UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JLIO DE MESQUITA FILHO"

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

CMPUS DE ARARAQUARA

SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI: ESTUDO ANATMICO E

HISTOQUMICO DAS FOLHAS E INVESTIGAO DO POTENCIAL

FARMACUTICO DO EXTRATO ETANLICO E SUAS FRAES.

ADEMIR SALVI JNIOR FARMACUTICO INDUSTRIAL

ARARAQUARA - SP

2009

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JLIO DE MESQUITA FILHO"

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

CMPUS DE ARARAQUARA

SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI: ESTUDO ANATMICO E

HISTOQUMICO DAS FOLHAS E INVESTIGAO DO POTENCIAL

FARMACUTICO DO EXTRATO ETANLICO E SUAS FRAES.

ADEMIR SALVI JNIOR FARMACUTICO INDUSTRIAL

ORIENTADOR: Prof. Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas, rea de Pesquisa e Desenvolvimento de Frmacos e Medicamentos, da Faculdade de Cincias Farmacuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas.

ARARAQUARA - SP

2009

Ficha Catalogrfica

Elaborada Pelo Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao Faculdade de Cincias Farmacuticas

UNESP Campus de Araraquara

Salvi Jnior, Ademir S184s Schinus terebinthifolius Raddi: estudo anatmico e histoqumico das

folhas e investigao do potencial farmacutico do extrato etanlico e suas fraes / Ademir Salvi Jnior. - Araraquara, 2009.

81 f. Dissertao (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista. Jlio de

Mesquita Filho. Faculdade de Cincias Farmacuticas. Programa de Ps Graduao em Frmacos e Medicamentos

Orientador: Luis Vitor Silva do Sacramento . 1. Schinus. 2. Aroeira-vermelha. 3. Anlise histoqumica. 4. Avaliao

farmacognstica. 5. Atividade antibacteriana. I. Sacramento, Luis Vitor Silva do, orientador. II.Ttulo.

CAPES: 4030005

I

Wxw|vt|t

O mestre que caminha sombra do templo rodeado de discpulos, no d de sua sabedoria, mas sim de sua f e de sua ternura. Se ele for verdadeiramente sbio, no te convidar a entrar na manso de seu saber, mas antes o conduzir ao limiar de tua prpria mente

(Gibran Khalil Gibran) Dedico todo o meu trabalho, seu prestgio e honra, aos que so a essncia de minha vida. A Deus, Nosso Senhor, pelo dom da vida e sublime presena em meu ser, pelo privilgio concedido e pela graa de permitir a concluso deste trabalho. Nossa Senhora Aparecida, pela singular proteo, poderosa intercesso e graas. Consagro sua santidade o meu entendimento. minha famlia, meu pai Ademir, minha me Terezinha e meu irmo Adriano, enquanto pessoas igualmente belas e admirveis em essncia, por constiturem estmulos e atitudes que bem influenciaram minha pessoa impulsionando-me a buscar vida a cada momento. Guardo-lhes o mais profundo agradecimento por terem aceito a privao da minha companhia em funo dos estudos, concedendo-me a oportunidade de me realizar ainda mais. minha av e madrinha, Leonora, pelas oraes a mim oferecidas durante toda essa caminhada, pelos seus docinhos de pinga, sua alegria, seu carinho e afeto. minha noiva Carolina, que com palavras no consigo descrever o quanto significa para mim. Voc, meu amor, minha vida, meu tudo, meu nada, que est ao meu lado em todas as horas, que me compreende, que me faz sorrir, me faz feliz, me faz amar e sentir-me amado. Voc mais do que uma paixo, encanta pela elegante simplicidade, requintada gentileza e nobreza transbordante. Obrigado pelo seu respeito e amor, por existir e estar comigo.

II

Tztwxv|x

"Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, pois cada pessoa nica e nenhuma substitui outra. Cada um que passa em nossa vida passa sozinho, mas no vai s nem nos deixa s. Leva um pouco de ns mesmos, deixa um pouco de si mesmo. H os que levam muito, mas h os que no levam nada. Essa a maior responsabilidade de nossa vida, e a prova de que duas almas no se encontram ao acaso"

(Antoine de Saint-Exupry) A realizao deste trabalho no mrito individual, mas resultado da contribuio de inmeras pessoas que participaram direta ou indiretamente para o seu desenvolvimento. Agradecer sempre necessrio e tambm, um ato honrado de gratido. Ao meu Orientador, Prof. Luis Vitor Silva do Sacramento, pela orientao incondicional. Quando poderia ser simplesmente orientador, foi mestre, transmitindo-me seus conhecimentos e experincias, mostrando o seu profissionalismo e, com isso revelando o seu lado humanista. Quando poderia ser mestre, foi amigo, e em sua amizade entendeu-me ajudando e incentivando a seguir pelos caminhos da vida, das luzes, rumo satisfao plena dos ideais humanos e profissionais. Expresso os meus maiores agradecimentos e o meu profundo respeito, que sero sempre poucos diante do muito que me foi ofertado. Profa. Dra. Tais Maria Bauab, pelo papel fundamental de sua co-orientao, se assim posso dizer; por instruir e repartir comigo os seus conhecimentos, colocando em minhas mos ferramentas novas com as quais, como asas, me abriram novos horizontes. A todos os Professores que fizeram do magistrio um ideal, mesclando a arte de ensinar com o dom da convivncia, tornando-se meus amigos e transmitindo suas experincias que muito ajudaram na minha formao. Aos tcnicos e amigos dos laboratrios de Botnica, Microbiologia e Qumica Orgnica da Unesp, Campus de Araraquara, que participaram das atividades desenvolvidas neste trabalho. Aos Professores que participaram do Exame de Qualificao, Dra. Isabele Rodrigues Nascimento, Dra. Tais Maria Bauab e Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento, pelos relevantes apontamentos e preparao para a defesa dessa dissertao. Aos Professores que participaram da Comisso Examinadora de Defesa, Dr. Norberto Peporine Lopes, Dra. Hrida Regina Nunes Salgado e Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento, pelas crticas construtivas e importantes sugestes auferidas finalizao do trabalho. Faculdade de Cincias Farmacuticas da UNESP, Seo de Ps-graduao, ao Departamento de Princpios Ativos Naturais e Toxicologia, ao Departamento de Frmacos e Medicamentos, seus professores e servidores, ressaltando o apoio do servidor Luiz Eduardo

III

dos Santos (Dudu) do Laboratrio de Farmacognosia, pela seriedade, trabalho e empenho em suas atribuies. Aos amigos e companheiros do Laboratrio de Botnica, em especial a Anglica Barretto (Teka) por todos os momentos vividos neste tempo, pela amizade, cumplicidade, carinho e afeto. Aos amigos que fiz nesta etapa de minha vida, quero agradecer a todos por estarem sempre comigo, dando-me fora e incentivo. Por dizerem algumas vezes, o que eu realmente precisava ouvir, em lugar do que eu gostaria que dissessem, e por ter me mostrado um outro lado a considerar, nos momentos difceis. Por compartilhar tantas coisas boas, criando vrias lembranas. Ter um amigo algo especial, ter vrios sensacional, mas ser amigo de algum ainda melhor. Escolhe um trabalho de que gostes, e no ters que trabalhar nem um dia na tua vida

(Confcio) A Escola de Enfermagem Maurcio de Medeiros, pela oportunidade de trabalho ao conceder minha primeira experincia profissional em docncia e pela confiana depositada. Agradeo Direo da Escola, a todos os seus funcionrios, professores e alunos pelo apoio, aprendizado e amizade que me ofereceram. A UniPinhal (Fundao Pinhalense de Ensino) pela confiana e reconhecimento profissional.

IV

Xztyx

Nascemos para manifestar a glria do universo que est dentro de ns. No est apenas em um de ns: est em todos ns. E conforme deixamos nossa prpria luz brilhar, inconscientemente damos s outras pessoas permisso para fazer o mesmo. A educao a arma mais poderosa que voc pode usar para mudar o mundo.

Nelson Rolihlahla Mandela

V

S U M R I O

Pgina

1. RESUMO ................................................................................................................. 1 2. ABSTRACT ............................................................................................................. 2 3. INTRODUO ....................................................................................................... 3 4. OBJETIVOS ............................................................................................................ 5

CAPTULO I - SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI ................................................ 6 1. Introduo .................................................................................................................. 6 1.1. Classificao taxonmica e sistemtica ................................................................. 6 1.2. Aspectos botnicos ................................................................................................. 8 1.3. Aspectos fitoqumicos ............................................................................................ 10 1.4. Aspectos etnobotnicos e farmacolgicos .............................................................. 11

CAPTULO II - ESTUDO ANATMICO E HISTOQUMICO DAS FOLHAS . 14 1. Introduo .................................................................................................................. 14 2. Metodologia ............................................................................................................... 15 2.1. Material botnico .................................................................................................... 15 2.2. Estudo anatmico ................................................................................................... 15 2.3. Estudo histoqumico ............................................................................................... 16 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 17 3.1. Estudo anatmico ................................................................................................... 17 3.2. Estudo histoqumico ............................................................................................... 21 4. Concluso .................................................................................................................. 24

CAPTULO III - CONTROLE DE QUALIDADE DA DROGA VEGETAL ....... 25 1. Introduo .................................................................................................................. 25 1.1. Estabelecimento dos parmetros da qualidade ....................................................... 26 2. Metodologia ............................................................................................................... 27 2.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal .............................. 27 2.2. Determinao do resduo slido do vegetal fresco ................................................. 28 2.3. Obteno da droga vegetal pulverizada .................................................................. 28 2.4. Caracterizao fsico-qumica da droga vegetal pulverizada originada das folhas de Schinus terebinthifolius ............................................................................................

28

2.4.1. Amostragem ........................................................................................................ 28 2.4.2. Determinao da granulometria da droga vegetal pulverizada ........................... 29 2.4.3. Estudo e determinao do tamanho mdio das partculas ................................... 29 2.4.4. Determinao da densidade ................................................................................. 29 2.4.5. Determinao de gua pela perda por dessecao ............................................... 30 2.4.6. Determinao do pH ............................................................................................ 30 2.4.6.1. Determinao potenciomtrica do pH .............................................................. 30 2.4.6.2. Determinao colorimtrica do pH .................................................................. 31 2.4.7. Determinao de cinzas totais ............................................................................. 31 2.4.8. Determinao de cinzas insolveis em cido ...................................................... 31 2.4.9. Determinao de extrativos no extrato alcolico ................................................ 32 2.4.10. Determinao do resduo insolvel no lcool ................................................... 32 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 32 3.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal .............................. 32 3.2. Obteno da droga vegetal pulverizada .................................................................. 33 3.3. Caracterizao fsico-qumica da droga vegetal pulverizada originada das folhas de Schinus terebinthifolius ............................................................................................

