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ÂNGELA MARIA FIORENTINI
CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES TECNOLÓGICAS DE Staphylococcus
xylosus ISOLADAS DE SALAMES ARTESANAIS E APLICAÇÃO COMO
CULTURA INICIADORA EM SALAME TIPO MILANO
Tese apresentada à Banca do programa de Pós
Graduação em Ciência dos Alimentos da
Universidade Federal de Santa Catarina (SC),
como requisito final para a obtenção do grau de
Doutor em Ciência dos Alimentos.
Orientador : Dr. Ernani S. Sant´Anna
Co- Orientadora : Dra. Teresinha Marisa Bertol
Florianópolis/SC
2008
Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
F518c Fiorentini, Ângela Maria. Caracterização e propriedades tecnológicas de Staphylococcus xylosus
isoladas de salames artesanais e aplicação como cultura iniciadora em salame tipo Milano / Ângela Maria Fiorentini. – Florianópolis, 2008. – 113 f.
Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal
de Santa Catarina, 2008.
Orientação: Ernani S. Sant´Anna.
1. Staphylococcus xylosus. 2. Cultivos iniciadores. 3. Salame tipo Milano. I. Sant´Anna, Ernani S. II. Título
CDU: 664
664.92
Patrícia da Rosa Corrêa
CRB10 / 1652
CARACTERIZAÇÃO E PROPRIEDADES TECNOLÓGICAS DE Staphylococcus xylosus ISOLADAS DE SALAMES ARTESANAIS E APLICAÇÃO COMO
CULTURA INICIADORA EM SALAME TIPO MILANO
Por
Ângela Maria Fiorentini
Tese apresentada como requisito final para a obtenção do título de Doutor no
Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, pela Comissão formada
por:
Presidente: ______________________________________ ___________________ Dra. Ana Carolina Maisonave Arisi
Membro: __________________________________________ _________________
Dra. Teresinha Marisa Bertol
Membro: ___________________________________________ ________________
Dr. Nelcindo Nascimento Terra
Membro: ___________________________________________ ________________ Dr. Carlos Ricardo Soccol
Membro: __________________________________________ _________________ Dr. César Damian
Florianópolis
2008
AGRADECIMENTOS Ao Professor Doutor Ernani Sebastião Sant’Anna, pela orientação, apoio e
confiança.
À Embrapa Suínos e Aves, pelo apoio financeiro para a viabilização deste trabalho e
em especial à Doutora Teresinha Marisa Bertol, pela co-orientação, estímulo e
amizade. Ao Técnico Anildo Cunha Júnior pela colaboração nas análises físico-
químicas.
À Professora Doutora Ana Carolina Maisonave Arisi, pela importante colaboração na
viabilização das análises de caracterização molecular, pelo incentivo e contribuições
constantes.
À Doutora Maristela Cortez Sawitzki, pela amizade e companheirismo em todos os
momentos e apoio absoluto para a realização deste trabalho. Pelas constantes
informações, estímulo, por tudo.
Aos integrantes do laboratório de Biotecnologia alimentar/Biologia molecular
(UFSC): Andréia Dinon, Márcia Regina Pelisser, Caroline Tagliari, pelo apoio e
orientações recebidas e em especial ao Fábio Cristiano Angonesi Brod pela
amizade, pelas informações e importantes contribuições para a viabilização da
pesquisa.
Ao professor Doutor César Rombaldi e ao professor Doutor Wladimir Padilha pela
confiança, estímulo e por disponibilizar os laboratórios de Biotecnologia e
Microbiologia da UFPel. Aos Doutores Luciano Lucchetta e Márcio Zanuzo pelas
importantes contribuições em biologia molecular que possibilitaram o início da
viabilização da pesquisa.
À UNIJUÍ, pelo auxílio recebido e em especial ao Departamento de Biologia e
Química por viabilizar a realização de análises nos laboratórios de Microbiologia e
Físico-química e aos técnicos dos laboratórios do Núcleo de Alimentos: Liziane
Schittler, Gislaine Hermanns e Leidi Daiana Preichardt, como também aos bolsistas
e estagiários do curso de Química Industrial de Alimentos que acompanharam o
trabalho.
À Ingrid Boesche Tomazelli - LANAL - Microbiologia do SENAI/Chapecó, pela
viabilização das análises de enterotoxinas estafilocócicas.
À professora Doutora Renata Dias de Mello Castanho Amboni, pelo apoio na área
de análise sensorial.
Ao professor Doutor Eduardo Carasek da Rocha e Dilma Budziak do Departamento
de Química - UFSC, pelas orientações sobre as análises químicas.
A todos meus amigos e colegas da UFSC e UNIJUÍ, pelo carinho e amizade.
Aos meus familiares, pelo apoio e incentivo.
A todos que contribuíram e me apoiaram no decorrer do curso de Doutorado,
viabilizando a realização deste trabalho.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Testes bioquímicos para a identificação de Staphylococcus
isolados de embutidos naturalmente fermentados ........................
58
TABELA 2. Perfil de fermentação de carboidratos de Staphylococcus
isolados de embutidos naturalmente fermentados ........................
58
TABELA 3. Caracterização de Staphylococcus xylosus (caldo BHI) isolados
de embutidos naturalmente fermentados ........................................
59
TABELA 4. Atividade lipolítica de Staphylococcus xylosus isolados de
embutido naturalmente fermentado..................................................
61
TABELA 5. Contagens de linhagens S. xylosus AD1 e U5 após a liofilização
(inicial) e durante o periodo de estocagem a - 500C ......................
76
TABELA 6. Atividade antagonista e antimicrobiana de linhagens de S.
xylosus isoladas e linhagem de referência contra linhagens
selecionadas........................................................................................
77
TABELA 7. Variações nas análises físico-químicas durante a fermentação e
maturação de salame tipo Milano......................................................
94
TABELA 8. Evolução do conteúdo de ácidos graxos durante a fermentação
e maturação de salame tipo Milano..................................................
97
TABELA 9. Parâmetros de CIE L*, a* e b* em salame Milano após 40 dias
de maturação.......................................................................................
99
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Processo básico dos embutidos fermentados ............................... 15
FIGURA 2. Reações químicas características da formação da cor dos
produtos cárneos curados ................................................................
17
FIGURA 3. Hidrólise da uréia catalizada por urease microbiana .................... 23
FIGURA 4. Efeitos dos nitratos e/ou nitritos na cor da carne curada, com
ação de bactérias nitrato redutoras..................................................
27
FIGURA 5. Degradação do peróxido de hidrogênio .......................................... 29
FIGURA 6. Degradação de L-leucina................................................................... 32
FIGURA 7. Ação de bactérias GCC+ durante a fermentação........................... 33
FIGURA 8. Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log
UFC/mL) isoladas de embutidos naturalmente fermentados em
diferentes concentrações de NaCl........................................
59
FIGURA 9. Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log
UFC/mL) isoladas de embutidos naturalmente fermentados em
diferentes concentrações de NaNO2...............................................
59
FIGURA 10. Crescimento (log UFC/mL) de linhagens de Staphylococcus
xylosus isoladas de embutidos naturalmente fermentados, em
caldo adicionado de NaCl e NaNO2 .................................................
59
FIGURA 11. Amplificação PCR com iniciadores para gênero
TstaG422/Tstag765, usando 50 ng de DNA molde........................
61
FIGURA 12. Amplificação PCR com iniciadores para gênero
TstaG422/Tstag765 usando 2 µL de DNA......................................
62
FIGURA 13. Amplificação PCR com iniciadores espécie-específico
XYLF/XYLR. ........................................................................................
62
FIGURA 14. Fermentação de Staphylococcus xylosus AD1 e U5 em caldo
BHI a 350C...........................................................................................
74
FIGURA 15. Evolução da microbiota durante maturação de salame................. 91
FIGURA 16. Mudanças na concentração de nitrato e nitrito durante a
fermentação e maturação de salame tipo Milano...........................
94
RESUMO
A produção de embutidos cárneos destaca-se entre as alternativas econômicas para a região Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul, os quais, na sua grande maioria, são produzidos artesanalmente condimentados e processados conforme as preferências do manipulador, e muitas vezes são influenciadas pela sua origem (descendentes de italianos ou alemães). A fermentação acontece pela ação de uma microbiota natural variável e adaptada às condições ambientais. A qualidade do produto cárneo naturalmente fermentado é influenciada pelo crescimento dessa microbiota típica que geralmente pertence ao grupo de bactérias ácido lácticas (BAL) e grupo de cocos Gram positivos catalase positivo (GCC+) da Família Micrococcaceae (Staphylococcus e Kokuria). O objetivo desta pesquisa foi caracterizar linhagens de Staphylococcus xylosus isoladas de salames artesanais produzidos na região Noroeste do Rio Grande do Sul, estudar algumas propriedades tecnológicas e de segurança e sua viabilidade para uso como cultivo iniciador em embutidos cárneos. Como também, avaliar a ação do cultivo iniciador selecionado quanto às propriedades físico-químicas, microbiológicas e sensoriais em salame tipo Milano. Linhagens nativas de Micrococcaceae foram isoladas de 38 amostras de embutidos artesanais procedentes de 21 cidades da Região Noroeste do Rio Grande do Sul. Depois de isoladas e purificadas foram submetidas aos testes iniciais de coloração de Gram, catalase e coagulase. Em seguida, usou-se o sistema API Staph (BioMérieux) para a caracterização fenotípica e pela técnica de PCR (Reação em cadeia da polimerase) as linhagens foram caracterizadas molecularmente. Atividades tecnológicas foram avaliadas como: efeito da temperatura, pH, concentrações de NaCl, tolerância para NaCl e NaNO2, capacidade para reduzir nitritos, atividade lipolítica e atividade antagonística. A viabilidade das linhagens quanto ao processo fermentativo em caldo e posterior liofilização e armazenamento também foi avaliado. Aspectos relativos à segurança foram observados pela detecção de enterotoxinas. E por fim, foi processado salame tipo Milano inoculado com a linhagem selecionada de S. xylosus U5 isolada de embutidos artesanais para verificar a influência da mesma nas características microbiológicas, físico-quimicas e sensoriais do produto. Dos 89 isolados que apresentaram atividades positiva para catalase e negativa para coagulase, 25 linhagens foram aleatoriamente selecionadas para caracterização fenotípica. Nove dessas linhagens pertencentes à espécie S. xylosus, por API STAPH, apresentaram habilidade para reduzir nitratos e nitritos, crescimento satisfatório das linhagens foi verificado na presença de NaCl, e NaNO2 e atividade de catalase positivo e lipolítica. As linhagens foram ainda avaliadas quanto ao gênero e espécie através da PCR, e duas linhagens foram identificadas como S. xylosus (AD1 e U5). Ambas apresentaram viabilidade para a fermentação e estabilidade no processo de liofilização e armazenamento e reação negativa para enterotoxinas estafilocócicas, ausência de antagonismo para com os patógenos testados, porém apresentou sinergismo com as BAL. As enzimas da linhagem S. xylosus U5 inoculada em salame tipo Milano que mostraram eficiente atividade sob as condições encontradas no produto, foram catalase, nitrito e nitrato redutase, contribuindo para as propriedades físico-químicas e sensoriais do produto. Não houve diferenças significativas na composição geral dos ácidos graxos livres entre as amostras, enquanto os parâmetros de cor foram superiores no salame inoculado e esse foi também o produto preferido pelos degustadores. Palavras-chave: Staphylococcus xylosus, cultivos iniciadores, salame tipo Milano
ABSTRACT
The production of sausages is one of the main economical alternatives for the Northwest Region of the State of Rio Grande do Sul, which are produced mainly by artisanal processes and manufactured according to the manipulator's preferences being influenced by its origin (descending from Italians or Germans). The fermentation is carried out due to the activity of a variable natural microflora adapted to the environmental conditions. The quality of the meat product naturally fermented is influenced by the growth of that typical microflora usually belonging to the lactic acid bacteria group (LAB) and Gram positive, catalase positive cocci group (GCC+) of the Micrococcaceae family (Staphylococcus and Kokuria). The aim of this research was to characterize Staphylococcus xylosus strains isolated of artisanal salami produced in the Northwest Region of Rio Grande do Sul, in order to study some technological and safety properties and their viability for using as starter cultures in sausages. Activity of the selected starter cultures concerning to physicochemical, microbiological and sensorial properties in Milano salami was also evaluated. Wild strains of Micrococcaceae were isolated from 38 samples of artisanal sausages collected in 21 cities of the Northwest Region of Rio Grande do Sul. After isolation and purification steps, strains were submitted to the initial tests of Gram coloration, catalase and coagulase. API Staph system was then used (BioMérieux) for phenotypic characterization. Molecular characterization was performed by Polymerase Chain Reaction (PCR). The following technological activities were evaluated: temperature effect, pH, concentrations of NaCl, NaCl and NaNO2 tolerance, nitrite reducing capacity, lipolytic activity and antagonistic activity. Viability of strains for fermentative process in broth followed by freeze-drying and storage was also evaluated. Safety was evaluated through enterotoxins detection. Finally, Milano salami was manufactured by inoculating the isolated strains of S. xylosus U5 from artisanal sausages in order to investigate the influence of the selected strain in the microbiological, physiochemical and sensorial properties of the final product. Twenty five out of eighty nine strains that presented activities for catalase- positive and coagulase- negative were randomly selected for phenotypic characterization. Nine out of the twenty five strains were characterized, by API STAPH, as belonging to the S. xylosus species and presented ability to reduce nitrates and nitrites; satisfactory growth was verified in the presence of NaCl, and NaNO2 and also catalase-positive and lipolytic activity. The strains were also evaluated by genus and species PCR, and two strains were identified as S. xylosus (AD1 and U5). Both strains presented viability for the fermentation, stability after freeze-drying process and storage, negative reaction for staphylococcal enterotoxins, absence of antagonism to the pathogenic bacteria tested. However, they presented synergism with LAB. The enzymes of the S. xylosus U5 strain, inoculated in Milano salami, that showed efficient activity under the conditions of the product, were catalase, nitrite and nitrate reductase, contributing for sensory and physiochemical properties of the product. There were not significant differences in the general composition of the free fatty acids among samples, while the color parameter was superior in the inoculated salami. This was also the preferred salami for tasters. Key words : Staphylococcus xylosus, starter cultures, milano salami
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO................................................................................................. 11 1 REFERENCIAL TEÓRICO.............................. ............................................. 15 1.1 CARACTERÍSTICAS DE PRODUÇÃO DE CARNE SUÍNA E AGROINDUSTRIALIZAÇÃO DE EMBUTIDOS CÁRNEOS.......... .................
15
1.1.1 Embutido fermentado - Salame tipo Milano..... .................................. 18 1.1.2 Bactérias envolvidas na fermentação de embuti dos........................ 22 1.1.3 Fermentação com cultivos iniciadores......... ..................................... 26 1.2 MICRORGANISMOS DA FAMÍLIA MICROCOCCACEAE....... ................ 27 1.2.1 Propriedades tecnológicas de linhagens de Staphylococcus xylosus ..........................................................................................................
29
REFERÊNCIAS .............................................................................................. 39 2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE Staphylococcus xylosus: POTENCIAL TECNOLÓGICO PARA USO EM EMBUTIDOS FERMENTADOS (Artigo 1)................... ...................................
52 3 VIABILIDADE DE LINHAGENS DE Staphylococcus xylosus ISOLADAS DE EMBUTIDOS ARTESANAIS PARA APLICAÇÃO COM O CULTIVOS INICIADORES EM PRODUTOS CÁRNEOS (Artigo 2) ..............
70 4 INFLUÊNCIA DE LINHAGEM NATIVA DE Staphylococcus xylosus NAS CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS, FÍSICO-QUÍMICA S E SENSORIAIS EM SALAME TIPO MILANO (Artigo 3)........ ...........................
84 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................. ............................................. 113
INTRODUÇÃO
A produção de embutidos cárneos destaca-se entre as alternativas
econômicas para a região Fronteira Noroeste do estado do RS 1, os quais, na sua
grande maioria, são produzidos artesanalmente, condimentados e processados
conforme as preferências do manipulador, muitas vezes influenciadas pela sua
cultura/origem (descendentes de italianos ou alemães), obtendo-se as
denominações de salame e lingüiça. Isto possibilita agregar valor à carne suína
gerando alternativas para a sua comercialização e, conseqüentemente, contribui
para a diversidade de produtos disponíveis na região.
A região Fronteira Noroeste pertence à mesorregião do Noroeste Rio-
Grandense, distante 500 km da capital Porto Alegre e faz fronteira com a Argentina a
Oeste. É composta por 20 municípios, abrangendo uma área total de 4.689 km2,
com uma população estimada em torno de 210 mil habitantes. A região tem no
agronegócio o ponto central de sua matriz de geração de renda, com atividades
voltadas para a agricultura e a pecuária. Produtos oriundos do setor primário são
processados por muitas agroindústrias da região, entre elas destacam-se
agroindústrias processadoras de embutidos cárneos (DALLABRIDA e
BÜTTENBENDER, 2007).
Os embutidos cárneos tradicionais são elaborados predominantemente com
carne e gordura suína, que são misturados e processados com sal e especiarias,
sem a adição de cultivos iniciadores. A fermentação desses produtos somente
acontece pela ação de uma microbiota natural, cuja composição é variável e seu
crescimento promovido pelas condições ambientais. Esta microbiota é composta por
uma ampla variedade de microrganismos derivados da matéria-prima contaminada
durante o abate e, por isso, pode contaminar a massa, os produtos ou o ambiente
das unidades de processamento.
A qualidade do produto cárneo naturalmente fermentado é influenciada pelo
crescimento dessa microbiota típica isolada de embutidos artesanais que,
geralmente, pertence ao grupo de bactérias ácido lácticas (BAL) e grupo de cocos
Gram positivos catalase positivo (GCC+) representados pelos gêneros
Staphylococcus e Kokuria, pertencentes à Família Micrococcaceae. A multiplicação
1 Classificação dos Conselhos Regionais de Desenvolvimento - COREDES - RS.
12
dessas bactérias durante o processo de maturação dos embutidos resulta na
produção de metabólitos que podem inibir o desenvolvimento de microrganismos
indesejáveis e levar à formação de aromas característicos.
O uso de cultivos iniciadores em embutidos cárneos tem proporcionado a
obtenção de um produto com boas propriedades organolépticas. A cor, o
desenvolvimento de textura e a qualidade higiênico-sanitária são características
influenciadas positivamente pelos cultivos iniciadores comerciais. No entanto, essas
culturas presentes no mercado muitas vezes não realçam suficientemente as
propriedades de flavor, com vistas a atender às expectativas de um consumidor
cada vez mais exigente. Assim, a seleção de cepas com boas características para
cultivos iniciadores, ou seja, com alto potencial para a produção de aromas, é de
fundamental importância para produtos cárneos fermentados. Os microrganismos
mais promissores para uso como cultivos iniciadores são aqueles isolados da
microbiota natural de produtos tradicionais, pois essas culturas tendem a ter
capacidades metabólicas mais altas que podem afetar vantajosamente a qualidade
do produto. Provavelmente, a seleção natural os tenha favorecido dotando-os de
vantagens ecológicas para que possam melhor competir com os demais
microrganismos do alimento.
Por isso, isolar bactérias GCC+ de produtos cárneos artesanais, realizar sua
identificação e caracterização é o que poderá garantir a aplicação desses
microrganismos como cultivos iniciadores em embutidos cárneos. Desta forma se
poderia manter a característica artesanal do produto, mas com controle da
fermentação e do processo de cura. Seria uma alternativa de processamento, pois,
além da obtenção de um produto estável à temperatura ambiente, as reações
enzimáticas produzidas pelas linhagens de Micrococcaceae auxiliariam na formação
de flavor característico e diferenciado.
O estudo tem o objetivo de caracterizar linhagens de Staphylococcus xylosus
isoladas de salames artesanais produzidos na região Fronteira Noroeste do Rio
Grande do Sul, estudar propriedades tecnológicas e de segurança e sua viabilidade
para uso como cultura iniciadora em embutidos cárneos. E mais: avaliar a ação do
cultivo iniciador selecionado quanto às propriedades físico-químicas, microbiológicas
e sensoriais em salame tipo Milano, através da identificação fenotípica e molecular
de linhagens de Staphylococcus xylosus presentes na microbiota de embutidos
cárneos artesanais; obtenção de cultivo iniciador a partir da linhagem de
13
Staphylococcus xylosus selecionada (U5); determinação de produção de
enterotoxinas e atividade antagonística e elaboração de salame tipo Milano
inoculado com o cultivo iniciador.
A definição do microrganismo em estudo justifica-se por ser o Staphylococcus
xylosus uma espécie predominante da microbiota de embutidos fermentados
naturalmente em muitos países, como Itália, Espanha, Grécia, Brasil e outros, assim
como pelo importante potencial tecnológico em embutidos cárneos: na formação e
estabilização da cor por redução de nitrato a nitrito; na decomposição de peróxidos
pela ação da enzima catalase; e na formação do flavor do produto, devido às
atividades lipolíticas e proteolíticas.
