Artigo TCC Carolina M. Camargo

1

ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE UMA VARIANTE DO GENE CD40L E O PÊNFIGO 1

FOLIÁCEO 2

3

Carolina Maciel CamargoI, Danielle Malheiros

II, Maria Luiza Petzl-Erler

III 4

5

I Graduanda do curso de Ciências Biológicas na Universidade Positivo, Curitiba, PR, Brasil. 6

II Doutora em Genética, professora titular na Universidade Positivo, Curitiba, PR, Brasil. 7

IIIDoutora em Genética Humana, coordenadora do Laboratório de Genética Molecular 8

Humana, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná. 9

10

Correspondência: 11

Dra. Danielle Malheiros, Universidade Positivo, Rua Professor Pedro Viriato Parigot de 12

Souza, 5300 - Cidade Industrial, Curitiba, PR, Brasil. 13

E-mail: [email protected]. 14

15

Palavras-chave: fogo selvagem, CD40L, rs3092945, doença autoimune, estudo de associação 16

caso-controle. 17

18

19

20

21

22

23

24

2

RESUMO 25

26

O pênfigo foliáceo (PF) é uma doença autoimune endêmica no Brasil, de etiologia 27

complexa e pouco conhecida. O gene CD40L, localizado no cromossomo X, codifica a 28

molécula CD40L, expressa principalmente em células T CD4+ ativadas e de papel 29

fundamental na resposta imune celular e humoral. Em razão de suas funções, variabilidade e 30

associações com diversas doenças autoimunes, esse gene é candidato a conferir 31

susceptibilidade ao PF. O polimorfismo rs3092345 (-726T>C) está localizado na região 32

promotora do referido gene e sua associação com o PF já foi encontrada em estudo anterior. O 33

objetivo do presente trabalho foi analisar uma amostra independente de pacientes e controles e 34

subsequentemente reunir esta amostra à já genotipada para ampliar o tamanho da amostra. 35

Para tanto, a genotipagem dos pacientes e controles foi feita através da técnica PCR-RFLP. 36

Foram analisados 155 pacientes e 95 controles. Foi observado apenas um aumento no número 37

de portadores do alelo T em pacientes (OR = 2,50; P = 0,045). Contudo, quando esta amostra 38

foi reunida à amostra já analisada anteriormente, a associação previamente encontrada, de 39

maneira geral, permaneceu. Foi observada uma frequência maior de alelos T (OR = 1,69; P = 40

0,030), uma diminuição de C (OR = 0,58), e uma frequência maior de portadores do alelo T 41

(OR = 4,80; P = ≤10-3

) em pacientes da amostra conjunta de homens e mulheres. A 42

frequência do alelo T foi maior em homens pacientes do que em controles (OR = 3,34, P = 43

0,017), e tendências de associações foram observadas em mulheres. Diferenças 44

estatisticamente significativas também foram encontradas em afrobrasileiros e eurobrasileiros. 45

Os resultados não reproduzem totalmente aqueles do estudo anterior, no entanto, a associação 46

foi confirmada na amostra conjunta. Fica assim demonstrada a importância do tamanho da 47

amostra para os estudos de associação. Os resultados desse estudo levam-nos a concluir que o 48

polimorfismo analisado tem influência na patogênese do PF. 49

3

INTRODUÇÃO 50

51

O pênfigo é um grupo de dermatoses bolhosas autoimunes, raras e órgão-específicas, 52

cuja manifestação cutânea consiste em vesículas e bolhas na pele (Cunha e Barraviera, 2009). 53

A formação de bolhas ocorre através da acantólise (perda de adesão entre os queratinócitos), 54

mediada por autoanticorpos patogênicos que se acumulam nas superfícies dos queratinócitos e 55

são direcionados contra proteínas desmossômicas, as desmogleínas (Dsg) (Martel e Joly, 56

2001; Gonçalves et al., 2011). No pênfigo foliáceo, o antígeno reconhecido é a Dsg1. A 57

doença ocorre no mundo todo, mas sua forma endêmica – o pênfigo foliáceo endêmico (PF) 58

ou fogo selvagem – ocorre no Brasil, além de outros países, porém aqui apresenta sua maior 59

incidência (Campbell et al., 2001; Qian et al., 2012). 60

A etiologia do PF ainda é obscura, mas a agregação temporal e geográfica da doença 61

sugere que a exposição recorrente a determinados fatores ambientais é crucial para o seu 62

desenvolvimento (Diaz et al., 2008). A exposição a picadas de insetos hematófagos parece 63

estar envolvida com a etiologia do PF: Lutzomyia longipalpis (mosquito palha), reduviídeos 64

