da fração de volume de 8-iso-PGF2ɑ
Na Figura 23A podemos observar a representação do número de células
iNOS positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células iNOS positivas nos
animais do grupo OVA (OVA: 26,15 ± 3,00 / 104µm2) em relação aos controles
(C: 0,00 ± 0,00 / 104µm2; C+CR: 0,00 ± 0,00 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células iNOS positivas no grupo OVA+CR (OVA+CR:
11,30 ± 1,65 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
iNO
S-cé
lula
s po
sitiv
as /
104 µm
2Vi
as a
érea
s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 23A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células iNOS positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
73
Podemos observar na Figura 23B a representação do número de células
iNOS positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células iNOS
positivas nos animais do grupo OVA (OVA: 10,41 ± 0,70 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 1,30 ± 0,56 / 104µm2; C+CR: 1,06 ± 0,48 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células iNOS positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 5,52 ± 1,01 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
iNO
S-cé
lula
s po
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as /
104 µm
2Se
ptos
alv
eola
res
0
5
10
15
20
25
30
Figura 23B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células iNOS positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
74
Na Figura 24A podemos observar a representação do número de células
NF-kB positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células NF-kB positivas
nos animais do grupo OVA (OVA: 16,62 ± 2,42 / 104µm2) em relação aos
controles (C: 1,13 ± 0,71 / 104µm2; C+CR: 1,19 ± 0,54 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células NF-kB positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 4,59 ± 0,64 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
NF-
k β-c
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vas
/ 104
µm2
Vias
aér
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5
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30
Figura 24A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células NF-kB positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
#
75
Podemos observar na Figura 24B a representação do número de células
NF-kB positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células NF-kB
positivas nos animais do grupo OVA (OVA: 10,02 ± 0,87 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 0,58 ± 0,40 / 104µm2; C+CR: 0,42 ± 0,26 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células NF-kB positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 3,88 ± 0,75 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
NF-
k β-c
élul
as p
ositi
vas
/ 104
µm2
Sept
os a
lveo
lare
s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 24B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células NF-kB positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* *
#
76
Na Figura 25A podemos observar a representação da fração de volume
de 8-iso-PGF2ɑ nas vias aéreas. Houve aumento de 8-iso-PGF2ɑ nos animais
do grupo OVA (OVA: 16,57 ± 1,51%) em relação aos controles (C: 1,55 ±
0,98%; C+CR: 1,25 ± 0,55%, p<0,05). Houve diminuição da fração de volume
de 8-iso-PGF2ɑ no grupo OVA+CR (OVA+CR: 4,54 ± 0,41%) em relação ao
grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
8-is
o-PG
F2α
(%)
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aér
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0
5
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30
Figura 25A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão da fração de volume de 8-iso-PGF2ɑ nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. Os resultados estão expressos em porcentagem. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
#
77
Podemos observar na Figura 25B a representação da fração de volume de
8-iso-PGF2ɑ nos septos alveolares. Houve aumento de 8-iso-PGF2ɑ nos
animais do grupo OVA (OVA: 13,57 ± 0,66%) em relação aos controles (C: 0,58
± 0,26%; C+CR: 0,98 ± 0,35%, p<0,05). Houve diminuição da fração de volume
de 8-iso-PGF2ɑ no grupo OVA+CR (OVA+CR: 3,43 ± 0,84%) em relação ao
grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
8-is
o-PG
F2α
(%)
Sept
os a
lveo
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s
0
5
10
15
20
25
30
Figura 25B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão da fração de volume de 8-iso-PGF2ɑ nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. Os resultados estão expressos em porcentagem. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
* #
78
4.4.4 Quantificação das células MMP-9, TIMP-1 e TGF-β positivas
Na Figura 26A podemos observar a representação do número de células
MMP-9 positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células MMP-9 positivas
nos animais do grupo OVA (OVA: 18,30 ± 2,59 / 104µm2) em relação aos
controles (C: 1,30 ± 0,89 / 104µm2; C+CR: 0,00 ± 0,00 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células MMP-9 positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 4,82 ± 0,61 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
MM
P-9-
célu
las
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/ 10
4 µm2
Vias
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0
5
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20
25
30
Figura 26A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células MMP-9 positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
#
*
79
Podemos observar na Figura 26B a representação do número de células
MMP-9 positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células MMP-9
positivas nos animais do grupo OVA (OVA: 9,32 ± 1,18 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 0,68 ± 0,46 / 104µm2; C+CR: 1,03 ± 0,48 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células MMP-9 positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 3,51 ± 0,86 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
MM
P-9-
célu
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/ 10
4 µm2
Sept
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s
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5
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15
20
25
30
Figura 26B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células MMP-9 positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
#
*
80
Na Figura 27A podemos observar a representação do número de células
TIMP-1 positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células TIMP-1 positivas
nos animais do grupo OVA (OVA: 17,21 ± 1,77 / 104µm2) em relação aos
controles (C: 0,41 ± 0,41 / 104µm2; C+CR: 0,69 ± 0,45 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células TIMP-1 positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 4,00 ± 1,14 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
TIM
P-1-
célu
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/ 10
4 µm2
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25
30
Figura 27A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células TIMP-1 positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
81
Podemos observar na Figura 27B a representação do número de células
TIMP-1 positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células TIMP-1
positivas nos animais do grupo OVA (OVA: 9,32 ± 1,18 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 0,68 ± 0,46 / 104µm2; C+CR: 1,03 ± 0,48 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células TIMP-1 positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 4,80 ± 1,30 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
TIM
P-1-
célu
las
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/ 10
4 µm2
Sept
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30
Figura 27B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células TIMP-1 positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
82
Na Figura 28A podemos observar a representação do número de células
TGF-β positivas nas vias aéreas. Houve aumento de células TGF-β positivas
nos animais do grupo OVA (OVA: 24,34 ± 1,62 / 104µm2) em relação aos
controles (C: 0,54 ± 0,54 / 104µm2; C+CR: 0,43 ± 0,43 / 104µm2, p<0,05). Houve
diminuição no número de células TGF-β positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 15,29 ± 1,06 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
TGF β
-cél
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pos
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s / 1
04 µm2
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Figura 28A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células TGF-β positivas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
83
Na Figura 28B podemos observar a representação do número de células
TGF-β positivas nos septos alveolares. Houve aumento de células TGF-β
positivas nos animais do grupo OVA (OVA: 13,51 ± 0,93 / 104µm2) em relação
aos controles (C: 0,66 ± 0,41 / 104µm2; C+CR: 0,64 ± 0,43 / 104µm2, p<0,05).