A presente pesquisa fez parte do projeto Desenvolvimento de cultivos
iniciadores para o processamento de embutidos cárne os artesanais , atendendo
aos conceitos norteadores do Macroprograma 3 - EMBRAPA, Código: 03.03.2.33.00,
coordenado pela Doutora Teresinha Marisa Bertol (EMBRAPA Suínos e Aves) com
uma equipe interinstitucional: Ângela Maria Fiorentini (UNIJUÍ), Maristela Cortez
Sawitzki (UERGS), Ernani S. Sant´Anna (UFSC). Duas linhas de pesquisas foram
desenvolvidas: Caracterização fenotípica e molecular de Staphylococcus xylosus e
investigação de propriedades tecnológicas sob a responsabilidade de Ângela Maria
Fiorentini e Caracterização fenotípica e molecular de Lactobacillus plantarum e
investigação de propriedades tecnológicas de responsabilidade de Maristela Cortez
Sawitzki. A pesquisa deu continuidade ao projeto Desenvolvimento e aplicação de
cultivos iniciadores em produtos cárneos fermentado s sob responsabilidade da
Universidade Regional do Noroeste do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ), o qual
possibilitou a identificação fenotípica dos microrganismos isolados a partir da
microbiota de produtos cárneos artesanais e gerou um banco de culturas composto
de bactérias ácido lácticas e Micrococcaceae, mantido pela UNIJUÍ. Participaram
deste projeto os pesquisadores Ângela Maria Fiorentini (UNIJUÍ), Maristela Cortez
Sawitzki (UNIJUÍ/UERGS), Ernani S. Sant´Anna (UFSC) e Nelcindo Nascimento
Terra (UFSM), em convênio com a Secretaria de Ciência e Tecnologia do Estado do
Rio Grande do Sul.
A Tese está organizada, primeiramente, com a explicitação do referencial
teórico sobre os temas relevantes ao estudo; na seqüência, a pesquisa realizada foi
dividida em artigos, como se segue: Artigo 1 - Caracterização fenotípica e molecular
14
de Staphylococcus xylosus e a investigação de algumas propriedades tecnológicas;
Artigo 2 - Estudo da viabilidade da linhagem Staphylococcus xylosus isolada de
embutidos artesanais para aplicação como cultivo iniciador em produtos cárneos;
Artigo 3 - Processamento de salame tipo Milano para verificar a influência de
linhagem nativa de Staphylococcus xylosus nas características microbiológicas,
físico-químicas e sensoriais do produto. E por fim, considerações finais sobre a
pesquisa desenvolvida, bem como sua continuidade.
15
1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 Características de produção de carne suína e ag roindustrialização de
embutidos cárneos
A carne suína é a mais produzida no mundo, atingindo 104.990 milhões de
toneladas em 2006. A produção nacional cresceu quase 6% neste período, atingindo
2,86 milhões de toneladas, e a estimativa é de superar três milhões de toneladas em
2007. O Brasil vem aumentando suas exportações de carne suína, sendo
responsável por 12% das exportações mundiais, num total de 528.195,0 t em 2006.
(ABIPECS, 2007).
Dados estatísticos sobre o consumo mundial de carne revelam, em primeiro
lugar, a carne suína, com um consumo de 16,5 kg/pessoa. No Brasil, a previsão
para 2007 do consumo per capita de carne suína é de 12,47 kg/habitante (ACSURS,
2007). Mais de 50% deste consumo corresponde a produtos processados (POF -
2002/2003, 2008).
O Rio Grande do Sul possui o terceiro maior rebanho de suínos do país, cuja
cultura integra a cadeia produtiva associada à agroindustrialização da carne,
importante cadeia produtiva do Estado (SEPLAG, 2007), atingindo o percentual de
70% no consumo de carne industrializada e 30% de carne in natura (ACSURS,
2007).
Como uma alternativa econômica, com vistas a agregar valor ao produto os
produtores, industrializam embutidos cárneos, diversificando-os quanto às
tecnologias de produção e às características sensoriais e ainda, visando atender às
expectativas do consumidor. A elaboração dos mesmos consiste na trituração da
carne e gordura misturados aos ingredientes como conservadores (sais de cura),
sal, açúcares e especiarias, embutidos em invólucros naturais ou artificiais,
defumados ou não, cru ou cozidos. Muitos produtos cárneos são comercializados,
como lingüiça, salame, copa, morcela, salsicha, mortadela com sua diversidade e
variações.
Entre os embutidos cárneos fermentados comercializados, destaca-se a
produção de salames, com uma produção/dia aproximada de 110 a 120 toneladas
(NIELSEN, 2001 apud TERRA et al., 2004). No Brasil, temos normas e padrões que
estabelecem a classificação dos diversos tipos de salames - Regulamento Técnico
16
de Identidade e Qualidade de Salames, objetivando fixar a identidade das
características mínimas de qualidade para este produto cárneo (BRASIL, 2000).
Embutidos fermentados caracterizam-se pelo seu baixo teor de umidade e
atividade de água e a presença de ácido láctico. Em conseqüência à fermentação do
embutido durante o seu processamento, características são conferidas ao produto
tais como segurança, vida de prateleira, fatiabilidade, aroma e sabor próprio
(BUCKENHÜSKES, 1993).
Para tanto, faz-se necessária a utilização de métodos combinados de
preservação, com a redução da atividade de água e do pH do produto, garantindo
um produto estável á temperatura ambiente (NASSU et al., 2002).
Os embutidos fermentados são classificados como produtos secos ou semi-
secos e em geral não são emulsionados. Seu processamento consiste basicamente
da seleção e corte da carne e da gordura, adição de condimentos e aditivos.
Normalmente, os embutidos semi-secos são defumados e submetidos a altas
temperaturas (63°C), enquanto que os secos fermentam a temperaturas de 15 e
26°C e podem ser defumados ou não, sendo mais secos e firmes que os semi-secos
(ORDÓÑEZ et al., 1999). As principais transformações que ocorrem na etapa de
fermentação podem ser resumidas em: mudanças da microbiota inicial, redução de
pH, redução de nitratos a nitritos, formação de nitrosomioglobina, solubilização e
gelificação de proteínas miofibrilares e sarcoplasmáticas, fenômenos de oxidação,
hidrólise e desidratação, inibindo o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis
(LIZASO et al., 1999).
A preferência em consumir embutidos fermentados está incorporada no hábito
alimentar do brasileiro, sendo que, dentre eles, os salames são os mais consumidos
e populares (ANTONI, 2005). É um produto que consiste da mistura de carne
cortada em pedaços ou triturada, toucinho (gordura), sais, agentes de cura,
condimentos, embutido em tripas, fermentado e desidratado (FERNÁNDEZ et al.,
2001). É durante a maturação e secagem que se pode obter um produto seguro e
estável, pois nessa etapa que ocorrem os processos físicos, bioquímicos e
microbiológicos importantes, desenvolvendo o aroma típico e a estabilização da cor
e, durante a secagem, com a redução da atividade de água, contribui para o
desenvolvimento da textura.
A elaboração de todos os produtos fermentados comporta uma tecnologia
básica.
17
Fonte: Varnan e Sutherland (1995).
Figura 1 - Processo básico dos embutidos fermentados.
Um grande avanço observado na indústria de produtos cárneos fermentados
se deu com a utilização de microrganismos desejáveis no início do processamento.
Linhagens de Bactérias ácido lácticas (BAL) e Micrococcaceae estão disponíveis
comercialmente e são denominadas, pela Legislação Brasileira, de cultivos
iniciadores (BRASIL, 2000). Bactérias Ácido Lácticas são responsáveis pela rápida
fermentação de carboidratos provocando a diminuição do pH e bactérias do grupo
Micrococcaceae podem reduzir nitrato e nitrito, influenciando na qualidade do
produto. Esses processos são responsáveis por conferir a cor vermelha
Semi secos Dessecados
Secagem (defumação)
Secagem e maturação
NaCl, açúcares, sais de cura, etc..
cultivos iniciadores
matéria-prima
trituração/ moagem
embutimento
fermentação
embalagem
Distribuição/mercado
18
característica e provocar o desdobramento e transformação de proteínas, lipídios e
carboidratos, garantindo aroma e sabor característico dos embutidos
fermentados/maturados (PARDI et al., 1996).
1.1.1 Embutido fermentado - salame tipo Milano
De acordo com a Instrução Normativa n022/2000, entende-se por salame tipo
Milano o produto cárneo industrializado, elaborado de carnes suínas ou mistas
(suínas e bovinas), toucinho, adicionado de outros ingredientes, com granulometria
média entre 3 e 6 mm, embutido em envoltórios naturais ou artificiais, curado,
defumado ou não, fermentado, maturado e dessecado por tempo determinado pelo
processo de fabricação. Para a obtenção dos fatores essenciais de qualidade, o
tempo de maturação é de grande importância, variando de acordo com o processo
utilizado e, principalmente, com o calibre, indicado um período de maturação de, no
mínimo, 35 dias para salames com calibre de 70 mm (BRASIL, 2000).
Para a formulação do produto, é necessário o uso de ingredientes obrigatórios
como: carne de suíno (mín. 60%), toucinho, sal, nitrito e/ou nitrato de sódio e/ou
potássio. Os ingredientes opcionais consistem de: carne bovina; leite em pó;
açúcares; maltodextrinas; proteínas lácteas; aditivos intencionais; vinho;
condimentos, aromas e especiarias; substâncias glaceantes (revestimento externo).
É regulamentada a aplicação de coadjuvantes de tecnologia, como os cultivos
iniciadores (starters). Os padrões de identidade e qualidade do salame tipo milano,
quanto às características físico-químicas, prevêem os seguintes valores: Atividade
de água - Aw (máx.): 0,90; Umidade (máx.): 35 %; Gordura (máx.): 35 %; Proteína
(mín.): 23 %; Carboidratos totais (máx.): 4,0 % (BRASIL, 2000).
Produtos cárneos fermentados são ricos em lipídios e, no caso de salame tipo
Milano, um significativo percentual deles é representado por ácidos graxos
monoinsaturados (em torno de 45%) e polinsaturados (aproximadamente 13%)
(ZANARDI et al., 2004).
Ingredientes usados na formulação de salame tipo M ilano
- Sal (cloreto de sódio)
19
É um componente básico de todas as misturas de cura, cuja ação é
potencializar o sabor dos produtos. É extremamente solúvel em água e quando em
contato com a carne se dissolve rapidamente no suco superficial (PARDI, et al.,
1996).
O seu papel em embutidos cárneos envolve: a) retardar o crescimento
microbiano, devido ao aumento da pressão osmótica desidratando o produto,
mediante a adição em geral de concentrações de 2 a 3% em embutidos crus; b)
auxiliar na solubilização das proteínas miofibrilares que influenciam na textura de
produtos cárneos picados; c) aumentar a capacidade de retenção de água em
conseqüência da solubilidade das proteínas; d) contribuir para o aroma dos
alimentos, possivelmente devido à sua interação com os tecidos magros e/ou gordos
para produzir compostos aromáticos desejáveis (ORDÓÑEZ et al., 2005; PEARSON
e GILLET, 1999).
- Sais de cura
O nitrato de sódio (NaNO3) e o nitrito de sódio (NaNO2) são usados para
combater os efeitos adversos do sal na cor da carne, produzindo pigmentos
estáveis. Porém, o nitrito requer menos etapas na estabilização da cor, uma vez que
o nitrato deve ser reduzido primeiro a nitrito, como mostra a figura 2.
NaNO3 redução → NaNO2 (1)
NaNO2 meio ácido: pH 5,7 → HNO2 (2)
HNO2 redução → H2O + N2O3 (3)
N2O3 redução → NO + NO2 (4)
NO2 redução → NO + O2 (5)
H2O NO N
N N N N N N
NO + Fe++ → Fe++ → Fe++
N
globina (6) globina (7) globina desnaturada (8)
MIOGLOBINA MIOGLOBINA NITROSA HEMOCROMO
Fonte: Forrest et al. (1979).
Figura 2 - Reações químicas características da formação da cor dos produtos cárneos
curados.
N N N N N
20
O nitrito é convertido, na carne, em ácido nitroso, o qual é reduzido a óxido
nítrico. O óxido nítrico é o componente ativo que se combina com a mioglobina para
formar mioglobina nitrosa, pigmento vermelho característico de produtos cárneos
curados. Pela ação do aquecimento, a mioglobina nitrosa forma um pigmento
estável, o hemocromo, também denominado nitroso hemocromogênio (Figura 2). O
nitrato não possui atividade antioxidante, mas torna-se funcional na redução para
nitrito. As funções importantes do nitrito incluem estabilizar a cor, contribuir para
desenvolver o flavor característico da carne curada, inibir o crescimento de algumas
bactérias (principalmente Clostridium botulinum) e retardar o desenvolvimento da
rancificação (GRAY e PEARSON, 1984; KILLDAY et al., 1988; OSADA et al., 2000).
A quantidade mínima de nitrito requerida para produzir a cor adequada na
carne e em todos os produtos cárneos é estimada entre 30 e 50 mg.kg,-1 enquanto
que, para produzir aroma típico de curado em um produto cárneo são necessários
de 20 a 40 mg.kg.-1 Ambos os efeitos devem-se às reações com nitritos e óxido
nítrico nos produtos cárneos (ORDÓÑEZ et al., 2005).
Algumas espécies de microrganismos causadores de toxinfecção, como
Clostridium botulinum e Staphylococcus coagulase positivo, têm seu crescimento
inibido a concentrações de nitritos de 80 a 150 mg.kg-1 (ORDÓÑEZ et al., 2005).
Segundo Branen e Davidson (1983) apud Terra et al. (2004), o mecanismo de
inibição envolve o bloqueio de sítios sulfidrílicos dentro da célula bacteriana. O
transporte ativo, o recebimento de oxigênio e a fosforilação oxidativa são inibidos
pelo nitrito. A inibição de Clostridium botulinum pode ocorrer pela reação de óxido
nítrico com um composto essencial que contenha ferro, ferrodoxina, dentro de
células germinativas.
O efeito antioxidante do nitrito, provavelmente, é devido à ação quelante do
nitrito para com o ferro não heme liberado durante o corte e moagem da matéria-
prima (ZANARDI et al., 2004). Uma concentração de nitrito de 20 a 50 mg.kg-1 seria
suficiente para a efetivação da ação antioxidante de nitritos (LÜCKE, 2000).
No produto final, podem ser encontrados de 10 a 20% do nitrito adicionado na
elaboração do produto (THIEMIG et al., 2000). A legislação brasileira (BRASIL,
2000) estabelece um limite máximo residual de nitrito de 30 mg . kg-1 de produto.
Esse controle se deve em razão de que, em determinadas concentrações,
apresentam riscos de provocar doenças como hipertensão e carcinogênesis
(CAMMACK et al., 1999; PAIK et al., 2005).
21
- Açúcares
O açúcar também é um conservante que proporciona o aroma de carne
curada e permite o desenvolvimento de algumas bactérias desejáveis, produtoras de
aroma. As condições redutoras criadas pelo açúcar influem na cor da carne curada
porque estabilizam o Fe,2+ na redução de nitratos a nitritos e ainda destes, a óxido
nítrico. A quantidade de açúcar simples normalmente utilizada fica em torno de 1%,
suficiente para prevenir a oxidação dos pigmentos cárneos, que impede a formação
de derivados indesejáveis durante o processo de cura e, também, serve de fonte de
energia para microrganismos desejáveis (ORDÓÑEZ et al., 2005).
- Condimentos
Os condimentos contribuem para realçar o sabor e o desenvolvimento de
flavor em embutidos secos, mas tem sido demonstrado que possuem atividade
antioxidante e antimicrobiana. Alecrim, orégano, sálvia, cebola, alho pimenta-da-
jamaica e cravo-da-índia são alguns dos condimentos com significativas
propriedades antioxidantes em produtos alimentícios (MADHAVI et al., 1996).
Em alimentos processados sob adequadas condições higiênico-sanitárias e
contendo reduzido número de população microbiana, o efeito antimicrobiano dos
condimentos pode ser efetivo, fornecendo uma proteção contra fungos, bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas (DÍAZ et al., 2002). Também contribuem para o
aroma através da formação de compostos voláteis.
- Antioxidantes
A função específica do antioxidante é a de retardar ou impedir a
deteriorização dos alimentos, evitando formação de ranço pelo processo de
oxidação. O ácido ascórbico e eritórbico e seus sais estabilizam alimentos com
gordura, função esta garantida por apresentarem função de seqüestradores de
oxigênio (ORDÓÑEZ et al., 2005).
O ascorbato, geralmente utilizado, previne a oxidação, enquanto o nitrito pode
potencializar a proteção, assim como o uso de cultivos iniciadores também está
relacionado com a atividade antioxidante quando presentes as enzimas catalase e
nitrato redutase.
22
1.1.2 Bactérias envolvidas na fermentação de embuti dos
Hammes e Knauf (1994) destacam que a diversidade de embutidos cárneos
produzidos nas diferentes regiões do mundo teve origem, ao longo dos anos, pela
manipulação artesanal e empírica dos ingredientes e matérias-primas utilizados na
fabricação de salames, cujo processo de fermentação se dava pela ação de
bactérias presentes naturalmente na carne.
Atualmente, a produção de embutidos em pequena escala continua usando o
método tradicional de fermentação espontânea sem adição de cultivos iniciadores.
Os microrganismos originados da própria carne ou do ambiente constituem a
denominada microbiota caseira (PINTO, 2001). De acordo com Moretti et al., (2004),
ao analisarem salame típico Siciliano no Norte da Itália, constataram que tais
embutidos são freqüentemente de qualidade superior comparados a fermentações
controladas inoculadas com cultivos iniciadores, distinguível quanto à análise
sensorial, em parte devido às propriedades da matéria-prima e às características da
tecnologia usada, mas também pela composição específica da microbiota caseira.
Os cultivos iniciadores hoje disponíveis comercialmente, na sua maioria são
compostos de mais de um microrganismo, com a finalidade de somar suas ações
para se obter o efeito desejado no produto final. Dentre as alterações desejáveis
promovidas pelos cultivos iniciadores destacam-se a redução do pH, a produção de
catalase, a redução de nitratos e a produção de enzimas proteolíticas e lipolíticas,
cujas ações promovem a formação de compostos aromáticos típicos de embutidos
fermentados (HOLZAPFEL et al., 1995). No entanto, a aptidão dos mesmos quando
aplicados a um tipo particular de embutido é questionável, posto que uma cultura
eficiente em um tipo de embutido fermentado não necessariamente tem o mesmo
desempenho em outro tipo. Por exemplo, cultivos iniciadores comerciais na Europa,
principalmente produzidos em países do Norte Europeu, nem sempre são capazes
de competir com a microbiota caseira presente em planta de embutidos cárneos no
Sul da Europa, de forma que seu uso freqüentemente resulta em perdas de
características sensorias desejáveis (SAMELIS et al., 1998).
Os microrganismos presentes naturalmente nos produtos artesanais são
Bactérias ácido lácticas (BAL) e cocos Gram positivo catalase positivo (GCC+).
Espécies GCC+ predominantes em embutidos cárneos naturalmente fermentados
pertencem aos gêneros Staphylococcus e Kokuria. S. xylosus, S. carnosus, S.
23
saprophyticus foram as espécies isoladas como dominantes, mas outras também
ocorrem, como S. equorum, S. warneri, S. epidermidis e S. lentus (MONTEL et al.,
1992, 1996; SAMELIS et al., 1998; COPPOLA et al., 2000; GARCIA-VARONA et.al.,
2000; COCOLIN et al., 2001; ROSSI et al., 2001; PAPAMANOLI et al., 2002;
AYMERICH et al, 2003; GARDINI et al., 2003; BLAIOTTA et al., 2004; MAURIELLO
et al., 2004; DROSINOS et al., 2005; ESSID et al., 2007; FIORENTINI et al., 2007).
Também Kokuria varians foi isolado de embutidos naturalmente fermentados, porém
em menores quantidades (COPPOLA et al., 1997; ENCINAS et al., 2000; OLESEN e
STAHNKE, 2000). Entre as espécies de BAL que aparecem mais freqüentemente e
que foram isoladas de produtos com fermentação natural estão: Lactobacillus
curvatus, L. sakei e L. plantarum (PARENTE et al., 2001; AYMERICH et al., 2003;
AMMOR et al., 2005; AMMOR et al., 2006; RANTSIOU et al., 2005; DROSINOS et
al., 2007; SAWITZKI et al., 2007).
A grande quantidade de embutidos artesanais fermentados de origens
diferentes representa um potencial da biodiversidade que pode ser explorada para a
obtenção de um cultivo iniciador com características competitivas para dominar o
processo fermentativo. Um dos desafios principais é explorar essa biodiversidade de
produtos e introduzir linhagens que, naturalmente, dominam as fermentações
tradicionais e tendem a ter capacidades metabólicas mais altas que podem afetar
vantajosamente a qualidade do produto, por exemplo, em relação à formação de
aroma ou segurança do produto (AYAD et al., 2000).
Dentre os grupos biológicos estão os microrganismos, cujo desenvolvimento
morfológico é limitado; no entanto, possuem características fisiológicas bem
diversas. Assim, para caracterizar os microrganismos diferentes metodologias são
utilizadas visando à identificação fenotípica e molecular.
Isolamento, identificação e caracterização de Micrococcaceae de produtos
cárneos artesanais asseguram sua aplicação como cultivo iniciador em embutidos
mantendo sua característica artesanal e ao mesmo tempo controlando a
fermentação e os processos de maturação. É uma alternativa de processamento,
porque permite um produto estável à temperatura ambiente e as reações
enzimáticas realizadas por Micrococcaceae influenciam o flavor típico de embutidos
naturalmente fermentados. Porém, a caracterização de tais microrganismos é
necessária para garantir seu uso seguro como cultivos iniciadores e para explorar
sua máxima potencialidade.
24
A identificação fenotípica é realizada a partir de provas bioquímicas que
consistem na verificação das transformações químicas que ocorrem num substrato
pela ação de um determinado microrganismo. Todo microrganismo produz
alterações nos meios em que se desenvolvem decorrentes das atividades
metabólicas. A maioria das transformações ocorre pela ação de enzimas produzidas
por microrganismos, ou é apenas fisiológica, sem a participação enzimática
(RIBEIRO e SOARES, 1998).
