ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT - taurus.unicamp.brtaurus.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/331870/1/Kmit_ArthurHenriquePe... · experimentos e cultura de células, ... formando monocamadas

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT

AVALIAÇÃO DOS FÁRMACOS VX-809 E VX-770 NA FUNÇÃO DA

CFTR E A FUNÇÃO DE CANAIS ALTERNATIVOS DE CLORETO EM

CÉLULAS PRIMÁRIAS EPITELIAIS DAS VIAS AÉREAS DE

PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA

CAMPINAS

2018


AVALIAÇÃO DOS FÁRMACOS VX-809 E VX-770 NA FUNÇÃO DA

CFTR E A FUNÇÃO DE CANAIS ALTERNATIVOS DE CLORETO EM

CÉLULAS PRIMÁRIAS EPITELIAIS DAS VIAS AÉREAS DE

PACIENTES COM FIBROSE CÍSTICA

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos

requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em

Ciências Médicas, Área de Concentração Ciências

Biomédicas.

ORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª Margarida Sofia Pereira Duarte Amaral

CO-ORIENTADORA: Prof.ª Dr.ª Carmen Sílvia Bertuzzo

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO

ARTHUR HENRIQUE PEZZO KMIT, E

ORIENTADO PELA PROF.ª DR.ª MARGARIDA

SOFIA PEREIRA DUARTE AMARAL

CAMPINAS

2018

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO


ORIENTADOR: MARGARIDA SOFIA PEREIRA DUARTE AMARAL

COORIENTADOR: CARMEN SÍLVIA BERTUZZO

MEMBROS:

1. PROF. DR. MARGARIDA SOFIA PEREIRA DUARTE AMARAL

2. PROF. DR. JACKSON DE SOUZA MENEZES

3. PROF. DR. LUIZ VICENTE RIBEIRO FERREIRA DA SILVA FILHO

4. PROF. DR. CARLA BEATRIZ COLLARES BUZATO

5. PROF. DR. ANDRE ALMEIDA SCHENKA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: DATA DA DEFESA [20/02/2018]

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Luiz Carlos Kmit e Vania Aparecida Pezzo Kmit que dignamente

me apresentaram à importância da família e o caminho da honestidade e persistência.

À mulher da minha vida Cínthia Fernandes Kmit pelo apoio incondicional em

todos os momentos, principalmente nos de incerteza, muito comuns para quem tenta trilhar

novos caminhos.

Sem vocês nenhuma conquista valeria a pena.

E, a todos os pacientes fibrocísticos do mundo, em especial os do Brasil, este

trabalho é para vocês.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais Luiz Carlos Kmit e Vania Aparecida Pezzo Kmit, meus primeiros

e maiores exemplos de amor, perseverança, bondade, honestidade e força. Por sempre me

ensinar a agir com respeito, simplicidade, dignidade, honestidade e amor ao próximo. A

minha melhor amiga, minha esposa Cínthia Fernandes Kmit, pelo amor, apoio, dedicação e,

especialmente, a paciência que você sempre teve por mim. A minha irmã, Maria Carolina

Pezzo Kmit, pelo carinho, apoio, união e companheirismo. E a toda minha família, sobrinho,

avós, tios, primos, sogro, sogra, cunhados pelo apoio e carinho demonstrando em todos os

momentos.

Em especial a minha orientadora Profa. Dra. Margarida Sofia Pereira Duarte

Amaral, pela oportunidade. Por ter me recebido tão prontamente em seu laboratório em

Lisboa – Portugal. Por aceitar minhas decisões, que nem sempre são fáceis. É uma grande

honra ter em minha história a sua presença de professora, guia científico e por despertar, em

mim, um senso crítico científico. Por ter proporcionado momentos de discussão, crescimento

e muito aprendizado em nossas conversas e reuniões. Admiro sua paixão pela ciência, em

especial pela fibrose cística, na busca de conhecimento, doação, entusiasmo e se importando

tanto com o bem estar dos pacientes e familiares. Deixo aqui uma pequena homenagem. Todo

o meu respeito e admiração.

A Profa. Dra. Carmen Sílvia Bertuzzo, minha co-orientadora. Agradeço por me

ajudar em todos os momentos difíceis que passei no decorrer desse doutorado. De me ensinar

a me portar, de me acalmar e ajudar em todos os momentos de maior estresse e

principalmente de nunca falar não e sempre apoiar minhas decisões. Obrigado por estar

sempre presente. Meus sinceros agradecimentos, respeito e admiração.

Ao Prof. Dr. Antônio Fernando Ribeiro, meu co-orientador. Agradeço por

disponibilizar o LAFIC para o desenvolvimento do meu trabalho. Por todas as conversas,

apoio, ensinamentos e discussões. Das conversas e risadas nas viagens para buscar os pulmões

em São Paulo, independente do horário e dia. Do auxilio com os pacientes no ambulatório

para a realização das coletas. De abrir novos horizontes para a pesquisa na fibrose cística no

Brasil. E principalmente pelo apoio e confiança em meu trabalho. Meus sinceros

agradecimentos, respeito e admiração.

Minha gratidão a minha amiga de trabalho, Dra. Adriana Mendes Vinagre, por

toda ajuda no desenvolvimento do meu trabalho, experimentos, coletas, protocolos, cultura de

células. Obrigado por todas as conversas, risadas, apoio e trabalho. Sem você esse trabalho

não seria realizado. A Dra. Juliana Moreira pela amizade e ajuda no início do meu doutorado.

A estagiária, agora aluna de mestrado, Gabriela da Silva Leite, pela ajuda no LAFIC, nos

experimentos e cultura de células, e por ter proporcionado a minha primeira coorientação de

TCC.

Agradeço ao biólogo Paulo César Alves pela ajuda, empréstimo de materiais,

disponibilização de equipamentos e disponibilidade sempre que necessária. À bióloga

Amanda Roberta Almeida pela ajuda e contribuições nas culturas de células no Laboratório

Multiusuário.

Agradeço ao Dr. Fernando Augusto Lima Marson, pela ajuda neste último ano de

doutorado. Muito obrigado por todas as correções, sugestões e ensinamentos na minha

formação de doutor.

Minha gratidão aos que fizeram parte desta trajetória, professores, doutores,

funcionários, alunos e colegas. Aos funcionários do CIPED e do ambulatório de fibrose

cística do HC. Em especial, Dra. Maria de Fátima Corrêa Pimenta Servidoni, Dra. Maíra

Assumpção, Dra. Aline Gonçalves, Ms. Stephanie Villa-Nova Pereira e Renata Guirau que

participaram e me ajudaram neste trabalho.

Aos professores Dr. José Dirceu Ribeiro, Dra. Adyléia Aparecida Dalbo Contrera

Toro, Dra. Carla Beatriz Collares Buzato pelas contribuições realizadas na qualificação deste

doutorado.

Aos professores Dr. Jackson Menezes, Dr. Luiz Vicente Ribeiro Ferreira da Silva

Filho, Dra. Carla Beatriz Collares Buzato, Dr. André Schenka por aceitarem serem membros

titulares da banca deste doutorado. Aos professores Dra. Marilda de Souza Gonçalves e Dr.

Paulo José Cauduro Marostica por aceitarem serem membros suplentes da banca deste

doutorado.

O meu muito obrigado a todos os pacientes que participaram dos estudos, doando

as suas células, sem vocês nunca seria possível à realização desse trabalho.

As agências de fomento, Fapesp, Capes, Faepex, Ciência sem Fronteiras, e outras que

participaram do financiamento desta pesquisa e da bolsa de estudos concedida na realização

do doutorado e a Universidade Estadual de Campinas – Unicamp.

RESUMO

Introdução: A fibrose cística (FC) é uma doença autossômica recessiva que afeta mais de 85 mil

pessoas em todo o mundo e pouco menos de 4 mil no Brasil, que é o 7º país com mais pacientes

registrados. Pacientes fibrocísticos sofrem com a complexidade e gravidade da doença, com uma

sobrevida média de 12 anos no Brasil e 30 anos em países desenvolvidos. A FC é consequência de

mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), que codifica uma

proteína transmembranar de mesmo nome, expressa na membrana apical de células epiteliais. Atuando

como um canal de cloreto e bicarbonato, a proteína CFTR é essencial para manutenção e equilíbrio

hidro salino do líquido superficial nos tecidos epiteliais. O déficit de sua função ou sua ausência

provoca a desidratação e acidificação deste líquido que gera diversas complicações nos órgãos

relacionados, principalmente no pulmão causando acumulo de muco e criando um ambiente favorável

para adesão e proliferação de patógenos, que leva a perda de função pulmonar e uma morte prematura

do paciente com FC. Atualmente, foram desenvolvidos fármacos moduladores da CFTR, que corrigem

a função deficiente na FC e promovem melhoras no fenótipo dos pacientes fibrocísticos. Fármacos

candidatos foram avaliados em estudos in vitro de células primárias de pacientes FC e apresentaram

eficácia para algumas mutações do gene CFTR, que seguido de testes clínicos, possibilitaram a

formulação dos medicamentos Ivacaftor® (VX-770), Lumacaftor

® (VX-809), Orkambi

® (VX-809 +

VX-770) Tezacaftor®

(VX-661) e Symdeko® (VX-661 + VX-770). Objetivo: Avaliar a função da

CFTR e a ação de fármacos moduladores da CFTR (VX-809 e VX-770), e a função de canais de

cloretos alternativos. Métodos: Foram isoladas e cultivas células HBE oriundas de 5 lóbulos

pulmonares, e células epiteliais traqueais (HTE) foram isoladas de um fragmento traqueal. Também

foram isoladas e cultivas células HNE de 23 pacientes. Após a manutenção dessas células em cultura,

elas foram cultivadas em filtros de membrana poliéster em interface ar-líquido (ALI) para

diferenciarem e polarizarem, formando monocamadas celulares confluentes. Os fármacos da CFTR,

corretor VX-809 e potenciador VX-770, foram analisados na Câmara de Ussing pelo protocolo de

quantificando a secreção de Cl- mediada pelo canal CFTR, nas células HNE e HBE dos pacientes

estudados. Resultados: A técnica da análise de função da CFTR em células HBE e HNE

diferenciaram estatisticamente a atividade da CFTR de pacientes não FC e FC. As análises nas células

HNE também diferenciaram pacientes não FC (wt/wt) de pacientes não FC portadores (fc/wt). A

avaliação da ação dos fármacos foi baseada nas funções basais da CFTR (100%) de pacientes não FC

(wt /wt). A ação do VX-809, VX-770 e dos dois combinados, VX809 + VX-770, foram positivas em

células HBE e HNE dos pacientes FC. Sendo assim, a função da CFTR basal e modulada pelos

fármacos, varia de paciente para paciente, mesmo aqueles que apresentavam a mesma mutação. No

presente trabalho, foi evidenciado que células HBE e HNE são ferramentas importantes para

quantificação individual da ação dos fármacos moduladores da CFTR. Baseadas nessas premissas

foram testadas as funções da CFTR em células HNE de 12 pacientes F508del / F508del em relação a

dois polimorfismos em dois genes, (SNP rs7512462 no gene SLC26A9 e o SNP rs3788766 no gene

SLC6A14). O SNP rs7512462 demonstrou modular positivamente a função da CFTR e a ação do VX-

809 e/ou VX-770 nas células HNE. Já no outro SNP, o rs3788766, demonstrou modular positivamente

a função basal da CFTR. Na investigação de alternativas na correção do defeito de transporte iônico no

epitélio FC, foi analisada a função da TMEM16A nas células HBE e HNE pela sua ativação com o

ATP, e foi comprovada a presença deste canal pela sua inibição com o uso do inibidor específico de

TMEM16s, o CaCCinh-AO1. A função da TMEM16A é independente da função da CFTR, e também

da ação dos fármacos moduladores, VX-809 e/ou VX-770, demonstrando ser um alvo potencial para

regular o transporte de Cl- nas vias aéreas de pacientes com FC, a ser somado com o tratamento dos

fármacos na FC. Conclusão: A cultura primária de células epiteliais brônquicas e nasais

demonstraram serem ferramentas importantes para a realização de estudos de função da CFTR, ação

de fármacos moduladores da CFTR, polimorfismos em genes moduladores da CFTR e/ou FC e de

canais alternativos para a correção do transporte iônico no epitélio da FC. Tal estratégia parece ser

relevante para aplicar a medicina personalizada.

Palavras-chave: CFTR; Fibrose Cística; Mutação; Genética; Vias aéreas; Fármacos moduladores;

VX-809; VX-770; ENaC; CaCC; Cloreto; Bicarbonato; TMEM16A; SLC26A9; Câmara de Ussing.

ABSTRACT

Introduction: Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease affecting more than 85,000

people worldwide and just under 4,000 in Brazil, which is the 7th country with the most registered

patients. Fibrocystic patients suffer from the complexity and severity of the disease, with an average

survival of 12 years in Brazil and 30 years in developed countries. CF is a consequence of mutations

in the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductivity Regulator) gene, which encodes a

transmembrane protein of the same name, expressed on the apical membrane of epithelial cells. Acting

as a chloride and bicarbonate channel, CFTR is essential for the maintenance and hydro saline balance

of surface fluid in epithelial tissues. The deficit of its function or its absence causes the dehydration

and acidification of this liquid that generates several complications in the related organs, mainly in the

lung causing accumulation of mucus and creating a favorable environment for adhesion and

proliferation of pathogens, which leads to loss of pulmonary function and a premature death of the CF

patient. Currently, CFTR modulating drugs have been developed that correct CF deficient function

and promote improvements in the phenotype of fibrocystic patients. Candidates drugs were evaluated

in in vitro studies of CF patients' primary cells and showed efficacy for some mutations of the CFTR

gene, which followed the clinical trials, allowing the formulation of the drugs Ivacaftor® (VX-770),

Lumacaftor® (VX-809) , Orkambi

® (VX-809 + VX-770) Tezacaftor

® (VX-661) and Symdeko

® (VX-

661 + VX-770). Objective: To evaluate the function of CFTR and the action of CFTR modulating

drugs (VX-809 and VX-770), and the function of alternative chloride channels. Methods: Bronchial

epithelial cells (HBE) from 5 lung lobes were isolated and cultured, and tracheal epithelial cells (HTE)

were isolated from a tracheal fragment. Nasal epithelial cells (HNE) cells from 23 patients were also

isolated and cultured. After maintenance of these cells in culture, they were grown on air-liquid

interface (ALI) polyester membrane filters to differentiate and polarize, forming confluent cell

monolayers. CFTR drugs, VX-809 and VX-770 were analyzed in the Ussing Chamber by the

quantification protocol of Cl-mediated by the CFTR channel in the HNE and HBE cells of the patients

studied. Results: The technique of CFTR function analysis in HBE and HNE cells statistically

differentiated CFTR activity from non-CF and CF patients. Analyzes in HNE cells also differentiated

non-CF patients (wt/wt) from non-CF patients (cf/wt). The evaluation of drug action was based on

baseline CFTR functions (100%) of non-CF patients (wt/wt). The action of VX-809, VX-770 and the

two combined, VX809+VX-770, were positive in HBE and HNE cells of FC patients. Thus, the

function of baseline and drug-modulated CFTRs varies from patient to patient, even those with the

same mutation. In the present work, it was evidenced that HBE and HNE cells are important tools for

individual quantification of the action of the CFTR modulating drugs. Based on these assumptions, the

functions of CFTR in HNE cells from 12 F508del/F508del patients were tested for two

polymorphisms in two genes (SNP rs7512462 in the SLC26A9 gene and SNP rs3788766 in the

SLC6A14 gene). SNP rs7512462 has been shown to modulate positively the function of CFTR and the

action of VX-809 and/or VX-770 on HNE cells. In the other SNP, rs3788766, it was shown to

modulate the basal function of CFTR. In the investigation of alternatives in the correction of the ionic

transport defect in the CF epithelium, the function of TMEM16A in HBE and HNE cells was analyzed

for its activation with ATP, and the presence of this channel was confirmed by its inhibition with the

use of the specific inhibitor of TMEM16s, CaCCinh-AO1. The function of TMEM16A is independent

of the function of CFTR and the action of modulating drugs, VX-809 and/or VX-770, proving to be a

potential target for regulating the transport of Cl- in the airways of CF patients, be added to the

treatment of CF drugs. Conclusion: The primary HBE and HNE cells has been shown to be important

tools for the study of CFTR function, CFTR modulating drugs, polymorphisms in CFTR and/or CF

modulating genes and alternative channels for the correction of ionic transport in the CF epithelium.

Such a strategy seems to be relevant in applying personalized medicine.

Keywords: CFTR; Cystic fibrosis; Mutation; Genetics; Airways; Modulating drugs; VX-809;

VX-770; ENaC; CaCC; Chloride; Bicarbonate; TMEM16A; SLC26A9; Ussing chamber..

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema representativo da estrutura da proteína CFTR. A. Estrutura linear. B. A

proteína CFTR expressa na membrana lipídica, composta de dois domínios de abrangência da

membrana (MSD1 e MSD2) compostos por seis segmentos transmembranares cada (TM1 a

TM12) e conectados a respectivo domínio de ligação dos nucleotídeos (NBD1 e NBD2). O

domínio R liga a primeira metade (MSD1 e NBD1) com a segunda metade (MSD2 e NBD2).

O canal abre quando o domínio R é fosforilado pela proteína quinase A (PKA) estimulada

pelo monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) e quando o ATP liga nos NBDs (Modificado

de: Ratjen, et al., 2015). ........................................................................................................... 31

Figura 2. Esquema representativo do ciclo da doença na FC em células brônquicas. CFTR:

Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; ENaC: Canais epiteliais de sódio;

Na+: Sódio; Cl

-: Cloreto (Modificado de: De Boeck, et al., 2016). .......................................... 32

Figura 3. Esquema representativo do ciclo de obstrução em glândulas na fibrose cística (FC).

A. Tecido normal e B. tecido FC. LSA: liquido superficial aerífero; HCO3-: Bicarbonato; Cl-:

Cloreto; Na+: Sódio (Modificado de: Ratjen, et al., 2015). ...................................................... 33

Figura 4. Modelagem molecular baseados em cristalografia da proteína CFTR indicando o

local que ocorre a mutação F508del. A. CFTR completo MSD1 (domínio de abrangência da

membrana 1), azul; MSD2 (domínio de abrangência da membrana 2), amarelo; NBD1

(domínio de ligação dos nucleotídeos 1), ciano; NBD2 (domínio de ligação dos nucleotídeos

2), laranja; Domínio R, verde; F508del, vermelho; B. Posição da F508 no NBD1 (Modificado

de: Molinski, et al., 2012)......................................................................................................... 34

Figura 5. Esquema representativo da classificação funcional, para uma melhor estratégia de

tratamento na fibrose cística, de sete diferentes classes funcionais do CFTR. Comparação da

célula com o CFTR normal, expresso na membrana apical de células epiteliais e a sua

condutividade de íons de cloreto (Cl-),

com as células de CFTR mutado, resumindo o defeito,

exemplo de mutações, terapia corretiva e fármaco (droga) utilizado (Modificado de: De

Boeck, et al., 2016). .................................................................................................................. 35

Figura 6. Modelos de estudos para uma medicina personalizada na terapêutica FC. Tecidos

coletados de diferentes órgãos, afetados pela FC, dos pacientes que são usados para gerar

culturas de células 2D e culturas esferoides 3D ou analisados como tecido montado. Foram

desenvolvidos protocolos para a geração de culturas esferoides dos epitélios nasais,

brônquicos e retais. As culturas 2D são estabelecidas para células humanas das vias aéreas e

os tecidos epiteliais intesteinais humano (Modificado de: Cholon & Gentzsch, 2017). .......... 41

Figura 7. Deficiência no transporte de íons epiteliais e a defesa prejudicada do hospedeiro nas

vias aéreas de FC. A. Vias aéreas não FC: a secreção coordenada de sal e água conduzida pelo

CFTR em conjunto com os canais alternativos de cloreto TMEM16A e SLC26A9 e a

absorção pelo canal epitelial de sódio ENaC, resultam na hidratação adequada da camada de

liquido superficial aerífero (LSA) essencial para uma limpeza mucociliar efetiva. Além disso,

a secreção de bicarbonato mediada pelo CFTR contribui para a regulação do pH. B. Vias

aéreas FC: o mau funcionamento da CFTR prejudica a secreção de Cl- / HCO3- levando a

desidratação e acidez do LSA e um muco hiperconcentrado. A desidratação da LSA é ainda

agravada pelo aumento da absorção de sódio / H2O mediada pelo ENaC. Como resultado, a

limpeza mucociliar e a morte bacteriana são prejudicadas, tornando as vias aéreas FC

vulneráveis para infecção e inflamação (Modificado de: Mall & Gallieta, 2015). .................. 44

Figura 8. Estratégias farmacológicas em canais iónicos na fibrose cística. A. Dependendo dos

mecanismos moleculares subjacentes, o resgate farmacológico de função da CFTR mutante

pode ser corrigido por potenciadores, corretores e agentes de leitura. Estratégias para

compensar o mau funcionamento da CFTR incluem a ativação dos canais alternativos de

cloreto B.TMEM16A e C. SLC26A9. Em princípio, esses alvos alternativos poderiam ser

ativados por moduladores de tráfico que aumentam o número de canais de cloreto e/ou por

ativadores que aumentam a probabilidade de abertura desses canais na membrana plasmática

apical. D. Além disso, a inibição da absorção de sódio / H2O mediada pelo ENaC, seja

inibindo a sua ativação proteolítica por inibidores de protease ou por inibição direta do canal

por bloqueadores de ENaC podem ser usadas como uma estratégia para neutralizar a

desidratação da superfície das vias aéreas FC (Modificado de: Mall & Gallieta, 2015). ........ 45

Figura 9. Transporte de L-arginina do líquido superficial aéreo (LSA) pela SLC6A14

contribui para a defesa do hospedeiro, reduzindo a ligação da P. aeruginosa (PA) à membrana

apical das células epiteliais das vias aéreas. O transportador de aminoácidos SLC6A14 (caixa

roxa sólida) medeia à absorção de L-arginina em células epiteliais ciliadas no pulmão.

Quando a SLC6A14 é disfuncional (caixa roxa tracejada) devido à variação genética (por

exemplo, polimorfismos), a L-arginina é acumulada no LSA e aumenta a fixação da P.

aeruginosa na superfície das células epiteliais (Modificado de: Di Paola, et al.,2017). .......... 47

Figura 10. Células Primárias Humanas Epiteliais Brônquicas – HBE. A. Lóbulo pulmonar B.

Arvore brônquica após a remoção das partes aderentes (limpo) C. Células primárias epiteliais

brônquicas em placas p-100 (Aumento de 20 vezes). D. Células epiteliais brônquicas com

100% de confluência em filtros de membrana porosa de poliéster Corning® Costar®

Snapwell (Aumento de 10 vezes). ............................................................................................ 51

Figura 11. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) em células primárias

epiteliais nasais e brônquicas humanas. A. Ilustração representativa da inserção do eletrodo

chopstick nos filtros de membrana porosa para a realização das medições TEER. B. Aparelho

Milicell® ERS-2, eletrodo chopstick e placa de 6 poços contendo os filtros de membrana

porosa de poliéster Corning® Costar

® Snapwell (Modificado de: Ebrary, 2018). ................... 52

Figura 12. Imagens em objetiva 10X da co-cultura das células primárias epiteliais nasais com

os fibroblastos NIH/3T3. Tripsinização diferenciada das células HNE e dos fibroblastos: A.

Células HNE mais os fibroblastos em co-cultura e B. após a adição da tripsina EDTA (1X)

por 90s à 37ºC, os fibroblastos foram descolados, restando apenas células HNE aderidas aos

frascos T25. .............................................................................................................................. 55

Figura 13. Câmara de Ussing de perfusão contínua micro modificada. .................................. 56

Figura 14. Duas Microcâmaras de Ussing com sistema de perfusão contínua comum,

montadas em gaiola de Faraday................................................................................................ 57

Figura 15. Circuito elétrico na Câmara de Ussing em condições de circuito-aberto. ............. 58

Figura 16. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células

HBE do paciente Pul3 (? / ?) . A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras

de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros

Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809.

Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE

incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=6–9). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de

Student bicaudal. p < 0,05. ....................................................................................................... 62


HBE do paciente Pul4 (c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação

da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE),

cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de

DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de

Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). ....................... 63


HBE do paciente Pul5 (F508del / c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs)). A. ΔIsc-eq-FSK do

protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais

brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas

por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos,

analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-

809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de Student bicaudal. p < 0,05. ............. 64


HBE do paciente Pul11 (F508del / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em

Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em

filtros Corning® Costar

® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-

809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células

HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T

de Student bicaudal. p < 0,05. .................................................................................................. 65


HBE do paciente Pul12 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras

de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros



incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de

Student bicaudal. p < 0,05. ....................................................................................................... 66


HTE do paciente Traq4 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras

de Ussing, de células primárias epiteliais traqueais humanas (HTE), cultivadas em filtros



incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3 – 6). .................................................................. 67

Figura 22. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes

sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais

brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5

e Pul11 (FC), incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-

FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR

com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-

809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto) e (n=3–9). Diferença significativa avaliada pelo

Teste T de Student p<0,05; #: Pul3 comparada com todos os outros grupos; *: VX-770 do

Pul4 comparada com o Pul5 e do Pul5 comparada com o Pul11; **: VX-809 do Pul4

comparada com os grupos Traq4, Pul5 e Pul11; ***: VX-809 do Pul5 comparada com os

grupos Traq4 e Pul12; $: Diferença significativa do VX-809 do Pul11 comparada com os

grupos Traq4 e Pul12. ............................................................................................................... 68

Figura 23. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas

das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK -

µA/cm2) avaliadas em células epiteliais brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes

Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11 (FC), incubadas por 48hs com DMSO

(0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da

CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de

Ussing. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770

(preto). (n=3–9). ....................................................................................................................... 68

Figura 24. Gráfico em barras das correntes de curto circuitos (ΔIsc-eq - µA/cm2) sensíveis a

Forscolina (FSK 2µM) em células primárias epiteliais nasais (HNE) dos pacientes da segunda

etapa (PX01 – F508del/F508del; PX02 – F508del/WT; PX03 – wt/wt; PX04 – wt/wt; PX05 –

F508del/R1066C), geradas pelo protocolo de ativação da função da CFTR, em Câmaras de

Ussing cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell. Filtros pré-incubados por 48hs

com DMSO (0,05%). n=3-6. #,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T

de student bicaudal (p<0,05). ................................................................................................... 73

Figura 25. Imagens das células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas nos filtros

Corning® Costar® Snapwell. A. Filtro sem muco. B. Presença do muco sob as células HNE.

Aumento com objetiva de 10X. ................................................................................................ 73



nasais (HNE) de dois pacientes não FC (wt/wt), dois pacientes não FC heterozigotos

(wt/F508del) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou

VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela

forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. A.

Comparação dos ΔIsc-eq-FSK das HNE dos pacientes por grupo de genótipos: wt/wt; wt

F508del; F508del/F508del. B. Porcentagem de função da CFTR nas HNE dos pacientes por

grupo de genótipos: F508del/F508del e wt/F508del em relação ao grupo controle wt/wt

(100%). n=6-46. *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal

(p<0,05). ................................................................................................................................... 74



nasais (HNE) de dois pacientes não FC (wt/wt) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas

por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do

protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770

(10µM), em Câmaras de Ussing. A. Comparação dos ΔIsc-eq-FSK das HNE dos pacientes por

grupo de genótipos: wt/wt; F508del/F508del. B. Porcentagem de função da CFTR nas HNE

dos pacientes F508del/F508del em relação ao grupo controle wt/wt (100%). DMSO (branco);

VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). n=6-46. #,##

,###

,####

,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student (p<0,05).

