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Departamento de Química e Bioquímica, Licenciatura em Bioquímica
Biologia Molecular 2012/2013
Docentes:
Margarida Amaral, Anabela Ramalho
Discentes:
Alexandra Salvado, nº40267
Andreia Sousa, nº40261
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Tópicos a abordar
• Os princípios da genómica e proteómica;
• Diferentes tipos de técnicas de proteómica e respectivo
equipamento;
• Análise e interpretação de resultados;
• Exemplos de aplicação.
2 FCUL, Departamento de Química e Bioquímica
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Genómica
• Ciência que estuda o genoma completo de um
organismo.
determinar a sequência completa do DNA de organismos
ou apenas uma sequência de interesse
• Mas estas informações não são suficientes para saber
quais são as proteínas que estão a ser realmente
expressas na célula, num dado momento e numa
determinada condição
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 3
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Genómica funcional
• Ciência que descreve a função de genes e proteínas
• Tenta explicar:
• Função do DNA a nível dos genes;
• Transcrição de RNA (transcriptómica)
• Síntese de proteínas (proteómica)
Genómica funcional ≠ Genómica
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 4
Enquanto a genómica foca-se em
aspetos estáticos tais como:
• Sequenciação de DNA;
• Estudos estruturais
A genómica funcional foca-se em
aspetos dinâmicos tais como:
• Transcrição de um gene;
• Tradução e interações entre
proteínas
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Genómica e Genómica funcional
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Genómica DNA (gene)
RNA
Proteína
Transcrição
Tradução
Transcriptómica
Proteómica
Genómica
funcional
Visão mais abrangente de como uma função biológica surge a partir da
informação codificada a partir do genoma de um organismo
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Um pouco de história…
• 1970 – criação de bases de dados de proteínas usando a
técnica eletroforese bidimensional;
• 1994 – Wilkins e Willians propuseram o tema proteoma
como sendo todo o conteúdo de proteínas expressas por
um genoma;
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 6
Para compreender na totalidade a função génica era necessário o estudo
em larga escala das proteínas expressas
A análise das sequências dos nucleótidos nem sempre reflete uma relação
direta com os níveis de proteínas expressas e consequentemente com a
atividade biológica
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Proteómica
• Ciência que estuda o conjunto de proteínas e as suas
isoformas (que são determinadas pelo genoma) contidas
numa amostra biológica
• Método direto para identificar, quantificar e estudar as
modificações pós-traducionais das proteínas numa
célula;
• É o equivalente proteico do genoma
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• Organismo
• Tecido
• Célula
• Organelo celular
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Proteómica: como surgiu?
• Necessidade de se investigar o controle da expressão
génica e os seus impactos no metabolismo celular;
• Informações importantes como:
• Quais as proteínas que são expressas;
• Os níveis de expressão destas proteínas;
• O momento de expressão destas proteínas;
• Modificações pós-traducionais;
• Interações entre proteínas;
• Respostas expressas pelas células em diferentes situações ou
tratamentos;
• Diferenças moleculares entre linhagens de células.
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 8
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Proteómica vs. Genómica
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 9
• Estudo da estrutura, função e
controlo dos sistemas biológicos
através das propriedades das
proteínas;
• Conhecimento acerca da
abundância, atividade e estrutura
das proteínas expressas por uma
célula
• Não é estática: modifica-se de
acordo com as condições e
estímulos a que um organismo
está exposto
• Estudo apenas da sequência dos
genes (genoma);
• Não elucida muitos dos processos
biológicos;
• Não se obtém dados sobre a
expressão dos genes, a
quantidade expressa e o
funcionamento dos seus
produtos;
• É estática.