Cada microrganismo possui um sistema enzimático específico, resultando
num perfil bioquímico que possibilita a caracterização de gêneros e espécies
bacterianas. As provas bioquímicas baseiam-se, principalmente, na utilização, pelos
microrganismos, de fontes de carbono e nitrogênio pelas vias metabólicas de
oxidação ou fermentação.
Com o avanço da biologia molecular nos últimos anos, novas metodologias
são aplicadas para a análise de ácidos nucléicos. A classificação dos
microrganismos com base na informação genética tem como vantagem a unificação
do conceito de espécie, a estabilidade da classificação e a obtenção de bons
esquemas de identificação (SILVEIRA et al., 2000).
Para a detecção e identificação de microrganismos em alimentos, os métodos
moleculares vêm sendo amplamente utilizados em procedimentos de caracterização:
RAPD (Amplificação Randômica de DNA Polimórfico) (ROSSI et al., 2001; MARTÍN
et al., 2005), PCR espécie-específica (AYMERICH et al., 2003; MOROT-BIZOT et
al., 2003; RANTSIOU et al., 2005), PCR multiplex (MOROT-BIZOT et al., 2003).
Vários métodos de tipagem/tipificação têm sido igualmente utilizados para a
caracterização de Staphylococcus, como eletroforese em gel de campo pulsado
(PFGE) (SNOPKOVA et al., 1994), eletroforese em gel com gradiente desnaturante
(DGGE) de fragmentos do gene 16S RNAr (COCOLIN et al., 2001; RANTSIOU et al.,
2005) e amplificação da região intergênica 16S-23S (ROSSI et al., 2001; BLAIOTTA
et al., 2003).
A biotecnologia industrial necessita, freqüentemente, identificar uma linhagem
em particular e discriminá-la das outras. A utilização industrial de microrganismos é
uma prática antiga. Entre os produtos industriais gerados pelos microrganismos
estão: 1) Alimentos e suplementos (queijos e iogurtes, carnes fermentadas, picles);
2) Bebidas; 3) Ácidos orgânicos; 4) Enzimas. Hoje, com os avanços da biologia
25
molecular e da engenharia genética têm-se avançado na utilização de
microrganismos em diversos campos do dia-a-dia do ser humano (MELO, 2002).
Várias pesquisas têm sido conduzidas para a identificação de espécies
bacterianas de Lactobacillus e Staphylococcus coagulase negativo em produtos
cárneos, aplicando a técnica de PCR e/ou suas variações. Morot-Bizot et al. (2003;
2006) desenvolveram iniciadores específicos para identificação de Staphylococcus
xylosus, aplicando PCR específico e PFGE. Aymerich et al. (2003), detectaram seis
espécies de BAL e seis de Staphylococcus coagulase negativo isoladas de
embutidos artesanais e identificaram as mesmas por PCR espécie-específico. Comi
et al., (2004) caracterizaram linhagens de microrganismos starters isolados de
embutidos produzidos artesanalmente pela metodologia de PCR-RAPD. Linhagens
de Staphylococcus spp. isoladas de embutidos cárneos foram caracterizadas pelo
método PCR-DGGE (RANTSIOU et al, 2005).
Como as linhagens de bactérias isoladas de alimentos estão diretamente
envolvidas com a qualidade de produtos fermentados, ou seja, poderão ser usadas
como cultivos iniciadores em embutidos cárneos, é imprescindível optar pela
identificação molecular, pois a identificação fenotípica da microbiota de embutidos
fermentados é insuficiente para caracterizar um microrganismo, uma vez que isto
pode ser incerto devido a uma interpretação subjetiva e ambígua do perfil
colorimétrico resultado de testes bioquímicos, os quais refletem apenas uma
pequena parte da informação genética do microrganismo (QUERE et al., 1997;
BLAIOTTA et al., 2003; AYMERICH et al., 2003).
Segundo Drosinos et al., (2005), as linhagens iniciadoras mais promissoras
são aquelas isoladas de produtos cárneos naturalmente fermentados onde elas
estão bem adaptadas e, na maioria dos produtos é a população dominante. A
seleção de linhagens que apresentam características desejáveis é necessária para
obter embutidos fermentados com propriedades tecnológicas e sensoriais
apropriadas. O primeiro critério na seleção de linhagens para o uso como cultivos
iniciadores é a redução de nitrato, uma vez que influencia na formação da cor
(GARCIA-VARONA et al., 2000). Outros critérios secundários também devem ser
avaliados, como produção de acetoína e atividade de urease (Figura 3). Há
controvérsias em relação a produção de acetoína, alguns autores como Drosinos et
al., (2005), considera desejável pois a partir da acetoína as bactérias podem gerar 2-
3 butanodiol por via oxidativa contribuindo para o flavor, enquanto Garcia-Varona et
26
al. (2000) considera uma característica negativa pela habilidade das bactérias de
produzirem por redução, o diacetil, que poderá desenvolver flavor indesejável aos
produtos.
(NH2)2CO + H2O
Figura 3 - Hidrólise da uréia catalisada por urease microbiana.
1.1.3 Fermentação com cultivos iniciadores
Os cultivos iniciadores hoje comercializados consistem, geralmente, da
interação de mais de um microrganismo, buscando potencializar as características
de cada um para a obtenção do efeito desejado no produto final. Dois grupos de
bactérias considerados tecnologicamente importantes e freqüentemente
encontrados em embutidos cárneos são as bactérias ácido lácticas (BAL) e cocos
Gram positivos e catalase positivos (GCC+) da família Micrococcaceae.
Os cultivos iniciadores são adicionados em embutidos cárneos para garantir a
segurança em termos de saúde pública e a redução no tempo de fermentação,
obtendo-se um produto final de qualidade e padronizado, com atributos sensoriais
diferenciados e extensa vida de prateleira (NASSU et al., 2002).
As espécies selecionadas de microrganismos devem garantir qualidade e
homogeneidade ao produto, bem como é essencial que os mesmos sejam tolerantes
entre si, ou, preferencialmente, que cresçam sinergicamente (VARNAN e
SUTHERLAND, 1995). As espécies mais utilizadas na fermentação de carnes são
Lactobacillus e Pediococcus, do grupo de BAL responsáveis pela acidificação dos
produtos cárneos e bactérias do gênero Staphylococcus coagulase negativo e
Kocuria (formalmente Micrococcus), as quais produzem quantidades muito limitadas
de ácido e são utilizadas para a estabilização da cor, o desenvolvimento de flavor
através da prevenção da rancificação e, ainda, a produção de vários compostos
aromáticos, pela sua atividade lipolítica e proteolítica (HOLZAPFEL et al., 1995).
O desenvolvimento de microrganismos no produto depende da formulação e
das condições de processamento, cujos parâmetros mais importantes são
CO2 + 2 NH3
amônia
urease
microbiana
27
temperatura, aw, presença de nitrato/nitrito, concentração de carboidratos e
cuidados higiênicos.
As culturas são disponibilizadas na forma liofilizada ou congelada. A
liofilização é considerada um dos melhores métodos para preservar a viabilidade de
microrganismos. A mais importante vantagem de cultivos iniciadores liofilizados é a
excelente estabilidade de estocagem e fácil manipulação, distribuição e aplicação.
A cultura, quando liofilizada, deve ser diluída antes de sua utilização como
inóculo. Deve-se usar, como diluente, água ou água peptonada 0,1%, isenta de
metais pesados, com redução de cloro e esterilizada. Após a diluição, a cultura deve
ficar em repouso durante 30 minutos. O inóculo não deve ser misturado diretamente
com os demais ingredientes, pois o contato com o sal e sal de cura pode reduzir a
viabilidade e atividade das células (BUSANI,1990).
1.2 MICRORGANISMOS DA FAMÍLIA MICROCOCCACEAE
As espécies da família Micrococcaceae utilizadas em cultivos iniciadores
comerciais são Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus e Kocuria varians
(JESSEN, 1995). Apresentam características de cocos Gram positivos, aeróbios
facultativos, catalase positivas, desenvolvem-se a temperaturas ótimas de 25-350C,
em pH 5,0 a 5,5 e em substratos com 10% de NaCl, são nitrato redutores e não são
produtoras de ácido láctico ( FRAZIER, 1993).
De acordo com Bergey´s Manual of Sistematic Bacteriology, o gênero
Staphylococcus consta de 33 espécies (SCHELEIFER e KLOOS, 2002). Entre as
linhagens de Staphylococcus spp estão muitas bactérias conhecidas por serem
responsáveis por doenças em humanos (Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis). Outras, no entanto, denominadas Staphylococcus coagulase negativa
(SCN), tornaram-se importantes para a indústria de produtos cárneos, sendo usadas
como coadjuvantes de tecnologia durante a fermentação dos produtos (PEREIRA,
2001).
Linhagens de SCN são caracterizadas pelo complexo enzimático que
proporcionam, para muitas espécies, a capacidade lipolítica, a proteolítica, a
produção de nitrato redutase e a catalase. Assim, os efeitos desenvolvidos por
esses microrganismos nos produtos cárneos são a formação e estabilização da cor
em conseqüência da ação de nitrato redutase; a catalase, que evita a formação de
28
compostos lipídicos de sabor e aroma indesejáveis ao produto final; e a formação de
compostos químicos de sabor característicos de salames, pela ação lipolítica e
proteolítica dos estafilococos, mais a geração de diferentes compostos voláteis
(LÜCKE, 2000; HAMMES e KNAUF, 1994).
Muitas pesquisas realizadas, principalmente em países da Europa,
envolvendo o isolamento de estafilococos de salames, resultaram na identificação
das seguintes espécies: S. xylosus e S. saprophyticus foram dominantes em
embutido fermentado grego (SAMELIS et al., 1998; PAPAMANOLI et al., 2002;
DROSINOS et al., 2005). S. xylosus foi a espécie dominante em embutidos
espanhóis (GARCIA-VARONA et al., 2000). Aymerich et al, (2003) identificaram S.
xylosus, S. carnosus e S. epidermidis em embutidos de baixa acidez. A microbiota
estafilocócica foi mais diversificada em embutidos italianos, em que espécies como
S. xylosus, S. saprophyticus, S. equorum seguidas por S. warneri, S. epidermidis e
S. lentus foram identificadas (COPPOLA et al., 2000; COCOLIN et al., 2001; ROSSI
et al., 2001). Em tradicional embutido francês fermentado e seco, as espécies
dominantes foram S. xylosus, S. carnosus, S. warneri e S. saprophyticus (MONTEL
et al., 1992, 1996).
A origem dessas espécies é atribuída à pele suína e/ou humana, da qual
esses microrganismos fazem parte da microbiota natural (PEREIRA, 2001). S.
saprophyticus e S. epidermidis são as espécies dominantes encontradas em pele de
humanos e, ocasionalmente, isoladas da pele de animais domésticos. Essas
espécies são provavelmente adquiridas da pele da carne de suínos ou de
manipulação humana durante o processamento de embutidos. Uma vez que S.
saprophyticus e S. epidermidis são reconhecidos como patógenos oportunistas
isolados do trato urinário humano, não são recomendados para o uso como cultivos
iniciadores.
Staphylococcus xylosus é uma das espécies freqüentemente utilizadas em
cultivos iniciadores comerciais para aplicação em embutidos fermentados. Esse
microrganismo possui características fisiológicas e tecnológicas importantes para a
fermentação de salames, como a produção de catalase; não produção de
coagulase; formação de ácido a partir de glicose, sacarose, maltose, manose,
lactose, xylose, cerca de 80% das linhagens reduzem nitrato; 40-70% possuem
atividade lipolítica; a maioria possui atividade proteolítica; e crescimento em 7,5%,
29
10% e 15% de NaCl e em temperaturas de 15 e 450C (SCHLEIFER e KLOOS,
2002).
1.2.1 Propriedades tecnológicas de linhagens de Staphylococcus xylosus
As linhagens de Staphylococcus coagulase negativa destacam-se pela
importância tecnológica na fermentação de embutidos. Durante esse processo
em embutidos, muitas funções são atribuídas aos estafilococos, principalmente
na formação e estabilização da cor, decomposição de peróxidos e na formação
do flavor do produto.
- Atividade nitrato e nitrito redutase
Na elaboração de produtos fermentados são adicionados sais de cura, como
nitrato e/ou nitrito de sódio, os quais, além do efeito conservante e redução da
rancidez lipídica, conferem aos produtos as características típicas de produto
curado: cor, sabor e aroma (PINTO et al, 2001). A reação de cura requer a presença
de nitrato redutase, que é uma enzima produzida pela bactéria. As linhagens de
Micrococcaceae possuem esta enzima intracelular localizada na membrana
plasmática, cuja atividade possibilita de forma mais rápida o desenvolvimento da cor.
A ação de estafilococos está relacionada ao metabolismo aeróbio facultativo
dos mesmos, possibilitando a redução bacteriana de nitrato a nitrito, a partir do qual
se formará óxido nítrico (NO), que reagirá com a mioglobina para a formação de
nitrosomioglobina, pigmento que fornece a cor característica de produtos curados,
porém instável, que por sua vez, se transforma, por secagem ou cozimento, em
nitrosohemocromogênio, de cor vermelha estável (Figuras 4 e 7) (ALLY et al, 1992).
Em decorrência da adição de sais de cura nos produtos cárneos, é neles
detectada a presença de nitrito residual, composto com ação carcinogênica pela
provável formação de nitrosaminas. Espécies de Staphylococcus possuem atividade
nitrato e nitrito redutase (BERDAGUÉ et al., 1993) e, ainda deve-se registrar que a
ação da enzima nitrito redutase é fundamental para reduzir os níveis de nitrito
residual no produto. Observa-se, além dessas, mais uma ação de linhagens
Micrococcaceae, a capacidade de redução de nitrito, demonstrada pela ausência de
nitrosaminas em produtos cárneos fermentados (PINTO et al., 2001).
30
Papamanoli et al., (2002) observaram que todas as linhagens de S. xylosus
reduziram nitratos a nitritos a 20 e 300C. A maioria das linhagens testadas reduziu
nitratos a nitritos quando obtidas pelo método ágar em placas a 180C (temperatura
freqüentemente usada durante a maturação de embutidos fermentados) (ESSID et
al., 2007). Quando a redução de nitrato para nitrito por linhagens de Staphylococcus
foi detectada por espectrofotômetro e método ágar em placas, diferenças
significativas foram apresentadas entre a atividade determinada a 20 e 300C para
todas as linhagens testadas. Os resultados obtidos por espectrofotometria
mostraram que todas as linhagens são capazes de reduzir nitrato a 15, 20 e 300C,
enquanto que para nitrito a maior quantidade foi liberada a 300C (CASABURI et al.,
2005).
Nitrato
Nitrito NO + H2O
NO + Mb NOMb
NO + MetMb NOMetMb
NOMetMb NOMb
NOMb + calor + fumaça NO - hemocromogênio
Fonte: Ordóñez et al. (2005).
Figura 4 - Efeitos dos nitratos e/ou nitritos na cor da carne curada, com ação de bactérias
nitrato redutoras. Mb: mioglobina; MetMb: metamioglobina; NOMb: nitrosomioglobina;
NOmetMb: óxido nítrico metamioglobina; NO - hemocromogênio: nitroso-hemocromogênio.
- Ação da catalase
Os estafilococos possuem também a enzima intracelular, catalase, importante
na decomposição de peróxido de hidrogênio (Fig. 5), impedindo a formação de
hidroperóxidos e, assim, previnem a oxidação lipídica. Essa atividade antioxidante
Nitritos
Ausência de luz e ar
Condições favoráveis
Condições favoráveis
Condições favoráveis
Organismos redutores
31
contribui para o desenvolvimento de um produto com cor, aroma e sabor desejáveis
(FRANCIS, 1993; BARRIÉRE et al., 2001).
O peróxido de hidrogênio pode estar presente em salames em conseqüência
do metabolismo de algumas linhagens de bactérias lácticas presentes no produto. É
um composto indesejável pela sua ação oxidante da mioglobina e de lipídios da
matéria-prima (HAMMES e KNAUF, 1994).
Essa importante atividade tecnológica foi informada em estudos prévios de
Mauriello et al., (2004) e Essid et al., (2007), em que todas as espécies de
Staphylococcus pesquisadas mostraram atividade antioxidante dependente das
linhagens, prevenindo a produção de off-flavors pela oxidação lipídica durante
maturação de embutidos. Em contrapartida, relatos de Casaburi et al., (2005)
demonstram que a mesma atividade nas linhagens testadas apresentou-se
bastante variável.
H2O2
Figura 5 - Reação de degradação do peróxido de hidrogênio.
- Atividade proteolítica e lipolítica
Para assegurar a qualidade sensorial de embutidos fermentados, é preciso
a contribuição de GCC+ (HUGAS e MONFORT, 1997). Staphylococcus spp
podem contribuir para o flavor do produto final não apenas por prevenir a
formação de compostos indesejáveis (atividade da catalase), mas também sendo
responsáveis pela formação de compostos importantes para o flavor de produtos
curados ou de seus precursores (Figura 7), incluindo peptídios, aminoácidos,
aldeídos, aminas e ácidos graxos livres, resultado da ação de proteases e lípases
estafilocócicas sobre proteínas e lipídios da carne (LÜCKE, 2000; MAURIELLO et
al., 2004).
O flavor é a combinação de sabor e aroma e é um fator importante para a
aceitação de um produto, uma vez que é o principal atributo de qualidade. A
característica de flavor dos embutidos fermentados é dada pela combinação de
diferentes compostos voláteis e não voláteis. Alguns são originados da adição de
Catalase H2O + O2
microbiana
32
especiarias, outros são metabólitos ou produtos químicos derivados de carboidratos,
lipídios e proteínas durante o período de fermentação e cura do produto. O
crescimento microbiano no embutido, juntamente com a atividade enzimática da
carne e dos lipídios, é certamente responsável por muitos desses compostos
(STAHNKE, 1994).
Leistner (1991) também cita que muitos destes compostos são formados, no
produto, por reações químicas e enzimáticas durante o processo de maturação e
estocagem, e destaca que o perfil aromático de embutidos fermentados curados
consiste de uma ampla variedade de compostos, tais como hidrocarbonetos,
aldeídos, ácidos, cetonas, álcoois, ésteres, sulfídicos, nitritos e outros. A proporção
entre esses compostos é influenciada pelas linhagens de Staphylococcus e contribui
para o flavor dos embutidos. Por essa razão, para a produção de embutidos com
flavor típico de um produto fermentado curado, é necessário selecionar cultivos
iniciadores pelo seu potencial aromático.
Fonte: Buckenhüskes (1993), com modificações.
Figura 7 - Ação de bactérias GCC+ durante a fermentação de embutidos.
Berdagué et al. (1993) foram os primeiros a sugerir que Staphylococus spp
são os maiores responsáveis pelo efeito de aromas em embutidos fermentados.
Linhagens de Staphylococcus spp, adicionadas como cultivos iniciadores em
embutidos fermentados, além de reduzir nitratos a nitritos e produzir catalase,
Enzimas lipolíticas
ausência de oxidação lipídica
ácidos graxos
peptídios e aminoácidos
secagem
HNO2
Enzimas proteolíticas
Nitrato redutase Catalase
nitrosomioglobina
NO3-
NO2-
NO
mioglobina
nitrosohema
Flavor cor vermelha
33
podem influenciar o nível de muitos compostos aromáticos, contribuindo para o
desenvolvimento do flavor típico.
Lipólises ocorrem, em embutidos, pela ação de enzimas endógenas (carne e
gordura) e/ou pela atividade de microrganismos, geralmente GCC+, considerados os
responsáveis pela quebra de lipídios em embutidos fermentados (SAMELIS et al.,
1993; MONTEL, 1998). Os compostos de aroma produzidos pela degradação de
lipídios ocorrem durante os períodos de fermentação e maturação pela hidrólise de
frações de lipídios, originando a liberação de ácidos graxos livres por triglicerídios e
fosfolipídios (MOLLY et al., 1997). Os ácidos graxos livres, que resultam de
processos lipolíticos, representam um papel importante no desenvolvimento do
sabor típico em embutidos fermentados, e são, além disso, os precursores dos
ésteres, aldeídos, cetonas, lactonas e dos álcoois, que podem contribuir
consideravelmente ao perfil sensorial final dos embutidos (SAMELIS et al., 1993;
HIERRO et al., 1997).
Entre os ácidos graxos livres de cadeia longa encontrados em estudos de
Galgano et al. (2003) e Zuber et al. (2007) em embutidos inoculados de bactérias
Lactobacillus sakei e S. xylosus, estão o ácido oléico (predominante nas amostras),
linoléico, palmítico, esteárico e mirístico. Já os ácidos graxos livres de cadeia curta
foram representados por ácido acético, butírico, capróico e propiônico.
Os produtos cárneos fermentados são ricos em lipídios e, no caso de salame
tipo Milano, por exemplo, uma porcentagem significativa deles é composta de ácidos
graxos monoinsaturados (45%) e polinsaturados (aproximadamente 13%) (ZANARDI
et al., 2004). A geração e a transformação, principalmente de ácidos graxos livres
insaturados, são consideradas muito importantes para o desenvolvimento de flavor
no embutido fermentado, devido às diferentes conversões oxidativas de ácidos em
componentes de aroma (CHIZZOLINI, NOVELLI e ZANARDI, 1998).
