[Apostila] Bioquímica e Biologia Molecular - USP

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

I M P R E S S Ã O

D I G I T A L

D O

D N A

Indivíduo

Sondas

QBQ-217 BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE

2003

DOCENTES RESPONSÁVEIS: Profa. Suely Lopes Gomes (Coordenadora)

Profa. Aline Maria da Silva

QBQ-217/Bioquímica e Biologia Molecular do Gene – 2003

QBQ-217

Bioquímica e Biologia Molecular do Gene Ciências Farmacêuticas, 2003 - Diurno

DOCENTES RESPONSÁVEIS: Profa. Suely Lopes Gomes (Coordenadora, sala 1211 - Bloco 12 inferior) Profa. Aline Maria da Silva (sala 1224 - Bloco 12 inferior) MONITORES: Karina F. Ribichich Daniela Beton HORÁRIO E SALAS: Aulas Expositivas: 4as. e 5as. feiras das 14 às 16hs - Sala 10 - Bloco 6 inferior Exercícios (Discussão): 4as. e 5as. feiras das 16 às 18 hs - Salas 9 e 10 - Bloco 6 inferior Aulas Práticas: Bloco 7 superior ORGANIZAÇÃO DO CURSO: O Curso envolve aulas expositivas, períodos para resolução e discussão de exercícios e aulas práticas. Utilizando as informações das aulas expositivas e a bibliografia recomendada, os alunos deverão resolver os exercícios. Os exercícios serão discutidos nos períodos de discussão em sala de aula com acompanhamento das professoras e monitores. Nas aulas práticas serão realizadas experiências que envolvem algumas técnicas utilizadas na Biologia Molecular. Os alunos serão divididos em grupos e cada aluno deverá apresentar um RELATÓRIO INDIVIDUAL contendo os resultados obtidos e a resolução das questões correspondentes. Só serão aceitos relatórios de alunos que realizaram as aulas práticas. POR RAZÕES DE SEGURANÇA, O USO DO AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO. AVALIAÇÃO: A avaliação será feita através da média ponderada das notas obtidas nas três provas (P1, P2 e P3), nos relatórios (R) e na participação nos períodos de discussão de exercícios (E), de acordo com a fórmula abaixo:

Nota final= [(P1 x 3) + (P2 x 3) + (P3 x 3) + ½ (R + E)] 10

A matéria das provas será CUMULATIVA. No final do curso, será oferecida uma prova substitutiva (com toda a matéria) para alunos que faltarem a uma das três provas (apresentar justificativa) ou que não atingiram média ≥ 5,0. Os alunos que não atingirem média ≥ 5,0, porém atingirem média ≥ 3,0 e 75% de frequência poderão realizar a prova de recuperação no segundo semestre de 2003.

A FREQUÊNCIA OBRIGATÓRIA MINÍMA ÀS AULAS É DE 75%. BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA: - Biologia Molecular Básica (2000) A. Zaha (Coordenador) Ed. Mercado Aberto - Biochemistry (1995) L.Stryer. 3rd & 4th edition. W.H.Freeman and Co. New York. - Recombinant DNA (1992) J.Watson, M.Gilman, J.Witkowski & M.Zoller. Ed. Scientifc American Books. - Guia de Rotas na Tecnologia do Gene (1999), M. R. Walker & R. Rapley, Atheneu Editora São Paulo.

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CRONOGRAMA QBQ-217 19/02. 4a. feira - Estrutura e Função dos Ácidos Nucleicos. 20/02. 5a. feira - Fluxo da Informação Genética. Exercício I. 26/02. 4a. feira - Estrutura do DNA e Replicação. Exercício I. 27/02. 5a. feira – Reação em cadeia da polimerase (PCR). Exercício II. 05/03. 4a. feira – Não haverá aula (Cinzas). 06/03. 5a. feira – Mutação e Reparo. Exercício III. 12/03. 4a. feira – Experiência 1: Extração de DNA de E. coli. 13/03. 5a. feira - Plasmídeos e transposons. Exercício IV. 19/03. 4a. feira – Experiência 2: Transformação de bactérias com plasmídeos. 20/03. 5a. feira – Explorando os genes: clonagem de DNA. Exercício IV. 26/03. 4a. feira - Síntese e Processamento de RNA. Exercício V. 27/03. 5a. feira - Código Genético. Exercício VI. 02/04. 4a. feira - PROVA I. 03/04. 5a. feira - Síntese proteica. Exercício VII. 09/04. 4a. feira - Controle da Expressão Gênica em Procariotos I. Exercício VII. 10/04. 5a. feira – Controle da Expressão Gênica em Procariotos II. Exercício VIII. 16/04. 4a. feira – SEMANA SANTA (Não haverá aula). 17/04. 5a. feira - SEMANA SANTA (Não haverá aula). 23/04. 4a. feira - Experiência 3: Indução da β-galactosidase por IPTG. 24/04. 5a. feira - Cromossomos de Eucariotos. Exercício VIII. 30/04. 4a. feira - Controle da Expressão Gênica em Eucariotos. Exercício IX. 1º/05. 5a. feira – DIA DO TRABALHO (Não haverá aula). 07/05. 4a. feira - Mecanismos de Transdução de sinal. Exercício IX. 08/05. 5a. feira - Oncogenes e câncer. Exercício X. 14/05. 4a. feira - Exercício X/Plantão de Dúvidas. 15/05. 5a. feira - PROVA II 21/05. 4a. feira - Reunião Anual da SBBq (Não haverá aula). 22/05. 5a. feira - Análise de Genomas I e II. 28/05. 4a. feira – Experiência 4: Preparação de DNA plasmidial. 29/05. 5a. feira - Análise de Genomas III. Exercício XI 04/06. 4a. feira - Experiência 5: Digestão de DNA e eletroforese em gel de

agarose. 05/06. 5a. feira – Proteínas Recombinantes/Transgênicos. Exercício XII. 11/06. 4a. feira - Experiência 6: Expressão de proteína recombinante em E. coli. 12/06. 5a. feira – Diagnóstico clínico através do DNA/Terapia Gênica. 18/06. 4a. feira – Exercício XIII. 19/06. 5a. feira – CORPUS CHRISTI (Não haverá aula). 25/06. 4a. feira – PROVA III 26/06. 5a. feira – Período de estudo. 02/07. 4a. feira – PROVA SUBSTITUTIVA

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EXERCÍCIOS I. Estrutura e Função dos Ácidos Nucleicos 1. Quais as diferenças de composição e estrutura entre RNA e DNA. Como se distingue entre a uracila e a timina, e entre a ribose e a desoxirribose. 2. Escreva os nomes das bases, ribonucleosídeos, desoxirribonucleosídeos, ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos do DNA e RNA. 3. Escreva a sequência de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma fita com a sequência:

(5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3') Exprima, em porcentagem, a composição de bases do DNA de fita dupla. 4. Como são chamadas as ligações covalentes que unem dois nucleotídeos consecutivos nas moléculas de ácidos nucleicos? Esquematize estas ligações. 5. Uma molécula de ácido nucleico tem a seguinte composição de bases:

C = 24,1% G = 18,5% T = 24,6% A = 32,8% O que você pode afirmar sobre esta molécula? 6. Explique por que ácidos nucleicos são desnaturados quando submetidos a alta temperatura ou pHs extremos ? Uma molécula de DNA desnaturada por aquecimento pode ser renaturada? Como? 7. O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a fórmula :

Tm = 69,3 + 0,41(%GC), onde GC é a porcentagem de Guanina + Citosina a) DNA de E. coli contém 50% GC. Calcular o Tm para o DNA desta bactéria. b) As curvas de fusão da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm é normalmente maior do que 65oC. Por que isto é importante para a maioria dos organismos? c) Como varia o Tm com a força iônica da solução? d) O que acontece com Tm quando se adiciona etanol à solução de DNA? 8. Descreva os principais experimentos que indicaram que o DNA é o material genético. 9. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. Qual seria o resultado deste experimento se a replicação do DNA fosse conservativa? 10. Quais os diferentes tipos de RNA que podem ser encontrados nas células? Quais as suas funções principais?