Houve diminuição no número de células TGF-β positivas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 6,92 ± 0,90 / 104µm2) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
TGF β
-cél
ulas
pos
itiva
s / 1
04 µm2
Sept
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s
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25
30
Figura 28B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão do número de células TGF-β positivas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* #
*
84
4.5 Análise por medida de densidade óptica
4.5.1 Quantificação da fração de volume das fibras colágenas e elásticas
Na Figura 29A podemos observar a representação da fração de volume
de fibras colágenas nas vias aéreas. Houve aumento da fração de volume de
fibras colágenas nos animais do grupo OVA (OVA: 18,90 ± 1,31%) em relação
aos controles (C: 7,73 ± 1,27%; C+CR: 5,26 ± 0,69%, p<0,05). Houve
diminuição na fração de volume de fibras colágenas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 11,98 ± 0,75%) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Fibr
as c
olág
enas
(%)
Vias
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0
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25
30
Figura 29A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão da fração de volume de fibras colágenas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. Os resultados estão expressos em porcentagem. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
* #
85
Podemos observar na Figura 29B a representação da fração de volume de
fibras colágenas nos septos alveolares. Houve aumento da fração de volume
de fibras colágenas nos animais do grupo OVA (OVA: 12,89 ± 0,90%) em
relação aos controles (C: 2,97 ± 0,29%; C+CR: 2,88 ± 0,40%, p<0,05). Houve
diminuição da fração de volume de fibras colágenas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 5,69 ± 0,70%) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Fibr
as c
olág
enas
(%)
Sept
os a
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s
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Figura 29B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão da fração de volume de fibras colágenas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. Os resultados estão expressos em porcentagem. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* *
#
86
Na Figura 30A podemos observar a representação da fração de volume
de fibras elásticas nas vias aéreas. Houve aumento da fração de volume de
fibras elásticas nos animais do grupo OVA (OVA: 16,43 ± 1,04%) em relação
aos controles (C: 6,50 ± 0,55%; C+CR: 5,73 ± 0,68%, p<0,05). Houve
diminuição na fração de volume de fibras elásticas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 7,81 ± 0,76%) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Fibr
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icas
(%)
Vias
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30
Figura 30A: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão da fração de volume de fibras elásticas nas vias aéreas dos quatro grupos experimentais. Os resultados estão expressos em porcentagem. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
*
#
87
Podemos observar na Figura 30B a representação da fração de volume de
fibras elásticas nos septos alveolares. Houve aumento da fração de volume de
fibras elásticas nos animais do grupo OVA (OVA: 12,15 ± 0,47%) em relação
aos controles (C: 5,52 ± 0,37%; C+CR: 5,78 ± 0,25%, p<0,05). Houve
diminuição da fração de volume de fibras elásticas no grupo OVA+CR
(OVA+CR: 8,32 ± 0,43%) em relação ao grupo OVA (p<0,05).
C OVA C+CR OVA+CR
Fibr
as e
lást
icas
(%)
Sept
os a
lveo
lare
s
0
5
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20
25
30
Figura 30B: Gráfico de barras demonstrando média ± erro padrão da fração de volume de fibras elásticas nos septos alveolares dos quatro grupos experimentais. Os resultados estão expressos em porcentagem. * p<0,05 em comparação aos grupos C e C+CR, # p<0,05 em relação ao grupo OVA.
* * #
88
4.6 Análise de correlação
A Tabela 5 mostra a análise de correlação da Rrs e da Ers em relação às
células do fluido do lavado broncoalveolar (células totais, macrófagos, células
polimorfonucleares e linfócitos). Foram observadas correlações significativas
entre todos os parâmetros avaliados.
Tabela 5: Correlação de Pearson de Rrs e Ers em relação ao fluido do lavado broncoalveolar.
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
FLBA-Células totais 0,863
0,000302
0,918
0,0000256 FLBA-Macrófagos 0,827
0,000905 0,894
0,0000878 FLBA-Polimorfonucleares 0,920
0,0000228 0,961
0,000000625 FLBA-Linfócitos 0,845
0,000536 0,895
0,0000823
A análise de correlação da Rrs e da Ers em relação à produção de
citocinas (IL-4, IL-5 e IFN-γ) a partir do método ELISA está demonstrada na
Tabela 6. Foram observadas correlações significativas entre todos os
parâmetros avaliados.
