ANÁLISE MORFOLÓGICA, MOLECULAR, …€¦ · E PROTEÔMICA DA RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO Ortleppascaris sp. - Rhinella marina JEFFERSON PEREIRA E SILVA BELÉM – Pará ... Marisa

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES

INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

ANÁLISE MORFOLÓGICA, MOLECULAR, HISTOPATOLÓGICA

E PROTEÔMICA DA RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO

Ortleppascaris sp. - Rhinella marina

JEFFERSON PEREIRA E SILVA

BELÉM – Pará

2013


ANÁLISE MORFOLÓGICA, MOLECULAR, HISTOPATOLÓGICA

E PROTEÔMICA DA RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO


Orientadora: Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos

Co-Orientador: Prof. Dr. Cláudio Lísias Mafra de Siqueira

BELÉM – Pará

2013

Dissertação apresentada para o Programa de Pós-

Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como requisito para a

obtenção do grau de Mestre em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientadora: Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos

Santos.

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) Sistema de Bibliotecas

da UFPA

Silva, Jefferson Pereira e, 1989-

Análise morfológica, histopatológica, molecular e proteômica da relação

parasito-hospedeiro Ortleppascaris sp.-Rhinella marina / Jefferson Pereira e Silva.

- 2013.

Orientadora: Jeannie Nascimento dos Santos;

Coorientador: Cláudio Lísias Mafra de Siqueira.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de

Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários, Belém, 2013.

1. Helminto. 2. Nematoda. 3. Relação hospedeiro-parasito. 4. Anuro. 5. Anfíbio. I.

Título.

CDD 22. ed. 592.57

1


ANÁLISE MORFOLÓGICA, MOLECULAR, HISTOPATOLÓGICA E

PROTEÔMICA DA RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal

do Pará, como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários.

Orientadora: Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos (Orientadora)

Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia Dra Reinalda

Marisa Lanfredi, ICB, UFPA

Co-orientador: Prof. Dr. Cláudio Lísias Mafra de Siqueira

Laboratório de Parasitologia e Epidemiologia Molecular, UFV

Banca examinadora: Prof. Dr Evonnildo Gonçalves (Titular)

Laboratório de Tecnologia Biomolecular, ICB, UFPA

Prof. Dr Marcio Roberto Teixeira Nunes (Titular)

Centro de Inovações Tecnológicas, IEC

Prof. Dr Leonardo dos Santos Sena (Titular)

Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Prof. Dr Adriano Penha Furtado (Suplente)

LBCH Dra Reinalda Marisa Lanfredi, ICB, UFPA

Data da Defesa: ____/_____/______

2

DEDICATÓRIA

Dedico de mais sincero coração este trabalho e esforço à minha mãe, Maria

Ivoneide Barbosa Pereira, que por sua generosidade e amor esquece os seus próprios

méritos empenhados na minha felicidade.

3

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

PROCAD-NOVAS FRONTEIRAS E PROPESP/FADESP, pelo auxílio financeiro para

a realização deste trabalho.

Ao Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade

Federal de Viçosa, com o apoio do Núcleo de Análise de Biomoléculas (NUBIOMOL)

do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de

Viçosa, pela infraestrturura.

Ao Professor Humberto Ramos pelas sugestões, amizade, incentivo e pelo

exemplo de competência e simplicidade em ajudar.

Aos amigos da Casa 21: Rose, Carla, Leandro, Ronnie pela agradável

convivência.

Às amigas queridas Ana Clara (irmã) e Fernanda, sem as quais não seria

possível a realização deste trabalho. Gostaria de registrar minha admiração, amizade e

meu infinito obrigado a vocês duas de modo especial.

À República “Doidimais”: Carol, Karen, Camila. Agregados: Rafael, Bruno,

Claudinha, Larissa e Flávia por terem feito dos meus dias em Viçosa dias inesquecíveis.

Aos melhores amigos que eu poderia ter: Lorena, Lázaro, Loriane, Tamyris,

Flávia e Rose, que sempre fazem da minha vida mais leve e feliz.

Adriano Furtado, que não poupou esforços em me apoiar durante toda a

realização desta dissertação, devo minha gratidão.

À Sandra e Dante, por terem sido uma família para mim.

À minha família do LBCH, em especial Elane, pelos conselhos. Djane e Tiago

pela grande amizade e companheirismo construídos.

Minha família, pelo apoio incondicional, em particular minha avó (mãezinha) e

Maria pelos ensinametos que só a sabedoria de um coração puro pode trazer.

À minha orientadora e amiga, Jeannie, por me permitir crescer como profissional

sem nunca esquecer de mim como pessoa, compreendendo minhas grandes limitações e

me fazendo superá-las. Este agradecimento é muito pouco frente a dimensão do que

sempre fez por mim. Meu carinho e admiração.

Por fim, a todos aqueles que se fizeram presentes, mesmo em pensamento, e

contribuíram para realização deste trabalho devo minha gratidão.

4

SUMÁRIO

RESUMO .............................................................................................................. 5

ABSTRACT ......................................................................................................... 6

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 7

1.1. O PARASITO Ortleppascaris sp. .............................................................. 7

1.2. O HOSPEDEIRO Rhinella marina (Linnaeus, 1758) ............................... 7

1.3. HISTOPATOLOGIA HEPÁTICA E HELMINTOLOGIA ................... 8

1.4. A BIOLOGIA MOLECULAR E HELMINTOLOGIA ........................... 10

1.5. PROTEÔMICA E SECRETOMA ........................................................... 12

1.6. ANÁLISE DE PRODUTOS HELMÍNTICOS ........................................ 14

1.7. HELMINTOS E IMUNOMODULAÇÃO ............................................... 15

1.8. POTENCIAIS MOLÉCULAS NA BIOLOGIA E PATOGENICIDADE

DOS HELMINTOS .................................................................................................... 18

1.9. Ortleppascaris x Rhinella marina: MODELO PARA ESTUDO DE

RELAÇÃO HELMINTO-HOSPEDEIRO ................................................................. 18

1.10. OBJETIVOS .......................................................................................... 20

1.10.1 Objetivo Geral: ................................................................................. 20

1.10.2. Objetivos Específicos: ..................................................................... 20

2. ARTIGOS..................................................................................................... 21

2.1. ARTIGO 1 ................................................................................................ 21

2.2 ARTIGO 2 ................................................................................................. 30

2.3. ARTIGO 3 ................................................................................................ 39

2.4. ARTIGO 4 ................................................................................................ 72

3. CONCLUSÃO .............................................................................................. 102

3.1 TAXONOMIA E BIOLOGIA MOLECULAR DE Ortleppascaris sp. . 102

3.2. HISTOPATOLOGIA DA INTERAÇÃO Ortleppascaris sp. x R. marina

.................................................................................................................................. 102

3.3. ANÁLISE PROTEÔMICA DA INTERAÇÃO Ortleppascaris sp. x R.

marina ....................................................................................................................... 103

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 105

5

RESUMO

Helmintos são organismos complexos, que podem causar infecções em seres

humanos e animais, as quais são frequentemente negligenciadas. Contudo, estudos

sobre a morfologia e biologia de helmintos parasitos são necessários para o melhor

entendimento das relações parasito-hospedeiro. Neste trabalho é descrita a ocorrência

do nematódeo Ortleppascaris sp., parasito encontrado em fígado de Rhinella marina,

abordando aspectos morfológicos, genéticos, histológicos e proteômicos visando o

entendimento da relação desenvolvida pelo anfíbio hospedeiro e o helminto parasito. A

metodologia utilizada inclui taxonomia alfa, análise ultraestrutural e biologia molecular

para fornecer dados taxonômicos sobre o nematódeo e contribuir para sua sistemática.

Análises histopatológicas identificaram as alterações morfo-fisiológicas no órgão-alvo a

partir da infecção e o impacto causado pelo parasito no hospedeiro bem como a reação

deste frente ao invasor. A análise proteômica, através de eletroforese bi-dimensional e

espectrometria de massas, foi realizada a fim de identificar derivados helmínticos

constituintes de Ortleppascaris sp. além de outras moléculas envolvidas nesta complexa

relação parasito-hospedeiro, permitindo a triagem de marcadores proteicos relativos a

este modelo de estudo. Esta pesquisa adiciona portanto dados sobre a morfologia, status

filogenético e distribuição geográfica de Ortleppascaris sp., permite a avaliação da

dinâmica do processo infeccioso causado pelo helminto e aponta possíveis moléculas

importantes para o campo de estudo de produtos e biomarcadores helmínticos de

interesse humano e veterinário.

6

ABSTRACT

Helminths are complex organisms, that can be responsible for human and animal

infections, which are frequently neglected. However, studies about morphology and

biology of helminthes parasites on are necessary for a better understanding of thehost-

parasite relationship.. The present work describes the occurrence of nematode

Ortleppascaris sp. parasiting the liver of Rhinella marina using morphological, genetic,

proteomic and histological approaches to understand the relationship developed by

amphibian host and helminth parasite. The methodology include alpha taxonomy,

molecular biology and ultrastructural analysis were published, discussingto provide

data about the nematode taxonomy contributing for the systematic of this group.

Histopathology studies, identified the morpho-physiological alterations in the infected

organ assessing the impact caused by the parasite in the host as well as the reactions of

the parasite. Proteomic approaches, using two-dimensional electrophoresis and mass

spectrometry, were performed to identify derivatives constituents helmintics of

Ortleppascaris sp. and other molecules involved in this complex relationship between

parasite-host, allowing the screening of protein markers related to these helminthes. The

present work added new data on the morphology, geographical distribution and

phylogenetic status of the Ortleppascaris sp., allows the evaluation of the dynamics of

infection caused by those helminthes and shows important molecules for the field of

study of anthelmintic products and biomarkers of human and veterinary interest.

7

1. INTRODUÇÃO

1.1. O PARASITO Ortleppascaris sp.

Os nematódeos do gênero Ortleppascaris Sprent, 1978 foram registrados, em

sua forma larval, parasitando fígados de anfíbios como Eleutherodactylus cf.

terraebolivaris, em Tobago por Moravec e Kaiser (1995); Leptodactylus bufonius

Boulenger, 1894, na Argentina, por Gonzáles e Hamann (2006) e Chaunus fernandezae

Gallardo, 1957 por Gonzáles e Hamann (2007) no mesmo país.

Sua forma adulta é encontrada no trato gastrintestinal de animais da Ordem

Crocodylia (Goldberg et al., 1991), tais como Caiman crocodilus (no Brasil), Caiman

sclerops e Crocodylus intermedius (na Venezuela), Crocodylus rhombifer, Caiman

yacare, Alligator mississippiensis, distribuídos pela América do Sul, Cuba, e no sul dos

Estados Unidos (Sprent, 1978; Catto, 1991; Moravec & Kaiser, 1995; Gonzáles &

Hamann, 2007; Wadle et al., 2009).

Entretanto, apesar destes parasitos terem sido registrados em fígados de anfíbios,

o ciclo de vida e modo de infecção desse gênero é ainda desconhecido, pois vale

destacar que anfíbios não são parte significante da dieta de crocodilianos (Sprent, 1978;

Wadle et al., 2009).

As características morfológicas mais relevantes para definição taxonômica de

larvas no gênero Ortleppascaris, são: posição das aletas laterais, as quais se estendem

desde as proximidades do anel nervoso até a região do ânus; o esôfago estreito,

consideravelmente longo; a presença de ventrículo e de ceco intestinal. São também

considerados importantes para a Taxonomia de larvas os dados do comprimento e

largura do corpo do helminto, posição do poro excretor, posição do anel nervoso,

comprimento e largura de esôfago, do ventrículo, do ceco intestinal e comprimento da

porção posterior de acordo com Moravec & Kaiser (1995) e Gonzáles & Hamann (2006,

2007).

1.2. O HOSPEDEIRO Rhinella marina (Linnaeus, 1758)

Os anfíbios constituem uma classe de animais vertebrados, pecilotérmicos e que

não possuem bolsa amniótica, cuja característica mais marcante é o ciclo de vida

dividido em duas fases: uma aquática e outra terrestre (Young et al., 2004).

8

Rhinella marina (Fig. 1) é um anfíbio comum no Brasil. Possuem porte variando

de 2 a 20 cm de comprimento; protuberância acima dos olhos até o focinho; uma grande

glândula paratóide atrás de cada olho; ausência de dentes e membrana interdigital nas

patas dianteiras; pele seca e verrugosa; pupilas horizontais e as íris douradas. A espécie

não apresenta pálpebra inferior, mas uma membrana nictitante (Frost et al., 2006).

São animais sinantrópicos, encontrados na América Central, América do Sul e

Sul do Texas (América do Norte), tendo sido introduzido em muitas regiões tropicais,

para o controle de pragas na agricultura, como por exemplo, na agricultura de cana-de-

açúcar (Zug & Zug, 1979; Brandt & Mazzotti, 2002; Ragoo & Omahmaharaj, 2003).

Assim, a partir da década de 90, o homem auxiliou a dispersão desta espécie de tal

forma que, hoje, podem ser encontrados em várias regiões do planeta e, em muitas

delas, é considerado como praga (Barton, 1997; 1999).

Figura 1: Rhinella marina. Fonte: Arquivo pessoal de Lilian Cristina Macedo (2012).

1.3. HISTOPATOLOGIA HEPÁTICA E HELMINTOLOGIA

A histopatologia caracteriza-se pelo estudo de tecidos ou de fragmentos de

tecidos obtidos através de necropsias/biopsias ou de outra técnica de colheita. Estas

9

amostras passam por processamento histológico que envolve fixação, desidratação,

clarificação, geralmente, por produtos químicos, com posterior infiltração em resinas,

microtomia e coloração para fins de visualização microscópicas de alterações da

estrutura tecidual e celular normais, causadas por agentes externos ou não (Horobin,

1982; Lemos et al., 2003).

Análises morfológicas em conjunto com estudos histológicos são abordagens

que se complementam e auxiliam no diagnóstico de parasitos teciduais além de

possibilitar o entendimento das alterações induzidas pelo parasito no hospedeiro.

De acordo com Eiras & Rego (1989), a repercussão do parasitismo sobre a

condição do hospedeiro pode ser vital e depende de vários fatores, tais como: a natureza

do parasito, a intensidade de infecção e o órgão afetado.

Segundo Rodrigues et al. (2002) helmintos, de maneira geral, podem induzir

respostas imunes com alterações patológicas nocivas, mas não letais, ao seu hospedeiro

e nos estudos sobre infecções por endoparasitos, observam-se várias alterações em

órgãos e tecidos dos hospedeiros.

Geralmente, os tecidos reagem encapsulando os parasitos por hiperplasia celular,

resultando em nódulos, que podem ser macroscópicos (Rodrigues et al., 2002) ou

resultando na formação de granulomas, frequentemente no fígado na esquistossomose

mansônica humana (Andrade, 2005) ou na capilaríase hepática, na qual os parasitos

podem produzir um quadro de hepatite aguda ou sub-aguda com forte eosinofilia e

ainda afetar outros órgãos (Orihuela et al., 2006).

Ratos infectados por Capillaria hepatica Bancroft, 1983, nematódeo zoonótico

de distribuição global presente no fígado, apresentam alterações histopatológicas de

bases imunológicas como, por exemplo, nódulos branco-amarelados contendo ovos e/ou

vermes, caracterizando granulomas, além de fibrose septal (Lemos et al., 2003).

A fibrose hepática é caracterizada pela presença de miofibroblastos e mastócitos;

já os granulomas são apenas focais com características de inflamação, rodeada por

tecido conjuntivo, macrófagos, eosinófilos, linfócitos e células plasmáticas, além de

outras alterações, como vermes e ovos circundados por fibras colágenas (Akiyoshi &

Terada, 1998; Jeong et al., 2008).

Barros (2008) também descreve alterações hepáticas em murinos desnutridos e

eutróficos submetidos à infecção experimental por Schistosoma mansoni Sambon, 1907.

Em alguns casos as alterações histopatológicas são geradas pelos estímulos de citocinas

10

do tipo Th2, em virtude da presença de ovos do parasito no órgão, causando, inclusive,

grande produção de imunoglobulinas.