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II. Fluxo da Informação Genética 1. Após a infecção de E. coli com o bacteriofago T2, quais dos seguintes eventos ocorrem e em que ordem ? (a) novas proteínas são sintetizadas (b) novos RNAS são sintetizados (c) novos ribossomos são sintetizados (d) novos RNAS se associam a novos ribossomos (e) novos RNAS se associam a ribossomos pré-existentes 2. RNA é facilmente hidrolizado por álcali, enquanto DNA não o é. Por que? 3. Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. coli tem a seguinte sequência

5'...AGGTTACCTAGTTGC...3' Suponha que um mRNA seja transcrito a partir deste DNA usando a fita complementar como molde. Qual será a seqüência deste mRNA? O que você pode dizer sobre a capacidade de formação de um híbrido RNA-DNA? 4. Qual é a sequência do polipeptídeo que seria codificado pelo mRNA sintetizado na questão 3. Assuma que o quadro de leitura começa com o primeiro nucleotídeo. 5. Quais os diferentes tipos de RNA que podem ser encontrados nas células e como eles se diferenciam quanto à estrutura, tamanho, abundância e função? 6.Baseando-se na lista de códons e amino ácidos abaixo, quais das seguintes afirmações são corretas? AGU = serina AGC = serina AAU = asparagina AAC = asparagina AUG = metionina AUA = isoleucina (a) o código genético é degenerado (b) a alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons poderia levar à substituição de uma serina por uma asparagina no polipeptídeo. (c) a alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons necessariamente levaria à substituição de um aminoácido no polipeptídeo codificado. (d) um tRNA com o anticódon ACU se ligaria a um ribossomo na presença de um destes códons. 7.Uma globina de 146 aminoácidos sofreu uma mutação no códon correspondente ao sexto aminoácido da cadeia. A análise do DNA indicou uma mudança de (5')TTC(3') para (5')TAC(3') na fita molde. Pergunta-se : (a) A mutação provocou a troca de um aminoácido por outro? Em caso afirmativo, qual é este aminoácido? (b) Quais as implicações para a estrutura da proteína? (c) Qual seria o resultado se a mesma troca ocorresse na base do lado (5') do DNA?

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III. Estrutura do DNA e Replicação/ PCR 1. Combine as características da coluna da direita com o tipo de hélice do DNA da coluna da esquerda (a) A-DNA (1) As pirimidinas estão na configuração anti (b) B DNA (2) Os fosfatos na cadeia estão em ziguezague (c) Z-DNA (3) A sua formação é favorecida por superenovelamento negativo (4) Apresenta um sulco maior relativamente largo e profundo (5) Apresenta uma estrutura helicoidal no sentido dextrógiro (6) Tem 10,4 pares de bases por volta (7) Tem a estrutura similar àquela do RNA de fita dupla (8) As fitas na hélice têm polaridades opostas 2. Combine as propriedades ou funções na coluna à direita com a DNA polimerase na coluna da esquerda: (a) DNA polimerase I (1) envolvida na replicação (b) DNA polimerase II (2) requer um iniciador e um molde (c) DNA polimerase III (3) envolvida no reparo de DNA (4) sintetiza a maior parte do DNA durante a replicação (5) remove o iniciador e preenche as lacunas durante a replicação 3. Defina os seguintes termos: primer, ori, RNA primase, fragmento de Okasaki, síntese descontínua de DNA, DNA ligase, girase, fita líder. 4. O fragmento de DNA no esquema abaixo é de fita dupla em ambas as extremidades porém de fita simples no meio. A polaridade da fita superior está indicada. 5'__________________________3' __________P HO_________ a) O fosfato (P) indicado na fita inferior está na extremidade 5' ou 3' do fragmento ao qual ele pertence ? (Indique no esquema). b) Como você esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA "in vivo" ? c) Quantos fragmentos você esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse realizado "in vitro", na presença de todos os desoxirribonucleotídeos-trifosfato e DNA polimerase ? 5. Explique porque certas variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar atividade de DNA polimerase praticamente ausente, mas podem ter atividade de exonuclease 5' → 3' praticamente normal.

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6. Qual a atividade da DNA polimerase III que é responsável pela editoração durante a replicação ? 7. Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que a duas fitas não podem ser replicadas pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a célula supera o problema ? Esquematize a formação da ligação fosfodiester durante a replicação a partir do nucleotídeo trifosfato livre mostrando o grupo fosfato que é incorporado.

8. A técnica de PCR (polymerase chain reaction) é utilizada para obter grandes quantidades de DNA a partir de amostras contendo quantidades ínfimas de DNA. a) Descreva os passos envolvidos nesta técnica. b) Que tipo de DNA polimerase é normalmente utilizada? c)Exemplifique aplicações desta técnica. 9. Você deseja amplificar através da técnica de PCR, o DNA contido entre as sequências mostradas na figura abaixo. Escreva a sequência do par de “primers” que você terá que utilizar na reação. Esquematize as reações de polimerização até o terceiro ciclo da amplificação. 5’ GACCTGTGGAAGC CATACGGGATTG 3’ IV. Mutação e Reparo do DNA. Plasmídeos e Transposons 1. Que propriedade da DNA polimerase I é responsável pela observação de que bactérias mutantes polA1 são mais sensíveis à luz ultravioleta ? Explique. 2. Descreva brevemente as 3 etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas envolvidas. 3. Como a maquinaria de reparo de E. coli identifica a fita de DNA que tem um nucleotídeo não complementar incorporado durante a replicação?

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4. Visto que U pareia com A tão bem quanto T pareia com A, por que somente T é encontrado no DNA ? 5. Bromouracila é um mutagênico que produz troca de bases, enquanto acridina causa adições ou deleções de uma base no DNA. Mutações causadas por acridina frequentemente podem ser compensadas por mutações secundárias, distantes vários nucleotídeos da primeira mutação,, enquanto aquelas causadas por bromouracila, geralmente requerem mudanças dentro do mesmo codon. Explique. 6. Explique como algumas cepas da bactéria Salmonella são usadas para detectar substâncias carcinogênicas. Por que extrato de fígado de mamífero está envolvido no teste ? 7. Células de mamífero de dois genótipos diferentes podem ser fundidas na presença do virus Sendai, para formar células multinucleadas (heterocarions) contendo núcleos de ambos os genótipos. Quando fibroblastos de dois pacientes sofrendo de Xeroderma pigmentosum foram fundidos, os heterocarions resultantes não mostraram deficiência em reparo de DNA. Que conclusões podem ser tiradas desta observação? Explique. 8. Defina o termo "transposon". Explique como os transposons podem: conduzir à ativação ou à inativação gênica. 9. Descreva as condições necessárias para que duas bactérias conjuguem com sucesso. O que é uma célula Hfr ? Qual a diferença entre fator F e F'. 10. Suponha que uma cepa Hfr de E. coli sensível à estreptomicina (Str

S), capaz de sintetizar

os aminoácidos Leu e His, é misturada em meio de cultura com uma cepa F- que é resistente à estreptomicina e incapaz de sintetizar Leu e His. Após certo tempo a conjugação é interrompida, colocando-se a mistura num liquidificador e transferindo-se amostras da cultura para placas seletivas para testar se houve ou não conjugação. (a) Ocorre algum crescimento bacteriano quando as bactérias são transferidas para um meio contendo estreptomicina e na ausência de Leu e His? Explique este resultado. (b) Suponha que você repetiu o experimento com menor tempo de incubação antes de colocar a mistura no liquidificador. Explique porque agora as bactérias crescendo na presença de estreptomicina necessitam do aminoácido His, mas não do aminoácido Leu. 11. Como você explica a necessidade do antibiograma antes de prescrever um antibiótico?

