apostila 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICADISCIPLINA BIOQUÍMICA 4 – BQ 004

MANUAL DE AULAS PRÁTICAS

Prof. Levy Dos Santos Guedes

RECIFE2007

APRESENTAÇÃO

O objetivo deste manual é tornar o aluno consciente da importância das aulas práticas para a sua formação profissional, procurando envolvê-lo de forma mais efetiva, através da aplicação de questionários sobre cada aula prática executada.

As fichas de estudo trazem informações que ajudam o aluno a entender a relação existente entre a prática realizada e o tema teórico correspondente. Além das aulas práticas, o manual contem um texto sobre o tema de aula teórica: “Integração e regulação do metabolismo”. Este tema é abrangente e será apresentado ao aluno na forma de painel dirigido. O manual ainda contem textos com exemplos clínicos e temas sobre algumas doenças relacionadas com o metabolismo celular, que serão apresentados pelos alunos na forma de seminários.

Considerando que o Curso Farmacêutico é um curso essencialmente prático e que a Bioquímica é uma disciplina bastante árida em seu conteúdo, esperamos que os alunos possam, com este manual, compreender melhor os assuntos das aulas teóricas através da execução das práticas e da apresentação dos seminários sobre temas relacionados. Isso torna-se imperioso, uma vez que a Bioquímica é uma disciplina fundamental na formação do Farmacêutico.

Nesta edição estamos introduzindo algumas modificações na metodologia das práticas e algumas correções no texto.

Recife, 11 de maio de 2007

Prof. Levy dos Santos Guedes

Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes 2

ÍNDICE

APRESENTAÇÃO .......................................................................................... 2

1. Cinética de Reações Catalisadas por Enzimas ............................................. 4

2. Inibição de Reações Catalisadas por Enzimas ............................................. 8

3. Consumo de Glicose por Células de Sacharomyces cerevisiae ................... 10

4. Dosagem de Peróxidos de Lipídeos ............................................................. 13

5. Efeito da Glicose sobre a Peroxidação de Lipídeos ..................................... 17

6. Hidrólise de Proteínas ................................................................................... 18

7. Dosagem de Uréia no Plasma Sangüíneo ..................................................... 20

ESTUDOS DIRIGIDOS ................................................................................... 22

PAINEL DIRIGIDO

1. Integração e Regulação Metabólica .............................................................. 24

2. Questões Sobre o Tema Integração e Regulação Metabólica ....................... 33

BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 34

3 Manual de Aulas Práticas – Prof. Levy dos Santos Guedes

CINÉTICA DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS

OBJETIVOS

A realização desta prática permite ao aluno:1- Uma introdução ao estudo da cinética de reações catalisadas por enzimas2- Medir a velocidade de uma reação enzimática.3- Calcular a constante de Michaelis-Menten (KM) e a velocidade máxima (Vmáx) e

destacar a importância destes parâmetros na caracterização das enzimas.4- Conferir a importância da equação de Lineweaver-Burk no cálculo de KM e Vmáx.

INTRODUÇÃO

Cinética de reações enzimáticas

As enzimas desempenham um papel de destaque no organismo vivo, uma vez que catalisam reações bioquímicas imprescindíveis ao desenvolvimento e manutenção das células.

A concentração de uma enzima em tecido ou fluido biológico pode ser determinada medindo-se a velocidade da reação catalisada pela enzima. Para isso são utilizados métodos analíticos que permitam medir a diminuição na concentração do substrato ou o aumento na concentração do produto da reação.

Muitos fatores podem afetar a atividade enzimática: concentração do substrato, temperatura, pH, concentração de ativadores e inibidores, concentração do produto. Todas estas variáveis podem e devem ser controladas, mas a presença de ativadores e inibidores em sistemas biológicos nem sempre é detectada e por isso não pode ser controlada. Por isso a medida da atividade enzimática não corresponde necessariamente à concentração real da enzima. Para medir com precisão a velocidade de uma reação enzimática é necessário que esta velocidade se mantenha constante durante o experimento.

Com auxílio da equação de Michaelis-Menten é possível determinar o percentual da velocidade de uma reação enzimática com uma dada concentração de substrato, em relação à velocidade máxima da reação, ou seja, à velocidade obtida com uma concentração de substrato capaz de saturar toda a enzima presente no meio da reação. Assim, se em uma reação enzimática for utilizada uma concentração de substrato correspondente a 20 vezes o valor do KM, a velocidade da reação corresponderá a 95% da Vmáx:

Admitindo que no final da reação 10% do substrato tenha sido consumido, a concentração agora corresponderá a 18 vezes o valor do KM e a velocidade da reação a 94,7% da Vmáx. A variação da velocidade é muito pequena e pode ser ignorada.

Na prática esse problema torna-se mais complexo uma vez que a solubilidade do substrato é limitada e muitas vezes as enzimas apresentam um KM alto. Nestes casos é aconselhável desenvolver a reação enzimática em um espaço de tempo curto e repetir o

v = Vmáx [S] (KM + [S]) v Vmáx100 = 20 KM (KM + 20 KM)


experimento com o material que contem a enzima, diluído, todas as vezes em que mais de 10% do substrato for consumido na reação.

Aplicações de enzimas nas análises clínicas

Os conhecimentos da enzimologia vêm sendo aplicados no laboratório clínico para medir a atividade de enzimas e a concentração de substratos em tecidos ou fluidos de pacientes. Enzimas como trombina e plasmina, associadas ao processo de coagulação sangüínea, bem como lipoproteína lipase, envolvida com o processamento dos quilomícrons; são exemplos de enzimas específicas do plasma e por isso são encontradas em concentrações mais elevadas. Nas doenças de tecidos e órgãos pode haver alterações na permeabilidade da membrana, ou morte celular e com isso, enzimas dos tecidos difundem-se para o plasma. Essas enzimas, normalmente estão presentes em baixas concentrações e não têm nenhum papel funcional no plasma.

No diagnóstico do envolvimento de um órgão específico numa doença, seria ideal se as enzimas particulares para cada órgão pudessem ser identificadas. Isso é improvável porque os processos metabólicos de vários órgãos são muito semelhantes. Embora existam poucas enzimas específicas para um determinado órgão ou tecido, como a álcool desidrogenase do fígado e a fosfatase ácida da próstata, o estudo da cinética do aparecimento e desaparecimento de enzimas particulares no plasma, permite que o diagnóstico do envolvimento de um órgão específico seja feito.

Estudos da cinética de liberação de enzimas cardíacas no soro, após um enfarte do miocárdio, permitem estabelecer quando o ataque ocorreu e se o tratamento é efetivo. A concentração plasmática de creatina fosfocinase (CPK), aumenta cerca de seis vezes, entre o primeiro e o segundo dia após o enfarte; enquanto a lactato desidrogenase (LDH) e a -hidroxibutírico desidrogenase (HBDH), aumentam cerca de duas vezes, de forma mais lenta, mas permanecem elevadas por mais tempo.

Entre as enzimas utilizadas com freqüência no diagnóstico de doenças podemos relacionar, além daquelas citadas acima, fosfatase alcalina, amilase, lipase, aspartato e alanina amino transferases, estas duas últimas, também conhecidas como transaminase glutâmico oxaloacética (TGO) e transaminase glutâmico pirúvica (TGP), respectivamente.

O reconhecimento dos metabólitos que se acumulam em fluidos biológicos, tem um papel importante na identificação de possíveis defeitos na produção ou na atividade de enzimas. Como exemplo temos a acidúria orótica hereditária, devida à deficiência de duas enzimas envolvidas com a via de biossíntese de pirimidinas (orotato fosforibosil transferase e orotidina), gerando um acúmulo de ácido orótico. A hiperuricemia é um outro exemplo de aumento de metabólito, devido a deficiência na produção da enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase.

Enzimas são utilizadas como reagentes químicos em analisadores clínicos portáteis. Dosagem de colesterol, triacilgliceróis, glicose, podem ser realizados em poucos minutos, usando 10L de plasma. A química clínica moderna tem se beneficiado da união entre a química e a imunologia. Anticorpos específicos contra um antígeno protéico são acoplados a uma enzima indicadora, como peroxidase de raiz forte (horseradish), gerando um ensaio muito específico e sensível. Esse ensaio é conhecido como ELISA (enzyme-linked immunoadsorbent assay). Um exemplo de sua utilização é demonstrado por um ensaio para identificação dos antígenos protéicos da capa do vírus da imunodeficiência humana (HIV), que gera a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS).

A identificação de isoenzimas – enzimas que catalisam a mesma reação, mas migram diferentemente em um campo eletroforético – também tem sido usada para diagnóstico clínico. Exemplos de isoenzimas que têm ampla aplicação clínica:


1) Creatina fosfocinase – um dímero com dois tipos de subunidades, M (muscular) e B (cerebral). No músculo esquelético as duas subunidades são do tipo M. No cérebro as duas unidades são do tipo B. Somente no miocárdio se encontra a isoenzima contendo as duas subunidade M e B. Nos outros tecidos são encontradas quantidades variáveis de isoenzimas MM e BB. De acordo com a mobilidade para o ânodo, na eletroforese, essas isoenzimas são denominadas CPK1 (BB), CPK2 (MB) e CPK3 (MM).

2) Lactato desidrogenase, uma enzima tetramérica contendo apenas duas subunidades diferentes: H, para o coração e M, para o músculo esquelético. São identificadas cinco formas dessas isoenzimas: LDH1 (HHHH) e LDH2 (HHHM), encontradas no miocárdio e nos eritrócitos; LDH3 (HHMM), no cérebro e rim; LDH4 (HMMM) e por fim LDH5

(MMMM), encontradas no fígado e músculo esquelético.Estreptocinase, uma mistura de enzimas obtida de um streptococcus, é utilizada para

a remoção de coágulos sangüíneos, através da ativação do plasminogênio, a forma inativa da plasmina, no plasma. Uma outra aplicação de enzimas como agentes terapêuticos é a utilização da asparaginase. Algumas células leucêmicas parecem perder a capacidade de sintetizar asparagina. Dessa forma, a asparaginase inibe o crescimento de células tumorais, reduzindo os níveis plasmáticos de asparagina do hospedeiro.