Ponte de ligação entre o genótipo e o fenótipo de um organismo
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Fatores que afetam o proteoma duma célula
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Genoma
Proteoma
Interações entre
proteínas
Temperatura
Substâncias químicas
Infeção por organismos patogénicos
Condições ambientais
Expressão génica
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Proteómica: Vantagens e Desvantagens
• Vantagens
• estudo da expressão génica em condições específicas;
• identificação de proteínas que sofrem modificações pós-
traducionais (que não são detetadas por análise do genoma).
• Desvantagens
• Limitações
• Só uma parte das proteínas sintetizadas pode ser detetada
experimentalmente;
• Degradação da amostra.
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 11
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Proteómica: técnicas utilizadas
• Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida • Separação (por carga e massa), deteção e quantificação das
proteínas
• ICAT (isotope-coded affinity tags) • Permite identificar diferenças no conteúdo proteico de duas amostras
• Microarrays de proteína • Interacções das proteínas e as suas funções
• Espectrometria de massa • Fragmentação de proteínas;
• Análise de péptidos;
• Identificação das proteínas (bioinformática).
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Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Preparação da amostra
• Rutura celular através de:
• Métodos químicos (detergentes, solventes orgânicos,
entre outros)
• Métodos físicos (homogeneização com misturador,
agitação mecânica, entre outros)
• Solubilização e desnaturação das proteínas
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Figura 2. Esquema da preparação da amostra.
Figura 1. Homogeneizador
de Potter – Elvehjem.
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Eletroforese 2D – princípios
• Consiste em separar, sob a influência de um campo
elétrico, moléculas carregadas.
• A velocidade de migração depende de:
• Tamanho
• Forma
• Carga elétrica
• Numa eletroforese 2D, as proteínas são submetidas a
duas etapas de separação eletroforética consecutivas:
• Etapa de 1ª dimensão
• Etapa de 2ª dimensão
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 14
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Eletroforese 2D – etapa de 1ª dimensão
• Consiste numa focagem isoelétrica: proteínas são
separadas pela sua carga elétrica através de um
gradiente de pH
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 15
As proteínas migram no gel até atingirem uma posição estacionária,
onde o seu pI é igual ao valor de pH (carga nula)
Figura 3. Primeira dimensão: focagem isoelétrica das proteínas.
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Eletroforese 2D – etapa de 2ª dimensão
• As proteínas são submetidas a uma eletroforese
desnaturante em gel de poliacrilamida – SDS-PAGE;
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As proteínas (carga global negativa) são separadas de acordo com as suas
massas moleculares – proteínas de maiores dimensões migram menos no gel
Figura 4. Segunda dimensão: SDS-PAGE.
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Eletroforese 2D - Equipamento
• Focagem isoelétrica
• SDS-PAGE
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Figura 5. Equipamento utilizado numa
eletroforese de focagem isoelétrica.
Figura 6. Equipamento utilizado numa eletroforese SDS-PAGE.
Unidade de
focagem
isoelétrica Câmara de
focagem
isoelétrica
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Eletroforese 2D – Resultados I
• Os resultados da eletroforese são visíveis através de
vários métodos de deteção:
• Coloração de proteínas
• Corantes (Azul de Coomassie, nitrato de prata, entre outros)
• Reagentes fluorescentes
• Fluorografia ou autoradiografia
• Deteção de proteínas marcadas radioativamente (incorporação de 3H, 14C, 35S, 32P, 33P ou 125I às proteínas)
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 18
Aplicados juntamente com os métodos anteriores
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Eletroforese 2D – Resultados II
• No final da eletroforese 2D obtém-se um gel contendo numerosas
manchas (“spots”) bem separadas, cada uma correspondente a uma
proteína ou a uma forma proteica.
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Figura 7. Eletroforese bidimensional 2D-PAGE utilizado na análise de proteomas.
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Eletroforese 2D – vantagens e desvantagens
Vantagens
• Boa resolução para proteínas;
• Deteção de modificações pós-
traducionais;
• Comparações quantitativas;
• Boa avaliação visual para
amostras pouco complexas
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 20
Desvantagens
• Limitado pelo intervalo de pH;
• As proteínas pouco abundantes
são de difícil deteção;
• Quando a quantidade de
proteínas é muito elevada a
resolução é baixa
• Análise e quantificação são
difíceis.