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V. Explorando os Genes 1. Quando uma molécula de DNA estranha, isto é, de um organismo diferente, entra em certas bactérias o DNA é frequentemente hidrolisado. Explique as bases enzimáticas deste fenômeno de restrição. Explique como o DNA estranho pode as vezes escapar desta hidrólise. Por que o DNA da própria bactéria não sofre hidrólise? 2. Quais das seqüências abaixo são possíveis sítios de reconhecimento de uma enzima de restrição ? Por que ? (a) 5'-AGTC-3' (b) 5'-ATCG-3' 3'-TCAG-5' 3'-TAGC-5' (c) 5'-ACCT-3' (d) 5'-ACGT-3' 3'-TGGA-5' 3'-TGCA-5' 3. As enzimas de restrição Hind III e Hae III, que reconhecem e clivam respectivamente as seqüências de DNA: ↓ ↓ (5') AAGCTT (3') (5') GGCC (3') (3') TTCGAA (5') (3') CCGG (5') ↑ ↑ foram utilizadas separadamente para clivar a molécula do DNA dupla fita circular abaixo .... AAGCTTTCAGCAGGCCTA .... .... TTCGAAAGTCGTCCGGAT .... Após a clivagem a solução foi aquecida para inativar a enzima de restrição e a solução foi esfriada lentamente após a adição ou não de NaOH 0,1M, para tornar a solução alcalina. Em que condições o DNA assim tratado apresentou-se circular quando observado ao microscópio eletrônico ? 4. Você deseja clonar um gene de levedura no fago lambda. Por que é necessário clivar tanto o DNA de levedura quanto o DNA de lambda com a mesma enzima? Se as enzimas forem diferentes, que características devem ter as extremidades dos fragmentos produzidos pela digestão enzimática ? 5. Como você pode verificar que um fragmento de DNA foi inserido num plasmídeo durante um experimento do clonagem ? Que enzimas você teve que utilizar para a fazer a clonagem ?

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VI. Síntese e Processamento de RNA 1. Dê a composição de subunidades da holoenzima e do cerne da RNA polimerase de E. coli, atribuindo funções às subunidades. 2. Quando uma cultura de E. coli em crescimento é submetida a um rápido aumento de temperatura, um novo e característico conjunto de genes é altamente expresso. Explique como ocorre esta alteração na expressão dos genes. 3. As DNA polimerases necessitam de um iniciador, ao qual se liga um novo nucleotídeo para o crescimento da cadeia polinucleotídica. É necessário um iniciador para a ação da RNA polimerase? 4. Que subunidades da RNA polimerase bacteriana são necessárias para a iniciação da transcrição a partir de um promotor? E para a terminação da transcrição? Explique como uma mutação poderia dar origem a uma E. coli resistente ao antibiótico rifamicina. 5. Uma pequena cadeia de RNA sintetizado in vitro tem a seguinte seqüência: 5'- AUGUACCGAAGUGGUUU - 3' Coloque os grupos fosfato e um asterisco naqueles que serão radiativos quando a transcrição for feita na presença de [γ

32P]-ATP

b) Faça o mesmo para [α32

P]-UTP 6. Defina "promotor", enumere as suas propriedades e diga como podem ser localizados através da técnica de "footprinting". 7. A sequência de um segmento de uma molécula. de DNA duplex é: (a) 5'-ATCGCTTGTACGGA-3' (b) 3'-TAGCGAACATGCCT-5' Quando este segmento serve de molde para a RNA polimerase de E. coli ele dá origem a um segmento de RNA com a seguinte sequência: (c) 5'-UCCGUACAAGCGAU-3'. Indique: a) a fita codificadora; b) a fita senso; c) a fita molde; d) a fita anti-senso. 8. Até que ponto o mRNA, rRNA e tRNA são modificados nos procariotos ? Indique as modificações que podem ocorrer. 10. Combine as descrições na coluna da direita com a RNA pol DNA-dependente eucariótica apropriada: a) RNA pol I (1) localizada no nucléolo (2) localizada no nucleoplasma (3) sintetiza hnRNA b) RNA pol II (4) sintetiza tRNA (5) sintetiza rRNA

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(6) sintetiza precursores do rRNA c) RNA pol III (7) inibida por α-amanitina (8) sintetiza RNA na direção 5'-3' (9) composta de várias subunidades 11. Você usaria num paciente, como agente terapêutico anti-bacteriano, qual destes antibióticos: a) rifamicina ou b) actinomicina D ? Justifique a sua escolha. 12. Quais as principais características das sequências de promotores de genes eucarióticos transcritos em mRNAs? Qual a função dos fatores de transcrição e “enhancers”? 13. Em que consiste o terminal 5' cap do mRNA e qual o seu papel ? Qual a característica do terminal 3' encontrado na maioria dos mRNAs de eucariotos e como eles são formados ? 14. Genes de eucariotos são geralmente constituídos de introns e exons. Estas seqüências são tanto transcritas como traduzidas? A remoção dos íntrons (splicing) tem que ser um processo extremamente preciso. Por que? Dê um exemplo de "splicing" aberrante que leva a um tipo de talassemia em humanos. 15. Suponha que o DNA humano é clivado em fragmentos do tamanho aproximado de um mRNA humano maduro e que então são preparados híbridos RNA-DNA. O mesmo procedimento é repetido com E. coli. Quando os híbridos RNA-DNA de cada espécie são examinados ao microscópio eletrônico, qual deles mostra o maior grau de hibridização? Explique e faça um esquema. 16. O mRNA monocistrônico de eucariotos geralmente representa o transcrito primário ? E o mRNA dos procariotos ? Explique. Faça uma comparação, indicando as principais diferenças encontradas em eucariotos entre um gene, seu transcrito primário e o mRNA maduro que deixa o núcleo para a tradução no citoplasma.

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VII. Código Genético e Síntese de Proteínas 1. Dada a semelhança entre valina e isoleucina e a maior concentração de Val em relação a Ile (5:1) em E. coli, os cálculos indicam que a isoleucil-tRNA sintetase deveria incorporar às proteínas, erroneamente, valina em lugar de isoleucina a cada 40 reações. Entretanto, o erro acontece apenas 1 vez em cada 3000 reações. Explique porque. 2. Como algumas aminoacil-tRNA sintetases podem atingir elevado grau de precisão nas reações, mesmo sem ter um mecanismo hidrolítico de revisão ? 3. Explique porque as moléculas de tRNA devem ter, concomitantemente, características estruturais particulares e comuns. 4. Complete: Cada aminoácido é levado aos ribossomos para a síntese de polipeptídeos pelo pareamento de bases entre o _________________ de uma molécula de aminoacil-tRNA e o _____________de um mRNA. 5. Escreva os produtos finais das seguintes reações: a) valina + ATP + tRNAVal + valil-tRNA sintetase . b) valina + ATP + tRNAIle + isoleucil-tRNA sintetase . 6. Em um experimento verificou-se que Cys-tRNACys pode ser convertido a Ala-tRNACys e usado num sistema in vitro de síntese de proteínas. (a) Se o Ala-tRNACys for marcado com 14C no aminoácido, a alanina marcada seria incorporada na proteína sintetizada no lugar de outros resíduos Ala ? Explique. (b) O que o experimento indica sobre a importância da precisão da reação da aminoacil-tRNA sintetase em relação ao processo global da síntese protéica ? 7. Assumindo que cada nucleosídeo na coluna da esquerda está na primeira posição de um anticódon, com qual(is) nucleotídeo(s) na coluna da direita ele vai parear durante uma interação códon-anticódon, se cada um dos nucleotídeos da direita estiver na terceira posição (3') de um códon ? anticódon códon (a) Adenosina-P (1) Adenosina-P (b) Citidina-P (2) Citidina-P (c) Guanosina-P (3) Guanosina-P (d) Inosina-P (4) Uridina-P 8. De acordo com o princípio de oscilação no pareamento de bases ("wobble"), qual o número mínimo de tRNAs necessário para decodificar os seis códons de leucina - UUA, UUG, CUU, CUC, CUA e CUG ? Explique. 9. Uma mutação supressora compensa o efeito de outra mutação num gene distinto do primeiro. Explique como o tRNA poderia estar envolvido neste processo. 10. Em procariotos, a maioria da cadeias polipeptídicas são iniciadas com o aminoácido ______, cujo códon é ______.

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11. Num sistema de síntese de proteínas in vitro, que permita o início e término da síntese em qualquer sequência de RNA, que peptídeo seria produzido pelo poli-ribonucleotídeo 5'-UUUGUUUUUGUU-3' ? Indique qual o aminoácido N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo obtido.