Na indústria farmacêutica, enzimas ligadas a matrizes insolúveis (enzimas imobilizadas) são utilizadas como reatores químicos altamente específicos. Por exemplo, -galactosidase é utilizada para reduzir o conteúdo de lactose no leite.

FUNDAMENTO DA PRÁTICA

Nesta prática utilizaremos a enzima urease (uréia amidohidrolase, EC 3.5.1.5). Esta enzima apresenta uma alta especificidade para o substrato uréia (NH2CO-NH2),

transformando-o em amoníaco (NH4+) e carbonato (HCO3

-), em meio ácido:

NH2CO-NH2 + 2H2O + H+ =========> 2NH4+ + HCO3

-

A medida da atividade enzimática pode ser determinada medindo-se a diminuição na concentração de uréia ou o aumento de amoníaco ou carbonato formado.

Neste experimento utilizaremos a reação proposta por Berthelot para determinar os níveis de amoníaco formado. Em meio alcalino, amoníaco é transformado em amônia (NH3) e

reage com um derivado fenólico (salicilato) na presença de hipoclorito de sódio produzindo um composto de cor azul, o indofenol, cuja intensidade é proporcional à concentração de amônia. Nitroprussiato de sódio é utilizado como catalisador desta reação.


UREASE

PROCESSO

Identificar sete tubos de ensaio: Branco (B) e mais seis tubos enumerados de 1 a 6 e seguir a orientação abaixo:

TUBOS ÁGUA DEIONIZADA

SUBSTRATO (URÉIA)8,56% 85,6mg%

ENZIMA (UREASE)(268 U/ml)

B 0,4 mL - - 1,0 mL1 0,3 mL 0,1 mL - 1,0 mL2 0,2 mL 0,2 mL - 1,0 mL3 - 0,4 mL - 1,0 mL4 0,3 mL - 0,1 mL 1,0 mL5 0,2 mL - 0,2 mL 1,0 mL6 - - 0,4 mL 1,0 mL

1- Incubar todos os tubos em banho-maria (BM) a 37°C por 5 minutos (esta é a reação enzimática).

2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da solução oxidante (hidróxido de sódio 2,8 mM e hipoclorito de sódio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37°C por 5 minutos..3- Ler as absorções ópticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do

espectrofotômetro.

CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Construir um gráfico contendo no eixo das abcissas as concentrações do substrato [S] (0,1; 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 e 4,0 mM)* e no eixo das ordenadas a leitura das absorções (v).

Construir um novo gráfico contendo nos eixo das abscissas, 1/[S] e nas ordenadas, 1/v. Calcular KM e Vmáx.

OBSERVAÇÃO

A urease (268 U/ml) está dissolvida com tampão fosfato 10 mM, pH 6,9; salicilato de sódio 31,2 mM e nitroprussiato de sódio 1,68 mM.

* -Considerando que 0,1ml da solução de uréia, a 8,56%, contem 8,56 μg de uréia. -Considerando, ainda, que essa massa do substrato está dissolvida em um volume final

(volume dos reagentes) de 1,4ml. -Em 1000ml da preparação teremos 6,11mg de uréia, cuja massa molecular é 60,06 daltons. -6,11 mg/60,06mg por litro corresponde, aproximadamente, a uma concentração 0,1mM.


INIBIÇÃO DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS

OBJETIVOS

A realização desta prática permite ao aluno:1- Identificar o efeito de inibidores sobre a velocidade de uma reação enzimática.2- Conferir a importância do gráfico duplo recíproco, proposto por Lineweaver-Burk,

na identificação do tipo de inibidor de uma reação enzimática.

INTRODUÇÃO

Moléculas diferentes do substrato podem interagir com a enzima levando a uma redução de sua atividade. O estudo da inibição enzimática é de interesse, porque revela informações acerca do mecanismo de ação da enzima. Muitas substâncias tóxicas, incluindo drogas, expressam sua ação no organismo através da inibição de enzimas.

A inibição reversível é descrita pelo equilíbrio da interação enzima inibidor. Os processos de inibição enzimática podem ser classificados como competitivo e não competitivo, dependendo da forma como o inibidor age sobre a enzima. O inibidor competitivo, geralmente tem uma estrutura semelhante à do substrato e pode ligar-se ao sítio ativo da enzima, mas não pode ser transformado. Um inibidor não competitivo não se liga no sítio ativo da enzima, mas liga-se em outra região da molécula enzimática e impede que a enzima reconheça o substrato.

Para distinguir cineticamente, os dois processos de inibição enzimática, aplica-se o gráfico proposto por Lineweaver-Burk aos resultados obtidos experimentalmente. A enzima, numa concentração constante, reage com concentrações crescentes do substrato na ausência do inibidor e em um segundo experimento a enzima reage com o substrato em concentrações crescentes na presença do inibidor.


A realização desta prática é muito semelhante à anterior. Utilizaremos a enzima urease (uréia amidohidrolase, EC 3.5.1.5), em presença do substrato – uréia – mas utilizaremos cloreto de mercúrio (HgCl2) como inibidor da enzima.

PROCESSO

Identificar sete tubos de ensaio: Branco (B) e mais seis tubos enumerados de 1 a 6 e seguir a orientação abaixo:

TUBOS ÁGUA DEIONIZADA

INIBIDOR (HgCl2 0,05%)

SUBSTRATO (URÉIA)8,56mg% 85,6mg%

ENZIMA (UREASE)(268 U/ml)

B 0,4 mL 0,1mL - - 1,0 mL1 0,3 mL 0,1mL 0,1 mL - 1,0 mL2 0,2 mL 0,1mL 0,2 mL - 1,0 mL3 - 0,1mL 0,4 mL - 1,0 mL4 0,3 mL 0,1mL - 0,1 mL 1,0 mL5 0,2 mL 0,1mL - 0,2 mL 1,0 mL6 - 0,1mL - 0,4 mL 1,0 mL



2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da solução oxidante (hidróxido de sódio 2,8 mM e hipoclorito de sódio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37°C por 5 minutos..

3- Ler as absorções ópticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do espectrofotômetro.

CÁLCULO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Construir um gráfico contendo no eixo das abcissas as concentrações do substrato [S] (0,1; 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 e 4,0 mM) e no eixo das ordenadas a leitura das absorções (v), deste experimento e dos valores da prática anterior.

Construir um novo gráfico contendo nos eixo das abcissas 1/[S] e nas ordenadas 1/v. Calcular KM e Vmáx, com os valores obtidos nesta prática e na prática anterior.

Com os resultados, definir o tipo de inibição do cloreto de mercúrio sobre a urease.


CONSUMO DE GLICOSE POR CÉLULAS DE Sacharomyces cerevisiae

OBJETIVOS

1- Demonstrar o consumo de glicose pelas células.2- Determinar os níveis de glicose utilizando uma técnica espectrofotométrica.

INTRODUÇÃO

S. cerevisiae são organismos unicelulares, pertencentes à classe dos ascomicetes (asco= órgão produtor de esporos) e gênero Sacaromicete, utilizados em larga escala na produção de álcool e bebidas fermentadas e também na panificação. Essas leveduras estão entre os mais importantes fungos domesticados e metabolizam a glicose gerando etanol e dióxido de carbono. O pão assado adquire uma textura suave, devido a formação de bolhas de dióxido de carbono na massa.

Para este experimento poderíamos utilizar as hemácias. Nos mamíferos, a hemácia madura não contem núcleo, nem mitocôndrias, nem ribossomos e por isso não é capaz de desempenhar as mesmas atividades metabólicas das células nucleadas. No entanto, o ganho de energia na hemácia faz-se, fundamentalmente, pela glicólise. Essa energia é utilizada na manutenção das condições osmóticas, da forma discóide e do ferro no estado ferroso. A glicose desaparece rapidamente no sangue, quando deixado fora dos vasos sangüíneos e nessas condições há um aumento nos níveis de ácido láctico.

Na prática do laboratório clínico, o sangue colhido para a dosagem de glicose deve ter o plasma separado imediatamente das hemácias, ou ao sangue total acrescenta-se fluoreto que é um inibidor da enolase, enzima que catalisa a seguinte reação na via glicolítica:

2-fosfoglicerato fosfoenolpiruvato + H2O

Este experimento nos permite avaliar o consumo de glicose, in vitro, medindo a redução nos níveis de glicose com o tempo de incubação.

SUSPENSÃO DE CÉLULAS DE Sacharomyces cerevisiae

Dissolver 15g de células em 100 mL de solução fisiológica tamponada, pH 7,4 (PBS).

PROCESSO

Preparar três tubos de ensaio, identificados com os números 0, 5 e 10, respectivamente e proceder conforme esquema:1- Adicionar a cada tubo 0,5mL da suspensão de células + 0,2mL da solução de glicose a

10% + 1,0mL de PBS.2- Incubar os tubos 5 e 10 em banho-maria a 37o C, por 5 e 10 min, respectivamente.

OBS. Para utilizar o MÉTODO DE DOSAGEM QUÍMICA seguir o item 3. Para dosagem pelo MÉTODO DE DOSAGEM ENZIMÁTICA seguir a metodologia, adiante.