.................................................................................................................................................. 75

Figura 28. Análise dos valores de ΔIsc-eq em células epiteliais nasais humanas (HNE)

cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell, de diferentes pacientes FC com diferentes

mutações, F508del/F508del (linha preta), F508del/c.1584+18672 bp A>G (linha vermelha),

F508del/R334W (linha azul) e F508del/I618T (linha verde) incubados por 48h a 37°C com

DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR em Câmaras de

Ussing. Células HNE tratadas com A. VX-770, B. VX-809 e C. VX-809 + VX-770. Linhas

tracejadas horizontais suplementares nos gráficos indicam 10% do valor médio dos ΔIsc-eq-FSK

da função da CFTR em culturas de pacientes wt / wt (100%). ................................................ 75

Figura 29. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas

das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK -

µA/cm2) avaliadas em células epiteliais nasais (HNE), A. de 2 pacientes heterozigotos não FC

(wt/F508del), 1 F508del/R334W, 1 F508del/I618T, 2 F508del/c.1584+18672 bp A>G e B. 12

pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM).

Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e

potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco);

VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=2–6). ............... 76

Figura 30. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em

filtros Corning® Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-

809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC

F508del/F508del classificados pelo SNP rs7512462 (SLC26A9). Análise da ação dos

fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na CFTR de células HNE

de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha

vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CT+CC (linha verde), CT (linha azul) e TT

(linha vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média

aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ................ 77

Figura 31. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE)

cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del

agrupados em relação ao SNP rs7512462 (SLC26A9), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a

37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3 μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo

de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos fármacos nas

células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-

770 (preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student bicaudal; #,

##,

###: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student

bicaudal em comparação com o genótipo CT e grupo CT+CC (p<0,05). Linhas tracejadas

horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da CFTR em células

HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ............................................................................ 78


cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del

agrupados em relação à presença do alelo C ou T no SNP rs7512462 (SLC26A9), incubadas

por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados

no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR resgatada pelo pelos

fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);

VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico

T de student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e

10% da função basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). 79




F508del/F508del classificados pelo SNP rs3788766 (SLC6A14). Análise da ação dos

fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na CFTR de células HNE

de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha

vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha

vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos

ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ....................................... 80


cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del

agrupados em relação ao SNP rs3788766 (SLC6A14), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a

37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3 μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo

de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos fármacos nas

células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-

770 (preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10%

da função basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ........ 81



agrupados em relação à presença do alelo C ou T no SNP rs3788766 (SLC6A14), incubadas

por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados

no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR resgatada pelo pelos

fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);

VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**,***,****: Diferente significativamente pelo teste

estatístico T de student bicaudal; #: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student bicaudal em comparação com o genótipo C e T (DMSO) (p<0,05). Linhas tracejadas






F508del/F508del classificados pelos SNPs rs7512462 (SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14).

Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na

CFTR de células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, C (linha verde) e T

(linha vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média

aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt). ................ 83



agrupados em relação à presença do alelo C ou T nos SNPs rs7512462 (SLC26A9) e

rs3788766 (SLC6A14), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM).

Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de

função da CFTR resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770

(cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente

significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas



Figura 38. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE)

cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o

corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por 48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de

quatro pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não FC heterozigotos (wt/F508del –

Cinza), 17 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul), 1

F508del/R1066C (Verde), 1 G542X/I618T (Amarelo) e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G

(Vermelho). n=2-6. ................................................................................................................... 85


cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas com DMSO (0,05%) ou o

corretor da CFTR VX-809 (3µM) por 48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de dois

pacientes não FC (wt/wt - tracejado), um paciente não FC heterozigotos (wt/F508del – Cinza),

16 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul), 1 F508del/R1066C

(Verde), e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G (Vermelho). n=2-6. ........................................... 85


cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o

corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por 48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de

dois pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não FC heterozigotos (wt/F508del –

Cinza) e 12 F508del/F508del (Preto). n=2-6. *,**: Diferente significativamente pelo teste

estatístico T de student bicaudal (p<0,05). ............................................................................... 87

Figura 41. Traçado original (Vte) da estimulação do ATP (100µM), apical, em células

primárias epiteliais brônquicas (HBE) do paciente não FC Pul12 (wt/wt), cultivadas em filtros

Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. ........................................ 88

Figura 42. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em células primárias epiteliais brônquicas

humanas (HBE) de pacientes não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell

e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-18. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste

estatístico T de student bicaudal; #: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student bicaudal em comparação com as células HBE dos Pul3, Pul4, Pul5, Pul11 e Pul12

(p<0,05). ................................................................................................................................... 88

Figura 43. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em relação à incubação com DMSO (0,05% –

branco) ou o corretor da CFTR VX-809 (3µM – preto) das células primárias epiteliais

brônquicas humanas (HBE) dos pacientes FC Pul3, Pul4, Pul5, Pul11 e não FC Pul12 e Traq4

cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=3-

9. ............................................................................................................................................... 89

Figura 44. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-

AO1 (40µM), em células primárias epiteliais humanas brônquicas (HBE) e traqueais (HTE)

dos pacientes FC Pul3, Pul4 e Pul11 e não FC Pul12 e Traq4 cultivadas em filtros Corning®

Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-18. *: Diferente

significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05). ................................ 90

Figura 45. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em três aplicações de ATP (1: preto; +AO1: cinza

claro; 2: cinza escuro) e da sua inibição pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em

células primárias epiteliais humanas A. brônquicas (HBE) do paciente FC Pul3 e B. traqueias

do paciente não FC Traq4 cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em

Câmaras de Ussing. n=12-18. *,** Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student unicaudal (p<0,05). ...................................................................................................... 90

Figura 46. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em células primárias epiteliais nasais humanas

(HNE) de pacientes não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e

analisadas em Câmaras de Ussing. n=3-10. ............................................................................. 91

Figura 47. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em relação a incubação com DMSO (0,05%) ou o

corretor da CFTR VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos

pacientes controles P02 e P30 (wt/wt), controle heterozigoto PX02 (wt/F508del) e pacientes

FC P03 (F508del/R334W), P06 (G542X/I618T), P10 e P17 (F508del/ F508del/ c.1584+18672

bp A>G) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de

Ussing. n=2-4. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal

(p<0,05). ................................................................................................................................... 92

Figura 48. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) em relação à incubação com DMSO (0,05%) ou o

corretor da CFTR VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos

pacientes FC F508del/F508del, cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e

analisadas em Câmaras de Ussing. n=2-6. ............................................................................... 92

Figura 49. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-

AO1 (40µM), em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de pacientes não FC e

FC (P30: wt / wt; PX02 – wt / F508del; P03 – F508del / R334W; PX01, P18, P19 e P25:

F508del / F508del) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em

Câmaras de Ussing. n=6-8. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student

bicaudal (p<0,05). ..................................................................................................................... 93

Figura 50. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) e de sua inibição pelo inibidor de CaCC,

CaCCinh-AO1 (40µM), em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) do A. paciente

não FC heterozigoto (PX02 – wt / F508del) e B. do paciente FC (PX01: F508del / F508del)

cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6.

*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student (p<0,05). .............. 94

Figura 51. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm2) de quatro aplicações de ATP (100µM), com

lavagens de 15min entre cada aplicação, em células primárias epiteliais nasais humanas

(HNE) do paciente não FC (P02 – wt / wt) e sete pacientes FC F508del / F508del (P08, P09,

P12, P14, P15, P16 e P20) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em

Câmaras de Ussing. n=6-8. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student unicaudal (p<0,05). ...................................................................................................... 95

Figura 52. Cascata de ativação da TMEM16 em células epiteliais. Ativação dos receptores

purinérgicos membranares ativados pelo ATP, que ativam a fosfolipase C (PLC), ativando o

PIP2 que via IP3, libera cálcio (Ca2+

) intracelular, estocados no Reticulo endoplasmático,

ativando assim o TMEM16A (Modificado de: Guo, et al., 2015). ........................................ 103

Figura 53. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de

função da CFTR e teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias

epiteliais nasais (HNE) do paciente P02 não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da

CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);

Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ....................................................................... 123



epiteliais nasais (HNE) do paciente P30 não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da





epiteliais nasais (HNE) do paciente PX02 não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise

de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172

(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 124



epiteliais nasais (HNE) do paciente P01 não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise

de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172

(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 124



epiteliais nasais (HNE) do paciente PX01 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de

função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172

(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 124



epiteliais nasais (HNE) do paciente P08 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de

função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770

(10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). ........................................................ 125












































função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172

(CFTRinh 172 30µM)............................................................................................................. 128



epiteliais nasais (HNE) do paciente 25 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função

da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);




epiteliais nasais (HNE) do paciente 03 FC (F508del/R334W). Protocolo de análise de função

da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM);




epiteliais nasais (HNE) do paciente 06 FC (G542X/I618T). Protocolo de análise de função da





epiteliais nasais (HNE) do paciente 10 FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de

análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador

VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). .......................................... 129



epiteliais nasais (HNE) do paciente 10 FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de

análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM); Potenciador

VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM). .......................................... 129

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Listas de materiais utilizados na preparação dos meios de cultura de crescimento

epitelial brônquico (do inglês: Bronchial Epithelial Growth Media – BEGM) e meio para

diferenciação e polarização das células em interface ar-líquido (do inglês: Air Liquid Interface

– ALI). ...................................................................................................................................... 52

Tabela 2. Dados do isolamento das células primárias epiteliais brônquicas de lóbulos

pulmonares explantados no INCOR e no HC da Unicamp. ..................................................... 61

Tabela 3. Análise dos ΔIsc-eq em µA/cm2

do protocolo de função da CFTR nas células HBE e

HTE em Câmara de Ussing. ..................................................................................................... 67

Tabela 4. Porcentagens de função da CFTR nas células HBE e HTE, analisadas em Câmara

de Ussing, total, função basal (FSK 2µM) mais a ação dos fármacos VX-770 (10µM) e VX-

809 (3µM). Pul12 controle não FC 100% de função basal. ..................................................... 69

Tabela 5. Lista de pacientes com células primárias epiteliais nasais (HNE) coletadas,

analisadas a função da CFTR, Mutação dos pacientes e motivos da exclusão. Os pacientes

foram divididos em três etapas de estudo: a primeira (Piloto 1-3), fase em que foram

estabelecidos e validados os protocolos de estudo; a segunda (PX01-PX05) os estudos foram

realizados sem a presença do potenciador VX-770 e a última fase (P01-P30) com o protocolo

completo. .................................................................................................................................. 71

Tabela 6. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-eq,

em células primárias epiteliais nasais (HNE). .......................................................................... 72

Tabela 7. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-eq,

em de células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) em Câmara de Ussing, de pacientes

agrupados conforme o seu genótipo: wt/wt, wt / F508del e F508del / F508del. ..................... 73

Tabela 8. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl- em

células HNE de doze pacientes FC homozigotos para a F508del agrupados de acordo com o

SNP especifico: rs7512462 do gene SLC26A9 e rs3788766 do gene SLC6A14. A medida da

secreção de Cl- mediada pela CFTR foram quantificadas pela análise das médias e dos

desvios padrões dos deltas de correntes de curto-circuito equivalentes (ΔIsc-eq) determinadas

pela estimulação do AMPc pela FSK (2µM) sozinha (ΔIsc-eq-FSK) e pela adição do

potencializador VX-770 (10µM) (ΔIeq-sc-FSK+VX-770) nas células HNE incubadas por 48 horas

pelo corretor VX-809 (3µM) ou pelo veículo DMSO (0,05%). ............................................... 78

Tabela 9. Pacientes F508del/F508del e seus respectivos SPNs nos genes modificadores

analisados. ................................................................................................................................ 83

Tabela 10. Análise dos ΔIsc-eq da inibição do ENaC pela Amilorida (20µM) em células

primárias epiteliais nasais de pacientes FC e não FC, em Câmara de Ussing. ......................... 86

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A – Ampére;

ACTV – Coquetel de antibióticos: Anfotericina B, Ceftazidina, Tobramicina, Vancomicina;

ALI – Interface de ar líquido (do inglês: Air liquid interface);

Amil – Amilorida;

AO1 – Inibidor de canais de cloreto ativados pelo cálcio AO1;

ASL – Líquido superficial aerifico (do inglês: Air surface liquid);

ATP – Adenosina Trifosfato;

BSA – Albumina de soro bovino (do inglês: Bovine Serum Albumine);

BEGM – Meio de crescimento epitelial brônquico (do inglês: Bronchial Epithelium Growth

Media);

BPE – Extrato de Pituitária Bovina (do inglês: Bovine Pituitary Extract);

Ca2+

– Cálcio;

CaCC – Canal de cloreto ativado pelo cálcio (do inglês: Calcium Activated Chloride

Channel);

cAMP – Monofosfato cíclico de adenosina;

CFTR – Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator;

CFTRinh172 – Inibidor específico do canal CFTR;

Cl- – Cloreto;

CRC – Células condicionalmente reprogramadas;

DMSO – Dimetilsulfóxido;

DTT – DL-Dithiothreitol;

Dnase – Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino;

DPBS – Solução de tampão de fosfato salino Dulbecco;

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético;

EGF – Fator de crescimento epidérmico (do inglês: Epidermal Growth Factor);

ENaC – Canais epiteliais de sódio (do inglês: Epithelial Sodium Channel);

FBS – Soro fetal bovino (do inglês: Fetal Bovine Serum);

FC – Fibrose Cística;

FEV1 – Volume expiratório forçado no primeiro segundo da capacidade vital forçada;

FIS – Indução do inchaço por forscolina (do inglês: Forskolin Induced Swelling);

FRT – Células de tireoide de rato;

FSK – Forscolina;

GWAS – Genoma de ampla associação;

HBE – Células epiteliais primárias brônquicas humanas (do inglês: Human Bronchial

Epithelial);

HCO3- – Bicarbonato;

HNE – Células epiteliais primárias nasais humanas (do inglês: Human Nasal Epithelial);

HTE – Células epiteliais primárias traqueais humanas (do inglês: Human Tracheal

Epithelial);

HTS – Rastreio de alto rendimento (do inglês: Highthrouput Screening);

H2O – Água;

ICM – Medição de correntes no intestino (do inglês: Intesteinal Current Measurements);

IP3 – Inositol trifosfato;

IRT – Tripsinogênio imunorreativo;

Isc – Corrente de curto circuito;

Isc-eq – Correntes de curto circuito equivalentes;

mEq/L – mil equivalente por litro;

mRNA – RNA mensageiro;

MSD – Domínio de abrangência da membrana (do inglês: Membrane Spanning Domain);

mV – milivolts;

Na+ – Sódio;

NaCl – Cloreto de Sódio;

NBCS – Soro de bezerro recém-nascido (do inglês: Newborn Calf Serum);

NBD – Domínio de ligação dos nucleotídeos (do inglês: Nucleotide Bind Domain);

NBS – Rastreio de recém-nascidos (do inglês: Newborn Screening);

NMD – Decaimento do mRNA mediado por nonsense (do inglês: Nonsense-mediated mRNA

decay);

ORCC – Canal de cloreto de retificação externa (do inglês: Outwardly Rectifying Chloride

Channel);

P. aeruginosa – Pseudômonas aeruginosa;

PBS – Solução de tampão de fosfato salino;

Pen/Strep – Penicilina / Estreptomicina;

PIP2 – Fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato;

PKA – Proteína quinase A;

PLC – Fosfolipase C;

RE – Reticulo Endoplasmático;

Ringer – Solução tampão de uso nos experimentos na Câmara de Ussing;

ROCK – Inibidor da Rho quinase;

Rte – Resistência transepitelial;

SEM – desvio padrão da média aritmética;

SLC6A14 – Família transportadora de soluto 6 membro 14;

SLC26 – Família transportadora de soluto 26;

SLC26A9 – Família transportadora de soluto 26 membro 9;

SNP – Polimorfismo de nucleotídeo único;

TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido;

TEER – Resistência elétrica transepitelial;

TM – Segmentos transmembranares;

TMEM16 – Família de proteínas transmembranar 16;

TMEM16A – Proteína transmembranar 16A;

TMEM16F – Proteína transmembranar 16F;

UTP – Trifosfato de uridina;

Vte – Voltagem transepitelial;

wt – Tipo selvagem (Wild type);

ΔIsc-eq – Delta das correntes de curto circuito equivalentes;

ΔIsc-eq-Amil – Delta das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis amilorida;

ΔIsc-eq-FSK – Delta das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina;

ΔIsc-eq-FSK+VX-770 – Delta das correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina

mais o potenciador VX-770;

SUMÁRIO

1. Introdução ..................................................................................................................................... 30

1.1. CFTR – Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator .......................................... 30

1.2. Fibrose Cística........................................................................................................................ 30

1.3. Mutações no gene CFTR ........................................................................................................ 33

1.4. Técnicas para o diagnóstico na fibrose cística ...................................................................... 36

1.5. Fármacos moduladores da CFTR e testes in vitro para análise de eficácia ........................... 38

1.6. Correção da secreção do íon cloreto na fibrose cística por canais alternativos ................... 42

1.7. Polimorfismos em genes modificadores da CFTR e/ou FC .................................................... 45

2. Objetivo Geral ............................................................................................................................... 48

2.1. Objetivos Específicos ............................................................................................................. 48

3. Métodos ........................................................................................................................................ 49

3.1. Aspectos Éticos ...................................................................................................................... 49

3.2. Estudo em Células Primárias do Epitélio Brônquico Humano (HBE) ..................................... 49

3.2.1. Pacientes com fibrose cística atendidos pelo Serviço de Transplante Pulmonar do

Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. .................................................................... 49

3.2.2. Padronização do cultivo de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE) ... 50

3.3. Estudo em Células Primárias do Epitélio Nasal Humano (HNE ............................................. 53

3.3.1. Pacientes diagnosticados com FC atendidos pelo ambulatório de fibrose cística do

departamento de pediatria do hospital de clínicas da Unicamp .................................................. 53

3.3.2. Padronização da técnica de cultivo das células HNE ..................................................... 53

3.3.3. Análise dos polimorfismos SNP rs7512462 no gene SLC26A9 e rs3788766 no gene

SLC6A14 55

3.4. Câmara de Ussing .................................................................................................................. 55

3.4.1. Princípios gerais sobre a Câmara Ussing ....................................................................... 55

3.4.2. Tipos de Câmaras de Ussing .......................................................................................... 56

3.4.3. A Câmara de perfusão continua .................................................................................... 56

3.4.4. Medições transepiteliais em circuito aberto ................................................................. 57

3.5. Protocolos para a avaliação da função da CFTR e TMEM16A em células HBE e HNE em

Câmara de Ussing .............................................................................................................................. 58

3.6. Análise estatística .................................................................................................................. 60

4. Resultados ..................................................................................................................................... 61

4.1. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em células HBE de

pacientes FC ...................................................................................................................................... 61

4.2. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em células primárias

epiteliais nasais (HNE) ....................................................................................................................... 69

4.2.1. SNP rs7512462 (SLC26A9) modula a função e o resgate da CFTR (F508del / F508del)

pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770) ............................................................................ 76

4.2.2. Resgate da CFTR (F508del/F508del) pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770)

condicionada pelo SNP rs3788766 (SLC6A14) ............................................................................... 79

4.2.3. rs7512462*C e rs3788766*C agrupados modulam positivamente a função da CFTR e

melhoram a ação do Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770) .................................................. 82

4.2.4. Análise da função do canal epitelial de sódio, ENaC, pelos fármacos VX-809 e VX-770

em células primárias epiteliais nasais (HNE) ................................................................................. 84

4.3. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais brônquicas (HBE) de

pacientes FC e não FC........................................................................................................................ 87

4.3.1. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias

brônquicas humanas (HBE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-809 na

CFTR 88


brônquicas humanas (HBE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1) .................. 89

4.4. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de

pacientes FC e não FC........................................................................................................................ 90

4.4.1. Correntes não seletivas estimuladas pelo ATP em células epiteliais primárias nasais

humanas (HNE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-809 na CFTR......... 91


humanas (HNE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1). ................................... 92


humanas (HNE) diminuem após múltiplas aplicações .................................................................. 94

5. Discussão ....................................................................................................................................... 96

5.1. Análise e Interpretação dos experimentos em Câmara de Ussing ....................................... 96


epiteliais brônquicas humanas (HBE ................................................................................................. 96


epiteliais nasais humanas (HNE). ...................................................................................................... 98

5.4. Modulação da função de CFTR e da ação dos fármacos VX-809 e VX-770 por polimorfismos

em genes associados à FC em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE). ........................ 100

5.5. Função do ENaC nas células HNE de pacientes FC e não FC ............................................... 102

5.6. Análise da função de TMEM16A nas células HNE e HBE de pacientes não FC e FC ........... 102

5.7. Relevância do Trabalho ....................................................................................................... 104

5.8. Perspectivas ........................................................................................................................ 105

5.9. Dificuldades na realização do estudo .................................................................................. 105

6. Considerações Finais ................................................................................................................... 109

6.1. Cultivo de células primárias epiteliais brônquicas (HBE) e nasais (HNE) humanas ............ 109

6.2. Ação dos fármacos moduladores da CFTR em células HBE e HNE ...................................... 109

6.3. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR em células

HBE 109

6.4. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR em células

HNE 110

6.6. Avaliação da função da TMEM16A em células HBE e HNE ................................................. 111

7. Conclusões................................................................................................................................... 112

8. Referências .................................................................................................................................. 113

9. Apêndice ...................................................................................................................................... 123

10. ANEXOS ................................................................................................................................... 130

30

1. Introdução

1.1. CFTR – Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator

A fibrose cística (FC) é causada por mutações no gene CFTR (do inglês: Cystic

Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), que está localizado no braço longo do

cromossomo 7 e codifica uma proteína transmembranar de mesmo nome (Kerem et al., 1989;

Riordan, 1989; Rommens et al., 1989). A proteína CFTR está localizada na membrana apical

de células epiteliais e atua como um canal iônico que transporta cloreto (Cl-) e bicarbonato

(HCO3-). Este canal é regulado pela adenosina trifosfato (ATP) e fosforilação mediada por

proteína quinase A (PKA) quando estimulada pelo monofosfato cíclico de adenosina (cAMP)

(Riordan et al., 1989; Collins, 1992).

A proteína CFTR é composta por duas subunidades, contendo dois domínios de

abrangência da membrana (MSD1 e MSD2, do inglês: Membrane-Spanning Domains),

compostos por seis segmentos transmembranares cada (TM1 – TM12), que comunicam o

meio extracelular ao intracelular e são conectados aos domínios de ligação dos nucleotídeos

(NBD1 e NBD2, do inglês: Nucleotide Binding Domain), formando o poro do canal. Na

primeira metade da molécula, o NBD1 é seguido por um domínio citoplasmático conhecido

como "Domínio R" (Regulator Domain), contendo vários resíduos de serina que são

fosforilados pela PKA para regular a função do canal CFTR. O domínio R liga as duas

metades da proteína (MSD1 e NBD1 na MSD2 e NBD2) (Fig. 1) (Ratjen, et al., 2015;

Callebaut, et al., 2017; Meng, et al., 2017; Mijnders, et al. 2017).

1.2. Fibrose Cística

A FC é a doença autossômica recessiva mais frequente em populações caucasianas,

afetando mais de 85 mil pessoas em todo o mundo, incluindo aproximadamente 30 mil

indivíduos na América do Norte e mais 30 mil na Europa. As taxas de prevalência são

menores em populações não caucasianas, por exemplo, 1 em 4.000 a 10.000 latino-

americanos, 1 em 15.000 a 30.000 africanos e aproximadamente 1 em > 100.000 asiáticos. O

Brasil é o 7º país do mundo com mais pacientes registrados, até o ano de 2015 estavam

cadastrados 3.857 pacientes, com uma taxa de 1 em cada 75.000 nascidos vivos, e no estado

de São Paulo 1 em cada 12.195. Estes números podem estar subestimados, pois muitos

31

estados brasileiros não contam com centros de referência FC, impossibilitando o diagnóstico

preciso da doença (Rebrafc, 2015; Lopes-Pacheco, 2016; Jackson & Goss, 2017; Nunes, et

al., 2017).

Figura 1. Esquema representativo da estrutura da proteína CFTR. A. Estrutura linear. B. A proteína CFTR

expressa na membrana lipídica, composta de dois domínios de abrangência da membrana (MSD1 e MSD2)

contendo seis segmentos transmembranares cada (TM1 a TM12) e conectados ao respectivo domínio de ligação

dos nucleotídeos (NBD1 e NBD2). O domínio R liga a primeira metade (MSD1 e NBD1) com a segunda metade

(MSD2 e NBD2). O canal abre quando o domínio R é fosforilado pela proteína quinase A (PKA) estimulada

pelo monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) e quando o ATP liga nos NBDs (Modificado de: Ratjen, et al.,

2015).

A CFTR é essencial para controle do pH e equilíbrio hidro salino do fluido

superficial das células epiteliais, pela interação com um conjunto de outras proteínas, como

exemplo, o canal epitelial de sódio (ENaC, Na+). A má função ou ausência da CFTR leva a

não secreção de Cl- e HCO3-, um aumento na absorção de Na

+ e consequentemente a de água,

devido ao gradiente de concentração criado, determinando desidratação e acidificação do

líquido da superfície dos tecidos epiteliais (Tarran et al., 2001; Pezzulo et al., 2012; Veit, et

al., 2015; De Boeck & Davies, 2017).

As modificações no líquido superficial do epitélio desencadeada pelo mau

funcionamento ou ausência da CFTR geram diversas complicações nos tecidos epiteliais e

glândulas secretoras e prejudica funcionamento dos órgãos e sistemas envolvidos (Fig. 2). O

pulmão apresenta as piores complicações clínicas, sendo a maior causa de morte prematura na

FC. Destacam-se como principais complicações nas vias aéreas inferiores: sintomas

respiratórios agudos ou persistentes; tosse crônica e produção de escarro; muco hiperviscoso;

doença pulmonar obstrutiva; pneumonia recorrente ou infecção pulmonar; colonização

persistente com patógenos da FC, principalmente a Pseudomonas aeruginosa; baixo

32

desempenho nos testes de função pulmonar; anormalidades crônicas da radiografia de tórax

(bronquiectasia). Já nas vias aéreas superiores as complicações são: pólipos nasais e doença

nos sinus; doença sino-pulmonar supurativa crônica; pansinusite crônica (Gaspar, et al., 2013,

Amaral, 2015).

Figura 2. Esquema representativo do ciclo da doença na FC em células brônquicas. CFTR: Cystic Fibrosis

Transmembrane Conductance Regulator; ENaC: Canais epiteliais de sódio; Na+: Sódio; Cl

-: Cloreto

(Modificado de: De Boeck, et al., 2016).