12. Qual é o papel da vitamina ácido fólico no processo de tradução em procariotos? 13. O códon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptídica quanto para dirigir a incorporação de uma metionina em posições internas de uma proteína. Quais os mecanismos de seleção do códon AUG para a iniciação da tradução em procariotos? 14. Para cada uma das etapas da tradução, descritas abaixo, dê o nucleotídeo trifosfato envolvido como cofator e o número de ligações fosfato de alta energia consumidas. a) Ativação do amino ácido b) Formação do complexo de iniciação 70S (procariotos) ou 80S (eucariotos) c) Entrada do aminoacil-tRNA no ribossomo d) Formação da ligação peptídica e) Translocação 15. Os três códons de terminação são ______, _______ e ______. 16. Muitos antibióticos exercem sua ação por inibição da síntese proteica. Como, então, alguns destes antibióticos podem ser usados em humanos para combater infecções microbianas sem causar efeitos tóxicos devido à inibição da síntese proteica eucariótica? 17. Considere a seguinte sequência de um fragmento de DNA isolado de bactéria:

5' CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC 3' a) Assumindo que esta sequência corresponde a sequência da fita codificadora, qual seria a sequência de aminoácidos do polipeptídeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene for traduzido? Que características na sequência do mRNA determinam qual é o códon iniciador? Considere a primeira base como o início da transcrição. 18. Quais são as características das seqüências sinais que dirigem certos polipeptídeos para o retículo endoplasmático nas células eucarióticas e para secreção em bactérias? 19. Qual é o compartimento celular em que são sintetizadas a maioria das glicoproteínas? 20. Dê exemplos de modificações pós-traducionais que podem ocorrer nas proteínas.

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VIII. Controle da Expressão Gênica em Procariotos 1. Defina expressão gênica constitutiva. Compare expressão gênica induzida com repressão gênica. Use o esquema proposto por Jacob e Monod para o operon da lactose e defina os termos operon, gene estrutural, gene regulador, operador, promotor, indutor, repressor e co-repressor. 2. Numa cultura de E.coli em um meio contendo tanto lactose quanto glicose, qual dos açúcares é metabolizado preferencialmente? Qual é o mecanismo que permite esta seletividade ? O que acontece quando a glicose se esgota durante o crescimento da bactéria ? 3. Para o cultivo de E.coli utilizaram-se meios contendo além dos sais necessários, os componentes: a) lactose d) glicose + cAMP b) lactose + glicose e) lactose + glicose + cAMP c) glicose Analise a produção de β- galactosidase em cada caso, justificando a resposta segundo o modelo de Jacob e Monod. 4. Qual o efeito da deleção do gene regulador do operon lac? Haveria outro tipo de mutação resultando no mesmo efeito ? 5. Um mutante incapaz de crescer tanto em galactose quanto em arabinose, além de diversas outras fontes de carbono, foi isolado de uma cultura de E. coli do tipo selvagem. Que tipo de mutação pode ter produzido estes resultados ? 6. Algumas mutações constitutivas conhecidas no operon da lactose ocorrem no operador(O) ao invés do gene regulador (I). (a) Você esperaria que um mutante O- seria dominante ou recessivo em relação ao alelo selvagem O+ (b) A mutação constitutiva no sítio operador atua em cis ou trans ? (c) Proponha um experimento envolvendo os genes I+,O-, O+ e Z+ que confirme a sua resposta no ítem (b). Assuma que é possível diferenciar a quantidade de enzima produzida no diploide (++) daquela produzida no haploide (+). (d)Mostre de forma análoga se a mutação constitutiva no gene regulador (I-) atua em trans ou em cis. 7. Por que o triptofano é chamado de co-repressor na regulação do operon das enzimas biossintéticas deste aminoácido ? Qual o efeito provável da deleção do gene regulador trp R ? 8. Demonstrou-se que o operon para a biossíntese do aminoácido fenilalanina de uma certa bactéria é regulado por um mecanismo de atenuação. O que pode ser afirmado sobre a sequência de aminoácidos do peptídeo líder para este operon ? Explique. 9. Uma célula de E. coli que possui um profago λ é imune à infecção lítica por outro fago λ. Por que ? 10. Qual o efeito da deleção do gene CI de λ ? Qual o efeito da deleção do gene N de λ?

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IX. Cromossomos de Eucariotos Controle da Expressão Gênica em Eucariotos 1. Quais os aspectos mais comuns na organização dos genes dos genomas eucarióticos? 2. Combine os organismos listados na coluna da esquerda com a quantidade correta de DNA do seu genoma haplóide na coluna da direita. E. coli (bactéria) (1) 1,7 x 108 pb S. cerevisiae (levedura) (2) 4 x 106 pb D. melanogaster (mosca de fruta) (3) 3,9 x 109 pb H. sapiens (homem) (4) 1,4 x 107 pb 3. Quais das seguintes afirmações sobre o DNA isolado de um cromossomo eucariótico são corretas ? - É resistente à quebra durante a extração por seu grande tamanho. - É linear e não ramificado - É uma molécula única - Pode ter tamanho superior a 100 Mb 4. O núcleo de uma célula humana tem 6µm de diâmetro e a extensão total do DNA dos seus 46 cromossomos soma 1,8m. Como é resolvida a discrepância entre estas duas grandezas? 5. Esquematize a estrutura do nucleossomo. O que são histonas e qual o seu papel na organização da cromatina? 6. Dois estudantes de bioquímica: Norberto e Lucia, decidem fracionar uma amostra de cromatina para isolar cada uma das histonas. Norberto adiciona sal à amostra e aplica a solução resultante numa coluna de gel-filtração. Lucia toma a amostra original e a adiciona a uma coluna de cromatografia de troca iônica. Comente sobre as perspectivas de sucesso para cada um destes experimentos, explicando o seu raciocínio. Se necessário, sugira um procedimento alternativo. 7. Cromossomos artificiais de levedura (YACS) podem ser construídos a partir de três espécies de elementos de DNA. Quais são êles ? 8. Compare a expressão gênica em procariotos e eucariotos quanto a: a) grau de acoplamento da transcrição e da tradução. b) número de produtos gênicos em um transcrito primário. c) número de proteínas resultantes da tradução de um transcrito primário. d) proporção de seqüências codificadoras no DNA. e) organização de genes em operons. 9. Cromatina que é ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa, enquanto cromatina que é inativa (heterocromatina) é compacta. Quando núcleos de células de galinha produzindo globina foram tratados brevemente com DNase pancreática, os genes de globina de adultos foram seletivamente destruídos, mas os genes para globina embrionica e ovalbumina permaneceram intactos. Quando os núcleos de células de oviduto foram tratadas com DNase, os genes de ovalbumina foram destruídos. Explique estes resultados.

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10. Conceituar: a) fatores de transcrição; b) "enhancers" (ativadores) indicando suas funções. Exemplifique características estruturais exibidas por fatores de transcrição. 11. O fator de transcrição IIIA (TF IIIA) liga-se ao 5SRNA tão bem quanto à região de controle interna do gene que o codifica. Por que ? Como esta ligação ao produto gênico pode ser usada para regular a expressão do gene 5S ? 12. A RNA polimerase II, responsável pela síntese dos mRNAs em eucariotos, é incapaz de se ligar aos seus promotores no DNA, a menos que fatores de transcrição estejam ligados na vizinhança destes promotores. O que você espera que aconteça durante o choque térmico em células eucarióticas, quando os genes para as proteínas de choque térmico são fortemente induzidos? Explique. 13. Caseína é a proteína mais abundante do leite. É produzida em células epiteliais do tecido mamário em resposta a hormônios, incluindo o hormônio polipeptídico prolactina. Tecido mamário em cultura incubado na ausência de prolactina contém cerca de 300 moléculas de mRNA de caseína por célula, enquanto células incubadas na presença de prolactina contém cerca de 30.000 moléculas de mRNA de caseína. No entanto o núcleo de células de tecido mamário em cultura sintetiza somente cerca de 3 vezes mais mRNA de caseína na presença de prolactina. Proponha uma explicação para estes resultados?