33

VI

4. Concluso .................................................................................................................. 39

CAPTULO IV - ESTUDO FITOQUMICO ........................................................... 41 1. Introduo .................................................................................................................. 41 1.1. Anlise fitoqumica preliminar ............................................................................... 42 1.2. Processo extrativo: consideraes gerais ............................................................... 43 1.3. Fracionamento por partio .................................................................................... 43 1.4. Cromatografia em camada delgada ........................................................................ 44 2. Metodologia ............................................................................................................... 44 2.1 Triagem fitoqumica preliminar .............................................................................. 44 2.2. Obteno do extrato etanlico ................................................................................ 45 2.3. Fracionamento do extrato vegetal .......................................................................... 46 2.4. Perfil cromatogrfico .............................................................................................. 46 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 46 4. Concluso .................................................................................................................. 50

CAPTULO V - AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA ............. 51 1. Introduo .................................................................................................................. 51 1.1. Pesquisa da atividade biolgica .............................................................................. 51 1.2. Estudo antibacteriano ............................................................................................. 52 2. Metodologia ............................................................................................................... 53 2.1. Extratos vegetais ..................................................................................................... 53 2.2. Amostras bacterianas .............................................................................................. 54 2.3. Estocagem e manuteno das cepas ....................................................................... 54 2.4. Espectro de absoro do extrato etanlico e fraes do extrato vegetal ................ 54 2.5. Padronizao da suspenso bacteriana ................................................................... 54 2.6. Preparo do extrato etanlico e fraes do extrato vegetal ...................................... 55 2.7. Determinao da atividade antibacteriana e concentrao inibitria mnima (CIM) pelo mtodo de diluio em microplacas ...........................................................

55

2.7.1. Mtodo de diluio em microplacas .................................................................... 55 2.7.1.1. Leitura espectrofotomtrica das microplacas ................................................... 56 2.7.1.2. Determinao da concentrao bactericida mnima (CBM) a partir do mtodo de diluio em microplacas ..............................................................................

57

2.7.1.3. Leitura das microplacas utilizando resazurina como revelador ....................... 57 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 57 3.1. Determinao da atividade antibacteriana e da concentrao inibitria mnima (CIM) pela tcnica de diluio em microplacas com leitura espectrofotomtrica ........

57

3.2. Determinao da atividade antibacteriana e da concentrao inibitria mnima (CIM) pela tcnica de diluio em microplacas utilizando resazurina como revelador

60

3.3. Determinao da concentrao bactericida mnina (CBM) das amostras vegetais que apresentaram atividade antibacteriana ....................................................................

63

4. Concluso .................................................................................................................. 64

5. CONSIDERAES FINAIS .................................................................................. 65

6. REFERNCIA BIBLIOGRFICA ....................................................................... 67

Resumo 1

1. RESUMO

SALVI JUNIOR, A. Schinus terebinthifolius Raddi: estudo anatmico e histoqumico

das folhas e investigao do potencial farmacutico do extrato etanlico e suas fraes.

Araraquara, 2009. (Mestrado em Cincias Farmacuticas) Universidade Estadual Paulista

Jlio de Mesquita Filho - UNESP.

Schinus terebinthifolius Raddi, pertence famlia Anacardiaceae, popularmente denominada

como aroeira-vermelha. Trata-se de uma espcie nativa da Amrica do Sul, especialmente do

Brasil, Paraguai e Argentina. No Brasil ocorre ao longo da Mata Atlntica desde o nordeste

at o sul do pas. Consta oficialmente na primeira edio da Farmacopeia Brasileira, a qual

designa as cascas do tronco como seu farmacgeno, embora estudos revelem que folhas e

frutos tambm podem ser utilizados como fonte de substncias ativas e, devido a este fato,

desperta um grande interesse para a pesquisa. Na literatura citada como cicatrizante, anti-

inflamatria, antioxidante, antitumoral e antimicrobiana. Este trabalho teve como objetivos:

descrever a anatomia da regio mediana de fololos de Schinus terebinthifolius; realizar testes

histoqumicos nas folhas da espcie com fins de caracterizao preliminar de constituintes

qumicos de interesse; realizar o estudo granulomtrico da droga vegetal pulverizada

proveniente do processo de moagem de folhas de S. terebinthifolius; estabelecer a

caracterizao fsico-qumica da droga vegetal; realizar a anlise fitoqumica preliminar do

extrato e fraes obtidas; e, avaliar a atividade antimicrobiana do extrato e das fraes

utilizando-se a tcnica de microdiluio em placas. Os resultados da anatomia revelaram as

formas das estruturas celulares das folhas e os tipos de incluses celulares presentes; na

anlise histoqumica e triagem fitoqumica identificou-se a presena de grupamentos

fenlicos, flavonoides e taninos, terpenoides e saponinas de interesse farmacolgico; na

caracterizao fsico-qumica destacou-se importantes informaes para o estabelecimento

dos parmetros referentes ao controle da qualidade da droga; na atividade antibacteriana, o

extrato e suas fraes, mostraram-se efetivos frente a Staphylococcus aureus, Enterococcus

faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Em funo dos

resultados encontrados, pode-se concluir que as folhas da aroeira-vermelha apresentam

metablitos ativos com potencial para o desenvolvimento de fitoterpicos.

Palavras-chave: Schinus, aroeira-vermelha, anlise histoqumica, avaliao farmacognstica,

atividade antibacteriana.

Ademir Salvi Jnior

Abstract 2

2. ABSTRACT

SALVI JUNIOR, A. Schinus terebinthifolius Raddi: anatomical and histochemical study

of the leaves and research of pharmaceutical potential of the ethanolic extract and its

fractions. Araraquara, 2009. (Master in Pharmaceutical Sciences) Univ. Estadual Paulista

Jlio de Mesquita Filho - UNESP.

Schinus terebinthifolius Raddi, belongs to the Anacardiaceae family, is popularly known as

Brazilian pepper. It is native from South America, especially Brazil, Paraguay and Argentina.

In Brazil it occurs along the Atlantic Forest from the northeast to the south. Officially listed in

the first edition of the Brazilian Pharmacopoeia, which means the bark of the trunk as its

pharmacogens, although studies show that fruits and leaves can also be used as a source of

active substances, and due to this fact, arouses a great interest for search. The literature cited

as healing, anti-inflammatory, antioxidant, antitumor and antimicrobial activities. This study

aimed to describe the anatomy of the middle region of leaves of Schinus terebinthifolius;

perform tests histochemical in leaflets of the species for purposes of preliminary

characterization of chemical constituents of interest; perform the study granulometric to the

sprayed drug plant from the process of grinding the leaves of S. terebinthifolius; establish the

physical-chemical characterization of the drug plant; perform the preliminary phytochemical

analysis of extract and fractions obtained; and, to evaluate the antimicrobial activity of the

extract and the fractions using the microdilution plates. The results of the anatomy revealed

the forms of cellular structures of the leaves and the types of cellular inclusions present; the

histochemical analysis and phytochemical screening could identified the presence of phenolic

groups, flavonoids and tannins, terpenoids and saponins of pharmacological interest; in

physical-chemical characterization to be detached important information for the

establishment of the parameters concerning to quality control of drug; of the antibacterial

activity, the extract and the fractions were shown to be effective against the Staphylococcus

aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa..

Given these results, it can be concluded that the leaves of Brazilian pepper shows of active

metabolites with potential for the development of a herbal medicine.

Keywords: Schinus, Brazilian pepper, histochemical analyses, pharmacognostic assessment,

antibacterial activity.

Ademir Salvi Jnior

Introduo 3

3. INTRODUO

A utilizao de produtos naturais como recurso teraputico to antiga quanto

civilizao humana e, por muito tempo, produtos minerais, vegetais e animais constituram o

arsenal teraputico (EISENBERG et al., 1998). Alm disso, pelo seu paralelo com o

desenvolvimento da cultura humana, foi e ainda acompanhada por significados mgico-

religiosos e vises peculiares de sade e doena (RATES, 2001).

A utilizao de plantas medicinais vem atingindo um pblico cada vez maior. O

retomo medicina natural ou tradicional requer um posicionamento muito firme dos meios

acadmicos. fato preocupante, o uso indiscriminado de plantas medicinais sem qualquer

conhecimento fitoqumico, farmacolgico e toxicolgico. Isto vem acontecendo com a

maioria das espcies vegetais consumidas pela populao (BALLV et al., 1995). A

fitoterapia existe principalmente no mercado informal, o que representa grande perigo sade

da populao (BENDAZZOLI, 2000).

A identificao correta das espcies, sua forma de uso, controle de qualidade e

mecanismo de ao, tambm constituem questes a serem resolvidas. A identificao dos

vegetais proporciona aos laboratrios especializados (ervanrios, farmcias de manipulao,

indstrias de fitoterpicos, estabelecimentos de ensino farmacutico) condies para

efetuarem sua preparao, comercializao ou estudo, com segurana alicerada em

conhecimento cientfico (BALLV et al., 1995).

O uso de plantas medicinais, especialmente na Amrica do Sul, contribui

significativamente para os cuidados bsicos com a sade. Para o tratamento de infeces

comuns, muitas plantas so utilizadas no Brasil na forma de extrato bruto, infuses ou

emplastros, sem nenhuma evidncia cientfica de sua eficcia (PESSINI et al., 2003). Existem

casos em que as preparaes utilizando o extrato bruto so mais eficazes do que aquelas

preparadas com quaisquer de seus princpios ativos isolados (MATOS, 2000).

Inegavelmente, as plantas medicinais e os fitoterpicos apresentam papel importante

na sade das pessoas, pois cerca de 25% dos medicamentos prescritos mundialmente so de

origem vegetal (OMS, 1991; RATES, 2001).