Estes parasitos também induzem a formação de granulomas pequenos e esparsos

no parênquima hepático, com ausência de fibrose periportal no grupo desnutrido. Outro

tipo de lesão também se caracteriza por infiltração de células mononucleares e de alguns

linfócitos nos espaços-porta e em torno de veias centrolobulares, além de numerosos

granulomas em torno de ovos de S. mansoni degenerados ou isolando fragmentos de

cascas de ovos (Barros, 2008).

A maioria das lesões possuem predominantemente colágeno, às vezes exibindo

componente exsudativo, particularmente eosinófilos. Ocorre ainda a presença de

pigmento pardo-amarelado em aglomerados granulosos, sobretudo nos espaços-porta

mais calibrosos, além de vascularização aumentada, hiperplasia de ductos biliares e

infiltração inflamatória crônica (Barros, 2008).

Em fígado de Salminus maxillosus Valenciennes, 1840 (peixe conhecido como

“dourado”) foram observados os nematóides da espécie Neocucullanus neocucullanus

encerrados em cistos esbranquiçados, situados no parênquima hepático próximo à

superfície do órgão, produzindo infecção tanto nas regiões centrais, como periféricas,

sendo que algumas vezes, realiza perfuração do parênquima do órgão, permitindo uma

visão do cisto na superfície do órgão. Microscopicamente o tecido torna-se

desorganizado e com células típicas de processo inflamatório ativo (Rodrigues et al.,

2002).

1.4. A BIOLOGIA MOLECULAR E HELMINTOLOGIA

Biologia molecular é uma importante ferramenta na área da Parasitologia,

especificamente na Helmintologia, pois contribui com a identificação e a sistemática de

espécies, o diagnóstico de infecções, epidemiologia de parasitos, análises de estruturas

genéticas de uma população, expressão gênica, estudo de resistência a drogas e

desenvolvimento de vacinas (Gasser et al., 1999; Genchi et al., 2007),

Apesar de alguns entraves entre o método molecular e a taxonomia alfa, a

caracterização molecular de helmintos tem se mostrado uma ferramenta de extrema

importância para os estudos em parasitologia, pois além de auxiliar na identificação de

parasitas, pode ainda auxiliar no entendimento de questões ainda não elucidadas, como

11

o mecanismo de ação e resistência de alguns fármacos utilizados no tratamento destas

infecções (Genchi et al., 2007).

Atualmente, os estudos de descrições morfológicas de espécies de helmintos têm

incluído em seus resultados a descrição de uma ou mais sequências gênicas, com

informações que podem ser usadas em estudos sobre filogenia molecular como em

trabalhos desenvolvidos por Nadler et al. (2007), Furtado et al. (2009), Casiraghi et al.

(2006), Melo et al. (2011), Otranto et al., (2011).

Mitreva et al. (2005) realizou um estudo comparativo entre sequências genéticas

de nematódeos baseado em sequências do DNAr encontradas em bancos de dados e o

genoma sequenciado de Caenorhabtidis elegans. Neste trabalho, estes autores

agruparam o Filo Nematoda em cinco clados definidos, que podem ser distintos por

características morfológicas e especificidade parasitária.

Folmer et al. (1994), desenvolveram um par de iniciadores (LCO1490 e

HCO2198) amplificadores de uma região conservada de fragmento de DNA com 710

pb, do gene codificador da subunidade I da citocromo oxidase C (COI). Deste modo,

estes iniciadores puderam gerar análises filogenéticas contemplando estudos em

sistemática de organismos inclusos em 11 filos de invertebrados metazoários,

contabilizando mais de 80 espécies, dentre estas, espécies de nematódeos.

Mar et al. (2002) sugeriram os espaçadores transcritos 1 e 2 mais o gene 5.8S do

DNAr como região de escolha na identificação molecular de helmintos por preservar

similaridades dentro deste grupo de seres vivos, mas também diferenças específicas, as

quais podem ser levadas em consideração para estudos moleculares. De fato, esta região

vem sendo pesquisada por diversos autores que desenvolvem estudos filogenéticos por

seqüenciamento nucleotídico e, mais recentemente, por análise de sua estrutura

secundária em diversos seres vivos, como Dassanayake et al. (2008) e Miao et al.

(2008).

Outro aspecto importante da Biologia Molecular na Helmintologia no que tange

a identificação acurada da biodiversidade desses organismos é a proposta do “DNA

barcoding – código de barras”, caracterizado como um método de identificação, o qual

utiliza um pequeno marcador molecular genético como ferramenta para esta

identificação. O código de barras de DNA tem o sentido de contornar possíveis

problemas na identificação de espécies e sistemática realizadas através da tradicional

12

abordagem morfológica, o que pode gerar identificações incorretas causadas pela

plasticidade fenotípica (Elsasser et al., 2009).

Este método tem como padrão para esta identificação no Reino animal o uso de

uma região gênica codificante da enzima mitocondrial citocromo c oxidase I (COI),

contendo 658 pares de base (Hebert et al., 2003a, b). Estes aspectos conferem a este

DNA um potencial para se tornar uma ferramenta universal, padronizada e econômica

para uma identificação massiva (Ferri et al., 2009).

1.5. PROTEÔMICA E SECRETOMA

Proteínas são polímeros de aminoácidos resultantes da tradução das informações

genéticas contidas no DNA de um genoma. Estão presentes em grande diversidade, nas

membranas, no citoplasma e no interior do núcleo, agindo como enzimas, anticorpos,

componentes estruturais, receptores celulares, agentes de sinalização, transporte e

armazenamento de substâncias entre outras funções variadas. Devido a essa diversidade

funcional, as proteínas exercem papéis fundamentais em quase todos os fenômenos

biológicos, como produção de energia, comunicação celular, defesa, contração

muscular, atividade neuroquímica, reprodução, dentre outros (Souza et al., 1999).

A tecnologia de sequenciamento nucleotídico em larga escala pode proporcionar

uma grande quantidade de genomas inteiros de muitos organismos. Desse modo,

durante muitos anos, o conhecimento genômico propagou a ideia de que não seriam

necessários os estudos em níveis proteicos para se obter dados relacionados ao aumento

ou redução da sua expressão e que somente seria necessário a determinação dos níveis

de mRNA, para avaliar as interações entre as proteínas e suas funções no

desenvolvimento de determinada condição fisiológica (Monti et al., 2005).

Ao serem sintetizadas, as proteínas podem sofrer importantes modificações para

se tornarem funcionais, portanto tais transformações devem ser consideradas juntamente

com informações sobre a sequência genética (Baggerman et al., 2004).

Desse modo o proteoma é, sem dúvida, muito mais complexo que o genoma

pois, enquanto o DNA possui somente quatro bases nitrogenadas, as proteínas estão

compostas de aminoácidos, dos quais existem 20 tipos diferentes, originando em uma

célula, tecido ou organismo milhares de proteínas e apresentando, portanto, uma alta

complexidade. A análise proteômica refere-se à avaliação sistemática dessas proteínas,

13

de forma a comparar a sua expressão celular tecidual ou orgânica em distintos

momentos fisiológicos (Wilkins et al., 1995; Soares et al., 2007).

A proteômica envolve, portanto, uma análise total ou mesmo em larga escala das

proteínas de um organismo, gerando quantidade massiva de dados experimentais

(Cagney et al., 2003). O proteoma, termo cunhado pela primeira vez por Wilkins &

Williams em 1995 é, por definição, o conjunto de todas as proteínas expressas por um

genoma em um determinado tempo (Lanças et al., 2003).

Estudos nessa área são, portanto, capazes de fornecer importantes informações

sobre as modificações pós-traducionais de proteínas, contribuindo para o entendimento

do funcionamento celular (Pandey & Mann, 2000) enquanto que o genoma representa,

através do DNA, um possível código desse dinamismo das transformações protéicas.

A proteômica está subdivida em duas grandes áreas: proteômica estrutural

(determinação estrutural em larga escala) e proteômica funcional (expressão).Os estudos

estruturais avaliam os níveis de inibição e de superexpressão, investigando modelos

celulares de expressão protéica submetidos a duas ou mais situações fisiológicas

diferentes.

Essa pesquisa comparativa é usualmente utilizada para identificar proteínas e

para relacionar o perfil de expressão do proteoma com alguma situação fisiológica

específica (Monti et al., 2005).

O aumento do número de genomas seqüenciados fez crescer exponencialmente o

número de seqüências de proteínas com funções desconhecidas. Como nem sempre a

seqüência genômica é suficiente para elucidar essas funções, a proteômica é uma área

do conhecimento científico altamente dinâmica e competente para tal (Antunes, 2008).

Os dados de seqüenciamento gênico associados a estudos proteômicos e

peptidômicos estruturais e funcionais buscam estabelecer o melhor entendimento do

estado metabólico induzido por situações fisiológicas específicas, assim estudos

proteômicos podem ser valiosos para a identificação de novos alvos terapêuticos e o

entendimento da dinâmica protéica (Antunes, 2008; Sun & Cavalli, 2009).

Neste ensejo, sabe-se que patógenos podem liberar um número amplo de

diversificadas proteínas, as quais podem modificar e adaptar o ambiente hospedeiro,

influenciando a seu favor modificações em vias de sinalização imune, invocando um

processo conhecido como imunomodulação helmíntica (Hewitson et al., 2009).

14

Convencionou-se denominar, portanto, como “Excreção/Secreção” (E/S) os

produtos ativamente exportados através de vias secretórias ou mesmo àquelas que

podem se difundir ao meio por “extravasamento” a partir dos tecidos dos parasitos

(Hewitson et al., 2009).

In vivo, antígenos “secretados” incluem enzimas digestivas que emanam do

intestino de vermes adultos, bem como conteúdo uterino que fêmeas liberam juntamente

com os ovos ou larvas de transmissão estágio. No entanto, os parasitos podem muito

bem adaptar tais "secreções" para cumprir um novo papel no hospedeiro, uma vez que

elas são liberadas a partir do interior do corpo do helminto. Por isso, é necessário para

analisar todos os produtos E/S, submetê-los a uma gama completa de ensaios

bioquímicos, imunológicos e análises proteômicas para que se saiba qual a sua real

origem fisiológica (Hewitson et al., 2009)

Este conjunto de moléculas protéicas e não-protéicas, o secretoma, fornece as

ferramentas necessárias para a sobrevivência do parasita no seu nicho hospedeiro, no

entanto, ao passo que essas moléculas são a chave para os efeitos deletérios e

patogênicos, o secretoma da célula infectada é igualmente importante para o

entendimento dos mecanismos de defesa hospedeira diante do ataque do patógeno (Lee

et al., 2009).

Dados sobre o secretoma de organismos patogênicos são escassos e limitados a

específicos tipos de amostras e experimentos, mesmo àqueles relacionados a agentes

infecciosos causadores de “doenças tropicais negligenciadas”, como no caso dos

helmintos. Nesse sentido, análises da parte protéica de secretomas de helmintos pela

proteômica tem sido realizadas para diminuir essa deficiência e assim, desenvolver

novas soluções terapêuticas para erradicar estas infecções (Hotez, 2009).

1.6. ANÁLISE DE PRODUTOS HELMÍNTICOS

As moléculas expressas ou liberadas por patógenos podem ser classificadas

como proteícas, glicoprotéicas ou lipídicas e são estudadas, em helmintos, a partir da

obtenção de extratos brutos/somáticos desses parasitos e de seus produtos de

excreção/secreção (Northern & Grove, 1987).

Segundo Ehigiator et al. (2000), o extrato de helmintos pode ser obtido através

da maceração do helminto e posterior centrifugação do homogenato. A obtenção de

produtos de excreção/secreção, conforme descrição de Craig et al. (2006), consiste no

15

cultivo in vitro do helminto e retiradas de alíquotas do meio em determinado intervalo

de tempo, assim como, de helmintos para verificar se a estrutura do mesmo não foi

modificada durante cultivo, alterando a composição das substâncias obtidas.

A análise proteômica é o principal método atualmente escolhido para este tipo

de pesquisas (Sickmann et al., 2002) e segundo Cagney et al. (2003), a maioria dos

experimentos proteômicos envolvem quatro etapas:

a) Isolamento proteico a partir de uma amostra biológica (como por exemplo

um extrato celular), seguindo algum tratamento experimental;

b) Fracionamento das proteínas resultantes (ou peptídeos, produtos oriundos de

digestão proteômica) por métodos tradicionais tais como eletroforese

bidimensional em gel de poliacrilamida (2D PAGE) ou Cromatografia

Líquida (LC), por exemplo;

c) Caracterização da proteína ou peptídeo através de Espectrometria de Massas

(MS);

d) Identificação da proteína por meio de interpretação manual ou correlação em

base de dados de acordo com o espectro de massa obtido.

Esta ferramenta facilita na identificação de produtos helmínticos que já estão no

hall de potenciais vacinas ou alvos de intervenção terapêutica (Ranganathan & Garg,

2009).

No entanto, mesmo com alguns trabalhos empregando uma abordagem

proteômica para o estudo da biologia desses animais, uma das principais limitações para

a realização de alguns estudos é a escassez de informações genômicas disponíveis.

Atualmente, além dos modelos helmínticos Caenorhabditis elegans e C. briggsae

apenas cinco genomas nucleares de nematodas foram publicados e são de Brugia

malayi, Meloidogyne incógnita e M. hapla, Pristionchus pacificus e Trichinella spiralis

(Rebello et al., 2011).

1.7. HELMINTOS E IMUNOMODULAÇÃO

O parasitismo é uma condição desvantajosa por definição, embora os helmintos

parasitas sejam profícuos na regulação imune e na supressão de mecanismos

imunopatológicos (Maizels et al., 2004), uma vez que fugir ou amortecer a resposta

16

imune de seus hospedeiros, pode lhes proporcionar oportunidade de atingir a

maturidade, reproduzir-se e completar seu ciclo de vida. Conseqüentemente, muito pode

ser aprendido a partir das relações parasito-hospedeiro, particularmente quando o

parasita é usado como uma ferramenta para avaliar imunidade do hospedeiro (Wilson &

Maizels, 2006).

Embora a base molecular da supressão imune induzida por helmintos ainda

esteja por ser definida completamente, a caracterização dessas moléculas é uma

importante abordagem para essa investigação, pois são elas a razão da subversão das

células imune do hospedeiro (Kwan-Lim et al., 1989).

Numerosos estudos demonstram que moléculas bioativas presentes em extratos

de helmintos e produtos de excreção/secreção são capazes de modular o sistema

imunológico do hospedeiro, favorecendo a sobrevivência do parasito, mas trazendo

também benefícios para o hospedeiro (Johnston et al., 2009).

Recentemente, estes estudos têm evoluído a um ponto onde os dados a partir de

modelos animais e, em menor número, de observações clínicas, sugerem que a infecção

com helmintos parasitas podem reduzir a severidade de doenças como esclerose

múltipla (La Flamme et al., 2003), diabetes mellitus tipo I (Zaccone et al. 2003), asma

(Wilson et al., 2005), doença intestinal inflamatória e, talvez, distúrbios

cardiovasculares (Elliott et al., 2005).

Esses produtos de Excreção/Secreção são expostos para o meio extra-celular do

parasita através das vias secretoras clássica e não clássica, ficando expostos na

superfície do corpo ou mesmo liberados, fazendo-as acessíveis ao sistema imune ou

mesmo à ação de drogas. A via clássica é mediada pela presença de sinais peptídicos

com curtas sequencias amino-terminais, enquanto as proteínas secretadas pela via não-

clássica são de difícil previsão devido estas serem normalmente secretadas por via

independente de Retículo endoplasmático e Complexo de Golgi, além de não necessitar

de sequências de peptídeo sinal (Nickel, 2003; Bendtsen et al., 2004).

A eficácia de anti-helmínticos têm diminuído gradativamente com seu repetido

uso, além disso, uma rápida reinfestação tem ocorrido após a administração desses

medicamentos, requerindo o desenvolvimento de vacinas como uma prioridade para a

melhoria da saúde pública, como no caso da admistração de benzimidazóis em

infestação por Necator americanus e Ancylostoma caninum (Albonico et al., 1995).