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X. Transdução de Sinal/Oncogenes e Câncer 1. Exemplifique como uma cascata de sinalização intracelular pode ser ativada, citando alguns tipos de sinais extracelulares. 2. Qual o tipo de modificação covalente reversível em proteínas mais frequente nas cascatas de sinalização intracelular ? Quais são as enzimas que catalisam esta modificação ? 3. O cAMP (AMP cíclico) é um importante mensageiro secundário para muitos hormônios. Como pode ocorrer a ativação da enzima adenilato ciclase após ativação de um receptor hormonal ? 4. Como ocorre a transmissão do sinal mitogênico em resposta ao estímulo pelo fator de crescimento de epiderme (EGF) ? 5. Como a transcrição de certos genes pode ser influenciada em resposta a um sinal extracelular ? 6. Qual foi a importância da descoberta que um extrato celular de uma galinha com um sarcoma causava um sarcoma quando era injetado em outra galinha ? 7. O que são protooncogenes e oncogenes? Que tipos de proteínas estes genes podem codificar ? 8. A proteína c-src é homóloga à proteína viral oncogênica conhecida com v-src e atua como tirosina quinase citossólica, cuja atividade é regulada por fosforilação. Qual a característica de v-src que a torna uma proteína oncogênica. 9. A predisposição ao câncer pode ser hereditária. Explique este fato lembrando-se que existem proteínas que agem como supressores do crescimento celular. 10. Retinoblastoma, um câncer de retina que aflige crianças, está asssociado a uma deleção no cromossomo 13. Proponha uma possível função para o gene selvagem (Rb), que codifica uma proteína de 105 kD localizada no núcleo capaz de se ligar ao DNA.

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XI. Análise de Genomas 1. Descreva a técnica de Southern. O que a diferencia da técnica de Northern? 2. Qual é a técnica para o estudo simultâneo do nível de expressão de milhares de genes em uma determinada condição fisiológica ? 3. Qual a diferença entre uma biblioteca genômica e uma biblioteca de cDNA. Explique como a presença de íntrons em genes eucarióticos complica a produção de produtos protéicos que eles codificam quando a expressão é feita em bactéria. Como se pode resolver este problema? 4. Descreva o sequenciamento de DNA pelo método de interrupção controlada da replicação (método de Sanger) incluindo o método de separação e análise das moléculas de DNA produzidas na reação.

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5. A figura abaixo mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo método de Sanger. Escreva a sequência deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para cima. A sequência obtida codifica para um domínio de uma proteína. Encontre a fase de leitura desta sequência. O que aconteceria se durante a leitura do gel você tivesse omitido uma base? Como você faria para ter segurança absoluta da sequência deste fragmento de DNA ? G A T C

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6. No exercício anterior utilizou-se nucleotídeos radioativamente marcados na reação de sequenciamento. Que derivados de nucleotídeos são utilizados no sequenciamento automatizado ? XII. Obtenção de Proteínas Recombinantes/Animais transgênicos 1. A partir de uma biblioteca de cDNA você isolou um cDNA completo que codifica para uma proteína que é um potente estimulador do sistema imunológico. Você agora deseja clonar este cDNA em um vetor de expressão para produzir grande quantidade desta proteína em E. coli. O cDNA possui nas suas extremidades sítios para enzima BamHI e você planeja cloná-lo no sítio de BamHI do vetor de expressão. Esta é sua primeira vez com experimentos de clonagem e você decide seguir cuidadosamente as instruções do manual de clonagem, que recomenda que o vetor digerido deve ser tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da extremidade 5’. a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina? b) Como você analisaria se a clonagem foi bem sucedida? c) A proteína de seu interesse afeta o crescimento das bactérias. Como você faria para obter grande quantidade desta proteína recombinante? 2. O antígeno que é utilizado na vacina recombinante contra a Hepatite B é uma glicoproteína. Como você faria para obter esta proteína recombinante ? 3. Suspeita-se que o aminoácido Lisina da posição 272 é essencial para a ação catalítica de uma certa enzima, que pode ser facilmente purificada com atividade a partir de extratos de E.coli expressando a proteína recombinante. Como você investigaria se este aminoácido é de fato essencial para atividade catalítica desta enzima? Que metodologias teria que utilizar? 4. O gene completo (contendo todos os exons e íntrons) do hormônio de crescimento de ratos pode ser expresso em camundongos sob o controle de um promotor indutível por Cd2+. Como podem ser obtidos tais camundongos transgênicos? Quais as suas características? Como você explica o fato da expressão do gene do rato ser expresso perfeitamente em camundongos? 5. Planeje a obtenção de cabras transgênicas que possam produzir o hormônio de crescimento humano em seu leite. 6. Há poucos anos atrás, cientistas europeus realizaram a clonagem de uma ovelha (Dolly), a partir de células de uma ovelha adulta. Compare este tipo de experiência com a obtenção de um animal transgênico.

XIII. Diagnóstico Clínico através do DNA/Terapia Gênica 1. Dois recém-nascidos desenvolveram infecção com o vírus herpes simplex na maternidade. Um deles se recuperou e o outro morreu. A autopsia mostrou infecção generalizada por herpes. Epidemiologistas precisavam saber se os recém-nascidos haviam sido infectados pela mesma cepa viral. Amostras de ambas as crianças foram usadas para cultivar o vírus. DNA marcado radioativamente das culturas do vírus foi analisado com enzimas de restrição e os resultados indicaram que as duas crianças foram infectadas pela mesma cepa. Como endonucleases de restrição podem ser usadas para distinguir cepas do vírus herpes simplex?

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2. A anemia falciforme está associada a existência de uma mutação pontual de A→T, no gene da β-globina que provoca a troca do aminoácido Glu por Val na proteína. Esta mutação elimina um sítio reconhecido pela enzima de restrição MstII. O desenho abaixo representa um esquema dos genes selvagem e mutante. Planeje um teste utilizando a técnica de "Southern blot" para o diagnóstico pré-natal desta doença. Faça o esquema do resultado esperado considerando um feto normal e de um portador da doença cujos pais são heterozigóticos.

MstII MstIIMstII

1,1 kpb

1,3 kpb

Sítio que está ausentena β-globina mutante

��

3. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma das doenças genéticas mais comuns. O gene da DMD localiza-se no cromossomo X, possui mais de 2 x 106 pares de base e contem pelo menos 70 exons. 60% dos casos são devidos à ocorrência de deleções grandes concentradas em duas regiões do gene. 1/3 dos novos casos são devidos a novas mutações no gene. A técnica de PCR- multiplex é um método rápido e eficiente no diagnóstico da DMD e pode detectar aproximadamente 80% de todas as deleções já conhecidas. Nesta técnica são utilizados múltiplos pares de primers que podem amplificar, em uma reação, 9 segmentos (de tamanhos diferentes) do gene nas regiões onde as deleções ocorrem mais frequentemente. Um exemplo de análise por PCR-multiplex é apresentado abaixo. Descreva as deleções, se houverem, em cada um dos seis pacientes de DMD analisados. Que controle adicional você sugere para confirmar o diagnóstico do paciente F? As setas apontam os nove sítios amplificados pela PCR. Normal equivale a um indivíduo do sexo masculino não portador da DMD e O é um controle negativo onde não foi adicionado DNA à mistura de reação.

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4. O método de identificação de indivíduos mais frequentemente utilizado está baseado na comparação do número de certas repetições variáveis em série que estão localizadas em regiões conhecidas do genoma humano. Explique como pode ser realizado um teste para identificação de indivíduos, levando em conta este fato. 5. Quais são as alternativas possíveis para realização de terapia gênica (tipos de vetores) ?

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ROTEIRO PARA AS AULAS PRÁTICAS

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ROTEIRO PARA AS AULAS PRÁTICAS

RECOMENDAÇÕES: 1. Por razões de segurança não será permitido ao aluno frequentar as aulas sem avental. É PROIBIDO COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATÓRIO. 2. Leia com detalhe o protocolo e preste atenção as instruções fornecidas antes de iniciar a experiência. 3. Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponíveis com cuidado, para evitar desperdício e quebra. 4. Mantenha sua área de trabalho organizada. Ao terminar a experiência passe água na vidraria utilizada e coloque à no local indicado. 5. O relatório individual deverá ser entregue no final de cada uma das aulas práticas. O relatório deverá ser feito de acordo com modelo ao final de cada protocolo experimental. Após preenchidas, as respectivas folhas devem ser destacadas e entregues. 6. Qualquer dúvida ou acidente peça auxílio aos monitores ou aos professores.

USO DO AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO.