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Eletroforese 2D – Exemplo
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 21
Figura 8. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. albicans na faixa de pH de 3 a 10 com
tratamento com fluconazol na concentração de 1400 µg/mL em géis corados pelo azul de Coomassie.
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Eletroforese 2D – Exemplo
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 22
Figura 9. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. albicans com tratamento com fluconazol na
concentração de 1400 µg/mL, visão ampliada das proteínas alteradas.
Alterações verificadas:
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ICAT
• O método utiliza 2 marcações:
• Marcador leve
• Marcador pesado (átomos de H são substituídos por D)
• O marcador é constituído por:
a) Um grupo químico que reage com os grupos específicos das
proteínas (por exemplo: se reagir com o grupo tiol, o marcador
liga-se a todas as cisteínas na proteína)
b) Grupo biotina
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Figura 10. Estrutura de um reagente ICAT especifico para os grupos tiol das proteínas.
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ICAT – Como aplicar?
1. Aplicar o marcador leve a uma das amostras e o marcador pesado a outra;
2. Clivar as proteínas com tripsina (Atenção: os fragmentos com cisteína continuam marcados!)
3. Juntar os dois extratos proteicos;
4. Cromatografia de afinidade (liga a biotina da molécula de ICAT e portanto os fragmentos de interesse)
5. Obtém-se uma mistura idêntica de péptidos (os péptidos de cada amostra diferem 8 Da)
6. Espectrometria de massa
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Sinais aos pares, separados por 8 unidades de
massa, com a mesma abundância
A não ser que a proteína esteja a ser expressa em
diferentes quantidades nas amostras
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ICAT – Estratégia (I)
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As proteínas isoladas de uma célula
saudável são tratadas com o
marcador leve (amostra de controlo)
enquanto as proteínas isoladas de
uma célula doente são tratadas com o
marcador pesado
Os péptidos marcados com ICAT são
separados dos outros péptidos por
cromatografia de afinidade
Figura 11. Estratégia de atuação do ICAT.
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ICAT – Estratégia (II)
• Espectrometria de massa
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 26
Quantificação de proteínas Identificação de proteínas
• Cromatografia liquida de afinidade
Figura 12. Exemplos de cromatograma e de espectro obtido por cromatografia liquida de afinidade e
espectrometria de massa, respetivamente.
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ICAT – Exemplo (Proteoma de T. Cruzi)
• Doença de Chagas (Chaguismo)
• Também conhecida por tripanossomíase americana;
• É uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 27
Figura 13. Exemplo esquemático de estratégia utilizada
para o estudo de proteoma. (Retirado de Kalume et al. 2005)
Resultados:
Expressão conservativa entre as
formas evolutivas epimastigota,
tripomastigota e amastigota.
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
ICAT – Exemplo (Proteoma de T. Cruzi)
• MAS…
• O número de proteínas focalizadas no gel e o número de
identificações obtidas representaram uma pequena parte de todo o
proteoma de cada forma evolutiva.
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 28
ICAT – análise quantitativa das proteínas
das formas tripomastigota e amastigota
29 proteínas com níveis ~ de expressão
9 proteínas predominantes na forma tripomastigota
3 proteínas predominantes na forma amastigota
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Espectrometria de massa – I
• O espectrómetro é um aparelho complexo que:
• Vaporiza os compostos a analisar;
• Produz iões (em fase gasosa);
• Separa iões de acordo com a sua razão massa/carga (m/z).
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 29
Obtém-se um gráfico da abundância
dos iões a cada razão m/z obtida
• É constituído por:
• Sistema de introdução da amostra (input);
• Fonte de iões (câmara de ionização);
• Analisadores (separação dos iões);
• Detetor de iões;
• Sistema de tratamento de dados. Figura 14. Espectrómetro de massa.