17

Parasitoses helmínticas de interesse veterinário também tem sido alvo para

estudos proteômicos abordando mecanismos de sobrevivência dos helmintos em

questão. A maioria desses estudos tem utilizado murinos como modelo animal para

infecções helmínticas. Porém, é importante ressaltar que muitos resultados diferentes

têm sido obtidos usando diferentes modelos animais e helmínticos, fazendo disto uma

dificuldade em extrapolar as informações obtidas aos helmintos e respectivos

hospedeiros naturais (Meeusen, 1999).

A respeito dessas descobertas, o parasitismo de helmintos em modelos animais

tem contribuído diretamente para o conhecimento e compreensão de como o sistema

imune de mamíferos é mobilizado para combater parasitas metazoários (Johnston et al.,

2010).

Em seres humanos e alguns modelos animais, os antígenos ou alérgenos

helmínticos estimulam os linfócitos T a produzirem citocinas Th2, como a interleucina

(IL)-4 e a IL-5. A IL-4 induz os linfócitos B a produzirem imunoglobulina E (IgE) e a

IL-5 atrai e ativa os eosinófilos além de diminuir os níveis de interferon – γ (IFN- γ)

(Tezuka et al., 2003).

Além disso, Th2 associada às citocinas IL-4, IL-9, IL-13, IL-25 e IL-33 são

conhecidas por desempenhar um importante papel na mediação dos mecanismos

efetores que contribuem para expulsão do verme do interior do intestino, tais como:

hiperplasia de células caliciformes, produção de muco, eosinofilia, mastocitose,

recrutamento de macrófagos e hipercontração muscular (Nair et al., 2006; Anthony et

al., 2007; Díaz & Allen, 2007).

Substâncias liberadas em diferentes estágios de sensibilização do modelo animal

(infecções primárias, secundárias e múltiplas), diferentes estágios dos parasitos (larva e

adultos), e sexo dos parasitos (macho e fêmea) podem evocar diferentes perfis de

respostas imunes (Balic et al., 2000).

Segundo Craig et al. (2006), essas moléculas são derivadas da superfície do

helminto e/ou de glândulas excretoras/secretoras especializadas e freqüentemente

liberadas em estágios específicos. Isto foi observado em estudos proteômicos realizados

por Soblik et al. (2011) em Strongyloides ratti, o qual apresentou diferentes

composições nos perfis proteicos entre machos, fêmeas e estágios larvais, comprovando

que o complexo ciclo biológico de helmintos, com estágios de vida livre e separação

18

sexual, fazem com que cada um desses estágios tenha importância única na interação

com seu hospedeiro.

1.8. POTENCIAIS MOLÉCULAS NA BIOLOGIA E PATOGENICIDADE DOS

HELMINTOS

Baseados na abundância de proteínas encontradas em produtos de excreção e

secreção, essas moléculas são classificadas quanto a sua importância para a viabilidade

de vermes, tanto na sua patogenicidade quanto imunossupressão, reprodução adesão,

dentre outros aspectos biológicos condizentes com cada organismo. A partir desses

estudos, começam a surgir a possibilidade de produção de vacinas e de novas

perspectivas a combate desse modelo de infecção (Bethony, 2005).

Os principais antígenos vacinais já determinados são enzimas hidrolíticas,

incluindo proteases e acetilcolinesterases, a partir do estágio larval infeccioso 3 (L3) e

estágios adultos de Ancylostoma sp. As principais moléculas candidatas encontrados em

L3 são as proteínas ASP (Ancylostoma-secreted proteins), astacin-like metaloprotease

(MTP), a acetilcolinesterase (ACH) e transtirretina (TTR). A partir da fase adulta, os

antígenos principais encontradas são o inibidor tecidual das metaloproteinases (como

Ac-TMP), proteases aspárticas e cisteinil proteases (Ranganathan & Garg, 2009).

ASP-1 e ASP-2 são proteínas liberadas em maior abundância no período de

penetração no hospedeiro pelos estágios L3 de helmintos de ciclo geográfico. Estas

moléculas são ricas em cisteína e pertencem à superfamília das proteínas relacionadas à

patogenicidade (PRP) (Hawdon & Hotez, 1996).

ASP-2, que estão localizadas no esôfago glandular e cutícula do estágio L3 de A.

caninum, mostrou-se um antígeno de caráter protetor em cães vacinados em laboratório,

devido à redução na contagem de ovos, carga parasitária e aumento in vitro da

habilidade do soro humano em inibir a migração desse estágio através de tecido da pele

em comparação a amostras controle (Bethony, 2005).

1.9. ORTLEPPASCARIS X RHINELLA MARINA: MODELO PARA ESTUDO DE

RELAÇÃO HELMINTO-HOSPEDEIRO

A sobrevivência dos parasitos em seus hospedeiros depende da relação de

adaptação estabelecida entre os mesmos, pois dentre outros fatores limitantes para essa

19

co-existência, o sistema imunológico do hospedeiro desempenha estratégias de

detecção, inativação e/ou destruição do organismo invasor. Por consequência, este

necessita desenvolver mecanismos para o escape, mimetização e manipulação do

sistema imune, adaptando a resposta do hospedeiro ao seu benefício (McKay, 2006).

Na helmintologia, o estabelecimento dessas relações pode ser elucidado através

de diversos modelos de parasitos e hospedeiros, tendo como ferramentas diversas áreas

do conhecimento, como análises morfológicas, histopatológicas, genômicas e

proteômicas. Neste estudo, temos como exemplo o nematódeo Ortleppascaris sp. e seu

hospedeiro R. marina.

As informações sobre os parâmetros morfológicos em estudos por microscopia

de luz são escarças nas descrições de larvas de Ortleppascaris sp. e análises ultra

estruturais dessas larvas não haviam sido realizadas. A Taxonomia Alfa se utiliza de

estudos morfológicos de helmintos por técnicas de microscopia de luz, no entanto, cada

vez mais tem sido importante a adição de informações por meio de análises

ultraestruturais.

Neste trabalho, aspectos histopatológicos da infecção hepática por

Ortleppascaris sp. em de R. marina são mostradas em tecidos incluídos em parafina

além de técnicas que utilizam método de fixação e processamento de amostra para

resina hidrofílica como suporte para os cortes histológicos, que, segundo Pannocchia et

al., (2008), preservam de melhor maneira as estruturas teciduais, possibilitando melhor

visualização das estruturas do que as técnicas convencionais em parafina.

A caracterização molecular de helmintos tem sido realizada para parasitos de

interesse médico, veterinário e econômico. No entanto, estudos referentes a parasitas

que não estão inclusos nessas categorias se fazem necessários, pois geram sequências

nucleotídicas aos bancos de dados, como o Genbank, com informações que podem ser

usadas em análises filogenéticas.

A caracterização proteômica e identificação de moléculas envolvidas no

parasitismo de Ortleppascaris sp. contribui para o avanço do entendimento da relação

deste parasito com seu hospedeiro, gerando informações e perspectivas no campo de

estudo de biomoléculas.

20

1.10. OBJETIVOS

1.10.1 Objetivo Geral:

- Realizar estudo morfológico, molecular, histopatológico e proteômico de

Ortleppascaris sp. parasito de fígado de Rhinella marina.

1.10.2. Objetivos Específicos:

- Caracterizar as estruturas somáticas de larvas de Ortleppascaris sp. por

microscopia de luz e eletrônica de varredura;

- Identificar as alterações histopatológicas provocadas por este parasita em

fígado de Rhinella marina;

- Caracterizar sequencias gênicas de larvas de Ortleppascaris sp.;

- Construir um mapa 2D de referência de proteínas presentes no extrato somático

e fluido cístico de larvas de Ortleppascaris sp., utilizando espectrometria de massas

como referência;

- Realizar análise comparativa dos perfis proteômicos do extrato somático e

fluido cístico desse parasito.

21

2. ARTIGOS

2.1. ARTIGO 1

Título: Morphological and molecular characterization of Ortleppascaris sp.

larvae parasite of cane toad Rhinella marina from eastern Amazonia. 2013.

Revista: The Journal of Parasitology (ISSN).

Online ISSN: 1937-2345.

Print ISSN: 0022-3395.

Frequência: Bimensal.

Fator de impacto: 1.405.

Volume: 99.

Número: 1.

Páginas: 118-123.

Ano de publicação: 2013.

30

2.2 ARTIGO 2

Título: Liver histopathological alterations in the cane toad, Rhinella marina

(AMPHIBIA: BUFONIDAE), induced by Ortleppascaris sp. larvae (NEMATODA:

ASCARIDIDAE).

Revista: The Journal of Parasitology.

Online ISSN: 1937-2345.

Print ISSN: 0022-3395.



Ano de publicação: 2013, no prelo.

39

2.3. ARTIGO 3

Título: Proteomic profile of Ortleppascaris sp. larvae in Rhinella marina.

Revista a ser submetido: International Journal for Parasitology

ISSN: 0020-7519

Frequência: Bimensal


Ano de submissão: 2013.

40

PROTEOMIC PROFILE OF ORTLEPPASCARIS SP. LARVAE IN RHINELLA

MARINA

Jefferson Pereira e Silva*, Adriano Penha Furtado *, Humberto Josué de Oliveira

Ramos†, Ana Clara Rosa Salvador†, Claudio Lísias Mafra de Siqueira‡ and

Jeannie Nascimento dos Santos *

*Laboratory of Cell Biology and Helmithology (Laboratório de Biologia Celular e

Helmintologia) “Profa. Dra. Reinalda Marisa Lanfredi”, Biological Sciences Institute

(Instituto de Ciências Biológicas), Federal University of Pará (Universidade Federal do

Pará), Belém, Pará, Brazil. e-mail: [email protected]

†Laboratory of Molecular Biology of Plants (Laboratório de Biologia Molecular de

Plantas)

‡Laboratory of Parasitology and Molecular Epidemiology (Laboratório de Parasitologia

e Epidemiologia Molecular)

ABSTRACT: Ortleppascaris sp. is a helminth that, in its larval stage, infects the liver

parenchyma of the amphibian Rhinella marina, resulting in severe physiological and

pathological changes. This study used a proteomic approach to determine the overall

profile of proteins expressed in a somatic extract from the nematodes to investigate the

relationship between the parasite and its host. A total of 60 abundant proteins were

selected from the two-dimensional electrophoresis, identified by MS, and grouped

based on their Gene Ontology by the biological processes in which they are possibly

involved. Through homology, important helminthic derivatives were identified, such as

the immunoreactive As37 antigen, guanylyl cyclases, proteolytic enzymes, and other

proteins conserved among different parasites. This study represents a new approach to

helminth-related proteomic studies using an amphibian animal model. Furthermore, this

study identified protein markers that are important to the host-parasite relationship and

the viability, development, infectivity, and virulence of helminths.

mailto:[email protected]

41

INTRODUCTION

Helminths are complex, often dangerous organisms wich are neglected, even in

this era of health system globalisation [1]. However, with the emergence of "omics"

tools, particularly proteomics, these organisms have been investigated at the molecular

level [2]. Proteomics has provided much information and promising results, identifying

a repertoire of helminth derivatives that may reveal their biology, mode of infection,

and the pathology associated with infection [3-7].

Molecular studies are needed for the design of future interventions, such as

antihelminthic vaccines, which may directly influence the quality of life of billions of

human beings. In addition, the occurrence of infection in animals and plants, the

organisms most affected by parasitic infections, represents an important public health

problem and is of global economic significance [8, 9].

Along with their hosts, helminths have co-evolved for thousands of years,

resulting in a favourable environment for the survival and co-existence of both parties in

a complex adaptive mechanism [10-12]. This host-parasite adaptation is closely related

to the host immune system, which detects and attempts to inactivate and/or destroy the

invader. The parasite, in turn, develops strategies for escape by mimicking and

manipulating the host immune system, thereby adapting the host response to parasitism

[13].

Research shows that by manipulating their immune systems, the hosts can

become vulnerable to other infections or, conversely, suppress their

immunopathological reactions. These processes also depend, in evolutionary terms, on

the duration of the relationship between helminth parasites and their hosts [13, 14].

Johnston et al. [15] suggest that the bioactive molecules present in extracts of helminths

or their excretion/secretion products are responsible for modulating the host immune

response in favour of the parasites.

Helminth biomolecules can be classified as glycoproteins, lipids, and proteins,

and have been studied using extracts of helminths or their excretion/secretion products.

Each protein class contains structural and functional diversity, including cytokines,

chemokines, hormones, digestive enzymes, antibodies, extracellular proteinases, toxins,

and antimicrobial peptides. Some of these proteins are involved in vital biological

processes, such as oxidation-reduction processes, cell adhesion and migration, cell-cell

communication, differentiation, proliferation, morphogenesis, defence, virulence

42

factors, and immune responses [16-18]. According to Craig et al. [6], these substances

are derived from the surface of the helminth or from specialised excretory/secretory

glands and are often released at specific stages. Among the group of helminths that

release immunomodulating substances, the Nematoda phylum is important because

members of this phylum have been used in clinical trials for the treatment of

immunological diseases and vaccine development [13, 19, 20].

In the present study, helminths of the genus Ortleppascaris were used. As adults,

these parasites are found in the gastrointestinal tract of Crocodilians [21], and as larval

forms, they are found in the liver of amphibians [22-25].

According to Silva et al. [25], the nematode infects the liver of R. marina in its

larval parasitic form and develops inside fibrous cysts, which are apparently filled with

amorphous material and cellular debris. Infection by these larvae induces a significant

increase in the area occupied by melanomacrophages, which are phagocytic immune

system cells in amphibians, and other pathological changes, such as the presence of

inflammatory infiltrates distributed throughout the liver parenchyma. However, even

with severe physiological changes due to parasitism, the defence system of the anuran

is, in most cases, unable to curb the presence of the parasite because the larvae remain

alive and develop in these organs from their elementary stages [26].

The identification and proteomic analysis of biomolecules of Ortleppascaris sp.

larval parasites of R. marina contribute to the understanding of the host-parasite

relationship. Further, the screening of molecular markers generates information for the

study of immunomodulatory products, which are targets of interest for the control of

helminth infections in humans and animals.

MATERIAL AND METHODS

Parasites

Helminths were harvested from the interior of cysts present in the hepatic

parenchyma of the host. The parasites were subjected to three washing steps with PBS

(pH 7.4) and then stored in extraction buffer (7 M urea - 2 M thiourea - 2% CHAPS) at

-20ºC.

Preparation of somatic extract of Ortleppascaris sp.

43

Somatic protein extracts were obtained by macerating approximately 200 larvae

(L3 stage) in extraction solution (7 M urea - 2 M thiourea - 2% CHAPS) under cooling

with liquid nitrogen, then centrifuging the extracts at 13,000x g for 15 min at 4°C. The

supernatant was used directly for protein analysis.

Two-dimensional electrophoresis

The total protein concentration was determined by the Bradford method [27],

and samples were stored at -80°C until use. Aliquots of protein extract containing 100

µg of sample were diluted to a final volume of 125 µL in Destreak solution (GE

healthcare) and 2% IPG buffer (pH 3 – 10) (GE healthcare). Seven-centimetre strips

(Immobiline, GE healthcare) with an immobilised pH gradient in the range of 3-10 were

rehydrated with the protein extract for 17 h using IPGBox (GE Healthcare). Isoelectric

focusing was initiated immediately after rehydration.

The isoelectric focusing was performed with an automated system (Ettan

IPGphor III GE Healthcare) at 20°C with a constant current of 50 μA/strip and a total of

5.0 to 6.5 kVh following the four-step program: 300 V for 4 h; linear gradient to 1000 V

for 30 min; linear gradient to 5000 V for 1:20 h; 5000 V for 30 min.

After the isoelectric focusing, the strips were reduced in equilibration buffer (6

M urea, 0.075 M TrisHCl (pH 8.8), 29% glycerol, 2% SDS, 0.02% bromophenol blue)

containing 2% dithiothreitol (DTT) for 30 min and then alkylated for 30 min in the

equilibration buffer containing 2.5% iodoacetamide.

For the second dimension, the strips were placed on a 12.5% polyacrylamide gel

in a Mini Protean Cell system (Bio-Rad). The electrophoresis ran at a constant 80 V for

2 h. The gels were stained with Coomassie Blue G-250 solution overnight with stirring

and scanned with ImageScanner III (GE Healthcare) using Labscan software (GE

Healthcare).