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EXPERIÊNCIA No.1: EXTRAÇÃO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli. Protocolo: Será utilizada uma cultura de bactérias E.coli HB101 que foi inoculada ontem no final da tarde em meio de cultura líquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitação vigorosa a 37°C até hoje pela manhã, quando a cultura foi transferida para geladeira. ❶ Coletar as bactérias pela centrifugação de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Descartar o meio de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %. Secar bem o tubo, invertendo-o sobre papel absorvente. Balancear os tubos! ❷ Adicionar 6mL da solução I (citrato de sódio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0 com HCl). Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactérias por inversão. ❸ Remover a tampa e adicionar 0,7mL da solução II [Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 10% (P/V)]. Fechar o tubo e incubá-lo em banho-maria a 60°C por 10 min, com agitação manual suave. ❹ Retirar o tubo do banho, abrir e deixá-lo a temperatura ambiente por 5min. Adicionar igual volume (6,7mL) da solução III (Clorofórmio:alcool isoamílico 24:1 V/V). Não pipetar com a boca! Fechar muito bem o tubo. Agitar suavemente por 10 min a temperatura ambiente. Esta etapa deve ser realizada na capela de exaustão.

❺ Centrifugar 5 min a 5000 rpm. ❻ Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa para uma proveta. Estimar o volume e transferir para um cálice graduado. ❼ Medir, na mesma proveta, 2 volumes de etanol resfriado a -20°C e adicioná-lo lentamente com pipeta Pasteur, pela parede do cálice. ❽ "Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva. Transferí-lo para um tubo de ensaio contendo 10mL de Solução IV (NaCl 1%). Aquecer a 50oC, por 10-20min, até completa dissolução. ❾ Identificar o tubo com o número do grupo. Tomar uma alíquota e diluir em 1 ml de água. Medir a D.O.260nm e D.O.280nm e calcular a relação D.O.260nm /D.O.280nm. Estimar a quantidade de DNA obtida assumindo que D.O.260nm (Densidade Óptica a 260nm) = 1 equivale a 50µg DNA/mL.

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RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.1

Nome: Grupo No. Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:___________________________________________ _____________________________________________________________________

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RESULTADOS OBTIDOS :_______________________________________________

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Nome: QUESTÕES: 1. Qual a função do SDS, Clorofórmio: Isoamílico e Etanol nas etapas da purificação? Consultar tabela (no fim da apostila). 2. Por que é possível "enrolar" o DNA no bastão de vidro? 3. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experiência realizada. 4. Se compararmos as medidas de absorção a 260 nm e a 280 nm da amostra de DNA obtida e de uma solução de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactérias, o que observaríamos? Por que?

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5. Qual o espectro de absorção do DNA na luz ultravioleta. Como se compara com o espectro de absorção de albumina? 6. Como você faria para obter DNA puro a partir dessa preparação que contém DNA e RNA? 7. Por que ocorre o efeito hipercrômico na desnaturação do DNA?

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EXPERIÊNCIA No.2:INDUÇÃO DA β-GALAGTOSIDASE POR IPTG. A β-galactosidase de E.coli é uma enzima indutível que hidrolisa β-D-galactosídeos. A atividade desta enzima pode ser medida com substratos cromogênicos que quando hidrolisados dão origem a produtos coloridos. Um exemplo é o orto-nitrofenil-β-D-galactosídeo (ONPG) que é incolor mas na presença de β-galactosidase é convertido a galactose e orto-nitrofenol. O orto-nitrofenol é amarelo e sua absorção pode ser medida a 420nm. Altos níveis de β-galactosidase só são medidos em culturas crescendo na presença de lactose ou de um indutor não metabolizável, o IPTG (isopropil-tiogalactosídeo).

Protocolo: Será utilizada uma pré-cultura de bactérias E.coli CSH23 que foi semeada ontem no final da tarde em meio de cultura líquido esterilizado e mantida até hoje pela manhã, quando a cultura foi transferida para geladeira. ❶ Tome uma alíquota da pré-cultura de bactérias e dilua em meio líquido na presença e ausência de IPTG (1mM) sob agitação vigorosa a 37°C até a cultura atingir D.O.600nm (Densidade Óptica a 600nm) = 0,7. Esfrie as culturas no gelo por 20 min. ❷ Retire 0µL, 50µL e 100µL de cada cultura, transferindo separadamente para 3 tubos Eppendorf previamente identificados. Complete com água para um volume final de 100µL. Adicione 0,7mL de tampão de ensaio (tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0 contendo KCl 10mM, MgSO4 1mM e β-mercaptoetanol 50mM).

Não descarte o restante das culturas mantendo-as no gelo. ❸ Adicione 50 µL de cloroformio. Agite bem. Incube os tubos em banho de água a 30oC por 5 min. ❹ Inicie a reação pela adição de 200 µL de ONPG (4mg/mL) e incube a mistura de reação em banho de água a 30oC por 10 min. ❺ Interrompa a reação adicionando 0,4mL de Na2CO3 1M. ❻ Centrifugue os tubos por 5 min na minicentrífuga. ❼ Remova delicadamente o sobrenadante de cada tubo para a cubeta sem retirar o clorofórmio, e faça a leitura da D.O.420nm (Densidade Óptica a 420nm). Enxague as cubetas com água entre a cada leitura. ❽ Faça uma diluição 1:10 das culturas de E.coli e faça a leitura da D.O.600nm (Densidade Óptica a 600nm).

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❾ Calcule a atividade de β-galactosidase das duas culturas: Atividade de β-galactosidase = 1000 x D.O.420nm __________________ UNIDADES tempo (min) x volume x D.O600nm de cultura (mL)

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Nome: Grupo No. Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:___________________________________________

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Nome: QUESTÕES: 1. O que você pode concluir sobre o genótipo da cepa CSH23? O que você esperaria encontrar em um experimento semelhante utilizando uma cepa cujo genótipo é I-O+Z+? E no caso de uma cepa I+O-Z+? Proponha um experimento para distinguir entre estas cepas.

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EXPERIÊNCIA No. 3: TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COM PLASMÍDIOS CONTENDO GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS. A técnica de transformação permite a introdução de plasmídeo em uma bactéria e sua manutenção como um elemento autônomo auto-replicativo. Este plasmídeo pode conferir à bactéria hospedeira certas propriedades (por exemplo resistência a drogas) que podem ter valor seletivo no meio. Várias técnicas são disponíveis para transformar uma bactéria. Na aula prática usaremos o método do CaCl2. Neste método as bactérias são submetidas a um tratamento num meio hipotônico contendo cálcio que as torna competentes para a transformação pelo DNA do plasmídeo. Usaremos o plasmídeo pBR322 (ver mapa abaixo). O plasmídio pBR322 é comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de genes. Além da origem de replicação que permite sua propagação em bactérias (E. coli) o pBR322 apresenta duas marcas genéticas, ou seja, genes que codificam para proteínas que conferem resistência a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introdução de pBR322 em E. coli que normalmente é sensível tanto à ampicilina como à tetraciclina, leva ao aparecimento de bactérias capazes de crescer em meio (líquido ou sólido) contendo estes antibióticos. Note que a introdução de genes exógenos no sítio da enzima de restrição Pst I leva à perda da resistência à ampicilina, uma vez que este sítio está localizado na região ampr. Da mesma forma, clonagem no sítio da enzima Bam HI leva à perda da resistência a tetraciclina. Transformação de bactérias que são sensíveis a um antibiótico, em resistentes, será revelada através de plaqueamento (inoculação) de bactérias em placas de agar contendo meio LB (meio rico de Luria Bertani) na ausência e na presença de antibióticos: placas LB-A ou LB-tet. contendo 50 mg/ml ampicilina ou 12,5 mg/ml tetracicilina.

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Protocolo: O ideal seria fazermos a experiência em condições estéreis, para evitar contaminação. Como isto não será possível, manipule convenientemente o material estéril fornecido. NÃO ABRA AS PLACAS DE ÁGAR ATÉ O MOMENTO DE USO. As bactérias competentes para transformação foram preparadas a partir de uma cultura em fase exponencial do crescimento e através de sucessivas lavagens do precipitado de bactérias com uma solução de CaCl2 e mantidas congelads a -80oC. ❶ Inocular 5 ml de meio LB líquido com uma colônia de bactérias HB101 (E. coli) e incubar à 37°C até o dia seguinte sob forte agitação (200-250 rpm). ❷ Diluir a pré-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar à 37°C sob agitação até OD600nm =0,3 (fase logarítmica de crescimento). ❸ Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactérias por centrifugação (4000 rpm, 5min). Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 ml de tampão acetato de sódio (frio) 20 mM pH 6,5 contendo CaCl2 0,1M. Incubar no gelo por 20 minutos. ❹ Coletar as bactérias (4000 rpm, 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampão (frio). ❺ Após pelo menos 30 min. no gelo estas BACTÉRIAS COMPETENTES podem ser transformadas. ❻ Para transformar, distribui 0,1 ml/tubo da suspensão de bactérias competentes para cada um de 2 tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 µg DNA de pBR322 em 10 µl de tampão 10 mM Tris pH 7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo será usado como controle (bactéria apenas). ❼ Incubar em gelo por 15 min. antes de dar o choque térmico (42°C por exatamente 90 segundos). Transferir os tubos para o gelo por 2 min. ❽ Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37°C sem agitação, em banho-maria, por uma hora. ➒ Tranferir 25µl ou 250µl da suspensão para placas de ágar LB e LB-A (LB contendo ampicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactérias com o auxílio de uma alça de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na própria tampa da placa de Petri.