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Espectrometria de massa – II
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Sistema de
introdução da
amostra
Fonte iónica
(iões em fase
gasosa)
Analisador
(Separação dos
iões)
Detetor
(deteção dos
iões)
Sistema de
dados
(tratamento de
dados)
Espetro de massa
Vácuo
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Espectrometria de massa – III
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Câmara de
Ionização
Campo
magnético
Campo
elétrico
Figura 15. Espectrómetro de massa e todos os seus principais componentes.
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Espectrometria de massa - Fonte iónica (I)
• Na análise de proteínas, a fonte de iões mais utilizada é:
• MALDI (matrix-assisted laser desorption/ ionisation)
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Porquê? A amostra é misturada com a matriz (composto
orgânico conjugado).
As matrizes são projetadas de forma a ter um máximo
de absorção ao comprimento de onda do feixe do laser.
O laser causa a excitação e a vaporização do solvente
e a amostra fica na fase gasosa.
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Espectrometria de massa - Fonte iónica (II)
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Desvantagens
• Se a concentração da solução
é desconhecida, é necessário
realizar diluições em série da
amostra
Melhores resultados na gama de
concentrações 0,1-10 pmol mm-3
Vantagens
• Método de ionização suave;
• Como a matriz absorve quase
toda a radiação, aumenta a
probabilidade da amostra ficar
ionizada sem fragmentar
• Produção de iões de massa
molecular elevada com
elevada sensibilidade;
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Espectrometria de massa – analisador (I)
• Na análise de proteínas, o analisador mais utilizado é:
• TOF (“time of flight”)
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Porquê? • Os iões entram num tubo de voo em que os iões
mais leves migram mais rapidamente, chegando em
primeiro lugar ao detetor.
• Os iões são separados com base na razão m/z, uma
vez que é aplicado, ao mesmo tempo inicial, o
mesmo potencial
• Vantagens:
• Virtualmente, não existe limite de massa molecular para amostra
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Espectrometria de massa – MALDI-TOF (I)
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 35
Figura 16. Esquema do funcionamento da espectrometria de massa MALDI-TOF.
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Espectrometria de massa – MALDI-TOF (II)
• Desvantagem: esta técnica é afetada por corantes, sais,
tampões ou detergentes (iónicos ou não iónicos)
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 36
Remover estes compostos por:
• Lavagem;
• Diálise;
• Resinas de troca iónica;
• Cromatografia de pipeta (cromatografia de fase
reversa em que a amostra se liga ao interior da
pipeta enquanto os sais não, a amostra é depois
removida com solventes orgânicos, exemplo:
acetonitrilo 50-75%)
Figura 17. Cromatografia de pipeta.
Solução?
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Análise quantitativa de complexos proteicos
• A análise do proteoma envolve os seguintes passos:
1. Corrida em gel (eletroforese unidimensional ou bidimensional);
2. Corar a amostra (ex: azul de Coomassie);
3. Encontrar as proteínas de interesse
4. Extrair e clivar as proteínas
5. Análise da massa dos resultados
6. Procurar correspondências numa base de dados
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 37
• Ferramenta Mascot de Matrix Science
• Protein prospector
• NCBInr
• Ferramenta SwissProt do Expasy
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Espectrometria de massa – exemplo
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 38
Figura 18. Exemplo de espectro obtido por espectrometria de massa
para a parvalbumina de jacaré.