O ambiente viscoso, seco e espesso no líquido da superfície epitelial dificulta ou

impede o transporte correto de substâncias secretadas por glândulas e excretadas pelos ductos,

como as enzimas pancreáticas, bile, saliva, suor, esperma, entre outras (Fig. 3). Essas

substâncias têm a suas composições alteradas ou ainda não são transportadas, levando a

complicações aos órgãos relacionados e desencadeando complicações sistêmicas. No trato

gastrointestinal podem causar: insuficiência pancreática com má absorção; desnutrição;

esteatorréia e fezes anormais; íleo meconial e obstrução intestinal; prolapso retal; doença

hepatobiliar; pancreatite recorrente; síndrome de obstrução intestinal distal. Já nas glândulas

sudoríparas ocorre elevada concentração de Cl- no suor e ausência de sudorese por estímulo ß-

adrenérgico. No sistema reprodutivo masculino ocorre ausência congênita bilateral e/ou

unilateral do canal deferente e azoospermia obstrutiva. Ainda, como alteração metabólica se

observa: hipoproteinemia; deficiência de vitaminas lipossolúveis; síndrome de depleção de

sal, com ou sem alcalose metabólica (Rosenstein & Cutting, 1998; Farrel, et al., 2008;

Ashlock & Olson, 2011; De Boeck, et al., 2011; Amaral, 2015).

33

Figura 3. Esquema representativo do ciclo de obstrução em glândulas na fibrose cística (FC). A. Tecido normal

e B. tecido FC. LSA: liquido superficial aerífero; HCO3-: Bicarbonato; Cl-: Cloreto; Na

+: Sódio (Modificado de:

Ratjen, et al., 2015).

1.3. Mutações no gene CFTR

Atualmente estão descritas mais de 2000 variantes no gene CFTR, e

aproximadamente 300 mutações com manifestação clinica da doença. A deleção do

aminoácido fenilalanina na posição 508, deste gene, gera a mutação mais frequente (F508del),

com uma prevalência de 90% em pelo menos um alelo (heterozigoto) nos pacientes FC dos

EUA e Europa e 60% de prevalência de homozigotos (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Veit,

et al., 2015; Mijnders, et al. 2017; De Boeck & Davies, 2017). No Brasil a prevalência de

heterozigotos e homozigotos para F508del é de 45% e 26%, respectivamente (REBRAFC,

2015) (Fig. 4).

Pela elevada quantidade de mutações no CFTR, foi atribuída uma classificação

funcional, para uma melhor estratégia de tratamento na FC, contendo sete diferentes classes

funcionais do CFTR. Na classe (I) estão as mutações (ex: Gly542X, Trp1282X) que

produzem um mRNA truncado, de “códon de paragem” (stop códon), não sendo possível a

tradução da proteína, e degradado pelo decaimento do mRNA mediado por nonsense (do

inglês: Nonsense-mediated mRNA decay – NMD). Para o foco de tratamento dessa classe de

mutações, é necessária resgatar a síntese de um mRNA completo, tendo como modelo de

34

mecanismo para fármacos os Read Through (lendo completamente), agentes que farão com

que o mRNA seja produzido por completo (Fig. 5) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting,

2015; Veit, et al., 2015; Bosch & De Boeck, 2016; Mijnders, et al. 2017; Boeck & Davies,

2017; Zainal Abidin, et al., 2017).

Figura 4. Modelagem molecular baseados em cristalografia da proteína CFTR indicando o local que ocorre a

mutação F508del. A. CFTR completo MSD1 (domínio de abrangência da membrana 1), azul; MSD2 (domínio

de abrangência da membrana 2), amarelo; NBD1 (domínio de ligação dos nucleotídeos 1), ciano; NBD2

(domínio de ligação dos nucleotídeos 2), laranja; Domínio R, verde; F508del, vermelho; B. Posição da F508 no

NBD1 (Modificado de: Molinski, et al., 2012).

A F508del é uma mutação de classe (II) e nesta classe ocorre o não enovelamento

correto da proteína, e assim é degradada no proteossoma. O foco de tratamento dessa classe

de mutações, é de corrigir o enovelamento da proteína ou enganar o “controle de qualidade”

celular, no reticulo endoplasmático (RE), para assim a proteína chegar até a membrana. Os

fármacos que podem ser utilizados para essa classe de mutação são os corretores, que

corrigem o enovelamento ou levam a proteína até a membrana plasmática, sem que essa seja

degradada (Fig. 5) (Clancy, et al,. 2012; Boyle et al., 2014; Wainwright et al., 2015; Amaral,

2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Mijnders, et al., 2017; Bosch & De

Boeck, 2016; De Boeck & Davies, 2017).

As mutações de classe (III) (Gly551Asp, Ser549Arg, Gly1349Asp), não

apresentam condutividade do canal, e as de classe (IV) (Arg117His, Arg334Trp, Ala455Glu),

possuem má condutância do canal, e ambas estão presente na membrana apical, mas não

funcionam corretamente. Os potenciadores da CFTR são um grupo de fármacos que corrigem

esse defeito, potencializando a abertura do canal e a condutância iônica normal (Fig. 5) (Char,

35

et al., 2014; Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Char, et al.,

2017; Mijnders, et al., 2017; De Boeck & Davies, 2017).

Na classe (V) estão contidas as mutações (Ala455Glu, 3272-26A → G, 3849+10

kg C→T) que geram uma CFTR normal, porém em menor número, com transporte iônico

reduzido. Isto ocorre devido ao Splicing alternativo, produzindo um mRNA anormal que não

é traduzido corretamente, e a proteína é degradada. Sendo assim, corrigir o Splicing é o alvo

de fármacos a serem produzidos, podendo utilizar a técnica de oligonucleotídeos anti-sense,

bem como corretores e/ou potenciadores, na tentativa de aumentar a expressão e função da

CFTR (Fig. 5) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Mijnders, et

al., 2017; De Boeck & Davies, 2017).

Figura 5. Esquema representativo da classificação funcional, para uma melhor estratégia de tratamento na

fibrose cística, de sete diferentes classes funcionais do CFTR. Comparação da célula com o CFTR normal,

expresso na membrana apical de células epiteliais e a sua condutividade de íons de cloreto (Cl-),

com as células

de CFTR mutado, resumindo o defeito, exemplo de mutações, terapia corretiva e fármaco (droga) utilizado

(Modificado de: De Boeck, et al., 2016).

Na classe (VI) (c. 120del23, rPhe508del) de mutações da CFTR está inserida a

F508del resgatada pelos corretores, pois após o resgate da proteína anormal, essa não

consegue permanecer ancorada na membrana plasmática, característica dessa classe, sendo

internalizada e degradada. Para corrigir esse defeito são necessários estabilizadores para

aumentar a permanência da proteína na membrana plasmática, inibindo sua internalização e

36

degradação (Fig. 5) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015;

Mijnders, et al., 2017; De Boeck & Davies, 2017).

Finalmente as mutações de classe (VII) (dele2,3(21kb), 1717-1G→A) são

caracterizadas por grandes deleções no gene CFTR e não produzem o mRNA, não ocorrendo

à produção da proteína. O alvo para o tratamento é a terapia gênica ou by-pass (canais

alternativos), pois não é possível resgatar um mRNA ou a proteína (Fig. 5) (Amaral, 2015;

Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Mijnders, et al., 2017; De Boeck &

Davies, 2017).

1.4. Técnicas para o diagnóstico na fibrose cística

A FC é uma doença multifatorial e multissistêmica, que apresenta diversos

desafios para o seu diagnóstico e prognóstico, sendo assim, mesmo com um quadro clínico

sugestivo, não é indicado diagnosticar um paciente apenas com a clínica, sendo necessária

uma ampla investigação e aplicação de testes diagnósticos. Recentemente muitos países

aderiram ao rastreio de recém-nascidos (teste do pezinho – New Born Screening – NBS),

inclusive o Brasil, desde 2009 (REBRAFC, 2015), pelo teste do tripsinogênio imunorreativo

(immunoreactive trypsinogen – IRT). No paciente FC a liberação de tripsinogênio no sangue é

elevada como resultado da obstrução causada por acúmulo de secreção nos ductos

pancreáticos. Entretanto, mesmo em lactentes com teste positivo de NBS, o diagnóstico de

FC, deve ser confirmado por outros testes, pois a presença de testes falso negativo/positivo

pode ocorrer (Athanazio, et al., 2017, 2016; De Boeck, et al., 2017; Faria, et al., 2017).

O teste do suor, desenvolvido em 1959, é o exame de diagnóstico padrão ouro até

hoje, o mais confiável, quando aplicado corretamente, e amplamente disponível para a FC no

mundo todo. Este teste analisa a concentração de eletrólitos no suor do paciente com o uso da

pilocarpina por iontoforese e deve ser realizada em pelo menos dois testes e em diferentes

tempos de coleta. As concentrações de cloreto no suor avaliadas distinguem os pacientes em

três grupos: para valores ≥ 60 mEq/L são considerados como FC clássico; valores de cloreto

entre 30 a 60 mEq/L os pacientes apresentam valores limítrofes, FC residual (mutações III,

VI, V) ou inconclusivos; e para valores ≤ 30 mEq/L os indivíduos são considerados sem FC.

Para indivíduos com valores limítrofes e superiores a 60, a avaliação das mutações no gene

CFTR é indicada (Gibson & Cooke, 1959; Athanazio, et al., 2017; De Boeck, et al., 2017;

Faria, et al., 2017).

37

A análise genética é uma ferramenta importante para o diagnóstico mais preciso

na FC, entretanto, ainda não é uma técnica muito acessível no Brasil. Contudo, as terapias de

precisão estão se tornando disponíveis e viáveis, e laboratórios de pesquisa em genética ou

laboratórios licenciados, terão que se adaptar para analisar os dados genéticos e identificar as

mutações de CFTR. O protocolo de análise de mutações de CFTR varia entre diferentes

grupos, no entanto, no geral, recomenda-se a análise de mutações por um painel padrão que

analisa as mutações mais comuns causadoras de doenças na população que está sendo

avaliada (cobrindo cerca de 80% a 85% das mutações na população). Quando duas mutações

de CFTR não são identificadas e o diagnóstico de FC é quase certo (concentração de cloreto

de suor acima de 60 mEq/L) ou altamente provável (quadro clínico sugestivo), o segundo

passo é o sequenciamento extensivo de todo o gene CFTR. No sequenciamento completo

podem não ser identificadas as mutações causadas por grandes deleções ou inserções, sendo

necessária, em alguns casos, a utilização de outros métodos de sequenciamento. Ainda assim,

a análise das mutações no CFTR não esclarece totalmente como a doença está manifestada no

paciente FC, pois o potencial patogênico de muitas mutações no CFTR ainda não está

elucidado (Athanazio, et al., 2017; De Boeck, et al., 2017; Faria, et al., 2017; National

Guideline Alliance (UK), 2017).

Outra ferramenta para o diagnóstico da FC é a medição de correntes no intestino

(Intesteinal Current Measurements – ICM), que analisa a função da CFTR, a partir de

medições de correntes de curto circuito de Cl- através do canal CFTR no intestino, pela

técnica de eletrofisiologia da Câmara de Ussing, em biopsias retais, de pacientes com um

quadro de FC inconclusivo. Capaz de classificar pacientes não-FC, FC clássico e FC com

função residual, a ICM apresenta elevada complexidade de execução, dificuldades de

interpretação dos resultados (Mall & Hirtz, 2004; Sousa, et al., 2012; Servidoni, et al., 2013).

Recentemente outra técnica foi desenvolvida para diagnóstico da FC pela

mensuração da taxa de suor β-adrenérgico, por um aparelho denominado evaporímetro. Neste

teste é aplicado um coquetel β-adrenérgico intradérmico no braço do paciente, que inclui

atropina para bloquear a função colinérgica dependente de CFTR. Do mesmo modo que a

técnica de ICM, a evaporimetria é uma técnica robusta com uma interpretação de resultados

complexa, caso não aplicada corretamente, o que dificulta a disseminação de seus resultados

como ferramenta de diagnóstico. A evaporimetria foi desenvolvida recentemente e necessita

de validação mais precisa, embora, tenha demonstrando grande eficácia em diferenciar

38

pacientes FC, não FC portadores de uma mutação de CFTR (wt / fc) e indivíduos não FC

(Quinton, et al., 2012; Kim, et al., 2016).

1.5. Fármacos moduladores da CFTR e testes in vitro para análise de eficácia

Há anos são utilizados fármacos para melhorar os sintomas da FC, como bronco

dilatador, antibióticos, enzimas digestivas, que aumentaram a qualidade e expectativa de vida

dos pacientes. Porém ainda não foi corrigido o defeito básico causador da FC, o transporte

alterado ou nulo de Cl- e HCO3- no epitélio dos pacientes com FC (Cohen-Cymberknoh, et

al., 2011). Nos últimos 10 anos, surgiram os fármacos para a correção do defeito básico da

FC, que atua a nível intracelular, modula e leva a CFTR até a membrana apical, ou caso esteja

inserido na membrana, fazendo com que ocorra a condutância iônica (Bell, et al., 2015;

Boeck & Davies, 2017).

A análise de vários compostos pela técnica de rastreio de alto rendimento (High

Throughput Screening - HTS) foi essencial para a descoberta dos fármacos moduladores da

CFTR (Galietta, et al., 2001; Pedemonte, et al., 2011; Pasyk, et al., 2012). Em 2005 foi

publicado um artigo descrevendo a análise positiva de pequenas moléculas que corrigiram a

função da CFTR em células de tireoide de rato (FRT) transfectadas com um CFTR normal

(wt/wt) e com o CFTR mutado (F508del/F508del) (Pedemonte, et al., 2005).

Além disso, em 2005 (Fulcher, et al.) foi padronizada a técnica de cultivo de

células epiteliais primárias brônquicas (HBE) de pacientes com FC isolados de pulmões

explantados, para análise da avaliação da função da CFTR e ação de fármacos moduladores

na CFTR. Em 2009 foi publicado pela primeira vez o resgate de função da CFTR pelo

fármaco potenciador VX-770 (Ivacaftor®, Kalydeco

®) em células HBE de pacientes FC com o

genótipo G551D/F508del (Van Goor, et al., 2009). O mesmo grupo em 2011 (Van Goor, et

al., 2011), mostraram que a utilização do fármaco VX-809 (Lumacaftor®) apresenta um

resgate de função da CFTR em células HBE de pacientes F508del/F508del.

Após a comprovação que essas pequenas moléculas, VX-770 e VX-809,

melhoram a função da CFTR, estudos clínicos foram realizados com o VX-770 e

comprovaram sua eficácia para a mutação G551D (Accurso, et al., 2010; Ramsey, et al.,

2011). Depois dessa comprovação, o VX-770, comercializado nas versões

Ivacaftor®/Kalydeco

® (VX-770), está hoje aprovado nos EUA e em alguns países europeus,

para utilização em um grupo de pacientes, acima de seis anos de idade, com as mutações de

39

classes III e IV (G551D, 1244E, G1349D, G178R, G551S, G970R, S1251N, S1255P, S549N,

S549R) (CADTH, 2015). Além disso, estudos na mutação R117H ou na mutação F508del

combinada com algumas das mutações citadas anteriormente estão sendo realizados (Char, et

al., 2014; Char, et al., 2017).

Outro fármaco, aprovado nos EUA e em alguns países europeus, para o uso na FC

foi o Lumacaftor® (VX-809), que após testes em células HBE F508del/F508del demonstrou

uma pequena recuperação de função da CFTR (Van Goor, et al., 2011; Awatade, et al., 2015).

Dessa forma, foi utilizada a associação de VX-809 e VX-770 (Orkambi®) em pacientes

homozigotos para a F508del e teve como desfecho uma melhora na função pulmonar, VEF1

(volume expiratório forçado no primeiro segundo da capacidade vital forçada), de 2% a 3%

(Wainwright, et al. 2015). O Orkambi®

também foi aprovado para uso de pacientes FC

homozigotos para a F508del, e alguns pacientes demonstraram um melhora significativa,

sendo essa resposta específica para cada indivíduo avaliada (Clancy, et al., 2012; Boyle et al.,

2014; Wainwright et al., 2015).

O Orkambi®

também foi associado à variabilidade da expressão fenotípica da

doença em outros órgãos afetados pela FC e, principalmente, na qualidade de vida

(Thomassen, et al., 2017; Graeber, et al., 2018). Esta combinação também está sendo

estudada em mutações menos frequentes no CFTR com o intuito de verificar sua viabilidade

na modulação positiva da CFTR (Bell, et al., 2015; Boeck & Davies, 2017).

Recentemente outro fármaco modulador da CFTR, VX-661 (Tezacaftor®

),

demostrou melhora fenotípica em pacientes com a mutação F508del, em homozigose ou

heterozigoze composta, superior ao VX-809, quando combinado ao VX-770, sendo finalizado

o estudo de fase três (Taylor-Cousar, et al., 2017; Rowe, et al., 2017). Outros fármacos estão

sendo produzidos e testados, individualmente ou combinados com os já aprovados, na

tentativa de encontrar melhoras nas funções da CFTR e nos fenótipos na FC (Harutyunyan, et

al., 2017; Oliver, et al., 2017; VRTX, 2018).

O cultivo e análise de células HBE foi o método de teste de fármacos in vitro para

a FC de maior viabilidade nos últimos anos. Recentemente, foi desenvolvida uma nova

técnica utilizando as biopsias retais para teste dos moduladores da CFTR – organoides

intestinais (Dekkers et al., 2013). A técnica isola criptas do epitélio intestinal (biópsia retal)

para a formação de mini intestinos, cultiváveis por muitas passagens, diferentemente das

células HBE, e são utilizados para a análise de função da CFTR pela técnica de indução do

inchaço por forscolina (Forskolin Induced Swelling - FIS). O FIS permite avaliar a ação dos

40

moduladores da CFTR em organoides intestinais de pacientes com FC (Dekkers et al., 2013;

Beekman, 2016; Noordhoek, et al., 2016; Boj, et al., 2017).

O método dos organoides intestinais é uma ótima técnica para análises

personalizadas de função da CFTR e avaliação da ação dos moduladores da CFTR.

Correlações positivas entre a eficácia dos moduladores da CFTR, avaliadas nos organoides

intestinas em diferentes genótipos do CFTR e comparadas pelo VEF1 apresentaram

correlações positivas, demonstrando ser uma técnica robusta para estudos farmacológicos na

FC. Dessa forma, o uso dos organoides intestinais viabiliza a aplicação da medicina

personalizada na FC pela seleção de tratamentos associados à função CFTR (Beekman, 2016;

Dekkers, et al., 2016; Noordhoek, et al., 2016).

As técnicas de cultivo de células HBE e organoides intestinais são

complementares, pois os tecidos estudados são oriundos de diferentes órgãos afetados na FC,

pulmão e intestino, e nesses órgãos, a expressão da CFTR é diferente (Kreda, et al., 2005;

Kreda & Gentzsch, 2011; Kreda, et al.,2012).

Os organoides intestinais supriram alguns dos problemas encontrado nas células

HBE, o de não poderem ser coletados rotineiramente, pois derivam de pulmões explantados, e

os organóides de biópsias retais. Outro diferencial é o da maior facilidade de coleta do

material biológico de pacientes com diferentes genótipos de CFTR, possibilitando um estudo

mais amplo de diferentes mutações (Sousa, et al., 2012; Dekkers et al., 2013; CFTR2, 2018).

No entanto, apesar da biópsia retal ser um exame de rotina hospitalar (colonoscopia), requer

especialização para realizar a coleta, que podem causar complicações para o paciente

(Servidoni, et al., 2013).

Apesar da importância do uso dos organoides intestinais, a células HBE ainda

apresentam relevância, pois são oriundas das vias aéreas, maior causa de morte prematura na

FC. Dessa forma, o estudo das vias aéreas e métodos de avaliação de função da CFTR nesse

tecido são necessários, e foram parcialmente supridos com a padronização do cultivo de

células epiteliais nasais (HNE) (Suprynowicz, et al., 2012; Pranke, et al., 2017).

A coleta das células HNE é acessível e de fácil realização através de um escovado

nasal simples, em ambas as narinas, e colocada em cultura para o crescimento. Está técnica de

coleta já era realizada há muitos anos, no entanto o baixo número de células era um desafio

para a viabilização dos estudos, então, recentemente foi desenvolvida a técnica de cultivo de

“células condicionalmente reprogramadas” (CRC). Está técnica tem as células HNE co-

cultivadas com fibroblastos de camundongo irradiadas, que são fontes de fatores de

41

crescimento para as células HNE, aumentando assim a taxa de crescimento, a aderência e

ainda mantém as características de diferenciação das células. Ainda é adicionado o inibidor da

Rho quinase (ROCK), que diminui a taxa de mortes celulares programadas (apoptose), assim

aumenta a proliferação celular (plasticidade) dessas células. Essa metodologia, da mesma

forma que as cédulas HBE, permite a quantificação do transporte de Cl- mediado pelo cAMP

como um marcador substituto da função da CFTR, e a análise dos moduladores da CFTR

(Suprynowicz, et al., 2012; Pranke, et al., 2017; McGarry, et al., 2017).

Com o cultivo das células HBE e HNE e a produção de organoides intestinais,

hoje estão sendo desenvolvidas técnicas do cultivo de organoides das vias aéreas, oriundos de

células bronquiais (Deslee, et al., 2007) e nasais (Brewington, et al., 2018). Uma diferença

notável da cultura dos organoides intestinais para os das vias aéreas é a camada ciliar presente

nessas células. Com isso, estão sendo produzidos dois tipos de organoides das vias aéreas, um

com a região apical voltada para dentro, cultivado em matrigel, como os organoides

intestinais, e outra voltada para fora, cultivada sem matrigel, sendo possível observar o

batimento ciliar nesses organoides (Fig. 6) (Cholon & Gentzsch, 2017).

Figura 6. Modelos de estudos para uma medicina personalizada na terapêutica FC. Tecidos coletados de

diferentes órgãos, afetados pela FC, dos pacientes que são usados para gerar culturas de células 2D e culturas

esferoides 3D ou analisados como tecido montado. Foram desenvolvidos protocolos para a geração de culturas

esferoides dos epitélios nasais, brônquicos e retais. As culturas 2D são estabelecidas para células humanas das

vias aéreas e os tecidos epiteliais intestinais humano (Modificado de: Cholon & Gentzsch, 2017).

O desenvolvimento de novas ferramentas de triagem capazes de prever a eficácia

da droga de forma individualizada justifica estudos in vitro da resposta a novas drogas para

essa doença, antes de seu uso, em razão do elevado custo e de possíveis efeitos colaterais

42

dessas substâncias. Ainda, a aplicação de uma medicina personalizada é necessária para

melhorar as estratégias de tratamento e identificar combinações farmacêuticas ótimas para

pacientes com FC com diferentes mutações no CFTR (Amaral & Balch, 2015; Amaral, 2015;

Beekman, 2016; Cholon & Gentzsch, 2017; Marson et al., 2017; Paranjape & Mogayzel,

2017).

1.6. Correção da secreção de íons de cloreto na fibrose cística por canais alternativos

A descoberta da existência de canais de cloreto alternativos nas células epiteliais

das vias aéreas foi feita pela estimulação de células in vitro, ou em epitélio nasal in vivo, com

agonistas de cálcio, por exemplo UTP (trifosfato de uridina) ou ATP. Este tratamento resulta

em uma grande estimulação do transporte de Cl- não dependente da CFTR, pois também

ocorrem em pacientes com FC. A partir dessa descoberta estudos focados nesses canais

alternativos de Cl- foram realizados. Estudos clínicos com o uso do aerossol de Denufosol,

fármaco análogo de UTP que induz a elevação do cálcio intracelular ao se ligar nos receptores

purinérgicos (P2Y2) localizados na membrana apical das células epiteliais. O Denufosol não

demonstrou melhora na função pulmonar ou reduziu as exacerbações em pacientes com FC

em testes clínicos de fase três. Os motivos da ineficácia desta droga não são claros, mas uma

possibilidade é a meia-vida curta da substância na superfície das vias aéreas. Porém esses

achados abriram portas de estudos nos canais alternativos de Cl- para suprir a deficiência da

secreção desse ânion pelas células epiteliais dos pacientes FC (Clunes & Boucher, 2008;

Ratjen, et al., 2012; Moss, et al., 2013; Mall & Gallieta, 2015).

Uma grande candidata para essa função são as TMEM16s (“Anoctamin”; ANO),

que constituem uma família de 10 proteínas transmembranares (ANO 1 a 10; ou TMEM16A à

TMEM16K, com exceção da I). A TMEM16A (ou ANO1) é um canal de cloreto ativado pelo

cálcio (CaCCs) que transporta, bidireccionalmente, Cl-, HCO3- e outros ânions através da

membrana apical do epitélio (Pedemonte & Galietta, 2014). A TMEM16F (ou ANO6) foi

descrita como um canal de cloreto de retificação externa (ORCC – Outwardly Rectifying

Chloride Channel), embaralhador de fosfolipídios dependente de cálcio (Ca2+

), CaCC e um

canal não seletivo para cátions (Kmit et al., 2013; Ousingsawat et al., 2015). As TMEM16

são compostas por dez hélices transmembranares, quatro subunidades alfa e as extremidades

NH2- (N-terminal) e COOH- (C-terminal) e o poro de condutância do Cl- é formado de

dímeros de proteínas (Brunner et al., 2014).

43

Fisiologicamente, a TMEM16A é ativada por estímulos que mobilizam Ca2+

intracelular através da ativação de agonistas purinérgicos (P2Y; P2X) pelo ATP. No epitélio

das vias aéreas, a ativação deste canal pode ser causada por estresse mecânico (por exemplo,

tosse) ou outros estímulos, que liberam ATP intracelular, levando à secreção de ânions

dependente de TMEM16A (Ousingsawat, et al., 2011; Mall & Gallieta, 2015; Benedetto, et

al., 2017; Li, et al., 2017). Curiosamente a atividade da TMEM16A aumenta sob condições

pró-inflamatórias (citocinas ou componentes bacterianos), que levam a hipersecreção de muco

(Caci, et al., 2015; Gorrieri., et al., 2016).

Estudos reportam que a CFTR e o TMEM16A são os dois principais canais de

ânions secretores no epitélio intestinal e das vias aéreas e, portanto, fornecem uma regulação

crítica da hidratação do muco nesses locais. A TMEM16A, no epitélio das vias aéreas, esta

mais abundantemente presente nas células caliciformes, que secretam muco, já a CFTR é

predominante em células ciliadas e ambos os tipos celulares compões as glândulas

submucosas dos brônquios (Fig. 7). Foram relatadas duas correlações distintas entre essas

duas proteínas, primeiro que a TMEM16A é inibida pela ativação da CFTR e segundo que

esses canais apresentam interação nas correntes de Cl- ativadas tanto pelo Ca

2+ quanto para o

cAMP. Ainda mais, a TMEM16A é necessária para a expressão adequada de CFTR na

membrana plasmática com a interação do domínio de ligação PDZ, proteína necessária para

ancoragem das proteínas na membrana celular (Ousingsawat, et al., 2011; Mall & Gallieta,

2015; Benedetto, et al., 2017; Li, et al., 2017).

A TMEM16A pode representar um alvo terapêutico alternativo para contornar a

disfunção da CFTR no epitélio das vias aéreas de pacientes com FC. A estimulação

farmacológica da TMEM16A pode ajudar a normalizar as propriedades do LSA (liquido

superficial aerífero) e do muco aumentando a secreção de cloreto e bicarbonato. Sendo assim,

a estimulação da TMEM16A pode ser usada como terapia adjuvante na FC, em combinação

com moduladores da CFTR. Essa terapia pode ser especialmente valiosa para os indivíduos

que apresentam mutações no CFTR de classe I ou VII, já que essas não respondem à terapia

de moduladores da CFTR (Fig. 8) (Li, et al., 2017).