In-gel tryptic digestion and mass spectrometry

The spots detected by ImageMaster 2D Platinum 7.0 software (GE Healthcare)

and observed with the naked eye were manually excised, treated with washing solution

(50% methanol, 5% acetic acid), and then dehydrated in 100% acetonitrile in a vacuum

centrifuge at room temperature. The proteins were subsequently subjected to reduction

(10 mM DTT) and alkylation (100 mM iodoacetamide).

44

The samples were digested at 37°C overnight with proteomic-grade trypsin

(Promega, Madison, WI, USA) in 50 mM ammonium bicarbonate (final concentration

20 ng/μL). Tryptic peptides were extracted from the gel solution with 50% acetonitrile

in 5% formic acid.

The extracted peptides were transferred to a sterile tube and treated with 100

mM ammonium bicarbonate, dried in a vacuum centrifuge, and resuspended in a

solution of 50% acetonitrile, 0.05% formic acid, and 0.1% trifluoroacetic acid.

Aliquots of 0.5 µL of each sample were applied to a steel plate at a 1:1 ratio with

2,5-dihydroxybenzoic acid matrix (Sigma). After crystallisation, the plate was inserted

into the mass spectrometer for analysis. All MS spectra were obtained in the m/z range

of 800 - 4000 Da using a MALDI-TOF Ultraflex III spectrometer (Bruker Daltonics).

The spectra were analysed using FlexAnalysis 3.3 software (Bruker Daltonics) for the

determination of peaks.

The search for protein homology by peptide mass fingerprinting (PMF) was

performed using the Blaxter Lab database (NEMBASE4) and the Mascot Daemon

software (Matrix Science). The search parameters were set as follows: up to two missed

cleavage sites; 0.1 Da error for the identification of peptides; carbamidomethylation of

cysteines as a fixed modification and oxidation of methionine as a variable

modification. PMF data analysis was supplemented by linking with Gene Ontology

through the UniProt database to infer the biological processes in which the identified

molecules are involved. The identified proteins were grouped into functional categories

and subcategories according to their ontology.

RESULTS

Identification of the Somatic Extract Proteome of Ortleppascaris sp.

To characterise the protein profile of the nematode’s somatic extract, the most

abundant proteins detected with the Image Master 2D Platinum software, shown in

Figure 1 and indicated as spots 1-60, were analysed by mass spectrometry.

45

Figure 1: 2D gel containing the somatic extract of Ortleppascaris sp. larvae

The list of marked spots on the two-dimensional gel (Figure 1) with their

proteins and corresponding helminth according to the Nembase4 database are

summarised in Table 1. Of these, 26 spots were identified, 24 spots were identified as

hypothetical proteins, and six spots were not characterised (Table 1). Four spots did not

produce spectra of sufficient quality to allow their identification, having insufficient

homology with any protein from the database.

46

Table 1 - Summary of somatic extract proteins of Ortleppascaris sp. identified by

MS using Nembase4 database. (See Supplemental Table 1 for details)

Spot Protein [helminth]

01 hypothetical protein CAEBREN_23080 [Caenorhabditis

brenneri]

02 CRE-ATH-1 protein [Caenorhabditis remanei]


brenneri]

04 As37 [Ascaris suum]

05 Sulphotransferase domain containing protein [Brugia malayi]

06, 33, 34, 37,

38, 39,40 Cell division protein kinase 7 [Ascaris suum]

07 CBN-CDC-37 protein [Caenorhabditis brenneri]

08 Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein

glycosyltransferase 48 kDa subunit [Ascaris suum]

09, 29, 48, 60 hypothetical protein CAEBREN_00296 [Caenorhabditis

brenneri]


brenneri]

11, 16, 41, 42 LONg family member (lon-3) [Caenorhabditis elegans]

12 hypothetical protein F46F3.3 [Caenorhabditis elegans]

13, 50 guanylyl cyclase [Heterodera glycines]

14 CRE-NSY-4 protein [Caenorhabditis remanei]

15 cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2

[Trichinella spiralis]

17, 19, 44, 49 Uncharacterised protein family UPF0005 containing protein

[Brugia malayi]

18 hypothetical protein LOAG_04901 [Loa loa]


22 GTP-binding protein SAR1 [Brugia malayi]

23 hypothetical protein CRE_11672 [Caenorhabditis remanei]


brenneri]

47


27 hypothetical protein CRE_25790 [Caenorhabditis remanei]

28, 31, 35, 55, 56 actin variant 1 [Dictyocaulus viviparus]

30, 59 [Pyruvate dehydrogenase acetyl-transferring-phosphatase 1

[Ascaris suum]

32 formyl-CoA transferase [Micromonospora aurantiaca ATCC

27029]

36 hypothetical protein LMOh7858_0493 [Listeria

monocytogenes str. 4b H7858]

43 Hypothetical protein CBG09068 [Caenorhabditis briggsae]

46, 47, 52 hypothetical protein AbauAB_10162 [Acinetobacter

baumannii AB900]

51 rnf126-prov protein [Brugia malayi]

53 Nodal modulator 1 [Ascaris suum]

57 hypothetical protein CBG_14574 [Caenorhabditis briggsae

AF16]


The products detected in the somatic extract include enzymes involved in

metabolic processes and energy production (spots 1, 2, 3, 15, 30, 59), such as

hydrolases of the PP2C family (protein phosphatase 2C), sulphotransferases (spot 5)

and transferases from the CoA transferase family III (spot 32), which are evolutionarily

conserved and related to energy production in helminths and protozoa.

Some of the abundant proteins were associated with body morphogenesis, such

as spots 11, 16, 41, and 42, which corresponds to the collagen present in the cuticle of

helminths. Similarly, other structural components, such as cytoskeletal proteins, were

identified among the hypothetical proteins (spots 10, 57) or positively identified with

significant scores as proteins from the actin family (spots 28, 31, 35, 55, 56).

Regarding the development process of the larvae, seven proteins (spots 06, 33,

34, 37, 38, 39, 40) related to cell division and protein phosphorylation processes were

found.

48

Guanylyl cyclases (spots 13, 50) were also detected; these molecules are of great

importance to the biology of helminths, as they are involved in cell signalling, neural

circuits, and host recognition.

Endoplasmic reticulum (ER) membrane proteins involved in the process of

asparagine glycosylation (spot 8) and SAR1 protein (spot 22), which is related to

vesicular trafficking between ER and Golgi, were also identified.

Surprisingly, some other relevant proteins were identified: As37 (spot 4), which

is a highly reactive antigen in Ascaris suum and a member of the immunoglobulin

family, and proteolytic enzymes (spot 43), which are considered virulence factors for

the establishment and maintenance of helminthic infection.

Proteomic Analysis of the Somatic Extract

Most of the proteins found in this study had nearly significant scores when

ranked with proteins that are homologous to those found in the database. However,

other proteins, such as those related to the cytoskeleton, exhibited values with

considerable significance.

Table 2 shows the list of identified proteins with their respective spot numbers.

They are grouped into functional categories and subcategories according to their GO, as

described in Supplemental Table 1. Also shown in Supplemental Table 1 are the

following parameters: the identification of each spot from the gel of somatic extract

shown in Figure 1; the protein name and its corresponding helminth; the GI accession

numbers from the National Centre for Biotechnology Information (NCBI) database

corresponding to the protein sequence with the highest match to the peptides; and the

scores, match, coverage, theoretical isoelectric point and molecular weight, and the

amino acid sequences of corresponding peptides obtained by mass spectrometry.

49

Table 2. Summary of the identified proteins from the gel of the somatic extract and the category of biological process in GO

terms. See Supplemental Table 1 for additional information

Molecules of metabolic processes and energy production

GO term Process/Biological function Spot Protein

GO: 0006535 Biosynthesis of cysteine from serine 01 hypothetical protein CAEBREN_23080

GO: 0016787 Hydrolase 02 CRE-ATH-1 protein

GO: 0008152 Metabolic process 03 hypothetical protein CAEBREN_12726

32 formyl-CoA transferase

GO: 0008146 Sulphotransferase 05 Sulphotransferase domain containing protein

GO: 0019901 Protein kinase ligand 07 CBN-CDC-37 protein

GO: 0016787/

GO: 0000104

Hydrolase/succinate dehydrogenase

action 15 cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2

GO: 0016787/

GO: 0006470 Hydrolase/protein dephosphorylation 30, 59 Pyruvate dehydrogenase acetyl-transferring-phosphatase 1

Structural molecules and organic morphogenesis


GO: 0051301/

GO: 0004674 Cell division/protein phosphorylation

06, 33, 34,

37, 38,

39,40

Cell division protein kinase 7

GO: 0005856 Cytoskeleton

10 hypothetical protein CAEBREN_00853

57 hypothetical protein CBG_14574

28, 31, 35,

55, 56 actin variant 1 [Dictyocaulus viviparus]

GO: 0010171/

GO: 0042329

Body morphogenesis/constituents of

cuticle structure

11, 16, 41,

42 LONg family member (lon-3)

50

GO: 0016021 Membrane protein

14 CRE-NSY-4 protein

17, 19, 44,

49

Uncharacterised protein family UPF0005 containing

protein

Immunoreactive molecules and virulence factors


GO: 0005515 Protein binding 04 As37

GO: 0006508 Proteolysis 43 Hypothetical protein CBG09068

Molecules of the biosynthetic/secretory pathway


GO: 0004579/

GO: 0018279

Glycotransferase/N-terminal

Glycosylation in asparagine 08

Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein

glycosyltransferase 48 kDa subunit

GO: 0016192 Transport mediated by vesicles 22 GTP-binding protein SAR1

Molecules of the chemosensory process


GO: 0035556 Intracellular signal transduction 13, 50 guanylyl cyclase

51

DISCUSSION

Protein Identification and Interpretation

Problems with the identification of sequences in the proteomic analysis are not

related to the production of significant scores because many of these databases are

incomplete or not well established [28]. According to Antunes [29], these data should

be considered even when they present low scores due to the lack of a complete and

specific database for the organism in question. The scarcity of database entries for each

sequence is responsible for the low scores. However, the expectation is that detecting

these molecules is a strong indication of their presence in the systems studied.

Molecules of the Metabolic Process and Energy Production

This group of molecules includes a large group of enzymes, such as hydrolases

that catalyse the breakage of several covalent bonds important for fighting aging in

nematodes [30]. Succinate dehydrogenase was also identified in our spots and is

involved in the mitochondrial electron transport chain, cell signalling, and apoptosis

[31, 32].

In proteomic studies of Brugya malayi, Hewitson et al. [4] suggested that these

molecules are essential for resisting the oxidative stress caused by reactive oxygen

species and nitrogen produced by immune cells. Thus, these molecules may be involved

in the evasion of the host immune system.

The CoA-transferase family of enzymes is widely found in helminths

parasitising their hosts in hypoxic environments or anaerobic conditions, such as

Ortleppascaris sp. According to Tielens et al. [33], these proteins are responsible for

acetate production from acetyl-CoA, which is directly associated with the production of

metabolic energy in various helminths and protozoa.

Phosphatases from the protein phosphatase 2C (PP2C) family, one of the largest

families of serine/threonine phosphatases, are also involved in the metabolism of

Ortleppascaris sp. According to Wenk et al. [34], these enzymes have a broad spectrum

of specific substrates, including enzymes that regulate many metabolic pathways and

energy production and are likely involved in the metabolic processes of the helminths in

the present study.

52

Homologous proteins of this family have been found in Caenorhabditis elegans

(C. elegans) and are encoded by the FEM-2, F42G9.1, T23F11.1 genes, which may be

related to gender determination in helminths. It is believed that the FEM-2 gene encodes

a protein with phosphatase activity that leads to somatic male development and sperm

production [35, 36]. Because protein phosphorylation is a major mechanism of cellular

regulation and these proteins are highly evolutionarily conserved [37]. In addition to

participating in the metabolic processes of Ortleppascaris sp., these molecules must be

involved in the sexual differentiation of the larvae.

Structural Molecules and Organic Morphogenesis

Similar to proteomic studies performed with other parasitic nematodes, many of

the abundant proteins from the somatic extract of Ortleppascaris sp. are associated with

cell division, the cytoskeleton, or even the structural constitution of the helminth; these

proteins are used in the intense morphological changes that occur during the larval

stage. Evidence of high larval mitotic activity was observed based on the identification

of seven proteins (spots 6, 33, 34, 37, 38, 39, 40) related to cell division and protein

phosphorylation, which are processes required for larval viability during fully active

development.

Structural molecules encoded by the gene lon-3 were identified; these molecules

have been previously studied in C. elegans. This gene encodes cuticular collagen, which

is required during larval development in hypodermal cells and specifies and controls

body length. Expression occurs on the surface of helminths and plays an important role

in the formation of the cuticle [38, 39]. Cox et al. [40, 41] state that cuticular collagens

are synthesised and secreted by hypodermal cells and polymerise in the apical surface of

the epithelium, forming a complex structure of six layers. Furthermore, according to

Johnstone & Barry [42], different genes encoding collagen are expressed in discrete

time periods during nematode larval stages.

The identification of these homologs in the somatic extract from Ortleppascaris

sp. suggests that the helminth undergoes a developmental process in the host, as shown

by Silva et al. [25].

These findings suggest the use of Ortleppascaris sp. and other nematodes as an

experimental model to study the processes regulating body size and shape and other

aspects of development. Many nematode processes remain poorly understood, as

53

indicated by Conlon & Raff [43] and Suzuki et al. [38]. According to Van der Eycken

[44], genes encoding collagen appear to be highly evolutionarily conserved, even

among free-living nematodes and parasites, such as C. elegans, Ascaris suum,

Haemonchus contortus, and Meloidogyne incognita.

The spots 28, 31, 35, 55, 56 were identified by their significant scores as

homologous to actin, a major component of the cytoskeleton that is important to cell

shape maintenance, endocytosis, organelle movement, and cell division. These proteins

interact with myosin, and in invertebrates, they are structural constituents of the

contractile machinery.

Immunoreactive Molecules and Virulence Factors

A database search indicated the presence of As37, a highly immunoreactive 37

kDa antigen belonging to the immunoglobulin superfamily. As37 was previously

identified in the larval stage of Ascaris suum by Tsuji et al. [45], who also suggested its

presence in other nematodes, such as A. lumbricoides and Toxocara canis. In addition,

this antigen was recently identified in Angiostrongylus costaricensis [46] and A.

cantonensis [47]. In the latter study, the authors also described peptide molecules with

high homology to As37 in Baylisascaris schroederi and Brugia malayi.

This important antigen was identified among the molecules expressed by

Ortleppascaris sp. and is a possible candidate target for an antihelminth vaccine. The

existence of As37 homologs in other nematodes suggests that As37 is specific to

nematodes. The helminth used in this study belongs to the order Ascaroidea, the same

as A. suum.

In addition to identification of immunoreactive antigens, homologs of

proteolytic enzymes, such as the hypothetical protein CBG09068, are present in the

somatic extract of Ortleppascaris sp. This group of proteins is considered by Dalton

[48] as a potential candidate for anti-parasitic interventions. They are possibly expressed

in the intestines of parasites; alternatively, they may be constituents of the products of

excretion and secretion.

According to Hong et al. [49], Rhoads et al. [50], Dresden & Xu [51] and Chung

et al. [52], these enzyme homologs have been implicated in many of the developmental

processes of helminths, such as moulting, hatching, and encystment. This finding is

consistent with the larval-stage, encysted parasitism studied in this report.

54

In addition, according to McKerrow et al. [53] and Rebello et al. [54], these are

key molecules for the invasion of the host by the helminth in the infective larval stage;

they are considered the major virulence factors for the establishment and maintenance

of an infection. The proteolytic enzymes assist in the evasion of the host immune

system by degrading the mucus barrier of the gastrointestinal tract, preventing blood

coagulation, facilitating the feeding process, and aiding in the invasion of connective

tissue [55-57]. These factors were observed in the liver of R. marina parasitised by

Ortleppascaris sp. [26], where they were shown to be encysted or free in the

parenchyma with apparent destruction of connective tissue.