Os ácidos graxos livres são mais suscetíveis à oxidação do que os
triglicerídios e fosfolipídios, comprovado pelo aumento de sua quantidade no final da
fase de maturação de embutidos (COUTRON-GAMBOTTI e GANDEMER, 1999).
Compostos originados da autooxidação de lipídios como hexanal e octanal são
importantes não para o flavor, mas contribuem para o aroma de ranço (STAHNKE,
2000). É importante considerar que um excesso de oxidação lipídica origina
produtos que podem desencadear reações secundárias, resultando em compostos
34
indesejáveis característicos de rancidez e/ou tóxicos, com possíveis perigos para a
saúde humana (ZANARDI et al., 2004).
Determinados fatores interferem no grau de lipólise, como o pH, que pode ser
decisivo; a temperatura de fermentação, que, quanto mais elevada, maior produção
de ácidos graxos livres; e os níveis de sais, em que valores reduzidos desencadeiam
maior produção de ácidos graxos livres (STAHNKE, 1995; SORENSEN e
JAKOBSEN, 1996). O potencial de lipólise apresentado pelos microrganismos pode
ser afetado pelo pH do embutido cárneo, pois, em virtude da sensibilidade ao pH por
GCC+, seu número pode reduzir e sua atividade enzimática pode ser comprometida
(SONDERGAARD e STAHNKE, 2002).
Staphylococcus, em particular S. xylosus e S. carnosus, produzem o aroma
pela conversão de aminoácidos (particularmente de cadeia ramificada, aminoácidos
leucina, isoleucina e valina) (STAHNKE et al., 2002; BECK et al., 2004; OLESEN et
al., 2004; TJENER et al., 2004). Montel et al. (1998) e Stahnke et al. (2002)
estudaram a formação de compostos aromáticos pela degradação de proteínas, e o
metabolismo de aminoácidos (leucina, isoleucina, fenilalanina), aldeídos e produtos
secundários: ácidos, álcoois e ésteres. Os microrganismos Micrococcaceae,
responsáveis por essas conversões produzem 2 e 3-metilbutanal, 2-metilpropanal,
metional, fenilacetaldeído, e muitos outros (BERDAGUÉ et al. (1993);
STAHNKE(1994); MONTEL et al. (1996).
O aldeído 3-metilbutanal é derivado da degradação microbiológica da L-
leucina (Figura 6), constatado após a adição desta em meio de cultura inoculado
com Staphylococcus xylosus, observando-se um aumento na quantidade de 3-
metilbutanal e 3-metilbutanóico em relação ao controle (MOLLER et al., 1998). Os
mesmos metabólitos foram obtidos por Larrouture et al. (2000) quando o
aminoácido foi adicionado em meio de cultura contendo S.carnosus e S. xylosus.
Muitas pesquisas têm sido realizadas e os resultados divulgados, referentes a
compostos aromáticos isolados de embutidos fermentados. Berdagué et al. (1993)
mostraram que embutidos produzidos com diferentes cultivos iniciadores
pertencentes à família Micrococcaceae têm diferentes padrões aromáticos,
indicando que eles resultariam em embutidos com diferente perfil sensorial. Assim
também, a pesquisa desenvolvida por Tjener et al. (2003) demonstrou que a
produção de aromas em embutidos fermentados com culturas de Pediococcus
35
pentosaceus e Staphylococcus xylosus resulta da formação de compostos
desejáveis para o sabor de embutido maturado.
Fonte: Larrouture et al. (2000).
Figura 6 - Degradação microbiológica de L-leucina.
A natureza das culturas iniciadoras tem uma grande influência na composição
volátil e nas características sensoriais, contribuindo para o flavor de embutidos
curados. A proteólise é uma das reações enzimáticas que, além de contribuir para o
desenvolvimento de odor (compostos voláteis), também é responsável, em parte, na
formação do flavor particular no produto cárneo (BERDAGUÉ et al., 1993).
O uso de linhagens bem selecionadas que geram altas quantidades de
compostos aromáticos pode permitir alcançar melhor qualidade sensorial e/ou
acelerar o processo de fermentação da carne. A seleção de Staphylococcus
apropriados para aplicação é crucial. Linhagens de S. xylosus, por exemplo,
predominam em salames no Sul da Europa, os quais são caracterizados por um
aroma arredondado e um gosto menos ácido, sendo recomendadas quando a
intenção é a produção de embutidos muito aromáticos (SAMELIS et al., 1998). As
linhagens produziram, entre outros, os seguintes compostos: 3-metil-1-butanol,
diacetil, 2-butanona, acetoína, benzaldeido e metil-cetonas (STAHNKE, 1999;
SONDERGAARD e STAHNKE, 2002). Dados divulgados por OLESEN et al., (2004)
confirmam a teoria de que linhagens de Staphylococcus, utilizadas como cultivos
CO2
Aminoácido oxidase NH3
Leucina + alfa-cetoácido
ácido hidroxi alfa-cetoisocapróico
ácido alfa-cetoisocapróico +
aminoácido
alfa-cetoácido aminotransferase
dehidrogenase
ácido alfa -cetoisocapróico
complexo multienzimático alfa-cetoácido dehidrogenase
3- metilbutanal descarboxilase
ácido 3-metilbutanóico 3-metilbutanol
álcool dehidrogenase aldeído
dehidrogenase
36
iniciadores, são fundamentais para a formação de importantes compostos voláteis
em embutidos fermentados.
- Atividade antagonista
Esta propriedade é a combinação de efeitos de diferentes fatores biológicos,
resultado de atividades metabólicas de microrganismos e suas interações
competitivas. Microrganismos benéficos (BAL e Micrococcaceae) garantem a
segurança de embutidos fermentados, pois, durante o processo fermentativo, são
capazes de produzir metabólitos com propriedades antimicrobianas, tais como ácido
acético, peróxido de hidrogênio e bacteriocinas (HOLZAPFEL, 2002).
Segundo Lauková e Mareková (1993), essa atividade ocorre devido à
capacidade de GCC+ de produzir bacteriocinas, observada pela atividade inibitória
de S. xylosus contra Listeria monocytogenes e outras bactérias Gram positivas.
Simonová et al. (2006) testaram linhagens de S. xylosus e S. carnosus que também
mostraram atividade inibitória contra L. innocua e Pseudomonas sp.
A maioria das linhagens de S. xylosus testadas por Essid et al., (2007) apresentou
ação antimicrobiana contra quatro bactérias indesejáveis: Salmonella arizonae,
Escherichia coli, Pseudomonas aeuroginosa e Enterococcus faecalis. Mesmo que
resultados positivos tenham sido demonstrados sobre a atividade inibitória de SCN
contra diferentes patógenos, a eficácia da atividade antimicrobiana das linhagens
precisa ser confirmada em produtos cárneos fermentados, pois fatores ambientais
no alimento específico podem afetar a produção de substâncias antimicrobianas
(PAPAMANOLI et al., 2002)
1.2.2 Efeitos adversos de linhagens de Staphylococcus spp
- Produção de enterotoxinas
As enterotoxinas estafilocócicas (SE) são uma família de nove principais tipos
sorológicos, termoestáveis, resistentes à pepsina, com peso molecular em torno de
26.000 a 29.600 Da. Causam gastroenterites como resultado do consumo de
alimentos contaminados, incluindo vômito com ou sem diarréia (BALABAN e
RASOOLY, 2000; CARMO et al., 2002).
37
Algumas linhagens de GCC+ (S. xylosus, S. saprophyticus) originadas de
alimentos podem produzir enterotoxinas (RODRÍGUEZ et al.,1996; PADMAPRIYA et
al., 2003). Linhagens de Staphylococcus spp. coagulase negativo que produzem
enterotoxinas têm sido isoladas, mas há muito pouca informação sobre seu papel
em alimentos contaminados (CARMO et al., 2002).
SEs podem ser detectadas in vitro ou pelas suas atividades biológicas in vivo.
No entanto, a detecção de rotina é por métodos imunológicos, como imunodifusão,
radioimunoensaio, aglutinação em látex, ensaios imunoenzimáticos (ELISA -
Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Um método alternativo para verificar a
capacidade enterotoxigênica de linhagens de estafilococos é a detecção específica
de genes de toxinas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (FREIRAS
et al., 2004). No entanto, apenas a presença desses genes não indica,
necessariamente, a capacidade de o microrganismo produzir toxina biologicamente
ativa suficiente para induzir manifestações clínicas (McLAUCHLIN et al., 2000).
Por outro lado, segundo Rodríguez et al. (1996), a presença de gens deve ser
considerada para todas as linhagens de Staphylococcus, especialmente quando as
mesmas são selecionadas para uso como cultivo iniciador em alimentos.
- Produção de aminas biogênicas (AB)
São compostos resultantes da decarboxilação ácida de aminoácidos por
microrganismos. Algumas ABs podem estar presentes, naturalmente, em baixas
concentrações em muitos alimentos e relativamente alto conteúdo em alimentos
fermentados (BOVER-CID et al., 1999). A produção de AB é uma característica de
diversos grupos de microrganismos, tais como Enterobacteriaceae, Pseudomonas
spp, Micrococcaceae, enterococos e BAL. As principais aminas encontradas em
alimentos são as histaminas, tiramina, putrescina e cadaverina, responsáveis pela
presença de odores desagradáveis.
A concentração de ABs em produtos fermentados tende a aumentar com o
aumento do período de maturação e com a atividade proteolítica da microbiota
superficial do produto (PINTO et al., 2001). Entretanto, não foi verificada nenhuma
correlação entre o índice de proteólise e a produção de aminas biogênicas durante o
processo de fermentação de embutidos inoculados com culturas de S. carnosus e S.
xylosus (BOVER-CID et al., 1999). A ausência de formação de ABs deve ser um
critério importante quando da seleção de cultivos iniciadores para embutidos
38
fermentados. Masson et al., (1996) relataram que S. carnosus e S. xylosus podem
ser usados como cultivos iniciadores seguros pela sua produção de tiramina in vitro.
No entanto, Straub et al. (1995) observaram que S. carnosus tem um potencial
notável para formar ABs, mas o mesmo não foi percebido para S. xylosus.
Existem enzimas capazes de degradar ABs. São as denominadas amino
oxidases, encontradas em bactérias, fungos e células de animais e vegetais,
capazes de catalisar a desaminação oxidativa de aminas com a produção de
aldeídeos, peróxido de hidrogênio e amônia (COOPER, 1997).
Estudos de Martuscelli et al. (2000) relatam a capacidade para degradar ABs
in vitro de muitas linhagens de S. xylosus isoladas de embutidos fermentados
artesanais no Sul da Itália. Entre as linhagens testadas, S. xylosus S81 mostrou uma
alta capacidade de histamina oxidase e foi capaz de degradar uma parte de tiramina.
Gardini et al. (2002) observaram, em suas pesquisas que a presença de ABs em
alimentos é conseqüência de um complexo equilíbrio entre o ambiente do embutido
e as atividades enzimáticas da população microbiana. Estes resultados sugerem que
a presença e relativa atividade de amino oxidases devem ser consideradas como
uma importante característica distintiva na seleção de cultivos iniciadores para a
produção de alimentos fermentados.
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2 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE Staphylococcus
xylosus : POTENCIAL TECNOLÓGICO PARA USO EM EMBUTIDOS
FERMENTADOS
Artigo 1
Artigo com aceite para publicação em:
Brazilian Archives of Biology and Technology
53
Caracterização fenotípica e molecular de Staphylococcus xylosus :
Potencial tecnológico para uso em embutidos ferment ados
Ângela Maria Fiorentini,1 2 Maristela Cortez Sawitzki,1 4 Teresinha Marisa Bertol,3
Fábio Cristiano Angonesi Brod,1 Márcia Regina Pelisser,1 Ana Carolina Maisonnave
Arisi,1 Ernani Sebastião Sant’Anna.1
RESUMO
Linhagens de Micrococcaceae são aplicadas em embutidos cárneos fermentados como culturas iniciadoras, onde vários membros desta família são naturalmente encontrados. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar Staphylococcus xylosus de embutidos cárneos artesanais produzidos na região Sul do Brasil. Dos 89 isolados que apresentaram atividades positiva para catalase e negativa para coagulase, 25 cepas foram selecionadas para caracterização fenotípica. Nove cepas identificadas como Staphylococcus xylosus por API STAPH foram avaliadas para capacidade de redução de nitratos e o crescimento satisfatório das cepas foi verificado na presença de nitrito e NaCl, demonstrando seu potencial para utilização como culturas iniciadoras em embutidos cárneos fermentados. As linhagens foram ainda avaliadas quanto ao gênero e espécie através da reação de polimerase em cadeia (PCR), e apenas duas linhagens foram identificadas como S. xylosus, diferindo dos resultados encontrados na caracterização fenotípica.
Palavras-chave : Staphylococcus xylosus, embutido fermentado, cultivos iniciadores,
PCR
ABSTRACT
Phenotypic and molecular characterization of Staphylococcus xylosus:
Technological potencial for use in fermented sausag e.
Micrococcaceae strains are applied to fermented sausage as starter cultures, where several members of this family are naturally found. The aim of the present work was to isolate and characterize Staphylococcus xylosus from artisanal sausages produced in South Region of Brazil. From 89 isolates presenting catalase positive and coagulase negative activities, 25 strains were selected for phenotypic
1Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina, Rod. Admar Gonzaga, 1346, 880034-001, Florianópolis, SC, Brasil 2Depto. de Biologia e Química - UNIJUÍ RS 344, km 39, 98900-000, Santa Rosa, RS, Brasil 3EMBRAPA SUÍNOS e AVES, BR 153, km 110, 89700-000, Concórdia, SC, Brasil 4Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, Rua Nelsis Ribas Fritsch, 1111, 98.200-000, Ibirubá, RS, Brasil.
54
characterization. Nine strains identified as Staphylococcus xylosus by API STAPH were evaluated for its nitrate reduction capacity and satisfactory growth of the strains was verified in the presence of nitrite and sodium chloride, demonstrating their potential for use as starter cultures in fermented sausage. The strains were also evaluated through genus and species-specific PCR and only two were identified as S. xylosus, differing from results found in phenotypic characterization.
Key words: Staphylococcus xylosus, fermented sausage, starter cultures, PCR.
INTRODUÇÃO
Bactérias ácido lácticas (BAL) e cocos Gram positivo catalase positivo (GCC+)
(Micrococcaceae) são as bactérias mais importantes encontradas em embutidos
cárneos, sendo fundamentais para a tecnologia de fabricação. Elas são usadas
como cultivos iniciadores em produtos cárneos, sendo as BAL responsáveis pela
produção de ácido láctico e prevenção do crescimento de patógenos e a família
Micrococcaceae, principalmente linhagens de Staphylococcus e Kocuria, são
conhecidas por proporcionar a formação e estabilização da cor e prevenção da
oxidação lipídica em produtos cárneos fermentados. Além disso, estas linhagens
também influenciam o nível de compostos aromáticos devido à sua atividade
lipolítica e proteolítica (TALON et al., 2002; AYMERICH et al., 2003; SPRICIGO e
PIANOVSKY, 2005).1
Várias espécies estafilocócicas foram isoladas de embutidos fermentados.
Linhagens de S. xylosus e S. saprophyticus foram dominantes em embutido
fermentado grego (Samelis et al., 1998; Papamanoli et al., 2002; Drosinos et al.,
2005). Em embutidos espanhóis, S. xylosus foi a espécie dominante (GARCIA-
VARONA et.al., 2000). Aymerich et al. (2003) identificaram S. xylosus, S. carnosus e
S. epidermidis em embutidos de baixa acidez. A microbiota estafilocócica foi mais
diversificada em embutidos italianos, em que espécies como S. xylosus, S.
saprophyticus e S. equorum seguidas por S. warneri, S. epidermidis e S. lentus
foram identificadas (COPPOLA et al., 2000; COCOLIN et al., 2001a; ROSSI et al.,
2001). Em tradicional embutido francês fermentado e seco, as espécies dominantes
foram S. xylosus, S. carnosus, S. warneri e S. saprophyticus (MONTEL et al., 1992,
1996).
55
S. xylosus é usada na indústria cárnea como um cultivo iniciador para
embutidos fermentados, uma vez que assegura a formação da cor e contribui para o
desenvolvimento de flavor (Martín et al., 2005). As linhagens iniciadoras mais
promissoras são aquelas isoladas de produtos cárneos naturalmente fermentados,
em que elas estão mais bem adaptadas e constituem a população dominante
(DROSINOS et al., 2005).
Isolamento, identificação e caracterização de Micrococcaceae de produtos
cárneos artesanais asseguram sua aplicação como cultivo iniciador em embutidos,
mantendo sua característica artesanal mediante o controle da fermentação e dos
processos de maturação. É considerada uma boa alternativa de processamento
porque permite um produto estável à temperatura ambiente e as reações
enzimáticas realizadas por Micrococcaceae influenciam o flavor típico de embutidos
naturalmente fermentados. Porém, a caracterização de tais microrganismos é
necessária para garantir seu uso seguro como cultivos iniciadores.
A identificação da microbiota de embutidos cárneos somente através de
métodos fenotípicos é insuficiente para caracterizar um microrganismo, uma vez que
existe incerteza (BLAIOTTA et al, 2003), devido a uma interpretação subjetiva e
ambígua do perfil colorimétrico resultante de testes bioquímicos (fermentação de
carboidratos) (QUERE et al., 1997). Por isso, os métodos moleculares vêm sendo
amplamente utilizados em procedimentos de caracterização: RAPD (Randomly
Amplified Polymorphic DNA) (ROSSI et al., 2001; MARTÍN et al., 2005), PCR
espécie-específica (AYMERICH et al., 2003; MOROT-BIZOT et al., 2003;
RANTSIOU et al., 2005), PCR multiplex (MOROT-BIZOT et al., 2003). Vários
métodos de tipagem/tipificação têm sido igualmente utilizados para a caracterização
de Staphylococcus, como gel de eletroforese em campo pulsado (PFGE)
(SNOPKOVA et al., 1994), gradiente desnaturante em gel de eletroforese (DGGE)
de fragmentos do gene 16S RNAr (COCOLIN, et.al., 2001b; RANTSIOU, et.al.,
2005) e amplificação da região intergênica 16S-23S (ROSSI et.al., 2001; BLAIOTTA
et al., 2003).
O objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar Staphylococcus
xylosus de embutidos artesanais produzidos na Região Sul do Brasil por meio de
métodos fenotípicos e moleculares, como também caracterizar seu potencial
tecnológico para uso como cultivos iniciadores em embutidos fermentados.
56
MATERIAL E MÉTODOS
Isolamento de Micrococcaceae
Linhagens selvagens de Micrococcaceae foram isoladas de trinta e oito (38)
amostras de embutidos artesanais coletadas em vinte e uma (21) cidades da Região
Sul do Brasil. Depois de remover o invólucro, 25 g de cada amostra foram
homogeneizadas em 225 mL de água peptonada 0,1%. Diluições decimais foram
preparadas com posterior plaqueamento utilizando ágar BHI (Brain Heart Infusion),
incubadas a 350C/48 horas e, então, purificadas pelo método de esgotamento por
estrias em ágar BHI (Merck). As linhagens isoladas foram imediatamente submetidas
aos testes de coloração de Gram, catalase e coagulase, para assegurar sua
classificação na Família Micrococcaceae e armazenadas a –500C em caldo BHI com
20% de glicerol.
Caracterização fenotípica
As linhagens isoladas foram submetidas ao teste de produção de coagulase
usando plasma de coelho em EDTA (Merck). Galerias do sistema API Staph
(BioMérieux) foram, igualmente, usadas. O sistema provê os seguintes testes:
produção de uréia, arginina, acetil-glucosamina, redução de nitrato, formação de
acetoína e fermentação de carboidratos (maltose, d-manitol, d-mannose, lactose,
sucrose, rafinose, d-trealose, d-xylose, d-glucose, d-fructose). Conforme instruções
do fornecedor, a suspensão bacteriana foi inoculada nas galerias e incubada a 360C
durante 18-24 horas.
Efeito da temperatura, pH e concentrações de cloret o de sódio (NaCl)
O efeito de pH foi testado através do crescimento em caldo BHI (Merck),
ajustado para valores de pH de 5,0 e 5,5. Efeito de diferentes concentrações de
NaCl foi avaliado pelo crescimento em caldo BHI (Merck), suplementado com 10% e
15% de NaCl. Ambos os testes foram avaliados pela habilidade de crescimento em
diferentes temperaturas: 15ºC e 45ºC.
57
Tolerância para NaCl e nitrito de sódio (NaNO 2)
A tolerância para NaCl e NaNO2 foi testada através de crescimento em ágar
BHI (Merck), suplementado com diferentes concentrações de NaCl (1,5%, 2,0%,
2,5% e 3,0%) e NaNO2 (80, 100, 120, 150 e 200 µg/g) e incubados a 35ºC/48h. Foi
examinada a tolerância simultânea de linhagens para NaCl e NaNO2 em ágar BHI
(Merck), suplementados com NaCl (3%) e NaNO2 (200 µg/g) incubadas a 35°C/48h.
Capacidade para reduzir nitritos
A habilidade de linhagens para reduzir nitritos foi testada em caldo BHI
(Merck) com pH 5,0, suplementado com 156 e 300 µg/g de NaNO2 e incubadas a
35°C/48h. O nível de nitrito residual foi medido po r espectrofotometria a 474 nm
(HARRIGAN e MCCANCE, 1976).