Um membro da família de transportadores de ânions SLC26 (Solute Carrier

Family 26), o SLC26A9 (Member 9), recentemente foi identificado como um alvo promissor

para melhorar a disfunção causada no epitélio da FC. Ao contrário dos outros membros da

família SLC26, que funcionam como transportadores de Cl- e HCO3- e participam da

regulação do pH, o SLC26A9 funciona como um canal de Cl-

com mínima condutância de

44

HCO3-. Assim como o CFTR, o canal de Cl- SLC26A9 possui uma relação linear de corrente-

tensão (I-V) com uma baixa condutância de canal único, ao contrário da resposta transiente da

TMEM16A. Diferentemente da CFTR, que é regulada pela fosforilação dependente de cAMP,

e da TMEM16A, regulada pela concentração de Ca2+

livre intracelular, a SLC26A9, uma vez

inserida na membrana apical do epitélio, permanece ativa secretando continuamente Cl-. Esses

dados sugerem que a SLC26A9 é um alvo importante para a terapia da FC, independente de

mutação do CFTR (Avella, et al., 2011; Mall & Gallieta, 2015; Salomon, et al., 2016; Strug,

et al., 2016; Bertrand CA, et al., 2017; Li, et al., 2017).

Figura 7. Deficiência no transporte de íons epiteliais e a defesa prejudicada do hospedeiro nas vias aéreas de FC.

A. Vias aéreas não FC: a secreção coordenada de sal e água conduzida pelo CFTR em conjunto com os canais

alternativos de cloreto TMEM16A e SLC26A9 e a absorção pelo canal epitelial de sódio ENaC, resultam na

hidratação adequada da camada de liquido superficial aerífero (LSA) essencial para uma limpeza muco ciliar

efetiva. Além disso, a secreção de bicarbonato mediada pelo CFTR contribui para a regulação do pH. B. Vias

aéreas FC: o mau funcionamento da CFTR prejudica a secreção de Cl- / HCO3- levando a desidratação e acidez

do LSA e um muco hiperconcentrado. A desidratação da LSA é ainda agravada pelo aumento da absorção de

sódio / H2O mediada pelo ENaC. Como resultado, a limpeza muco ciliar e a morte bacteriana são prejudicadas,

tornando as vias aéreas FC vulneráveis para infecção e inflamação (Modificado de: Mall & Gallieta, 2015).

A estrutura molecular prevista da SLC26A9, que está em fase de cristalização

(Geertsma, et al., 2015), contém um sítio de ligação PDZ em sua cauda C-terminal, sendo

possível interagir com a CFTR, no caso de ambas as proteínas estarem presentes na mesma

célula. Consistente com esta ideia, a co-expressão da SLC26A9 com a CFTR normal (wt/wt)

em células aumentou a secreção de Cl-, enquanto a co-expressão da SLC26A9 com um FC

mutante F508del/F508del reduziu a função da SLC26A9 (Fig. 7) (Avella, et al., 2011; Strug,

et al., 2016; Bertrand CA, et al., 2017; Li, et al., 2017).

A SLC26A9 também surgiu como um alvo terapêutico promissor na tentativa de

melhorar a clínica de pacientes FC nas vias respiratórias, no trato gastrointestinal e no

pâncreas (Fig. 8). No entanto, o conhecimento atual do canal de Cl- SLC26A9 é limitado e é

45

necessária uma investigação considerável antes que este canal possa ser testado como alvo

terapêutico em pacientes FC e potencialmente outras doenças pulmonares obstrutivas crônicas

(Salomon, et al., 2016; Strug, et al., 2016; Bertrand CA, et al., 2017; Li, et al., 2017).

Figura 8. Estratégias farmacológicas em canais iónicos na fibrose cística. A. Dependendo dos mecanismos

moleculares subjacentes, o resgate farmacológico de função da CFTR mutante pode ser corrigido por

potenciadores, corretores e agentes de leitura. Estratégias para compensar o mau funcionamento da CFTR

incluem a ativação dos canais alternativos de cloreto B.TMEM16A e C. SLC26A9. Em princípio, esses alvos

alternativos poderiam ser ativados por moduladores de tráfico que aumentam o número de canais de cloreto e/ou

por ativadores que aumentam a probabilidade de abertura desses canais na membrana plasmática apical. D. Além

disso, a inibição da absorção de sódio/H2O mediada pelo ENaC, seja diminuindo a sua ativação proteolítica por

inibidores de protease ou por inibição direta do canal por bloqueadores de ENaC podem ser usadas como uma

estratégia para neutralizar a desidratação da superfície das vias aéreas FC (Modificado de: Mall & Gallieta,

2015).

1.7. Polimorfismos em genes modificadores da CFTR e/ou FC

Indivíduos que possuem o mesmo genótipo de CFTR apresentam fenótipos

distintos de FC, inclusive manifestações diferentes nos órgãos afetados. Alguns fatores

ambientais, heterogeneidade nas mutações e alguns genes modificadores ligados a FC

determinam, por exemplo, a gravidade em que a doença se desenvolve (Cutting, 2015;

Beekman, 2015; Strug, et al., 2016; Marson, et al., 2017).

Por essas razões, os tratamentos na FC passaram a ser baseados não apenas em

terapias que visam melhorar os sintomas, mas também, com moduladores da função do canal

CFTR. No entanto, as respostas aos fármacos moduladores de função da CFTR ainda

apresentam respostas variadas de um indivíduo para o outro, mesmo naqueles de mesmo

genótipo (Amaral, 2015; Bell et al., 2015; Cutting, 2015; Beekman, 2016; De Boeck &

46

Amaral, 2016; Marson et al., 2017). Além disso, o efeito desses fármacos em mutações raras

e órfãs da doença ainda permanece desconhecido (Beekman, 2016, Veit et al., 2016).

O potenciador VX-770 e o corretor VX-809, semelhante a outros moduladores da

CFTR, demonstram alta variabilidade de resultados para indivíduos de mesmo genótipo, razão

que ainda não está elucidada. Porém, alguns fatores podem nortear essas respostas: o

metabolismo das drogas em cada indivíduo, a gravidade da doença pulmonar no momento em

que o paciente iniciou o tratamento e o efeito dos genes modificadores (Clancy, et al. 2012;

Boyle et al., 2014; Wainwright et al., 2015; Beekman, 2016, Veit et al., 2016; Pranke, et al.,

2017).

Portanto, identificar fatores genéticos que expliquem tal variabilidade de

resultados é importante para o desenvolvimento de uma medicina personalizada, que

considere a variabilidade do organismo de cada indivíduo (Beekman, 2016, Veit et al., 2016).

Um polimorfismo de nucleotídeo único (Single Nucleotide Polimorphismo - SNP) intrônico

no gene SLC26A9, rs7512462, contribui para a alteração da gravidade da doença FC no

pâncreas e intestino. Trabalhos recentes argumentam que isso também ocorre nas vias aéreas

e a ação desse SNP sobre a função da CFTR pode ser verificada em células HBE e HNE,

contribuindo significativamente para o desenvolvimento da medicina personalizada (Strug, et

al., 2016; Salomon, et al., 2016 Bertrand, et al., 2017; Pereira, et al. 2017).

Recentemente foi demonstrado esse mesmo SNP, rs7512462, no gene SLC26A9

melhora a função da CFTR e a resposta ao VX-770 em células HBE de pacientes com a

mutação G551D/outra, e também, melhora a resposta do VX-809 em células HBE de

pacientes F508del/F508del. Este polimorfismo demonstrou melhoras no VEF1 em pacientes

que são tratados com o potenciador da CFTR, Ivacaftor® (Strug, et al., 2016).

Outro polimorfismo que demonstrou uma melhora em pacientes FC foi o

rs3788766 no gene SLC6A14 (Solute Carrier Family 6 Member 14), porém, este parece não

apresentar uma melhor na função da CFTR, mas em diminuir infecções bacterianas,

principalmente para a P. aeruginosa. No pulmão, o SLC6A14 pode regular a purificação de

proteínas e consequentemente reduzir os nutrientes para o crescimento bacteriano, com isso

este gene atua sobre a colonização/infecção, especialmente por P. aeruginosa, que está

associada ao declínio da função pulmonar e à redução da sobrevivência (Di Paola, et al.,2017;

Pereira, et al., 2017). Esta associação foi demonstrada em células HBE, que na expressão

funcional do SLC6A14 diminuiu a colonização, em estágios iniciais, das vias aéreas por P.

aeruginosa. Esta proteína transporta um metabólito (L-arginina) promotor de anexos

47

essenciais para as bactérias aderirem no LSA do hospedeiro, sendo assim, o SLC6A14 pode

modificar a doença pulmonar na FC (Fig. 9) (Di Paola, et al.,2017).

Figura 9. Transporte de L-arginina do líquido superficial aéreo (LSA) pela SLC6A14 contribui para a defesa do

hospedeiro, reduzindo a ligação da P. aeruginosa (PA) à membrana apical das células epiteliais das vias aéreas.

O transportador de aminoácidos SLC6A14 (caixa roxa sólida) medeia à absorção de L-arginina em células

epiteliais ciliadas no pulmão. Quando a SLC6A14 é disfuncional (caixa roxa tracejada) devido à variação

genética (por exemplo, polimorfismos), a L-arginina é acumulada no LSA e aumenta a fixação da P. aeruginosa

na superfície das células epiteliais (Modificado de: Di Paola, et al.,2017).

48

2. Objetivo Geral

Avaliar as funções da CFTR e de canais de cloreto alternativos em células

primarias epiteliais brônquicas e nasais oriundas de pacientes FC e não FC do estado de São

Paulo.

2.1. Objetivos Específicos

Padronizar as técnicas de cultivo de células primárias epiteliais brônquicas e nasais

humanas no Laboratório de Fibrose Cística (LAFIC);

Avaliar a ação dos fármacos, corretor VX-809 e potenciador VX-770, na modulação

da CFTR em células HBE e HNE de pacientes com fibrose cística (FC);

Analisar a função da CFTR e a respostas aos fármacos VX-809 e VX-770 em células

HNE de pacientes FC F508del / F508del com polimorfismos em genes moduladores da CFTR

e / ou fenótipo da FC, rs7512462 (SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14);

Analisar a função da TMEM16A em células HBE e HNE de pacientes com e sem

fibrose cística (FC).

49

3. Métodos

3.1. Aspectos Éticos

Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética da FCM – Unicamp através da

plataforma Brasil, CAAE: 42458415.8.0000.5404 e número do parecer: 1.041.317. Os

materiais biológicos utilizados durante este estudo foram coletados mediante assinatura do

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) dos indivíduos participantes ou de seus

responsáveis legais.

3.2. Estudo em Células Primárias do Epitélio Brônquico Humano (HBE)

3.2.1. Pacientes com fibrose cística atendidos pelo Serviço de Transplante Pulmonar do

Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo.

Foram convidados a participar deste trabalho indivíduos maiores de 14 anos, com

diagnóstico de FC e atendidos pelo Serviço de Transplante Pulmonar do Hospital das Clínicas

da Universidade de São Paulo, São Paulo/SP, coordenado pelo Prof. Paulo Manuel Pêgo

Fernandes, que foram submetidos a transplante de pulmão. Os pacientes que aceitaram

participar deste estudo doaram um lóbulo pulmonar, os quais foram colhidos após o

procedimento de transplante pulmonar de rotina. Estes fragmentos foram transportados em

condições adequadas, em solução tampão de fosfato salino (PBS) a 4º C, até a Universidade

do Estadual de Campinas – Unicamp, SP. No LAFIC foi aplicado o protocolo de isolamento

das células epiteliais brônquicas para estabelecimento de culturas celulares HBE.

As células epiteliais traqueais controle foram obtidas por meio de consentimento

da família do doador do pulmão saudável, a qual permitiu o uso de fragmentos traqueais

originados durante o procedimento de transplante deste órgão, devido à necessidade de

adequação de seu tamanho à caixa torácica do paciente receptor. Os fragmentos de traqueia

foram colhidos durante procedimentos de transplantes realizados no Hospital das Clínicas da

Universidade de São Paulo.

Também foi coletado um lóbulo pulmonar retirado de um paciente com discinesia

ciliar e doado para estudo, com o consentimento dos responsáveis. O lóbulo foi

cirurgicamente retirado no Centro Cirúrgico do Hospital de Clínicas da Unicamp.

50

3.2.2. Padronização do cultivo de células primárias epiteliais brônquicas humanas

(HBE)

As células HBE foram isoladas dos brônquios dissecados de pulmões

transplantados advindos do Instituto do Coração/ Hospital das Clínicas da USP e do Hospital

de Clínicas da Unicamp, seguindo a metodologia descrita por Fulcher et al. (2009). O lóbulo

pulmonar (Fig. 10A) foi dissecado, retirando as estruturas aderentes proximais e distais das

vias aéreas, com ajuda de pinças, tesouras e bisturis cirúrgicos estéreis até os brônquios

ficarem “limpos” (Fig. 10B). Os brônquios foram cortados em pequenos pedaços de 5-10 cm,

lavados e limpos com PBS, para retirar o máximo de muco possível, colocados em um tubo

de 50ml (Sarstedt - PPGWB) e foram lavados três vezes com o meio, pré-preparado, “Wash

Media” (Joklik’s MEM - Sigma-Aldrich/M8028; L-glutamine - Sigma-Aldrich/G7513;

Gentamicin - Sigma-Aldrich/G1397; Penicillin-Streptomycin - Sigma-Aldrich/P4333) mais o

coquetel de antibióticos ACTV (Anfotericina B: 1mg – Sigma-Aldrich / A2942; Ceftazidina:

139mg – Sigma-Aldrich / CDS020667; Tobramicina: 80mg – Sigma-Aldrich / T4014; e

Vancomicina: 100mg – Sigma-Aldrich / V2002). Após as lavagens, foram adicionados 30ml

Soak solution (Wash Media + DL-Dithiothreitol (DTT) - Sigma-Aldrich/D0632;

Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) - Sigma-Aldrich/DN25) no tubo contendo

os brônquios e agitados, sob uma placa de agitação (Dragon Lab – SK-R1807-E), por 18 –

24hs a 4ºC. Após esse período, foi adicionando 10% de soro fetal bovino (FBS - Sigma-

Aldrich/F6178), para inibir a ação enzimática, e o conteúdo do tubo foi colocado em placas de

Petri de 155-mm, para realizar a retirada das células HBE dos brônquios. Com auxílio de

bisturis e pinças cirúrgicas estéreis, os brônquios foram raspados, gentilmente do lado luminal

do tecido, para retirar as células epiteliais. Após a máxima retirada de células dos brônquios, o

meio com as células foi coletado das placas e colocado em novos tubos de 50 ml, que foram

centrifugados a 500g por 5min a 4ºC. Então o sobrenadante foi descartado e é possível ver

duas colorações no precipitado, uma branca, contendo as células HBE, e outra vermelha

contendo células sanguíneas (hemácias), com isso, as HBE foram ressuspendidas em 3 ml de

“tampão de lise de sangue vermelho” (Sigma-Aldrich - R7757), incubadas por 10 min a 4º C,

adicionado 10 ml de PBS, e centrifugado novamente a 500g por 5min a 4ºC. Caso o

precipitado ainda tivesse cor avermelhada, o procedimento foi repetido até obter um

precipitado “limpo” (branco). Com o precipitado branco, as células HBE foram

ressuspendidas em Declump Solution (DPBS; Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) -

51

Sigma-Aldrich/EDS; DL-Dithiothreitol (DTT) – Sigma-Aldrich/D0632; Colagenase de

Clostridium histolyticum - Sigma-Aldrich/C2674; Desoxirribonuclease I de pâncreas bovino

(Dnase) - Sigma-Aldrich/DN25) e incubadas por 30 minutos a 37ºC. Após a incubação foi

adicionado 10% de FBS e novamente centrifugadas a 500g por 5min a 4ºC. O sobrenadante

foi descartado e o precipitado ressuspendido em meio de cultura de crescimento epitelial

brônquico (do inglês: Bronchial Epithelial Growth Media – BEGM) (Tabela 1). As células

HBE foram contadas em câmera de NeuBauer (PROLAB /K5-0111) e plaqueadas em uma

taxa de 2-6*106 por placa de petri de 100mm (Corning Costar – 430167) (Fig. 10C) já com o

um pré-revestimento de um dia, utilizando solução de revestimento de fibronectina e colágeno

(100mL LHC – Gibco/12677; 10mL Bovine serum albumin - Sigma-Aldrich/A9647; 1mL

Collagen from rat tail tendon – Roche/11179179001; 1mL Human Fibronectin - BD

Biosciences/354008).

Figura 10. Células Primárias Humanas Epiteliais Brônquicas – HBE. A. Lóbulo pulmonar B. Arvore brônquica

após a remoção das partes aderentes (limpo) C. Células primárias epiteliais brônquicas em placas p-100

(Aumento de 20 vezes). D. Células epiteliais brônquicas com 100% de confluência em filtros de membrana

porosa de poliéster Corning® Costar® Snapwell (Aumento de 10 vezes).

As células HBE foram cultivadas em BEGM mais o coquetel de antibióticos

ACTV por cinco dias, e após esse período foi retirado o ACTV do meio e cultivado até

atingirem 70 a 90% de confluência, trocando o meio em dias alternados. Após a confluência

desejada as células foram tripsinizadas (EDTA 10x – Sigma-Aldrich/59418C) e transferidas

para filtros de membranas porosas de poliéster Corning®

Costar®

Snapwell (Sigma-Aldrich /

CLS3801) previamente tratadas com colágeno IV (Sigma-Aldrich / C7521), em meio para

diferenciação e polarização das células em interface ar-líquido (do inglês: Air Liquid Interface

52

– ALI) (Fig. 10D, Tabela 1). Finalmente as células foram cultivas por ~21 dias, e as

medições da resistência elétrica transepitelial (TEER) foram realizadas uma vez por semana,

com eletrodos chopsticki do aparelho o Milicell® ERS-2 (Fig. 11), e ao atingir uma resistência

transepitelial mínima de 600 Ω/cm2, esta monocamada de células HBE foram incubadas por

48hs com 3µM VX809 (Selleckchem / S1565) ou 0,05% de DMSO (Sigma-Aldrich / D2650)

e realizou-se o estudo eletrofisiológico deste material em Câmaras de Ussing.

Tabela 1. Listas de materiais utilizados na preparação dos meios de cultura de crescimento epitelial brônquico

(do inglês: Bronchial Epithelial Growth Media – BEGM) e meio para diferenciação e polarização das células em

interface ar-líquido (do inglês: Air Liquid Interface – ALI).

BEGM CHECKLIST ALI CHECKLIST

Quantidade para 1L Quantidade para 1L

LHC (Gibco 12677) LHC + DMEM (Sigma D6429) (50:50)

Aditivo Quantidade Aditivo Quantidade

Insulina 1,05mL Insulina 1,05mL

Transferina 1,05mL Transferina 1,05mL

Hidrocortisona 1,05mL Hidrocortisona 1,05mL

Triiodotironina 1,05mL Triiodotironina 1,05mL

Epinefrina 1,05mL Epinefrina 1,05mL

EGF 1mL EGF 20µL

Ácido retinóico 1,05mL Ácido retinóico 1,05mL

Fosforyletanolamina 1,05mL Fosforyletanolamina 1,05mL

Etanolamina 1,05mL Etanolamina 1,05mL

Stock 11 1,05mL Stock 11 1,05mL

Pen/Strep 1,05mL Pen/Strep 1,05mL

Gentamicina 1,05mL BPE 714µL

Anfotericina B 1,05mL BSA 3,4mL

BPE 714µL Elementos mínimos 1mL

BSA 3,4mL Stock 4 1mL

Elementos mínimos 1mL

Stock 4 1mL

Figura 11. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER) em células primárias epiteliais nasais e

brônquicas humanas. A. Ilustração representativa da inserção do eletrodo chopstick nos filtros de membrana

porosa para a realização das medições TEER. B. Aparelho Milicell® ERS-2, eletrodo chopstick e placa de 6

poços contendo os filtros de membrana porosa de poliéster Corning® Costar

® Snapwell (Modificado de: Ebrary,

2018).

53

3.3. Estudo em Células Primárias do Epitélio Nasal Humano (HNE)

3.3.1. Pacientes diagnosticados com FC atendidos pelo ambulatório de fibrose cística do

departamento de pediatria do hospital de clínicas da Unicamp

Foram convidados a participar deste estudo indivíduos maiores de cinco anos de

idade, diagnosticados com FC e encaminhados ao Ambulatório de Fibrose Cística do

Departamento de Pediatria da Unicamp, coordenado pelo médico Prof. Dr. Antônio Fernando

Ribeiro. Indivíduos não FC, para o grupo controle, foram convidados para participar do

estudo após a confirmação de não terem FC por exames de diagnóstico, teste do suor e

evaporimetria, no Centro de Investigação Pediátrica (CIPED).

3.3.2. Padronização da técnica de cultivo das células HNE

Foram coletadas células HNE de 38 pacientes com uma micro escova interdental

(Interdental brush / 10028353), inserindo-a em ambas as narinas dos pacientes, após lavagem

com solução salina (NaCl – 0,9% – Samtec/L:SES), no Ambulatório de Pediatria do Hospital

de Clinicas – Unicamp, por um profissional qualificado. Após a coleta, a escova foi

transferida para tubos de 2 ml (Costar-3213) contendo uma ponteira de 200 µL (Exacta

Cruz/SC-222441) adaptada, para realizar a retirada das células das cerdas da escova, em meio

de cultura DMEM-F12 (Sigma-Aldrich/D9785) com 1% de L-Glutamina (Sigma-

Aldrich/G7513), 1% de penicilina e estreptomicina (Sigma-Aldrich/P4333), 10% de soro de

bezerro recém-nascido (NBCS – Sigma-Aldrich/N4637), 0,4% de anfotericina B (Sigma-

Aldrich/A2942), tobramicina 0,16µg/ml (Sigma-Aldrich/T4014) e vancomicina 0,1µg/ml

(Sigma-Aldrich/V2002).

O tubo contendo as células foi transportado à temperatura ambiente até o

Laboratório de Fibrose Cística (LAFIC), e foi centrifugado (Eppendrof 5804 R) a 500g, por 5

minutos à 4ºC, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspendido no meio DMEM-F12

novamente. Na sequência foi realizada a contagem das células utilizando a câmara de

Neubauer e após a contagem as células HNE foram cultivadas utilizando a técnica de cultura

de Células Reprogramadas Condicionalmente (CRC) (Suprynowicz, et al., 2012).

Para a realização da cultura das HNE-CRC, primeiro cultivou-se, por uma

semana, fibroblastos de linhagem de camundongo (NIH 3T3) em frascos T25 (Sarstedt / D-

54

51588) utilizando o meio de cultura DMEM-F12 aditivado com 1% de L-Glutamina, 1% de

pen/strep, e 10% de NBCS, trocados em dias alternados. O cultivo foi feito até a confluência

total (100% – ~1 semana), e os fibroblastos foram irradiados a 60 greys em um irradiador

localizado no Laboratório de Banco de Sangue do Hospital de Clínicas da Unicamp. Com os

fibroblastos prontos, pré-irradiados com 24h de antecedência, as HNE foram semeadas nas

garrafas de cultura T25 sobre os fibroblastos, para assim realizar a co-cultura. Nos primeiros

sete dias de cultura foram utilizados no meio DMEM-F12, além dos aditivos padrões listados

acima, foi adicionado o inibidor da Rho quinase (Sigma-Aldrich/Y0503) (10µM) e o coquetel

de antibióticos ATV (Anfotericina B 0,4%, Tobramicina 0,16µg/ml e Vancomicina

0,1µg/ml). Após esse período os antibióticos foram retirados do meio, e as células HNE foram

cultivadas até uma confluência de 80-90%, trocando os meios em dias alternados.

Após a confluência desejada ter sido atingida, foi realizada a tripsinização

diferenciada para separar as células nasais dos fibroblastos. Assim, retirou-se o meio de

cultura, lavaram-se as células com PBS (Sigma-Aldrich/372595) e foram colocados 3 ml de

tripsina EDTA 1X (Sigma-Aldrich/T2600000) na garrafa T25 e incubadas por 90 segundos à

37ºC, após esse tempo as células foram analisadas no microscópio invertido (OPTIKA-XDS-

3LT) para averiguar se os fibroblastos descolaram. Ao descolarem todos os fibroblastos,

descartamos e acrescentamos a tripsina EDTA 10X e incubamos, novamente, por 5 minutos à

37ºC. Adicionou-se 10 ml de meio de cultura para inibir a ação da tripsina e o conteúdo foi

transferido para um tubo de 15 ml (Sarstedt - PPGWB) e centrifugou-se por cinco minutos a

1800rpm a 4ºC. Descartou-se o sobrenadante e o precipitado foi ressuspendido com o meio de

cultura e as células foram contadas novamente (Fig. 12).

Depois da contagem, as células CRC-HNE foram transferidas para filtros de

membrana porosa de poliéster Corning® Costar

® Snapwell, a uma taxa de 3*10

5 células por

filtro, previamente tratadas com colágeno IV e mantidas em meio de cultura ALI (Tabela 1)

onde se diferenciaram e formaram um epitélio nasal polarizado com seu fenótipo diferenciado

original, incluindo células ciliadas e células secretoras de muco (Liu et al., 2012;

Suprynowicz et al., 2012). Finalmente foi aplicado o mesmo protocolo das células HBE em

cultura ALI, e após uma TEER de 1000Ω/cm2 as células CRC-HNE foram incubadas com 3

µM de VX-809 ou 0,05% de DMSO por 48hs e analisadas posteriormente em Câmara de

Ussing.

55

Figura 12. Imagens em objetiva 10X da co-cultura das células primárias epiteliais nasais com os fibroblastos

NIH/3T3. Tripsinização diferenciada das células HNE e dos fibroblastos: A. Células HNE mais os fibroblastos

em co-cultura e B. após a adição da tripsina EDTA (1X) por 90s à 37ºC, os fibroblastos foram descolados,

restando apenas células HNE aderidas aos frascos T25.

3.3.3. Análise dos polimorfismos SNP rs7512462 no gene SLC26A9 e rs3788766 no gene

SLC6A14

Foram coletadas alíquotas de sangues dos pacientes homozigotos para a F508del,

extraídos o DNA e analisados via PCR em tempo real, para avaliação do SNP rs7512462 do

gene SLC26A9 e rs3788766 no gene SLC6A14 como descrito anteriormente (Pereira, et al.,

2017).

3.4. Câmara de Ussing

3.4.1. Princípios gerais sobre a Câmara Ussing

A câmara de Ussing consiste em duas metades funcionais. Uma delas é a própria câmara

e a outra é o circuito elétrico. Uma infinidade de variações técnicas para ambas as subunidades tem

sido desenvolvida. Câmaras estão disponíveis em diferentes formas e tamanhos, enquanto o circuito

eletrônico permite não apenas a medição de resistência, corrente e voltagem, mas também os

parâmetros de impedância e capacitância (HUG, 2002).