Segundo a OMS, plantas medicinais so todas aquelas silvestres ou cultivadas,

utilizadas como recurso para prevenir, aliviar, curar ou modificar processos fisiolgicos,

patolgicos ou no, ou ainda empregadas como fonte de frmacos ou de seus

precursores/derivados. Os fitoterpicos so produtos medicinais acabados e etiquetados, cujos

componentes ativos so molculas obtidas da extrao de drogas vegetais (partes areas ou

Ademir Salvi Jnior

Introduo 4

subterrneas de plantas, ou outro material vegetal, ou combinaes destes, em estado bruto ou

em formas de preparaes vegetais) (OMS, 2000; RATES, 2001).

O conhecimento sobre as plantas sempre tem acompanhado a evoluo do homem

atravs dos tempos. As primitivas civilizaes cedo se aperceberam da existncia, ao lado das

plantas comestveis, de outras dotadas de maior ou menor toxicidade que, ao serem

experimentadas no combate doena, revelaram, embora empiricamente, o seu potencial

curativo. Toda essa informao foi sendo, de incio, transmitida oralmente s geraes

posteriores, para depois, com o aparecimento da escrita, passar a ser compilada e guardada

como um tesouro precioso (CUNHA, 2005).

O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo e inmeras

experincias vinculadas ao conhecimento popular das plantas medicinais e tecnologia para

correlacionar o saber popular e cientfico (ALBUQUERQUE e HANAZAKI, 2006; SANTOS

et al., 2009).

Com o propsito de se obter as informaes necessrias sobre plantas para fins

medicinais, etnofarmacognostas esto atualmente empenhados nesses estudos devido ao risco

eminente da perda total de tais conhecimentos empricos, considerando-se o que est

acontecendo em diversas regies do globo, onde a rpida mudana do modo de vida de

sociedades est provocando o desaparecimento da sua medicina popular, que se apoia, quase

sempre, em floras muito importantes. Enquadradas nesta problemtica, h um esforo

sistemtico para o estudo de espcies empregadas na medicina popular (CUNHA, 2005).

H sistemas teraputicos, de importncia mundial, que empregam plantas no

tratamento das doenas (CUNHA, 2005). Em casos especficos, a aplicao depender

diretamente da concentrao e composio qumica de metablitos secundrios presentes, os

quais podem variar significativamente seu perfil em funo de fatores como estado

fitofenolgico, fatores geogrficos (localizao), ecolgicos (habitat), variabilidade gentica

(expressa pelos quimiotipos), processo de extrao empregado, entre outros (BANDONI,

2000; MOURA et al., 2007).

Os flavonoides, taninos e leos essenciais, metablitos secundrios presentes na S.

terebinthifolius, mostram-se de grande valia, destacando-se com aplicao nas indstrias de

medicamentos, cosmticos e perfumaria, indstrias de alimentos (como flavorizantes,

antioxidantes e corantes de alimentos e bebidas) e indstrias de curtimento de couro

(LAWRENCE, 1984; QUEIRES e RODRIGUES, 1998; ALLARDICE et al., 1999; TOSS et

al., 2008).

Ademir Salvi Jnior

Objetivos 5

4. OBJETIVOS

Os objetivos foram traados para fornecer informaes teis para a identificao de

Schinus terebinthifolius, bem como propor parmetros de controle de qualidade da droga

vegetal originada de folhas e, ainda, avaliar o potencial antibacteriano da espcie. Para atingi-

los foi possvel:

Descrever a anatomia da regio mediana de fololos de Schinus terebinthifolius;

Realizar testes histoqumicos nas folhas da espcie com fins de caracterizao preliminar de constituintes qumicos de interesse;

Realizar o estudo granulomtrico da droga vegetal pulverizada proveniente do processo de moagem de folhas de S. terebinthifolius;

Estabelecer a caracterizao fsico-qumica da droga vegetal;

Realizar a anlise fitoqumica preliminar do extrato e fraes obtidas;

Avaliar a atividade antibacteriana do extrato e das fraes utilizando-se a tcnica de microdiluio em placas.

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 6

CAPTULO I

SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI

1. Introduo

Muito conhecida dos brasileiros por suas potencialidades medicinais - e por isso

tambm rica em denominaes populares - a aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi) pertence

famlia Anacardiaceae e popularmente denominada como aroeira-vermelha. Nativa da

Amrica do Sul, ocorre no Brasil em regies de Mata Atlntica, remanescentes ou

reflorestadas, desde o Rio Grande do Norte ao Rio Grande do Sul. Consta na primeira edio

da Farmacopeia Brasileira, a qual designa as cascas do troco como seu farmacgeno. No

entanto, suas folhas tm despertado interesses farmacolgicos como fonte de princpios

ativos. Na etnobotnica e em resultados de ensaios farmacolgicos citada como cicatrizante,

anti-inflamatria, antioxidante, antitumoral e antimicrobiana. Figueiredo (2009) aponta que na

dcada de 60, Geraldo Vandr fez uma citao rvore nos versos de uma cano

considerada subversiva, denominada Arrueira, que constou nas listas dos censores do governo

ditatorial como uma provocao e estmulo contra o regime militar de ento.

Madeira de dar em doido vai descer at quebrar

a volta do cip de aroeira no lombo de quem mandou dar

(Arrueira - Geraldo Vandr)

1.1. Classificao taxonmica e sistemtica

Ao publicar, em 1673, a Histoire General des Drogues o farmacutico Pierre Pomet,

adotou a classificao e a descrio taxonmica, para complementar uma identificao

botnica mais precisa e estvel, resolvendo problemas da origem e da descrio dos caracteres

das plantas ou dos rgos utilizados, encorajando, a partir desta poca, o estudo das plantas

para a aplicao no tratamento de doenas (CUNHA, 2005).

Schinus terebinthifolius Raddi pertence famlia Anacardiaceae a qual representada

por 70 gneros e cerca de 600 espcies de rvores e arbustos, conhecidos por serem frutferos

e apresentarem madeira de boa qualidade (PIO CORRA, 1984). Esta famlia est distribuda

principalmente em regies tropicais e subtropicais, com alguns representantes em zonas

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 7

temperadas. Apresenta importncia econmica para a produo de taninos e resinas, bem

como de alimentos, com alguns frutos comestveis. Muitas espcies so cultivadas para

ornamentao. Alguns membros desta famlia possuem tecidos resinosos, resina esta, s

vezes, irritante para a pele. (FAMLIA Anacardiaceae, 2009).

O gnero chamado de Schinus, nome grego para a rvore Mastic (Pistacia lentiscus),

a qual se assemelha. Compreende cerca de 30 espcies nativas para a Amrica do Sul

(FAMLIA Anacardiaceae, 2009). Ao longo dos tempos tem havido um nmero razovel de

reclassificaes no mbito deste gnero e anteriores designaes incorretamente continuam a

ser utilizada por aqueles desconhecidos das mudanas, inclusive, em alguns casos, os

departamentos governamentais e at mesmo livros didticos (SCHINUS, 2008a). Cabe

ressaltar que cerca de 25% dos gneros dessa famlia so conhecidos como txicos e

causadores de dermatite de contato severa (CORREIA et al., 2006). Entre as aroeiras h

algumas que apresentam ao irritante para a pele, porm no esta, a aroeira-vermelha, que

tambm conhecida como aroeira-mansa (AROEIRA vermelha, 2009b).

Schinus terebinthifolius Raddi uma espcie nativa da Amrica do Sul, especialmente

do Brasil, Paraguai e Argentina (DEGSPARI et al., 2005). encontrada em algumas partes

da Amrica Central e algumas regies da Europa, frica, sia e, nos Estados Unidos, ocorre

no Hava, nos Estados da Califrnia, do Arizona e da Flrida onde foi introduzida para fins

ornamentais. No Brasil, ocorre espontaneamente na costa litornea, em reas remanescentes

da Mata Atlntica, e em outros tipos de formaes vegetais, devido sua grande plasticidade

ecolgica (BAGGIO, 1988; LORENZI e MATOS, 2002; SANTOS et al., 2007;

CARVALHO-MACHADO, 2008). A espcie encontrada desde a plancie costeira at

altitudes de 1.100 m a 1.200 m (BAGGIO, 1988).

Dentro de sua amplitude ambiental, a espcie apresenta distintas formas de

crescimento, com ectipos de porte, variando desde pequenos arbustos (50 a 60 cm) at

rvores com 15 metros de altura (REITZ et al., 1983).

So muitas as plantas conhecidas com o nome de aroeira ou arrueira, nome de vrias

espcies de plantas da famlia Anacardiaceae (AROEIRA, 2008), e pelos nomes populares

que carregam deixam transparecer que se trata de espcies espalhadas pelo pas afora

(AROEIRA brasileira, 2009). Especificamente Schinus terebinthifolius Raddi, a aroeira-

vermelha, nativa do Brasil e consta oficialmente na Farmacopeia Brasileira de 1929.

tambm, conhecida popularmente como: aroeira-brasileira, aroeira-branca, aroeira-negra,

aroeira-da-praia, aroeira-do-brejo, aroeira-do-iguap, aroeira-do-campo, aroeira-do-paran,

aroeira-do-serto, aroeira-mansa, aroeira-pimenteira, aroeira-precoce, aguar-yba, aguaraba,

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 8

blsamo, cabu, cambu, corneba, fruto-do-sabi e pimenta-rosa (PHARMACOPEIA, 1929;

SCHINUS, 2008b; AROEIRA mansa, 2009; AROEIRA vermelha, 2009a). designada

tambm pelas de suas sinonmias botnicas: Schinus mucronulata, Schinus weinmanniifolius,

Schinus riedeliana, Schinus selloana, Schinus damaziana, Schinus raddiana (AROEIRA

mansa, 2009), Astronium juglandifolium Griseb., Astronium urundeuva (Fr. All.) Engl.

(AROEIRA vermelha, 2009a). As denominaes internacionais utilizadas so: Brazilian

pepper, Brazilian holly, Brazilian pepper tree, Christmas berry e Florida holly (EUA),

Mexican pepper, pimienta de Brasil (Porto Rico), faux poivrier e poivre rose (Frana),

Rosapfeffer (Alemanha), warui (Ilhas Fiji) (SCHINUS, 2008d).

1.2. Aspectos botnicos

A aroeira-vermelha (Figura 1) uma rvore diica, de pequeno porte e de folhas

perenes. Ocorre em vrias formaes vegetais, sendo mais comum em beiras de rios, crregos

e em vrias vrzeas midas de formao secundria, contudo cresce tambm em terrenos

secos e pobres (LORENZI, 2000).