Número de colônias/ placa Placa LB Placa LB-A #1 Bactérias controle 25µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒ #2 Bactérias controle 250µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒ #3 Bactérias transformadas 25µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒ #4 Bactérias transformadas 250µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒

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RESULTADOS OBTIDOS: 1. Preencher a tabela com o número de colônias obtido em cada caso.

Número de colônias/ placa Placa LB Placa LB-A #1 Bactérias controle 25µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒ #2 Bactérias controle 250µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒ #3 Bactérias transformadas 25µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒ #4 Bactérias transformadas 250µL ▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒▒

2. Qual a eficiência de transformação obtida, em termos de n° de colônias/ug de DNA?

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Nome: QUESTÕES: 1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactérias competentes? 2. Qual o papel do choque térmico? 3. Por que as bactérias devem ser incubadas por 60 min a 37°C antes de espalhá-las em placas de ágar? 4. Que utilidade teria esta técnica do ponto de vista biotecnológico ? Dê um exemplo.

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EXPERIÊNCIA No. 4: PREPARAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL A partir das bactérias transformadas obtidas na experiência anterior, extrair e purificar o DNA plasmidial, separando-o do DNA cromossomal bacteriano. Protocolo: Utilizaremos cultura de E. coli em meio LB-A (50µg/ml ampicilina). 1. Tomar 1 ml da cultura e colocar em um tubo Eppendorf. 2. Centrifugar a 12000xg por 5 min à temperatura ambiente. 3. Descartar o sobrenadante e secar o sedimento invertendo o tubo sobre papel absorvente por 1 min. 4. Adicionar 100µl de tampão GET/RNase e ressuspender as bactéria por agitação no vortex. 5. Adicionar 200µl de solução de lise e inverter 10 vezes o tubo lenta e delicadamente. 6. Incubar a mistura por 5 min à temperatura ambiente. 7. Adicionar 200µl de solução neutralizadora e inverter 10 vezes o tubo bem lenta e delicadamente 8. Incubar o tubo em gelo por 20 min. 9. Centrifugar a 12000xg por 15 min à temperatura ambiente. 10. Transferir 440µl do sobrenadante resultante da centrifugação do passo 9 para outro eppendorf contendo 300µl de isopropanol. 11. Centrifugar a 12000xg por 10 min à temperatura ambiente, 12. Desprezar o sobrenadante e levar o sedimento com 500µl de 70% etanol. 13. Centrifugar a 12000xg por 5 min à temperatura ambiente. 14. Secar o sedimento sob vácuo em “speed vac” e ressuspendê-lo em 25µl de T.E. 15. Incubar por 5 min a 65oC. 16. Tomar um volume apropriado da solução de plasmídeos e adicionar tampão de amostra na proporção 1:10. 17. Aplicar a amostra em gel 0.7% agarose em TBE, contendo 0,5µg/ml brometo de etíido e submeter a eletroforese a 100V em tampão TBE. 18. Observar o DNA obtido na preparação por iluminação do gel com luz ultravioleta. GET/Rnase – dextrose 50mM, EDTA 10mM, Ribonuclease A 150µg/ml em Tris-HCl 25mM pH 8.0 Solução de lise – SDS 1% em NaOH 0,2N Solução neutralizadora – Acetato de potássio 3M pH 4,8

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RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.4 Nome: Grupo No. Data OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:___________________________________________

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Nome: QUESTÕES: 1. Que papel desempenha cada componente do tampão GET (glicose, EDTA e Tris)? 2. O que é lisozima e para que é usada na preparação de plasmídeos? 3. Qual a função do NaOH e do SDS presentes na solução de lise? 4. Se o DNA cromosomal tiver sido muito quebrado durante as manipulações, onde espera encontrá-lo após precipitação com KAc? Quais as consequências para a preparação de DNA plasmidial? 5. Como age o isopropanol? Este álcool poderia ser substituído por etanol, por exemplo? 6. Por que se dissolve a preparação de DNA em tampão Tris-EDTA? 7. Quantas bandas do DNA plasmidial são vizualizadas no gel corado com EtBr? Quantas bandas voce esperaria caso o pBR322 purificado fosse digerido com a enzima EcoRI?

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EXPERIÊNCIA No. 5: DIGESTÃO DE DNA COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO e ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE Preparações de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digestão com enzimas de restrição para identificação e caracterização do DNA. A escolha das enzimas de restrição deve ser baseada no mapa de restrição (quando disponível) ou opta-se pelo emprego de um conjunto de enzimas de forma a permitir a caracterização do DNA em questão, ou seja, obter seu mapa físico. As enzimas de restrição classificam-se em 3 gupos quanto a força iônica para a atividade (alta, média e baixa). As enzimas de restrição comercialmente disponíveis costumam vir acompanhadas do tampão correspondente e instruções para realizar a reação. Na experiência a ser realizada o DNA do plasmídeo será digerido com 4 enzimas de restrição diferentes. - Cada grupo (ver tabela abaixo) receberá um tubo Eppendorf contendo os componentes da reação com exceção do DNA plasmidial. Manter o tubo em banho de gelo. ❶ Acrescentar 10µL da solução de plasmídeo (DBQ1, 150ng/10µL) no tubo.

GRUPOS 1,7,13,19 2,8,14,20 3,9,15,21 4,10,16,22 5,11,17,23 6,12,18,24 EcoRI BglII EcoRI e

BglII EcoRI e

XbaI BglII e XbaI

sem enzima

H2O 7 µL 7 µL 6 µL 6 µL 6 µL 10µL Tampão da enzima (10X)

2 µL 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL -

Enzima (1 U) 1µL 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL - Plasmídeo 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL Volume total 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL ❷ Misturar o conteúdo dos tubos por agitação e centrifugação rápida. ❸ Incubar a reação em banho maria a 37°C durante 60min. ❹ Interromper a reação pela adição de 1µL EDTA 0,1 M (Opcional). Transferir o tubo para um banho a 65°C, durante 15min. Retirar o tubo do banho e rapidamente colocá-lo em gelo. ❺ Adicionar a cada um dos tubos 5µL de tampão da amostra. Misturar e centrifugar. A amostra está pronta para ser analizada em eletroforese em gel de agarose. Tampão de digestão 10X Tampão da amostra Tris-HCl 100mM - 500mM* Tris 10mM pH 8, NaCl 500mM-1M* EDTA 1mM pH 8, MgCl2 100mM azul de bromofenol 0,25% p/v DTT 10mM xileno cianol 0,25% p/v *(depende da enzima) sacarose 40% p/v

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FRACIONAMENTO DO DNA EM GEL DE AGAROSE Preparo do gel de agarose 1,0% OBS: Serão montados dois géis com espaço para aplicação de até 14 amostras ❶ Pesar 1,0 g de agarose. Adicionar 100mL de tampão TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH8). ❷ Aquecer em banho fervente e misturar até completa dissolução da agarose. Enquanto espera-se a dissolução da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar até 40°C (até conseguir segurar com as mãos) e acrescentar 5µL de uma solução de brometo de etídio 10mg/mL. CUIDADO BROMETO DE ETÍDIO É CARCINOGÊNICO! Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocação do pente. Deixar solidificar por pelo menos 30min. ❸ Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampão TBE à cuba de modo a cobrir o gel com menor volume possível. ❹ Aplicar as amostras preparadas na experiência anterior. Ligar a fonte de eletroforese e aplicar aproximadamente 100V. Cuidado para não tocar o tampão. ❺ Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0,5cm do fim do gel. ❻ Tranferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando óculos protetores. Fotografar o padrão de bandas observado com uma régua posicionada na lateral do gel. OBS: Ordem de aplicação das amostras nos géis GEL 1 1 - 2 - 3 - 4 -5 – 6 - Padrão de tamanho - 7 - 8 - 9 – 10 – 11- 12 GEL 2 13 - 14 -15 – 16 – 17 – 18 - Padrão de tamanho - 19 – 20 – 21 – 22 – 23 –24