Atualmente, todos os tipos de tecidos epiteliais e membranas celulares polarizadas têm

sido estudados com a câmara de Ussing. Duas abordagens tornaram isso possível: (i) concepção de

microcâmaras permitindo o estudo de até mesmo os menores fragmentos de tecido, que exigem

significativas técnicas de microcirurgia, para serem obtidos e (ii) a utilização de células cultivadas em

filtros de suporte membranoso permeável, que transformou a Câmara de Ussing amplamente utilizada

e bem-sucedida (HUG, 2002).

56

3.4.2. Tipos de Câmaras de Ussing

Atualmente existem dois tipos de câmaras de Ussing: câmara de circulação e a de

perfusão contínua. Enquanto o primeiro tem sido adotado pela maioria dos laboratórios por sua

simplicidade, o outro oferece várias vantagens distintas. Neste trabalho foi utilizada a câmara de

Ussing de perfusão contínua micro modificada.

3.4.3. A Câmara de perfusão continua

As duas metades das câmaras, feitas de teflon (Fig. 13) são projetadas para minimizar a

pressão hidrostática e, portanto, evitar danos graves ao tecido durante a perfusão. O banho de soluções

dos dois lados do tecido é entregue para a câmara de Ussing dos reservatórios montados 20-50 cm

acima da câmara através de tubos de polietileno para o interior da câmara, usando válvulas para

regular a vazão. A temperatura é regulada por meio de um sistema de aquecimento de água com tubos

de peças T, que cercam os tubos finos de polietileno com as soluções dos reservatórios. As

extremidades do tubo externo são seladas com tampas de borracha (Fig. 14) (HUG, 2002).

Figura 13. Câmara de Ussing de perfusão contínua micro modificada.

Para a utilização de amostras de tecido muito pequena, tais como as biopsias retais, um

pequeno disco circular mantém o tecido inserido (diâmetro <1 mm) entre as duas metades da câmara,

após tudo ser montado. O mesmo é realizado para as células polarizadas, entretanto o disco removível

é adaptado para acoplar as membranas de filtro porosas de poliéster contendo as células polarizadas

(Corning® Costar

® Snapwell). Ao olhar para as Câmaras de Ussing, podem ser observados pequenos

buracos perfurados ao redor da câmara. Estes furos permitem a inserção de quatro eletrodos (eletrodos

de Agar e eletrodos de Prata (Ag) / Cloreto de Prata – AgCl) e tubos para a entrada e saída de

soluções, em ambas as metades da câmara.

Entrada de Fluxo

Disco Removível

Eletrodos de Agar

Base aquecida

Saída de Fluxo

Parte da Câmara

Ag/AgCl Eletrodos

57

Figura 14. Duas Microcâmaras de Ussing com sistema de perfusão contínua comum, montadas em gaiola de

Faraday.

3.4.4. Medições transepiteliais em circuito aberto

3.4.4.1. Voltagem Transepitelial

Tecidos e células epiteliais transportam íons e, portanto, geram uma voltagem

transepitelial. Esta voltagem tem sido denominada como "potencial de transporte ativo". Um pré-

requisito para a geração do potencial de transporte é a distribuição assimétrica dos canais de íons nas

membranas apicais e basolaterais das células epiteliais polarizadas. O movimento líquido de cargas

positivas da região apical para a região basolateral gera uma voltagem que é igual à diferença da

voltagem entre as duas membranas (HUG, 2002).

3.4.4.2. Resistência transepitelial

O epitélio apresenta duas características que os distinguem de todos os outros

tecidos: polaridade e estancamento (do inglês tightness). A polaridade é gerada pela

distribuição assimétrica de proteínas, tanto nas membranas apicais como nas membranas

basolaterais. Um conjunto de proteínas chamadas "tight junctions" separa as duas membranas.

A formação e a permeabilidade das "tight junctions" determina a resistência e a integridade do

58

tecido. Voltagens podem ser relatadas pela resistência elétrica. Tanto o tratamento inadequado

do tecido como o design inadequado da câmara irá influenciar significativamente a resistência

transepitelial, eventualmente tornando impossíveis medições elétricas (HUG, 2002).

3.4.4.3. Circuito Aberto (Fig. 15)

Foram injetados pulsos curtos de corrente (0,5 µA - duração de 1s, período de 5s)

nas câmaras, através de um gerador de pulsos. A corrente passa através do tecido e cria um

desvio de voltagem breve, deixando a célula intacta na maior parte do tempo durante a

medição. O sinal medido é uma corrente internamente "traduzida" em uma voltagem pelo

gerador de pulsos, que é continuamente monitorado e gravado por um sistema de aquisição de

dados (Power Lab). Sob essas condições, quando Rte (resistência transepitelial) e Vte

(voltagem transepitelial) são conhecidos, a Isc (Corrente de Curto-Circuito) também pode ser

calculada a partir da Lei de Ohm: Isc = Vte / Rte.

Figura 15. Circuito elétrico na Câmara de Ussing em condições de circuito-aberto.

3.5. Protocolos para a avaliação da função da CFTR e TMEM16A em células HBE e

HNE em Câmara de Ussing

Para o protocolo do estudo de função do CFTR na Câmara de Ussing são usados

diversos compostos para a ativação ou inibição de canais iônicos, esses são dissolvidos em

solução tampão de Ringer (em mM: NaCl 145; KH2PO4 0,4; K2HPO4.3H2O 1,6; Glucose 5;

MgCl2.6H2O; Ca-Gluconat.1H2O 1,3) que foi complementado com a Indometacina (10 mM),

59

para bloquear a atividade de secreção basal de Cl- dependente de cAMP e o pH foi ajustado

para 7,4. As concentrações de Cl- apical e basal foram mantidas equivalentes. Após um

período de equilíbrio de 20 min, a amilorida (20μM) foi adicionada ao lado luminal para

bloquear o fluxo de Na+ mediado pelo ENaC, então o agonista de cAMP, forscolina (2 µM

FSK), potenciador VX-770 (10μM), e inibidor específico do canal CFTR (CFTInh172 –

30μM) foram adicionados sequencialmente (Moniz et al., 2013; Awatade et al., 2015)

(Protocolo 1). Ao término de cada protocolo do CFTR, foi adicionado o ATP (100µM) para

análise de Isc-eq geradas pelo ativo. Na tentativa de elucidar essa resposta, foi adicionado em

conjunto com o ATP o inibidor de CaCCs, específico para as TMEM16s, CaCCinh-AO1

(40µM) (Cabrita, et al., 2017; Benedetto, et al., 2017) (Protocolo 2).

Os sais e compostos utilizados foram obtidos da Sigma-Aldrich, exceto o VX-809

e VX-770 que foram adquiridos na SelleckChem.

Protocolo 1 – CFTR: Protocolo de análise da secreção de Cl- dependente da CFTR. Na região apical

das células foram adicionados os seguintes compostos dissolvidos em solução tampão de ringer mais

indometacina (Indo – 10µM), sempre em adição ao anterior: Amilorida (Amil – 20µM), inibidor do

ENaC; ativação da CFTR pela forscolina (FSK – 2µM); o potenciador da CFTR VX-770 (10µM); e o

inibidor específico da CFTR 172 (CFTRinh 172 – 10µM). Na região basolateral das células CRC-HNE

foram constantemente perfundido por ringer mais Indo.

Região apical das células HNE

Ringer + Indo

Amil (20µM)

Forscolina (2 µM)

VX-770 (10 µM)

CFTRinh172 (10 µM)

Disco de inserto com as células HNE

Ringer + Indo

Região basolateral das células HNE

Protocolo 2 – TMEM16A: Protocolo de função da TMEM16A pela determinação da secreção de

Cl- após a aplicação do protocolo da CFTR. Após a aplicação do protocolo de ativação da CFTR, as

células CRC-HNE foram lavadas por 20 min e foram adicionados os seguintes compostos

dissolvidos em solução tampão de ringer mais indometacina (Indo – 10µM): o ATP (100µM);

lavadas por 20 min; TMEM16A será inibida pelo CaCCinh-AO1 (AO1 - 20µM); ativada pelo ATP

(100µM); novamente a lavagem por 20 min; e finalmente a ativação da TMEM16A pelo ATP

(100µM) “sozinho”. Na região basolateral das células HNE foram constantemente perfundido por

ringer mais Indo.

Região apical das células HNE

Ringer + Indo

Amil (20µM)

Protocolo

da CFTR

20

min ATP (100 µM)

20

min AO1 (20 µM)

20

min ATP (100 µM)

ATP (100 µM)

Disco de inserto com as células HNE

Ringer + Indo

Região basolateral das células HNE

60

3.6. Análise estatística

Os resultados foram expressos em: 1) Delta da média aritmética das Isc-eq de cada

composto (ΔIsc-eq); 2) Erro padrão da média (SEM), dado pelo desvio padrão dos ΔIsc-eq dos

compostos referidos dividido pela raiz quadrada do número de experimentos.

O teste estatístico teste T de Student foi aplicado, unicaudal para calcular amostras

de uma mesma população de dados emparelhadas e bicaudal para calcular diferenças

significativas entre duas populações de dados emparelhadas, com um intervalo de confiança

de 95% e uma significância a partir de valor p <0,05.

61

4. Resultados

4.1. Análise do resgate da função da CFTR pelos fármacos VX-809 e VX-770 em

células HBE de pacientes FC

Foram isoladas células HBE de lóbulos pulmonares de 11 pacientes FC, de um

paciente não FC e de uma traqueia de um paciente não FC transplantados no INCOR em São

Paulo e no HC da Unicamp. Dos 12 lóbulos, cinco tiveram células HBE extraídas e analisadas

com sucesso. Dentre os sete pulmões não avaliados neste estudo, dois (Pul2 e Pul10) tiveram

suas células lisadas durante o protocolo de isolamento das células HBE, em outros dois as

culturas apresentaram contaminação persistentes por fungos e bactérias (Pul1 e Pul6), um não

foi utilizado por apresentar insuficiência de células (Pul7) e finalmente, em outros dois

lóbulos as células não aderiram nas placas de cultura (Pul8 e Pul9). As células epiteliais

traqueais do paciente não FC foram também extraídas e analisadas com sucesso (Tabela 2).

Tabela 2. Dados do isolamento das células primárias epiteliais brônquicas de lóbulos pulmonares explantados no

INCOR e no HC da Unicamp.

Pulmões Data Situação Motivo Crio preservado

Pul1 Set / 2015 Descartado Contaminação Não

Pul2 Nov / 2015 Descartado Células Lisadas Não

Pul3 Dez / 2015 Analisado — Sim

Pul4 Dez / 2015 Analisado — Sim

Pul5 Fev / 2016 Analisado — Sim

Pul6 Abr / 2016 Descartado Contaminação Não

Pul7 Jun / 2016 Descartado Poucas Células Não

Pul8 Set / 2016 Descartado Não adesão em placas Não

Pul9 Nov / 2016 Descartado Não adesão em placas Não

Pul10

Pul 11

Dez / 2016

Fev/2017

Descartado

Analisado

Células Lisadas

—

Não

Sim

Pul 12 Ago/2017 Analisado — Sim

Traq 4 Dez / 2015 Analisado — Sim

As células HBE dos pulmões FC analisados, Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11 tiveram o

gene CFTR sequenciado pela técnica de sequenciamento de nova geração (NGS – New

Generation Sequencing) com painel da Illumina, e foram encontrados os seguintes genótipos

de mutações: Pul3 ? / ?; Pul4 c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?; Pul5 F508del /

c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs); e Pul11 F508del / ?. Os pontos de interrogação (?)

significam que não foi encontrada uma mutação no gene CFTR, porém não indica que não

seja FC, e outras análises genéticas devem ser feitas para encontrar a mutação de CFTR

desses pacientes.

62

A análise da função da CFTR nas células HBE do Pul3 apresentaram valores de

ΔIsc-eq-FSK basal e na adição do potenciador VX-770 próximas a zero, incubadas com o DMSO,

e negativas na presença do VX-809, demonstrando pouca e/ou nula função da CFTR. Os

valores de ΔIsc-eq-FSK foram estatisticamente maiores no grupo DMSO em comparação com o

VX-809 e VX-809 + VX-770, e ΔIsc-eq-FSK maiores com DMSO + VX-770 que o VX-809 +

VX-770 (Fig. 16, Tabela 3). A presença dos fármacos nessas células não demonstraram

melhoras na função da CFTR, ao contrário, diminuiu, o VX-770 teve 0,98% (±0,20) sendo

menor que a basal, 1,29% (±0,60), e o VX-809 apresentando números negativos, -0,99%

(±0,72), bem como a combinação dos dois VX-809 + VX-770, -1,39% (±0,89) de função da

CFTR em relação ao controle (Pul 12) (Fig. 23, Tabela 4).

Figura 16. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm

2) das células HBE do paciente

Pul3 (? / ?) . A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias

epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs

com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara de Ussing

(mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=6–9). *: Estatisticamente diferente pelo teste

T de Student bicaudal. p < 0,05.

Nas células HBE do Pul4 (c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?) demonstraram uma

função basal, ΔIsc-eq-FSK (DMSO), acima do esperado para um paciente FC e teve um aumento

nos valores de ΔIsc-eq-FSK com VX-809 e VX-809 + VX-770, entretanto o VX-770 não

demonstrou potenciar a atividade da CFTR nessas células (Fig. 17, Tabela 3). As funções de

CFTR basais foram de 10,38% (±2,03) em relação ao controle (Pul 12), demonstrando uma

melhora pelo VX-809 de 15,31% (±1,58). Já na presença do VX-770 essa melhora também

63

foi inferior a basal, 9,91% (±2,26), e com o VX-809 + VX-770, 12,21% (±1,48) inferior ao

VX-809 sozinho (Fig. 23, Tabela 4).



Pul4 (c.1010T>A (p.Phe337Tyr) / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de

células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e

incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em

Câmara de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3).

Nas células HBE do Pul5 (F508del / c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs)), o

VX-770 demonstrou um efeito bem expressivo, tendo valores de ΔIsc-eq-FSK bem superiores

quando comparadas com os ΔIsc-eq-FSK basal. No grupo DMSO os valores de ΔIsc-eq-FSK com

VX-770 foram 3,6 vezes maiores que os ΔIsc-eq-FSK basal e no grupo VX-809 33 vezes maiores

do que os ΔIsc-eq-FSK basal, demonstrando um grande efeito desse fármaco nessas células. A

ação do VX-809 + VX-770 nos valores ΔIsc-eq-FSK gerados foram 2,5 vezes maiores que os nos

ΔIsc-eq-FSK no grupo DMSO + VX-770 (Fig. 18, Tabela 3). A função resgatada da CFTR pelo

VX-770 foi de 49,55% (±2,83) e da combinação dos dois fármacos, VX-809 + VX-770

apresentando uma função de 123,81% (±57,36), ou seja, superior ao grupo controle (Pul12).

Por outro lado, nessas células o VX-809 sozinho demonstrou um efeito negativo tendo valore

de ΔIsc-eq-FSK menores no grupo VX-809 comparado com o grupo DMSO, e apresentou um

resgate da CFTR de 3,72% (±1,54), sendo menor que a função basal de 13,57% (±6,44) (Fig.

23, Tabela 4).

64



Pul5 (F508del / c.1234_1238delGCAAA (p.Ala412Thrfs)). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em

Câmaras de Ussing, de células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning®

Costar® Snapwell e incubadas por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos

experimentos, analisados em Câmara de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809.

(n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T de Student bicaudal. p < 0,05.

As análises das células HBE do Pul 11 (F508del / ?) demonstraram uma melhora

pelos fármacos na função da CFTR. O VX-809 resgatou quase o dobro da função basal da

CFTR nessas células. Os valores de ΔIsc-eq-FSK basal e com o VX-770 foram semelhantes,

porém, os ΔIsc-eq-FSK nos grupos incubados com o VX-809 e VX-809 + VX-770 foram

superiores em comparação ao grupo DMSO, sendo, estatisticamente diferentes, os valores de

ΔIsc-eq-FSK do grupo VX-809 + VX-770 em comparação com o DMSO (Fig. 19, Tabela 3). A

função basal da CFTR nessas células foi de 4,72% (±0,43), o VX-770 apresentou uma

pequena melhora, 4,86% (±0,60), o VX-809 teve uma função de 8,23% (±1,34) e a

combinação dos dois apresentou uma função de 8,82% (0,47±) quando comparadas ao normal

(Pul12) (Fig. 23, Tabela 4).

65

Figura 19. Análise das correntes de curto circuito equivalentes (ΔIsc-eq - µA/cm2) das células HBE do paciente

Pul11 (F508del / ?). A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células

primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar

® Snapwell e incubadas

por 48hs com 0,05% de DMSO ou 3µM VX-809. Traçados originais dos experimentos, analisados em Câmara

de Ussing (mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente

pelo teste T de Student bicaudal. p < 0,05.

Na análise das células HBE do Pul12, um paciente não fibrocístico, com

discinesia ciliar, demonstrou valores de ΔIsc-eq-FSK de 11,649 (±4,72 – µA/cm2) e esse valor foi

considerado a função normal de CFTR (100%). A presença dos fármacos diminuiu essa

função basal, principalmente na combinação do VX-809 + VX-770, gerando ΔIsc-eq-FSK de

5,991 (±1,572 – µA/cm2), porém não foram estatisticamente diferentes (Fig. 20, Tabela 3). A

função basal dessas correntes foi considerada como 100% de função da CFTR, a incubação do

VX-809 diminuiu essa função para 63,77% (±14,99), o VX-770 para 67,33% (±19,96) e a

combinação de ambos, resultou em uma diminuição ainda maior para 51,42% (±13,49) (Fig.

23, Tabela 4).

66



Pul12 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias

epiteliais brônquicas humanas (HBE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs


(mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3). *: Estatisticamente diferente pelo teste T

de Student bicaudal. p < 0,05.

Finalmente, os ΔIsc-eq-FSK analisados das células HTE da Traq3, não FC, foram

inibidas pela ação do inibidor específico CFTR 172 (30µM) e não foi afetado pela presença

dos fármacos VX-770 e/ou VX-809. Ao contrário, uma diminuição nos valores de ΔIsc-eq-FSK,

o mesmo observado no Pul12 (Fig. 20, Tabela 3). Foi realizada uma análise comparativa em

relação às funções da CFTR entre as células HBE do Pul 12, não FC, e das células HTE da

Traq4, também não FC. Esses resultados demonstraram valores de ΔIsc-eq-FSK próximas

(Tabela 4) e também a mesma redução nos ΔIsc-eq-FSK na presença dos fármacos. Comparando

a função da CFTR, tendo os ΔIsc-eq-FSK do Pul12 como 100%, os ΔIsc-eq-FSK da Traq4 tiveram

funções de 102,79% (±34,12). Entretanto nas células HTE os fármacos reduziram ainda mais

a função do CFTR, com VX-770 uma função de 36,58% (±12,95), com o VX-809 de 44,69%

(±8,02) e a combinação VX-809 + VX-770 de 19,50% (±6,91) (Fig. 23, Tabela 4).

67


2) das células HTE do paciente

Traq4 não FC. A. ΔIsc-eq-FSK do protocolo de ativação da CFTR, em Câmaras de Ussing, de células primárias

epiteliais traqueais humanas (HTE), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e incubadas por 48hs


(mV), de células HBE incubadas com B. DMSO e C. VX-809. (n=3 – 6).

Tabela 3. Análise dos ΔIsc-eq em µA/cm2

do protocolo de função da CFTR nas células HBE e HTE em Câmara

de Ussing.

Paciente

ΔIsc-eq-FSK ± SEM

n

Valores de p (DMSO)*

DMSO

(0,05%)

VX-770

(10µM)

VX-809

(3µM)

VX-809 + VX-

770 VX-770 VX-809

VX-809 + VX-

770

Pul3 0,15

±0,023

0,115

±0,023

-0,115

±0,078

-0,161

±0,104 9 0,599 0,027 0,022

Pul4 1,209

±0,236

1,155

±0,263

1,784

±0,184

1,422

±0,172 3 0,690 0,128 0,507

Pul5 1,581

±0,751

5,772

±0,329

0,434

±0,18

14,423

±6,682 3 0,048 0,211 0,129

Pul11 0,550

±0,050

0,566

±0,070

0,959

±0,156

1,028

±0,055 3 0,888 0,067 0,003

Pul12 11,649

±4,720

7,844

±2,325

7,428

±1,747

5,991

±1,572 5 0,196 0,390 0,250

Traq3 11,975

±3,974

4,262

±1,508

5,206

±0,935

2,272

±0,805 6 0,452 0,128 0,141

Valores de p: comparação da incubação com as drogas em relação ao controles por DMSO

Analisando todas as células HBE dos pulmões, o Pul3 teve os menores valores de

ΔIsc-eq-FSK, DMSO, VX-770, VX-809 e VX-809 + VX-770, sendo estatisticamente menores

quando comparados com todos os outros Pulmões. Os valores de ΔIsc-eq-FSK das células HBE

do Pul4 incubados com VX-809 foram estaticamente maiores que as do Pul5 e Pul11 e

menores que as dos Traq4. Os valores de ΔIsc-eq-FSK das células HBE Pul5 e Pul11 incubados

com VX-809 foram estatisticamente menores comparados aos Pul12 e Traq4 e os ΔIsc-eq-FSK

68

com o VX-770 do Pul4 foram estaticamente menores que o Pul5, e esses foram

estatisticamente maiores que os do Pul11 incubados com DMSO (Fig. 22, Tabela 3)

Figura 22. Gráfico em barras representando as correntes de curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina

(FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos

pacientes Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11 (FC), incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou

VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e

potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco); VX-770 (cinza

claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto) e (n=3–9). Diferença significativa avaliada pelo Teste T

de Student p<0,05; #: Pul3 comparada com todos os outros grupos; *: VX-770 do Pul4 comparada com o Pul5 e

do Pul5 comparada com o Pul11; **: VX-809 do Pul4 comparada com os grupos Traq4, Pul5 e Pul11; ***: VX-

809 do Pul5 comparada com os grupos Traq4 e Pul12; $: Diferença significativa do VX-809 do Pul11

comparada com os grupos Traq4 e Pul12.

Figura 23. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas das correntes de

curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células

epiteliais brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes Traq4 e Pul12 (não FC) e Pul3, Pul4, Pul5 e Pul11

(FC), incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo

de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing.

DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=3–9).

69

Tabela 4. Porcentagens de função da CFTR nas células HBE e HTE, analisadas em Câmara de Ussing,

total, função basal (FSK 2µM) mais a ação dos fármacos VX-770 (10µM) e VX-809 (3µM). Pul12

controle não FC 100% de função basal.

Paciente % / SEM

DMSO

% / SEM

VX-770

% / SEM

VX-809

% / SEM

VX-770 + VX-809

n

Pul3 1,29 ±0,60 0,98 ±0,20 -0,99 ±-0,72 -1,39 ±-0,89 9

Pul4 10,38 ±2,03 9,91 ±2,26 15,31 ±1,58 12,21 ±1,48 3

Pul5 13,57 ±6,44 49,55 ±2,83 3,72 ±1,54 123,81 ±57,36 3

Pul11 4,72 ±0,43 4,86 ±0,60 8,23 ±1,34 8,82 ±0,47 3

Pul12 100 ±40,52 67,33 ±19,66 63,77 ±14,99 51,42 ±13,49 5-6

Traq3 102,79 ±34,12 36,58 ±12,95 44,69 ±8,02 19,50 ±6,91 6


células primárias epiteliais nasais (HNE)

As células HNE de 38 pacientes FC e não FC foram coletadas em diferentes

etapas (Tabela 5). Em 09/2015 foram coletadas células HNE de três pacientes FC para o

estudo piloto (Piloto 1-3). De março a abril de 2016 foram coletadas células HNE de cinco

pacientes, um paciente homozigoto para a F508del, PX01, três controles, sendo um

heterozigoto para a F508del, PX02 (wt/F508del), dois sem mutação para o gene do CFTR,

PX03 e PX04 (wt/wt), e um paciente com a mutação F508del/R1066C, PX05. Após a

validação de todos os resultados, foram iniciadas novamente as coletas em agosto de 2016,

quando foram coletadas células HNE de 30 pacientes (P01 – P30), que incluem dois controles

(wt/wt), dois controles heterozigoto F508del/wt, 19 F508del homozigotos, e sete pacientes de

outras mutações (Tabela 5). Alguns pacientes foram excluídos do estudo por contaminação

da cultura, descolamento da camada de fibroblastos ou poucas células coletadas (P04, P05,

P07, P11, P24, P26, P23, P27, P28 e P29), um por as células não polarizaram nos filtros (P22)

e outro por não respostas durante o experimento nas Câmaras de Ussing (P13).

Foram analisados três filtros com células HNE de cada paciente do estudo piloto

(piloto 1-3), incubados com ALI, DMSO e VX-809. Esses resultados validaram a técnica,

demonstrando que as células HNE poderiam ser analisadas da maneira que havíamos descrito,

pois possuíam boa resistência transepitelial e respondiam aos compostos do protocolo de

função da CFTR em Câmara de Ussing.

As células HNE dos pacientes da segunda etapa (PX01-05) foram analisadas em

Câmaras de Ussing com o protocolo de análise da função da CFTR, porém sem a adição do

corretor VX-770. As células HNE do paciente FC PX01 (F508del / F508del), e do paciente

controle portador PX02 (wt / F508del) foram incubadas com DMSO (0,05%) e VX-809

(3µM) por 48hs antes dos experimentos. As análises dos valores de ΔIsc-eq-FSK das células

70

HNE do PX01 demonstraram um aumento de função entre os grupos tratados com DMSO (-

0,025 ± -0,019 µA / cm2) em comparação com VX-809 (0,076 ± 0,08 µA / cm

2). O PX02 teve

os valores de ΔIsc-eq-FSK das células HNE estatisticamente maiores quando comparas ao PX01,

demonstrando atividade da CFTR, sendo os valores de ΔIsc-eq-FSK do grupo incubado com

DMSO (1,967 ± 0,158 µA / cm2) maiores que a do grupo incubado com VX-809 (1,073 ±

0,289 µA / cm2) (Fig. 24, Tabela 6).

As células HNE dos pacientes PX03 (wt / wt), PX04 (wt / wt) e PX05 (F508del /

R1066C) foram incubadas apenas com DMSO (0,05%) por 48hs antes dos experimentos. As

análises dos ΔIsc-eq-FSK mostraram a ativação da CFTR. Os ΔIsc-eq-FSK foram comparados entre

as células HNE dos cinco pacientes da segunda etapa demonstrando diferenças significativas

entre os grupos não FC, não FC portador e FC (Fig. 24).

Os pacientes PX03, PX04 e PX05 apresentaram uma camada de “muco” anormal

por cima da camada células HNE nos filtros de membrana porosa, o que não alterou a

polarização das mesmas, bem como a análise da função da CFTR na Câmara de Ussing.

Entretanto, os resultados dos pacientes controles foram bem distintos, por esse motivo, esses

pacientes não foram analisados em conjunto com os pacientes da 3ª etapa.

Na terceira etapa de coletas de células HNE foram analisados dois pacientes

controles (P02 e P30), um controle heterozigoto (P01 – F508del/wt) onze pacientes

F508del/F508del (P08, P09, P12, P14, P15, P16, P18, P19, P20, P21 e P25) e quatro pacientes

de outras mutações (P03: F508del/R334W; P06: G542X/I618T; P10 e P17: F508del/

c.1584+18672 bp A>G) (Tabela 6).