Figura 1: Aspectos morfolgicos de aroiera-vermelha (Schinus terebinthifolius) A: exemplar cultivado em vaso para ornamentao de interiores; B: detalhe da inflorescncia e das folhas; C: frutos maduros.

O fuste geralmente curto e tortuoso, sustentando uma copa arredondada, pouco densa

e atraente, principalmente quando h florao (pequenos cachos de flores brancas) e

frutificao (cachos de frutos globulosos, vermelhos) (REITZ et al., 1983). Sua madeira,

muito pesada (densidade 1,19 g/cm3), de grande resistncia mecnica e praticamente

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 9

imputrescvel (AROEIRA vermelha, 2009a), tem sido utilizada na forma de moures, cercas,

lenha e carvo (ALLARDICE et al., 1999).

A casca, em sua superfcie externa, de cor pardo-acinzentada, profundamente

fendida no sentido longitudinal e um tanto no sentido transversal, muito rugosa, recoberta

muito irregularmente de manchas mais claras e apresenta de longo em longo placas de

liquens; a face interna estriada longitudinalmente e de cor pardo-avermelhada; esta casca

impregnada de matria resinosa, que aparece frequentemente em sua superfcie (AROEIRA,

1929).

As folhas so compostas, alternadas, imparipinadas, com 2,5 a 12 cm de comprimento

e possuindo de 3 a 13 (normalmente 7 a 11) fololos elpticos-oblongos, com superfcies

superiores verde-escuras e superfcies inferiores verde claras e margens dentadas, com

nervuras claras; tm, como detalhe principal, rquis aladas. As flores so pequenas e dispostas

em inflorescncias axilares e terminais do tipo rcemo, ostentando spalas de formas

triangulares a lanceoladas com margens ciliadas. Ambas as flores, masculinas e femininas,

ocorrem em pedicelos e tm basicamente a mesma estrutura. O florescimento ocorre

principalmente durante os meses de setembro a janeiro, surgindo pequenas flores de colorao

branco-esverdeadas, aromticas e melferas, e devido a este fato so muito atrativas para as

abelhas, o que as tornam muito importantes para a apicultura. O plen abundante pode

provocar reaes alrgicas e irritaes em pessoas sensveis. (REITZ et al., 1983;

SANCHOTENE, 1985; FERRITER, 1997; ALLARDICE et al., 1999; LORENZI, 2000;

DEGSPARI et al., 2005; SANTOS et al., 2007; SCHINUS, 2008b; SCHINUS, 2008c;

AROEIRA brasileira, 2009; AROEIRA mansa, 2009).

As rvores de S. terebinthifolius frutificam predominantemente no perodo de janeiro a

julho (LORENZI, 2000). Seus frutos so pequenos, possuindo um formato arredondado, do

tipo drupa e apresentam colorao verde no incio e depois se tornam rosadas a avermelhadas

e brilhante, reunidos em cachos pendentes; apresentam polpa avermelhada e comestvel,

tornando a aroeira muito procurada e preferida pela avifauna. Na Flrida, seus frutos so

utilizados para decorao de natal, o que lhe conferiu a denominao de Christmas Berry. A

pequena semente do fruto da aroeira-vermelha, redonda e lustrosa nica, marrom escura

medindo cerca de 3 mm de dimetro. Inscreve-se entre as muitas especiarias existentes e que

so utilizadas essencialmente para acrescentar sabor e refinamento aos pratos da culinria

universal. O sabor suave e levemente picante e adocicado do fruto da aroeira-vermelha, bem

como sua bonita aparncia, de uso decorativo permite o seu emprego em variadas

preparaes, podendo ser utilizada na forma de gros inteiros ou modos. No entanto,

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 10

especialmente apropriada para a confeco de molhos que acompanham as carnes brancas, de

aves e peixes, por no sobrepor o seu gosto sutil (USP, 2002). Introduzida na cozinha

europeia, muito popular na Frana, onde utilizada na ornamentao e como tempero de

preparaes culinrias, com o nome de poivre rose (pimenta-rosa); considerado um tipo de

pimenta doce (REITZ et al., 1983; SANCHOTENE, 1985; FERRITER, 1997; LORENZI,

2000; DEGSPARI et al., 2005; SANTOS et al., 2007; SCHINUS, 2008b; AROEIRA

brasileira, 2009; AROEIRA mansa, 2009). Seu sabor parecido com o da pimenta do reino,

sendo um pouco mais suave, aromticos, adocicados e, ao mesmo tempo, levemente

apimentados (AROEIRA vermelha, 2009b; FIGUEIREDO, 2009).

A propagao se d por sementes e, certamente, por estaquia a partir de segmentos da

raiz e do caule. O crescimento relativamente rpido, podendo atingir 1,0 m de altura no

primeiro ano (SANCHOTENE, 1985).

A aroeira-vermelha uma rvore bastante interessante e muito utilizada para

arborizao urbana. Seu porte mdio e a frutificao ornamental, aliadas beleza e rusticidade

da planta, fazem com que ela seja uma excelente escolha para o paisagismo, prestando-se

como arvoreta e para a formao de cercas-vivas. Ela tambm indicada para reflorestamento

de reas degradadas e mata ciliar, pois uma rvore pioneira. A aroeira-vermelha

considerada como planta invasora em muitos pases onde extica, devido facilidade de

propagao (AROEIRA mansa, 2009; FIGUEIREDO, 2009).

1.3. Aspectos fitoqumicos

As principais caractersticas morfo-histolgicas e qumicas da espcie Schinus

terebinthifolius Raddi, com vistas ao seu reconhecimento laboratorial como droga, so

referentes s partes da planta utilizada e sua relao presena de classes de metablitos

secundrios (JORGE e MARKMANN, 1996). Segundo a Farmacopeia Brasileira (1929), a

parte do material vegetal a ser utilizado a casca, embora estudos revelem que alm das

cascas, folhas e frutos tambm podem ser utilizados como fonte de substncias e, devido a

este fato, desperta um grande interesse para a pesquisa.

O interesse pela espcie se d pelo seu metabolismo secundrio que produz diversos

compostos ativos entre outros compostos. Os estudos fitoqumicos de S. terebinthifolius

detectaram a presena de compostos fenlicos simples, flavonoides e taninos, leos

essenciais, esterides, triterpenos, antraquinonas e saponinas na espcie (LAWRENCE, 1984;

JORGE e MARKMANN, 1996; QUEIRES e RODRIGUES, 1998; LIMA et al., 2006).

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 11

Estudos j desenvolvidos detectaram que tanto as cascas como as folhas revelaram-se

igualmente ricas em taninos e em leos essenciais. A nica diferena substancial entre a

composio qumica de ambas no que se refere presena de flavonoides e saponinas, as

quais se destacaram nas cascas (JORGE e MARKMANN, 1996). Verificou-se tambm a

presena de compostos fenlicos nos frutos; extratos obtidos a partir destes apresentaram

quantidade significativa de flavona apigenina (o qual justifica a colorao amarelada), cido

elgico e tambm flavanona naringina (DEGSPARI et al., 2005).

Os leos essenciais so ricos em mono e sesquiterpenos e apresentaram diferenas na

proporo relativa dessas substncias. Estudos apresentaram, com a obteno do leo

essencial de folhas, compostos qumicos majoritrios distintos, como sabineno, -pineno, -pineno, cariofileno, germacreno-D, biciclogermagreno, trans-cariofileno e limoneno

(MOURA et al., 2007; SANTOS et al., 2007). Sendo tambm identificados, em relao ao

leo essencial obtido de frutos maduros, predominantemente, os monoterpenos: -3-careno e -pineno, e os sesquiterpenos: -gurjuneno, cis--guaieno, trans--guaieno, -muuroleno, trans-calameno, cubenol e epi--muurolol (GEHRKE et al., 2007).

1.4. Aspectos etnobotnicos e farmacolgicos

As investigaes etnofarmacolgicas e etnobotnicas tm sido a principal abordagem

reconhecida por cientistas em todo o mundo, como uma estratgia de seleo de plantas

medicinais (ALBUQUERQUE e HANAZAKI, 2006; SANTOS et al., 2009).

Quase todas as partes de S. terebinthifolius, incluindo folhas, cascas, frutos, sementes,

resinas, e oleoresina (ou blsamo), tm sido utilizada medicinalmente pelos povos indgenas

em todas as regies tropicais (PANETTA e MCKEE, 1997). As partes utilizadas de S.

terebinthifolius que apresentam propriedades medicinais so as cascas, as folhas e os frutos e,

o seu emprego correto para fins teraputicos pela populao em geral, requer o seu uso

selecionado por sua eficcia e segurana teraputicas, baseadas na tradio popular ou

cientificamente validadas como medicinais. fundamental que a escolha do material a ser

utilizado, das formas corretas de preparaes e administrao de seus produtos sejam

destinados para o seu uso, conforme o caso, em preparaes diversas para serem ingeridas,

ditas de uso interno e em outras preparaes para uso na pele ou nas mucosas das cavidades

naturais, ditas como uso externo (LORENZI e MATOS, 2002).

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 12

A literatura etnobotnica cita o uso das cascas, com base na tradio popular, na forma

de cozimento (decocto), especialmente pelas mulheres, em banhos de assento aps o parto e

como anti-inflamatrio e cicatrizante, ou como medicao caseira contra febre e para o

tratamento de doenas do sistema urinrio e do aparelho respiratrio, bem como nos casos de

hemoptise (expectorao sangunea ou sanguinolenta), afeces e hemorragias uterinas

(BRAGA, 1960; LORENZI, 1992; GRUENWALD et al., 2000). Da casca, extrai-se o leo

empregado contra tumores e doenas da crnea (DEGSPARI et al., 2005). Segundo Santos e

colaboradores (2009), em um estudo etnobotnico de plantas medicinais para problemas

bucais, destacou-se a aroeira dentre as mais vendidas pelos raizeiros, devido aos relatos de

uso sobre a atividade cicatrizante e anti-inflamatria em afeces bucais.