3- Transferir alíquotas de 0,2 mL (em duplicata) dos tubos 0, 5 e 10 para tubos de centrífuga, previamente identificados (0a e 0b, 5a e5b, 10a e 10b), contendo 1,8 mL de ácido tricloroacético (TCA), a 10%. Deixar os tubos em repouso por 10 min, agitando-os


esporadicamente e centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos. Transferir, por decantação, o sobrenadante para tubos limpos, previamente identificados (0a e 0b, etc), que será utilizado na dosagem dos níveis de glicose, pelo método de dosagem química.

MÉTODO PARA DOSAGEM DE GLICOSE

1 – Método de dosagem química

Fundamento - O grupamento amino da orto-toluidina reage com o grupamento aldeído da glicose, em solução de ácido acético glacial a quente e dá origem a um composto de cor verde, estável. A intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose na amostra e sua estabilidade depende do equilíbrio entre uma glicosilamina (-NH-CHOH-) e a base de Schiff (-N=CH-) correspondente.

Solução padrão de glicose - 100mg de glicose em 100 mL de solução. Para a dosagem diluir a solução padrão 1:10 com água destilada.

Dosagem de glicose - Identificar nove tubos (B, P1, P2, 0a, 0b, 5a, 5b, 10a e 10b) - Branco, Padrões e Testes.Transferir 1 mL de cada sobrenadante límpido para os respectivos tubos de ensaio previamente identificados.Adicionar a cada tubo:

TUBO SOLUÇÃO PADRÃO DILUÍDA

TESTES(0a, 0b, 5a, 5b,

10a e 10b)

ÁGUA DESTILADA

REAGENTE DA ORTO-TOLUIDINA

Padrões 1 mL - - 3,5 mLTestes - 1 mL - 3,5 mLBranco - - 1 mL 3,5 mL

Aquecer os tubos em banho-maria fervente por 10 minutos e resfriá-los em água corrente.

Ler as densidades ópticas (DO) da solução em cada tubo, no espectrofotômetro em 630 nm. Ajustar o zero do aparelho com o Branco.

Calcular a concentração de glicose em cada amostra e expressar os valores em mg%. Construir um gráfico das DO em função do tempo de incubação.

CONCLUSÕES:

2- Método de dosagem enzimática

Fundamento - Duas enzimas estão envolvidas neste processo: glicose oxidase, que age sobre a glicose e gera ácido glicônico e peróxido de hidrogênio. E peroxidase, que utiliza o peróxido de hidrogênio como agente oxidante para transformar 4-aminoantipirina e fenol em


antipirilquinonimina e água. Antipirilquinonimina é um composto colorido que absorve em 505 nm. A intensidade de cor é proporcional à quantidade de peróxido de hidrogênio gerado na primeira reação.

Dosagem de glicose - Identificar nove tubos (B, P1, P2, 0a, 0b, 5a, 5b, 10a e 10b) - Branco, Padrões e Testes. Transferir alíquotas de 0,05 mL para os respectivos tubos de ensaio previamente identificados:

TUBO SOLUÇÃO PADRÃO (100mg

%)

TESTES(0a, 0b, 5a, 5b,

10a e 10b)

ÁGUA DESTILADA

REAGENTE

Padrões 0,05 mL - - 2,5 mLTestes - 0,05 mL - 2,5 mLBranco - - 0,05 mL 2,5 mL

Misturar e incubar em banho-maria a 37°C durante 15 minutos.O nível de água do banho deve ser superior ao nível da mistura em cada tubo de

ensaio.Ler as densidades ópticas (DO) da solução em cada tubo, no espectrofotômetro em

505 nm. Ajustar o zero do aparelho com o Branco.Calcular a concentração de glicose em cada amostra e expressar os valores em mg%. Construir um gráfico das concentrações de glicose em função do tempo de incubação.

CONCLUSÕES:


DOSAGEM DE PERÓXIDOS DE LIPÍDEOS

OBJETIVOS

A realização desta prática permite ao aluno determinar os níveis de substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico em células de Sacharomyces cerevisiae e avaliar o grau da peroxidação dos lipídeos.

INTRODUÇÃO

A peroxidação de lipídeos é um processo complexo onde ácidos graxos insaturados e outros lipídeos são oxidados por ação dos radicais livres. Para entender a reatividade destas espécies químicas, devemos lembrar que os elétrons, nas moléculas, geralmente se reúnem em pares. Na molécula de água, por exemplo, o oxigênio se apresenta rodeado por quatro pares de elétrons; dois pares se ligam fracamente em uniões OH e dois pares não estão ligados:

Para descrever completamente um elétron em um átomo devemos considerar, além dos seus números quânticos n (principal), l (secundário) e ml, um quarto número quântico ms, chamado número quântico de spin; que está associado com a rotação do elétron em torno do seu próprio eixo e pode ter um dos dois valores possíveis: + ½ ou - ½ , dependendo da direção da rotação do elétron. Dois elétrons em um mesmo orbital com valores de ms + ½ ou - ½ são ditos emparelhados. Um par eletrônico é mais estável do que os elétrons isolados, uma vez que, aparentemente, dois elétrons com spins opostos têm seus campos magnéticos recíprocos anulados.

Radicais livres podem ser definidos como átomos, moléculas ou fragmento molecular com, pelo menos, um elétron desemparelhado. A presença do elétron desemparelhado, em geral, confere ao radical livre alta reatividade química e, ainda, certas propriedades como características paramagnéticas. Para restaurar sua estabilidade estas espécies químicas tendem a retirar um elétron de outra substância ou doar o seu elétron desemparelhado. Com isso podem gerar novos radicais livres, numa reação em cadeia. No organismo vivo a produção de radicais livres é permanente, mas esta produção está associada ao metabolismo celular do oxigênio e às reações de óxido-redução. Entre as fontes geradoras de radicais livres destacam-se:

A cadeia respiratória mitocondrial - A mitocôndria é considerada a “casa de força” da célula, aí se encontra um complexo sistema de transferência de elétrons, conhecido como Cadeia Transportadora de Elétrons (CTE). A função deste sistema é reduzir o oxigênio ao mesmo tempo em que gera energia, que é armazenada sob a forma de ATP. Embora os elétrons sejam transferidos aos pares, os citocromos integrantes da CTE só transferem um elétron de cada vez. Quando uma molécula de oxigênio recebe um elétron é transformada no ânion superóxido (O2

-.) - um radical livre. Cerca de 5% do ânion superóxido, gerado no processo de redução do oxigênio, pode ser liberado da CTE e, por dismutação, gera peróxido de hidrogênio (H2O2).

Os radicais livres derivados da redução do oxigênio são os produtos fisiológicos potencialmente mais perigosos, gerados a partir da respiração celular.


A fagocitose - Em estado de repouso os neutrófilos consomem pouco oxigênio. Em contato com partículas a serem fagocitadas, eles produzem uma invaginação de sua membrana, encerrando assim o material a destruir (fagossoma), isolando-o do citoplasma. Essa estimulação dos neutrófilos é acompanhada de uma aceleração no consumo de oxigênio (“choque respiratório”), com ativação de uma enzima de membrana - a NADPH-oxidase - que catalisa a redução do oxigênio, gerando o ânion superóxido, que por dismutação gera peróxido de hidrogênio.

Estes dois agentes oxidantes (O2-. e H2O2) participam da produção de espécies

químicas ativas, como o radical hidroxil (OH.) e na liberação de hipoclorito e de cloraminas, sob a influência de uma enzima leucocitária, a mieloperoxidase. Este conjunto de reagentes agressivos (ânion superóxido, peróxido de hidrogênio, hipoclorito e cloraminas) liberados nos fagossomas são responsáveis pela destruição do material fagocitado. Na ausência de NADPH-oxidase, a atividade fagocitária torna-se diminuída ou mesmo abolida.

As reações de desintoxicação - Os peroxissomos são organelas celulares que desempenham um papel importante na desintoxicação de numerosas moléculas. Uma variedade de substâncias tóxicas são absorvidas com freqüência através do trato gastrointestinal, ou são produzidas a partir do metabolismo celular. Estas substâncias podem sofrer modificações em sua estrutura química (o processo de desintoxicação) e em seguida devem ser excretadas, sobre tudo, pela urina.

Os mecanismos de desintoxicação utilizados no fígado são diversificados, envolvendo oxidação, redução, hidrólise, conjugação, ou uma combinação destes mecanismos. Em geral, a oxidação é o primeiro dos mecanismos utilizados, seguido às vezes de reação de conjugação.

A desintoxicação por oxidação, implica na hidroxilação, que é catalisada por um sistema “oxidase de função mista” presente nos peroxissomos. Este sistema é constituído de uma hidroxilase, citocromos P450, NADPH, ferredoxina e FAD. Neste sistema o citocromo P450

transfere um elétron, de cada vez, para o oxigênio molecular, o que favorece a produção de ânions superóxido e peróxido de hidrogênio. Este último é desdobrado a água e oxigênio pela catalase, presente nessas organelas.

A síntese de prostaglandinas - As prostaglandinas, como a prostaciclina e o tromboxano A2, têm sua origem no ácido araqüidônico, liberado dos fosfolipídeos integrantes de membrana, por ação da fosfolipase A2.

Os radicais hidroxil são gerados no processo de síntese das prostaglandinas, na fase de transformação do ácido araqüidônico a endoperóxidos, por ação da ciclooxigenase.

Estes radicais livres intervêm secundariamente sobre a cascata do ácido araqüidônico, inibindo a ciclooxigenase e promovendo a via metabólica pró-agregante do tromboxano A2

sobre a via anti-agregante e vasodilatadora da prostaciclina.

As radiações - Raios gama e raios-X são exemplos de radiações ionizantes. Quando uma molécula colide com essas radiações absorve energia e pode emitir elétrons com alto nível energético.