As células HNE desses pacientes foram incubadas 48hs com DMSO (0,05%) ou

VX-809 (3µM) e no protocolo de função da CFTR, foi adicionado o potenciador VX-770

(10µM) após a adição da Forscolina (3µM). As células HNE dos pacientes controles geraram

valores de ΔIsc-eq-FSK similares, incubadas com DMSO (P02 4,522 ± 0,417 e P30 3,984 ±

0,452) e VX-809 (P02 4,432 ± 0,975 e P30 3,905 ± 0,690) (Tabela 6). Os valores de ΔIsc-eq-

FSK incubados com DMSO nas células HNE desses dois pacientes foram agrupados e

calculados as média aritmética e desvio padrão da média (4,292 ± 0,301) e esse valor foi

considerado como um valor basal normal de função da CFTR (100%). Posteriormente, este

valor médio foi usado nos cálculos de função da CFTR dos outros experimentos realizados

em células HNE de pacientes não FC heterozigotos (F508del/wt) e pacientes FC (Tabela 7).

71

Tabela 5. Lista de pacientes com células primárias epiteliais nasais (HNE) coletadas, analisadas a função da

CFTR, Mutação dos pacientes e motivos da exclusão. Os pacientes foram divididos em três etapas de estudo: a

primeira (Piloto 1-3), fase em que foram estabelecidos e validados os protocolos de estudo; a segunda (PX01-

PX05) os estudos foram realizados sem a presença do potenciador VX-770 e a última fase (P01-P30) com o

protocolo completo.

Paciente Mutação Exclusão

Piloto 1 F508del/desconhecida –

Piloto 2 F508del/G542X –

Piloto 3 F508del/1812-1G>A –

PX01 F508del/F508del –

PX02 wt / F508del –

PX03 wt / wt –

PX04 wt / wt –

PX05 F508del/R1066C –

P01 wt / F508del –

P02 wt / wt –

P03 F508del/R334W –

P04 F508del/F508del Poucas células

P05 F508del/P205S Poucas células

P06 G542X/I618T –

P07 F508del/F508del Poucas células

P08 F508del/F508del –


P10 F508del/ c.1584+18672 bp A>G –

P11 F508del/R334W Contaminação (Bactéria)


P13 F508del/F508del Câmara de Ussing




P17 F508del/ c.1584+18672 bp A>G –





P22 F508del/F508del Células não Polarizaram

P23 F508del/F508del Fibroblastos Descolaram

P24 F508del/R334W Contaminação (Fungo)





P29 wt / wt Contaminação (Bactéria)

P30 wt / wt –

72

Tabela 6. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-

eq, em células primárias epiteliais nasais (HNE).

ΔIsc-eq-FSK ± SEM

Paciente Genótipo DMSO VX-770 VX-809 VX-809+

VX-770 n

Valor

de p

PX01 F508del/F508del -0,025

±0,019#

– 0,076

±0,08#

– 3 0,462

PX02 wt / F508del 1,967

±0,158#

– 1,073

±0,289#

– 3

0,053

PX03 wt / wt 19,323

±3,095 – – – 6 –

PX04 wt / wt 6,483

±1,091 – – – 6 –

PX05 F508del/R1066C 0,396

±0,108 – – – 6 –

P01 wt / F508del 1,907

±0,416#

1,498

±0,297#

– – 6 0,085

P02 wt / wt 4,522

±0,417#

4,292

±0,179

4,432

±0,975

4,451

±0,883#

4 0,944

P03 F508del/R334W 0,198

±0,047#

0,306

±0,061

0,303

±0,088

0,936

±0,286#

4 0,044

P06 G542X/I618T 0,066

±0,291

0,402

±0,184

0,13

±0,266

1,114

±0,562

2-

3 –

P08 F508del/F508del 0,059

±0,111#

0,11

±0,043

0,149

±0,086

0,211

±0,049#

3-

4 0,223

P09 F508del/F508del 0,08

±0,078#

0,187

±0,078

0,565

±0,117

0,61

±0,092#

4 0,009

P10

F508del/

c.1584+18672 bp

A>G

0,232

±0,354#

0,444

±0,056

0,447

±0,085

0,660

±0,326#

3 0,424

P12 F508del/F508del 0,211

±0,054#

0,154

±0,05

0,442

±0,088

0,382

±0,082#

4 0,055

P14 F508del/F508del 0,274

±0,087

0,352

±0,135

0,803

±0,273

0,829

±0,244

2-

5 –

P15 F508del/F508del 0,15

±0,036#

0,199

±0,04

0,197

±0,009

0,365

±0,163#

3 0,267

P16 F508del/F508del 0,215

±0,056#

0,23

±0,086

0,491

±0,136

0,564

±0,011#

3 0,004

P17

F508del/

c.1584+18672 bp

A>G

-0,82

±0,146

0,425

±0,441

0,109

±0,054

0,186

±0,130

2-

3 –

P18 F508del/F508del 0,29

±0,167

0,4

±0,081

0,296

±0,137

0,437

±0,187

2-

3 –

P19 F508del/F508del 0,187

±0,127#

0,128

±0,06

0,348

±0,122

0,381

±0,09#

4-

6 0,233

P20 F508del/F508del 0,125

±0,012

0,145

±0,034

0,15

±0,077

0,129

±0,032 2 –

P21 F508del/F508del 0,185

±0,033 –

0,364

±0,022 –

2-

3 –

P25 F508del/F508del 0,452

±0,101#

0,626

±0,183

0,441

±0,077

0,487

±0,041#

3-

4 0,732

P30 wt / wt 3,984

±0,452#

3,069

±0,579

3,905

±0,690

2,792

±0,526#

3 0,161

#: Comparação entre os valores para análise estatística. Estatisticamente diferentes pelo teste de

Student. (p<0,05)

73

Figura 24. Gráfico em barras das correntes de curto circuitos (ΔIsc-eq - µA/cm

2)

sensíveis a Forscolina (FSK

2µM) em células primárias epiteliais nasais (HNE) dos pacientes da segunda etapa (PX01 – F508del/F508del;

PX02 – F508del/WT; PX03 – wt/wt; PX04 – wt/wt; PX05 – F508del/R1066C), geradas pelo protocolo de

ativação da função da CFTR, em Câmaras de Ussing cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell. Filtros

pré-incubados por 48hs com DMSO (0,05%). n=3-6. #,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste

estatístico T de student bicaudal (p<0,05).

Figura 25. Imagens das células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas nos filtros Corning® Costar®

Snapwell. A. Filtro sem muco. B. Presença do muco sob as células HNE. Aumento com objetiva de 10X.

As células HNE do P01, heterozigoto não FC, foi similar ao paciente PX02 da

segunda etapa, apresentando valores de ΔIsc-eq-FSK incubadas com DMSO (P01: 1,907 ±0,416 e

PX02: 1,967 ±0,158) menores que os controles wt/wt, próximos a 50% da função desses (P01:

Tabela 7. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl-, ΔIsc-eq, em de

células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) em Câmara de Ussing, de pacientes agrupados

conforme o seu genótipo: wt/wt, wt / F508del e F508del / F508del.

Genótipo

ΔIsc-eq-FSK ± SEM

DMSO VX-770 VX-809 VX-809

+VX-770 n

Valor

de p

wt/wt 4,292 ±0,301# 3,768 ±0,344 4,206 ±0,592 3,740 ±0,612

# 2 0,969

wt/F508del 1,937 ±0,20# 1,498 ±0,297 1,073 ±0,289

# – 1-2 0,042

F508del/ F508del 0,186 ±0,028# 0,230 ±0,034 0,372 ±0,048 0,439 ±0,049

# 10-12 0,001

P value

wt/wt vs

wt/F508del < 0,001 0,004 0,011 –

wt/wt vs

F508del/F508del < 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001

wt/F508del vs

F508del/F508del < 0,001 < 0,001 < 0,001 –

#: Comparação entre os valores para análise estatística. Estatisticamente diferentes pelo teste de Student. (p<0,05)

74

44,43%; PX02: 45,83%). Esses agrupados tiveram valores de ΔIsc-eq-FSK, incubados com

DMSO, de 1,937 µA/cm2 (±0,2) e 45,13% (±4,65) de função da CFTR em relação aos

controles (Fig. 26, Tabela 7).


(FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais nasais (HNE) de dois pacientes não FC

(wt/wt), dois pacientes não FC heterozigotos (wt/F508del) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs

com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela

forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. A. Comparação dos ΔIsc-

eq-FSK das HNE dos pacientes por grupo de genótipos: wt/wt; wt F508del; F508del/F508del. B. Porcentagem de

função da CFTR nas HNE dos pacientes por grupo de genótipos: F508del/F508del e wt/F508del em relação ao

grupo controle wt/wt (100%). n=6-46. *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student

bicaudal (p<0,05).

Na análise das células HNE dos 12 pacientes F508del/F508del agrupadas,

observamos que os valores de ΔIsc-eq-FSK, com o uso de VX-809 e/ou VX-770, foram

estatisticamente menores em comparação com o grupo de células HNE dos pacientes

controles e dos pacientes heterozigotos controles (p<0,05) (Fig. 26A, 27A, Tabela 7). Além

disso, as células HNE dos pacientes apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente

maiores com o uso do VX-809 e VX-809 + VX-770 em comparação ao DMSO e VX-770

(p<0,05) (Fig. 27A, Tabela 7). Na análise do resgate de função da CFTR nas células HNE

desses pacientes, em relação ao wt/wt (100%), observou-se uma função de 8,66% (±1,11%)

com o uso do VX-809 e 10,23% (±1,15%) com a combinação dos dois moduladores (VX-809

e VX-770) (Fig. 26B, 27B).

As células HNE de todos os pacientes FC quando analisadas separadamente,

apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK distintas para cada paciente, com o uso ou não das drogas,

inclusive entre pacientes com a mesma mutação. As células HNE analisadas apresentaram

melhora nos valores de ΔIsc-eq-FSK com o uso do VX-770, com exceção dos pacientes P12 e

P19, e os pacientes P06, P09 e P17 tiveram esses valores duplicados em relação ao DMSO

(Figura 28A). Já o VX-809 também apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK maiores em

comparação com as incubadas com DMSO, com exceções dos pacientes P18 e P23 que se

75

mantiveram praticamente inalterados (Figura 28B) e as células HNE dos pacientes P09 e P16

tiveram os valores de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores. Nos valores de ΔIsc-eq-FSK as células

HNE de todos os pacientes apresentaram uma melhora com o uso do VX-809 + VX-770 em

relação ao DMSO (Figura 28C). As células HNE dos pacientes P09 e P16 tiveram os valores

de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores na incubação com o VX-809 + VX-770 em comparação

com o DMSO. O paciente P21 não teve o VX-770 acrescentado no protocolo (Tabela 6).


(FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células epiteliais nasais (HNE) de dois pacientes não FC

(wt/wt) e 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de

ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela forscolina e potencialização da CFTR com o VX-

770 (10µM), em Câmaras de Ussing. A. Comparação dos ΔIsc-eq-FSK das HNE dos pacientes por grupo de

genótipos: wt/wt; F508del/F508del. B. Porcentagem de função da CFTR nas HNE dos pacientes

F508del/F508del em relação ao grupo controle wt/wt (100%). DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809

(cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). n=6-46. #,##

,###

,####

,*,**,***: Diferente significativamente pelo teste

estatístico T de student (p<0,05).

Figura 28. Análise dos valores de ΔIsc-eq em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros

Corning® Costar® Snapwell, de diferentes pacientes FC com diferentes mutações, F508del/F508del (linha

preta), F508del/c.1584+18672 bp A>G (linha vermelha), F508del/R334W (linha azul) e F508del/I618T (linha

verde) incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação da CFTR

em Câmaras de Ussing. Células HNE tratadas com A. VX-770, B. VX-809 e C. VX-809 + VX-770. Linhas

tracejadas horizontais suplementares nos gráficos indicam 10% do valor médio dos ΔIsc-eq-FSK da função da

CFTR em culturas de pacientes wt / wt (100%).

O tratamento com o corretor VX-809 melhorou os valores de ΔIsc-eq-FSK acima de

10% dos valores de ΔIsc-eq-FSK do grupo controle wt/wt (P02 + P30), nas células HNE dos

76

pacientes P09 (F508del/F508del), P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G), P12

(F508del/F508del), P14 (F508del/F508del), P16 (F508del/F508del), P25 (F508del/F508del).

Já no tratamento com os fármacos VX-809 + VX-770 os valores de ΔIsc-eq-FSK foram acima

dos 10% dos valores controles nos pacientes P03 (F508del/I618T), P06 (F508del/R334W),

P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G), P09 (F508del/F508del), P14 (F508del/F508del), P16

(F508del/F508del), P18 (F508del/F508del), P25 (F508del/F508del) (Fig. 28B, C e 29). As

células HNE dos demais pacientes não apresentaram ΔIsc-eq acima dos 10% do grupo controle.

As células HNE do P23 foram às únicas que apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK,

basal (DMSO), acima dos 10% do ΔIsc-eq-FSK de função normal dos controles (Fig. 29A).

Ainda mais os ΔIsc-eq-FSK das células HNE, tratados com VX-809+VX-770, apresentaram

melhoras expressivas nos pacientes com as mutações F508del/R334W (P03: 21,82%),

F508del/I618T (P06: 25,95%) e um com a mutação F508del/c.1584+18672 bp A>G (P10:

15,38%) (Fig 29B).

Figura 29. Gráfico em barras representando as porcentagens de função da CFTR calculadas das correntes de

curto circuito equivalentes sensíveis a forscolina (FSK – 2µM / ΔIsc-eq-FSK - µA/cm2) avaliadas em células

epiteliais nasais (HNE), A. de 2 pacientes heterozigotos não FC (wt/F508del), 1 F508del/R334W, 1

F508del/I618T, 2 F508del/c.1584+18672 bp A>G e B. 12 pacientes F508del/F508del, incubadas por 48hs com

DMSO (0,05%) ou VX-809 (3µM). Valores de ΔIsc-eq-FSK analisados do protocolo de ativação da CFTR pela

forscolina e potencialização da CFTR com o VX-770 (10µM), em Câmaras de Ussing. DMSO (branco); VX-770

(cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=2–6).

4.2.1. SNP rs7512462 (SLC26A9) modula a função e o resgate da CFTR (F508del /

F508del) pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770)

O SNP rs7512462 acarreta na troca de uma citosina por uma timina, tendo três

genótipos possíveis (CC, CT e TT). Os pacientes foram agrupados da seguinte maneira: 6 TT

(P08, P12, P15, P18, P19 e P20); 5 CT (PX01, P09, P14, P21, P25) e 1 CC (P16) (Fig. 30A,

B, C). Os valores de ΔIsc-eq-FSK e as funções do CFTR foram comparados entre: (i) TT versus

77

CT; (ii) TT versus CT + CC. O genótipo CT e o grupo CT + CC apresentaram valores de ΔIsc-

eq-FSK basais (DMSO) levemente maiores que o genótipo TT. Na análise da ação dos fármacos,

o VX-770, VX-809 e VX-809 + VX-770 o genótipo CT e o grupo CT + CC apresentaram

ΔIsc-eq-FSK significativamente maiores que no genótipo TT (Fig. 30, Tabela 8). Todos os

grupos apresentaram valores de ΔIsc-eq-FSK pelos fármacos VX-809 + VX-770 estatisticamente

maiores que o basal (DMSO). Já o genótipo CT e o grupo CT + CC apresentaram valores de

ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores também no uso do VX-809 em comparação com ao

DMSO. Ainda o genótipo TT e o grupo CT+CC tiveram ΔIsc-eq-FSK tratados com VX-809 +

VX-770 estatisticamente maiores em comparação com os ΔIsc-eq-FSK tratados apenas com o

VX-770 (Fig. 31A). O genótipo CT e o grupo CT + CC demonstraram funções da CFTR

resgatada pelo VX-809 e pela combinação de VX-809 + VX-770 superiores a 10% da função

do wt/wt (100%), o que não foi observado para o genótipo TT (Fig. 31B).

Figura 30. Análise dos ΔIsc-eq-FSK em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros Corning®

Costar® Snapwell incubados por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de

ativação da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC F508del/F508del classificados pelo SNP

rs7512462 (SLC26A9). Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na

CFTR de células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT

(linha vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CT+CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha

vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das

células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt).

78

Figura 31. Análise de função da CFTR em células epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros

Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação ao SNP rs7512462

(SLC26A9), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos

A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos

fármacos nas células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770

(preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal; #,

##,

###:

Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal em comparação com o genótipo CT e

grupo CT+CC (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total

da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).

Tabela 8. Análise da função da CFTR avaliada pela determinação da secreção de Cl- em células

HNE de doze pacientes FC homozigotos para a F508del agrupados de acordo com o SNP

especifico: rs7512462 do gene SLC26A9 e rs3788766 do gene SLC6A14. A medida da secreção

de Cl- mediada pela CFTR foram quantificadas pela análise das médias e dos desvios padrões

dos deltas de correntes de curto-circuito equivalentes (ΔIsc-eq) determinadas pela estimulação do

AMPc pela FSK (2µM) sozinha (ΔIsc-eq-FSK) e pela adição do potencializador VX-770 (10µM)

(ΔIeq-sc-FSK+VX-770) nas células HNE incubadas por 48 horas pelo corretor VX-809 (3µM) ou pelo

veículo DMSO (0,05%).

Paciente ΔIsc-eq-FSK ± SEM

DMSO VX-770 VX-809 VX-809 + VX-770

SLC6A14 - rs3788766

CC 0,272 ± 0,049 0,325 ± 0,089 0,450 ± 0,108 0,490 ± 0,127

CT 0,167 ± 0,045 0,164 ± 0,035 0,349 ± 0,071 0,369 ± 0,054

TT 0,129 ± 0,046 0,206 ± 0,039 0,319 ± 0,060 0,446 ± 0,060

SLC26A9 - rs7512462

CT + CC 0,209 ± 0,047 0,329 ± 0,074 0,492 ± 0,080 0,639 ± 0,082

CT 0,208 ± 0,057 0,362 ± 0,094 0,493 ± 0,091 0,656 ± 0,101

TT 0,166 ± 0,035 0,171 ± 0,026 0,261 ± 0,046 0,306 ± 0,045

SLC6A14 - rs3788766 + SLC26A9 - rs7512462

CT + CC 0,308 ± 0,047 0,376 ± 0,091 0,556 ± 0,101 0,649 ± 0,107

TT + CT 0,134 ± 0,030 0,173 ± 0,024 0,282 ± 0,044 0,349 ± 0,045

79

O rs7512462*C (alelo C) demonstrou ser essencial na modulação positiva da

CFTR em comparação com o rs7512462*T (alelo T). Nas análises considerando os alelos, os

valores de ΔIsc-eq-FSK com a ação dos fármacos VX-809 e VX-809+VX-770 do alelo C foram

estatisticamente maiores comparado ao alelo T (Fig. 32A). Ainda alelo T teve os valores de

ΔIsc-eq-FSK na presença dos fármacos VX-809 e VX-809 + VX-770 significativamente maiores

comparados com o DMSO, e também o VX-809 + VX-770 significativamente maiores que o

VX-770 sozinho. Já o alelo T teve os valores de ΔIsc-eq-FSK com o VX-809 significativamente

maiores em comparação com o DMSO e o tratamento com o VX-809 + VX-770 apresentou

ΔIsc-eq-FSK significância quando comparado com todos os demais tratamentos, DMSO, VX-770

e VX-809 (Fig. 32A). Na função da CFTR nas células HNE de pacientes cm o alelo C o VX-

809 e VX-809 + VX-770 tiveram funções da CFTR superior a 10% (Fig. 32B).


Corning® Costar® Snapwell de 12 pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação à presença do alelo C

ou T no SNP rs7512462 (SLC26A9), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM).

Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR

resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);

VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student

bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da

CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).

4.2.2. Resgate da CFTR (F508del/F508del) pelo Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-

770) condicionada pelo SNP rs3788766 (SLC6A14)

O SNP rs3788766, também, acarreta na troca de uma citosina por uma timina,

tendo três genótipos possíveis (CC, CT e TT). O genótipo CC (P14, P20, P21 e P25)

80

apresentou valores de ΔIsc-eq-FSK maiores quando comparado com o CT (P08 e P12) e TT

(PX01, P09, P15, P16, P18 e P19) em todos os tratamentos (DMSO, VX-770, VX-809 e VX-

809 + VX-770) (Fig. 33; Tabela 8). O genótipo TT teve valores de ΔIsc-eq-FSK quando tratados

com VX-809 e VX-809 + VX-770 estatisticamente maiores comparados com o DMSO, e

também na comparação VX-809 + VX-770 com o VX-770. Já o genótipo CT teve valores de

ΔIsc-eq-FSK na presença do VX-809 estatisticamente maiores cm relação ao DMSO. Não foi

observado valores de ΔIsc-eq-FSK significativamente maiores no genótipo CC (Fig. 34A, Tabela

8).


Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação

da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC F508del/F508del classificados pelo SNP rs3788766

(SLC6A14). Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809 + VX-770 na CFTR de

células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha

vermelha), e agrupados pelo genótipo do SNP, CC (linha verde), CT (linha azul) e TT (linha vermelha). Linhas

tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos dois

controles (P01 e P30 – wt/wt).

A função da CFTR nas células HNE desses pacientes classificados pelo SNP

rs3788766 (SLC6A14), em relação ao wt/wt (100%), apresentou funções superiores a 10% nos

genótipos CC e TT tratados com o VX809 + VX-770 e no genótipo CC tratado com o VX-

809 (Fig. 34B).

81


Corning® Costar® Snapwell de doze pacientes FC F508del/F508del agrupados em relação ao SNP rs3788766

(SLC6A14), CC+CT, CT e TT, incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM). Análise dos

A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem da função da CFTR resgatada pelos

fármacos nas células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro); VX-809+VX-770

(preto). (n=09-24).*,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05).

Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função basal total da CFTR em células

HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).



ou T no SNP rs3788766 (SLC6A14), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM).

Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de função da CFTR

resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-809 (cinza escuro);

VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**,***,****: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student bicaudal; #: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal em comparação com

o genótipo C e T (DMSO) (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da

função basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).

Na análise alélica das células HNE dos pacientes, o alelo rs3788766*C apresentou

valores de ΔIsc-eq-FSK (DMSO) estatisticamente maiores comparadas ao alelo rs3788766*T. O

82

rs3788766*T teve valores de ΔIsc-eq-FSK, tratados com o VX-809 estatisticamente maiores

quando comparados com o DMSO e tratados com VX-809 + VX-770 estatisticamente

maiores quando comparados com o DMSO, VX-770 e VX-809. Já o alelo rs3788766*C teve

valores de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores no uso de VX-809 e do VX-809 + VX-770 em

relação ao DMSO. Ainda mais, ambos os alelos (rs3788766*C e rs3788766*T) tiveram

função de CFTR acima de 10% na combinação de VX-809 + VX-770 (Fig. 35).

4.2.3. rs7512462*C e rs3788766*C agrupados modulam positivamente a função da

CFTR e melhoram a ação do Lumacaftor (VX-809) e Ivacaftor (VX-770)

As células HNE dos 12 pacientes (F508del/F508del) foram classificadas em 2

grupos em relação aos SNPs rs7512462 e rs3788766, sendo: (i) grupo C (P14, P21 e P25) –

pelo menos um alelo C em ambos os SNPs (CC/CC; CT/CT/ CC/CT e CT/CC); (ii) grupo T

(PX01, P08, P09, P12, P15, P16, P18, P19 e P20) – pacientes com outras combinações

(TT/TT; TT/CT; CT/TT; CC/TT e TT/CC) (Fig. 36, Tabela 9). O grupo C apresentou valores

de ΔIsc-eq-FSK estatisticamente maiores que o grupo T em todos os tratamentos DMSO, VX-

770, VX-809 e VX-809+VX-770, sendo esta função, aproximadamente, o dobro do

observado para o grupo T (Fig. 37ª, Tabela 9). Entretanto, o grupo T, apresentou melhora

estatísticas nos valores de ΔIsc-eq-FSK na incubação com VX-809 em comparação com a

incubação com o DMSO e VX-809 + VX-770 em comparação com todos os outros grupos de

tratamentos (DMSO, VX-770 e VX-809+VX-770), fato não observado no grupo C (Fig. 37A,

Tabela 8). Ao analisar a função da CFTR o grupo C apresentou funções superiores a 10% nos

tratamentos com os fármacos (VX-770, VX-809 e VX-809+VX-770) em relação ao wt/wt

(100%) (Fig. 37B).

83

Tabela 9. Pacientes F508del/F508del e seus

respectivos SPNs nos genes modificadores analisados.

SLC6A14 SLC26A9

Paciente rs3788766 rs7512462

PX01 TT CT

P08 CT TT

P09 TT CT

P12 CT TT

P14* CC CT

P15 TT TT

P16 TT CC

P18 TT TT

P19 TT TT

P20 CC TT

P21* CC CT

P25* CC CT *: Pacientes com a presença de pelo menos um alelo C em ambos

os SNPs.


Costar® Snapwell incubados por 48h a 37°C com DMSO (0,05%) ou VX-809 (3μM) pelo protocolo de ativação

da CFTR em Câmaras de Ussing de doze pacientes FC F508del/F508del classificados pelos SNPs rs7512462

(SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14). Análise da ação dos fármacos A. C. VX-770 e B. D. VX-809 C. F. VX-809

+ VX-770 na CFTR de células HNE de pacientes de acordo com o genótipo do SNP, C (linha verde) e T (linha

vermelha). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 10% da média aritmética dos ΔIsc-eq-FSK das

células HNE dos dois controles (P01 e P30 – wt/wt).

84



ou T nos SNPs rs7512462 (SLC26A9) e rs3788766 (SLC6A14), incubadas por 48hs a 37°C com DMSO (0,05%)

ou VX-809 (3μM). Análise dos A. ΔIsc-eq-FSK gerados no protocolo de ativação da CFTR. B. Porcentagem de

função da CFTR resgatada pelo pelos fármacos em células HNE. DMSO (branco); VX-770 (cinza claro); VX-

809 (cinza escuro); VX-809+VX-770 (preto). (n=19-61). *,**: Diferente significativamente pelo teste estatístico

T de student bicaudal (p<0,05). Linhas tracejadas horizontais suplementares indicam 100% e 10% da função

basal total da CFTR em células HNE de dois controles (P01 e P30 – wt/wt).

4.2.4. Análise da função do canal epitelial de sódio, ENaC, pelos fármacos VX-809 e

VX-770 em células primárias epiteliais nasais (HNE)

No protocolo de análise de função da CFTR em Câmara de Ussing foi utilizado o

composto amilorida (20µM), um inibidor do ENaC. Nas células HNE dos pacientes

analisados (FC ou não FC) essa inibição do ENaC é muito variável, oscilando muito entre os

experimentos, mesmo para as mesmas mutações de CFTR (Fig. 38, Tabela 10).

A função do ENaC, nas análises dos valores de ΔIsc-eq-Amil, nas células HNE de

cada paciente, os PX01, PX02, P06, P08, P09, P12, P14, P15, P16, P17, P19, P21, P25 e P30,

demonstraram valores de ΔIsc-eq-Amil maiores no tratamento com DMSO em comparação com

o VX-809. Nos demais pacientes os valores de ΔIsc-eq-Amil foram maiores no tratamento com o

VX-em relação ao DMSO. As células HNE dos pacientes PX01 e P19, ambos

F508del/F508del, tiveram diferenças estatísticas entra os valores de ΔIsc-eq-Amil incubadas com

VX-809 comparados com o DMSO (Fig. 39, Tabela 10).