89
Tabela 6: Correlação de Pearson de Rrs e Ers em relação as citocinas IL-4, IL-5 e IFN-γ a partir do método ELISA.
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
IL-4 0,873
0,000208 0,911
0,0000387 IL-5 0,799
0,00184 0,828
0,000887 IFN-γ 0,806
0,00156 0,759
0,00421
A análise de correlação da Rrs e da Ers em relação aos eosinófilos, a
expressão celular de citocinas (IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-γ), aos marcadores de
remodelamento (fibras colágenas e elásticas, TGF-β, MMP-9 e TIMP-1) e de
estresse oxidativo (iNOS, NF-kB e 8-iso-PGF2ɑ) nas vias aéreas está
demonstrada na Tabela 7A e nos septos alveolares na Tabela 7B. Foram
observadas correlações significativas entre todos os parâmetros avaliados.
90
Tabela 7A: Correlação de Pearson de Rrs e Ers em relação aos marcadores inflamatórios (a), de remodelamento (b) e de estresse oxidativo (c) nas vias aéreas.
(a)
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
Eosinófilos 0,891 0,000103
0,904 0,0000547
IL-4 0,918 0,0000259
0,929 0,0000124
IL-5 0,877 0,000179
0,913 0,0000346
IL-13 0,893 0,0000905
0,947 0,00000290
IFN-γ 0,937 0,00000725
0,954 0,00000147
(b)
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
Fibras colágenas 0,868 0,000248
0,897 0,0000776
Fibras elásticas 0,946 0,00000337
0,949 0,00000256
TGF-β 0,869 0,000243
0,857 0,000374
MMP-9 0,908 0,0000435
0,934 0,00000860
TIMP-1 0,903 0,0000562
0,948 0,00000273
(c)
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
iNOS 0,889 0,000112
0,902 0,0000594
NF-kB 0,913 0,0000345
0,936 0,00000737
8-iso-PGF2ɑ 0,931 0,0000112
0,950 0,00000233
91
Tabela 7B: Correlação de Pearson de Rrs e Ers em relação aos marcadores inflamatórios (a), de remodelamento (b) e de estresse oxidativo (c) nos septos alveolares.
(a)
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
Eosinófilos 0,806 0,00156
0,799 0,00184
IL-4 0,904 0,0000546
0,928 0,0000139
IL-5 0,877 0,000179
0,929 0,0000127
IL-13 0,869 0,000240
0,858 0,000356
IFN-γ 0,893 0,0000904
0,892 0,0000949
(b)
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
Fibras colágenas 0,910 0,0000397
0,958 0,000000980
Fibras elásticas 0,887 0,000118
0,927 0,0000140
TGF-β 0,915 0,0000301
0,915 0,0000311
MMP-9 0,864 0,000286
0,933 0,00000940
TIMP-1 0,874 0,000202
0,911 0,0000376
(c)
Rrs Valor de R Valor de p
Ers Valor de R Valor de p
iNOS 0,827 0,000905
0,849 0,000480
NF-kB 0,876 0,000189
0,911 0,0000371
8-iso-PGF2ɑ 0,890 0,000105
0,935 0,00000821
92
4.7 Análise da anafilaxia cutânea passiva
A anafilaxia cutânea passiva evidenciou aumento nos anticorpos anafiláticos
específicos IgG1 e IgE nos camundongos expostos a ovalbumina (grupo OVA e
grupo OVA+CR: titulação máxima de 1:1280). Não houve detecção de anticorpos
IgG1 nos grupos C e C+CR.
93
4.8 Análise qualitativa
Na análise qualitativa das vias aéreas, a partir de fotomicrografias, foi
observado que houve aumento do número de eosinófilos e células IL-4, IL-5, IL-13 e
IFN-γ positivas no grupo OVA em relação aos controles. O tratamento com CrataBL
atenuou essa resposta, diminuindo, portanto, a inflamação (Figura 31).
30 μm
Figura 31: Fotomicrografias representativas das vias aéreas, coradas com LUNA para detectar eosinófilos (painéis A, B, C, D), imunohistoquímica para IL-4 (painéis E, F, G, H), IL-5 (painéis I, J, K, L), IL-13 (painéis M, N, O, P) e IFN-γ (painéis Q, R, S, T). Aumento de 400x. Barra de escala = 30 μm.
A C D
E F G H
I J K L
M N O P
B
Q R S T
Eosinófilos
IL-4
IL-5
IL-13
IFN-γ
C OVA OVA+CR C+CR
94
As vias aéreas dos animais expostos a ovalbumina apresentaram aumento da
fração de volume das fibras colágenas e elásticas, do número de células MMP-9,
TIMP-1 e TGF-β positivas em relação aos controles. O tratamento com CrataBL
reduziu essa resposta, diminuindo, portanto, o remodelamento (Figura 32).
30 μm
Figura 32: Fotomicrografias representativas das vias aéreas, coradas com Picrosirius para fibras colágenas (painéis A, B, C, D), Resorcina-fucsina para filbras elásticas (painéis E, F, G, H), imunohistoquímica para MMP-9 (painéis I, J, K, L), TIMP-1 (painéis M, N, O, P) e TGF-β (painéis Q, R, S, T). Aumento de 400x. Barra de escala = 30 μm.
A B C D
E F G H
I J K L
M N O P
Q R S T
C OVA OVA+CR C+CR
Fibras colágenas
Fibras elásticas
MMP-9
TIMP-1
TGF-β
95
Os animais expostos a ovalbumina apresentaram aumento do número de
células iNOS e NF-kB positivas e da fração de volume de 8-iso-PGF2ɑ em relação
aos controles. O tratamento com CrataBL reduziu essa resposta, diminuindo,
portanto, o estresse oxidativo nas vias aéreas (Figura 33).