O material celular está fundamentalmente distribuído em uma fase aquosa. A transferência da energia para a molécula de água excita os elétrons constituintes e gera uma molécula de água excitada (com um excedente de energia, comparada com sua energia normal). A conseqüência mais provável deste evento é uma ionização, como segue:

(1) H2O H2O+ + e-

(2) H2O+ + H2O H2O+ + OH.


ambas as espécies (H2O+ e OH.) têm um elétron desemparelhado, são radicais livres e por isso são espécies extremamente reativas. Outras espécies reativas podem ser geradas.

O elétron da reação (1) - elétron hidratado - pode reagir com oxigênio presente na célula e gerar ânion superóxido. Admite-se que cerca de 10 -5 segundo é o tempo decorrido entre a ação inicial dos radicais sobre os constituintes em uma solução e a formação de produtos. Vale ressaltar, no entanto, que essas espécies reativas têm um tempo de ação muito curto. Elétrons produzidos na reação (1) perdem sua energia para as espécies químicas do meio, em uma escala de tempo da ordem de 10-13 a 10-11 segundo.

Quando uma molécula absorve um fóton de luz ultravioleta, cuja energia é inferior à sua energia de ionização, ela deverá se excitar. Se a energia armazenada for suficiente, pode haver ruptura de ligações e produção de radicais livres por diversos mecanismos.

Os tecidos mais suscetíveis ao efeito dessas radiações são a pele e sobretudo os olhos, devido à sua exposição direta e à intensidade de seu metabolismo. De forma geral, os radicais livres exercem vários efeitos citotóxicos, envolvendo, virtualmente todos os componentes celulares. São capazes de promover eventual destruição de estruturas e tecidos, causando doenças genéticas, genético ambientais e ambientais, a exemplo da arteriosclerose, hipertensão, câncer, osteoartrite, entre outras, além da liberação de uma variedade de produtos de degradação como cetonas, álcoois, aldeídos e ésteres, propagando-se pela circulação. As membranas biológicas de um modo geral, oferecem um rico meio para o ataque peroxidativo que interfere na integridade das células.

Malondialdeído (MDA), formado a partir da quebra de ácidos graxos poliinsaturados, é identificado como o principal produto da peroxidação de lipídeos e serve como índice determinante da extensão da reação peroxidativa. O MDA reage com o ácido tiobarbitúrico (TBA) produzindo um pigmento de cor avermelhada que absorve em comprimento de onda de 535 nm. O pigmento formado é resultado da condensação de 2 moles de TBA com 1 mol de MDA. Esta reação não é específica para quantificar MDA, uma vez que existem outras substâncias que reagem com o TBA (TBARS), mas vem sendo amplamente utilizada para avaliar o grau de peroxidação de lipídeos.

DOSAGEM DE TBARS

Método de Buege JA & Aust SD (Methods in Enzymology 52:302-310, 1978)

REAGENTE: Solução de TBA 0,375% em ácido tricloroacético (TCA) a 15%

PROCESSO:

Identificar quatro tubos de ensaio: 0, 5, 10 e 20. A cada tubo adicionar 1,0 mL de suspensão de células de S. cerevisiae. Incubar os tubos respectivos por 5, 10 e 20 minutos a 37o C e em seguida transferir o conteúdo de cada tubo para tubo de centrífuga contendo 1,0 mL de TCA a 30%. A suspensão do tubo 0 não será incubada a 37º C, mas deve ser transferida para tubo de centrífuga contendo 1,0 mL de TCA a 30%.Depois de transferir as amostras para tubos de centrífuga contendo TCA a 30% Deixa-las em repouso por um tempo mínimo de10 min, misturando esporadicamente. Centrifugar todos os tubos a 3000 rpm por 5 min e transferir o sobrenadante límpido para tubos previamente identificados: 0, 5, 10 e 20.Preparar mais dois tubos (Branco e Padrão). Ao Branco adicionar 1,0 mL de água destilada e ao Padrão, 0,1 mL da solução padrão de MDA (32,12nmol/mL) + 0,9 de água destilada.


Adicionar a todos os tubos 2,0 mL da solução reagente, agitar e levar ao banho fervente por 15 min.Esfriar os tubos em água corrente e fazer a leitura da absorção óptica em 535nm. Calcular a concentração (μM) de TBARS em cada experimento, considerando que:

Massa do padrão (3,212nmol) DOpadrãoMassa da amostra ( x nmol ) DOamostra0,9 ml de suspensão de S. cereviseae x nmol de TBARS

Lançar os resultados em um gráfico (concentração vs tempo) e comparar com os resultados obtidos no próximo experimento.OBS.: DO – Densidade óptica


EFEITO DA GLICOSE SOBRE A PEROXIDAÇÃO DE LIPÍDEOS

OBJETIVOS

1- Reconhecer o malondialdeído como produto da peroxidação dos lipídeos.2- Identificar o efeito da glicose sobre a peroxidação dos lipídeos.

INTRODUÇÃO

Malondialdeído (MDA) é um produto da peroxidação dos lipídeos nos diversos tecidos e está presente no plasma sangüíneo. Pesquisas têm mostrado que os níveis de MDA plasmático aumentam com a idade. Esse composto é muito reativo e tem grande afinidade por grupamentos amino, o que pode favorecer sua ligação com as proteínas da membrana das células, comprometendo sua perfeita função. Na prática anterior pudemos acompanhar a produção de peróxidos de lipídeos medindo os níveis de TBARS em células de S. cerevisiae submetidas ao estresse oxidativo. Nesta prática vamos avaliar os níveis de TBARS em células de S. cerevisiae com suprimento de glicose, como fonte de energia.

PROCESSO

Identificar quatro tubos de ensaio: 0, 5, 10 e 20. A cada tubo adicionar 0,9 mL de suspensão de células de S. cerevisiae + 0,1 mL da solução de glicose a 10%.Incubar os tubos respectivos por 5, 10 e 20 minutos a 37o C e em seguida transferir o conteúdo de cada tubo para tubo de centrífuga contendo 1,0 mL de TCA a 30%. A suspensão do tubo 0 não será incubada a 37º C, mas deve ser transferida para tubo de centrífuga contendo 1,0 mL de TCA a 10%.Depois de transferir as amostras para tubos de centrífuga contendo TCA a 10% Deixa-las em repouso por um tempo mínimo de10 min, misturando esporadicamente. Centrifugar todos os tubos a 3000 rpm por 5 min e transferir o sobrenadante límpido para tubos previamente identificados: 0, 5, 10 e 20.Preparar mais dois tubos (Branco e Padrão). Ao Branco adicionar 1,0 mL de água destilada e ao Padrão, 0,1 mL da solução padrão de MDA + 0,9 de água destilada.Adicionar a todos os tubos 2,0 mL da solução reagente, agitar e levar ao banho fervente por 15 min.Esfriar os tubos em água corrente e fazer a leitura da absorção óptica em 535nm. Calcular a concentração (μM) de TBARS em cada experimento, considerando que:

Massa do padrão (3,212nmol) DOpadrãoMassa da amostra ( x nmol ) DOamostra0,9 ml de suspensão de S. cereviseae x nmol de TBARS

Lançar os resultados em um gráfico (concentração vs tempo) e comparar com os resultados obtidos no experimento anterior.

CONCLUSÕES:


HIDRÓLISE DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS1- Identificar os aminoácidos como unidade fundamental das proteínas2- Acompanhar a hidrólise de proteínas por aquecimento em meio ácido.

INTRODUÇÃO

Todas as proteínas na natureza têm como unidade fundamental vinte -aminoácidos e são construídas através de ligações amida entre estes aminoácidos. Quando isolados das proteínas os aminoácidos apresentam características estruturais comuns, qual seja um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao carbono . O que distingue estes compostos quanto às suas características físicas, químicas e biológicas é o grupo R, lateral, que é único para cada aminoácido. É fundamental que se estabeleça métodos práticos usados na separação e identificação destes compostos, uma vez que a estrutura e funções biológicas de uma proteína depende do seu conteúdo em aminoácidos.

Quando proteínas são aquecidas em um meio aquoso, ácido ou básico, as ligações amida sofrem hidrólise liberando os aminoácidos constituintes, cuja identificação implica no conhecimento de suas propriedades físico-químicas. É importante relembrar que estas substâncias são anfotéricas, ou seja, podem agir como ácido de Brönsted (doadoras de prótons) ou como base de Brönsted (aceptoras de prótons) - reações 1 e 2.

H3N+CH(R)COOH <===> H3N+CH(R)COO- (Reação 1)I II

H3N+CH(R)COO- <===> H2NCH(R)COO- (Reação 2)II III

A forma zwiteriônica (II) é produzida pela dissociação do próton em I (Reação 1) e essa forma pode também sofrer dissociação de um próton e gerar o ânion III.

Cada reação iônica é definida por uma constante de ionização, Ka e um pKa (-log Ka). Todos os grupos -carboxílicos dos 20 aminoácidos têm valores de pKa próximos, mas diferentes (pKa 2 a 3), o mesmo se observa para os grupos -amino (pKa 9 a 10). O valor do pKa de um aminoácido representa o pH no qual as duas formas iônicas estão presentes em concentrações iguais. Alguns aminoácidos apresentam grupos ionizáveis na cadeia R lateral. Os grupos ácidos ou básicos extras, é lógico, aumentam a complexidade das reações ácido-base dos aminoácidos, o que garante maior resolução na análise destes compostos em uma mistura.

O primeiro passo na caracterização de uma proteína isolada e purificada é a determinação da composição de seus aminoácidos. Ela é hidrolisada e a mistura de aminoácidos livres é submetida à análise qualitativa e quantitativa. A hidrólise de uma proteína em meio ácido ou básico não leva a resultados ideais, uma vez que ambos os métodos tendem a destruir alguns aminoácidos. A hidrólise ácida destrói triptofano, causa alguma perda de serina e treonina e converte asparagina e glutamina em ácido aspártico e glutâmico, respectivamente. A hidrólise em meio básico leva à destruição de serina, treonina e


racemização de aminoácidos livres. A hidrólise ácida é mais utilizada, por ser um método que apresenta menor índice de destruição.