85

Figura 38. Análise dos ΔIsc-eq-Amil em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) cultivadas em filtros

Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por

48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de quatro pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não

FC heterozigotos (wt/F508del – Cinza), 17 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul),

1 F508del/R1066C (Verde), 1 G542X/I618T (Amarelo) e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G (Vermelho). n=2-6.


Corning® Costar® Snapwell e incubadas com DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR VX-809 (3µM) por 48hs

a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de dois pacientes não FC (wt/wt - tracejado), um paciente não FC

heterozigotos (wt/F508del – Cinza), 16 pacientes FC: 12 F508del/F508del (Preto), 1 F508del/R334W (Azul), 1

F508del/R1066C (Verde), e 2 F508del/c.1584+18672bp A>G (Vermelho). n=2-6.

86

Tabela 10. Análise dos ΔIsc-eq da inibição do ENaC pela Amilorida (20µM) em células primárias

epiteliais nasais de pacientes FC e não FC, em Câmara de Ussing.

Paciente Genótipo Incubação ΔIsc-eq / SEM

Amilorida 20µM n

PX01 F508del/F508del DMSO -56,474 ±1,561 3

VX-809 -43,330 ±3,643* 3

PX02 wt / F508del DMSO -2,692 ±0,198 3

VX-809 -2,464 ±0,500 3

PX03 wt / wt DMSO -41,414 ±13,50 6

PX04 wt / wt DMSO -14,995 ±3,89 6

PX05 F508del/R1066C DMSO -7,481 ±1,037 6

P01 wt / F508del DMSO -3,134 ±0,680 3

P02 wt / wt DMSO -60,362 ±8,958 4

VX-809 -63,142 ±16,67 4

P03 F508del/R334W DMSO -19,259 ±0,047 4

VX-809 -20,253 ±4,112 4

P06 G542X/I618T DMSO -26,819 ±7,91 2

VX-809 -15,854 ±1,908 3

P08 F508del/F508del DMSO -59,915 ±9,072 3

VX-809 -47,663 ±9,563 4

P09 F508del/F508del DMSO -26,899 ±2,627 4

VX-809 -23,090 ±2,385 4

P10 F508del/ c.1584+18672 bp A>G DMSO -14,225 ±1,258 3

VX-809 -15,752 ±7,535 3

P12 F508del/F508del DMSO -31,952 ±2,171 4

VX-809 -26,230 ±2,135 4

P14 F508del/F508del DMSO -12,956 ±1,902 2

VX-809 -9,429 ±1,29 5

P15 F508del/F508del DMSO -31,081 ±8,577 3

VX-809 -28,071 ±1,98 3

P16 F508del/F508del DMSO -16,414 ±4,93 3

VX-809 -7,982 ±1,534 3

P17 F508del/ c.1584+18672 bp A>G DMSO -57,115 ±7,405 2

VX-809 -41,004 ±8,803 3

P18 F508del/F508del DMSO -29,156 ±1,854 2

VX-809 -33,23 ±2,188 3

P19 F508del/F508del DMSO -37,246 ±2,604 4

VX-809 -25,585 ±1,744* 6

P20 F508del/F508del DMSO -75,594 ±7,093 2

VX-809 -80,085 ±6,465 2

P21 F508del/F508del DMSO -10,004 ±0,623 2

VX-809 -9,039 ±2,322 3

P25 F508del/F508del DMSO -43,959 ±9,404 3

VX-809 -29,043 ±6,987 4

P30 wt / wt DMSO -30,267 ±10,883 3

VX-809 -19,581 ±9,629 3

*: Diferenças significativas entre os grupos DMSO e VX-809 do mesmo paciente, teste T de

Student. p<0,05.

87


Corning® Costar® Snapwell e incubadas com A. DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR B. VX-809 (3µM) por

48hs a 37ºC e analisados em Câmara de Ussing, de dois pacientes não FC (wt/wt - Branco), dois pacientes não

FC heterozigotos (wt/F508del – Cinza) e 12 F508del/F508del (Preto). n=2-6. *,**: Diferente significativamente

pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05).

Agrupando os pacientes controles (P02 e P30 – wt/wt), controles heterozigotos

(PX02 e P01 – wt/F508del) e os 12 pacientes F508del homozigotos (F508del/F508del), os

valores de ΔIsc-eq-Amil analisados, em ambas as incubações de DMSO ou VX-809,

apresentaram diferenças estatísticas entre os controles heterozigotos comparados aos

pacientes homozigotos FC e controles, e essa diferença não foi observada na comparação

entre os pacientes homozigotos não FC e FC (Fig. 40, Tabela 10).

4.3. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais brônquicas

(HBE) de pacientes FC e não FC.

Após as análises de funções da CFTR (FSK, VX-770 e CFTRinh172), as células

HBE de todos os pacientes foram lavadas (Ringer + Amil) por 10 minutos e então foram

estimuladas pelo ATP (100 µM), na região apical, e geraram Vte transientes, com um pico de

ativação máximo e decaindo com o tempo até o atingirem a Vte basal (Fig. 41). O pico

máximo das células HBE e HTE analisadas foi bem variável, tendo o Pul5 os maiores valores

de ΔIsc-eq-ATP e o Pul4 e Pul11 os menores, e curiosamente os ΔIsc-eq-ATP nas células HTE

foram negativos (Fig. 42). Os valore de ΔIsc-eq-ATP das células HBE dos pacientes Pul4, Pul11

e Pul12 foram quantificados na segunda aplicação de ATP, após a análise da inibição dos ΔIsc-

eq-ATP pelo inibidor de canais de cálcio ativados pelo cálcio A01 (CaCCinhAO1 40µM).

88

Figura 41. Traçado original (Vte) da estimulação do ATP (100µM), apical, em células primárias epiteliais

brônquicas (HBE) do paciente não FC Pul12 (wt/wt), cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e

analisadas em Câmaras de Ussing.

Figura 42. Análise dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm

2) em células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE) de

pacientes não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing.

n=6-18. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal; #: Diferente

significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal em comparação com as células HBE dos Pul3,

Pul4, Pul5, Pul11 e Pul12 (p<0,05).


brônquicas humanas (HBE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-

809 na CFTR

Células HBE de todos os pacientes FC e não FC incubados com DMSO (0,05%)

ou VX-809 (3µM) foram estimuladas pelo ATP, os ΔIsc-eq-ATP analisados, e demonstraram

respostas bem variáveis entre os pacientes, como citado anteriormente. Entretanto a ação do

corretor da CFTR, o VX-809, não mostrou efeito sobre essa resposta à estimulação do ATP,

pois os ΔIsc-eq-ATP das células HBE dos pacientes não apresentaram diferenças dos ΔIsc-eq-ATP

entre os grupos DMSO e VX-809 (Fig. 43).

89


2) em relação à incubação com DMSO (0,05% – branco) ou o corretor

da CFTR VX-809 (3µM – preto) das células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE) dos pacientes FC

Pul3, Pul4, Pul5, Pul11 e não FC Pul12 e Traq4 cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas

em Câmaras de Ussing. n=3-9.


brônquicas humanas (HBE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1)

Na tentativa de elucidar os canais envolvidos nos ΔIsc-eq-ATP gerados pela

estimulação do ATP, foi utilizado o inibidor de CaCCinh-AO1 (AO1 – 40µM) nas células

HBE e HTE dos pacientes controle Pul12 e Traq4 e paciente FC Pul3, Pul4 e Pul11. Os

valores de ΔIsc-eq-ATP das células de todos esses pacientes, com exceção da Traq4, foram

estatisticamente inibidas pelo AO1 (Fig. 44). As células HBE do paciente Pul3 e células HTE

do paciente Traq4 foram estimuladas primeiro pelo ATP, depois pelo AO1 seguido pelo ATP

+ AO1 e novamente pelo ATP, com “lavagens” (Ringer + Amilorida) de 15 minutos entres as

aplicações do ATP, e demonstraram que, apesar dos ΔIsc-eq-ATP serem menores para cada

aplicação adicional do ATP, isso não interferiu nas análises da inibição dessas correntes pelo

AO1 (Fig. 45). As células HBE dos demais pacientes, após essa comprovação, foram

estimuladas pelo AO1, seguido pelo ATP + AO1, e após 15 minutos de lavagem, foi aplicado

o ATP novamente.

90

Figura 44. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm

2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em

células primárias epiteliais humanas brônquicas (HBE) e traqueais (HTE) dos pacientes FC Pul3, Pul4 e Pul11 e

não FC Pul12 e Traq4 cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing.

n=6-18. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student bicaudal (p<0,05).


2) em três aplicações de ATP (1: preto; +AO1: cinza claro; 2: cinza

escuro) e da sua inibição pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em células primárias epiteliais

humanas A. brônquicas (HBE) do paciente FC Pul3 e B. traqueias do paciente não FC Traq4 cultivadas em

filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=12-18. *,** Diferente

significativamente pelo teste estatístico T de student unicaudal (p<0,05).

4.4. Análise da estimulação pelo ATP em células primárias epiteliais nasais humanas

(HNE) de pacientes FC e não FC.

Os mesmos protocolos de ativação dos ΔIsc-eq-ATP aplicado nas células HBE foram

aplicados nas células HNE. Os ΔIsc-eq-ATP, de pico máximo, foram bem variáveis entre os

pacientes, tendo o paciente não FC PX03 (wt/wt – com muco sobre as células*) os maiores

ΔIsc-eq-ATP e o P16 (F508del/F508del) os menores ΔIsc-eq-ATP. Dentre os pacientes

F508del/F508del o PX01 foi o que apresentou maiores ΔIsc-eq-ATP. Curiosamente o paciente

P17 (F508del/ c.1584+18672 bp A>G) apresentou ΔIsc-eq-ATP negativas, o que não foi

observado em nenhum dos outros pacientes, inclusive para outro paciente com a mesma

mutação de CFTR (P10), apesar de ter ocorrido com as células traqueias da Traq4 (Fig. 46).

Os ΔIsc-eq-ATP das células HNE dos pacientes P30 (wt/wt), P03 (F508del/F508del), P18, P19 e

91

P25 (F508del/F508del) foram quantificados na segunda aplicação de ATP, após a análise da

inibição dos ΔIsc-eq-ATP pelo inibidor AO1 (40µM).


2) em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de pacientes

não FC e FC cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=3-10.


nasais humanas (HNE) de pacientes FC e não FC são independestes da ação do VX-809

na CFTR.

Células HNE de todos os pacientes FC e não FC incubados com DMSO (0,05%)

ou VX-809 (3µM) foram estimuladas pelo ATP, foram analisados os ΔIsc-eq-ATP e tiveram

ativações bem variáveis entre os pacientes, como citado anteriormente. Entretanto a ação do

corretor da CFTR, o VX-809, não demonstrou efeito sobre essa resposta à estimulação do

ATP, pois os ΔIsc-eq-ATP dos pacientes não apresentaram diferenças dos ΔIsc-eq-ATP entre os

grupos DMSO e VX-809, demonstrando os mesmos achados das células HBE (Fig. 47, 48). O

paciente P17, que apresentou ΔIsc-eq-ATP negativas, teve diferença significativa, nos ΔIsc-eq-ATP,

na comparação entre as incubações com DMSO ou VX-809 (Fig. 48).

92


2) em relação à incubação com DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR

VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos pacientes controles P02 e P30

(wt/wt), controle heterozigoto PX02 (wt/F508del) e pacientes FC P03 (F508del/R334W), P06 (G542X/I618T),

P10 e P17 (F508del/ F508del/ c.1584+18672 bp A>G) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e

analisadas em Câmaras de Ussing. n=2-4. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student

bicaudal (p<0,05).


2) em relação à incubação com DMSO (0,05%) ou o corretor da CFTR

VX-809 (3µM) das células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) dos pacientes FC F508del/F508del,

cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=2-6.


nasais humanas (HNE) são inibidas pelo inibidor de CaCC AO1 (CaCC-inh-AO1).

Nas células HNE também foi aplicado o inibidor AO1 (40µM), da mesma forma

que foi aplicado nas células HBE. As células HNE dos pacientes controle (P30), controle

93

heterozigoto (PX02), FC F508del/F508del (PX01, P18, P19 e P25) e FC F508del/R334W

tiveram seus ΔIsc-eq-ATP inibidos estatisticamente pelo AO1 (Fig. 49). As células HNE dos

pacientes PX01 e PX02 foram estimuladas primeiro pelo ATP, depois pelo AO1 seguido pelo

ATP + AO1 e novamente pelo ATP, com “lavagens” (Ringer + Amilorida) de 15 minutos

entres as aplicações do ATP, e demonstraram que, apesar dos ΔIsc-eq-ATP serem menores para

cada aplicação adicional do ATP, isso não interferiu na inibição dessas correntes pelo AO1,

como realizado nas células HBE (Fig. 50). Os demais pacientes, após essa comprovação,

foram estimulados pelo AO1, seguido pelo ATP + AO1, e após 15 minutos de lavagem, foi

aplicado o ATP novamente (Fig. 49). Os outros pacientes não tiveram essa análise incluída no

protocolo.

Figura 49. Análise da inibição dos ΔIsc-eq-ATP (µA/cm

2) pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em

células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) de pacientes não FC e FC (P30: wt / wt; PX02 – wt / F508del;

P03 – F508del / R334W; PX01, P18, P19 e P25: F508del / F508del) cultivadas em filtros Corning® Costar®

Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-8. *: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de

student bicaudal (p<0,05).

94


2) e de sua inibição pelo inibidor de CaCC, CaCCinh-AO1 (40µM), em

células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) do A. paciente não FC heterozigoto (PX02 – wt / F508del) e

B. do paciente FC (PX01: F508del / F508del) cultivadas em filtros Corning® Costar® Snapwell e analisadas em

Câmaras de Ussing. n=6. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico T de student (p<0,05).


nasais humanas (HNE) diminuem após múltiplas aplicações

Foi testada a aplicação do ATP por quatro vezes, com lavagens de 15 minutos em

cada aplicação (Ringer + Amil) nas células HNE nos pacientes P02 (wt /wt), P08, P09, P12,

P14, P15, P16 e P20 (F508del / F508del) e os ΔIsc-eq-ATP demonstraram perder a ação dessas

ativações com múltiplas aplicações, sendo sempre a primeira aplicação de ATP gerado os

maiores ΔIsc-eq-ATP. Entretanto essas ativações foram variáveis entre as células HNE dos

pacientes, sendo o P16 o único que não demonstrou diferença estatística nos ΔIsc-eq-ATP da

primeira e a quarta aplicação do ATP e os pacientes P02, P08, P09, P12 e P15 tiveram os ΔIsc-

eq-ATP da primeira aplicação maiores significativamente entre as outras três aplicações (Fig.

51).

95


2) de quatro aplicações de ATP (100µM), com lavagens de 15min entre

cada aplicação, em células primárias epiteliais nasais humanas (HNE) do paciente não FC (P02 – wt / wt) e sete

pacientes FC F508del / F508del (P08, P09, P12, P14, P15, P16 e P20) cultivadas em filtros Corning® Costar®

Snapwell e analisadas em Câmaras de Ussing. n=6-8. *,**,***: Diferente significativamente pelo teste estatístico

T de student unicaudal (p<0,05).

96

5. Discussão

5.1. Análise e Interpretação dos experimentos em Câmara de Ussing

Para evitar variações das respostas aos fármacos e compostos em células HBE e

HNE, os experimentos foram padronizados de maneira rigorosa e criteriosa, sendo as células

avaliadas na mesma passagem (1) e mostrando valores de TEER e Rte similares. Em contraste

com o presente trabalho estudos de outros grupos utilizaram gradientes de concentrações de

cloreto (Awatade et al., 2014; Pranke et al., 2017). Ou seja, a solução tampão de Ringer na

região apical teve concentrações de Cl- (0 ou ~30mM) menores em relação à região

basolateral, concentrações normais de Cl- (~145mM), criando assim um gradiente de

concentração, forçando o transporte de Cl- da região basolateral para a região apical. Este

protocolo é utilizado para melhorar as análises dos ΔIsc-eq, tendo correntes maiores, e

facilitando a interpretação dos resultados, mesmo que ocorra uma ativação de CFTR muito

baixa é possível analisa-la, porém essa atividade pode fornecer resultados equivocados. Desta

forma, o nosso grupo entende que essas medições, com gradiente de concentrações de Cl-, não

corresponde ao que acontece na fisiologia do paciente, e assim, neste estudo, foi utilizado

concentrações de Cl- simétricas nas regiões apical e basolateral (Strug et al., 2016).


células primárias epiteliais brônquicas humanas (HBE).

Dos cinco pulmões analisados, o Pul3 não teve uma genética esclarecida, sendo

necessária à busca futura por grandes inserções ou deleções no gene CFTR para definir a

mutação (Athanazio, et al., 2017; De Boeck, et al., 2017; Faria, et al., 2017 National

Guideline Alliance (UK), 2017), entretanto, pelas analises de função de CFTR nas células

HBE, as mutações desse paciente devem pertencer as classe i ou vii, pois não demonstraram

funções de CFTR, tanto basais como na presença dos fármacos VX-809 e/ou VX-770 (Fig.

16, Tabela 3) (Amaral, 2015; Bell, et al., 2015; Cutting, 2015; Veit, et al., 2015; Bosch & De

Boeck, 2016; Mijnders, et al. 2017; Boeck & Davies, 2017; Zainal Abidin, et al., 2017). Já a

analise do Pul4 forneceu o achado de uma mutação em um alelo, c.1010T>A (p.Phe337Tyr) /

?, no outro, como no caso do Pul3, necessita-se fazer a busca por grandes inserções ou

deleções no gene CFTR. As análises de função de CFTR nas células HBE desse paciente,

97

demonstraram ter um função basal de 10,38%, sendo resgatado pelo VX-809 em mais de 5%

de função, com isso esse paciente se beneficiaria na utilização do Lumacaftor®

(Fig. 17,

Tabela 3) (Sousa et al., 2012; Cutting, 2015; Pranke et al., 2017). Ainda não foram

encontrados estudos demonstrando a função dessa mutação, bem como não está inserida no

banco de dados da CFTR2 (2018), sendo muito interessante a busca por informações dessa

mutação, que seriam de grande ajuda para o paciente.

Já o Pul5 teve a sua genética esclarecida, F508del / c.1234_1238delGCAAA

(p.Ala412Thrfs), mas também não foram encontrados estudos demonstrando a função dessa

mutação, bem como também não está inserida no banco de dados da CFTR2 (2018). Porém

pelo nosso estudo, foi demonstrado que essa mutação, p.Ala412Thrfs pareada com F508del,

teve uma potencialização grande da função da CFTR, que quando incubado com o VX-809 e

potencializado com VX-770 a função de CFTR chegou a níveis normais, 123,81% (±57,36), e

na presença apenas do VX-770 uma potencialização de 49,55% (±2,83), evidenciando

claramente que esse paciente seria beneficiado pelo uso Ivacaftor® ou Orkambi

® (Fig. 18,

Tabela 3) (Ramsey, et al., 2011; Harrison, et al., 2013).

No sequenciamento do CFTR para o Pul11, apenas foi encontrado a mutação

F508del em um alelo, no outro não teve resultados. Como demonstrado por muitos grupos, à

mutação F508del apresenta um função basal, nas células HBE do Pul11 foi de 4,72% (±0,43),

e o VX-809 tem efeito na correção da função da CFTR nessa mutação (8,23% ±1,34), bem

como o VX-809 + VX-770 (8,82% ±0,47). A função de CFTR nas células HBE deste paciente

não alcançou os 10% de funções do controle, com isso, para o uso dos fármacos por esse

paciente tem que ser aplicada um investigação mais ampla, uma vez que o ganho na melhora

do fenótipo pode ser mínimo ou nulo, o que pode não compensar pelos efeitos adversos dos

medicamentos. Por outro lado, ele poderia ter pequenos benefícios no uso do Lumacaftor® ou

Orkambi®, porque sua função de CFTR dobrou com a utilização do VX-809 e VX-809 + VX-

770 (Fig. 19, Tabela 3) (Van Goor, et al., 2011; Awatade, et al., 2015; Wainwright, et al.

2015; Pranke et al., 2017)

O Pul12, por ser originado de um paciente não FC, com outra doença pulmonar

grave, discinesia ciliar, foi o nosso controle de função de CFTR (100%). Curiosamente, as

células HTE do Traq4 tiveram funções basais de CFTR bem próximas ao Pul12 (102,79%

±34,12), demonstrando que essas células, oriundas do doador do pulmão para ser

transplantado, servem como células de controles para estudos de função da CFTR, mesmo

sendo oriundas de regiões fisiologicamente diferentes (Fig. 20, 23, Tabela 3).

98


células primárias epiteliais nasais humanas (HNE).

Foi analisada a função da CFTR em células HNE de 23 pacientes. Os quatro

pacientes não FC (wt / wt – PX03, PX04, P02 e P30) mostraram ter uma função de CFTR,

através da análise dos ΔIsc-eq-FSK, superiores em comparação com todos os pacientes FC e

pacientes não FC portadores (wt / F508del) (Tabela 6). No cultivo das células HNE dos

pacientes PX03, PX04 e PX05, foi observada a presença de muco sobre a camada de células

HNE nos filtros (Fig. 25). Não se sabe se realmente foi por causa desse fator, mas nessas

células, os ΔIsc-eq-FSK foram altas, principalmente no PX03 (19,323 ±3,095), que foram

significativamente maiores comparadas com os ΔIsc-eq-FSK das células HNE dos PX04 (6,483

±1,091), P02 (4,522 ±0,417) e P30 (3,984 ±0,452), e os ΔIsc-eq-FSK do PX04 foram maiores,

mas não significativas, na comparação com os ΔIsc-eq-FSK dos P02 e P30. As análises das

células HNE desses pacientes (PX03 e PX04) não foram comparadas com as demais células

HNE dos outros pacientes analisados, incluindo o PX05, que também teve a presença de

muco. A presença do muco nesses filtros não foi esclarecida, uma vez que não foi observado

este fato novamente nas demais culturas de células HNE.

Nos demais pacientes foram analisadas os ΔIsc-eq-FSK na presença do veículo

DMSO (0,05%) e dos fármacos VX-770 (10µM), VX-809 (3µM) e VX-809+VX-770. Nos

pacientes controles (wt/wt) P02 e P30, o VX-809 não teve efeito positivo nos ΔIsc-eq-FSK, pelo

contrário, reduziu levemente essas correntes (Tabela 6), principalmente na aplicação do VX-

770. Isso ocorre, provavelmente, porque pacientes não FC tem uma função de CFTR normal,

que com a estimulação da FSK, em nível de saturação para obter o máximo de função da

proteína possível, ocorre uma abertura total dos canais CFTR, não podendo gerar mais

correntes pelos fármacos moduladores, porque são proteínas normais, e a interação dos

fármacos não ocorre, ou ao contrário, pode competir com as proteínas, diminuindo levemente

sua expressão (Awatade, et al., 2014; Marigowda, et al., 2017; Molinski, et al., 2017).

Os nossos dados demonstraram que as células HNE dos pacientes controles P02 e

P30 (wt /wt), quando combinados, tiveram ΔIsc-eq-FSK estatisticamente superiores em relação à

combinação das análises nas células HNE dos 12 pacientes FC clássicos (F508del / F508del).

Também tiveram uma função de CFTR de 10% em relação aos controles, o que corroboram

outros estudos in vitro realizados para essas análises (Fig 26, 27, Tabela 7) (Awatade et al.,

99

2014; Strug et al., 2016; Pranke et al., 2017). Outro dado interessante foi observado que os

ΔIsc-eq-FSK nas células HNE dos pacientes heterozigotos (wt / F508del), apresentaram uma

função de CFTR próximo de 50% dos controles (wt / wt), dados que corroboram o estudo em

células HNE (Fig. 26, Tabela 7) (Pranke et al., 2017). Esses dados estão de acordo com os

achados de Strug et al., (2016) e Pranke et al., (2017), em células HBE e HNE, demonstrando,

que as células HNE são uma ferramenta robusta para estudo na FC e testes a novas drogas

moduladoras da CFTR.

Atualmente, estudos dos fármacos moduladores da CFTR vêm demonstrando

funções diferentes entre pacientes FC, apresentando efeitos positivos ou não, independente

das mutações do CFTR serem as mesmas, dados que foram achados no nosso estudo (Fig. 28,

29, Tabela 6). Na análise personalizada da ação dos fármacos moduladores da CFTR nas

células HNE dos pacientes FC os ΔIsc-eq-FSK gerados foram distintas para cada paciente,

entretanto todos apresentaram um aumento da função da CFTR incubados com o VX-809,

com exceção dos pacientes P18 e P25 que se mantiveram praticamente inalterados e dos

pacientes P20, P25 e P17 (Fig. 28) (Awatade et al., 2014; Amaral MD, 2015; Bell et al.,

2015; Cutting, 2015; Beekman, 2016; De Boeck & Amaral, 2016; Strug et al., 2016; Marson

et al., 2017; Pranke et al., 2017).

O tratamento com o VX-809 induzido melhora na função da CFTR, nas células

HNE dos pacientes P09 (F508del/F508del), P12 (F508del/F508del), P14 (F508del/F508del),

P16 (F508del/F508del), P25 (F508del/F508del), e P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G)

apresentando funções de CFTR, iguais ou maiores do que os 10% do controle (wt / wt) (Fig.

29A). O VX-770 nas células HNE dos pacientes P03 (F508del/R334W), P06

(F508del/I618T), P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G), P17 (F508del/c.1584+18672 bp

A>G) e P25(F508del/F508del) induziu melhoras na função da CFTR acima dos 10% do

controle. Adicionalmente, os pacientes P14 (F508del/F508del), P16 (F508del/F508del), P18

(F508del/F508del), P23 (F508del/F508del), P03 (F508del/R334W), P06 (F508del/I618T) e

P10 (F508del/c.1584+18672 bp A>G) mostraram melhoras na função da CFTR na

combinação do tratamento VX-809 e VX-770 (Fig. 29C).

Essas análises sugerem que esses pacientes avaliados, possivelmente, teriam

benefícios no uso do Lumacaftor® (VX-809), Ivacaftor

® (VX-809) + Lumacaftor® (VX-770)

ou Orkambi® (VX-809 + VX-770), pois foi demonstrado que esses pacientes atingiram um

resgate de função da CFTR acima de 10% da função da proteína normal, podendo obter

melhoras nos fenótipos FC, revertendo ou postergando, principalmente, a doença pulmonar,

100

dependendo do estágio da doença e do início da terapia (Sousa et al., 2012; Cutting, 2015;

Pranke et al., 2017). Os demais pacientes, por não apresentarem uma melhora significativa, ao

ponto de alcançar uma função de 10% do normal, seria recomendada uma investigação mais

ampla para utilização desses fármacos (Lumacaftor®, Ivacaftor

® e Orkambi

®), uma vez que o

ganho na melhora do fenótipo pode ser mínimo ou nulo, não justificaria o seu emprego de

efeitos adversos que esses medicamentos apresentam (Wainwright et al., 2015; Beekman,

2016, Veit et al., 2016; Pranke, et al., 2017).

5.4. Modulação da função de CFTR e da ação dos fármacos VX-809 e VX-770 por

polimorfismos em genes associados à FC em células primárias epiteliais nasais humanas

(HNE).