Another important factor that should be noted is the association of these

proteolytic enzymes with the host haemoglobin, which is considered the main substrate

in haematophagous nematodes [58]. This correlation was observed in the parasitism of

this study, where nematode infestation caused an exacerbation of melanomacrophage

centres in the parenchyma of R. marina. Melanomacrophages are host defence cells that

have a characteristic pigment formed by the degradation of haemoglobin in the

cytoplasmic compartment.

Molecules of the Secretory Biosynthetic Pathway

Constituents of the vesicular formation and recruitment machinery are present

among the abundant proteins of the somatic extract. In particular, there are several

proteins involved in glycosylation and the export of proteins and lipids from the ER.

According to Varki [59] and Berninsone [60], complex carbohydrates are

involved in multiple biological processes, including the immune response and parasite-

host interaction. A membrane glycotranferase of the ER was detected in both

Ortleppascaris sp. and Ascaris suum; wich is responsible for the production of glycans

with N-terminal oligosaccharides linked to asparagine.

Kelleher & Gilmore [61] reported that glycosylation is one of the most common

protein modifications in eukaryotes. The biosynthetic pathway of these glycans is

highly conserved in most eukaryotes, such as C. elegans [60, 62], and is essential for the

synthesis and transport of the glycolipid by ER vesicles.

Traffic along the biosynthetic secretory pathway occurs through packaging in

vesicles that bud from the ER [63]. COPII vesicles are key components of this pathway,

and the formation of such vesicles is initiated by the GTPase SAR1, which was found in

55

the present study. SAR1 is responsible for recruiting additional proteins and coating the

vesicles.

Glycoproteins are located in subcellular compartments, at the cell surface, and in

the cell matrix and may function as surface antigens of helminths. According to Thomas

& Harn [64], glycoproteins can direct the host immune system toward a typical Th2

response or modulate the system for the maintenance of infection by dendritic cells,

which may recognise these molecules as pathogen-associated molecular patterns.

The presence of proteins involved in production machinery and glycoprotein

trafficking may contribute to the increased cellular immune response described by Silva

et al. [26]. In addition, the glycoproteins may contribute to the export of sugars and

lipoproteins to the larvae cell surface during its full development because many proteins

have been identified as being part of the surface/cuticle composition of the nematode.

For example, collagen trafficking is mediated by "mega vesicles" formed by COPII [63]

and may cause a strong immune response against the nematode.

Molecules of the Chemosensory Process

Much has been speculated about the sensory abilities of helminths, for example,

their ability to sense odours or flavours, memorise temperature, and detect and respond

to different oxygen levels. To maintain vital functions, the nematode must be able to

recognise the "demand" for nutrients and initiate chemo- and thermotaxic processes to

respond to environmental changes and host tropism. Little is known about these

processes in helminths, particularly at the molecular level [65]. In C. elegans, studies

have identified the molecular basis of the genetic and behavioural plasticity of

signalling proteins, including the guanylyl cyclase enzymes [66-68] that are present in

the somatic protein group of Ortleppascaris sp.

Guanylyl cyclases are ubiquitous enzymes found in organisms ranging from

bacteria to humans. They catalyse the conversion of GTP to cGMP and are involved in

cell signalling and other physiological processes, including smelling, muscle

contractility, electrolyte homeostasis, and retinal phosphotransduction [69, 70]. Studies

have shown that the genes encoding guanylyl cyclases are coincidentally expressed in

sensory regions of the helminth body, such as in the nerve ring, amphid, and tail of the

Heterodera glycines nematode [70] and in the gustatory neurons of C. elegans [71].

56

Holden-Dye & Walker [72] believe that such molecules have a significant role in the

neural circuits involved in host recognition by chemotaxis and thermotaxis.

In helminths, it is hypothesised that guanylyl cyclases increase their expression

at low oxygen concentrations [73]. Enzyme upregulation likely occurs at the sites of

Ortleppascaris sp. infection, which correspond to areas with low amounts of free

oxygen. Moreover, according to Hallem et al. [66], enzyme expression is closely related

to CO2 concentrations, which in turn appear to be an important chemotactic component

to attract nematodes. It is believed that the presence of CO2 in C. elegans is mediated by

evolutionarily conserved receptor-like guanylyl cyclases. This receptor, GCY-9, is well

known in C. elegans and has orthologs in other nematodes, such as Heterodera

glycines, Meloidogyne incognita, and the human nematode Brugia malayi, indicating

that CO2 is a determinant of the affinity of helminths for their respective hosts.

Thus, Ortleppascaris sp. may be attracted to its amphibian host because,

according to Taylor et al. [74], this animal has pulmonary and skin respiration that

releases carbon dioxide predominantly through the skin. This study provides new

perspectives regarding the chemotaxis, host recognition, and life cycle of this nematode.

CONCLUSION

Key molecules of helminth biology were found in the present study, such as

guanylyl cyclases that are involved in the chemosensory and neurobiological processes

of parasitic nematodes. Furthermore, immunoreactive antigens specific to nematodes

and virulence factors that are considered potential antihelminthic vaccine candidates and

protein markers for helminth infection, respectively.

Other proteins identified in Ortleppascaris sp., such as actin, proteins related to

lon-3, and PP2C, are highly evolutionary conserved. Thus, this organism has potential

for use in structural studies on the development and sexual differentiation of nematodes.

The set of molecules identified shows the diversity of processes that occur in

these nematodes regarding development, redox metabolism, infectivity, and virulence

and is a further indicator of the physiological complexity of these organisms.

The proteomic approach used here provides information about the host-parasite

relationship at the molecular level and is relevant to co-evolutionary studies, the choice

of antigen for vaccine development, and the duality of the physiological relationship

between these two organisms.

57

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guanylyl cyclases. Curr Biol. 2009;19:996-1004.

[72] Holden-Dye L, Walker RJ. Neurobiology of plant parasitic nematodes. Invertebrate

neuroscience : IN. 2011;11:9-19.

[73] Gray JM, Karow DS, Lu H, Chang AJ, Chang JS, Ellis RE, et al. Oxygen sensation

and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature.

2004;430:317-22.

[74] Taylor EW, Leite CA, Mckenzie DJ, Wang T. Control of respiration in fish,

amphibians and reptiles. Brazilian journal of medical and biological research = Revista

brasileira de pesquisas medicas e biologicas / Sociedade Brasileira de Biofisica [et al].

2010;43:409-24.

66

Supplemental Table 1 – Expressed proteins of the somatic extract of the Ortleppascaris sp. Identified by PMF using the Nembase4 database.

Spots Proteins GI accession * Score Match Coverage (%) PI/MW

theoretical Peptides

01

hypothetical protein

CAEBREN_23080

[Caenorhabditis brenneri]

341903378 53 4 19 6.18/33828

GFPGTIAAK

LVITMPASMSVER

MALEEGLLCGISSGANVHAACK

DEAEGMGVTTLEADLSR

02 CRE-ATH-1 protein

[Caenorhabditis remanei] 308474210 53 3 43 6.38/15633

ILLGGFSQGAAVSLFSGLTYHR

TPVFFGCGDSDSIVPFGNLMK

SFDYIDSFQEGVEFHVYR

03


CAEBREN_12726


341883050 54 5 30 5.80/22246

SDDINCENPK

DDDGMLGGFAHLHKPDITQSR

DDDGMLGGFAHLHKPDITQSR

VDMVELVK

ENLSDSGKPLFDDEDHSWTK

04 As37 [Ascaris suum] 22036079 53 5 17 5.17/34804

APHFPQQPVAR

DLADSDAGAYR

DDGQVMVMEFR

GDEIVAESDR

FEVPQGAPTFTR

05

Sulfotransferase domain

containing protein [Brugia

malayi]

170593967 55 4 26 6.28/37955

EENDILPYLNDSSCHYTICIHEEDGK

FDTFFK

LAFGNYFEHLKPWLPHIYDDNVLFLK

EQSDIIDNMYAQFFSGTEAEFLLTSDMA

06 Cell division protein kinase

7 [Ascaris suum] 324507876 46 3 32 6.54/29952

LLTELYHDNVIALLDVIGHR

TSIQLVFDFMETDLENLIK

NILLQVFLGLEFLHLNFILHR

33, 34, 37 Cell division protein kinase

7 [Ascaris suum] 324507876 50 9 44 4.96/34918

AGFAGDDAPR

AVFPSIVGRPR

IWHHTFYNELR

VAPEEHPVLLTEAPLNPK

LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK

38, 39,40 Cell division protein kinase 324507876 48 3 22 6.54/29952 LLTELYHDNVIALLDVIGHR

67

7 [Ascaris suum] TSIQLVFDFMETDLENLIK

NILLQVFLGLEFLHLNFILHR

07 CBN-CDC-37 protein

[Caenorhabditis brenneri] 341896809 44 3 50 6.82/4694

MSHDEDDTYHNIDTPSLFR

MSHDEDDTYHNIDTPSLFR

SHDEDDTYHNIDTPSLFR

08

Dolichyl-

diphosphooligosaccharide--

protein glycosyltransferase

48 kDa subunit [Ascaris

suum]

324509341 41 4 16 5.64/39496

GIALVADELGPLQMILMTASSTAYSHN

PNK

TVEEHPSAVGK

SPPAEYTIMDDVR

WVPFQGK

09


CAEBREN_00296


341874383 44 2 58 6.92/5221

MAQVVVAACLLSAIAFALGSHK

GDNAATAEVEIEDRPIHIGR

29, 48, 60


CAEBREN_00296


341874383 44 2 85 6.92/5221

MAQVVVAACLLSAIAFALGSHK

GDNAATAEVEIEDRPIHIGR

10


CAEBREN_00853


341899417 55 4 52 5.45/18354


CPEALFQPSFLGMESAGIHETSYNSIMK

DLYANTVLSGGSTMYPGIADR

SEYDESGPSIVHR

11 LONg family member (lon-

3) [Caenorhabditis elegans] 17566918 47 3 60 6.78/10985

MGAGTPSNR

ENYGGYGILQQVHSNLFTAK

VALGSLCSCIPQNDCPTGPPGVQGNSG

QPGE

16 LONg family member (lon-


MGAGTPSNR



QPGE

41,42 LONg family member (lon-


MGAGTPSNR



QPGE

12


F46F3.3 [Caenorhabditis

elegans]

115534662 45 3 70 5.58/6972

QGMGSYLHVLPDSK

EGDEPIYTLGASFYGGLEPAGAK

MGYMTRPFG

68

13 guanylyl cyclase

[Heterodera glycines] 4337130 48 3 38 6.67/20988

IGESVEPESFQMATIFFSDVVSFTTLAGK

CSPLLVVNLLNGLYTAFDGIIDTHDCYK

VETIGDGYLVCSGIPK

50 guanylyl cyclase

[Heterodera glycines] 4337130 44 4 38 6.67/20988



CSPLLVVNLLNGLYTAFDGIIDTHDCYK

VETIGDGYLVCSGIPK

14 CRE-NSY-4 protein

[Caenorhabditis remanei] 308465131 58 5 27 8.90/20304

TNITNMGR

SMEFEHSVFVQQAPPPARPR

SMEFEHSVFVQQAPPPARPR

SVADSMPELSR

SYPSDIAMGGR

15

cleavage and

polyadenylation specificity

factor subunit 2 [Trichinella

spiralis]

339247939 52 4 22 6.49/23105

HVIVVGSGLAGLSAALAAFNQGSR

VNGVQDNAK

LFYSDTMK

ANSVGSDR

17

Uncharacterized protein

family UPF0005 containing

protein [Brugia malayi]

170584338 50 3 27 7.93/23630

DHLVNVYATVAMGVGVAAGGASVHL

FTDILR

LGFFFAFCGLSGLGMGPLLER

YIIVLLA

19, 44




170584338 48 3 27 7.93/23630


FTDILR


YIIVLLA

49




170584338 59 4 37 7.93/23630


FTDILR

ANLLLSLVSIGLMFALISTPHSK


YIIVLLA

18 hypothetical protein

LOAG_04901 [Loa loa] 312075594 46 3 25 8.93/24945

CVIVSQWTILLNILEYHLK

DNLANFGGTICPSK

FISGSTSSDINTGSLIANAVVEK


LOAG_06031 [Loa loa] 312078154 44 3 25 4.87/18912

IPAAFSGTCHISSELDNGCFK

AGDELNVEFPTGGK

69

SDSPVVFR

22 GTP-binding protein SAR1

[Brugia malayi] 170588099 45 3 30 5.28/15067

MSWLWDWVSGMLNYLGLTK

SWLWDWVSGMLNYLGLTK

MAQHVPTLHPTSEELSLGGIR

23


CRE_11672

[Caenorhabditis remanei]

308493487 45 4 20 6.67/26411

NPVDTFLKPSVFFDDYNHR

MHLNHPGTIR

MHLNHPGTIR

SENATMDISYPDSGPEMYR

25


CAEBREN_23609


341896763 44 5 41 5.16/22258

MMHMANGNIDEFR

QTQSFLEGIESQMALPVLR

LASFMDVDDDHYDSFLGK

ESGPSMNEDEEPQTDIDFYVDR

DMINIADTK


LOAG_09802 [Loa loa] 312087199 42 4 26 6.22/19027

MPVSIQQLASASR

HLTNGHESLNMLK

EFAQPYNGMLPLSQSNDDER

EFAQPYNGMLPLSQSNDDER

27


CRE_25790

[Caenorhabditis remanei]

308468060 52 4 23 5.17/28449

MAELDESVLLGDSTDQHDGPIDENALL

DAK

AISTTGLAR

GYALLVLNSDAAVK

SPATVMIS

28 actin variant 1 [Dictyocaulus

viviparus] 162280611 47 4 23 4.96/34918


CPEAMFQPSFIGMESAGIHENSYNSIMK

CPEAMFQPSFIGMESAGIHENSYNSIMK

DLYANTVLSGGSTMYPGIADR


viviparus] 162280611 84 10 46 4.96/34918

AGFAGDDAPR

AVFPSIVGRPR

IWHHTFYNELR

VAPEEHPVLLTEAPLNPK

DLTDYLMK

70


viviparus] 162280611 104 9 44 4.96/34918

AGFAGDDAPR

AVFPSIVGRPR

IWHHTFYNELR

VAPEEHPVLLTEAPLNPK



viviparus] 162280611 97 9 44 4.96/34918

AGFAGDDAPR

AVFPSIVGRPR

IWHHTFYNELR

VAPEEHPVLLTEAPLNPK



viviparus] 162280611 99 9 44 4.96/34918

AGFAGDDAPR

AVFPSIVGRPR

IWHHTFYNELR

VAPEEHPVLLTEAPLNPK


30

[Pyruvate dehydrogenase

acetyl-transferring-

phosphatase 1 [Ascaris

suum]

324508573 46 3 35 6.02/14778

FLIVASDGLWEWFDADTAVR

RPLDTNSATHLLR

LHDQLQLPDGAAR

59

[Pyruvate dehydrogenase

acetyl-transferring-

phosphatase 1 [Ascaris

suum]

324508573 51 3 35 6.02/14778

FLIVASDGLWEWFDADTAVR

RPLDTNSATHLLR

LHDQLQLPDGAAR

32

formyl-CoA transferase

[Micromonospora

aurantiaca ATCC 27029]

302868224 43 3 62 8.76/7336

CQISSNFDGFPPSPLTYDR

HFAGTGFEVVK

VGIFAQHLAR

36


LMOh7858_0493 [Listeria

monocytogenes str. 4b

H7858]

47092550 55 3 58 9.47/9612

EEPNNEVLTWNGFKPYKPAK

IDVFLAK

DISDTTFLGLVTVFALVMSCR

71

43

Hypothetical protein

CBG09068 [Caenorhabditis

briggsae]

268572001 46 3 72 4.33/8114

LYDTQPANLSGLNEEFISGAR

LDNLVSTYTAIK

GVVESLEDTDAFDADPNVGSR

46


AbauAB_10162

[Acinetobacter baumannii

AB900]

239502665 44 3 26 4.66/19907

NNEEEDGPVIIMSRPDEEK

NSPDDDLINDYVADEQYYR

NCPTSVK

47, 52


AbauAB_10162

[Acinetobacter baumannii

AB900]

239502665 47 3 26 4.66/19907

NNEEEDGPVIIMSRPDEEK

NSPDDDLINDYVADEQYYR

NCPTSVK

51 rnf126-prov protein [Brugia

malayi] 170590155 45 3 38 6.58/17389

GGSGSNTPSNGR

AQGPQAIAMQMHPILGQVLSSLGDPHM

QVR

DGTMHGPFGDYVWGENGMDR

53 Nodal modulator 1 [Ascaris

suum] 324501240 44 4 25 6.23/22345

EYFEFDK

IIFFPNR

YLLKPISPMFLPSQIQIDLNNGPVTNLK

SGPVSFLR

57


CBG_14574

[Caenorhabditis briggsae

AF16]

309359371 56 6 30 5.02/34059

AGFAGDDAPR

DSYVGDEAQSK

IWHHTFYNELR

VAPEEHPVLLTEAPLNPK

SYELPDGQVITVGNER


LOAG_01253 [Loa loa] 312067645 44 3 33 6.81/17326

FSQQLKPIFEEASNR

GSAIAWAIVDCDR

QLIPSIQNFTTNVELNNQIDLK

*GenInfo Identifier (GI) – número de acesso no GenBank – NCBI

72

2.4. ARTIGO 4

Título: Abordagem proteômica da relação parasito hospedeiro entre

Ortleppascaris sp. e Rhinella marina.