O processo de hidrólise consiste em dissolver a amostra de proteína em uma solução aquosa ácida (normalmente HCl 6N) e aquecer a solução a 110°C por 12 a 15 h, ou mantê-la à temperatura ambiente por uma semana. O intervalo de tempo necessário para a hidrólise depende da natureza dos resíduos de aminoácidos. Para separação e identificação dos aminoácidos, as técnicas mais versáteis, econômicas e convenientes são baseadas em métodos cromatográficos. A análise qualitativa dos aminoácidos pode ser feita por cromatografia em papel, em camada fina de sílica gel ou celulose, no entanto muitas técnicas mais sensíveis são utilizadas atualmente. Os aminoácidos livres são detectados na placa ou papel, em que foi desenvolvido o cromatograma, através da reação com ninhidrina. O aminoácido prolina desenvolve uma cor amarela, enquanto os demais aminoácidos desenvolvem uma cor violeta.


Em nosso experimento iremos acompanhar o processo de hidrólise protéica, medindo os níveis de aminoácidos liberados através da reação com hidróxido de sódio. As proteínas serão precipitadas com ácido tricloroacético (TCA) enquanto os aminoácidos livres, no sobrenadante, reagem com NaOH, formando um composto de coloração castanha, que absorve em 440 nm (Leigton et al. Journal Molecular Biology, 76:103-122, 1973).

PROCESSOA- Preparação da solução de ovoalbumina (solução A):

Dissolver 3 ml de clara de ovo com 17 ml de água destilada, em um Erlenmeyer e adicionar 5,0 ml de HCl concentrado. Misturar.

B- Hidrólise ácida com aquecimento:

1- Transferir alíquotas de 3 ml da solução de ovoalbumina para cinco tubos de ensaio. Levar os tubos ao banho-maria fervente e após 20, 30, 40 e 50 min, transferir o conteúdo dos tubos de ensaio (um a cada período de tempo) para tubos de centrífuga, previamente identificados (20, 30, 40 e 50), contendo 0,5 ml de TCA a 30%. Agitar e deixar em repouso por um mínimo de10 minutos.

2- Centrifugar o conteúdo de cada tubo, transferir 1,5 ml do sobrenadante para tubos de ensaio, previamente identificados, e ao tubo branco adicionar 1,5 ml de água destilada.

3- No final adicionar ao conteúdo de cada tubo de ensaio, 3 ml da solução de hidróxido de sódio 1 M.

4- Ler a densidade óptica (DO) em 440 nm, nos diversos tubos. Ajustando o zero do espectrofotômetro com o branco.

5- Construir um gráfico da DO em função do tempo.


DOSAGEM DE URÉIA

OBJETIVOS

1- Identificar a uréia como o principal produto de excreção de amônia.2- Reconhecer a enzima urease como um reagente para análises bioquímicas.3- Descrever os métodos mais comumente utilizados para a determinação de uréia.4- Descrever o fundamento do método utilizado neste experimento.5- Determinar os níveis de uréia no soro sangüíneo.6- Identificar as causas que geram o aumento nos níveis plasmáticos de uréia.

INTRODUÇÃO

A uréia é formada no fígado a partir de amônia produzida em todos os tecidos, como produto final do catabolismo protéico. A uréia representa a maior fração de substâncias orgânicas presentes na urina e cerca de 80% do nitrogênio não protéico excretado na urina, em condições normais.

Existem vários métodos utilizados na determinação de uréia. Entre eles destacamos:a) A utilização de xantidrol em métodos gravimétricos, colorimétricos, oxidimétricos.b) A determinação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl.c) Determinação colorimétrica utilizando reagentes como diacetil-monoxima, dimetil-

glioxima ou p-dimetil-amino-benzaldeído.d) Determinação enzimática utilizando urease (uréia amidohidrolase, EC 3.5.1.5). A

hidrólise enzimática da uréia gera amônia (NH3) e bióxido de carbono (CO2). Este pode ser dosado por gasometria, enquanto a amônia pode ser quantificada: i) por titulometria, com o reagente de Nessler; ii) enzimaticamente, com glutamato desidrogenase; iii) através da reação de Berthelot.

FUNDAMENTO DA PRÁTICAUtilizaremos a reação de Berthelot para quantificar a amônia formada por ação da

urease sobre a uréia, presente no soro sangüíneo. Cada molécula de amônia reage com duas moléculas do derivado fenólico (salicilato) na presença de hipoclorito de sódio, em meio alcalino, para formar indofenol, composto de cor azul. A intensidade de cor da reação é proporcional à concentração de amônia.

PROCESSOEm um tubo de ensaio diluir 0,1 mL de soro com 0,9 mL de solução salina. Marcar cinco tubos de ensaio: Branco, Padrão(2) e Teste(2) e adicionar a cada um:

TUBOS URÉIA (70mg%) SORO ENZIMA (UREASE)(268 U/ml)

Branco - - 1,0 mLPadrão (2) 0,05 mL - 1,0 mLTeste (2) - 0,05 mL 1,0 mL


2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da solução oxidante (hidróxido de sódio 2,8 mM e hipoclorito de sódio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37°C por 5 minutos..


3- Ler as absorções ópticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do espectrofotômetro.

CÁLCULO

Podemos calcular a concentração de uréia no soro - expressa em mg% - através da fórmula:

Concentração de uréia (mg%) = LT / LP x 70 LT - Leitura do TesteLP - Leitura do Padrão

CONSIDERAÇÕES SOBRE O MÉTODO

1- O método enzimático para dosagem de uréia apresenta um alto índice de confiança, uma vez que a urease reage especificamente com a uréia.

2- A reação de Berthelot é um método de dosagem de amônia sensível e acurado.3- A amostra de soro ou plasma deve ser utilizada tão logo tenha sido coletada. Para

obtenção do plasma não devem ser utilizados anticoagulantes contendo sais de amônia, por motivos óbvios e fluoretos, porque inibem a urease.

IMPORTÂNCIA CLÍNICA

Os níveis plasmáticos de uréia são utilizados em conjunto com os níveis de creatinina como auxiliar no diagnóstico diferencial de hiperuremia pré-renal e pós-renal.

Entre as causas pré-renais responsáveis pelo aumento de uréia no plasma estão a descompensação cardíaca, desidratação, aumento no catabolismo de proteínas. Entre as causas renais destacam-se nefrite crônica, necrose tubular, glomerulonefrite aguda ou crônica. As causas pós-renais são qualquer tipo de obstrução do trato urinário (cálculos, dilatação da glândula prostática, tumores).

Os níveis de uréia se encontram reduzidos na insuficiência hepática aguda, com lesões muito extensas. No último trimestre da gravidez também se observa uma diminuição nos níveis de uréia.

Valores normais: 10 a 50 mg de uréia por 100 mL de plasma.


ESTUDOS DIRIGIDOS

Cinética de Reações Catalisadas por Enzimas

01- Qual a importância das enzimas nos organismos vivos?02- Como é possível avaliar a concentração de uma enzima em tecido ou fluido biológico?03- Explique porque a medida da atividade enzimática não corresponde necessariamente à

concentração real da enzima.04- Qual a importância dos parâmetros Vmáx e KM, na caracterização de uma enzima?05- Dê exemplos da aplicação clínica das enzimas.06- Explique como foi possível acompanhar a velocidade da reação enzimática, na prática.07- Com os dados obtidos na prática sobre enzimas, demonstre como cresce a velocidade de

uma reação enzimática com o aumento da concentração do substrato e calcule KM e Vmáx

da enzima.

Inibição de Reações Catalisadas por Enzimas

01- Qual a importância de analisarmos o efeito de inibidores sobre reações enzimáticas?02- O que distingue o efeito de um inibidor competitivo daquele não competitivo?03- Como é possível distinguir, experimentalmente, um inibidor competitivo de um não

competitivo?04- Com os dados obtidos na prática, demonstre o tipo de inibição em que se enquadra o

cloreto de mercúrio, em relação à urease.

Consumo De Glicose por células de Sacharomyces cerevisiae

05- Explique porque a via glicolítica é importante para as hemácias.02- Porque é importante separar o plasma dos elementos figurados do sangue, o mais rápido

possível, quando se pretende dosar os níveis plasmáticos de glicose?03- Qual a opção, quando não há condições de separar o plasma dos elementos figurados de

imediato?06- Explique como foi possível acompanhar o consumo de glicose pelas células de

Sacharomyces cerevisiae.07- Com os resultados obtidos na prática calcule a concentração de glicose, em mg%,

construa um gráfico das concentrações em função do tempo de incubação e explique porque os resultados foram diferentes.

Dosagem de Peróxidos de Lipídeos

01- O que são radicais livres e qual a ação dessas espécies químicas no organismo vivo?02- Fale sobre três fontes geradoras de radicais livres no organismo vivo.


03- Como explicar a ação danosa da luz ultravioleta sobre a pele?04- Explique como foi possível determinar os níveis de peróxidos de lipídeos no plasma.05- Com os resultados obtidos na prática calcule a concentração de peróxidos de lipídeos

plasmáticos, referidos como níveis de TBARS em M e construa um gráfico da concentração em função do tempo de incubação das células de S. cerevisiae.

Efeito da Glicose Sobre a Peroxidação de Lipídeos

01- Como é gerado, no organismo vivo, o malondialdeído (MDA)?02- Por que um aumento de MDA no plasma pode comprometer a atividade biológica das

proteínas?03- Qual o efeito prático na determinação do efeito da glicose sobre a peroxidação de

lipídeos?04- Com os resultados obtidos nesta prática e aqueles obtidos na prática anterior demonstre,

graficamente, o efeito da glicose sobre os níveis de TBARS medidos nas células.