Atividade lipolítica
A atividade lipolítica das linhagens foi testada de acordo com Kouker e Jaeger
(1987) e Haba et al. (2000). O meio, contendo 0,8% de caldo nutriente (BBL), 0,4%
de NaCl e 1% de ágar-ágar, foi ajustado a pH 7, autoclavado (121ºC por 15 min) e
esfriado a 60ºC. O azeite de oliva extra-virgem, concentração final de 2,5%, foi
esterilizado separadamente em autoclave e 10 mL de Rodamina B (1mg/mL, Sigma)
dissolvida em água destilada esterilizada por filtração foi adicionada ao meio. Após a
homogeneização, usada para uma correta emulsificação, o meio de cultura foi
dispensado em placas de Petri. A atividade de lipase foi identificada nas placas
como um halo fluorescente laranja sob luz UV a 350 nm após 24-26 h de incubação
a 37°C.
Caracterização molecular
As linhagens isoladas caracterizadas fenotipicamente como Staphylococcus
xylosus e a linhagem de referência ATCC 29971 foram multiplicadas overnight em
caldo BHI a 350C. Alíquotas de 1 mL de cada cultura foram centrifugadas a 13.000 g
por 2 minutos, sob refrigeração, e a extração de DNA foi realizada a partir do
58
precipitado das células, conforme o protocolo do kit Wizard Genomic DNA
Purification (Promega).
Amplificações foram executadas com os iniciadores TstaG422/Tstag765
(Martineau et al., 2001) e XYLF/XYLR (MOROT-BIZOT et al., 2003; CORBIÉRE
MOROT-BIZOT et al., 2004) permitindo a identificação do gênero Staphylococcus e
da espécie S. xylosus, respectivamente. Os iniciadores TstaG422/Tstag765 e
XYLF/XYLR amplificam fragmentos de 370 bp e 539 bp, respectivamente (MOROT-
BIZOT et al., 2003). Além disso, uma linhagem de referência de Lactobacillus
plantarum (ATCC 8014) foi usada como controle negativo em todas as reações de
PCR.
Para a identificação molecular ao nível de gênero, reações de PCR foram
realizadas em um volume final de 25 µL contendo 2 µL de DNA extraído, 2,5 mM de
MgCl2, 0,2 µM de cada iniciador TstaG422/Tstag765, 200 µM de cada dNTP e 1,25
U de Taq DNA polimerase em tampão 1X, de acordo com as instruções do
fabricante (Promega). Amplificações foram executadas em um MinicyclerTM (MJ
Research, Inc. Watertown, MA), sob as seguintes condições: 3 min a 96ºC, 40 ciclos
de 30 s a 95ºC, 60 s a 55ºC, 30 s a 72ºC e uma extensão final de 3 min a 72ºC
(MOROT-BIZOT et al., 2003; MARTINEAU et al., 2001).
Para a identificação molecular ao nível de espécie, reações de PCR foram
realizadas em um volume final de 25 µL contendo 2 µL de DNA extraído, 1,5 mM de
MgCl2, 0,2 µM de cada iniciador XYLF/XYLR, 200 µM de cada dNTP e 1,25 U de
Taq DNA polimerase em tampão 1X, de acordo com as instruções do fabricante
(Promega). Amplificações foram executadas em um Minicycler TM (MJ Research, Inc.
Watertown, MA), sob as seguintes condições: 5 min a 94ºC, 40 ciclos de 60 s a
94ºC, 60 s a 55ºC, 3 min a 72ºC e uma extensão final de 6 min a 72ºC (MOROT-
BIZOT et al, 2003; CORBIÉRE MOROT-BIZOT et al., 2004).
Os produtos de PCR (10 µL da reação + 2 µL de tampão de carga) foram
separados por electroforese a 400mA e 80V por 50 min em gel de agarose 2,5%,
com tampão TBE 1X corado com brometo de etídio. A visualização foi executada em
transiluminador UV e as imagens registradas com uma máquina fotográfica digital
(Canon Powershot A70).
59
RESULTADOS E DISCUSSÃO
De um total de 175 linhagens de Micrococcaceae isoladas de embutidos
naturalmente fermentados, 89 (50,8%) são catalase positivo e coagulase negativo.
Destas, 25 linhagens foram escolhidas aleatoriamente e submetidas ao sistema API
STAPH, para a caracterização fenotípica das mesmas (Tabelas 1 e 2). Vinte e uma
(84%) das vinte e cinco linhagens foram identificadas como Staphylococcus ssp,
uma linhagem (4%) foi identificada como Kocuria varians e três (12%) apresentaram
perfil duvidoso. Considerando as linhagens identificadas como Staphylococcus,
Staphylococcus xylosus foi a espécie dominante (42,8%), seguida por S.
saprophyticus (28,5%), S. lentus (19%), S. epidermidis (4,7%) e S. warneri (4,7%).
Papamanoli et al. (2002) encontraram S. saprophyticus como a espécie dominante,
seguida por S. xylosus, S. carnosus em embutido fermentado seco. Samelis et al.
(1998) mostraram que S. saprophyticus e S. xylosus dominaram a população de
Micrococcaceae em salame tradicional grego. Essas espécies ocorrem em várias
regiões da Europa e são relatadas em alguns estudos sobre isolamento e
caracterização fenotípica de micrococos em produtos cárneos: S. saprophyticus
(SEAGER et al., 1986; COPPOLA et al., 2000), S. epidermidis (KOTZEKIDOU, 1992;
COPPOLA et al., 2000) e S. xylosus (MIRALLES et al., 1996; COPPOLA et al.,
2000).
S. xylosus é a espécie dominante na maioria de embutidos fermentados
secos, sendo usada como cultivo iniciador por causa de sua contribuição na
formação do flavor e da cor. Por outro lado, S. saprophyticus e S. epidermidis são as
espécies dominantes encontradas na pele de humanos e, ocasionalmente, isoladas
da pele de animais domésticos. Essas espécies são provavelmente adquiridas da
pele e da carne de suínos, ou de manipulação humana durante o processamento de
embutidos. Uma vez que S. saprophyticus e S. epidermidis são reconhecidos como
patógenos oportunistas isolados do trato urinário humano, não são recomendados
para o uso como cultivos iniciadores.
A maioria das linhagens identificadas como S. xylosus apresentou as
características típicas das espécies (Tabelas 1 e 2), como redução de nitrato
(88,8%), produção de acetoína (77,7%), produção de ácido a partir de xilose (77,7%)
e manose (88,8%), mas não de rafinose (11,1%). Algumas linhagens identificadas
como S. xylosus não fermentaram xilose e manose, como também relatado por
60
Drosinos et al. (2005) e Samelis et al. (1998). Poucas linhagens identificadas como
S. saprophyticus foram capazes de reduzir nitrato (33,3%), enquanto 83,3%
produziram acetoína. As linhagens identificadas como S. saprophyticus, em sua
maioria, não produziram ácido pela fermentação de manose e xilose, mas foram
capazes de fermentar maltose e trealose.
A seleção de linhagens que apresentam características desejáveis é
necessária para obter embutidos fermentados com propriedades tecnológicas e
sensoriais apropriadas. O primeiro critério na seleção de linhagens para uso como
cultivos iniciadores é redução de nitrato, uma vez que influencia na formação da cor
(GARCIA-VARONA et al., 2000). Outros critérios secundários também devem ser
avaliados como produção de acetoína e atividade de urease. No presente trabalho,
linhagens identificadas como S. xylosus apresentaram características desejáveis,
também informadas por Drosinos et al. (2005): atividades de nitrato redutase e
urease e produção de acetoína. De acordo com Smith e Palumbo (1983), tolerância
para NaCl e NaNO2 e crescimento entre 27°C e 43°C são outras caracte rísticas
importantes. Linhagens testadas no presente trabalho mostraram atividades de
catalase positivo e coagulase negativo, crescimento a 15°C e 45°C, nas
concentrações de NaCl (10% e 15%) e nos valores de pH 5,0 e 5,5 em caldo BHI
(Tabela 3).
Tabela 1
Testes bioquímicos para a identificação de Staphylococcus isolados de embutidos
naturalmente fermentados
Identificação Isolados Redução
Nitrato Uréia Acetoína
Acetil-
glucosamina Arginina Catalase Coagulase
S. xylosus 9(36) 8(88,8) 4(44,4) 7(77,7) 8(88,8) 8(88,8) 9(100) 0
S.
saprophyticus 6(24) 2(33,3) 5(83,3) 5(83,3) 4(66,6) 0 6(100) 0
S. lentus 4(16) 3(75) 0 0 4(100) 1(25) 4(100) 0
S. epidermidis 1(4) 1(100) 1(100) 0 1(100) 1(100) 1(100) 0
S. warneri 1(4) 1(100) 1(100) 0 1(100) 0 1(100) 0
Perfil duvidoso 3(12) 2(66,6) 1(33,3) 0 0 2(66,6) 3(100) 0
Obs: Os valores entre parênteses representam % de isolados positivos.
O crescimento das linhagens não foi inibido em substrato sólido (ágar BHI)
sob diferentes concentrações de NaCl, mostrando tolerância a uma concentração de
3% deste sal (Figura 1). A linhagem AD1 mostrou acentuada diminuição no
61
crescimento, de 7 log UFC/mL para 8 log UFC/mL. Sete (7) das nove (9) linhagens
toleraram uma concentração de 200 µg/g de NaNO2 e seu crescimento não foi
mudado considerando a ausência de NaNO2 (Figura 2).
Tabela 2
Perfil de fermentação de carboidratos de Staphylococcus isolados de embutidos
naturalmente fermentados
Identificação Glucose Mannose Maltose Lactose Treal ose Manitol Xylose Sucrose Rafinose
S. xylosus 9(100) 8(88,8) 9(100) 8(88,8) 9(100) 9(100) 7(77,7) 8(88,8) 1(11,1)
S.
saprophyticus
6(100) 3(50) 6(100) 5(83,3) 6(100) 4(66,6) 1(16,6) 6(100) 0
S. lentus 4(100) 4(100) 4(100) 4(100) 4(100) 4(100) 3(75) 4(100) 4(100)
S. epidermidis 1(100) 1(100) 1(100) 0 0 1(100) 0 1(100) 0
S. warneri 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 1(100) 0 1(100) 0
Perfil duvidoso 3(100) 2(66,6) 3(100) 1(33,3) 2(66,6) 3(100) 1(33,3) 2(66,6) 1(33,3)
Obs: Os valores entre parênteses representam % de isolados positivos.
Tabela 3
Caracterização de Staphylococcus xylosus (caldo BHI) isolados de embutidos naturalmente
fermentados
AB1 AC3 R1 S4 AD5 AD1 Q3 M4 U5
pH
5,5 + + + + + + + + +
5,0 + + + + + + + + +
Temperatura
150 + + + + + + + + +
450 + + + + + + + + +
NaCl
10% + + + + + + + + +
20% + + + + + + + + +
Obs: + representa crescimento positivo.
As linhagens AB1 e AC3 mostraram diminuição do crescimento na presença
de 200 µg/g de NaNO2, de 8 log UFC/mL para 3 log UFC/mL. Ao mesmo tempo sete
(7) das nove (9) linhagens não apresentaram diferenças no crescimento quando
NaCl e NaNO2 foram usados simultaneamente, mostrando apropriada tolerância
(Figura 3).
62
7,9
8
8,1
8,2
8,3
8,4
8,5
8,6
8,7
8,8
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
% NaCl
log
CF
U/m
L
AB1
AC3
R1
S4
AD5
AD1
Q3
M4
U5
Figura 1 - Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log UFC/mL) isoladas de
embutidos naturalmente fermentados em diferentes concentrações de NaCl.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 50 100 150 200 250
NaNO2 (µµµµg/g)
log
CF
U/m
L
AB1AC3R1S4AD5AD1Q3M4U5
Figura 2 - Crescimento de linhagens de Staphylococcus xylosus (log UFC/mL) isoladas de
embutidos naturalmente fermentados em diferentes concentrações de NaNO2.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
AB1 AC3 R1 S4 AD5 AD1 Q3 M4 U5
Strains
log
CF
U/m
L
0%
NaCl 3% + NaNO2 200 µg/g
Figura 3 - Crescimento (log UFC/mL) de linhagens de Staphylococcus xylosus isoladas
de embutidos naturalmente fermentados, em caldo adicionado de NaCl e NaNO2.
Linhagens
63
A presença de sais de cura, como nitrato e nitrito de sódio, melhoram a cor do
produto e possuem uma importante ação bacteriostática contra Clostridium
botulinum e microrganismos patogênicos. No entanto, mesmo que a redução de
nitrito assegure a formação de cor em embutidos fermentados, é necessário que
no produto final estejam presentes baixos níveis de nitrito residual diminuindo o
risco de formação de nitrosaminas, porém não é recomendado que esses níveis
atinjam valores muito reduzidos para que possa manter a proteção do produto
(HUGAS E MONFORT, 1997). A capacidade de cultivos iniciadores em reduzir
nitritos pode dever-se à atividade enzimática de nitrito redutase ou pela redução do
pH. Medidas espectrofotométricas não apresentaram níveis detectáveis de nitrito
residual em testes realizados e no controle nem apresentaram variações na
concentração inicial de NaNO2. Considerando-se que o pH foi ajustado para 5,0 e
a atividade de nitrito redutase não foi avaliada, podemos supor que a redução de
nitrito ocorreu por ação de linhagens de S. xylosus.
As linhagens de S. xylosus também apresentaram atividades lipolítica e
proteolítica (HAMES e HERTEL, 1998). No presente trabalho a atividade lipolítica
foi testada nas nove (9) linhagens isoladas e em todas elas foi constatada e
identificada em placas testes como um halo laranja fluorescente sob luz UV
(Tabela 4). Martín et al. (2005) observaram tal atividade em 99 linhagens de S.
xylosus isoladas de embutidos ligeiramente fermentados, num total de 194
microrganismos.
Tabela 4
Atividade lipolítica de Staphylococcus xylosus isolados de embutido naturalmente
fermentado
AB1 AC3 R1 S4 AD5 AD1 Q3 M4 U5 Atividade
lipolítica + + + + + + + + +
Obs: + representa atividade lipolítica positiva (halo laranja sob luz fluorescente UV).
Para executar a caracterização molecular de linhagens de S. xylosus isoladas
de embutidos naturalmente fermentados, iniciadores que ampliam fragmentos
específicos do gênero Staphylococcus e da espécie de S. xylosus foram usados.
Nove linhagens identificadas como S. xylosus e uma como S. epidermidis foram
selecionadas para análises de PCR, uma vez que a identificação pelo método
64
fenotípico tem limitações e pode resultar em identificação equivocada (RHODEN e
MILLER, 1995; BLAIOTTA et al., 2003; MOROT-BIZOT et al., 2006). Nove entre
dez linhagens apresentaram o fragmento esperado quando iniciadores
TstaG422/Tstag765 foram usados, confirmando que as linhagens isoladas
pertencem ao gênero Staphylococcus (Figuras 4 e 5). A figura 4 mostra uma
reação em que 50 ng de DNA molde foram usados. Como algumas linhagens não
apresentaram o fragmento esperado, a reação foi repetida com 2 µL de DNA
molde sem diluição (Figura 5). Concentração de DNA molde parece influenciar a
reação com iniciadores TstaG422/Tstag765. Tal influência não foi observada em
reações onde iniciadores XYLF/XYLR foram usados (Figura 6).
Figura 4 - Amplificação PCR com iniciadores para gênero TstaG422/Tstag765, usando 50 ng de DNA molde. Linhas 1 e 14: marcador 50 bp (Promega); linha 2: controle (S. xylosus ATCC 29971); linha 3: controle (água); linhas 4 – 13: linhagens selvagens de GCC+ isolados de embutidos fermentados naturalmente. Somente duas linhagens confirmaram pertencer à espécie S. xylosus, uma
vez que estas foram as únicas linhagens que deram um produto de PCR esperado
de 539 bp quando usados iniciadores espécie-específicos para S. xylosus (Figura 6).
As outras linhagens não apresentaram nenhum fragmento, sugerindo que
pertençam a outras espécies de Staphylococcus e estejam em discordância com a
caracterização fenotípica. Resultados semelhantes foram relatados por Morot-Bizot
et al., (2003), cujas pesquisas identificaram como S. xylosus 7 de 27 linhagens
isoladas de alimentos pelo sistema API STAPH e caracterizadas molecularmente
por PCR espécie-específico. Em contraste, Di Maria et. al. (2002) obtiveram
concordância entre as caracterizações fenotípica e genotipíca das linhagens
submetidas.
350bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
65
Figura 5 - Amplificação PCR com iniciadores para gênero TstaG422/Tstag765 usando 2 µL de DNA (em torno de 215 ng). Linhas 1 e 15: marcador 50 bp (Promega); linha 2: controle positivo (S. xylosus ATCC 29971); linha 3: controle negativo (água); linhas 4 – 13: linhagens selvagens de GCC+ isoladas de embutidos fermentados naturalmente; linha 14: controle negativo (L. plantarum ATCC).
Figura 6 - Amplificação PCR com iniciadores espécie-específico XYLF/XYLR. Linha 1: marcador 1 kb (Invitrogen); linha 2: controle negativo (água); linha 3: controle positivo (S. xylosus ATCC 29971); linhas 4 – 13: linhagens selvagens de GCC+ isoladas de embutidos fermentados naturalmente.
CONCLUSÃO
Esses resultados demonstram que os métodos moleculares são
significativamente importantes para identificação ao nível de espécie, uma vez que
permitiram uma identificação precisa de linhagens de S. xylosus. A presença
destas espécies na microbiota de embutidos naturalmente fermentados produzidos
na Região Sul do Brasil indicam uma boa capacidade de adaptação das mesmas
neste tipo de produto. As duas linhagens de S. xylosus caracterizadas
molecularmente, mostraram atividade das enzimas nitrato redutase, catalase e
lipase, crescimento satisfatório na presença de NaCl e NaNO2 e capacidade de
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
539bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
350bp
66
redução de nitritos, apresentando, portanto, potencial para uso como cultivos
iniciadores em embutidos fermentados.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi apoiada por EMBRAPA, UNIJUÍ e UFSC.
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3 VIABILIDADE DE LINHAGENS DE Staphylococcus xylosus ISOLADAS DE
EMBUTIDOS ARTESANAIS PARA APLICAÇÃO COMO CULTIVOS I NICIADORES
EM PRODUTOS CÁRNEOS
Artigo 2
Artigo com aceite para publicação em:
Brazilian Journal of Microbiology
71
Viabilidade de linhagens de Staphylococcus xylosus isoladas de
embutidos artesanais para aplicação como cultivos i niciadores em
produtos cárneos
Ângela Maria Fiorentini,1 2 Maristela Cortez Sawitzki,1 Teresinha Marisa Bertol,3
Ernani S. Sant’Anna1.
RESUMO
Investigamos a viabilidade de linhagens de Staphylococcus xylosus (AD1 e U5) isoladas de embutidos com fermentação natural, para aplicação como cultivos iniciadores em embutidos fermentados produzidos na Região Sul do Brasil. O estudo demonstrou que cepas de Staphylococcus xylosus (AD1 e U5) apresentaram crescimento significativo durante a fermentação, estabilidade no processo de liofilizacão e conservação, ausência de produção de enterotoxinas e viabilidade para aplicação como cultivo iniciador simples ou associado com bactérias lácticas na elaboração de embutidos fermentados.
Palavras-chave: Staphylococcus xylosus, cultivos iniciadores, embutidos cárneos.
SUMMARY
Viability of Staphylococcus xylosus isolated from artisanal sausages for
application as starter cultures in meat products
We investigated the viability of Staphylococcus xylosus strains AD1 and U5 isolated from natural fermented sausages for application as starter cultures in fermented sausages produced in the South Region of Brazil. The study demonstrated that the Staphylococcus xylosus strains AD1 and U5 showed significant growth during fermentation, stability over freeze-dried process and negative reaction for staphylococcal enterotoxins and viability for using as a single-strain culture or associated with lactic acid bacteria for production of fermented sausages.
Key words: Staphylococcus xylosus, starter cultures, sausages.
1 Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina, Rod. Admar Gonzaga, 1346, 880034-001, Florianópolis, SC, Brasil. 2Depto. de Biologia e Química - UNIJUÍ RS 344, km 39, 98900-000, Santa Rosa, RS, Brasil.
3EMBRAPA SUÍNOS e AVES, BR 153, km 110, 89700-000, Concórdia, SC, Brasil.
72
INTRODUÇÃO
Diferentes microrganismos advindos de matérias-primas e do ambiente são
contaminantes naturais de misturas de embutidos secos (LARROUTURE et al.,
2000). Linhagens de Micrococcaceae e também de Bactérias Ácido Lácticas (BAL)
são microrganismos importantes usados como cultivos iniciadores em fermentações
de carnes. A adição das mesmas em embutidos cárneos pode melhorar a segurança
e a estabilidade do produto estendendo a vida de prateleira, além de proporcionar a
diversidade resultando em novas propriedades sensoriais (LÜCKE, 2000).
A bactéria Staphylococcus xylosus (Micrococcaceae) é uma das espécies de
estafilococos prevalecentes, encontradas naturalmente na maioria dos embutidos
fermentados produzidos na Itália e Espanha (BLAIOTTA et al., 2004; GARCIA-
VARONA et al., 2000), em produtos cárneos da Slovákia (SIMONOVÀ et al., 2006) e
em produtos cárneos salgados tradicionais Tunisianos (ESSID et al., 2007). Na
indústria de carne, esta espécie é usada como um cultivo iniciador para embutidos
fermentados, em virtude de suas propriedades tecnológicas, uma vez que melhora o
desenvolvimento de cor pela atividade nitrito e nitrato redutase, previne a
rancificação e igualmente a formação de off-flavor pela atividade de catalase e
contribui para o desenvolvimento de flavor devido às atividades proteolítica e
lipolítica (MARTÍN et al., 2005; GALGANO et al., 2003). A seleção de microbiota
nativa para formulação de cultivos iniciadores pode ser uma ferramenta para
preservar as características típicas desses produtos (MAURIELLO et al., 2004). Isso
porque, os cultivos iniciadores mais promissores são aqueles isolados de produtos
cárneos naturalmente fermentados onde eles estão mais bem adaptados e
representam a população dominante (DROSINOS et al., 2005).