30 μm
Figura 33: Fotomicrografias representativas das vias aéreas, coradas por imunohistoquímica para iNOS (painéis A, B, C, D), NF-kB (painéis E, F, G, H) e 8-iso-PGF2ɑ (painéis I, J, K, L). Aumento de 400x. Barra de escala = 30 μm.
A B C D
E F G H
I J K L
C OVA OVA+CR C+CR
iNOS
NF-kB
8-iso-PGF2ɑ
96
Na análise qualitativa dos septos alveolares, a partir de fotomicrografias, foi
observado aumento no número de eosinófilos e células IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-γ
positivas no grupo OVA em relação aos controles. O tratamento com CrataBL
atenuou essa resposta, diminuindo, portanto, a inflamação (Figura 34).
30 μm
Figura 34: Fotomicrografias representativas dos septos alveolares para IL-4 (painéis E, F, G, H), IL-5 (painéis I, J, K, L), IL-13 (painéis M, N, O, P) e IFN-γ (painéis Q, R, S, T). Aumento de 400x. Barra de escala = 30 μm.
A B C D
E F G H
I J K L
M N O P
Q R S T
C OVA OVA+CR C+CR
Eosinófilos
IL-4
IL-5
IL-13
IFN-γ
97
Os septos alveolares dos animais expostos a ovalbumina apresentaram
aumento da fração de volume das fibras colágenas e elásticas, do número de
células MMP-9, TIMP-1 e TGF-β positivas em relação aos controles. O tratamento
com CrataBL reduziu essa resposta, diminuindo, portanto, o remodelamento (Figura
35).
30 μm
Figura 35: Fotomicrografias representativas dos septos alveolares, coradas com Picrosirius para fibras colágenas (painéis A, B, C, D), Resorcina-fucsina para filbras elásticas (painéis E, F, G, H), imunohistoquímica para MMP-9 (painéis I, J, K, L), TIMP-1 (painéis M, N, O, P) e TGF-β (painéis Q, R, S, T). Aumento de 400x. Barra de escala = 30 μm.
A B C D
I J K L
M N O P
Q R S T
C OVA OVA+CR C+CR
Fibras colágenas
Fibras elásticas
MMP-9
TIMP-1
TGF-β
E F G H
98
Os animais expostos a ovalbumina apresentaram aumento do número de
células iNOS e NF-kB positivas e da fração de volume de 8-iso-PGF2ɑ em relação
aos controles. O tratamento com CrataBL reduziu essa resposta, diminuindo,
portanto, o estresse oxidativo nos septos alveolares (Figura 36).
30 μm
Figura 36: Fotomicrografias representativas dos septos alveolares, coradas por imunohistoquímica para iNOS (painéis A, B, C, D), NF-kB (painéis E, F, G, H) e 8-iso-PGF2ɑ (painéis I, J, K, L). Aumento de 400x. Barra de escala = 30 μm.
A B C D
E F G H
I J K L
C OVA OVA+CR C+CR
iNOS
NF-kB
8-iso-PGF2ɑ
5 DISCUSSÃO
100
5 DISCUSSÃO
No presente estudo, avaliou-se o efeito do inibidor de proteinase CrataBL,
purificado a partir da casca da Crataeva tapia, em um modelo experimental de
inflamação pulmonar alérgica crônica. Os animais sensibilizados com
ovalbumina e tratados com CrataBL apresentaram atenuação da
hiperresponsividade das vias aéreas e dos septos alveolares após o desafio
com metacolina. Este resultado correlacionou-se com a redução do número de
eosinófilos, da expressão de citocinas inflamatórias de perfil Th1-Th2 (IL-4, IL-
5, IL-13 e IFN-γ), com o remodelamento, avaliado pela redução da fração de
volume de fibras colágenas e elásticas e também com a expressão de células
positivas para MMP-9, TIMP-1, NF-kB e TGF-β. Além desses achados, houve
significativa atenuação na ativação da via de estresse oxidativo, observada por
meio da diminuição do número de células positivas para iNOS e da fração de
volume de 8-iso-PGF2ɑ neste modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica.
Pesquisas com novas terapias para o tratamento da asma são
necessárias, considerando que o padrão ouro, o corticosteróide, apresenta
efeitos adversos e seus efeitos no remodelamento ainda não estão bem
elucidados (Mattos et al., 2002; Bergeron et al., 2010). Além disso, sabe-se que
de 5 a 10% dos asmáticos não respondem de forma positiva com doses
elevadas de corticosteróides oral ou inalatório (Ito et al., 2006).
O envolvimento de proteinases na fisiopatologia do enfisema está
estabelecido (Churg e Wright, 2005) e na asma, há evidências de sua
relevância (Sekizawa et al., 1989; Berger et al., 1999). Proteinases não são
consideradas apenas como enzimas e não estão somente envolvidas na
101
degradação de proteínas. Elas tornaram-se importantes moléculas
sinalizadoras e seus inibidores estão sendo intensamente investigados (Wright
et al., 2003; Guarnieri et al., 2010).
A relação que inibidores de proteinase têm com a asma, pode ser
interessante se considerarmos o fato de muitos alérgenos serem proteinases
(Shen et al., 1999; Kauffman e Van Der, 2003). Portanto, ao serem estudados
em um modelo experimental de asma, os inibidores de proteinase
apresentaram bons e promissores resultados na inflamação das vias aéreas
(Chen et al., 2006; Lin et al., 2014).