Hidrólise de Proteínas

01- Porque é importante conhecermos a seqüência dos aminoácidos constituintes de uma proteína?

02- O que acontece com as proteínas quando são aquecidas em um meio aquoso, ácido ou básico?

03- Conceitue pKa e fale sobre a importância desta constante na análise dos aminoácidos em uma mistura.

04- Explique como foi possível acompanhar o processo de hidrólise protéica.05- Com os resultados obtidos na prática demonstre, através de um gráfico, o aumento na

concentração dos aminoácidos livres com o tempo.

Dosagem de Uréia no Soro Sangüíneo

01- Fale sobre a origem da uréia no organismo e sobre sua importância.02- Relacione três métodos utilizados na dosagem de uréia, destacando o mais preciso entre

eles.03- Qual o fundamento da reação de Berthelot e qual a sua aplicação?04- Com os dados obtidos na prática calcule a concentração de uréia e comente o resultado.05- Fale sobre a importância clínica da dosagem plasmática de uréia.


PAINEL DIRIGIDO

INTEGRAÇÃO E REGULAÇÃO METABÓLICA

Metabolismo é o conjunto total das transformações das moléculas dos nutrientes orgânicos nas células vivas. Através dessas transformações, catalisadas por enzimas, é extraída a energia química das moléculas dos nutrientes, que é utilizada na realização do trabalho celular.

Os organismos vivos podem ser divididos em dois grandes grupos: Os seres autotróficos (que se alimentam por si mesmos) podem utilizar o dióxido de carbono da atmosfera como única fonte de carbono e produzir todas as biomoléculas essenciais à vida. Os seres heterótrofos (que se alimentam às custas de outros) necessitam obter os átomos de carbono do meio ambiente na forma de moléculas orgânicas relativamente complexas.

Além das fontes de carbono, oxigênio e energia, todos os organismos vivos necessitam de uma fonte de nitrogênio, necessário para a síntese dos compostos nitrogenados, como os aminoácidos, as bases púricas e pirimídicas, etc.

O metabolismo pode ser entendido, ainda, como o conjunto das diversas vias metabólicas, resultado da ação de seqüências multienzimáticas que, individualmente, catalisam os passos sucessivos dessas vias. As seqüências específicas de intermediários envolvidos nas vias do metabolismo celular é designado freqüentemente como metabolismo intermediário. A transformação dos nutrientes, como carboidratos, proteínas e lipídeos; em estruturas mais simples, como CO2 e H2O é chamada de catabolismo. Este é um processo de degradação dos nutrientes, acompanhado pela liberação da energia livre inerente à estrutura complexa das moléculas orgânicas. As vias catabólicas geram energia e convergem para poucos produtos finais.

O processo de síntese de macromoléculas, como proteínas e ácidos nucleicos, a partir de pequenas moléculas precursoras (as unidades fundamentais) é conhecido como anabolismo ou biossíntese. As vias anabólicas envolvem consumo de energia e divergem para a formação de muitos produtos diferentes.

Figura 1 – Produção de energia no catabolismo e sua utilização no anabolismo celular


A Figura 1 mostra que há, na célula, um ciclo energético em que o ATP serve como elo de transporte de energia química, favorecendo uma união entre o catabolismo e o anabolismo. Um outro elo importante entre estes dois processos metabólicos é o NADPH, que transporta energia na forma de força redutora. Com isso é possível entender que a estratégia do metabolismo é formar ATP, poder redutor e unidades fundamentais para os processos de biossíntese.

No metabolismo celular existe um intrincado sistema de regulação, de tal forma que a liberação de energia nos processos catabólicos é controlada pelas necessidades celulares de energia na forma de ATP e de NADPH, e não pela simples disponibilidade dos nutrientes.

A regulação do metabolismo ocorre de várias formas:

1 – Compartimentação – A célula está dividida em compartimentos, separados uns dos outros por membranas. Alguns processos metabólicos como a glicólise, a via pentose fosfato, a síntese dos ácidos graxos ocorrem no citossol. Outros processos ocorrem na mitocôndria, como acontece com oxidação dos ácidos graxos, as reações do ciclo do ácido cítrico e a fosforilação oxidativa. Existem ainda aqueles processos que dependem da interação de reações que ocorrem em ambos os compartimentos, como a gliconeogênese, a síntese de uréia. Com isso a utilização de um determinado nutriente pela célula vai depender do compartimento em que essa molécula se encontra. A separação entre as vias de síntese e as vias de degradação é de fundamental importância para a regulação do metabolismo.

2 – Disponibilidade de substrato – Com freqüência, a concentração do substrato comanda direta ou indiretamente a velocidade de determinados processos. Embora muitas vezes seja ignorada a importância do suprimento de substrato como um fator de regulação do metabolismo, a concentração de ácidos graxos do sangue que entra no fígado é um fator determinante da velocidade da cetogênese. Gordura é sintetizada em excesso quando ocorre o consumo excessivo de substratos que contribuem para a lipogênese. Por outro lado, a ingestão deficiente de substratos glicogênicos (principalmente alanina) podem gerar hipoglicemia na gravidez ou no jejum prolongado.

3 – Efetores alostéricos – A primeira reação essencialmente irreversível em uma via metabólica é quase sempre fortemente regulada. As enzimas que catalisam estas reações são reguladas alostericamente. A quantidade e a atividade dessas enzimas vão determinar o fluxo de moléculas na maioria das vias metabólicas. Na via glicolítica, frutose 2,6-bisfostato estimula a fosfofrutocinase e inibe a frutose 1,6-bisfosfatase, dessa forma estimula a glicólise ao mesmo tempo em que inibe a gliconeogênese. Níveis elevados de ADP estimulam a atividade da isocitrato desidrogenase, no ciclo do ácido cítrico. O citrato ativa a acetil CoA carboxilase, estimulando a síntese de malonil CoA, na via de síntese de ácidos graxos. O aumento nos níveis de malonil CoA inibe a carnitina aciltransferase I, interrompendo a oxidação de ácidos graxos.

4 – Modificação covalente – Algumas enzimas quando são fosforiladas mudam sua conformação e sua atividade. A glicogênio fosforilase, por exemplo, quando fosforilada tem a sua atividade catalítica aumentada, enquanto a glicogênio sintase fosforilada tem a sua atividade diminuída. Essas modificações covalentes são catalisadas por enzimas específicas. Entre as enzimas que sofrem regulação pela fosforilação reversível, podemos citar ainda: piruvato cinase, lipase sensível a hormônio, fenilalanina hidroxilase, frutose 2,6-bisfosfatase.

5 – Níveis de enzimas – A mudança nos níveis enzimáticos é um mecanismo de regulação que envolve mudanças da velocidade de síntese ou de degradação de enzimas chaves. Entre essas enzimas está a glicocinase, fosfrutocinase, piruvato cinase, glicose 6-fosfatase, frutose 1,6-bisfosfatase.


6 – Especialização metabólica dos órgãos – A existência de órgãos com diferentes características, afeta consideravelmente a regulação do metabolismo. Nem todas as principais vias metabólicas operam em todos os tecidos em um determinado momento.

Estas formas de regulação do metabolismo evidenciam o papel preponderante das enzimas. Mas vale ressaltar a relevância dos hormônios, como moduladores da velocidade de uma grande variedade de reações bioquímicas e vias metabólicas.

A Figura 2 apresenta um esquema relacionando às principais vias metabólicas e o local onde elas ocorrem na célula. Os fatores que dirigem o fluxo das moléculas no metabolismo podem ser melhor compreendidos pelo exame de três importantes junções metabólicas: glicose-6-fosfato, piruvato e acetil CoA. Cada uma dessas moléculas têm diversos destinos mas estão interrelacionadas:

A Glicose-6-fosfato pode ser armazenada como glicogênio, degradada a piruvato, gerando ATP, ou transformada em ribose 5-fosfato, para síntese de nucleotídeos, com a produção concomitante de NADPH. Por outro lado, glicose 6-fosfato pode ser formada pela mobilização do glicogênio ou pode ser sintetizada a partir de piruvato e aminoácidos glicogênicos pela via da gliconeogênese.

O Piruvato é primariamente derivado da glicose 6-fosfato, alanina e lactato. A fácil redução do piruvato, catalisada pela lactato desidrogenase, serve para regenerar NAD+, permitindo que a glicólise prossiga temporariamente em condições anaeróbicas. O lactato acumulado nos músculos é transferido para o fígado e sofre oxidação. Uma outra reação reversível no citossol é a reação de transaminação do piruvato gerando alanina, o que garante um elo de ligação entre o metabolismo de aminoácidos e de carboidratos. Além da alanina, outros aminoácidos podem ser convertidos em piruvato. Oxaloacetato, produto da carboxilação do piruvato, pode ser transformado em fosfoenolpiruvato e, por isso, permite que a glicose seja sintetizada a partir de piruvato.

Acetil CoA é produzido em maior quantidade pela descarboxilação oxidativa do piruvato e pela -oxidação dos ácidos graxos. Esse composto pode ser totalmente oxidado a CO2 e H2O, através das reações do ciclo do ácido cítrico e cadeia transportadora de elétrons,

Figura 2 – Uma visão esquemática da compartimentação das principais vias metabólicas


ou pode gerar 3-hidroxi-3-metil glutaril CoA, precursor para a via de síntese do colesterol como também dos corpos cetônicos. Um outro destino do acetil CoA é a sua utilização para a síntese de ácidos graxos. O acetil CoA serve como elo de integração entre o metabolismo dos carboidratos, dos lipídeos e das proteínas e a integração destas vias metabólicas com o ciclo do ácido cítrico.