Porém, para selecionar uma linhagem apropriada com vistas a empregá-la
como cultivo iniciador, não só as propriedades tecnológicas são importantes, mas
também os aspectos relativos à segurança devem ser considerados. Um dos
aspectos se refere à capacidade de estafilococos coagulase negativo (SCN) produzir
substâncias antagônicas contra bactérias patogênicas (SIMONOVÀ et al., 2006;
PAPAMALONI et al, 2002), cuja propriedade pode ser importante para a segurança
de embutidos. Por outro lado, algumas linhagens de S. xylosus, S. saprophyticus e
Staphylococcus spp. originadas de alimentos podem produzir enterotoxinas
(RODRÍGUEZ et al., 1996; PADMAPRIYA et al., 2003). As enterotoxinas
estafilocócicas (ES) são uma família de nove principais tipos sorológicos de
73
enterotoxinas estáveis ao calor que causam gastroenterites como resultado do
consumo de alimento contaminado (BALABAN e RASOOLY, 2000). De acordo com
McLauchlin et al. (2000), a presença de genes de toxinas verificada pelo método de
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) não indica necessariamente, a capacidade
do microrganismo de produzir toxina biologicamente ativa suficiente para induzir
manifestações clínicas. Todavia, deve ser demonstrado que não são produzidas
enterotoxinas por linhagens de SCN quando selecionadas para uso como cultivo
iniciador em produtos cárneos (RODRÍGUEZ et al., 1996).
Para a seleção de um microrganismo Micrococcaceae como um cultivo
iniciador para embutidos fermentados, é importante que o mesmo não apresente
atividade de inibição contra BAL, em virtude da contribuição desse grupo ser
importante, principalmente para a produção de ácido láctico, que inibe crescimento
de patógenos (LÜCKE, 2000). Os cultivos iniciadores utilizados na produção
industrial de embutidos fermentados secos consistem de misturas de bactérias ácido
lácticas e Micrococcaceae (BUCKENHÜSKES, 1993). Assim, o sinergismo entre
esses dois grupos é essencial.
Para preservar essas bactérias isoladas por longos períodos de tempo, é
necessário usar métodos que mantenham as culturas viáveis e menos sujeitas às
variações. A liofilização é considerada como um dos melhores processos para
preservar a viabilidade de microrganismos, e particularmente, de bactérias e fungos
(FIGUEIREDO, 2001). As vantagens mais importantes da liofilização na preparação
de culturas é a excelente estabilidade de armazenamento e a fácil manipulação
durante o armazenamento, a distribuição e aplicação (BUCKENHÜSKES, 1993).
O objetivo do presente trabalho foi investigar a viabilidade de linhagens de
Staphylococcus xylosus (AD1 e U5) isoladas de embutidos naturalmente
fermentados, para uso adicional como cultivo iniciador em embutidos fermentados,
como também avaliar os aspectos de segurança.
74
MATERIAL E MÉTODOS
Linhagens bacterianas
A bactéria Staphylococcus xylosus foi a espécie dominante (42,8%) entre as
linhagens isoladas de embutidos naturalmente fermentados na Região Sul do Brasil,
quando caracterizadas fenotipicamente e duas linhagens (AD1 e U5) foram
confirmadas pela caracterização molecular como espécie S. xylosus (FIORENTINI et
al., 2007a). Ambas as linhagens foram selecionadas para esse estudo, considerando
as suas propriedades: atividade catalase positivo, capacidade para reduzir nitrito e
nitrato e atividade lipolítica. As linhagens de referência usadas nos testes foram
adquiridas da Coleção da Fundação André Tosello (Brasil): Lactobacillus plantarum
ATCC 8014, Listeria monocytogenes NTC 098630, Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus aureus ATCC 12598. Uma linhagem de Lactobacillus plantarum
isolada de embutido artesanal, fabricado sem adição de cultivo iniciador na região
Sul (Brasil), também foi usada nos testes (SAWITZKI, et al., 2007).
Cultivo das linhagens
Os cultivos foram iniciados de culturas estoques plaqueadas em ágar BHI
(Brain Heart Infusion, MERCK) e incubadas a 35°C/18h. Uma colônia foi tr ansferida
para caldo BHI (MERCK) e incubada a 35°C/18h, segui da pela transferência de 1%
de inóculo de células em suspensão para caldo BHI (MERCK). Finalmente, 1% de
inóculo foi transferido a um fermentador (New Brusnswick Scientific, modelo Bioflo
2000, EUA), com 4,5 L de caldo BHI (MERCK). A fermentação foi conduzida sob as
seguintes condições: temperatura de 35ºC±0,1ºC, agitação de 100 rpm e aeração de
0.7 vvm (L de ar/L meio/minuto) por 24 horas.
As amostras, em triplicata, foram assepticamente coletadas em frascos
estéreis a cada 2 horas durante o período de fermentação. Contagem de células
viáveis foi realizada através de cultivo em placas, em ágar BHI (MERCK) e incubada
a 350C/48h. Leituras de densidade óptica (DO) do meio de fermentação foram
executadas em espectrofotômetro (Hitachi U 2010) a 630 nm, de acordo com
Kanasaki et al. (1975).
75
Fermentação e liofilização
As linhagens de Staphylococcus xylosus (AD1 e U5) (inóculo inicial - 9 log
UFC. mL-1 ) foram cultivadas em 4,5 L de caldo BHI (MERCK) em um fermentador
(New Brusnswick Scientific, modelo Bioflo 2000, E.U.A) sob as seguintes condições:
350C± 0,1ºC, agitação de 100 rpm e aeração de 0.7 vvm (L de ar/L meio/minuto), por
10 a 12 h.
As células foram concentradas por centrifugação a 4000 x g, 30 min, 4°C
(Novatécnica RC, modelo NT825, Brasil), ressuspensas a 1/50 do volume de caldo
original em leite desnatado reconstituído (10% m.v-1) como crioprotetor e congelado
a - 200C. A liofilização foi executada em um liofilizador (Terroni Fauvel, modelo LT
1000/8, Brasil) por 18 a 24 h. As culturas liofilizadas foram armazenadas a -20°C,
até o uso na preparação de embutidos. Os experimentos de fermentação e
liofilização como também estudos de estabilidade foram realizados em duplicata,
para cada linhagem.
Estabilidade de armazenamento
As culturas liofilizadas foram armazenadas a -200C por dois diferentes
períodos: até quatro semanas ou seis meses. Após o período de armazenamento,
as culturas liofilizadas foram ressuspensas em água peptonada estéril 0,1%
(MERCK) (10mg/100 mL e diluições subseqüentes), crescidas em placas com ágar
BHI (MERCK) (350C/48 h). A população bacteriana foi determinada por análise de
contagem em placas para avaliar a estabilidade das culturas a -20ºC.
Detecção de enterotoxina
Para a detecção de enterotoxina, um auto-analisador VIDAS (Biomeriéux,
Brasil) e um kit VIDAS® Staph enterotoxina (Biomeriéux, Brasil) foram usados. O
princípio deste sistema Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) é o uso de
anticorpos de anti-enterotoxinas policlonais e, sete sorotipos de enterotoxinas (SEA,
SEB, SEC1, 2, 3, SED e SEE) (BERGDOLL, 1983). As linhagens foram cultivadas
em caldo BHI overnight e seguiu-se o protocolo de extração conforme orientações
do fornecedor. Resultados foram expressos como valor relativo de fluorescência
76
(VRF), calculado pela diferença das duas medidas (leitura do branco e após a
incubação do substrato com enzima). Esse cálculo aparece na folha de resultados.
O VRF obtido é interpretado pelo sistema VIDA, como segue: quando TV (Teste
Valor) < 0, 13, interpretação negativa e TV ≥ 0, 13, interpretação positiva.
Atividade antagonística
Efeitos antagonísticos de isolados de S. xylosus (AD1 e U5) foi detectada,
seguindo a técnica em gota (spot on the lawn) (LEWUS et al., 1991; OKEREKE, e
MONTVILLE, 1991). Em placas com ágar TSAYE (Trypticase Soy Agar - MERCK),
acrescido de 0,6% extrato de levedura (Yeast Extract - MERCK), foi gotejado na
superfície central 2�L de cada caldo BHI com culturas em overnight, contendo as
linhagens de S. xylosus (AD1 e U5) e incubou-se anaerobiamente a 350C por 48h.
Depois do período de incubação com conseqüente crescimento, uma sobrecamada
de aproximadamente 8 mL de caldo BHI (MERCK), contendo 1% de ágar (MERCK)
e 5 - 6 log UFC.mL-1 dos seguintes microrganismos L. plantarum ATCC 8014, L.
plantarum isolada de embutido artesanal, L. monocytogenes NTC 098630, E. coli
ATCC 25922, e S. aureus ATCC 12598, foi adicionada em cada placa. As placas
com a sobrecamada e uma placa controle (sem adição de microrganismo) foram
incubadas anaerobiamente a 30ºC por 48h. Um halo de inibição formado ao redor do
crescimento do microrganismo teste, indicou a atividade antagonística.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As linhagens de Staphylococcus xylosus AD1 e U5 cultivadas em caldo BHI
(MERCK), foram monitoradas pela contagem de células viáveis e leituras de
densidade ótica (DO), durante um período de 24 horas. Na figura 1b, a evolução da
Curva de Absorbância demonstra que, no período de 10 horas de fermentação das
linhagens AD1 e U5, foram obtidos 1.346 e 1.702 de absorbância relativa à
contagem de células viáveis de 11 log UFC. mL-1, respectivamente (Figura. 1a). O
pH do meio de fermentação apresentou uma pequena redução no período inicial (2 -
6 horas), permanecendo constante até o final da fermentação (Figura 1c).
A fermentação foi monitorada por leituras de DO e interrompida em 10 h (fase
de crescimento logarítmica), quando os valores obtidos por leitura
77
espectrofotométrica a 630 nm alcançaram a contagem relativa de células viáveis de
11 log UFC. mL-1 - 12 log UFC. mL-1.
O nível de inóculo de cultivos iniciadores a ser acrescentado à fermentação
de embutidos depende do potencial de crescimento do organismo no produto, sendo
considerado necessário em torno de 6 - 8 log UFC por grama de produto (LÜCKE,
2000). Então, para uso das linhagens AD1 e U5 como cultivos iniciadores em
embutidos, será necessário um período de aproximadamente 10 horas de
fermentação para obter o número desejado de células. Há poucas publicações sobre
cultivo de Micrococcaceae, embora muitas espécies de Staphylococcus sejam
usadas como cultivos iniciadores na indústria de produtos cárneos.
0
5
10
15
20
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 24
tempo (horas)
log
(ufc
/mL)
S.xylosus AD1 S.xylosus U5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 24
tempo (horas)
abso
rban
cia
(DO
)
S. xylosus AD1 S. xylosus U5
5
5,5
6
6,5
7
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 24
tempo (horas)
pH
S. xylosus AD1 S. xylosus U5
Figura 1 - Fermentação de Staphylococcus xylosus AD1 e U5 em caldo BHI a 350C.
a) Contagem de células viáveis durante o tempo de fermentação; b) Curva de Absorbância
relativa ao tempo de fermentação (D.O.); c) Variação de pH do meio de fermentação.
Condições desejáveis de armazenamento para iniciadores liofilizados são:
temperaturas abaixo de -15°C e a ausência de oxigên io e umidade. Sob essas
condições, a atividade ótima do cultivo iniciador será garantida durante 8 meses
(BUCKENHÜSKES, 1993). Neste estudo, depois de 1 mês e 6 meses de
armazenamento a - 200C, culturas de S. xylosus (AD1 e U5) apresentaram boa
estabilidade ao processo de liofilização. Pequena diminuição foi observada no
número de células durante o armazenamento, permanecendo a 11 log UFC. mL-1
(Tabela 1).
Essa estabilidade, provavelmente, é devida ao efeito positivo das condições
de armazenamento, assim como do crioprotetor usado (leite desnatado). De acordo
com Carvalho et al. (2004), leite desnatado pode prevenir dano celular estabilizando
a membrana da célula e provendo uma camada protetora para as células.
(a) (b) (c)
78
Tabela 1
Contagens de linhagens S. xylosus AD1 e U5 após a liofilização (inicial) e durante o periodo
de estocagem a - 500C
Inicial (log UFC. g-1)
1 mês (log UFC. g-1)
6 meses (log UFC. g-1)
S. xylosus AD1 11,47 11,41 11,04 S. xylosus U5 11,62 11,60 11,54
Não foram encontradas enterotoxinas estafilocócicas nas linhagens de S.
xylosus (AD1 e U5), isto é, observaram-se reações negativas para as sete
enterotoxinas estafilocócicas testadas por ELFA (dados não apresentados). A não
produção de enterotoxinas é uma característica importante das espécies usadas
como cultivos iniciadores, porque vários estudos demonstraram a capacidade de
estafilococos coagulase negativo (SCN) produzir enterotoxinas (CRASS e
BERGDOLL, 1986; VALLE et al., 1990), uma característica relacionada às espécies
coagulase positivas. Porém, poucos estudos foram realizados para determinar a
capacidade enterotoxigênica de SCN em alimentos. Noventa amostras de salames
industrializados foram analisadas por Pereira e Pereira (2006), tendo-se constatado
que nenhuma das 266 linhagens de SCN produziu enterotoxinas. Destas, 252
linhagens foram identificadas e aproximadamente 90% delas resultaram em S.
xylosus e S. carnosus.
As linhagens isoladas de S. xylosus (AD1 e U5) não exibiram atividade
antimicrobiana contra os seguintes microrganismos patogênicos nas condições
testadas: L. monocytogenes NTC 098630, E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC
12598. Igualmente, uma vez que não foi observado um halo de inibição ao redor da
colônia analisada (Tabela 2), linhagens de S. xylosus não apresentaram atividade
antagônica contra L. plantarum ATCC 8014 e uma linhagem isolada de L. plantarum.
Resultados semelhantes foram relatados por Drosinos et al. (2007), em que
nenhuma linhagem Staphylococcus spp apresentou atividade antimicrobiana contra
L. monocytogenes NCTC 10527, S. aureus NCBF 1499 e E. coli O157: H7 NCTC
12079.
As duas linhagens testadas não apresentaram halo de inibição para com as
linhagens de Lactobacillus plantarum, comprovando um sinergismo entre esses dois
grupos, o que é importante para futuras aplicações dessas linhagens em embutidos
fermentados.
79
Tabela 2
Atividade antagonista e antimicrobiana de linhagens de S. xylosus isoladas e linhagem de
referência contra linhagens selecionadas
S. xylosus AD1 S. xylosus U5
L. plantarum ATCC 8014 - -
L. plantarum strain Isolated - -
S. aureus ATCC 12598 - -
E. coli ATCC 25922 - -
L. monocytogenes NTC 098630 - -
Símbolos: +, ampla zona de inibição (≥ 3.0 mm); (+), pequena zona de inibição (≤ 3.0 mm); - nenhuma zona de inibição. Mauriello et al. (2004) e Fiorentini et al. (2007), constataram que muitas
linhagens de S. xylosus possuem propriedades tecnológicas que as qualificam como
cultivos iniciadores para produtos cárneos fermentados. Em particular, linhagens
AD1 e U5 apresentaram crescimento significativo durante a fermentação em caldo
BHI, estabilidade no processo de liofilização e conservação e boa atividade nas
propriedades estudadas, como ausência de atividade antagônica contra bactérias
ácido lácticas e reação negativa para enterotoxinas estafilocócicas.
O estudo demonstrou a viabilidade de linhagens de Staphylococcus xylosus
AD1 e U5 para aplicação como cultivos iniciadores simples ou associados com
bactérias ácido lácticas (BAL) na produção de embutidos fermentados. Como
também a segurança de seu uso, uma vez que não houve produção de
enterotoxinas pelas mesmas.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi apoiada por EMBRAPA, UNIJUÍ e UFSC.
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4 INFLUÊNCIA DE LINHAGEM NATIVA DE Staphylococcus xylosus NAS
CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS, FÍSICO-QUIMICAS E SENSORIAIS
EM SALAME TIPO MILANO
Artigo 3
Artigo submetido para publicação em:
Brazilian Archives of Biology and Technology
85
Influência de linhagem nativa de Staphylococcus xylosus nas características microbiológicas, físico-químicas e sensoriais em
salame tipo Milano Ângela Maria Fiorentini, 1,2* Maristela Cortez Sawitzki, 1 Teresinha Marisa Bertol,3 Anildo Cunha Júnior,3 Ernani S. Sant’Anna.1
RESUMO A análise da influência de culturas iniciadoras nativas nas características microbiológicas, físico-químicas e sensoriais de salame tipo Milano foi o objeto deste estudo. Foram produzidos dois grupos de salame tipo Milano: Grupo A - com aplicação de linhagem Staphylococcus xylosus U5 enquanto o controle, Grupo B, foi produzido sem cultivos iniciadores. O salame tipo Milano foi caracterizado pela importante atividade microbiana de estafilococos coagulase negativo (SCN), que resultou em significativo crescimento no Grupo A durante a maturação, com contagem inicial de 7,60 ufc.g-1 e alcançando um crescimento de 9,84 cfu.g-1 depois de 14 dias. As enzimas bacterianas que mostraram eficiente atividade sob as condições encontradas no salame tipo Milano foram catalase, nitrito e nitrato redutase, contribuindo para as propriedades físico-químicas e sensoriais do produto. Não houve diferenças significativas na composição geral dos ácidos graxos livres entre as amostras, enquanto os parâmetros de cor (L*, a* e b*) obtidos no salame inoculado (Grupo A) diferiram significativamente em relação ao controle (Grupo B) e foi o grupo preferido pelos degustadores. Palavras- chave: Staphylococcus xylosus, cultivos iniciadores, salame tipo Milano
ABSTRACT
Influence of native strain Staphylococcus xylosus on the microbiological, physicochemical and sensorial characteristics in Mi lano salami type
The influence of native starter cultures on the microbiological, physicochemical and sensorial characteristics of Milano salami type was studied. Two batches of Milano salami type were produced: Batch A, added of Staphylococcus xylosus U5 and Batch B (control), produced without starter culture. The Milano salami type was characterized by an important microbial activity of coagulase-negative staphylococci (CNS) that resulted, in Batch A, in substantial growth during ripening with an initial count of 7.60 log CFU.g-1 and reached in 9.84 log CFU.g-1 after 14 days. Bacterial enzymes that showed efficient activity under conditions found in Milano salami type were catalase, nitrite and nitrate reductase, contributing for sensory and physicochemical properties of the product. There were not significant differences in 1Depto. de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina, Rod. Admar Gonzaga, 1346, 880034-001, Florianópolis, SC, Brasil 2Depto. de Biologia e Química - UNIJUÍ RS 344, km 39, 98900-000, Santa Rosa, RS, Brasil 3EMBRAPA SUÍNOS e AVES, BR 153, km 110, 89700-000, Concórdia, SC, Brasil *[email protected]
86
general free fatty acids composition among batches, while color parameters (L *, a * and b *) in the inoculated salami (Batch A) presented significantly higher values in relation to control (Batch B). Moreover, batch A had the higher preference in sensorial analysis. Key words: Staphylococcus xylosus, starter cultures, milano salami type
INTRODUÇÃO
Embutidos fermentados podem ser definidos como produtos cárneos que
consistem em uma mistura de carne e partículas de gordura, sal, agentes de cura,
especiarias (temperos), etc. os quais adquirem suas propriedades características por
um processo no qual microrganismos são envolvidos (HAMMES, 1990).
Fermentações espontâneas foram aplicadas por milhares de anos, primeiramente
como um método para preservação dos gêneros alimentícios ao longo do ano e,
secundariamente, como um modo para obter alimentos condimentados e
aromatizados (DROSINOS et al., 2007).
Geralmente, Bactérias Ácido Lácticas (BAL) e Micrococcaceae são os dois
principais grupos envolvidos na fermentação de embutidos curados secos (LÜCKE e
HECHELMANN, 1987; COVENTRY e HICKEY, 1991).
A fabricação de embutidos fermentados tem uma longa história no Brasil.
Fruto da influência da imigração italiana no princípio do século vinte, ainda mantém
relação com suas tradições de origem. Por exemplo, apesar do uso de cultivos
iniciadores ter-se tornado comum na fabricação de vários tipos de produtos
fermentados, muitos embutidos artesanais típicos são ainda produzidos com
tecnologias tradicionais sem a utilização de iniciadores selecionados.
Uma grande diversidade de microrganismos já foi isolada desse tipo de
fermentação por métodos tradicionais, principalmente representados por
estafilococos coagulase negativo (SCN) pertencentes às espécies Staphylococcus
xylosus, S. saprophyticus e S. carnosus (COPPOLA et al., 1997; GARCIA-VARONA
et.al., 2000; PAPAMANOLI et al., 2002; MAURIELLO et al., 2004; DROSINOS et al.,
2005), e uma grande variedade de linhagens foi isolada e caracterizada em termos
de suas propriedades tecnológicas, principalmente proteólise (FADDA et al., 1998;
BOVER-CID et al., 1999), lipólise (MOLLY et al., 1996; MAURIELLO et al., 2004),
produção de compostos antimicrobianos (AYMERICH et al., 2000; MESSENS et al.,
87
2003, DROSINOS et al., 2007), decarboxilação de aminoácidos específicos
(MARTUSCELLI et al. 2000; BOVER-CID et al., 2001) e outros (MAURIELLO et al.,
2004).