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Aplicações da Proteómica
• Mining de Proteomas
• Perfil de expressão de proteínas
• Identificação de interações proteína-proteína
• Mapeamento de modificações de proteínas
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 39
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Mining de Proteomas
• Objetivos:
• Identificar o maior número possível de componentes do proteoma
• Catalogar todo o proteoma duma célula, num dado momento
• Interesse:
• Estudar as mudanças na composição proteíca dos proteomas
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 40
Associadas a doenças num organismo
Utilidade como marcadores de diagnóstico
(biomarcadores)
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Perfil de Expressão de Proteínas - I • Objetivo:
• Medir a expressão de um conjunto de proteínas em duas amostras
e depois compará-los
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 41
Detetar e identificar as
mesmas proteínas nas duas
amostras
Ferramenta bioinformática:
MelanieTM
• interface para visualizar, explorar e analisar as imagens do gel
de electroforese 2D
• identificar os marcadores de proteína de interesse através de
análise de expressão diferencial
MelanieTM
Problemas
• Este método pode indicar apenas o nível do produto do gene por
si só e não a forma como as proteínas são modificadas
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MelanieTM – Output
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 42
Análise:
• Presença ou ausência de spots
• Volume dos spots: quantificação
relativa
• Posição dos spots: modificações
pós-traducionais
Figura 20. Aspecto de um output do programa MelanieTM.
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Identificação de interações proteína-proteína
• Imunoprecipitação
• Utilização de anticorpos monoclonais para remover a proteína de
interesse
• Phage Display (“Exibição de fagos”)
• Através da utilização de fagos (ex. M13) permite o rastreio dos clones
obtidos devido à ligação do fenótipo (o péptido de interesse) com o
genótipo (o vetor de clonagem) que o expressou.
• The Yeast Two Hybrid System (“Sistema do duplo híbrido”)
• Permite detectar in vivo interacções proteína-proteína – através de
um ativador transcricional que leva à expressão de um gene
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 43
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Mapeamento das modificações da proteína – I
• Mapear as MPTs = identificar em que resíduo se
encontra a alteração
• Essa alteração pode ser (entre outras):
• Fosforilação – adição de um grupo fosfato (PO4) a um aminoácido
• Acetilação – introdução um grupo funcional acetil
• Alquilação – transferência de um grupo alquilo
• Metilação – substituição de H por um grupo metil (CH3).
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 44
Espectrometria
de massa
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Contribuições da Proteómica
• Tendo em conta todas as aplicações da proteómica, esta
pode ser aplicada a:
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 45
Estudo de agentes
infecciosos
Desenvolvimento
de novos fármacos
Marcadores de
diagnóstico
(biomarcadores)
Cancro
Doença de Alzheimer
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Conclusão
• A proteómica é um método direto
amplamente utilizado para identificar,
quantificar e estudar as modificações
pós-traducionais das proteínas de uma
célula;
• As técnicas mais utilizadas são a
eletroforese bidimensional e a
espectrometria de massa;
• As suas aplicações são vastas;
• Os seus contributos para o
desenvolvimento de novos fármacos e
de marcadores de diagnóstico são de
grande importância.
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 46
Figura 22. Interação entre as proteínas da célula
de levedura.
Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013
Bibliografia
• Wilson, K., & Walker, J. (2005). Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology
(6th edition). Cambridge: Cambridge University Press;
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Humana Press Inc.;
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biomarkers (2010). Proteome Science;
• O’Farrel, P. H. High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins (1975). J. Biol. Chem.
(250, 4007–4021);
• Silva, A. M. S., Corrêa, G. C., & Reis, E. M. Proteomica – Uma abordagem funcional do estudo do
genoma. Universidade do Grande Rio;
• Latterich M., Abramovitz M., & Leyland-Jones, B. Proteomics: New technologies and clinical
applications (2008). European Journal Of Cancer 44 (2008) 2737–2741;
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• http://www.scielo.br/pdf/cr/v40n3/a479cr1680.pdf;
• http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio07/analise.pdf;
• http://www.e-escola.pt/ftema.asp?id=116&canal=5
• http://www.posgraduacao.fcfar.unesp.br/biociencias/Disertacoes/2008/liliana_scorzoni-completo.pdf
• http://www.dionex.com/en-us/webdocs/5475-5475_AN520_V16.pdf
FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 47