Integração Metabólica entre os Diversos Tecidos

A integração das diversas funções dos órgãos é um processo muito complexo, uma vez que os padrões metabólicos de cérebro, músculo, tecido adiposo, trato digestivo e fígado são muito diferentes. Para um perfeito entendimento destas inter-relações há necessidade, além da abordagem bioquímica, de uma abordagem fisiológica. Neste texto abordaremos somente alguns aspectos bioquímicos significativos.

Tabela 1 – Reserva energética em um homem adulto (~70kg)Energia disponível (kcal)

ÓRGÃO Glicogênioou glicose

Triacilgliceróis ProteínasMobilizáveis*

Sangue 60 45 0Fígado 400 450 400Cérebro 8 0 0Músculo 1.200 450 24.000Tecido adiposo 80 135.000 40*Embora proteína não constitua material de reserva, na inanição podem ser consumidos 50% do seu total.

A distribuição das reservas energéticas nos diversos tecidos (Tabela 1) mostra como esses tecidos diferem no uso dos alimentos para satisfazer as suas necessidades energéticas:

Cérebro – Não tem reservas energéticas e, por isso, necessita de um suprimento contínuo de glicose. Ele consome cerca de 120 g diariamente, o que representa cerca de 60% do consumo de glicose pelo organismo inteiro em repouso. Durante a inanição, o cérebro utiliza os corpos cetônicos (acetoacetato e -hidroxibutirato), gerados pelo fígado, como fonte de energia, substituindo parcialmente a glicose. Essa mudança no uso de combustível de glicose para corpos cetônicos tem por objetivo minimizar a degradação de proteínas durante a inanição. Os ácidos graxos não servem como alimento para o cérebro, por não atravessarem a barreira hematoencefálica, mas os corpos cetônicos, derivados dos ácidos graxos, podem ser utilizados como fonte de energia pelo cérebro.

Músculo – Difere do cérebro por ter grande reserva de glicogênio e além de glicose utiliza ácidos graxos e corpos cetônicos como fontes de energia. O músculo, como o cérebro, não tem a enzima glicose-6-fosfatase, por isso não pode exportar glicose, que é seu alimento preferido para surtos de atividade. A velocidade da glicólise no músculo esquelético em contração ativa, excede aquela do ciclo do ácido cítrico. Muito do piruvato formado nesse processo é reduzido a lactato, que flui para o fígado onde é transformado em glicose. A alanina, como o lactato, podem ser transformada em glicose pelo fígado. No músculo em repouso os ácidos graxos são a principal fonte de energia, enquanto os corpos cetônicos podem também servir de alimento para o músculo cardíaco.

Tecido adiposo – Tem como função armazenar triacilgliceróis – produto da esterificação dos ácido graxos, sintetizados no fígado, com glicerol. O glicerol 3-fosfato, intermediário nessa reação de esterificação, é um produto da degradação da glicose na via glicolítica. Como os adipócitos não podem fosforilar o glicerol, necessitam de glicose para a


síntese de triacilgliceróis. As lipases do tecido adiposo são enzimas envolvidas com a liberação da maior parte de energia armazenada. A lipase que remove o primeiro ácido graxo de um triacilglicerol é sensível a vários hormônios circulantes (Figura 3). O controle da hidrólise de triacilgliceróis deve ser balanceado com o processo de síntese destes compostos, para assegurar um armazenamento de energia adequado e evitar a obesidade. Os níveis de glicerol 3-fostato, produzidos a partir de glicose, nos adipócitos desempenham um papel importante sobre destino dos ácido graxos. Níveis elevados de glicerol 3-fostato estimulam a esterificação, enquanto baixos níveis deste composto nos adipócitos favorecem a liberação dos ácidos graxos para a corrente sangüínea.

Fígado - Suas atividades metabólicas são essenciais para o provimento de material energético para o cérebro, músculo e outros órgãos periféricos. A maioria dos compostos absorvidos pelos intestinos passa através do fígado, o que permite que ele regule o nível de muitos destes compostos no sangue. O fígado pode captar grandes quantidades de glicose e convertê-las em glicogênio, como pode liberar glicose para o sangue a partir das reservas de glicogênio ou através da gliconeogênese. Lactato e alanina, a partir dos músculos e glicerol, do tecido adiposo, bem como os aminoácidos glicogênicos, são os principais precursores de glicose na gliconeogênese. Assim como o fígado regula o metabolismo dos carboidratos, também desempenha papel central na regulação do metabolismo dos lipídeos. As lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) são sintetizadas no fígado e transportam os ácidos graxos para o tecido adiposo para a síntese de triacilgliceróis. E é o fígado que, no jejum, transforma os ácidos graxos em corpos cetônicos. Malonil-CoA, precursor para a síntese de ácidos graxos, inibe a enzima carnitina aciltransferase I, envolvida com o transporte de ácidos graxos para a mitocôndria. Dessa forma, quando os níveis de malonil CoA estão altos a síntese de ácidos graxos é favorecida e a -oxidação, inibida. Quando os alimentos são escassos, os níveis de malonil CoA baixam e os ácidos graxos liberados do tecido adiposo são transformados em corpos cetônicos.

Figura 3 – Mobilização de ácidos graxos dos adipócitos

induzida por hormônio. PKA – Proteína cinase, MAG, DAG, TAG – Mono, di e triacilglicerol


Entre os hormônios envolvidos com a integração metabólica, insulina, glucagon epinefrina e norepinefrina são de particular importância no armazenamento e na mobilização de alimentos:

Insulina – É secretada pelas células do pâncreas estimulada pela presença de glicose e pelo sistema nervoso parassimpático. Esse hormônio atua nas cascatas de proteínas cinase. Estimula a síntese de glicogênio no músculo e no fígado. Estimula a glicólise hepática, favorecendo a síntese de ácidos graxos. Como já foi discutido, o aumento de ácidos graxos e glicose no tecido adiposo estimula a síntese e armazenamento de triacilglicerol. A insulina também promove a captação de aminoácidos ramificados (valina, leucina e isoleucina) pelo músculo e apresenta um efeito estimulador geral sobre a síntese proteica e inibe a degradação intracelular de proteínas.

Glucagon – É secretado pelas células do pâncreas em resposta aos baixos níveis de glicose no sangue. O glucagon inibe a síntese de glicogênio e estimula a glicogenólise, porque dispara a cascata de cAMP. Além disso estimula a gliconeogênese e inibe a glicólise por reduzir os níveis de frutose 2,6-bisfosfato. O aumento de cAMP nos adipócitos ativa a lipase que mobiliza os triacilgliceróis.

Epinefrina e norepinefrina – São secretadas pela medula adrenal e terminações nervosas simpáticas em resposta ao baixo nível de glicose circulante. Têm efeito semelhante àquele do glucagon por disparar a cascata de cAMP. Esses hormônios diferem do glucagon

Figura 4 – Integração do metabolismo entre os principais tecidos no estado bem alimentado


porque seu efeito glicogenolítico é mais acentuado no músculo do que no fígado. Na presença desses hormônios a captação de glicose pelos músculos é inibida e os ácidos graxos, liberados do tecido adiposo, são utilizados como fonte de energia. A epinefrina também estimula a secreção de glucagon e inibe a secreção de insulina. Assim, as catecolaminas aumentam a liberação de glicose hepática no sangue e diminuem a utilização de glicose pelo músculo.

A Figura 4 mostra um panorama da integração metabólica entre diversos tecidos. O transporte dos diversos compostos entre os órgãos é geralmente assumida pelo sangue. Os lipídeos, a princípio constituintes dos quilomícrons, são removidos do intestino pelo sistema linfático, enquanto glicose passa das células epteliais intestinais para o fígado através da veia porta. Ainda no intestino ocorre o metabolismo parcial dos aminoácidos, antes de serem liberados no sistema porta.

Adaptações Metabólicas no Jejum Prolongado

A energia necessária para um período de 24 horas varia de aproximadamente 1.600 kcal no estado basal a 6.000 kcal, dependendo do grau de atividade. Considerando os dados da Tabela 1, as reservas energéticas em um indivíduo com peso em torno de 70 kg são suficientes para satisfazer as necessidades calóricas na inanição por cerca de três meses. Mas as reservas de glicose se esgotam em apenas um dia. Mesmo assim, o nível de glicose circulante é mantido acima de 40 mg/dl. O cérebro não suporta níveis mais baixos, mesmo por períodos curtos. Além disso existem tecidos que só utilizam glicose como fonte de energia (Tabela 2). No entanto, os precursores de glicose não se encontram em grande quantidade. A maior parte da energia está armazenada nos ácidos graxos dos triacilgliceróis, mas esses compostos não podem ser convertidos em glicose, porque o acetil CoA não pode ser convertido em piruvato. O glicerol, que pode ser utilizado como precursor da glicose, é liberado em pequenas quantidades dos triacilgliceróis. Resta uma única fonte de precursores da glicose, os aminoácidos derivados da degradação proteica. Mas como o músculo é a maior fonte de proteínas e tem papel fundamental na estrutura do organismo, precisa ser preservado. Como é preciso prover os níveis de glicose acima de 40 mg/dl e preservar as proteínas do músculo, os ácido graxos e corpos cetônicos passam a serem utilizados como combustível.

Tabela 2 – Combustíveis Usados pelos Diversos TecidosTECIDOS GLICOSE A. GRAXOS C. CETÔNICOSEritrócitos + - -Leucócitos + - -Medula renal + - -Córtex renal + + +Cérebro + - +Músculo esquelético +(exercício intenso) +(repouso) +Músculo cardíaco + + +Retina + - -Fígado + + -Mucosa intestinal + - -

As alterações metabólicas durante o primeiro dia de jejum são como aquelas após o jejum de uma noite. Com a redução nos níveis de carboidratos, aumenta a secreção de glucagon, estimulando a mobilização de triacilgliceróis do tecido adiposo e a gliconeogênese pelo fígado. A captação de glicose pelo músculo é reduzida com os baixos níveis de insulina circulante, enquanto os ácidos graxos entram livremente e a -oxidação destes compostos no


músculo geram aumento na concentração de acetil CoA e de citrato, inibindo a via glicolítica e impedindo a conversão de piruvato em acetil CoA.. Após várias semanas de inanição, os corpos cetônicos tornam-se o principal combustível para o cérebro, reduzindo a utilização de glicose e garantindo a preservação das proteínas do músculo (Tabela 3).