SCN tem um papel importante no desenvolvimento do aroma como também
no flavor e cor de produtos cárneos fermentados (JESSEN, 1995). Eles têm várias
vantagens tecnológicas, como atividade nitrito e nitrato redutase, consumo de
oxigênio e atividade de catalase, que melhoram a estabilidade de cor e diminui o
desenvolvimento de ranço no produto (GEISEN, LÜCKE e KRÖCKEL, 1992;
BARRIÉRE et al., 2001). Berdagué et al. (1993), estabelece uma correlação entre o
tipo de cultivo iniciador e o flavor de embutidos fermentados, e Montel et al. (1996)
provaram que Staphylococcus contribuem à geração de flavor típico de embutidos
fermentados, possivelmente pela capacidade proteolítica e lipolítica (RODRÍGUEZ et
al., 1998; BERDAGUÉ et al., 1993).
S. xylosus é uma das espécies de Staphylococcus prevalecentes encontradas
na maioria de embutidos fermentados naturalmente (MONTEL et al., 1992;
COPPOLA et al., 1997; REBECCHI et al., 1998; COCOLIN et al., 2001), e, de fato,
em estudos prévios, comprovou-se a presença dessas linhagens em embutidos
artesanais na região Sul do Brasil (FIORENTINI et al., 2007a).
Com respeito a essas propriedades, S. xylosus é considerado um candidato
satisfatório como um cultivo iniciador, ou para uso na produção de embutidos. Na
seleção de um cultivo iniciador satisfatório, deve ser levado em conta que a
linhagem tem que competir com as mesmas espécies, ou com espécies
relacionadas, acontecendo em um único ambiente, denominado house flora
(SANTOS et al., 1998).
Na produção de embutidos fermentados tradicionais, devido a uma baixa
variabilidade na microbiota presente, é importante usar cultivos iniciadores
selecionados, consistindo em linhagens isoladas de produtos locais e, assim, bem
adaptadas ao produto em particular e à tecnologia de produção específica (PAPA e
GRAZIA, 1990). Além de estarem bem adaptados no microambiente eles poderiam
dominar a microbiota dos produtos cárneos fermentados (PAPAMANOLI et al.,
2003). De acordo com a legislação brasileira, o uso de cultivos iniciadores é
permitido e eles são considerados como coadjuvantes de tecnologia (BRASIL,
2000).
88
Em estudos prévios, realizou-se a identificação da linhagem S. xylosus U5,
isolada da microbiota de embutidos naturalmente fermentados, e em virtude do seu
potencial tecnológico (FIORENTINI et al, 2007a), da viabilidade da mesma no
processo fermentativo, estabilidade na liofilização e reação negativa para
enterotoxinas (FIORENTINI et al., 2007b) é recomendado para uso como cultivo
iniciador em embutidos fermentados. Por essa razão, o objetivo do presente trabalho
foi investigar a influência do cultivo iniciador Staphylococcus xylosus U5 nas
características microbiológicas, físico-químicas e sensoriais em salame tipo Milano.
MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismo
O microrganismo Staphylococcus xylosus U5 pertence ao grupo de
microrganismos isolados de embutidos artesanais coletados em vinte e uma cidades
da Região Sul do Brasil. Essa linhagem foi selecionada para uso como cultivo
iniciador com base na sua atividade de catalase positiva, capacidade para reduzir
nitrito e nitrato, atividade lipolitica e nenhuma produção de enterotoxinas em caldo.
Também foi submetida à caracterização fenotipica e molecular (FIORENTINI et al.,
2007a; FIORENTINI et al., 2007b).
Preparação de cultivos iniciadores
A cultura liofilizada de Staphylococcus xylosus U5 foi ressuspensa em água
destilada estéril ausente de cloro, depois, adicionada à mistura de carne na
concentração de 9 log UFC por grama de matéria-prima. Seguiu-se a recomendação
de Terra (1998) em que a concentração da cultura iniciadora a ser adicionada deve
ser superior em dois ciclos logarítmicos à contagem inicial de microrganismos
presentes na matéria-prima.
Preparação de salame tipo Milano
O salame tipo Milano foi fabricado em um local de indústria sob condições
tradicionais, matérias-primas selecionadas e boas práticas de fabricação. Os
89
embutidos tiveram a seguinte composição: carne suína (53,5%); carne bovina
(17,8%); toucinho lombar (17,8%); NaCl (2,8%); nitrato e nitrito de sódio (0,45%); e
demais ingredientes como: maltodextrinas, eritorbato de sódio, leite em pó
desnatado; vinho tinto e mistura de condimentos.
Os embutidos fermentados foram preparados a partir da moagem/trituração
das carnes e da gordura suína, adicionando-se os demais ingredientes. Depois de
misturados, dois grupos foram preparados: Grupo A: adicionado da cultura S.
xylosus U5 (9 log UFC.g-1 de matéria-prima); e Grupo B (controle): sem nenhuma
cultura adicionada. Na seqüência foram embutidos em invólucro de colágeno (70
mm de diâmetro). Após, os embutidos, com aproximadamente 800 g cada, foram
transferidos à sala de maturação e então de acordo com os parâmetros de umidade
relativa e temperatura, submetidos às seguintes condições durante o processo de
maturação, respectivamente: 25 °C e 95% (1º dia), 2 4°C /93% (2º dia), 23°C / 90%
(3º dia), 22°C / 85% (4º dia), 21°C / 80% (5º dia), 20°C / 75% (6º dia) e 18°C /75%
(7º dia), com a manutenção dessas condições (18°C / 75%) até o 420 dia, em que se
completa a maturação.
Procedimento de amostragem
Dois grupos de embutidos preparados conforme descrições anteriores foram
usados para os experimentos conduzidos pelo período de 42 dias. Amostras foram
tomadas, aleatoriamente, de cada grupo ao 10, 70, 140, 210, 280 e 420 dias após
formulação para a realização das respectivas análises. Duas repetições foram
realizadas por tratamento.
Análises microbiológicas
As amostras foram submetidas a análises microbiológicas para monitorar a
dinâmica de variações durante armazenamento de embutidos e a sua qualidade
higiênica. Em particular, foram transferidos 25 g de cada amostra em uma bolsa de
stomacher estéril e 225 mL de água peptonada estéril na concentração de 0,1%
(Oxoid) foram adicionados e misturados por 1 min em homogeneizador Stomacher
(ITR, mod.MK 1204). Diluições decimais consecutivas em água peptonada 0,1%
foram preparadas e 1 mL ou 0,1mL de amostras de diluições apropriadas foi vertido
90
ou esparramado em placas, em duplicata. As análises foram determinadas de
acordo com APHA (1992): (a) contagens de aeróbios mesófilos foram determinadas
em Plate Count Agar - PCA (Oxoid), incubados em 48-72 h a 300C; (b) BAL em ágar
MRS (De Man Rogosa and Sharp, Oxoid) com incubação por 72 h a 300C sob
condições anaeróbias; (c) Cocos Gram positivo, catalase positivo em ágar BHI
(Brain Heart Infusion, Oxoid) incubados por 48 h a 350C; (d) coliformes totais em
caldo Brilhant Green Bile (2%) (BGBB, Oxoid) por 48 h a 370C (método NMP); (e)
coliformes termotolerantes em caldo EC (Oxoid) incubados por 24 h a 420C (método
NMP); (f) Staphylococcus aureus (coagulase positivo) em meio BP (Baird-Parker,
Oxoid) com emulsão de telurito adicionada de gema de ovo (Oxoid), incubados por
24-48 h a 370C; (g) leveduras e bolores em ágar batata glicose (Oxoid),
suplementados com tetraciclina (1 mg/mL, Sigma) com incubação durante 5-7 dias a
250C; (h) Clostridium sulfito-redutor em ágar Base Perfringens - TSC (Oxoid),
incubado anaerobiamente por 48 h a 370C; (i) para a detecção de Salmonella ssp.,
pré-enriquecimento foi feito suspendendo 25 g de amostra em 225 mL de água
peptonada tamponada 1% (Merck) e incubação por 16-20 h a 370C. O
enriquecimento seletivo foi realizado transferindo 0,1 mL do meio pré-enriquecido
para 10,0 mL do caldo Rappaport-Vassiliadis (Merck) e para 10,0 mL do caldo base
Selenite Cystine (Oxoid), respectivamente. Em seguida, todos os tubos foram
incubados por 24 h a 420C. Após a incubação, cada caldo seletivo enriquecido foi
semeado em ágar modificado BPLS (Merck) e agar XLD (Merck). Em seguida, todas
as placas foram incubadas por 24 a 48h a 370C; (j) para a detecção de Listeria ssp,
o enriquecimento foi realizado adicionando 25,0 g da amostra em 225,0 mL de caldo
Fraser (Merck), seguido da incubação por 24 h a 30ºC. Então, 0,1 mL da cultura
enriquecida foi estriado sobre ágar Palcam (Merck) e ágar Oxford (Merck) incubado
por 48 h a 300C.
Os testes foram realizados em duplicata e os resultados da contagem da
população microbiana foram expressos em log UFC. g-1 (unidades formadoras de
colônias por grama de amostra), ou número mais provável por grama de amostra
(NMP . g-1).
91
Análises físico-químicas
As amostras foram trituradas e misturadas em um multiprocessador (Tecnal
Turratec TE-102) e liofilizadas (Virtis Unitop/1000L). Para monitorar as mudanças
químicas dinâmicas, durante e no final do processo (42 dias) de
fermentação/maturação do salame tipo Milano, a intervalos de 7 dias, foram
analisados: umidade, cinzas (forno mufla), proteína bruta (nitrogênio Kjeldahl),
lipídios (extrato etéreo), valores de peróxidos, acidez (% de ácido láctico), (1 mL de
NaOH(0,1N ) = 0,0090 g ácido láctico) e conteúdo de nitrato e nitrito foi realizado de
acordo com AOAC (2002).
A atividade de água (aw) foi determinada utilizando-se o equipamento Testo
400 CE (Testo GMBH & CO, Brasil). O pH foi medido através de potencial elétrico,
usando um pHmetro digital (Digimed) conectado com um eletrodo inserido
diretamente na amostra em suspensão em temperatura equilibrada para 25 ºC.
De acordo com Granadillo et al. (1995), análises de ferro e sódio foram
realizadas. Foram pesados aproximadamente 500 mg de amostras em um tubo de
digestão (22 x 250 mm), adicionado de 6,0 mL de HNO3:HClO4 8:1 (v/v) e aquecido
de acordo com o seguinte: 90ºC.30 min-1, 160ºC.40 min-1 (rampa de 10ºC. min-1),
180ºC .20 min-1; depois, esfriado sob temperatura ambiente até o desaparecimento
de vapor branco. Após a digestão, foram adicionados 2,5 mL de HCl(6M) e
completado o volume para 25 mL com água deionizada. A análise de Ferro (Fe) foi
determinada por meio de espectrometria de absorção atômica: amostras diluídas
foram diretamente aspiradas para o espectrômetro (Varian SpectrAA 220) equipado
com lâmpada cátodo-oco, usando chama de ar/acetileno. A quantidade de sódio
(Na) foi determinada em fotômetro de chama (Micronal B262). Ambos, ferro e sódio,
foram quantificados conforme parâmetros operacionais recomendados pelo
fabricante dos respectivos equipamentos.
Determinação de ácidos graxos livres
Inicialmente, as amostras foram liofilizadas (Virtis Unitop/1000L) e depois os
lipídios foram extraídos de acordo com Folch, Less e Stanley (1957). Deste extrato,
foi retirada uma alíquota de 10 mL e a concentração total de lipídios foi determinado
gravimetricamente. Uma alíquota adicional, contendo aproximadamente 100 mg de
92
lipídio foi esterificada e a composição de ácidos graxos determinada através de
cromatografia gasosa.
O extrato seco de lipídios foi esterificado com uma solução de cloreto de
amônio e ácido sulfúrico em metano (HARTMAN e LAGO, 1973). Ésteres metílicos
de ácidos graxos foram analisados em cromatógrafo gasoso (CG) (Shimadzu GC-
2010) acoplado a um espectrômetro de massa (Shimadzu QP2010). A separação foi
executada em uma coluna capilar MS-5 (30 m;·0,25 mm I.D. x 0.25 µm film
thickness) (Restec Rtx®). Gás Hélio ultrapuro foi utilizado como gás de arraste com
um fluxo de 1,0 mL . min-1. O programa de temperatura foi de 1500C elevando-se
para 2200C (20C min-1), mantida por 15 min. Foram injetadas amostras de 1 µl em
modo de split (100:1) e a temperatura do injetor foi de 2500C. Foram obtidos
espectros de massa sob as seguintes condições: 70 eV de impacto eletrônico com
energia do elétron, modo scan com m/z de 40-400 u. Fonte de íons aconteceu a
temperatura de 2200C e interface a 2500C.
Por comparação dos respectivos espectros de massa com o banco de dados
da biblioteca (NIST05) os ácidos graxos livres foram identificados, considerando-se
uma similaridade superior a 90%. Os resultados foram expressos em percentual de
área normalizada. A quantificação estimada foi determinada por normalização e
transformação do porcentual de área em g . 100 g-1 de amostra, usando o fator de
conversão para lipídios (F). Um valor de F de 0,956 foi utilizado para os produtos
cárneos processados baseado em Holland et al. (1994).
Duas medidas independentes foram feitas para cada amostra, obtendo-se a
média e o desvio padrão.
Avaliação de Cor
A avaliação de cor foi determinada para os Grupos A e B de salame tipo
Milano ao término do período de maturação, usando o colorímetro (Chroma Meter
CR-300, Minolta). Foram realizadas medidas de cor do CIE Lab, L* (lightness -
luminosidade/brilho), a* (redness - vermelho) e b* (yellowness - amarelo), em três
pontos da superfície de duas fatias (10mm). Ao todo, foram obtidas seis medidas
para cada amostra.
93
Detecção de enterotoxinas
Para a detecção de enterotoxinas foi usado um auto-analizador VIDAS
(Biomeriéux) e um kit VIDAS® Staph enterotoxina (Biomerieux). A extração de
enterotoxinas das amostras (Grupos A e B) foi procedido como descrito no protocolo
para produtos cárneos, instruções de acordo com o manual (SET 2 kit). O valor
relativo de fluorescência (VRF) obtido foi interpretado pelo sistema VIDAS como
segue: quando VT (Valor de Teste) < 0,13, interpretação negativa (ausência de
enterotoxinas) e VT ≥ 0,13, interpretação positiva (presença de enterotoxinas).
Análise sensorial
A análise foi realizada ao término do período de maturação dos embutidos por
um painel de 70 degustadores no laboratório de análise sensorial. Estes eram
estudantes e professores do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos e
não foram treinados previamente para avaliação sensorial de produtos cárneos. O
método usado foi a ordenação de preferência (ABNT/NBR12994/1993 e
NBR13170/1994), solicitando para que as amostras fossem degustadas pelos
participantes e ordenadas em seqüência de maior para menor preferência. Todos os
participantes assinaram o TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, em
conformidade com o Projeto 189/05: Desenvolvimento de cultivos iniciadores para a
produção de embutidos cárneos artesanais, aprovado em 27 de junho de 2005, pelo
Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Federal de
Santa Catarina.
Análise estatística
Os dados foram avaliados através de análise de variância (ANOVA) aplicando
o Teste - t para determinar diferenças entre as médias ao nível de significância de
5% (p< 0,05), utilizando o programa STATISTICA Versão 6.0.
94
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados das análises microbiológicas de salame tipo Milano durante a
fermentação e maturação são apresentados na Figura 1. Inicialmente, contagens de
aeróbios mesófilos foram ligeiramente baixos no Grupo B, enquanto o Grupo A
apresentou um número inicial mais alto. Após o período de 14 dias, as contagens
foram de 8,62 log UFC.g-1 e 6,49 log UFC.g-1, respectivamente nos grupos A e B
(Figura 1b).
Para os cocos Gram positivo, catalase positivo - Staphylococcus Coagulase-
negativo (SCN) as contagens no grupo inoculado (Grupo A) mostraram considerável
crescimento durante a maturação. Com uma contagem inicial de 7,60 log UFC.g-1
alcançaram valores de 9,84 log UFC.g-1 depois de 14 dias. No controle (Grupo B),
esses microrganismos foram encontrados em concentrações muito baixas, e depois
de 14 dias alcançaram valores de 6,95 log UFC.g-1 (Figura 1a). Este substancial
crescimento no Grupo A (2 log) foi contemplado pela baixa concentração de
bactérias ácido lácticas (BAL) durante a fermentação e maturação, alcançando
níveis máximos em torno de 6,34 log UFC.g-1 (Figura 1c), não afetando a
sensibilidade de Micrococcaceae na presença de alta acidificação (PALUMBO e
SMITH, 1977; LÜCKE, 1985). De acordo com trabalhos de Comi et al. (1992) e
Samelis et al. (1993) em embutidos fermentados fabricados em escala artesanal,
Micrococcaceae pode ser mais competitivo e alcançar contagens mais altas, 1-2 log,
no caso de um pH final de 5,5. BAL não foram utilizadas como cultivo iniciador,
assim, contagens das mesmas não foram diferentes nas amostras inoculadas e no
controle; na realidade, diversas espécies de BAL fazem parte da microbiota da
carne.
Coliformes totais e termotolerantes (<3 NMP) foram semelhantes em ambos
os grupos; entretanto, nas amostras inoculadas (Grupo A), o número destes
microrganismos diminuiu nitidamente e, depois de 7 dias de maturação, nenhuma
célula viável de coliformes totais e termotolerantes foi detectado. Enquanto que, no
controle, coliformes totais e termotolerantes estiveram presentes após 7 dias e só
depois de 21 dias de maturação não foram detectáveis, ambos estavam ausentes no
produto final. Bolores e leveduras não apresentaram nenhuma função significante
nos embutidos, estiveram presentes a níveis máximos de cerca de 2,77 log UFC.g-1
e, na maioria dos casos, não foram detectados. Estes resultados no produto final
95
estão de acordo com a legislação brasileira para os padrões microbiológicos de
produtos cárneos maturados (BRASIL, 2001), e comprovam a necessidade de boas
práticas de fabricação, para obter reduzida contaminação de microrganismos
indesejáveis em produtos cárneos.
0
2
4
6
8
10
0 7 14 21 28 42
tempo (dias)
log
cfu/
g
Batch A
control
0
2
4
6
8
10
0 7 14 21 28 42
tempo (dias)
log
cfu
/g
Batch A
control
0
2
4
6
8
0 7 14 21 28 42tempo (dias)
log
cfu/
g
Batch A
control
Figura 1 - Evolução da microbiota durante maturação de salame Milano. a) Cocos Gram positivo, catalase positivo; b) aeróbios mesófilos; c) BAL. Ambos os grupos estavam livres de Salmonella e Listeria após formulação,
como também números de Clostridium sulfito redutores (<1) e Staphylococcus
coagulase positivo (<2) durante a maturação e no produto final. De acordo com
Drosinos et al. (2005), isto indica a importância de selecionar matérias-primas de
boa qualidade microbiológica para produção de embutido seco.
Os resultados das análises físico-químicas do salame tipo Milano durante a
fermentação e maturação são apresentados na Tabela 1. As medidas dos valores de
pH durante a maturação não variaram entre os grupos (A e B). Provavelmente, pelas
baixas contagens de BAL, responsáveis pela redução de pH devido à produção de
ácido láctico e o pequeno efeito das linhagens de Staphylococcus no
desenvolvimento de pH nos embutidos. De acordo com Olesen et al. (2004), as
linhagens de Staphylococcus produzem quantidades muito limitadas de ácido.
Inicialmente, as medidas de pH de ambos os grupos foi em torno de 5,6 e, então,
diminuíram para valores de 5,2 depois de 7 dias de maturação; foi observado um
leve aumento no pH do produto final, com valores ao redor de 5,3 entre os grupos,
de acordo com resultados de Galgano et al., (2003). Isto poderia ser atribuído à
produção de amônia e outros compostos básicos como peptídeos, aminoácidos,
aldeídos, aminas e ácidos graxos livres oriundos da atividade proteolítica
(MAURIELLO et al., 2004).
Na tabela 1, verifica-se que atividade de água (aw) e umidade mostraram uma
diminuição constante durante a maturação, e proteína, gordura, cinza, NaCl, Na e Fe
a) b) c)
96
aumentaram o conteúdo durante a maturação em conseqüência da desidratação
ocorrida no produto. Esses resultados, no produto acabado (42 dias), estão
conformes à legislação brasileira - Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade
de salame tipo Milano (BRASIL, 2000).
O baixo percentual de ácido láctico (%) (Tabela 1) provavelmente é resultado
da atividade de SCN, que produz quantidades muito limitadas de ácido, ou pela
presença de LAB, as quais fazem parte da microbiota da carne.
Nitrato e nitrito curam e preservam carnes. O nitrato não apresenta atividade
antioxidante, mas torna-se funcional na redução de nitritos (TERRA et al., 2004).