Na tentativa de elucidar as funções e respostas aos fármacos da CFTR, em

pacientes com FC e mesmo genótipo de CFTR, estudos tem avaliado genes modificadores e

sua expressão / variabilidade, e estas podem estar relacionadas à clínica da FC ou expressão

de CFTR (Wright et al., 2006; Guillot et al., 2014). A análise de variantes, em genes

modificadores, que possam modular a função da CFTR e sua expressão no epitélio dos

diferentes órgãos na FC deve ser ressaltada (Cutting et al., 2015), e neste estudo foi

demonstrada a ação de duas variantes, que demonstraram intervir na variabilidade clínica da

FC, e que são atuantes na expressão de canais iônicos alternativos (Pereira et al., 2017).

No presente estudo, observarmos que o rs7512462 (SLC26A9) modula a função da

proteína CFTR nas células HNE de pacientes F508del/F508del. A variante rs7512462*C teve

uma modulação positiva (maior função), e a rs7512462*T, menor modulação na função final

de CFTR (Fig. 32). Pacientes que apresentaram os genótipos rs7512462*CT ou

rs7512462*CC tiveram função da CFTR e resposta ao VX-809 e VX-770, nas células HNE,

maiores do que os com rs7512462*TT (Fig. 30, 31, Tabela 8). Os dados corroboram com os

achados de Strug et al. (2016), em células HBE, demonstrando, que as células HNE são uma

ferramenta para estudo na função da CFTR, análises de novas drogas e estudos de

polimorfismos de outros genes moduladores da FC. Além disso, pacientes com genótipo CT e

o agrupamento CT + CC, para o rs7512462, tiveram funções da CFTR totais, no uso de VX-

809 e VX-770, superior a 10% de função das células HNE do wt / wt. Os achados do estudo

indicam que os pacientes avaliados, possivelmente, teriam benefícios no uso de VX-809 e

VX-770 (Lumacaftor®

e/ou Orkambi®), com melhora do fenótipo da doença, principalmente

101

pulmonar. E seria indicativo, que o aumento da expressão de CFTR possa ser um desfecho

que leve o paciente do fenótipo clássico para o não clássico da doença (função da CFTR entre

os 10-60%) – revertendo ou postergando, principalmente, a doença pulmonar, dependendo do

estágio inicial do início da terapia (Sousa et al., 2012; Pranke et al., 2017).

O SNP rs3788766 (SLC6A14) modulou a função da CFTR nas HNE dos

pacientes, sendo que o rs3788766*CC apresentou funções basais maiores do que os demais

genótipos. No uso do VX-809, o rs3788766*CC atingiu uma função superior a 10% da função

normal da CFTR, e na combinação do VX-809 e VX-770, o rs3788766*CC e o

rs3788766*TT tiveram função superior a 10% (Fig. 33, 34, Tabela 8). Como demonstrado

por Di Paola, et al., (2017) o gene SLC6A14 está relacionado com a adesão da P. aeruginosa,

com isso a função da CFTR basal nas células HNE desses pacientes, demonstrou ser maior

nos pacientes com o SNP rs3788766*CC em comparação com o rs3788766*TT, sendo quase

significativo estatisticamente (p = 0,050344) (Fig. 33, 34). Entretanto esse SNP não

demonstrou diferença na função alcançada em ambos os alelos C ou T no resgate de função

pelos fármacos, provavelmente por que esse SNP não interfere na ação dos fármacos na

correção da função de CFTR, mas sim na função da CFTR basal, pela modulação da adesão

do patógeno P. aeruginosa (Fig. 35) (Stanton, et al., 2015).

As análises demonstram, que em pacientes F508del/F508del, o rs3788766*CC e

rs3788766*TT, irão obter melhores resultados ao tratamento com o Lumacaftor®

(rs3788766*CC) e Orkambi® (rs3788766*CC e rs3788766*TT), com possível melhora

fenotípica. Pacientes com o SNP rs3788766*TT podem ser favorecidos, para uma

recuperação basal da função de CFTR, analisada para o SNP rs3788766*CC, pelo uso dos

fármacos VX-809 e VX-770, pois recentemente foi demonstrado que esses fármacos

diminuem as respostas inflamatórias contra a P. aeruginosa em células HBE de pacientes FC

(Ruffin, et al., 2017).

Nossos achados, são pioneiros ao demonstrar que a presença de numerosos SNPs,

em diferentes genes, possa modular a CFTR, quando somados. Dessa forma, os efeitos

cumulativos das variantes ocasionam o efeito de resposta individual, como observado para os

SNPs rs7512462*C (SLC26A9) e rs3788766*C (SLC6A14), na função da CFTR basal e no

uso de VX-770, VX-809 e VX-809 + VX-770 (Fig. 36, 37, Tabela 9).

102

5.5. Função do ENaC nas células HNE de pacientes FC e não FC

Para a análise da função da CFTR o ENaC é inibido com a Amilorida (20µM), e a

inibição foi analisada medindo-se o ΔIsc-eq-amil. Essas análises demonstraram que os pacientes

FC e não FC controles (wt / wt) tiveram as maiores funções de ENaC, e não foram diferentes

estatisticamente entre elas, fato que contrasta com os resultados do estudo de Pranke, et al.,

(2017). Eles demonstraram que a função do ENaC é maior em pacientes FC, o que seria mais

previsível, pela interação dos canais CFTR e ENaC (Tarran et al., 2001; Pezzulo et al., 2012;

Veit, et al., 2015; De Boeck & Davies, 2017). Entretanto os achados nos pacientes não FC

carreadores (wt / F508del) mostraram os menores valores entre todos os pacientes estudados,

concordando com o estudo de Pranke, et al., (2017) (Fig. 40).

Ainda foi analisado se atividade do ENaC diminuía durante a correção da CFTR

pelo VX-809, e nossas análises sugerem a possibilidade de avaliar uma diminuição na função

do ENaC pelo VX-809, pois quase todas as células HNE dos pacientes FC tiveram um ΔIsc-eq-

amil reduzido com o VX-809, sendo significativo para os PX01 e P19 (Fig. 39, Tabela 10).

Nos pacientes não FC controles (wt / wt), o P02 teve um aumento dos ΔIsc-eq-amil com o VX-

809, o P30 uma diminuição e o paciente não FC heterozigoto (wt / F508del) PX02 uma

diminuição (Fig. 39, Tabela 10). Esses dados demonstram que a atividade do ENaC é muito

variável em relação à correção da CFTR pelos seus fármacos moduladores.

Em resumo, é possível analisar a atividade do ENaC em células HNE de pacientes

FC, e caso se desenvolva um fármacos em potencial para corrigir essa superatividade da

ENaC em tecidos FC, eles podem ser testados com o uso desse método (Fig 7D) (Mall &

Gallieta, 2015).

5.6. Análise da função de TMEM16A nas células HNE e HBE de

pacientes não FC e FC

Para a análise da atividade da TMEM16A, foi utilizado o ATP como ativador

dessas correntes e para comprovação que elas são deste canal, usou-se o inibidor específico de

TMEM16s o CaCC-inh AO1 (40µM) (Cabrita, et al., 2017; Benedetto, et al., 2017).

Nas células HNE e HBE os ΔIsc-eq-ATP tiveram ativações distintas dependendo do

grupo avaliado (Fig. 42, 46), não demonstrando efeito nessas correntes com o corretor da

103

CFTR o VX-809 (Fig. 43, 47, 48). Ao aplicar o inibidor AO1 (40 µM), os ΔIsc-eq-ATP foram

significativamente inibidos nas células HNE e HBE dos pacientes analisados (Fig. 44, 49).

Foi demonstrada uma diminuição dos Isc-eq-ATP após serem estimulados pelo ATP

múltiplas vezes em células HNE, sendo a primeira ativação sempre maior que as demais (Fig.

52). Não foram encontrados motivos para essa ação, entretanto, traz algumas sugestões

fisiológicas. O TMEM16A é ativado pelo Ca2+

que o ATP estimulou via receptores

purinérgicos transmembranares (P2Y e P2X). O P2Y2 é o principal receptor purinérigico

nessas células e sua ativação sequencial e repetitiva com ATP gera uma desensibilização do

receptor, assim liberando menos Ca2+

intracelular e como consequência, resultando em menor

ativação da TMEM16A (Gabl, et al., 2015; Xing, et al., 2017) (Fig. 52).

Figura 52. Cascata de ativação da TMEM16 em células epiteliais. Ativação dos receptores purinérgicos

membranares ativados pelo ATP, que ativam a fosfolipase C (PLC), ativando o PIP2 que via IP3, libera cálcio

(Ca2+

) intracelular, estocados no Reticulo endoplasmático, ativando assim o TMEM16A (Modificado de: Guo, et

al., 2015).

Outra hipótese é do esgotamento de Ca2+

no RE, sendo necessário um tempo

maior para o RE recrutar Ca2+

novamente, ou ainda outros mecanismos que não estão

envolvidos em nossos experimentos (Tojyo, et al., 2008; Thillaiappan, et al., 2017).

Esses dados demonstram que a TMEM16A está presente e é funcional nessas células,

e estudos sobre canais alternativos de cloreto relacionados à modulação da CFTR ou melhora

na secreção de Cl- podem ser realizados utilizando esta metodologia (Li, et al., 2017; Mall &

Gallieta, 2015). Contudo, mais pesquisas devem ser desenvolvidas nessas células e em relação

à ativação da TMEM16A. Assim como, a realização de investigações sobre a hipótese da

TMEM16A e a CFTR estarem co-localizadas, e apresenta atividades correlacionadas, e ainda,

descobrir ativadores mais específicos da TMEM16A (Li, et al., 2017; Mall & Gallieta, 2015).

Além disso, com esses métodos, ainda é possível investigar se a ativação da

CFTR e da TMEM16A está correlacionada, utilizando ambos os inibidores da CFTR

(CFTRinh 172) e das TMEM16 (AO1), separadamente, para inibir as correntes geradas pela

104

FSK e pelo ATP, em pacientes com função de CFTR. Assim poderá ser possível avaliar se a

ação da CFTR e da TMEM16A estão correlacionadas.

5.7. Relevância do Trabalho

Os nossos achados corroboram a prática da medicina personalizada, tendo como

modelo a FC e uso de fármacos moduladores da CFTR pode ser aplicada nas células HBE e

HNE, para indicar o melhor fármaco (ou combinação de fármacos), que demonstre o melhor

resgate de função da CFTR em determinado paciente (Clancy et al., 2012; Boyle et al., 2014;

Wainwright et al., 2015; Beekman, 2016, Veit et al., 2016; Pranke et al., 2017).

Devido à viabilidade técnica observada, o nosso protocolo pode ser de relevância

em estudos de modulação da função de CFTR, testes de novos fármacos moduladores da

CFTR, avaliação de canais alternativos de Cl- na tentativa de suprir a necessidade deste ânion

no epitélio de pacientes FC e estudo de polimorfismos em genes moduladores da CFTR ou de

agente relacionados à FC.

Ressalta-se a importância em se realizar estudos com essa temática e o uso de

outros fármacos na modulação da CFTR em outras mutações do CFTR, raras e órfãs,

existentes em nossa população miscigenada brasileira. Sendo assim, as células HNE são uma

ferramenta útil para a análise da função e resgate da CFTR pelos fármacos moduladores,

tendo resultado similar às células HBE, com a facilidade de coleta de diferentes pacientes e

em maior escala (Pranke et al., 2017).

O desenvolvimento de ferramentas de triagem e biomarcadores, menos invasivos

aos pacientes, capazes de prever a eficácia de fármacos de forma individualizada, é

imprescindível para uma avaliação personalizada. A realização de estudos in vitro para a

verificação da resposta a novas propostas terapêuticas para a FC, antes da aplicação nos

mesmos, é importante em razão do elevado custo e de possíveis efeitos colaterais, o que torna

as células HNE uma ferramenta adequada (Amaral & Balch, 2015; Amaral, 2015; Beekman,

2016; Cholon & Gentzsch, 2017; Marson et al., 2017; Paranjape & Mogayzel, 2017).

Com isso, em um futuro próximo, podemos aplicar a medicina personalizada /

precisa nos pacientes atendidos no ambulatório de FC do Hospital de Clinicas da Unicamp,

através das técnicas de análise dos fármacos em células HNE e/ou HBE dos pacientes com FC

que tenham diferentes mutações e genes modificadores (polimorfismos) da CFTR / FC. Tais

105

informações podem mensurar qual fármaco, ou combinação de fármacos, podem fazer uso e

obter a melhor resposta individual a esses pacientes.

5.8. Perspectivas

Perspectivas para avaliar a resposta à medicina personalizadas / precisão na FC,

incluem: (i) validar os achados em outros genótipos de CFTR, heterozigotos F508del, por

incluir um grande número de pacientes com possível efeito benéfico ao uso da droga; (ii)

validar os achados utilizando outras drogas moduladoras do CFTR, como exemplo o VX-661

(Tezacaftor®

), nos pacientes F508del/F508del ; (iii) validar os achados para células HNE em

outros biomarcadores, incluindo, organoides intestinais, nasoesferoides e esferoides

brônquicos, o que pode refletir a especificidade de cada órgão afetado na FC que apresenta

um fenótipo amplo e complexo; (iv) incluir múltiplos genes modificadores na análise da

função de CFTR e resposta a drogas, principalmente, associados aos canais iônicos

alternativos, tendo como base estudos de associação por abordagem genoma ampla associação

(GWAS); (v) buscar os mecanismos pelos quais alguns pacientes com FC, apresentam função

residual da proteína e incluir esses genes, e seus respectivos expressos, como possíveis

mecanismos para correção da função de CFTR em pacientes com a mesma classe e/ou

genótipo de CFTR; (vi) abordar outras mutações de CFTR, incluindo as diferentes classes, em

suas raridades para cada mutação; (vii) validar os achados laboratoriais com o uso desses

fármacos por pacientes com FC, longitudinalmente, tendo a aprovação após os experimentos

em HNE e/ou HBE.

5.9. Dificuldades na realização do estudo

As técnicas do cultivo de células primárias humanas são muito delicadas e

envolvem muita dedicação, trabalho e uma equipe multidisciplinar, para assim obter um

material viável, sem contaminação e reproduzível, que apresenta muitas etapas: (i) coleta dos

materiais biológicos, que devem ser feitos por pessoas especializadas; (ii) transporte desse

material em local adequado para minimizar perdas e contaminações; (iii) aplicação das

metodologias de isolamento e extração das células, que são complexas, detalhadas e

envolvem uma gama alta de equipamentos, materiais e compostos; (iv) o tempo gasto na

manipulação dos matérias biológicos, desde a coleta do material até a obtenção das células;

106

(v) e finalmente, o cultivo das células, que necessita de uma sala de cultura padronizada,

meios de culturas especializados, tempo para o crescimento e diferenciação das células, para

assim obter células viáveis e compatíveis para a realização dos experimentos (Yaghi, et al.,

2010; Müller, et al., 2013; Ulm, et al., 2016).

No cultivo de células epiteliais das vias aéreas oriundas de pacientes FC o método

é um tanto complicado, principalmente nas células HBE, pois o isolamento das células é

realizado em lóbulos pulmonares explantados de pacientes com FC que já tinham uma função

pulmonar baixa e com colonizações crônicas por patógenos resistentes, para assim haver a

necessidade de um transplante (Syed, et al., 2016; Burcham, et al., 2017; Cribbs & Beck,

2017; Dupont, 2017; Zeriouh, et al., 2017). Na aplicação do método é necessária a utilização

de coquetéis de antibióticos em alta concertações, e que muitas vezes não são o suficiente

para erradicar os patógenos resistentes presentes sem prejudicar o isolamento, crescimento e

viabilidade celular (Randell, et al., 2011).

Na aplicação do método de obtenção das células HBE houve sete perdas de

culturas: dois por contaminações que não puderam ser erradicadas pelo coquetel de

antibióticos sem prejudicar a viabilidade celular; dois por problemas na aplicação do

protocolo na etapa de adição de enzimas digestivas (DNase, Protease e Colagenase) nos

tecidos brônquicos (Pul2 – Dissociation Solution) e nas células isoladas (Pul10 – Declump

Solution); um por obtenção de poucas células (Pul7), pois o brônquio isolado estava muito

pequeno, com isso obtivemos menos células, sendo que, na expansão das células HBE em

cultura com o BEGM as células não cresceram e obtivemos poucas células viáveis, entretanto,

essas ainda foram colocadas em cultura utilizando o protocolo de cultivo das células HNE-

CRC, mas por motivo de manipulação, as células contaminaram durante o crescimento; outros

dois pulmões (Pul 8 e Pul9) as células não aderiram nas placas, por dois motivos solucionados

posteriormente: (i) foi preparada uma nova solução de revestimento, e tivemos problemas

durante o preparo, então uma nova solução foi preparada e assim foi solucionado o problema

para os outros pulmões; (ii) a placa de cultura P-100 acabou (Corning Costar – 430167) e

compramos outras, porém foram compradas de outra marca (Sarstedt – D-51588), o que foi

um erro, pois as células HBE não aderiram ao material destas placas, utilizando o mesmo

protocolo de revestimento. Nos dois pulmões seguintes (Pul11 e Pul12) esses problemas de

revestimento e placas foram solucionados.

Nos pulmões Pul4 e Pul11, durante a cultura das células HBE nas placas de

cultura P-100 com o BEGM, que contém gentamicina e anfotericina, não apresentaram

107

contaminações, no entanto, ao passá-las para os filtros e cultivados com meio ALI, sem a

adição desses dois antibióticos, as células contaminavam. Com isso foi aplicado o método de

cultivo das células HBE-CRC, utilizando o coquetel ATV (anfotericina, tobramicina e

vancomicina). Na primeira semana de co-cultura com os fibroblastos, e essas células HBE

foram analisadas. A aplicação da técnica de CRC em células HBE já foi realizada por outros

grupos, inclusive comparando os resultados entre HNE-CRC e HBE-CRC (Gentzsch, et al.,

2017; Pranke, et al., 2017)

Já nas células HNE, no início nós tivemos muitos problemas com contaminações,

que foram aprimorados com a realização de lavagens com salina (0,09%) na narina dos

pacientes antes da coleta, o acréscimo do coquetel de antibióticos ATV na primeira semana de

cultura, e também a não coleta de células HNE de pacientes com exacerbações ou que

estavam doentes. Apesar da melhora, erradicar 100% as contaminações das culturas de células

é extremamente difícil, pois a variação de patógenos de paciente para pacientes é muito

grande. Ainda um fato observado foi que, no Brasil, por ser um país tropical, a proliferação de

patógenos é maior, com isso a utilização da ATV, na primeira semana de cultura de células

HNE, foi essencial na diminuição de contaminações (Roberts, 2005; Patz, et al., 2005;

Collaco, et al., 2011). Ainda tivemos um problema na fase final de cultura de células HNE, os

fibroblastos descolaram das garrafas T25 em co-cultura, a razão de ter acontecido isso foi à

utilização de FBS (Sigma-Aldrich – F6178) como suplemento no meio, ao invés de NBCS

(Sigma-Aldrich – N4762), pois o NBCS havia acabado e o novo comprado não havia chego a

tempo, assim utilizamos o FBS, pois tínhamos coletas marcadas. Evento solucionado com a

chegada do NBCS.

O principal fator de problemas e perdas da cultura de células foi à utilização de

três salas de cultura de células na realização deste trabalho. Primeiro foi utilizada uma cultura

de células no prédio Centro de Investigação em Pediatria (CIPED – Unicamp), essa não era

muito estéril, e tivemos muitos problemas com contaminações. Passamos a usar outra cultura

de células no laboratório de Genética Humana da FCM, contudo, pela demanda de alunos do

professor coordenador da sala de cultura e pelo alto período de uso da sala por nós, este uso

ficou inviável, e tivemos que trocar de lugar novamente. O terceiro e último local, foi à

utilização de uma cultura de células multiusuário da FCM, disponível para alunos de pós-

graduação, entretanto, por ser multiusuário, alguns alunos de outros projetos utilizavam em

conjunto com a nossa equipe, e contaminações de terceiros acabaram por contaminar nossas

culturas. Com isso, um próximo passo essencial para novos estudos idealizados com base

108

neste trabalho, será a construção e adequação de uma sala de cultura de células do Laboratório

de Fibrose Cística – LAFIC.

109

6. Considerações Finais

6.1. Cultivo de células primárias epiteliais brônquicas (HBE) e nasais (HNE)

humanas

As técnicas de cultivo de células HBE e HNE foram padronizadas no Laboratório

de Fibrose Cística (LAFIC). Apesar dos problemas e perdas de matérias presentes, esses

foram devidamente solucionados.

As células HBE e HNE polarizadas em filtros de membrana porosa são materiais

muito valiosos e de importância para estudos de testes de fármacos moduladores da CFTR e

de outros canais da FC, uma vez que, muitas células HBE podem ser obtidas de uma amostra,

e serem utilizadas em diversos estudos. As células HNE podem ser coletadas mais

rotineiramente com foco em diferentes mutações de CFTR.

6.2. Ação dos fármacos moduladores da CFTR em células HBE e HNE

O nosso estudo, sugere que as análises dos moduladores da CFTR testados, VX-

809 e VX-770, in vitro pela técnica de eletrofisiologia de câmara de Ussing em células HNE e

HBE, podem ser utilizados para a aplicação de uma medicina personalizada em pacientes FC

com diferentes mutações, assim demonstrando se o paciente estudado pode vir a ter maiores

benefícios na utilização de determinado fármaco ou combinações de fármacos.

6.3. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR

em células HBE

A genotipagem desconhecida do Pul3 não elucidou a mutação, contudo, a análise

das células HBE desse paciente demonstrou que a CFTR não tem função e nem é modulada

pelos fármacos.

A mutação p.Phe337Tyr do Pul4 demonstrou ter uma atividade residual da CFTR

basal e uma melhora na utilização do corretor VX-809, com isso, pacientes com essa mutação

podem ser beneficiados com o uso do Lumacaftor®.

A mutação F508del / p.Ala412Thrfs do Pul5 demonstrou ter uma modificação

positiva para o potenciador VX-770 sozinho e em combinação com o corretor VX-809, com

110

isso pacientes com essa mutação podem ser beneficiados com o uso dos fármacos Ivacaftor®

e/ou Orkambi®.

A mutação F508del / desconhecida do Pul11 demonstrou ter uma modificação

positiva para o corretor VX-809 sozinho e em combinação com o potenciador VX-770, com

isso pacientes com essa mutação talvez possam ser beneficiados com o uso dos fármacos

Ivacaftor® e/ou Orkambi

®.

6.4. Avaliação dos fármacos moduladores da CFTR em diferentes mutações do CFTR

em células HNE

Foi demonstrado que células HNE de pacientes F508del/F508del apresentam

funções da CFTR e modulações pelos fármacos VX-809 e VX-770 variadas, e que nem todos

os pacientes teriam efeitos benéficos com a utilização do Orkambi®.

A mutação F508del / R334W do P03 demonstrou ter uma modificação positiva

para o potenciador VX-770 ou o corretor VX-809 sozinhos, mas teve uma melhora expressiva

na combinação dos dois (VX-809 + VX-770), com isso, pacientes com essa mutação podem

ser beneficiados com o uso do fármaco Orkambi®.

A mutação G542X/ I618T do P06 demonstrou ter uma modificação positiva para

o potenciador VX-770 sozinho e em combinação com o corretor VX-809, com isso pacientes

com essa mutação podem ser beneficiados com o uso dos fármacos Ivacaftor® e/ou Orkambi

®.

Mais estudos devem ser feitos para a mutação F508del/ c.1584+18672 bp A>G,

pois um paciente P10 demonstrou uma modulação positiva para os fármacos VX-809 + VX-

770 porém outro paciente com a mesma mutação não demonstrou essa mesma modulação.

6.5. Modulação de função da CFTR por polimorfismo em genes moduladores do

fenótipo da FC

O polimorfismo rs7512462 (SLC26A9) demonstrou modular positivamente a

função da CFTR nas células HNE de pacientes FC homozigotos para a F508del, na presença

do alelo C, bem como uma melhora no resgate de função da CFTR pelos fármacos VX-809 e

VX-770. Já o polimorfismo rs3788766 (SLC6A14) parece modular positivamente a função

basal da CFTR nas células HNE de pacientes FC homozigotos para a F508del, na presença do

111

alelo C. E a combinação dos dois polimorfismos, com a presença do alelo C em ambos,

demonstrou modular positivamente as funções da CFTR basal.

6.6. Avaliação da função da TMEM16A em células HBE e HNE

A função da TMEM16A em células HNE e HBE foi demonstrada pela ativação e

inibição de suas correntes geradas pelo ATP e AO1 respectivamente. Portanto as técnicas

padronizadas nesse trabalho podem ser utilizadas para estudos mais detalhados desse canal e,

ainda, de outros canais alternativos de cloreto, visando terapias alternativas para a FC.

112

7. Conclusões

A função da CFTR e ação dos fármacos moduladores da CFTR avaliados em células

HBE e HNE demonstrou ser viável para análise individual dos pacientes (personalizada);

A função da CFTR avaliada em células HBE e HNE demonstrou ser variável em

diferentes e mesmas mutações do CFTR;

Os fármacos VX-809 e VX-770 apresentaram modulações positivas e variáveis na

função da CFTR em células HBE e HNE oriundas de diferentes pacientes com diferentes ou

mesmas mutações de CFTR;

A avaliação de polimorfismos em genes que possam modular a função da CFTR é

viável em células HNE;

O SNP rs7512462 no gene SLC26A9 demonstrou modular a função e modulação pelos

fármacos VX-809 e VX-770 da CFTR-F508del;

O SNP rs3788766 no gene SLC6A14 sugere uma interação na função basal da CFTR-

F508del;

A função da TMEM16A como um canal alternativo de cloreto pode ser avaliado em

células HBE e HNE;

A mutação da CFTR e sua modulação pelo VX-809 não interfere na ativação da

TMEM16A em células HBE e HNE.

113

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9. Apêndice

Traçados originais do protocolo de função da CFTR pela análise de secreção de

Cl- em células primarias epiteliais nasais (HNE) dos pacientes FC e não FC analisados.

Figura 53. Traçado Original de medições de voltagem transepitelial (mV) para análise de função da CFTR e

teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente P02

não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM);

Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).



não FC (wt/wt). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM);


124


teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente

PX02 não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM);

Forscolina (FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).



não FC portador (wt/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina

(FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).


teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente

PX01 FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina

(FSK 2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).

125



FC (F508del/F508del). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK

2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).









126













127













128




2µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).


teste de fármacos moduladores da CFTR realizado em células primárias epiteliais nasais (HNE) do paciente 25





FC (F508del/R334W). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK


129



FC (G542X/I618T). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM); Forscolina (FSK 2µM);




FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM);

Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).



FC (F508del/ c.1584+18672 bp A>G). Protocolo de análise de função da CFTR, Amilorida (Amil 20µM);

Forscolina (FSK 2µM); Potenciador VX-770 (10µM); Inibidor do CFTR 172 (CFTRinh 172 30µM).

130

10. ANEXOS

Anexo 1. Certifica de apresentação oral do trabalho em congresso internacional e premiado na 1ª colocação.

Anexo 2. Certifica de apresentação oral do trabalho em congresso nacional.

131

Anexo 3. Certifica de apresentação oral do trabalho em congresso internacional.

132

Anexo 4. Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa.

133

134

135

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