Com base no uso tradicional e farmacolgico e clnico o extrato das cascas pode ser

usado no tratamento tpico de ferimentos da pele, de mucosas em geral e nos casos de

cervicites (ferida no colo do tero) e cervicovaginites (WANICK e BANDEIRA, 1974) e

tambm de hemorroidas inflamadas; na forma de gargarejos ou bochechos com o decocto para

afeces gengivais e da garganta, podendo ser ingerido para combater a azia e a gastrite

(MATOS, 2002). Esta atividade pode ser til para estudos qumico-estruturais e

farmacolgicos, bem como sntese de novos anti-inflamatrios como alternativa aos que

provocam irritao gstrica (JORGE e MARKMANN, 1996).

Alm das cascas, as folhas tambm so usualmente preparadas na forma de decocto

com finalidade expectorante, antissptica, antidiarrica e cicatrizante (PACIORNIK, 1990;

RODRIGUES e CARVALHO, 2001; DI-STASI, 2002; LORENZI e MATOS, 2002;

MATOS, 2002). Em muitos estudos in vitro, extratos de folhas da aroeira brasileira

demonstram ao antiviral contra vrus de plantas e apresentam ser citotxicos contra alguns

tipos de cnceres (AROEIRA brasileira, 2009).

As folhas e frutos so adicionados gua de lavagem de feridas e lceras, para

limpeza de pele e de ao bactericida, embora a eficcia e a segurana do uso destas

preparaes no tenham sido, ainda, comprovadas cientificamente (BRAGA, 1960;

LORENZI, 1992; GRUENWALD et al., 2000).

Em anlises laboratoriais, assim como o extrato das folhas, os leos essenciais, tanto

das folhas quanto do fruto, tm demonstrado ao fungicida - contra cndida (in vitro) - e,

uma atividade antimicrobiana em estudos clnicos. O leo essencial das folhas e dos frutos

indicado em distrbios respiratrios, pois contm alta concentrao de monoterpenos. eficaz

em micoses, candidase (uso local) e alguns tipos de protozorios intestinais. Age tambm

como auxiliar no tratamento de alguns tipos de tumores/cnceres (carcinoma, sarcoma, dentre

Ademir Salvi Jnior

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi 13

outros) e como agente antiviral e anti-bactericida. Possui ao regeneradora dos tecidos e

til em escaras, queimaduras e problemas de pele (DEGSPARI et al., 2005; AROEIRA

brasileira, 2009). O leo essencial tambm indicado, externamente na forma de gel, loes

ou sabonetes, para limpeza de pele, coceiras, espinhas (acne), manchas, desinfeco de

ferimentos, micoses e para o banho dirio (AROEIRA brasileira, 2009).

Os resultados dos ensaios farmacolgicos de S. terebinthifolius, em diferentes

modelos, registraram a existncia de propriedades cicatrizantes, anti-inflamatrias

(GAZZANEO et al., 2005), antioxidante (VELSQUEZ et al., 2003; EL-MASSRY, 2009),

antitumoral (QUEIRES et al., 2006) e antimicrobiana incluindo nesta ao Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus e

Candida albicans (WANICK e BANDEIRA, 1974, MARTNEZ et al., 1996; GUERRA et

al., 2000; MELO-JNIOR et al., 2002; DEGSPARI et al., 2005; SCHMOURLO et al.,

2005; LIMA et al., 2006; SOARES et al., 2007; EL-MASSRY, 2009). A ao cicatrizante e

anti-inflamatria da droga pode estar relacionada presena de taninos, que podem apresentar

tambm ao antimicrobiana, antiviral, antioxidante e antitumoral. A presena dos

flavonoides pode indicar uma potencializao da ao cicatrizante de S. terebinthifolius,

devido aos flavonoides serem geralmente anti-inflamatrios, embora podem apresentar

tambm ao antiviral e anticarcinognica. Os leos essenciais podem estar tambm

relacionados sua ao anti-inflamatria e antibacteriana (JORGE e MARKMANN, 1996).

O uso das preparaes de aroeira deve ser revestido de cautela por causa da

possibilidade do aparecimento de fenmenos alrgicos na pele e nas mucosas (LORENZI e

MATOS, 2002). Em todas as partes da planta foi identificada a presena de pequena

quantidade de alquil-fenis, substncias causadoras de dermatite alrgicas em pessoas

sensveis (REICHERT e FRERICHS, 1945; GRUENWALD et al., 2000).

O amplo emprego desta planta na medicina popular motivo para a sua escolha como

tema de estudos, visando o seu emprego como fonte de ativos para o desenvolvimento de um

medicamento (fitoterpico ou fitofrmaco) eficaz e seguro.

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 14

CAPTULO II

ESTUDO ANATMICO E HISTOQUMICO DAS FOLHAS

1. Introduo

A tarefa de identificar os seres vivos surgiu com a necessidade humana de

individualiz-los para estudos e utilizaes diversas. Identificar uma espcie vegetal significa

oferecer-lhe meios seguros para que seja reconhecida por suas caractersticas morfolgicas.

Trata-se de uma tarefa rdua partindo-se do pressuposto que os indivduos so semelhantes no

nvel intraespecfico, principalmente (SACRAMENTO, 2009).

A rea farmacutica necessita de material certificado quanto sua identificao

botnica para relacionar seguramente o perfil qumico dos princpios ativos com uma

identidade vlida e reconhecida pela comunidade tcnico-cientfica (SACRAMENTO, 2009).

As espcies vegetais apresentam inmeras caractersticas morfolgicas que podem ser

estudadas e correlacionadas sua identidade, dentre elas o arranjo dos tecidos anatmicos.

Aquelas que ainda guardam em seu repertrio gentico-fisiolgico evolutivo um metabolismo

intrnseco e rico de possibilidades bioqumicas so prdigas em fabricar muitas substncias,

as quais podem ser identificadas quando ainda presentes no interior dos tecidos (SALVI

JNIOR et al., 2008; SOUZA et al., 2008; CEZAR-JUNIOR et al., 2008).

As plantas, principalmente as de uso medicinal podem apresentar sinonmias vulgares

e tambm cientficas dificultando os trabalhos de identificao e aumentando as incertezas do

processo. Diversos equvocos de identificao vegetal ocorrem quando no so observadas as

tcnicas mais apropriadas para o intento (SACRAMENTO, 2009).

Numa investigao criteriosa esgotam-se as possibilidades de erro quando so

executadas anlises complementares que associam os caracteres anatmicos com a ocorrncia

dos princpios ativos caractersticos de uma espcie determinados pela histoqumica e pelos

ensaios fitoqumicos preliminares (SALVI JNIOR et al., 2009; SOUZA-MOREIRA et al.,

2009). importante ressaltar que o estudo macro da morfologia vegetal deve tambm estar

relacionado s prticas de investigao para nortear a anlise dirimindo a dependncia de

equipamentos que muitas vezes podem ser de difcil acesso (SACRAMENTO, 2009).

Em estudos farmacobotnicos objetiva-se caracterizar e identificar espcies de

interesse medicinal, bem como as drogas vegetais originadas de suas partes, garantindo assim

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 15

uma autenticidade para a matria-prima fornecedora de princpios ativos. Nem sempre

caracterizar somente a droga vegetal se faz necessrio. Conhecer microscopicamente outros

rgos da planta fornecedora da droga eleita torna-se, num processo de identificao

complementar ou assessor, importante (SACRAMENTO, 2009).

Inmeras experincias com este ramo podem ser encontradas na literatura. Destaca-se

os trabalhos de Alberton et al., 2001 e Sanches et al. 2007.

Os conhecimentos relacionados Farmacobotnica so desta forma exercitados pelo

agente identificador, pois para entender os processos tcnicos inerentes s atividades de

investigao anatmica e histoqumica, ele ter que ter percorrido uma srie de experincias

tericas e prticas relacionadas sobretudo Anatomia Vegetal e Qumica (SACRAMENTO,

2009).

2. Metodologia

2.1. Material botnico

As folhas de Schinus terebinthifolius Raddi foram colhidas ao amanhecer, em agosto

de 2008, no incio do perodo de florao, de plantas localizadas no Horto de Plantas

Medicinais e Txicas da FCF, no municpio de Araraquara, Estado de So Paulo, nas

coordenadas 21 48 53.7S e 48 12 07,6W, com altitude de 656 metros. Na mesma

ocasio, foram amostrados ramos frteis do mesmo exemplar para a confeco de exsicatas e

depositados no Herbrio Rioclarense sob o nmero HRCB 51.668 e HRCB 51.669.

2.2. Estudo anatmico

Para a anlise anatmica de Schinus terebinthifolius, foram selecionadas folhas

maduras de ramos desenvolvidos. O limbo dos fololos amostrados foi dividido em trs

regies: tero superior, mediano e inferior. Os teros superior e inferior foram desprezados e

tero mediano do limbo foliar foi sub-amostrado em aproximadamente 9 mm2 da rea

prxima nervura central, tendo-se o cuidado de amostrar tambm a frao adjacente

nervura.

Em seguida, o material foi fixado em soluo de glutaraldedo (2,5%) e formaldedo

(4%), por imerso, durante 12 horas, sob condies de vcuo a temperatura ambiente.

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 16

Aps a fixao, o material foi desidratado e submetido pr-infiltrao e infiltrao

para polimerizao em resina sinttica glicol metacrilato, segundo Kraus e Arduin (1997),

sendo observadas as recomendaes do fabricante da resina (Leica).

Os blocos contendo o material includo foram cortados em micrtomo de rotao para

obteno de seces com 7 m de espessura. Aps a secagem e aderncia em lminas de

vidro, as seces foram coradas com azul de toluidina (0,05%) em tampo fosfato (pH 6,8)

(KRAUS e ARDUIN, 1997). Aps a colorao, as seces foram montadas em resina

sinttica Permount. Procedeu-se o estudo anatmico com o auxlio de microscpio com

captura de imagens (Leitz DMRXE).

Para anlise dos estmatos, fragmentos do tero mdio foram submetidos

dissociao com HNO3 (10%) durante 72 horas em estufa a 65 C. Em seguida foram

executadas trs lavagens sucessivas em gua destilada, e neutralizao com NaOH (0,1%) e

novamente lavagem em gua destilada. Clarificou-se os fragmentos obtidos em hipoclorito de

sdio (2%) durante trs minutos, e duas lavagens em soluo de cido actico (0,002%). Foi

aplicado azul de astra (1%) durante trs minutos. Fez-se uma lavagem rpida em etanol

(50%), procedendo-se em seguida a montagem em lminas de vidro contendo soluo de

glicerina:gua (1:1) (adaptado de GHOUSE e YUNUS, 1972; RUZIN, 1999).