Assim, durante a preparação, nitrato é reduzido a nitrito, que é o principal
ingrediente ativo nessas misturas de sais de cura (CAMMACK, 1999). Nitratos e
nitritos diminuíram em concentração durante a fermentação e maturação de salame
tipo Milano e os valores no salame inoculado (Grupo A) foram estatisticamente
diferentes (p < 0,05) em relação ao controle (Figura 2). Atribui-se essa diferença às
bactérias Micrococcaceae, pois estudos mostraram que S. xylosus possui uma boa
habilidade para reduzir nitrato, pela ação da enzima nitrato redutase o que torna
possível a redução do mesmo até nitrito no produto (MONTEL et al., 1996; TALON
et al., 1999; MAURIELLO et al., 2004; FIORENTINI et al., 2007. As concentrações
de nitrito necessárias para a ocorrência dos vários efeitos em embutidos seriam de
30 a 50ppm para o desenvolvimento da cor; de 20 a 40ppm para o desenvolvimento
do aroma, de 80 a 150ppm para o efeito conservador (MÜLLER, 1991; ORDÓÑEZ et
al., 2005), e entre 20 a 50ppm para o efeito antioxidante; porém, esses valores
dependem do tipo de produto cárneo (LÜCKE, 2000). Em produtos fermentados, o
nitrito é reduzido para óxido nítrico, devido à ação da enzima nitrito redutase,
também presente em representantes da família Micrococcaceae, tendo reação mais
rápida em pH inferior a 5,6 e redução da velocidade em pH maior que 6,2 (ARNAU
et al., 1998). Para a enzima nitrito redutase agir como agente redutor, as contagens
de Micrococcaceae devem ser em torno de 6 log UFC.g-1 (CAMPBELL-PLATT e
COOK, 1995).
Durante a fermentação e maturação de salame tipo Milano, a redução no
nível de nitrito em ambos os tratamentos pode ter acontecido pela ação da enzima
nitrito redutase presente nas espécies de Micrococcaceae, sendo mais acentuada
no Grupo A (7 a 28 dias) (Figura 2) devido às contagens de cocos Gram poisitivo,
97
catalase positivo, serem iguais ou superiores a 6 log.UFC.g,-1 enquanto no grupo B
ficaram em torno de 14 a 21 dias (Figura 1).
A capacidade de redução de nitrito é mais uma ação de linhagens
Micrococcaceae, demonstrada pela ausência de nitrosaminas em produtos cárneos
fermentados (PINTO et al., 2001).
O índice convencional de oxidação lipídica, valor de peróxidos, também foi
avaliado neste estudo. Durante a maturação foram observados valores reduzidos no
Grupo A em relação ao Grupo B, estatisticamente significativos (p < 0,05),
demonstrando a atividade da catalase da linhagem S. xylosus U5 (catalase positivo)
(Tabela 1). A oxidação conduz à formação de peróxidos e os mesmos são reduzidos
quando estão presentes microrganismos com alta atividade de catalase (VARNAN e
SUTHERLAND, 1995). A atividade de catalase é considerada por ser importante na
remoção de peróxido de hidrogênio, que pode ser formado como um metabólito por
LAB e outras espécies de bactérias em embutidos.
De acordo com Cornforth (1996), os níveis de nitrito em embutidos também
têm efeito na inibição do desenvolvimento da rancidez. Produtos cárneos
tradicionais, como embutidos fermentados secos são interessantes modelos para
investigações, por serem um produto exposto significativamente às condições pró-
oxidantes. Os valores de peróxidos encontrados neste estudo estão dentro de níveis
aceitáveis (isto é, ao redor 2-4 mequivO2. kg-1) para uma boa qualidade de
embutidos fermentados secos e nenhum odor rançoso censurável (FERNÁNDEZ e
RODRÍGUEZ, 1991; JOHANSSON et al., 1994; GHIRETTI et al., 1997; NOVELLI et
al., 1998; ZANARDI et al., 1998).
Tabela 1
Variações nas análises físico-químicas durante a fermentação e maturação de salame tipo
Milano
Análises Dia 1 0 Dia 70 Dia 140 Dia 210 Dia 280 Dia 420
Umidade (%) Grupo A Grupo B
52,88±0,43 52,4± 0,3
42,6± 0,33 44± 0,28
42,5±0,35 41,7± 0,45
40,5±0,27 35,4± 0,53
35,9±0,10 32,09± 0,08
28,4±0,08 28,05± 0,1
Cinza (%) Grupo A Grupo B
4,1±0,2 4,6±0,1
5,1±0,4 5±0,4
5,2±0,1 5,3±0,38
5,4±0,01 5,8±0,27
5,8±0,06 5,8±0,12
6,2±0,3 6,4±0,8
Gordura (%) Grupo A Grupo B
21,9±0,37 22±0,2
25±0,03 24,9±0,08
24,1±0,2 24,8±0,11
24,6±0,04 26,4±0,09
26,6±0,41 28,1±0,15
29,01±0,07 30,02±0,18
98
Proteina (%) Grupo A Grupo B
19,09±0,2
18,95±0,06
n.d. n.d.
n.d. n.d.
n.d. n.d.
n.d. n.d.
32,82±0,07 32,01±0,86
NaCl (%) Grupo A Grupo B
3,21±0,0 3,24±0,03
n.d. n.d.
n.d. n.d.
n.d. n.d.
n.d. n.d.
4,80±0,12 4,91±0,01
aw Grupo A Grupo B
0,954±0,10 0,963±0,07
0,932±0,22 0,932±0,35
0,901±0,18 0,906±0,27
0,9±0,09
0,903±0,13
0,87±0,18 0,87±0,28
0,821±0,06 0,832±0,31
pH Grupo A Grupo B
5,6±0,2 5,68±0,03
5,24±0,12 5,34±0,07
5,28±0,14 5,38±0,05
5,25±0,03 5,21±0,08
5,21±0,0 5,20±0,03
5,3±0,03 5,25±0,06
Fe (mg/100g) Grupo A Grupo B
1±0,08 1±0,09
1,2±0,55 1,1±0,1
1,4±0,78 1,1±0,8
1,2±0,02 1,2±0,75
1,2±0,05 1,2±0,06
1,5±0,10 1,7±0,08
Na (mg100g) Grupo A Grupo B
2049,3±1,90 2061,2±2,1
2301,1±1,42 2174,7±1,79
2427±0,96 2321,6±1,35
2483,2±0,88 2476,5±1,98
2518,3±1,02 2734,6±0,97
2522,7±0,66 2865,9±1,11
Ácido láctico (%) Grupo A Grupo B
0,26±0,03 0,25±0,01
0,57±0,02 0,51±0,06
0,64±0,09 0,63±0,08
0,7±0,05 0,66±0,03
0,83±0,10 0,86±0,03
1±0,64 0,86±0,05
Peróxidos
*
(mEq.kg-1) Grupo A Grupo B
0,65±0,03 0,66±0,02
0,73±0,07 0,95±0,05
1,29±0,05 1,52±0,03
1,48±0,05 2,23±0,00
2,07±0,03 3,59±0,06
2,86±0,06 3,89±0,02
Os valores informados são as médias de três repetições. Os valores na direita referem-se ao desvio
padrão (D.S.). Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle. * Valores de peróxidos apresentaram diferença significativa entre os tratamentos.
0
50
100
150
200
250
300
0 7 14 21 28 42
Tempo (dias)
Nitr
ato
(mg/
kg)
Grupo A Grupo B
0
20
40
60
80
100
120
140
0 7 14 21 28 42
Tempo (dias)
Nitr
ito (m
g/kg
)
Grupo A Grupo B
Figura 2 - Mudanças na concentração de nitrato e nitrito durante a fermentação e
maturação de salame tipo Milano. Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle
Os principais ácidos graxos livres encontrados nos produtos e transformados
durante a maturação foram: C14:0; C16:0; C16:1 (9); C17:0; C18:0; C18:1 (9); C18:1
(11); C18:2 (9,12), como apresentado na tabela 2. Em ambos os grupos houve um
aumento progressivo na concentração de ácidos graxos com o transcorrer do
período de maturação, porém, pequenas diferenças puderam ser observadas entre
os tratamentos, não apresentando diferença significativa ao nível de 5%.
99
Mesmo considerando que linhagens de Staphylococcus é a principal causa da
lipólise em embutidos fermentados (SAMELIS et al., 1993), os valores indicam que a
cultura Staphylococcus xylosus U5 não desenvolveu ação significativa nas
transformações químicas de ácidos graxos livres. Resultados semelhantes foram
relatados por Montel, et al., (1993) em embutidos preparados assepticamente, o
grupo inoculado com linhagens de Staphylococcus teve um conteúdo de ácidos
graxos livres similares ao apresentado no grupo controle, sendo assim, processos
lipolíticos não puderam ser atribuídos a Staphylococcus. Molly et al. (1997)
estudando a lipólise em embutidos mostrou que a atividade das bactérias nesses
produtos é pequena, em virtude de que as condições do meio não oferecem
condições favoráveis para as lípases bacterianas. Em controvérsia, Stahnke (1994)
obteve resultados onde mais de 60% dos ácidos graxos livres foram resultantes do
processo lipolítico em embutidos com S. xylosus comparados aos embutidos
elaborados sem cultivos iniciadores. Isto indica que as linhagens de S. xylosus são
realmente lipolíticas como mostrado por outros trabalhos (COMI et al., 1992;
SORENSEN et al., 1993). Embora várias bactérias, selecionadas pela sua atividade
lipolítica são usadas como culturas iniciadoras comerciais, a adição de lipases
freqüentemente não afeta a avaliação sensorial de embutidos fermentados
(FERNÁNDEZ et al., 1991). Além disso, a atividade lipolítica bacteriana é
influenciada por vários fatores, inclusive o estado fisiológico da cultura usada, o tipo
de substrato, pH, temperatura, etc. (TALON et al., 1992). Mesmo que a linhagem
Staphylococcus xylosus U5 tenha apresentado atividade lipolítica (FIORENTINI et
al., 2007a), nas condições encontradas em salame tipo Milano, pouca atividade foi
demonstrada. Galgano et al., (2003) e Zuber et al., (2007) quando verificaram a
influência de várias linhagens de S. xylosus em embutidos, nenhum efeito foi
perceptível sobre a composição de ácidos graxos em embutidos inoculados em
relação ao controle.
Na figura 3 são apresentadas as percentagens relativas de ácidos graxos
livres saturados, monoinsaturados e polinsaturados, após 40 dias de maturação. Em
comparação com a amostra controle (Grupo B), a adição de cultivos iniciadores
(Grupo A) não causou significativas modificações nas percentagens relativas de
ácidos graxos livres. Em ambos os grupos os ácidos graxos monoinsaturados foram
predominantes, 46,99 e 45,08% sendo o ácido C 18:1 encontrado em maiores
concentrações, seguido pelo C 16:1 e em menores proporções os ácidos graxos
100
polinsaturados, 9,37 e 7,81, respectivamente. Os ácidos graxos livres insaturados
são importantes precursores do flavor em produtos cárneos fermentados maturados
(MOLLY et al., 1997; CHIZZOLINI et al., 1998).
A percentagem de ácidos graxos saturados foi de 39,92 e 37,38% para o
salame controle e inoculado, respectivamente, representados com maior percentual
os ácidos C16:0 e C18:0. É desejável um reduzido percentual desses ácidos em
alimentos, visto que os mesmos influenciam no aumento do nível de colesterol
sangüíneo. Resultados similares são informados na literatura para outros embutidos
fermentados comparáveis ao tempo de maturação (DOMÍNGUEZ-FERNÁNDEZ e
ZUMALACÁRREGUI, 1991; HIERRO et al., 1997; GALGANO et al., 2003; ZUBER et
al., 2007) e em salames tipo Milano (ZANARDI et al., 2002; CAMPOS et al., 2006).
Tabela 2 Evolução do conteúdo de ácidos graxos durante a fermentação e maturação de salame tipo
Milano Ácidos graxos
(g/100g)
Grupos
Tempo/dias 1 7 14 21 28 42
C14:0 C16:0
C 17:0 C18:0 C16:1(9) C18:1(9) C18:1(11) C18:2(9, 12)
A B
A B
A B
A B
A B
A B
A B
A B
0,32±0,03 0,31±0,06 5,17±0,16 5,07±0,16 0,09±0,01 0,09±0,01 2,79±0,45 3,08±0,05 0,42±0,03 0,39±0,03 8,62±0,65 9,77±0,01 0,59±0,06 0,69±0,04 2,10±0,38 2,57±0,09
0,36±0,04 0,35±0,08 5,70±1,28 5,69±1,03 0,10±0,02 0,10±0,01 3,03±0,99 3,12±0,26 0,46±0,11 0,36±0,06 9,39±2,09 9,82±0,11 0,63±0,11 0,67±0,08 2,65±0,78 2,75±0,06
0,38±0,07 0,36±0,00 5,80±0,09 5,78±0,25 0,05±0,04 0,06±0,01 2,84±0,07 3,05±0,50 0,47±0,06 0,47±0,02 9,61±0,23 9,93±0,34 0,61±0,23 0,68±0,02 2,76±0,43 2,66±0,21
0,36±0,01 0,40±0,25 5,72±1,29 6,16±1,51 0,05±0,01 0,07±0,00 3,03±0,69 3,32±0,15 0,46±0,09 0,50±0,09 9,33±3,02 10,32±0,49 0,65±0,16 0,72±0,5 2,37±1,17 2,78±0,78
0,39±0,11 0,43±0,03 6,31±0,74 6,74±0,06 0,06±0,01 0,05±0,00 3,42±0,04 3,54±0,06 0,49±0,01 0,53±0,02 10,52±0,04 11,22±0,04 0,75±0,17 0,76±0,01 2,62±0,21 2,92±0,40
0,42±0,01 0,42±0,08 6,52±1,35 7,13±0,38 0,12±0,05 0,07±0,01 3,35±1,03 3,38±0,25 0,55±0,08 0,55±0,01 11,18±2,03 12,12±0,42 0,82±0,06 0,87±0,01 2,17±0,87 2,70±0,36
Os valores informados são as médias de três repetições. Os valores na direita referem-se ao desvio
padrão (D.S.). Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle.
101
0
10
20
30
40
50
saturados monoinsaturados polinsaturados
Àcidos graxos
Per
cent
agem
rela
tiva
(%)
Grupo A
Grupo B
Figura 3 - Composição de ácidos graxos em salame tipo Milano: percentagem relativa
depois de 40 dias de maturação. Grupo A: adição de S. xylosus Grupo B: controle
Quanto aos parâmetros de cor obtidos em salame tipo Milano, houve
diferenças entre as cores dos Grupos A e B no produto final (Tabela 3). O Grupo A
mostrou valores significativamente mais altos (p < 0,05) de L* (brilho), a* (vermelho) e
b* (amarelo) em relação ao controle (Grupo B). Provavelmente a ação enzimática de
S. xylosus U5 influenciou nos valores de L*e a*, pois esta ação envolve a atividade
bacteriana de nitrato redutase que reduz nitrato a nitrito aumentando a
disponibilidade de NO que conduz à formação de nitrosomioglobina (coloração
vermelha). Outra contribuição de S. xylosus U5 está relacionada à produção de
catalase que degradando o peróxido de hidrogênio, impede o esverdeamento do
produto em conseqüência da reação de peróxido de hidrogênio com a mioglobina.
Os valores de b * são devido a conseqüente redução da oximioglobina em função do
consumo de oxigênio pelos microrganismos.
DELLAGLIO et al. (1996) estudando salame Felino, um embutido curado seco
italiano, encontrou valores semelhantes de L* (39,10±47,27), mais alto para a*
(22,13±30,08) mas mais baixos para b * (5,68±8,90). Pagan-Moreno et al. (1992),
em outro tipo de chorizo, encontrou valores mais baixos para L* (34,72±41,53) e a*
(13,87± 17,55), sendo os valores de b* mais semelhantes (9,33±14,10). Em carnes e
produtos cárneos, a luminosidade (L*) parece ser o parâmetro mais informativo para
variações de cor (MIELNIK e SLINDE, 1983), mas a importância do vermelho (a*)
não deveria ser ignorada (FERREIRA, FERNANDES e YOTSUYANAGI, 1994).
102
Tabela 3 Parâmetros de CIE L*, a* e b* em salame Milano após 40 dias de maturaçãoa.
L* (brilho) a* (vermelho) b* (amarelo) Grupo A (S. xylosus U5) 49,46 (1,90) 18,26 (0,78) 9,79 (0,90) Grupo B (controle) 42,27 (1,21) 13,59 (0,81) 8,06 (0,61) a Valores médios (com desvio padrão entre parênteses).
No presente estudo, não foi encontrado enterotoxinas estafilocócicas em
salame tipo Milano (Grupos A e B), o que descarta a possibilidade de produção de
enterotoxinas pela cultura inoculada (S. xylosus U5) ou por SCN presentes nos
produtos, garantindo assim um produto seguro para o consumo. A intoxicação
alimentar estafilocócica ocorre pela ingestão de enterotoxinas pré-formadas no
alimento, contaminado essencialmente pela manipulação humana ou matéria-prima
procedente de animais portadores. Cunha et al., (2006) analisou um total de 88
amostras de alimentos e quatro isolados de CNS foram positivos para genes de
enterotoxinas, quando detectados por Reação de Polimerase em Cadeia (PCR),
embora nenhuma produção de enterotoxina fosse detectada pelo método de
aglutinação em látex (RPLA). Muito pouco se conhece, porém, sobre o crescimento
de SCN em alimentos. Em concordância com os resultados obtidos no presente
trabalho, Pereira e Pereira (2006) analisaram 90 amostras de salames
industrializados, pertencentes a seis diferentes marcas, foram analisadas visando a
enumeração, identificação e verificação do potencial enterotoxigênico das espécies
de estafilococos coagulase negativa (SCN). Entre os 266 isolados de SCN nenhum
produziu enterotoxina, e dos 252 identificados cerca de 90% eram S. xylosus e S.
carnosus.
A avaliação sensorial indicou a preferência para o salame inoculado (72,5%)
em relação ao controle. A linhagem S. xylosus U5 possui um perfil enzimático
comprovado capaz de promover propriedades sensoriais desejáveis no salame, as
quais interferem na aceitabilidade do produto. É possível afetar a qualidade sensorial
do produto final pelo tipo de cultivo iniciador (BERDAGUÉ et al., 1993). As espécies
de Micrococcaceae são as maiores contribuintes na formação de flavor e cor em
produtos cárneos (MONTEL et al., 1996; STAHNKE et al., 2002). O flavor, que
acontece devido à capacidade de lípases e proteases estafilocócicas formando
compostos químicos característicos de salames, assim como, à capacidade de
produção de catalase impedindo a formação de compostos indesejáveis, e a cor,
103
pela produção da enzima nitrato redutase são atributos importantes para a
aceitabilidade de um embutido.
Em conclusão, a linhagem de Staphylococcus xylosus U5 estudada obteve
um bom crescimento durante a fermentação e maturação de salame tipo Milano. As
enzimas bacterianas, que mostraram eficiente atividade sob as condições
encontradas no salame, foram catalase, nitrito e nitrato redutase, em conseqüência
às propriedades físico-químicas e sensoriais apresentadas pelo produto. Os
parâmetros de cor foram superiores no salame inoculado e foi o produto preferido
pelos degustadores, porém não houve diferenças significativas na composição geral
dos ácidos graxos livres para este tipo específico de embutido. A linhagem S.
xylosus U5 pode ser usada como um cultivo iniciador simples em embutidos
fermentados ou em sinergismo com BAL, como sugere a ausência de antagonismo
entre ambas. No entanto, estudos adicionais são ainda necessários para avaliar
demais propriedades tecnológicas (atividade proteolítica, produção de compostos
aromáticos) de linhagens nativas de S. xylosus em embutidos fermentados.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi apoiada por EMBRAPA, UNIJUÍ e UFSC.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os embutidos artesanais possuem uma microbiota típica e diversificada. O
entendimento da dinâmica dessa população nos produtos elaborados pode melhorar
o processo de fermentação, a segurança e a padronização de tais produtos e,
conseqüentemente reduzir perdas econômicas, reforçando deste modo sua posição
em um mercado caracterizado pela crescente industrialização. Além disso, os
produtos de diferentes origens possuem diferente qualidade sensorial, sendo
apreciados pelo seu alto valor gastronômico.
As mais recentes pesquisas buscam explorar a biodiversidade presente em
produtos artesanais na busca de linhagens industrialmente importantes, que
possibilitam melhorar e aperfeiçoar o processo de fermentação de embutidos e
garantir produtos com melhores características organolépticas, mais seguros, e mais
saudáveis.
No presente estudo, isolou-se linhagens de Staphylococcus xylosus de
embutidos artesanais e depois de caracterizadas muitas propriedades tecnológicas
puderam ser comprovadas tais como: viabilidade para a fermentação e estabilidade
no processo de liofilização e armazenamento, reação negativa para enterotoxinas
estafilocócicas, sinergismo com as BAL, eficiente atividade de catalase, nitrito e
nitrato redutase, contribuindo para as propriedades microbiológicas, físico-químicas
e sensoriais do produto.
A pesquisa proporcionou o domínio da técnica de isolamento, a
caracterização e obtenção das culturas como cultivos iniciadores, porém a
continuidade dos estudos se faz necessária, como o desenvolvimento de um meio
de cultura alternativo para reduzir custos de produção das linhagens em larga escala
e avaliar a viabilidade econômica da aplicação destas culturas em embutidos,
comparando com o uso de uma cultura iniciadora comercial.
É fundamental a investigação de demais propriedades dessas linhagens,
entre elas, a atividade proteolítica e a produção de compostos aromáticos. Cabe
destacar a influência de Staphylococcus xylosus na formação de compostos
aromáticos em embutidos fermentados, o que as torna com potencial para aplicação
na produção de embutidos artesanais, visando um produto com característica
regional, identidade cultural e muito apreciado pelo consumidor.
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