Modelos de inflamação pulmonar alérgica crônica foram desenvolvidos em
pequenos animais e têm fornecido informações importantes sobre mecanismos
imunes e inflamatórios da asma (Nials e Uddin, 1997; Pawuels at al., 1997).
Dentre estes animais, os murinos têm sido amplamente utilizados. Algumas
razões fazem dos camundongos uma das espécies ideais para estudar
doenças, tais como, genética amplamente conhecida, existência de diversas
sondas camundongo-específicas, baixo custo, ciclo reprodutivo rápido e grande
número de filhotes por vez (Nials e Uddin, 1997; Wills-Karp, 2001; Torres et al.,
2005).
Para desenvolvermos nosso modelo experimental de inflamação pulmonar
alérgica crônica, escolhemos o Balb/c, pois além de ser a linhagem comumente
utilizada de camundongos para modelos de desafio antigênico, desenvolvem
uma boa resposta imunológica Th2 (Boyce e Austen, 2005; Fernandez-
Rodriguez et al., 2008).
A hiperresponsividade das vias aéreas é uma característica típica da
asma e a inflamação crônica é considerada responsável por esse evento
102
(Leong e Huston, 2001). O desenvolvimento de hiperreatividade das vias
respiratórias é uma resposta exagerada destas estruturas a uma variedade de
estímulos específicos e não-específicos que contribuem para as exacerbações
dos sintomas da doença (Postma e Kerstjens, 1998; O’Connor et al., 1999).
Após a administração de um broncoconstritor intravenoso em modelos
experimentais ocorre um aumento significativo de Rrs e Ers, tanto em animais
controle quanto em animais sensibilizados (Pétak et al., 1997; Arantes-Costa et
al., 2002; Ruiz-Schütz et al., 2009) e assim, para quantificar a
hiperresponsividade, o desafio à metacolina é comumente empregado
(Cockcroft, 2010).
Animais sensibilizados com ovalbumina apresentam obstrução das vias
aéreas e, consequentemente, altos níveis de Rrs e Ers (Leong e Huston, 2001).
Neste estudo, o tratamento com CrataBL diminuiu aproximadamente 20% da
Rrs e 32% da Ers comparado ao grupo sensibilizado e não tratado. Este efeito
broncodilatador do tratamento com CrataBL em animais sensibilizados com
ovalbumina sobre a hiperresponsividade das vias aéreas está associado a
redução de mais de 50% da expressão de todos os marcadores inflamatórios e
de remodelamento avaliados.
O inibidor de proteinase CrataBL foi anteriormente estudado em um
modelo de elastase que induz lesão pulmonar em camundongos. Os autores
demonstraram que a CrataBL diminuiu a Rrs e Ers nos animais do grupo
elastase, confirmando assim seu efeito broncodilatador (Oliva et al., 2015).
Shigetomi et al. (2010) mostraram que um inibidor de proteinase
endógeno do tipo Kunitz desempenhou um papel importante na inibição da
atividade da proteinase durante a homeostase, inflamação, lesões teciduais e
103
progressão de câncer. Além da sua atividade anti-protease, também foram
observadas outras propriedades que contribuem para o controle do processo
inflamatório, incluindo modulação da expressão de citocinas e remodelamento
do tecido. Como sabemos, a CrataBL apresenta similaridade com inibidores de
proteinase do tipo Kunitz, capazes de inibir a tripsina, portanto, sugerimos que
estas características anti-inflamatórias podem ser estendidas para o inibidor
estudado neste trabalho.
Foi demonstrado em um estudo que um inibidor de serinoproteinase
reduziu a hiperresponsividade das vias aéreas em um modelo de asma e isto
foi associado à diminuição dos níveis de IL-5, IL-6 e IL-13 no fluido do lavado
broncoalveolar (Lin et al., 2014), corroborando com nossos achados.
O fluido do lavado broncoalveolar foi avaliado para verificar a inflamação
pulmonar, este é considerado um modo eficiente de monitorar a inflamação
(Churg e Wright, 2005). Foi observado aumento das células do FLBA (células
totais, macrófagos, células polimorfonucleares e linfócitos) do grupo OVA
semelhante à relatada em modelos animais experimentais (Nath et al., 2007;
Herbert et al., 2010; Silva et al., 2012; Toledo et al., 2013). O tratamento com
CrataBL atenuou o número destas células em relação ao grupo OVA, o que
sugere, uma importante ação anti-inflamatória deste inibidor que é semelhante
ao referido por Neuhof et al. (2003) em um modelo de edema pulmonar
causado por ativação de neutrófilos, em que o inibidor de elastase BbCI (da
família Kunitz de inibidores de plantas) diminuiu a formação de edema.
Os resultados obtidos com outros modelos animais de inflamação, pré-
tratados com os inibidores de proteinases BbCI e BbKI, sugeriram uma
104
potencial ação anti-inflamatória desses inibidores (Oliveira et al., 2010;
Almeida-Reis et al., 2012).
A CrataBL pode interferir significativamente no processo inflamatório após
sua ligação à heparina (Zhang et al., 2013) e glicosaminoglicanos na superfície
da célula. A heparina potencializa a atividade das proteases, principalmente
catepsinas (Almeida et al., 2001) e calicreína do plasma (Gozzo et al., 2006).
Assim, a CrataBL pode interferir na geração de peptídeos pró-inflamatórios
(quininas - bradicinina) e indiretamente, na atividade proteolítica.