2.3. Estudo histoqumico

Em relao ao estudo histoqumico, cortes transversais mo foram realizados em

fololos frescos, examinados e fotografados com auxlio do microscpio de captura de

imagens.

Os testes foram realizados de acordo com as recomendaes propostas por Ascenso

(2003), tanto para identificao de substncias apolares como para as polares. Os reagentes

empregados para evidenciar as substncias apolares foram: Sudan III (JOHANSEN, 1940)

para lipdios totais; sulfato azul do Nilo (CAIN, 1947) para diferenciao de lipdios cidos e

neutros; tetrxido de smio (GANTER e JOLLS, 1969-1970) para a identificao de lipdios

insaturados; reagente de Nadi (DAVID e CARDE, 1964) para identificao de leos

essenciais e leo-resinas; tricloreto de antimnio (HARDMAN e SOFOWORA, 1972; MACE

e HOWELL, 1974) para identificao de esteroides; cido sulfrico para a identificao de

lactonas sesquiterpnicas (Geissman e Griffin, 1971) e 2,4-dinitrofenilhidrazina (GANTER e

JOLLS, 1969-1970) para identificao de terpenoides com grupo carbonila. Para substncias

polares foram empregados: cloreto frrico (GANTER e JOLLS, 1969-1970) e dicromato de

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 17

potssio (GABE, 1968) para a identificao de compostos fenlicos totais; vanilina clordrica

(MACE e HOWELL, 1974) para a identificao de taninos, reagente de Dragendorff

(SVENDSEN e VERPOORTE, 1983) para identificao de alcaloides; lugol (JENSEN, 1962)

para a identificao de amido; vermelho de rutnio (JOHANSEN, 1940) para identificar

pectinas e azul brilhante de Comassie (FISCHER, 1968) para identificar protenas totais.

Neste trabalho, para a deteco das lactonas sesquiterpnicas, foi adotado o

procedimento descrito por Geissman e Griffin (1971) modificado por Higuchi (2007), que

recomenda a reao com uma soluo de cido sulfrico concentrado:glicerina 1:1 (v/v).

Como controle para identificao de substncias apolares, as seces foram tratadas

por dez minutos em cada passagem da srie etanlica (25%, 50%, 75% e 100%) e cetnica

(50% em etanol e 100%), seguida de reidratao gradual (LEWINSOHN et al., 1998). Como

controle para identificao de substncias polares, as seces foram tratadas com banho em

soluo comercial de hipoclorito de sdio (mximo de 2%) por 15 minutos, seguido de trs

banhos consecutivos em soluo gua destilada:cido actico (1:500).

De acordo com Kraus e Arduin (1997), os testes usados nos estudos anatmicos para o

reconhecimento de classes de metablitos celulares, em geral, reagem a mais de uma

substncia, gerando a necessidade de testes complementares, com controle, para garantir

correta interpretao. Em razo dessa recomendao, foram realizadas de uma a trs

repeties para cada substncia, sendo considerados passveis de testes complementares

aqueles compostos determinados por apenas uma reao de colorao.

3. Resultados e discusso

3.1. Estudo anatmico

A Figura 2 mostra os principais caracteres verificados no estudo anatmico dos

fololos de S. terebinthifolius.

As seces transversais do tero mdio da lmina foliolar revelam uma epiderme

uniestratificada, com as clulas da face adaxial maiores que as da face abaxial e com um

formato tabular bem definido. Adjacente a camada de clulas da face adaxial, pode-se

encontrar uma hipoderme, contendo clulas que variam quanto ao aspecto tabular, as quais

so maiores que as clulas epidrmicas (Figura 2A).

Observa-se que o mesofilo apresenta uma organizao dorsiventral, constituda por

duas camadas de clulas de parnquima palidico, que ocupa aproximadamente 75% da

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 18

Figura 2. . AtAspectos anatmicos do fololo de : regio do mesofilo observando-se epiderme, hipoderme (seta), parnquima clorofiliano composto pelo parnquima palidico (pp) e parnquima lacunoso (pl) e estmato (ponta de seta); B: mesofilo com destaque para a ocorrncia de cavidade secretora (asterisco), idioblasto cristalfero na hipoderme contendo drusas (ponta de seta) e estmato; C: idioblastos drusferos dispersos no parnquima clorofiliano, sob luz polarizada (pontas de seta); D: viso da face adaxial da nervura principal mostrando a disposio celular do parnquima medular (pm), cavidades secretoras (asterisco), floema (fl) e xilema (xl); E: viso da face abaxial da nervura principal mostrando colnquima angular (seta), drusas (ponta de seta preta), cavidades secretoras (asterisco), idioblastos fenlicos (ponta de seta branca), floema (fl), xilema (xl) e parnquima medular (pm); F: regio de transio do limbo para a nervura principal mostrando a transio discreta do parnquima clorofiliano para o parnquima fundamental. Barras: A, B e C: 50 m; D, E e F: 100 m.

S. erebinthifolius

pp

pl

ep

pp

pl

ep

*

*

*

fl

xl

flxl

pm

Pm

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 19

espessura do mesofilo. Dentre as clulas desse parnquima, prximo a hipoderme, encontram-

se clulas que possuem aglomerados de cristais de oxalato de clcio do tipo drusas (Figura

2C). O parnquima lacunoso apresenta arranjos compactos com poucos espaos intercelulares

e clulas de formas variadas. Observa-se que em algumas das clulas desse parnquima,

localizadas prximas a epiderme abaxial, h uma grande quantidade de drusas (Figura 2C).

No mesofilo podem ser encontradas grandes cavidades secretoras, possuidoras de clulas

epiteliais e endodrmicas.

A nervura central na regio do tero mediano do limbo foliolar, cncava nas

superfcies abaxial e adaxial. A epiderme mostra clulas pouco menores que as do mesofilo,

mais arredondadas. Na face abaxial verifica-se colnquima angular, onde podem ser

observadas 5 a 7 estratos de clulas, contendo grande quantidade de drusas. A nervura possui

um parnquima medular discreto com clulas de formato polidrico e com vacolo grande

(Figura 2E). Cavidades secretoras aparecem na regio floemtica do sistema vascular, sendo

distribudas acompanhando a tendncia circular deste ltimo (Figuras 2D e 2 E).

Na regio de transio do parnquima clorofiliano com a nervura central, clulas

parenquimticas da nervura aparecem entremeadas s do parnquima clorofiliano

interrompendo-lhe uma sequncia na nervura, consolidada pelo colnquima angular na rea

central (Figura 2D e 2F).

O sistema vascular formado por feixes colaterais, ocorrendo interrupes de clulas

parenquimticas que avanam em direo | regio medular. No xilema, os elementos de vaso

dispem-se radialmente regio central.

A Figura 3 mostra os aspectos verificados nas seces transversais da rquis foliar: um

formato cncavo na regio abaxial e plano na regio adaxial, onde duas expanses laterais

aparecem. Estas possuem epiderme uniestratificada com clulas de formato tabular e s vezes

arredondado, dois estratos na hipoderme, parnquima clorofiliano (palidico e lacunoso) e

um colnquima na extremidade do bordo.

O estelo da rquis possui um parnquima medular constitudo por clulas

isodiamtricas, de paredes delgadas, observando-se a ocorrncia de idioblastos fenlicos

dispersos (Figura 2A). Na regio do floema, cavidades secretoras aparecem dispostas

radialmente acompanhando o cilindro vascular (Figuras 2A e 2D).

Na regio superior plana um colnquima interrompe a continuidade circular do

parnquima fundamental na rquis; h ocorrncia de fibras nesta regio e que tambm

acompanham o cilindro do feixe vascular anficrival. Neste, o xilema possui elementos de vaso

dispostos radialmente e o floema, acompanha uma regio cambial; fibras separam uma regio

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 20

Figura 3. : viso geral da rquis apresentando as expanses laterais (setas) e idioblasto fenlico (ponta de seta);

: detalhe da cavidade secretora (asterisco) e dos tecidos adjacentes;

: 200 ; B, C, D e 50 ; F: 32 m.

Aspectos anatmicos do fololo de . AB: regio superior da rquis mostrando a

disposio do parnquima fundamental (pf) e colnquima (co) e, evidenciando a presena de fibras (seta); C: aspecto da expanso lateral da rquis mostrando a organizao dos tecidos semelhante a do limbo observando-se dois estratos na hipoderme (seta); parnquima palidico (pp); parnquima lacunoso (pl), colnquima (co); D E: regio inferior da rquis evidenciando a organizao do xilema (xl), floema (fl) e das fibras (fb); F: regio da rquis apresentando detalhes das fibras (fb) e de idioblastos cristalferos com monocristais (ponta de seta). Barras: A m E: m

S. terebinthifolius

*

pp

pl

co

fb

pf pf

fl

xl

fb

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 21

cortical discreta formada por clulas de parnquima e colnquima anelar (Figura 3D), onde

podem ser encontrados idioblastos contendo monocristais e drusas, ambos de oxalato de

clcio, prevalecendo em ocorrncia os monocristais (Figura 3F).

3.2. Estudo histoqumico

Um fator importante para a diagnose de drogas vegetais corresponde s incluses

celulares tanto de natureza orgnica ou inorgnica. As substncias sintetizadas no

metabolismo vegetal pode-se ser evidenciadas por reaes histoqumicas, com as quais

podemos identificar um grupo de substncias de interesse do ponto de vista farmacutico

associando-os s caractersticas de identificao da espcie. O estudo histoqumico realizado

para as folhas de S. terebinthifolius e seus resultados esto apontados na Tabela 1 e podem ser

visualizados nas Figuras 4 e 5.

Tabela 1. Estudo histoqumico realizado em folhas de Schinus terebinthifolius.