Revista a ser submetido: International Journal for Parasitology.

ISSN: 0020-7519.



Ano de submissão: 2013.

73

ABORDAGEM PROTEÔMICA DA RELAÇÃO PARASITO HOSPEDEIRO

ENTRE ORTLEPPASCARIS SP. E RHINELLA MARINA

Jefferson Pereira e Silva*, Adriano Penha Furtado *, Humberto Josué de Oliveira

Ramos†, Ana Clara Rosa Salvador†, Claudio Lísias Mafra de Siqueira‡ and

Jeannie Nascimento dos Santos *

*Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia “Profa. Dra. Reinalda Marisa

Lanfredi”, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, Pará,

Brazil. e-mail: [email protected]

†Laboratório de Biologia Molecular de Plantas

‡ Laboratório de Parasitologia e Epidemiologia Molecular

ABSTRACT: Entre microrganismos e seus hábitats faz-se necessária uma gama de

moléculas indispensáveis para o bom funcionamento deste ambiente, no mesmo sentido,

a relação entre helmintos e seus hospedeiros também carrega um arsenal molecular

bioquímico. Dentre estas moléculas, o proteoma constitui-se talvez no maior e mais

importante conjunto substâncias ativas. Proteínas desempenham papéis imprescindíveis

em processos biológicos vitais na relação parasito/hospedeiro, desde metabolismo

básico e produção de energia até respostas imunes complexas. Em helmintos

representam um importante foco para estudos imunológicos e análises bioquímicas. A

proteômica tem fornecido informações valiosas quanto a estes agentes infecciosos e,

então, porque não se voltar para o agente infectado? Neste estudo foi traçado o perfil

proteômico de fluido presente pela encapsulação de larvas de Ortleppascaris sp. no

parênquima hepático do anfíbio Rhinella marina. Proteínas foram separadas por

eletroforese bidimensional e identificadas por MS a partir de Peptide Mass Fingerprint

protéinas. 54 moléculas puderam ser analisadas neste fluido, revelando uma complexa

relação entre parasito-hospedeiro. Este trabalho contribui para estudos proteômicos

relacionados a marcadores proteicos quanto ao desenvolvimento, infectividade,

virulência e co-existência de helmintos e seus albergadores.

mailto:[email protected]

74

INTRODUÇÃO

A sobrevivência dos parasitos em determinado organismo depende da relação

parasito-hospedeiro estabelecida entre os mesmos (MCKAY, 2006). O secretoma é o

conjunto completo de produtos excretados/secretados por uma célula ou organismo

(RANGANATHAN & GARG, 2009), por meio do qual podemos entender como um

organismo se comporta, incluindo informações de como um parasita realiza sua funções

no “meio” hospedeiro (HEWITSON, 2008; NAGARAJ et al., 2008).

Johnston et al. (2009) relatam que moléculas bioativas presentes em extratos de

helmintos ou em seus produtos de excreção/secreção são responsáveis por modular a

resposta imune do hospedeiro a seu favor em termos de co-existência.

Estas biomoléculas podem estar envolvidas nos mais diversos níveis fisiológicos

e segundo Craig et al. (2006) e Soblik, et al., (2011), em helmintos, essas substâncias

são derivadas da superfície ou de glândulas excretoras/secretoras especializadas e

freqüentemente liberadas em estágios específicos.

Este elenco de produtos, principalmente as proteínas, tem sido intensamente

estudado, revelando que a liberação destas moléculas desempenha um papel importante

na infecção pelo patógeno e nas interações Hospedeiro-Patógeno. Esta

Excreção/Secreção de proteínas pelos patógenos pode, muitas vezes, suprimir o sistema

imunológico, colaborando para o fortalecimento da infecção ou mesmo auxiliar na

sobrevivência de patógenos em seus hospedeiros definitivos (RANGANATHAN &

GARG, 2009; LIAO et al., 2011).

Para estudos proteômicos, modelos de praxe tem sido utilizados como C.

elegans e ratos (BOLKER, 2012), no entanto, helmintos de interesse humano e

veterinário também são alvos de promissoras investigações (SOTILLO et al.,2012,

ROBINSON et al., 2013).

Aqui destacamos o parasitismo de Ortleppascaris sp. em fígado de Rhinella

marina, no qual larvas deste nematódeo são encontradas no interior de cistos fibrosos,

preenchidos por fluido viscoso (Silva et al., 2013). Durante o parasitismo, o helminto

em questão permanece vivo e se desenvolve no órgão desde estágios elementares,

comunicando-se com o ambiente hospedeiro.

Neste trabalho identificamos por ferramentas proteômicas a composição proteica

do fluido gerado pelo encistamento da larva, parasita do anfíbio Rhinella marina.

75

A análise proteômica e identificação dessas proteínas contribuirá para o avanço

do entendimento da relação parasito-hospedeiro e seus possíveis marcadores

moleculares, expandindo o campo de análise de biomoléculas em novos modelos de

estudo, para o entendimento de infecção helmínticas de interesse humano e veterinário.

MATERIAL E MÉTODOS

Fluido cístico

Foram coletados por sucção fluidos de aproximadamente 200 cistos por sucção,

utilizando seringa estéril descartável e armazenados em tampão de extração (Uréia 7 M

– Tiouréia 2 M – CHAPS 2%) a -20ºC.

Preparação de Proteínas do Fluido cístico

Os fluidos coletados em tampão de extração foram centrifugados a 13000 × g

por 15 min a 4° C para obtenção do sobrenadante, utilizado diretamente para análise de

proteínas.

Eletroforese bidimensional

A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de Bradford

(1976), em seguida as amostras foram armazenadas a - 80° C até uso.

Alíquotas de extrato proteico contendo 100 µg de amostra foram diluídas ao

volume final de 125 µl em solução Destreak (GE healthcare) e 2% de tampão IPG pH 3

- 10 (GE healthcare). Tiras de 07 cm (Immobiline, GE healthcare) de gradiente

imobilizado de pH na faixa 3-10 foram reidratadas com o extrato proteico por 17 h

utilizando IPGBox (GE Healthcare). Iniciou-se a focalização isoelétrica logo após o

término da reidratação.

A focalização isoelétrica foi realizada a 20°C, corrente constante de 50 µA/strip

com um total de 5,0 - 6,5 KVh, seguindo os steps: 300V-4h; gradiente de 1000V-30min;

gradiente 5000V-1:20h; step 5000V-30min, em sistema automatizado (ETTAN

IPGPhor III GE Healthcare).

Após a focalização isoelétrica, as tiras foram reduzidas em tampão de equilíbrio

(6M uréia, 0,075M TrisHCl pH 8,8; glicerol 29%; SDS 2%; azul de bromofenol 0,02%)

contendo 2% DTT (ditiotreitol) durante 30 minutos e em seguida, alquiladas por 30

minutos em mesmo tampão de equilíbrio mencionado, contendo iodacetamida 2,5%.

76

Para a segunda dimensão, as tiras foram colocadas sobre géis de poliacrilamida

12,5% em sistema Mini Protean Cell (Bio-Rad). A corrida de eletroforese seguiu

voltagem constante de 80V por 2 horas. Os géis foram corados em solução Coomassie

Blue G 250, overnight, sob agitação e escaneados em ImageScanner III (GE

Healthcare), software Labscan (GE Healthcare).

Digestão tríptica in gel e espectrometria de massas

Os spots detectados pelo programa ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE

Healthcare) e observados a olho nu foram manualmente excisados, tratados com uma

solução de lavagem (Metanol 50%, Ácido Acético 5%), em seguida desidratados em

acetonitrila 100% em centrífuga a vácuo à temperatura ambiente. Proteínas foram

submetidas a processo de redução (Ditiotreitol 10 mM) e alquilação (Iodacetamida 100

mM).

Amostras foram digeridas a 37 °C, overnight, com Tripsina grau proteômico

(Promega, Madison, WI, USA) em Bicarbonato de Amônio 50 mM, (concentração final

20ng/µL). Peptídeos trípticos foram extraídos do gel com solução acetonitrila 50% em

ácido fórmico 5%.

Os peptídeos extraídos foram transferidos para um tubo estéril, tratados com

Bicarbonato de Amônio 100 mM, secos em centrífuga a vácuo e resuspendidos em

solução de Acetronila 50%, Ácido Fórmico 0,05% e Ácido Trifluoroacético 0,1%.

Alíquotas de 0,5 µL de cada amostra foram aplicadas sobre uma placa de aço,

juntamente com a matriz de ácido 2,5 di-hidróxi-benzóico (Sigma), numa proporção

1:1. Após a cristalização a placa foi inserida no espectrômetro e a análise iniciada.

Todos os espectros MS foram obtidos no intervalo de m/z 800 – 4000 Da,

usando MALDI - TOF em espectrômetro Ultraflex III (Bruker Daltonics). Os espectros

foram submetidos à análise em FlexAnalisys 3.3 (Bruker-Daltonics) para a formação da

peaklist.

A busca de proteínas por homologia de PMF (peptide mass fingerprint) foi

realizada em pesquisa no banco de dados público do NCBI [Nacional Center for

Biotechnology Information (NCBInr)], limitando-se a busca por taxonomia em Xenopus

laevis nos espectros de amostras de fluido, usando a versão on line do Mascot (Matrix

Science). Como parâmetros de busca, foram utilizados até dois sítios de clivagem

perdidos; erro de 0,1 Da para identificação de peptídeos, além de carbamidometilação

77

de cisteínas como modificação fixa e oxidação de metionina como modificação

variável. No sentido de inferir o processo biológico no qual as moléculas identificadas

estão envolvidas, a análise dos dados de PMF foram enriquecidas confrontando-a junto

aos termos do Gene Ontology (GO) por meio da base de dados on line UniProt. As

proteínas identificadas foram agrupadas em categorias e subcategorias funcionais de

acordo com a ontologia.

RESULTADOS

Para caracterizar o perfil proteico do fluido, utilizamos os 54 spots mais

abundantes detectados com o programa Image Master 2D Platinum (Fig. 1).

Figura 1: Gel bidimensional de proteínas provenientes de fluido cístico presente no

encistamento de Ortleppascaris sp.

A identificação das proteínas foi realizada com auxílio do software Mascot, na

qual foram considerados scores significativos acima de 55 (p < 0,05), indicando

homologia significativa com sequência disponível no banco de dados usado na análise.

78

Buscas na base de dados GO (Gene Ontology) foram realizadas em associação

com nossos dados de PMF. A lista de spots assinalados no gel bi-dimensional (Fig. 1)

com suas respectivas proteínas estão sumarizadas no Quadro 1 a seguir segundo a base

de dados utilizada. Destes spots, 47 foram identificados, 4 como não-caracterizadas (03,

13, 34, 36) e 3 spots (35, 37, 49) não originaram espectros de boa qualidade para

identificação, não possuindo homologia suficiente com nenhuma proteína do banco de

dados utilizado.

As proteínas encontradas no fluido compõem um conjunto de moléculas que se

agrupam em categorias gerais para o funcionamento celular, como balanço redox,

tráfego vesicular, etc, mas também revela um grupo de moléculas presentes em

processos específicos sumarizadas a seguir:

Quadro 1. Sumário de proteínas do fluido cístico de Ortleppascaris sp.

identificadas a partir de PMF na base de dados NCBI, busca por taxonomia

em Xenopus laevis. (Ver Tabela 1 material suplementar para mais detalhes)

Spot Proteína

01 prolyl endopeptidase-like

02 CDKN2A interacting protein N-terminal like

03 uncharacterized protein LOC779198

04 MGC84728 protein

05, 16 Cytoglobin

06 cysteine-rich with EGF-like domain protein 2-B precursor

07 Chain A, Crystal Structure Of X. Laevis T-Cadherin Ec1

08 LOC733224 protein, partial

09, 10, 11, 12, 22 TraB domain containing

13, 34 uncharacterized protein LOC379167

14 regulation of nuclear pre-mRNA domain containing 1B

15 proteasome subunit beta type-7

17, 25 phosphopantothenoylcysteine synthetase

18 peroxisome proliferator-activated receptor alpha

19 fidgetin-like protein 1


79

21 LOC733282 protein

23 microtubule-associated protein 1 light chain 3 gamma

24 cell division cycle 73, Paf1/RNA polymerase II complex

component, homolog

26 Cas/HEF-like protein 1

27 structure-specific endonuclease subunit slx1

28 actin, cytoplasmic type 5

29 Unknown (protein for MGC:181785)

30 gamma-crystallin-3

31 autophagy protein 5

32 nitrogen fixation cluster-like

33 vacuolar protein sorting 33 homolog A

36 uncharacterized protein LOC734830

38 LOC398774 protein

39 Pro-opiomelanocortin B (unnamed protein product)



42, 52 copper chaperone for superoxide dismutase

43, 50 ATPase, H+ transporting, lysosomal 50/57kDa, V1 subunit H

44 RAB3A, member RAS oncogene Family

45 aspartoacylase-2

46 tubulin tyrosine ligase-like family, member 7

47 MARK3 protein

48 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide

formyltransferase/IMP cyclohydrolase

51, 53 LOC414512 protein, partial

54 methylthioadenosine phosphorylase

Prolyl endopeptidase-like (spot 01), da subfamília S9A, com provável atividade

de endopeptidade em serina. Subunidade beta de proteossomo (spot 15), também com

atividade de endopeptidadase, envolvida em via proteolítica não lisossomal dependente

de ATP/ubiquitina.

80

Proteína similar a inibidor de quinase dependente de ciclina (spot 02), cujos

genes correspondentes são candidatos a supressão de tumores.

Moléculas responsáveis por processos bioquímicos básicos tais como

citoglobina (spots 05, 16) atuante no transporte de oxigênio; caderina (spot 07),

relacionada em processos de adesão intracelular. Proteína fidgetin-like 1 (spot 19),

integrante da ampla família AAA ATPases.

Hidrolases responsáveis pela quebra ATP e transporte de prótons foram

encontradas nos spots 43 e 50 e Aspartociclase no spot 45.

Neste mesmo repertório de moléculas ubíquas expressas em eucariotos,

identificamos actina citoplasmática tipo 5 (spot 28), proteínas referentes ao tráfego

vesicular (spots 33 ,44); moléculas com função de ligação às proteínas (spot 38), ao

zinco (spot 40), modificação proteica (spot 46), fosforilação (spot 47).

Estão presentes moléculas do processo de oxi-redução de ácidos graxos, como

acil-CoA desidrogenase (spot 08) e PPAR-alpha (spot 18) (Peroxisome proliferator-

activated receptor alpha). Além dessas foram detectadas a proteína copper chaperone

for superoxide dismutase (CCS) em 2 spots (42, 52) e proteína nitrogen fixation cluster-

like (Nifu) (spot 32) operante no sistema de montagem de compostos “iron-sulphur”,

importantes para a transferência de elétrons.