Tabela 3 – Regulação do Metabolismo no Jejum Prolongado

FONTES DE ENERGIAQUANTIDADE GERADA OU CONSUMIDA EM 24

HORAS (GRAMAS)3o DIA 40o DIA

Consumo pelo cérebroGlicose 100 40Corpos cetônicos 50 100

Utilização de glicose por outros tecidos

50 40

Liberação pelo fígadoGlicose 150 80Corpos cetônicos 150 150

Lipólise no tecido adiposo 180 180Degradação da proteína muscular

75 20

Adaptações Metabólicas no Exercício

A conversão da energia química em trabalho mecânico pelo músculo implica na necessidade instantânea do consumo de glicose. No exercício anaeróbico (como corrida de velocidade ou levantamento de peso) o músculo depende de suas reservas de glicogênio e creatina fosfato, para a produção de ATP. A creatina fosfato serve como fonte de fosfato de alta energia para síntese de ATP, até que a glicogenólise e a glicólise sejam estimuladas. A via glicolítica torna-se a fonte primária de ATP para o músculo, devido a falta de oxigênio. Durante uma corrida de velocidade (100 m em ~10 s) o nível de ATP do músculo cai de 5,2 mM para 3,7 mM, enquanto o nível de creatina fosfato cai de 9,1 mM para 2,6 mM. Com a glicólise anaeróbica aumenta o nível sangüíneo de lactato de 1,6 mM para 8,3 mM, favorecendo o abaixamento do pH sangüíneo de 7,42 para 7,24. Por isso essa marcha não pode ser mantida em uma corrida de 1000 m em ~132 s, porque as reservas de creatina fosfato seriam consumidas em poucos segundos e a glicólise seria interrompida por falta de NAD+; sem falar na quantidade de ácido formado. Parte do ATP consumido será gerado pela fosforilação oxidativa.

A corrida de uma maratona (42.200 m em ~2 h) implica na utilização de ácidos graxos para a produção de ATP, uma vez que os depósitos de glicogênio são insuficientes para prover os 150 mol de ATP necessários para essa competição. No entanto, se a oxidação dos ácidos graxos fossem a única fonte de ATP a maratona deveria durar 6 h, uma vez que essa via metabólica é muito mais lenta do que a oxidação do glicogênio. Os melhores corredores consomem quantidades aproximadamente iguais de glicogênio e ácidos graxos, de tal forma que a glicose seja poupada para o final da maratona.

A taxa de oxidação dos ácidos graxos de cadeia longa aumenta de cinco a oito vezes, quando humanos são submetidos a um esforço físico que exige menos de 85% do consumo de oxigênio. Dois fatores determinam a utilização de ácidos graxos: A duração e a intensidade do exercício. Dessa forma, exercício intenso por 5 a 10 min, implica na utilização de ATP gerado a partir da oxidação de carboidratos. Em um esforço com menor intensidade por um período de 30 min ou mais, gera um aumento na taxa de oxidação de ácidos graxos. Essa taxa é


máxima, quando o esforço físico requer cerca de 60% do consumo máximo de oxigênio. Indivíduos bem treinados utilizam um percentual maior de ácidos graxos como fonte de energia, do que indivíduos sedentários, não treinados.

Transtornos do Metabolismo no Diabetes

No diabetes mellitus há uma superprodução de glicose pelo fígado que é subutilizada pelos outros órgãos. Em um indivíduo não tratado, o nível sangüíneo de insulina é muito baixo e o de glucagon é muito alto em relação às necessidades do paciente. A alta relação glucagon/insulina no diabetes estimula a glicogenólise e gliconeogênese e inibe a glicólise, contribuindo para o aumento dos níveis de glicose circulante. A glicose é excretada na urina junto com a água, o que leva o diabético na fase aguda da doença sentir fome e sede.

A utilização reduzida de carboidratos no diabético leva a um estímulo na quebra de lipídeos e proteínas. A oxidação de ácidos graxos promove a síntese de glicose através do aumento da concentração de Acetil-CoA, um efetor alostérico positivo da piruvato carboxilase. O aumento nos níveis de Acetil-CoA estimula a produção de corpos cetônicos, que podem suplantar a capacidade dos rins de manter o equilíbrio ácido-base e levar o diabético não tratado a entrar em coma, por causa do abaixamento do pH sangüíneo e da desidratação.

São conhecidas duas formas do diabetes mellitus: O tipo I, ou insulino-dependente, que em geral começa antes dos 20 anos de idade. Devido à produção defeituosa de insulina pelas células do pâncreas, os níveis sangüíneos de insulina não aumentam em resposta aos níveis elevados de glicose no sangue. No tipo II, ou não insulino-dependente, a insulina não está ausente. Níveis elevados de insulina podem ser observados nesse tipo de diabetes, mas há resistência dos tecidos à ação do hormônio. O pâncreas do paciente diabético não insulino-dependente não produz insulina suficiente para superar a resistência à insulina, induzida por sua obesidade. Embora não esteja bem entendido o fenômeno da resistência à insulina, a maioria dos indivíduos com diabetes do tipo II são obesos.

Metabolismo do Etanol e a Relação NAD+/NADH

Etanol é uma substância hidrossolúvel e de baixo peso molecular. Por isso é rapidamente absorvido, especialmente quando o estômago se encontra vazio. A concentração alcoólica no sangue pode atingir, em média, cerca de 0,1% uma hora após a ingestão de um copo de álcool a 50%, quatro copos de vinho, ou quatro garrafas de cerveja. O etanol chega ao fígado e é transformado em acetato, evolvendo duas etapas:

CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+ (1) Etanol Acetaldeído

CH3CHO + NAD+ CH3COO- + NADH + H+ (2)Acetaldeído Acetato

A etapa (1) – etapa lenta – é catalisada pela enzima álcool desidrogenase, no citossol enquanto a etapa (2) ocorre na matriz mitocondrial e é catalisada pela enzima aldeído desidrogenase. Em ambas as etapas ocorre a produção de NADH. Por esta razão, as vias metabólicas da gliconeogênese e da -oxidação dos ácidos graxos, que têm enzimas cuja atividade é sensível à presença de NADH, sofrem inibição durante o metabolismo do etanol. No jejum, esta situação favorece à hipoglicemia e ao acúmulo de triacilgliceróis no fígado


(fígado gordo). Pode, também, haver um acúmulo de ácido láctico, gerando acidose metabólica.

O consumo de álcool por uma pessoa subnutrida ou após exercício extenuante pode causar hipoglicemia. Os equivalentes de NADH em excesso bloqueiam a conversão de lactato em glicose e promovem a conversão de alanina em lactato, que acumula na corrente sangüínea. Com a redução da glicemia ocorre queda no desempenho motor e intelectual. Altas doses de etanol apresenta um efeito depressor, que pode levar a estupor e anestesia.

O etanol apresenta um alto conteúdo energético, produzindo cerca de 7,1 kcal/g, quando oxidado. O acetato derivado do metabolismo do etanol pode ser transformado em acetil-CoA, que é oxidado a CO2 e H2O, através das reações do ciclo do ácido cítrico e da cadeia transportadora de elétrons. No fígado as mitocôndrias têm uma capacidade limitada para oxidar o acetato, porque a ativação do acetato a acetil-CoA requer GTP. Com o aumento nos níveis de NADH, as reações do ciclo sofrem inibição. Isto leva a uma redução nos níveis de GTP, gerado na transformação de sucnil-CoA a succinato, e oxidação do acetil-CoA também fica comprometida. Grande parte do acetato é exportado do fígado para o sangue e pode ser oxidado, na forma de acetil-CoA, em outros tecidos.

Como acetato, acetaldeído pode ser exportado do fígado para a circulação sangüínea. Este último composto reage, rapidamente, com grupos funcionais importantes, como as proteínas das células sangüíneas e dos demais tecidos, comprometendo a sua atividade biológica.

Questões Sobre o Tema Integração e Regulação Metabólica

01- Conceitue metabolismo, e explique o que são seres autotróficos e seres heterótrofos e como esses seres sobrevivem.

02- Fale sobre a importância das enzimas no metabolismo e conceitue anabolismo e catabolismo.

03- Qual a importância do ATP e NADPH na regulação do metabolismo celular?04- Relacione as formas pelas quais ocorre a regulação do metabolismo e explique como elas

funcionam.05- Relacione as principais vias metabólicas e fale sobre a importância das junções

metabólicas: glicose-6-fosfato, piruvato e acetil CoA.06- Como é possível explicar a integração entre os diversos órgãos, quando existe diferentes

padrões metabólicos entre cérebro, músculo, tecido adiposo, trato digestivo e fígado? Fale sobre essas diferenças

07- Fale sobre os hormônios envolvidos com a regulação do armazenamento e da mobilização dos alimento e sobre seu papel na integração do metabolismo.

08- Explique como o organismo vivo se adapta a uma situação de jejum prolongado.09- As fontes de energia são as mesmas em qualquer atividade muscular? Explique.10- Quais os transtornos do metabolismo causados pelo diabetes mellitus e o que entende por

diabéticos insulino-dependentes e não insulino-dependentes?11- Independente dos efeitos prejudiciais, sociais e econômicos do alcoolismo, explique

porque o etanol não deve ser consumido como fonte de energia, apesar do seu alto teor calórico.


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