O recrutamento de eosinófilos nas vias aéreas é regulado por citocinas do
tipo Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), quimiocinas RANTES (Eotaxina) e também por
moléculas de adesão (Hogan, 2007). A inflamação eosinofílica é observada em
pacientes asmáticos (Hogan, 2007) e também está presente na maioria dos
modelos de asma (Prado et al., 2006; Angeli et al., 2008; Toledo et al., 2013).
Foi observado aumento no número de eosinófilos nas vias aéreas e nos
septos alveolares dos camundongos sensibilizados com ovalbumina e o
tratamento com CrataBL foi capaz de atenuar significativamente essa resposta.
Foi mostrado também, que o tratamento com o inibidor diminuiu o número de
células positivas para IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-γ nas vias aéreas e nos septos
alveolares. Estes resultados sugerem que esse inibidor modula os eventos de
sinalização envolvidos no recrutamento dos eosinófilos e dos linfócitos durante
uma resposta inflamatória alérgica.
Os efeitos do inibidor da tripsina pancreática básica endógena (BPTI) são
mediados por mecanismos anti-inflamatórios através da proteção do receptor
de trombina de alta afinidade, o receptor ativado por protease 1 (PAR-1). PAR-
1 pode ser ativado pela tripsina, trombina e metaloproteinase de matriz-1, a
105
qual leva à produção de várias citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas
(Shigetomi et al., 2010). Em nosso estudo, sugere-se que a CrataBL pode inibir
a tripsina, explicando assim, a redução na expressão de IL-4, IL-5, IL-13 e IFN-
γ nas vias aéreas e nos septos alveolares de animais sensibilizados com
ovalbumina.
A IL-4 parece estar envolvida na regulação da expressão de receptores
para IgE presentes nos mastócitos e também na expressão de molécula
vascular de adesão 1 (VCAM-1) no endotélio, contribuindo assim no
recrutamento de eosinófilos. A IL-5 é capaz de recrutar eosinófilos para as vias
aéreas (Hendeles et al., 2004; Lemanske e Busse, 2010) e estudos com
anticorpos anti-IL-5 demonstraram que o tratamento com IL-5 de neutralização
bloqueou a hiperresponsividade das vias aéreas e eosinofilia em resposta à
inalação do antígeno (Hamelmann e Gelfand, 2001; Leong e Huston, 2001;
Hogan, 2007). O tratamento com CrataBL em animais sensibilizados com
ovalbumina reduziu o número de células IL-4 e IL-5 positivas comparados ao
grupo OVA e, provavelmente, este achado explica a redução do número de
eosinófilos, que contribui para a diminuição da hiperresponsividade das vias
aéreas.
O processo inflamatório crônico pode contribuir para o remodelamento das
vias aéreas, onde estão envolvidas modificações da composição normal e
organização estrutural dos tecidos, que geralmente ocorrem em resposta a
várias formas mecânicas e fisiológicas de estresse e pode ser observado em
quase todos os tecidos (Vignola et al., 2003). O remodelamento é caracterizado
por mudanças estruturais nas vias aéreas, que envolve hipertrofia e hiperplasia
do músculo liso e de células caliciformes, destruição da matriz celular,
106
reparação e neovascularização (Phipps et al., 2004). Apesar dos efeitos
negativos do remodelamento, alguns autores mostraram que ele pode ser uma
resposta positiva, a fim de manter a homeostase e evitar uma broncoconstrição
grave (Brown et al., 2010).
O remodelamento pode ser determinante de hiperresponsividade e está
relacionado com a diminuição da função pulmonar observada em asmáticos e
em modelos animais (Kariyawasam et al., 2007; Southam et al., 2007; Angeli et
al., 2008; Kermode et al., 2011; Toledo et al., 2013). Na asma, o processo de
remodelamento implica na deposição de fibras colágenas e elásticas (Flood-
Page et al., 2003), MMPs, particularmente a MMP-9 (Mattos et al., 2002),
TIMP-1 (Royce et al., 2012) e TGF-β (Hogan, 2007), além de outros
marcadores.
Neste modelo foi quantificada a fração de volume de fibras colágenas e
elásticas nas vias aéreas e nos septos alveolares. Nossos resultados
corroboram aos anteriores em outros modelos experimentais de asma, que
encontraram aumento dessas fibras em cobaias e camundongos sensibilizados
com ovalbumina (Angeli et al., 2008; Vieira et al., 2008; Antunes et al., 2009).
Observamos que o tratamento com CrataBL atenuou a fração de volume de
fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas e septos alveolares de animais
sensibilizados com ovalbumina. Isso sugere que este inibidor além de ajudar a
reduzir a inflamação, indiretamente, contribuiu para a redução do
remodelamento. Este fato se deve, possivelmente, pela capacidade da CrataBL
neutralizar o efeito da heparina (Ferreira et al., 2013), pois sabe-se que a
mesma bloqueia a ativação de proteases e, assim, a destruição das fibras
elásticas localizadas nas estruturas estudadas. Uma resposta similar foi
107
observada em estudos que utilizaram um inibidor direto da atividade proteolítica
desta enzima, o BbCI (Almeida-Reis et al., 2012; Marques et al., 2012).
A redução da ativação de fibroblastos ou controle do desequilíbrio entre
proteases e antiproteinases pode também ser uma possível explicação para
estas constatações, relatados anteriormente por outros autores (Churg e
Wright, 2005; Neaud e Rosenbaum, 2008; Chen et al., 2010; GINA, 2015).