Proteínas com função ainda não elucidada estão presentes neste conjunto de

proteínas tais como domínio proteico TraB , identificadas em 05 spots (9, 10, 11, 12,

22) moléculas de ligação a ácidos nucléicos como LOC733282 protein (spot 21) e

cdc73 (spot 24) (cell division cycle 73, Paf1/RNA polymerase II complex component,

homolog) acreditadas como fator acessório da RNA polimerase II. Além de

endonucleases responsáveis por reparo e recombinação de DNA como structure-specific

endonuclease subunit slx1 (spot 27) e LOC443713 protein (spot 41). Em associação aos

ácidos nucléicos foram determinadas moléculas envolvidas na biossíntese de purinas

(spot 48), ligação a ácidos nucléicos (spots 51, 53) e metabolismo de nucleosídeos (spot

54).

Moléculas associadas ao processo de autofagia foram detectadas: Microtubule-

associated protein 1 light chain 3 gamma, também denominada map1lc3b ou LC3 (spot

23), membro da família de proteínas ATg8 ubiquitin-like (autophagy protein) e

autophagy protein 5 (spot 31).

81

Pro-opiomelanocortin B (spot 39), importante hormônio neurotransmissor

precursor de outros neuropeptídeos foi identificado com score significativo dentre este

conjunto de proteínas do fluido.

Análise Proteômica do Fluido Cístico

A pesquisa no banco de dados dos resultados foi realizada delimitando-se o

parâmetro de busca taxonômica para o organismo Xenopus laevis, uma vez que este é o

organismo taxonomicamente mais próximo ao hospedeiro R. marina no banco de dados

utilizado, ademais, nenhum spot referente ao extrato somático do parasito foi detectado

no gel bi-dimensional do fluido, sugestivo de que estas moléculas abundantes são do

hospedeiro e não do parasito.

O Quadro 2 a seguir mostra lista de proteínas identificadas com seus respectivos

spots identificados agrupadas em categorias e subcategorias funcionais de acordo com a

ontologia (Gene Ontology), minuciados na Tabela 2 (material suplementar), a qual

contém os dados referentes identificação pontual de cada spot do gel de fluido cístico

indicados na figura 1, o nome da proteína e seu respectivo helminto, os números de

acesso no GI indicado corresponde a sequencia de proteína do banco de dados do

National Center for Biotechnology Information (NCBI) com maior identidade com os

peptídeos, scores, match (número de peptídeos encontrados), coverage

(representabilidade dos peptídeos para a determinada proteína), ponto isoelétrico e

massa molecular teóricos e as sequências de aminoácidos dos peptídeos correspondentes

obtidas por espectrometria de massa.

82

Quadro 2. Sumário das proteínas identificadas a partir do gel de fluido cístico e processo biológico envolvido em termos

GO (categoria de processo biológico). Veja Tabela 2 com informações adicionais.

Moléculas do processo metabólico básico e produção de energia

Termo GO Processo/função biológico(a) Spot Proteína

GO: 0006508/

GO: 0004252

Proteólise/ Endopeptidase em

serina 01 Prolyl endopeptidade-like

GO: 0015671 Transporte de oxigênio 05, 16 Cytoglobin

GO: 0051603/GO:

0004252

Proteólise de processo

catabólico/ Endopeptidase 15 Proteasome subunit beta type

GO: 0046034 Processo metabólico de ATP 19 fidgetin-like protein 1

GO: 0005856 Citoesqueleto 28 actin, cytoplasmic type 5

GO: 0005515 Ligação a proteínas 38 LOC398774 protein

GO: 0016192 vesicle-mediated transport 33 vacuolar protein sorting 33 homolog A

GO: 0008270 Ligação com íon zinco 40 LOC443709 protein, partial

GO: 0015991 hidrólise de ATP e transporte de

prótons 43, 50 ATPase, H+ transporting, lysosomal 50/57kDa, V1 subunit H

GO: 0015031 Transporte de proteínas 44 RAB3A, member RAS oncogene Family

GO: 0016787 Hidrolase 45 Aspartoacylase-2

GO: 0006464 Modificação proteica celular 46 tubulin tyrosine ligase-like family, member 7

83

GO: 0006468 Fosforilação protéica 47 MARK3 protein

Moléculas envolvidas em processo de oxi-redução e stress oxidativo


GO:0055114/GO:0

003995

Oxi-redução/Acil-CoA

desidrogenase 08 LOC733224 protein, partial

GO: 0008289 Ligação em lipídeos 18 peroxisome proliferator-activated receptor alpha

GO: 0016226 Síntese de compostos Fe-S 32 nitrogen fixation cluster-like

GO: 0055114/ GO:

0006801

Oxi-redução/ processo

metabólico de superóxido 42, 52 copper chaperone for superoxide dismutase

Moléculas relacionadas a ácidos nucléicos


GO: 0003676 Ligação a ácidos nucléicos 21 LOC733282

GO: 0006281 Reparo de DNA 27 structure-specific endonuclease subunit slx1

41 LOC443713

GO: 0006164 Biossíntese de nucleotídeos de

purina 48

5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide

formyltransferase/IMP cyclohydrolase

GO: 0000166 Ligação a ácido nucléico 51, 53 LOC414512 protein, partial

GO: 0009116 Metabolismo de nucleosídeos 54 methylthioadenosine phosphorylase

84

Moléculas de reação hospedeira


GO:0006914 Autofagia 31 autophagy protein 5

GO:0007218 Via de sinalização neuropeptídica 39 Pro-opiomelanocortin B (unnamed protein product)

85

DISCUSSÃO

Identificação de Proteínas e Interpretação

Problemas na identificação de seqüências, em análise proteômica estão

relacionados a não produção de scores significantes, já que vários desses bancos estão

incompletos ou não bem estabelecidos (Medina et al., 2005). Segundo Antunes (2008),

esses dados devem ser considerados mesmo em os valores baixos de scores,

considerando a inexistência de um banco de dados completo e específico para os

organismos em questão. A escassez do banco de dados mais apropriado para cada

análise é responsável por redução nos valores dos score.

Apesar deste entrave, a perspectiva é de que a detecção destas moléculas sejam

um forte indicativo de sua presença nos sistemas de estudo.

Moléculas do Processo Metabólico básico e Produção de Energia

Clivagem peptídica é um processo muito comum e requer um número bastante

grande de famílias de enzimas. Dentre essas famílias encontra-se a Prolyl-peptidase,

uma dipeptil peptidase (DPP), com especificidade de clivagem em sítios ricos em

prolina, desempenhando uma função central na produção, regulação e degradação de

peptídeos in vitro (Lone et al., 2010).

Segundo Rosenblum & Kozarich (2003) estas proteínas desempenham um

importante papel na regulação de sinalização por hormônios peptídicos e talvez estejam

envolvidas na sinalização a partir do hormônio neuroendócrino Pro-opiomelanocortin

B, o qual está relacionado a respostas em situações de stress em alguns anuros.

São também indicadores moleculares para doenças oncogênicas, assim como

CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), também denominada p16 (Drexler,

1998), importante proteína para regulação do ciclo celular e tumoral.

Sua detecção no fluido pode ser justificada pela presença de moléculas de

colágeno, proteína rica em prolina, encontrado na cutícula de Ortleppascaris sp. ou

mesmo na matriz celular da face interna do cisto fibroso desencadeando, de acordo com

Lone et al., (2010), aumento da produção de FAP (fibroblast activation protein)

membro desta família de enzimas, cuja função é degradação dessa matriz.

86

Com função semelhante, subunidade beta do proteossomo foi registrada.

Segundo Groll & Huber (2003) é a maior via proteolítica em eucariotos, composta por

um complexo proteico multimérico dependente de ATP/ubiquitina, formado por mais de

31 diferentes subunidades alfas e betas. Esta maquinaria degrada proteínas anormais e,

assim, produz a maior fonte de antígenos peptídicos apresentados para o sistema imune

através do MHC de classe I, mas também regula a degradação em importantes processos

como adaptação metabólica, assim como é observado no interior do cisto, onde o

hospedeiro necessita de uma maquinaria adequada para a apresentação de antígenos,

reconhecimento do helminto, bem como necessita adaptar seu metabolismo frente à

infecção.

A citoglobina ainda é uma incógnita, pois sua função não é bem definida no

metabolismo em anfíbios, porém, estes animais ocupam posição filogenética favorável a

estudos genômicos devido uma conservação evolutiva dessa molécula (Fuchs et al.,

2006). Acredita-se que sua expressão exacerbada esteja relacionada com

hipóxia/isquemia tecidual (Pesce et al., 2002) e/ou síntese de colágeno (Schmidt et al.,

2004).

Estes aspectos estão presentes no fígado do hospedeiro R. marina, onde a

vascularização/oxigenação foi comprometida pelo parasitismo assim como a

organização tecidual mostrados por Silva et al. (2013), justificando, por conseguinte, a

expressão de caderinas, moléculas, as quais segundo Leckband & Prakasam (2006) são

responsáveis, dentre outras funções, pela manutenção da estrutura tecidual.

Quanto a molécula fidgetin-like 1, estudos realizados por Yang et al. (2005)

apontam sua função para o proliferação celular. O que na relação Ortleppascaris sp.

versus R. marina pode estar relacionada a proliferação celular larval assim como ocorre

em C. elegans (Luke-Glaser et al., 2007), sendo liberada para o meio extracorpóreo, e,

portanto presente no fluido.

Moléculas do Processo Oxi-redução e Stress Oxidativo

De acordo com Yang et al. (2005), a molécula fidgetin-like 1 participa, dentre

outras atividade celulares, do transporte mediado por vesículas aos peroxissomos.

Outras moléculas obtidas desta amostra influem nas reações redox, associadas, a

proliferação de peroxissomos, como a proteína PPAR-alpha, indicando um alto

metabolismo e reações beta-oxidação frente a ácidos graxos presentes neste fluido.

87

Além desse conjunto de proteínas outras moléculas-chave para metabolismo

lipídico, reguladoras da via de beta-oxidação ácidos graxos foram encontradas, tais

como, acil-CoA desidrogenase, NifU, envolvida na formação de complexos [Fe-S] e

transporte de elétrons (Johnson et al., 2005) e Copper Chaperone for Superoxide

dismutase (CCS) que segundo Rosenzweig & O’Halloran (2000) é marcador de uma

forte reação antioxidante, presente no fluido.

Moléculas da Reação Hospedeira

LC3 é expressa sob várias condições de stress (Shpilka et al., 2011), como

doenças, infecções microbianas, fase tumoral, e fome, além de ser usado como

marcador molecular de autofagia em mamíferos (Tanida et al., 2004), indicando que R.

marina está sob condições desfavoráveis a partir da infecção por Ortleppascaris sp.,

somado a essas informações foi encontrada autophagy protein 5, a qual assim como

p16, é marcador de processos tumorais e autofagia.

Ainda sim, moléculas de combate ao stress oxidativo, como CSS, aparecem de

modo abundante, sugerindo grande quantidade de radicais livres no fluido cístico, o que

pode certamente contribuir, junto com a injúria celular e hipóxia local, para processos

de autofagia e doenças relacionadas ao câncer, como afirmado por Kongara & Karantza

(2012), uma vez que PPAR-alpha está presente no conjunto de moléculas que podem

aumentar o número de radicais livres.

Todas estas moléculas relatadas podem estar envolvidas em processos de

resposta ao stress celular ou mesmo na resposta imune do anfíbio, uma vez que seu

parênquima sofre alterações na presença dos cistos contendo fases larvais de

Ortleppascaris sp.

A exemplo disto, encontramos com valores significativos de score, a proteína

Pro-opiomelanocortin B, encontrada nos anuros Rana idibunda e X. laevis (Jenks et al.,

2011) precursor de importantes neuropeptídios, como o α-MSH.

A presença dessa molécula está relacionada dentre outros processos, com um

reflexo neuroendócrino de mudança adaptativa de cor de pele em anfíbios, que envolve

a redistribuição e dispersão de pigmentos pelos melanóforos da pele, causando

escurecimento da mesma (Jenks et al., 2003). A Pro-opiomelanocortin B é liberada no

organismo em condições desfavoráveis ou stress intenso, como má nutrição e infecções

88

(Kolk et al., 2002), fatores sob os quais R. marina em questão está certamente

submetido durante a manutenção do parasitismo por Ortleppascaris sp.

CONCLUSÃO

O novo modelo de estudo, anfíbio-helminto, torna a pesquisa relevante, pois até

então, a maioria de estudos têm sido realizados apenas em murinos como modelos

animais, considerando que muitos resultados discrepantes têm sido obtidos usando

diferentes modelos animais e helmínticos, fazendo desta uma oportunidade para

observação da co-evolução destes organismos à luz da variedade e plasticidade de

moléculas protéicas expressas de acordo com diferentes nichos hospedeiros ou ambiente

em que esses helmintos se encontram.

A abordagem molecular de infecções helmínticas em R. marina traz à tona uma

gama de informações sobre o elenco de antígenos proteicos presentes em um animal

sinantrópico, considerado um indicador ambiental e vetor em potencial para zoonoses

helmínticas.

O mapeamento proteico da interface helminto-anfíbio pode demonstrar como o

hospedeiro reage frente ao desequilíbrio causado pelo parasitismo de forma a adaptar-se

a esta condição, contribuindo para elucidação da biologia das relações parasito-

hospedeiro.

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92

Tabela suplementar 1 - Proteínas expressas na amostra fluido cístico de Ortleppascaris sp. identificadas por PMF na base de dados NCBI, busca por taxonomia em Xenopus laevis.