Polaridade da substncia Grupo de substncias Reativo histoqumico Resultado

lipdios totais sudan III Positivo lipdios cidos e lipdios neutros sulfato azul do Nilo Positivo

leos essenciais e oleoresinas reagente de Nadi Negativo esteroides tricloreto de antimnio Negativo

lactonas sesquiterpnicas cido sulfrico Negativo

substncias apolares

terpenoides c/ grupo carbonila 2,4-dinitrofenilhidrazina Positivo compostos fenlicos totais cloreto frrico Positivo

taninos vanilina clordrica Positivo alcaloides reagente de Dragendorff Negativo

amido lugol Negativo

substncias

polares protenas totais azul brilhante de Comassie Positivo

A Figura 4 mostra os resultados positivos obtidos para as substncias apolares. Os

lipdios totais evidenciados pelo sudan III ocorrem em pequenos lipossomos dispersos em

todo o domnio mesoflico dos fololos, havendo uma concentrao maior no parnquima

clorofiliano em relao regio da nervura principal. Nesta ltima, os lipdios aparecem

evidentes nas cavidades secretoras principalmente em suas clulas epiteliais (Figuras 4B e

4C). O sudan III ao tambm evidenciar as ceras cuticulares mostrou que as clulas

epidrmicas dos fololos apresentam suas paredes celulares bastante cutinizadas conferindo

adequada impermeabilizao perda hdrica e proteo contra agentes patognicos (Figuras

4A, 4B e 4C).

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 22

Figura 4. Resultados positivos para as reaes histoqumicas em s para as principais classes de metablitos apolares: a gerais da regio do

ontrole negativo ()

; G: lipdios cidos (colorao azul) e lipdios neutros (colorao rsea) (sulfato azul do Nilo); J e L: terpenoides com grupo carbonila (2,4-dinitrofenilhidrazina) : 100 ; C, D, G, H e L 50 ; F e J: 32 m.

t fololo de spectos mesofilo e da nervura principal.

A, D, E, H e I: c

B e C: lipdios totais (sudam III); F e

. Barras: A, B, E e I m : m

S. erebinthifolius

srie hidroetanlica e cetnica, seguida de reidratao gradual, com colorao especfica para cada classe de metablito para lipdios totais (A), lipdios cidos e lipdios neutros (D e E) e terpenoides (H e I)

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 23

Figura 5. para as principais classes de metablitos polares: a gerais da regio da

: compostos fenlicos totais (cloreto frrico); G e H: protenas (azul brilhante de Comassie).

tResultados positivos para as reaes histoqumicas em s

soluo de hipoclorito de sdio, seguido de banho em soluo de gua destilada:cido actico (1:500)

fololo despectos nervura principal e do mesofilo do

limbo foliar. A e B: controle negativo para classes de compostos polares (); C e D

E e F: taninos (vanilina clordrica);

S. erebinthifolius

Ademir Salvi Jnior

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas 24

Os lipdios cidos e neutros aparecem evidenciados pelo sulfato azul do Nilo, que por

ser um corante alocromtico permite esta distino. Nas Figuras 4F e 4G podem ser

visualizados os lpides neutros (gorduras) marcados de colorao rsea, concentrados

prximos s cavidades secretoras e os lpides cidos (fosfolipdicos) marcados de azul

concentrados no clornquima.

De acordo com o resultado negativo obtido com o reagente de Nadi no se pode

afirmar que os lpides evidenciados pelo sudan III sejam leos essenciais ou oleoresinas. Os

terpenoides com grupamentos carbonlicos aparecem evidenciados pela colorao alaranjada

no teste com 2,4-dinitrofenilhidrazina nas Figuras 4J e 4L.

A Tabela 1 mostra que os testes histoqumicos para as classes dos metablitos polares

apontam resultados positivos para a ocorrncia de compostos fenlicos, tnicos e proteicos.

Na Figura 5 pode-se observar os caracteres visuais referentes a estas reaes. Os compostos

fenlicos como um todo foram evidenciados com cloreto frrico nas regies parenquimticas

dos fololos, destacando-se que esta ocorrncia se deu em maior intensidade no parnquima

palidico, quase que exclusivamente em seu primeiro estrato celular (Figura 5D). Num

desdobramento da classe fenlica foi testada a ocorrncia de taninos sendo evidenciado que

estes podem ser encontrados no primeiro estrato de clulas do parnquima palidico (Figura

5F). Os compostos proticos esto distribudos nas regies parenquimticas da nervura, bem

como localizados no parnquima palidico (no estrato celular adjacente a face adaxial) e nas

clulas do parnquima lacunoso mais prximo a epiderme da face abaxial.

4. Concluso

Os caracteres anatmicos descritos para S. terebinthifolius contribuem para a

identificao da espcie e auxiliam na identificao desta droga vegetal. Os fololos de

aroeira-vermelha podem ser indicados como fonte de princpios ativos de diferentes classes,

passveis de serem extrados e podem ser utilizados como fonte potencial para fitoterpicos,

indicando diretrizes mais definidas para estudos fitoqumicos de prospeco. Embora estudos

mais aprofundados devam ser realizados acerca do estudo fitoqumico desta espcie.

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 25

CAPTULO III

CONTROLE DE QUALIDADE DA DROGA VEGETAL

1. Introduo

Considerando a participao crescente de plantas medicinais e de medicamento de

origem vegetal no arsenal teraputico, cresce a necessidade de efetuar o controle de qualidade

utilizando de tcnicas modernas e eficientes. As plantas medicinais, que constituem matria-

prima para a produo de fitoterpicos e/ou fitofrmacos, apresentam variaes no teor de

seus constituintes e podem sofrer deterioraes e contaminaes. Assim, o controle de

qualidade de matrias-primas assume particular importncia (SHARAPIN et al., 2000).

Entende-se por qualidade o conjunto de critrios que caracterizam a matria-prima

para o uso ao qual se destina. A partir do estabelecimento dos parmetros de qualidade para a

matria-prima, e considerando-se um planejamento adequado e um controle do processo de

produo do medicamento, a qualidade do produto final estar, em grande parte, assegurada.

A qualidade da matria-prima vegetal a determinante inicial da qualidade de um fitoterpico

(FARIAS, 2001).

A qualidade das matrias-primas vegetais no garante, por si, a eficcia, a segurana e

a qualidade do produto final. A eficcia dada pela comprovao, atravs de ensaios

farmacolgicos, dos efeitos biolgicos preconizados para esses recursos teraputicos. A

segurana determinada pelos ensaios que comprovam a ausncia de efeitos txicos, bem

como pela existncia de contaminantes nocivos sade. A segurana e a eficcia dependem

de diversos fatores, como a metodologia de obteno, a formulao e a forma farmacutica e,

devem ser definidas para cada produto, estabelecendo parmetros de controle de qualidade do

produto final (FARIAS, 2001).

A qualidade adequada das matrias-primas deve ser realizada de acordo com bases

cientficas e tcnicas. Nos procedimentos rotineiros de anlise de qualidade, geralmente

preconizado o emprego de metodologias qumicas, fsicas ou fsico-qumicas e biolgicas,

sendo necessria a correlao entre os parmetros analisados e a finalidade que se destina

(FARIAS, 2001).

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 26

Estabelecido esses critrios, o emprego de protocolos de anlise, permitindo o

acompanhamento e a documentao de todos os procedimentos, fundamental para assegurar

e/ou gerenciar a qualidade (FARIAS, 2001).

Embora haja no pas uma legislao que estabelea critrios para a qualidade, e

normas para produo e comercializao, os produtos fitoterpicos ainda tm sido

comercializados fora dos padres estabelecidos, sem garantia da eficincia teraputica

desejada ou da ausncia de riscos sade do consumidor. Soma-se a isto, ainda, a venda de

produtos a base de plantas medicinais sem nenhuma comprovao pr-clnica nem clnica de

sua eficcia e segurana (YUNES et al., 2001) e a ausncia de farmacovigilncia

(BRANDO et al., 2002).

1.1. Estabelecimento dos parmetros da qualidade

Os parmetros da qualidade para fins farmacuticos so estabelecidos nas

Farmacopeias e Cdigos oficiais (FARIAS, 2001). Um mtodo de anlise prescrito na

Farmacopeia no necessariamente o nico nem o mais avanado sob o ponto de vista

cientfico. , no entanto, o mtodo oficial no qual sero baseadas as decises em casos de

dvidas ou litgio (SHARAPIN et al., 2000).

As farmacopeias so cdigos oficiais ou oficialmente adotados onde so descritos os

padres de qualidade dos medicamentos e os mtodos para a sua anlise, os quais a

monografia deve ser considerada como um todo, capaz de assegurar qualidade adequada ao

produto a que se destina (SHARAPIN et al., 2000). No caso das matrias-primas vegetais

oriundas de plantas clssicas, ou seja, aquelas estudadas tanto do ponto de vista qumico,

quanto farmacolgicos, existem monografias definindo critrios de identidade, de pureza e de

teor de constituintes qumicos. Dependendo da origem do vegetal, podem ser utilizadas

Farmacopeias de diferentes pases, alm de monografias complementares, como as elaboradas

pela Organizao Mundial de Sade (FARIAS, 2001).

No caso das plantas medicinais brasileiras, a grande maioria encontra-se descrita

apenas na primeira edio da Farmacopeia Brasileira, editada em 1929, sendo que partes das

monografias foram suprimidas na segunda edio ou destinadas ao Formulrio Nacional

(FARIAS, 2001). Quando uma droga vegetal no consta em uma Farmacopeia atualizada,

essencial que se elabore uma monografia estabelecendo padres de qualidade dessa planta

como matria-prima.

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 27

Alguns parmetros essenciais para a qualidade das matrias-primas vegetais podem

variar dependendo da procedncia do material. As variaes, principalmente na composio

qumica, ressaltam a importncia dos estudos de caracterizao farmacognstica,

correlacionados com a atividade farmacolgica. Assim sendo, a origem geogrfica exata e as

condies do cultivo, estgio de desenvolvimento, colheita, secagem e armazenamento, bem

como de tratamentos com agrotxicos, descontaminantes e conservantes devem ser

conhecidos (FARIAS, 2001).

O estabelecimento de parmetros quantitativos, para matrias-primas vegetais,

normalmente determinado pelo teor de um conjunto de substncias, preferencialmente

correlacionadas com a finalidade de uso. Para as plantas estabelecido um teor mnimo,

baseado em anlises sistemticas. Nos ensaios quantitativos devem ser consideradas as

caractersticas qumicas e fsico-qumicas dos constituintes, evitando-se erros analticos ou

problemas de abrangncia analtica ou limites de aceitabilidade (FARIAS, 2001).