No presente estudo foi observado aumento de células MMP-9 positivas
nas vias aéreas e nos septos alveolares de animais sensibilizados com
ovalbumina. Sabe-se que principalmente as células inflamatórias, tais como,
macrófagos, neutrófilos e eosinófilos, produzem MMP-9, que pode estar
intimamente associada ao processo de remodelamento (Atkinson e Senior,
2003; Vermeer et al., 2009).
A contribuição da MMP-9 no remodelamento tem sido demonstrada por
estudos com camundongos MMP-9-knockout, os quais apresentaram redução
das fibras colágenas e do infiltrado eosinofílico em comparação aos
camundongos que foram apenas sensibilizados (Lim et al., 2006).
O fato pelo qual o inibidor de proteinase CrataBL atenuou a deposição de
fibras colágenas e elásticas, comparado aos animais apenas sensibilizados
pode ser explicado a partir do estudo realizado por Nakahata et al. (2011), o
qual apresentaram a primeira evidência de que um inibidor de proteinase
similar ao CrataBL, o EcTI, foi capaz de bloquear a ativação de
prometaloproteinase-9 (proMPM-9), considerando que a MMP-9 é
principalmente expressa na forma de zimogênios que requer ativação por
serina ou cisteína proteinases ativas (Shamamian et al., 2001).
108
Outro nível de controle para a atividade da MMP-9 é a sua inibição por
intermédio de inibidores endógenos, como o TIMP-1. No presente estudo,
observamos aumento de TIMP-1 nas vias aéreas e nos septo alveolares após a
exposição à ovalbumina e esses valores foram atenuados com o tratamento
com CrataBL. Acredita-se que as TIMPs regulam a atividade das MMPs e o
equilíbrio entre os níveis de MMP-9 e TIMP-1 é um fator determinante da
degradação da matriz extracelular (Royce et al., 2012). Além disso, TIMP-1 tem
sido reconhecido por seu efeito biológico independente das MMPs, tal como,
indução de apoptose celular (Kelly e Jarjour, 2003; Lambert et al., 2004).
Observamos no presente estudo, aumento de MMP-9 associado com
aumento do seu inibidor, TIMP-1, que aconteceu provavelmente devido a uma
tentativa de reparar danos (Amaneli et al., 2010). O desequilíbrio entre a MMP-
9 e o TIMP-1 pode interferir com a migração de células e reparação de tecidos.
A atenuação nos valores de MMP-9 neste estudo, também pode ser
explicada devido a relação da CrataBL com a heparina. Sabe-se que além de
ter uma elevada afinidade para a heparina, as catepsinas podem ativar as pró-
uroquinases, que consequentemente estimulam o plasminogênio a formar
plasmina. Por sua vez, a plasmina ativa principalmente as MMP-2 e MMP-9. A
plasmina também ativa a elastase e aumenta ainda mais as metaloproteinases e as
atividades das catepsinas. Assim, a heparina desempenha um papel importante na
amplificação da rede de ativação das proteinases em processos fisiológicos
(Amalinei et al., 2010).
O processo de reparação seguido de lesões repetidas das vias aéreas
leva ao remodelamento, como já demonstramos anteriormente. Ele apresenta
aumento da deposição de proteínas de matriz na membrana reticular e na
109
submucosa brônquica. Dentre essas proteínas estão as precursoras de
colágeno, proteoglicanos III, tenascina e lumican (Flood-Page et al., 2003).
O TGF-β tem sido descrito como potente fator de diferenciação para a
formação de miofibroblastos e é capaz de realizar a regulação da expressão de
fibroblastos, através de uma proteína da matriz extracelular, a tenascina. Além
disso, foi demonstrado que a redução de eosinófilos a partir do tratamento com
anti-IL-5, está associada a diminuição significativa na expressão de proteínas
da matriz extracelular, sugerindo que o TGF-β pode regular o remodelamento
(Flood-Page et al., 2003; Hogan, 2007). No nosso estudo, o tratamento com
CrataBL em animais sensibilizados com ovalbumina reduziu o número de
células TGF-β positivas, provavelmente devido à redução de marcadores
inflamatórios de acordo com esses estudos citados acima.
O desequilíbrio do estresse oxidativo e da capacidade antioxidante
representam uma das características fisiopatológicas da asma. A produção de
espécies reativas de nitrogênio e oxigênio denota a atividade e os efeitos de
progressão da doença. O NO e os isoprostanos são considerados
biomarcadores de estresse oxidativo e altos níveis dessas substâncias podem
amplificar os efeitos deletérios e prejudiciais para os pulmões (Ricciardolo et
al., 2004; Voynow e Kummarapurugu, 2011).
Nosso grupo de pesquisa demonstrou anteriormente a importância do
óxido nítrico na asma experimental com o aumento da expressão celular de
iNOS e eosinófilos nas vias aéreas distais dos animais sensibilizados. Além
disso, também foi demonstrado que as células nNOS positivas, embora
constitutivas, foram aumentadas entre as células inflamatórias (eosinófilos e
linfomononucleares) (Prado et al., 2005a,b; Prado et al., 2011).
110
A iNOS pode agir em uma variedade de tecidos e órgãos e sua expressão
é tipicamente aumentada pelas citocinas e fatores pró-inflamatórias - IFN-γ,
TNF-ɑ e IL1-β (Comhair e Erzurum, 2010; Prado et al., 2011). O NO derivado
da iNOS tem um papel pró-inflamatório, pois ajuda no recrutamento de células
inflamatórias para o local da lesão, além de contribuir para a amplificação da
resposta inflamatória (Prado et al., 2011).