Spots Proteína Acesso GI* Score Match Coverage (%) PI/MW

Teórico Peptídeos

01 prolyl endopeptidase-like 291290935 47 8 15 6.81/81428

MRNLAQQVGLFVCR

QKFMAVTLK

RFITINSNSK

IAGVIYYIEHSNGCLYMLRRHGEAAEYK

RHGEAAEYK

HWEPVYEVQERTKLVDMEMLK

DHCLLFLK

ITAYENDQRVPIQGLLGYITRLR

02 CDKN2A interacting

protein N-terminal like 147901853 32 3 43 5.00/11255

FQSFSESDK

AREEFIIR

VCGMAEGIVVEDAPHFTTRDEIMK

03 uncharacterized protein

LOC779198 148235523 43 7 26 6.29/47492

YDPPDPRR

KSRWDELEISGR

LQTLGLKGNPLSQDILGLYQEPDGMR

DQILPSVPFTVMCFNVLCDK

AKIMSDQEK

KHVDGCAIFFRTEK

QLLMVANAHMHWDPEYSDVK

04 MGC84728 protein 148228072 45 6 16 9.93/33217

AQFLVEKAK

HKIVQAEGEATAAKMIGDALSK

IVQAEGEATAAKMIGDALSK

IVQAEGEATAAKMIGDALSKNPGYLK

MIGDALSKNPGYLKLR

RIRAAQSIAK

05 Cytoglobin 147906731 30 3 38 5.90/20708

GVIKETWARVYANCEDVGVSILIR

QHFSQFKHMEDPLEMEGSVQLR

VEPVYFKILTGVMLEVFAEEYAK

16 Cytoglobin 147906731 31 3 38 5.90/20708

GVIKETWARVYANCEDVGVSILIR

QHFSQFKHMEDPLEMEGSVQLR

VEPVYFKILTGVMLEVFAEEYAK

06 cysteine-rich with EGF- 148226184 40 4 13 4.60/41769 QKYPDLLK

93

like domain protein 2-B

precursor

SGDGSCRCK

ECNNGWVK

DCATGFVMLSGKCTDVDECDASEK

07

Chain A, Crystal Structure

Of Xenopus Laevis T-

Cadherin Ec1

290560285 35 3 24 4.97/10779

IPFPKIVGR

LYGKGVDQEPK

GVDQEPKGIFK

08 LOC733224 protein,

partial 62825972 40 4 45 9.54/27128

TDPEAPRHKQQTMILIPMDTAGIK

TRIAFGKPLVEQGTILAGIAQSRAEIEQAR

AAHLMDTVGNKTAALEISLIKMVAPTMAYR

AIQAFGAAGLSSDFPLAQFHAWARALR

09 TraB domain containing 148235771 65 7 37 5.84/42453

TIQEVQPDVVVVELCQYRVSMLK

EASKVPFCK

QKDLLEQMMAEMIGEFPDLHRTIVSER

ASETEPRKSIPSVVVGVVGMGHVPGIER

NWNCELNIQEIMRVPPPSTLSRAVAFAAK

IILSVPATQYCLQRLNQMATDLK

LNQMATDLK


ILWEMKIK

EASKVPFCK



LNQMATDLK


ILWEMKIK


EASKVPFCK


LNQMATDLK

94


ILWEMKIK

EASKVPFCK




LNQMATDLK


ILWEMKIK


EAKEINLEK

EASKVPFCK

LNQMATDLK


LOC379167 148236462 45 9 13 5.27/121070

STELPVQSIGALSHPPEEESVSFHK

LCYLGCMK

AQCVAPITVTLYVPNIPEGSVR

FWYFSRK

TFTETFYLKLKPSGSSGAADSMYEVVSLQR

RLQETSMR

NDLDQAEDKAEVLNKELLLTK

QICSQLSTR

EELEMIKAK

95


LOC379167 148236462 53 13 20 5.27/121070

AMEEILRDSEK

STELPVQSIGALSHPPEEESVSFHK

LCYLGCMK

AQCVAPITVTLYVPNIPEGSVR

SEVASFPIYK

NVKNSDMHLLDMESMGKSSDSK

RVYMTVAVDMVVTEVVEPVRFLLETVVR

FWYFSRK

KTFTETFYLK

NTEGDGQESLYK

NDLDQAEDKAEVLNKELLLTK

EELEMIKAK

TLNSIKTATGTQPTSAPSQQGSQASSPVLPAAK

14

regulation of nuclear pre-

mRNA domain containing

1B

147905258 32 4 18 5.41/36911

ASFTEPALEK

LSELSNSQQSVQTLSLWLIHHRK

QLAKMLMEYTQTQKEVLSNK

KLEEYKQK

15 proteasome subunit beta

type-7 147906595 40 5 27 8.64/30389

TGTTIAGIVFK

VATANRMLK

NAIAAGIFNDLGSGSNIDLCVITKNK

KGTTGILSEK

KGTTGILSEKITHFNLDVMEESVQTMDIS

17 phosphopantothenoylcystei

ne synthetase 148234547 39 5 14 7.15/33266

FLDNFSSGR

FLDNFSSGRR

AGYAVIFLHR

HRSMYPYSR

IQSSSGPLQITMK

25 phosphopantothenoylcystei

ne synthetase 148234547 37 5 14 7.15/33266

FLDNFSSGR

FLDNFSSGRR

AGYAVIFLHR

HRSMYPYSR

IQSSSGPLQITMK

96

18 peroxisome proliferator-

activated receptor alpha 148226176 36 6 16 5.58/52966

FEKCLNVGMSHNAIR

FEKCLNVGMSHNAIRFGR

ASTPPFVIHDMETLCMAEKTLVAK

GLRKPIGDMMEPK

LLQKMADLR

LLQKMADLRQLVTEHAQLVQTIK

19 fidgetin-like protein 1 148235265 47 6 14 7.20/72677

YSAILDSDKLEIGLNNYADSILTMAKCQR

WQSSLTTNNVLKLKSVQEMAEAGR

SVQEMAEAGRRAQLSLLNSTDASVR

EQLWVDQQK

NPGPLYGGGKK

QIVVSLMSK


partial 51703613 33 4 13 8.69/32266

HSGSTMAGSR

QQKLLREK

LPEQVTKPLPK

DIVLNVEEK

21 LOC733282 protein 67678022 35 3 8 5.75/31646

IMQKYGFR

YGFREGQGLGK

EECEKYGK

23

microtubule-associated

protein 1 light chain 3

gamma

148227010 39 6 55 9.82/14574

MSQPFKQRK

IPVIVERYRR

EKYLPLLDK

YLPLLDKTK

FLVPKDLSMMQFINIIRNR

DHKDEDGFLYMTYASQEMFG

24

cell division cycle 73,

Paf1/RNA polymerase II

complex component,

homolog

147901047 52 11 29 9.68/ 60701

ADVLSVLRQYNIQK

NVKTNYVIWGTGKEGQPR

VADEISAEAKKPR

EGMVATEQIRSLSEAMSVEKIAAIK

RSTIKTDLDDDITALK

YDQERFKGK

SVTEGASARK

KTQTPAVQPVPRPVSQARPPPNQKK

YDEVRLDPNVQK

FWETLDRYMVK

YMVKNKAHLR

97

26 Cas/HEF-like protein 1 213623648 45 7 8 8.47/ 96325

ADSPDELTFRK

GLTEIYDIPPSGK

GCYYNTLPPPR

NTSNIWKQR

DSNIQLRIK

QDTSHSPESPK

SSELCGLLK

27 structure-specific

endonuclease subunit slx1 147901424 40 5 13 8.86/ 33182

IQQHNGGKHK

RLTHVPRK

EKGRLGENR

CRVCYER

VCYERVQDK

28 actin, cytoplasmic type 5 288541396 49 8 26 5.30/ 42165

AVFPSIVGRPR

AVFPSIVGRPRHQGVMVGMGQK

DSYVGDEAQSKR

VAPEEHPVLLTEAPLNPK

DLTDYLMK

GYSFTTTAER

SYELPDGQVITIGNER

QEYDESGPSIVHR

29 Unknown (protein for

MGC:181785) 161612103 34 6 20 9.55/39454

KLPQAIIIGVKK

LPQAIIIGVK

GGTRALLEFLR

AVGAEPHFFDRNYDK

VISDYTQTLSK

EFYRPFNMKFYQMTGHDFGWD

98

30 gamma-crystallin-3 285026499 40 6 40 8.18/21842

MGKIFFYEDK

NFQGRSYECNSDCSDLSSYFNR

SCRMSPYHQGQYK

MSPYHQGQYK

FRDIHSCNVFDGNWMFYEEPNYRGR

DIHSCNVFDGNWMFYEEPNYR

31 autophagy protein 5 76150384 47 9 33 5.90/32860

MTDDKDVLR

LLLPRVSYLTLVTDK

VSYLTLVTDKVKK

KHFQKVMR

CQSKDVIEAHFMSSVK

HKSQVINEMQK

QLWMGLQNDK

FEQFWAINRK

FEQFWAINRKLMEFSPEDGGFR

32 nitrogen fixation cluster-

like 147903789 39 3 22 8.18/17373

NVGSLDKNAK

NVGSLDKNAKNVGTGLVGAPACGDVMK

AALADYRLK

33 vacuolar protein sorting 33

homolog A 189217822 37 7 15 6.60/68661

MFTLKSGPLPSSDVKNIIFFVRPR

RSILCEQR

LKDLGVLGSFMHR

LKDLGVLGSFMHR

MKRELGGSQSQITPVFDTLLLLDR

AGLLKLQTSSR

LAQILVRPGWR


LOC734830 148234275 38 5 31 4.70/21811

GSGSGAATSLPR

GSGSGAATSLPRMKR

GLATFCLDKEALR

EWEMQFKEK

YEYVGRLLKPGEEPSEYTDEEDVR

38 LOC398774 protein 120577670 35 3 7 5.83/63541 RLQWVSRITNDGDITYYNDSFK

CDDTAITPK

99

ISPGDWENK

39 Pro-opiomelanocortin B

(unnamed protein product) 1334681 37 3 90 10.17/3521

YGGFMTPER

SQTPLMTLFKNAIIK

NAIIKNTHK


partial 49522196 42 5 19 9.53/26306

DLGEPLGGTSK

NSRTNHSSHNDRGPGR

SSSNSNREVVMR

SSSNSNREVVMRVTTV

EVVMRVTTV


partial 49257706 37 7 25 9.54/37426

MPEGPELHR

VCKGLSFAGAVEK

VCKGLSFAGAVEKSAVSK

EVKLILTPLSDESEETHIVFRFGMSGSFK

FTPQDQIPK

LEIPPFTPAR

LEIPPFTPARSVLEAVK

42 copper chaperone for

superoxide dismutase 284520887 45 5 21 5.89/30073

CAHAVKNVLQDVKGVK

AVLKGMGTIK

AVLKGMGTIKSK

ASFRLVDER

QLCTCDGITIWEERNYPIAGPGR

52 copper chaperone for

superoxide dismutase 284520887 40 7 25 5.89/30073

MEELGSSRALSK

MEELGSSRALSKFEFAVQMTCEK

CAHAVKNVLQDVKGVK

AVLKGMGTIK

AVLKGMGTIKSK

ASFRLVDER

LKVYEIIGR

100

43, 50

ATPase, H+ transporting,

lysosomal 50/57kDa, V1

subunit H

148227105 40 7 18 6.01/55745

TFINLMTHISK

VSIFFDYARR

QDLFTVHMAARIIAKLAAWGR

LAAWGRELMEGSDLNYYFNWIK

TQLSSQKLR

NLLEKSTERETR

RVIEQLDGK

44 RAB3A, member RAS

oncogene Family 147901693 45 7 41 4.87/25139

MASATDSRYGQK

ILIIGNSSVGK

ILIIGNSSVGKTSFLFR

TIYRNDKR

YRTITTAYYR

TYSWDNAQVLLVGNK

QTFERLVDIICEKMSESLDTADPAVTGAK

45 aspartoacylase-2 147898393 37 3 14 6.11/34574

SFTADILLANPIAVERCVRYIDR

VAFIATEKK

HCFVPALKLQN

46 tubulin tyrosine ligase-like

family, member 7 148233920 34 10 17 9.37/106393

PSLPNESDHQATCSLSMHSDLPYQPSSSIK

LVIEEMMFTK

FWSDISDLVVK

YEGLLATAFQTFLAGRAASLQR

AASLQREMNNPLK

LSGKPTRPKEPR

NYSSHSSSNSTGSSSDTEEEDEKER

AARPFSNLSSPSSAAPMRRSVSCPR

KVLDIVRTNIR

TNIRSVLQR

47 MARK3 protein 38014795 41 7 13 9.37/67033

AENLLLDADMNIK

FLVLNPSKR

GRSISSSQKQR

GVTPPSPMLGNANNPNK

RNTYVCNER

101

GTASRSTFHGQLRER

LSLNGVRFK

48

5-aminoimidazole-4-

carboxamide

ribonucleotide

formyltransferase/IMP

cyclohydrolase

148228807 37 8 14 6.10/64415

EVSDGIVAPGYEDEALK

KKNGSYCVLQMDTSYEPSDIEIR

YTQSNSVCYAK

YTQSNSVCYAKDGQVIGMGAGQQSR

ADNWWLRHHPR

HHPRVLGMK

HHPRVLGMKFK

VLGMKFKAGVK


partial 46250145 35 4 26 8.48/32730

RIVTVFGATGAQGGSVAAALLADGSYTVR

TIKDAKISLDAYR

NLGFPAAQELANMFEFFQMKLDR

LDRNVDLTLELNPKAK


partial 46250145 37 7 32 8.48/32730

RIVTVFGATGAQGGSVAAALLADGSYTVR

HVVFSGLENVKK

CPAKYIGKDIGISTDK

VTGKTIKDAK

TIKDAKISLDAYR

DAKISLDAYR

NLGFPAAQELANMFEFFQMKLDR

54 methylthioadenosine

phosphorylase 147901520 39 5 18 8.35/28390

GAMITIEGPR

GAMITIEGPRFSSK

GAMITIEGPRFSSKAESHMFR

FSSKAESHMFR

ATSILLTAIPQIAAMDWTETLQSMK

*GenInfo Identifier (GI) – número de acesso no GenBank – NCBI

102

3. CONCLUSÃO

3.1 TAXONOMIA E BIOLOGIA MOLECULAR DE ORTLEPPASCARIS SP.

- A utilização de abordagem ultraestrutural gerou novos dados taxonômicos na

descrição do gênero Ortleppascaris, tais como presença de glândula excretora, mucro,

diferença regionalizada das estriações cuticulares, posicionamento de papilas sub-

labiais, anfídios e fasmídios, importante para sistemática desses organismos;

- Apesar de larvas de Ortleppascaris sp. já terem sido registradas previamente

em anuros da América do Sul, este é o primeiro registro deste parasito infectando

anfíbios no Brasil;

- Este é o primeiro registro deste nematódeo em R. marina, adicionando e

ampliando a distribuição geográfica deste helminto;

- A abordagem molecular representa um importante dado para as análises

filogenéticas desses organismos, uma vez que nenhum estudo prévio das características

genéticas do gênero havia sido realizado. Adicionalmente, dados sobre a repetição

dinucleotídica da sequência ITS pode contribuir para futuros estudos em genética de

populações.

3.2. HISTOPATOLOGIA DA INTERAÇÃO ORTLEPPASCARIS SP. X R.

MARINA

- A identificação e observação dos helmintos em seus hospedeiros bem como a

caracterização da resposta imune celular é de fundamental importância para a

compreensão dos processos pelos quais os parasitas podem modular seus hospedeiros;

- A presença dos helmintos em estudo visivelmente influencia na proliferação e

diapedese de melanomacrófagos, processo provavelmente induzido por produtos de

excreção e secreção resultantes do metabolismo das larvas em pleno desenvolvimento;

- Em relação à interação helminto-hospedeiro, acreditamos que o sistema de

defesa deste último não é capaz de coibir, na maioria das vezes, a presença do parasito

uma vez que há grande recrutamento de células de defesa como mostrado nos infiltrados

leucocitários e melanomacrófagos, e, ainda sim o parasito permanece vivo desde

estágios mais elementares;

103

- R. marina caracteriza-se como um hospedeiro adequado para o

desenvolvimento do helminto uma vez que larvas em diferentes estágios foram

observadas pela histologia.

3.3. ANÁLISE PROTEÔMICA DA INTERAÇÃO ORTLEPPASCARIS SP. X R.

MARINA

- São necessários estudos mais aprofundados que contornem os entraves

causados pela falta de banco de dados proteômicos relativos aos organismos em

questão, além de técnicas mais sensíveis para a identificação de proteínas com

parâmetros de identificação extremos, como peso molecular e ponto isoelétrico, não

abrangidos pela técnica de eletroforese bi-dimensional;

- Algumas outras proteínas expressas em Ortleppascaris sp. e seu hospedeiro,

como Actina, proteínas referentes a lon-3, PP2C e citoglobina que apresentam caráter de

conservação evolutiva, conferem a este organismo, potencial para estudos relativos ao

desenvolvimento estrutural e diferenciação sexual de animais, uma vez que a

conservação evolutiva de caracteres em nematódeos têm sido utilizados em estudos e

fornecido informações esclarecedoras;

- Moléculas-chave para a biologia de helmintos foram indicadas aqui, como as

guanilil ciclases, de grande participação em processos quimiosensoriais e neurobiologia

de parasitas nematódeos; antígenos imunorreativos, específicos de nematódeos,

portanto, candidatos vacinais anti-helmínticos; além de fatores de virulência,

considerados marcadores proteicos para infecção helmíntica em geral;

- O modelo de estudo anfíbio-helminto amplia as abordagens de estudo da

relação parasito-hospedeiro, pois até então, a maioria das pesquisas têm sido realizadas

em murinos como modelos animais, considerando que muitos resultados discrepantes

têm sido obtidos usando diferentes modelos animais e helmínticos, fazendo desta uma

oportunidade para observação da co-evolução destes organismos à luz da variedade e

plasticidade de moléculas protéicas expressas de acordo com diferentes nichos

hospedeiros ou ambiente em que esses helmintos se encontram;

- A abordagem molecular de infecções helmínticas em R. marina traz à tona uma

gama de informações sobre o elenco de antígenos protéicos presentes em um animal

sinantrópico, considerado um indicador ambiental e vetor em potencial para zoonoses

helmínticas;

104

- Este conjunto de moléculas encontradas mostra uma diversidade de processos

que ocorrem nesses nematódeos de acordo com o desenvolvimento, metabolismo redox,

infectividade e virulência, afirmando a complexidade fisiológica desses organismos;

- O mapeamento proteico da interface hospedeiro-parasito pode demonstrar

como o hospedeiro reage frente ao desequilíbrio causado pelo parasitismo de forma a

adaptar-se a esta condição. A abordagem proteômica forneceu informações sobre a

relação parasito-hospedeiro a nível molecular, relevantes para estudos co-evolutivos,

escolha de antígenos vacinais e dualidade fisiológica na relação entre estes dois

organismos.

105

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