As anlises realizadas com a amostra tm por objetivo definir se a matria-prima

poder ser empregada na elaborao de medicamentos. Portanto, durante todo o procedimento

de anlise, a matria-prima dever permanecer armazenada separadamente, em quarentena,

aguardando o laudo tcnico e, consequentemente, a sua liberao. Segundo as normas de boas

prticas de fabricao, deve-se guardar como contraprova uma quantidade da amostra

utilizada na anlise, caso seja necessrio repetir os ensaios. Alm disso, todo processo

analtico deve ser validado e variaes nos resultados devero ser consideradas

estatisticamente. Nas anlises de matrias-primas preconizada a realizao de ensaios em

triplicata (FARIAS, 2001).

O objetivo final em todos os casos fazer com que um produto oferecido como

substncia medicamentosa satisfaa um padro de qualidade, enquadrando-se nas exigncias

da monografia, quando analisado pelos mtodos preconizados pela Farmacopeia ou Cdigos

oficiais (SHARAPIN et al., 2000).

2. Metodologia

2.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal

As folhas frescas colhidas foram examinadas e separadas manualmente.

Sequencialmente, as folhas foram submetidas lavagem com gua corrente e, em seguida, a

desinfeco em soluo de hipoclorito de sdio (0,2% de cloro ativo) durante 20 minutos.

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 28

Aps a retirada do excesso de gua procedeu-se a secagem em estufa com ar circulante

(Marconi MA 035) aquecido a temperatura de 40 C, at a obteno de massa constante,

quando ento foram armazenadas em local seco e ao abrigo da luz (SHARAPIN et al., 2000).

2.2. Determinao do resduo slido do vegetal fresco

Tomou-se uma amostra das folhas frescas (10 g), a qual foi fragmentada o suficiente e

em seguida transferida para uma estufa com circulao de ar a temperatura de 40 C, at

massa constante. Calculou-se a porcentagem do resduo slido na amostra e os resultados

foram expressos pela mdia de trs determinaes (DETERMINAO, 1997, p.X-1.).

2.3. Obteno da droga vegetal pulverizada

A metodologia utilizada para a moagem das folhas secas foi por seccionamento

atravs de moinho de facas (Tecnal) seguidas pelo mtodo que combina impacto e atrito pelo

emprego de moinho de bolas (Fabbe). Este processo duplo objetivou a reduo do tamanho

das partculas de modo a aumentar, posteriormente, seu contato com o lquido extrator

(AULTON, 2005).

2.4. Caracterizao fsico-qumica da droga vegetal pulverizada originada das folhas de

Schinus terebinthifolius

Os mtodos de avaliao da droga vegetal foram desenvolvidos segundo normas

farmacopeicas, descritas nas seguintes obras de referncia: Farmacopeia Brasileira, 1977 e

1988; e, outras tcnicas no farmacopeicas descritas por Ansel et al., 2000; Costa, 2001,

Martins e Sacramento, 2004; Aulton, 2005.

2.4.1. Amostragem

Do total obtido para a droga pulverizada, retiraram-se vrias amostras utilizando a

tcnica de quarteamento conforme a necessidade para a execuo das anlises

(AMOSTRAGEM, 1988, p.V.4.2.1.).

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 29

2.4.2. Determinao da granulometria da droga vegetal pulverizada

Para padronizar a granulometria da droga vegetal pulverizada amostrou-se 25 g de p.

Colocou-se a amostra sobre um jogo de tamises (Granutest), operados por dispositivos

mecnicos (Produtest), de abertura nominal da malhas correspondentes a 1,180; 0,840;

0,590; 0,420; 0,250; 0,177 mm, provido de tampa e recipiente coletor. O processo foi

executado em tamisador vibratrio, de ao mecnica uniforme, durante um perodo de trinta

minutos (a F. bras. IV preconiza 20 minutos no mnimo), na escala de 100 vibraes/min de

acordo com as instrues do fabricante do equipamento. Posteriormente, foram pesados,

cuidadosamente, os ps recolhidos do coletor e a frao remanescente sobre cada tamis

(DETERMINAO, 1988, p.V.2.11.). Os resultados foram transpostos para o software

Excel e expressos de acordo com o termo utilizado e, representados pela mdia de trs

determinaes.

2.4.3. Estudo e determinao do tamanho mdio das partculas

Pela distribuio apresentada na determinao da granulometria e por estudos de

passagem e reteno da droga vegetal a partir da quantidade de ps utilizada, realizada pelo

mtodo de tamisao, pode-se construir planilhas e grficos para a determinao do tamanho

mdio das partculas e distribuio do tamanho das partculas utilizando o software Excel.

A distribuio de tamanho de partcula foi desdobrada em intervalos de tamanhos

diferentes, representados na forma de histograma, gerado a partir de dados da faixa

granulomtrica, o qual permitiu que o percentual de partculas apresentadas num dado

dimetro equivalente fosse determinado (AULTON, 2005).

O tamanho mdio das partculas da droga vegetal pulverizada foi quantificado por

mtodo de tamisao, quanto s suas propores de faixa granulomtrica e assim determinado

pelo clculo do dimetro mdio das partculas (dav), sendo o resultado obtido pela mdia de

trs determinaes (ANSEL et al., 2000).

2.4.4. Determinao da densidade

Para a determinao da densidade aparente da droga vegetal pulverizada foram

tomadas trs amostras de 25 g obtidas por quarteamento e separadas em frascos plsticos

independentes.

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 30

Cada amostra foi transferida para encapsulador onde foram dispostos trs grupos de

vinte e cinco cpsulas gelatinosas duras de tamanho 0 (zero), que individualmente possuem

volume conhecido de 0,688 mL; a massa das cpsulas vazias referente a cada grupo foi

determinada anteriormente. Aps o preenchimento dos grupos de cpsulas com a droga

vegetal pulverizada, a massa foi determinada e, descontada a massa das cpsulas vazias a

densidade aparente foi calculada dividindo-se os valores obtidos por exatamente 17,20 mL

(25 x 0,688 mL) (MARTINS e SACRAMENTO, 2004). Os valores de densidade

considerados resultaram da mdia calculada de trs determinaes para cada amostra.

2.4.5. Determinao de gua pela perda por dessecao

Mtodo gravimtrico: colocou-se cerca de 10 g da droga pulverizada, preparada e

exatamente pesada, em cpsula de evaporao, tarada. Secou-se em estufa (Fanen) a 105 C

por cinco horas e pesou-se. Continuou-se a dessecao, pesando a intervalos de uma hora, at

que a diferena entre duas pesagens sucessivas no fosse superior a 0,25% (MTODO, 1977,

p.914).

A porcentagem da perda por dessecao foi calculada pela equao segundo

Farmacopeia Brasileira (DETERMINAO, 1988, p.V.2.9.) e expressa pela mdia de trs

determinaes.

100xPa

PsPu

Pa = massa da amosta;

Pu = massa da cpsula de evaporao contendo a amostra antes da dessecao;

Ps = massa da cpsula de evaporao contendo a amostra aps a dessecao.

2.4.6. Determinao do pH

2.4.6.1. Determinao potenciomtrica do pH

Pesou-se 99,0 g de gua destilada e, aps aquecimento e ebulio durante 5 minutos,

verteu-se a gua destilada fervente sobre exatamente 1,0 g da droga vegetal pulverizada. Em

seguida, tampando-se o recipiente, deixou-se o material em infuso por 15 minutos. Decorrido

este perodo, foi realizada uma filtrao utilizando-se algodo. Aguardou-se o arrefecimento

da soluo extrativa obtida para a verificao do pH da soluo-problema em peagmetro

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 31

(Analion pH-metro), previamente calibrado. Para uma melhor reprodutibilidade deste teste o

valor do pH da gua tambm foi verificado (DETERMINAO, 1988, p.V.2.19.). O

resultado foi expresso pela mdia de trs determinaes.

2.4.6.2. Determinao colorimtrica do pH

Baseou-se no emprego de papeis indicadores, que tem a propriedade de mudar de

colorao conforme a variao de pH. A determinao foi levada a efeito umedecendo-se o

papel indicador (Universalindikator - Merck) com a soluo-problema e observando-se a

mudana de colorao (DETERMINAO, 1988, p.V.2.19.2.).

2.4.7. Determinao de cinzas totais

Calcinou-se previamente o cadinho de porcelana em mufla (Quimis) a temperatura de

450 C por um perodo de 30 minutos. O mesmo foi resfriado em dessecador e sua massa-tara

foi determinado em balana analtica (Tecnal Mark 1300). Posteriormente, amostrou-se

exatamente trs gramas da droga pulverizada, a qual foi distribuda uniformemente no

cadinho, incinerou-se o material e, em seguida, submeteu-se a calcinao em mufla a

temperatura de 450 C por um perodo de duas horas, at a que todo o carvo fosse eliminado.

Aps procedimento, o cadinho foi deixado em dessecador para arrefecimento seguindo-se a

determinao da massa at que o valor atingisse uma massa constante (DETERMINAO,

1988, p.V.4.2.4.). Os resultados calculados foram expressos em porcentagem de cinzas em

relao droga seca e representados pela mdia de trs determinaes.

2.4.8. Determinao de cinzas insolveis em cido

O resduo obtido na determinao de cinzas totais foi aquecido a fervura durante cinco

minutos com 25 mL de cido clordrico (70 g/L) em cadinho coberto com vidro de relgio.

Aps procedimento, lavou-se o vidro de relgio com cinco mL de gua quente, juntando esta

gua ao cadinho. Recolheu-se o resduo insolvel em cido, por filtrao, sobre papel de filtro

isento de cinza (Nalgon 3550), lavando-o com gua quente at que o filtrado se mostrasse

lmpido. Transferiu-se o papel de filtro contendo o resduo para o cadinho original, secou-se

sobre chapa quente (Tecnal TE 018) e incinerou-se a cerca de 500 C at massa constante

(DETERMINAO, 1988, p. V.4.2.5.). Os resultados calculados foram expressos em

Ademir Salvi Jnior

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal 32

porcentagem de cinzas insolveis em cido em relao droga seca e representados pela

mdia de trs determinaes.

2.4.9. Determinao de extrativos no extrato etanlico

Num balo volumtrico de 50 mL de capacidade juntou-se 2,5 g de droga pulverizada

(tamis com malhas de 0,22 mm de largura) e o etanol diludo, a 70 GL,