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RESULTADOS OBTIDOS: :______________________________________________

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Nome: QUESTÕES: 1. Por que se observam duas bandas no plasmídeo que não foi incubado com a enzima? 2. Por que se utiliza EtBr (Brometo de Etídio) no gel e no tampão da eletroforese? 3. Géis de agarose podem ser usados para análise de fragmentos de DNA que tenham entre 70 a 800.000 pares de base. Assim, é possível estimar o tamanho e a quantidade dos fragmentos de DNA. O tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em relação a de outros de tamanho conhecido. Se o gel foi fotografado com uma régua ao lado, a mobilidade relativa pode ser lida diretamente da foto. O gráfico da mobilidade em cm (M) contra o tamanho em pb (L) dará uma curva que pode ser usada para leitura do tamanho com relação a uma determinada mobilidade. Entretanto, a interpolação é muito mais precisa se a função puder ser encontrada em uma linha reta: gráfico de log L versus M. Desenhe a reta utilizando papel monolog (eixo x, mobilidade em cm, eixo y, tamanho em pb). Usando-se a mistura de padrões de tamanho em pb conhecida calcule o tamanho dos fragmentos obtidos da digestão do pQBQ com as enzimas utilizadas. Faça um desenho do pQBQ indicando a posição dos sítios de clivagem para estas enzimas.

5000 bp4000 bp3000 bp2000 bp1600 bp

1000 bp

500 bp

5000 bp4000 bp3000 bp2000 bp1600 bp

1000 bp

500 bp

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EXPERIÊNCIA No. 6: EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE EM E. COLI.

A produção de proteínas exógenas em E. coli é uma das muitas aplicações da tecnologia do DNA recombinante. Para que a expressão da proteína de interesse seja obtida, um fragmento de DNA contendo a região codificadora do gene correspondente deve ser clonado num valor de expressão de E. coli, sob o controle de um promotor geralmente induzível.

Na experiência a ser realizada, a expressão da proteína está sob o controle do promotor lac e a indução é feita com IPTG.

Após a indução, as amostras serão analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida. O gel de eletroforese é constituído de um polímero de acrilamida. A polimerização ocorre

na presença de radicais livres, os quais são gerados por persulfato de amônio e estabilizados por TEMED (N,N,N’,N’-tetramethilethilenediamina). A polimerização também depende da presença de um agente bifuncional N,N'-methilenebisacrilamida tornando as cadeias ligadas entre si formando um gel cuja porosidade é determinada pelo comprimento das cadeias e pelo grau de interligação entre estas.

O sistema de eletroforese que será utilizado será um sistema denominado descontínuo. São utilizados dois tipos de gel, um denominado gel de empilhamento e outro denominado gel de corrida. A função do gel de empilhamento é de concentrar amostras com grande volume, resultando em uma melhor definição e resolução dos resultados. As moléculas são, então, completamente separadas no gel de corrida I – Pré-Inóculo: 10 mL de meio LB, antibiótico a uma concentração final 100µg/mL (100µL de carbenicilina 50mg/mL) e bactéria (1 colônia). Crescer a 37ºC por uma noite com agitação de 200 rpm. II – Indução 1 – Num erlenmeyer colocar 10mL de meio LB fresco contendo carbenicilina 100µg/mL e diluir o pré-inóculo (DO600nm deve estar entre 0,1 e 0,15). Incubar a 37ºC e 200 rpm. 2 – Quando a cultura atingir DO600nm entre 0,4 e 0,5 coletar uma alíquota de 1mL (cultura não induzida) e adicionar IPTG à cultura para concentração final 1mM. Colocar a 37ºC, 200 rpm por 1 hora. 3 – Depois de 1 hora coletar uma alíquota de cultura induzida (1 mL). III – Tratamento das amostras induzida e não induzida 1 – Centrifugar 16000 x g por 5 minutos a temperatura ambiente. 2 – Desprezar o sobrenadante. 3 – Ressuspender o sedimento em 100µL de tampão amostra para eletroforese 1X (Tris 50 mM pH 6,8; DTT 25 mM; glicerol 10%; SDS 1% e azul de bromofenol 0,025%). 4 – Ferver a 95ºC por 5 minutos. 5 – Aplicar as amostras no gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

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RESULTADOS OBTIDOS: :______________________________________________

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Nome: QUESTÕES: 1. Qual o papel da carbenicilina? 2. Por que se usa IPTG para a indução da síntese da proteína recombinante? 3. Pode ser produzida uma glicoproteína utilizando-se o procedimento aqui descrito?

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PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS ÁCIDOS NUCLEICOS DNA RNA Força iônica baixa ("Salting in") alta ("salting out)

Solubiliza Precipita

Solubiliza Precipita

Meio ácido 0,5N (brando) à frio

Precipita Depurina

Precipita Depurina

Meio alcalino brando (0,3N KOH; 37°C; 18h)

ss: estável ds: desnatura

Hidrolisa 2' e 3'nucleosídeos

Solvente orgânico (cte dieletr. < que da H O) 2ex.: etanol, isopropanol

Precipita

Precipita

Agentes desnaturantes quebram pontes de H ex.: formamida, uréia

ss: estável ds: desnatura

1ária: estável 2ária: destruída

Luz UV (260 nm)

ss: absorve mais ds: absorve menos

Absorve

Calor

ss: estável ds: desnatura (Tm)

1ária: estável 2ária: destruída

Nucleases Exonucleases + +

Endonucleases + +

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INIBIDORES DE TRANSCRIÇÃO OU DE TRADUÇÃO ANTIBIÓTICOS Rifamicina (Streptomyces) Rifampicina (sintética) Inibe iniciação da transcrição (impede a formação da la. ligação fosfódieser) mas não inibe elongação da cadeia de mRNA. Liga-se à subunidade β de RNAP. Actinomicina D: Estrutura: 2 peptídeos + 3 anéis benzeno fenoxazona (ver p 715 Stryer). Extraída de Streptomyces. Inibe transcrição. Liga-se a dsDNA impedindo que seja usado como template. Anéis fenoxazona intercalam-se entre as bases nitrogenadas do RNA. Usado em tratamento de câncer. α-Amanitina (octapeptídeo cíclico) de um cogumelo (Amanita) Inibe RNAPII (muito) e III (um pouco, em maior concentração). Liga-se a RNAPII bloqueando a formação de mRNA ou de precursores de mRNA. Inibe elongação. Puromicina: Inibe tradução. Análogo de aminoacil-tRNA. Liga-se ao sítio A do ribossomo, impedindo a entrada de aminoacil-tRNAS. Foma ligação peptídica com a cadeia polipeptídica nascente (peptidil transferase). Peptidil-puromicina: peptídeo liberado do ribossomo contendo puromicina ligada covalentemente ao C-terminal. Tetraciclina: Liga-se ao sítio A do ribossomo, impede ligação de aminoacil-tRNA neste sítio. Cloranfenicol: Só inibe a síntese de proteínas de procariotos e mitocôndira (não inibe a síntese protéica extramitocondrial de eucariotos). Cicloheximida: Inibe a formação dos ribossomos de eucariotos (80S) mas não de procariotos (70S). Estreptomicina: Causa leitura incorreta do código genético. TOXINAS Diftérica: Inibe síntese protéica. Alvo é EF2 que cataliza a translocação do peptídeo. O fragmento A da toxina cataliza a transferência de ADP para EF2 (ADP-ribosilação) inativando este fator de elongação da cadeia polipeptídica. Ricina: Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucarióticos.

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CÓDIGO GENÉTICO UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys UUA Leu UCA Ser UAA STOP UGA STOP UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Trp CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly

AUG é parte do sinal de iniciação e também é o códon para as metioninas internas à cadeia.

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[Apostila] Bioquímica e Biologia Molecular - USP