Em relação à resposta nas vias aéreas e nos septos alveolares, a partir de
animais com inflamação alérgica crônica, os inibidores de iNOS (1400W ou L-
NAME) atenuaram a resposta ao desafio antigênico e este comprometimento
funcional foi associado com o controle da inflamação, remodelamento e
estresse oxidativo (Angeli at al., 2008; Starling et al., 2009; Prado et al., 2011).
A atenuação causada pelo bloqueio da resposta de produção de iNOS também
parece depender da modulação da via de Rho-quinase (Possa et al., 2012).
No processo de inflamação, a ativação das proteinases conduz ao
aumento da produção de bradicinina e a subsequente ativação de citocinas
pró-inflamatórias, que, assim, aumentam os números de células cNOS e iNOS
positivas (Viaro et al., 2000).
Como mencionado anteriormente, CrataBL foi capaz de neutralizar os
efeitos da heparina, que em consequencia, pode inibir a atividade de
determinadas serinoproteases (Zhang et al., 2013; Salu et al., 2014). Estes
resultados são importantes para promover a compreensão dos mecanismos de
várias doenças em que a atividade proteolítica tem uma função importante,
principalmente, considerando que a heparina de baixo peso molecular inibe a
ativação da iNOS na cicatrização de feridas (Lakshmi et al., 2011), assim,
111
sugere-se que a atenuação da iNOS no presente estudo pode estar
relacionada a ligação do CrataBL à heparina.
Nosso achado em relação à iNOS está em concordância com a pesquisa
de Molor-Erdene et al. (2005), que testou um outro inibidor da família Kunitz
(Bicunina) em um modelo de hipotensão induzida por LPS onde a Bicunina
inibiu significativamente a iNOS no tecido pulmonar.
O NO pode atuar também no aumento da Rrs e Ers no pulmão, através da
produção de peroxinitrito (Prado et al., 2011). Este agente é formado pela
interação de óxido nítrico e superóxido, gerando a peroxidação lipídica e
formação de isoprostanos. O 8-iso-PGF-2ɑ é considerado a forma
predominante reproduzida durante o ataque dos radicais livres às membranas
celulares devido ao estresse oxidativo (Montuschi et al., 1999). Alguns autores
descreveram que existe relação entre o aumento das respostas ao estresse
oxidativo e da exacerbação dos sintomas asmáticos, tais como, limitação do
fluxo aéreo, hiperresponsividade e remodelamento das vias aéreas com a
produção de quimiocinas, que contribuem para a cascata inflamatória (Brussino
et al., 2010; Voynow e Kummarapurugu, 2011).
Starling et al. (2009) mostraram que houve diminuição significativa na
densidade 8-iso-PGF2ɑ em tecido de pulmão de cobaias que foram
repetidamente expostos a ovalbumina e tratados com 1400W, um inibidor de
iNOS específico. No nosso estudo, houve redução na fração de volume de 8-
iso-PGF2ɑ, provavelmente, devido à redução das células iNOS positivas, que
podem ter contribuído na modulação da hiperresponsividade dos animais
sensibilizados com ovalbumina e tratados com CrataBL, indicando que a
proteína natural protege a membrana da célula de peroxidação lipídica.
112
A redução do estresse oxidativo através do tratamento com CrataBL
também pode ter contribuído para a atenuação do remodelamento da matriz
extracelular. Neste sentido, Prado et al. (2011), a partir de outro modelo de
asma, mostraram que a inibição da iNOS reduziu as células positivas de MMP-
9, TIMP-1 e TGF-β. Estes mediadores atuam na produção de fibras colágenas
e elásticas, contribuindo assim para a remodelação da matriz extracelular
(Prado et al., 2011), o que está de acordo com o presente estudo.
O fator de transcrição NF-kB é considerado um modulador importante da
inflamação na patogênese de doenças pulmonares (Pantano et al., 2008). Além
da atividade do NF-kB, da liberação de citocinas pro-inflamatórias e
quimiocinas, o epitélio das vias aéreas também secreta fatores que influenciam
diretamente as células dendríticas, que são as principais células
apresentadoras de antígenos do sistema imune (Bleck et al., 2006; Kato e
Schleimer, 2007).
Observamos que o número de células NF-kB positivas foi reduzido nos
animais tratados com CrataBL em comparação aos animais apenas
sensibilizados com ovalbumina. Lin et al. (2000) observaram que os fragmentos
pulmonares de ratos desafiados com ovalbumina possuiam elevada atividade
destas células.
Este estudo apresenta limitações, pois a CrataBL foi testada em um
modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica, assim, não
podemos extrapolar nossos achados diretamente para seres humanos. Além
disso, cabe ressaltar, que mesmo se tratando de um inibidor de proteinase de
origem vegetal e os compostos similares fazerem parte da bioquímica humana,
nós não testamos sua toxicidade, tornando assim, inviável reproduzir esses
113
achados. Não foram testadas doses diferentes e não foi feita uma curva dose
resposta.
6 CONCLUSÕES
115
6 CONCLUSÕES
Os nossos resultados apontam que a proteína bifuncional CrataBL foi
eficaz na redução da hiperresponsividade a metacolina, inflamação,
remodelamento e estresse oxidativo neste modelo experimental de inflamação
pulmonar alérgica crônica. Embora mais estudos precisem ser realizados, este
inibidor parece ser uma potencial ferramenta terapêutica para o tratamento da
asma.
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