(barbeiros) e simulídeos (borrachudos) (Qian et al., 2012). A etiologia do PF (fig. 1) parece 65

ocorrer em duas fases. Foi proposto que, em um primeiro estágio, um antígeno ambiental que 66

possui uma sequência semelhante ao domínio EC5 da Dsg1 desencadeia uma resposta não 67

patogênica à Dsg1. Nessa fase, o indivíduo não apresenta lesões cutâneas. A seguir, em certos 68

indivíduos que apresentam susceptibilidade genética, ocorre o fenômeno de espalhamento 69

intramolecular de epítopos, através do qual algum dano tecidual acaba por expor epítopos ou 70

ainda antígenos diferentes daqueles que geraram a resposta não patogênica inicial, e que antes 71

não eram detectados pelo sistema imune, levando à produção de autoanticorpos anti-Dsg1 72

direcionados contra aos domínios EC1 e EC2 e induzindo a acantólise (Culton et al., 2008). 73

4

Para aqueles que acabam por desenvolver a doença, o período entre as duas fases pode durar 74

até 10 anos (Qaqish et al., 2009). 75

O PF é uma das poucas doenças autoimunes nas quais apenas a interação entre o 76

autoanticorpo com o antígeno é capaz de originar todos os sintomas (Hans-Filho et al., 1999). 77

Pacientes com pênfigo apresentam depósitos intercelulares de imunoglobulinas, 78

predominantemente IgG4, mas também IgG1, IgG2, IgE e IgM, nas membranas dos 79

queratinócitos (Aoki et al., 2005; Calvanico et al., 1991; Qian et al., 2011), juntamente com 80

depósitos de complemento, especialmente C3 (Martel e Joly, 2001). A resposta celular 81

também é essencial na patogenia do PF já que as células B, no estágio da produção de 82

autoanticorpos, requerem a interação com células T auxiliares CD4+, especialmente do tipo 83

Th2 (Culton et al., 2008; Lin et al.,2000). Esse fato foi confirmado por Lin et al. (2000), que 84

demonstraram que linfócitos T CD4+, os responsáveis por regular a produção de anticorpos, 85

proliferam e apresentam uma resposta antígeno-específica restrita ao HLA-DR e direcionada 86

ao Dsg1 em pacientes com PF. 87

Aproximadamente 18% dos casos de pacientes com PF são familiares, e a agregação 88

familial evidencia a importância de fatores genéticos no desenvolvimento da doença (Castro e 89

Proença, 1983). 90

Alelos de genes do complexo MHC estão diretamente associados com o PF e doenças 91

autoimunes em geral. Os produtos dos alelos associados a maior susceptibilidade poderiam 92

facilmente interagir e apresentar autoantígenos, iniciando assim uma resposta de células T 93

autorreativas. Alternativamente, poderiam falhar na indução de tolerância central ou 94

periférica. Moléculas HLA classe II, por exemplo, possuem pockets que interagem com 95

aminoácidos de peptídeos ligantes. Polimorfismos das moléculas HLA II, portanto, podem 96

alterar esses sítios de ligação e, assim, os produtos de diferentes alelos ligam conjuntos 97

diferentes de antígenos exógenos e de autoantígenos (Tron et al., 2005). Há comprovada 98

5

associação entre o PF e alelos de HLA-DRB1. Foi proposto que os produtos dos alelos 99

associados à susceptibilidade aumentada compartilham um epítopo representado pela 100

sequência de aminoácidos LLEQRRAA nas posições 67-74 no terceiro domínio hipervariável 101

da molécula, o que sugere que a herança dessa sequência esteja envolvida com o 102

desenvolvimento da doença (Moraes et al., 1997). Entretanto, essa hipótese não foi 103

corroborada em outro estudo (Pavoni et al., 2003). 104

Com relação a outros genes, já foram encontradas associações de variantes genéticas 105

de interleucina 6 (IL6), interleucina 4 (IL4) (Pereira et al., 2004), morte celular programada 1 106

(PDCD1) (Braun-Prado e Petzl-Erler, 2007), CD40, CD40L e BLYS (Malheiros e Petzl-Erler, 107

2009), CD86, CTLA4 e CD28 (Dalla-Costa et al., 2010) com o PF. Associações não foram 108

encontradas com fator de necrose tumoral (TNF), linfotoxina alfa (LTA) (Roxo et al., 2003), 109

antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) (Pavoni et al., 2006), BAX e TP53 (Kohler e 110

Petzl-Erler, 2006) e desmogleína 1 (DSG1) (Petzl-Erler e Malheiros, 2005). 111

O gene que codifica CD40L, o ligante de CD40 (também chamado CD40L, CD154, 112

TRAP, TNFSF5 ou CD40LG), é um candidato a susceptibilidade para doenças autoimunes, 113

devido ao papel essencial que apresenta nas respostas imunes. Em humanos, ele está 114

localizado no cromossomo X, posição Xq26-Xq27, é composto de 12-13 kb, e contém em 5 115

éxons e 4 íntrons (van Kooten e Banchereau, 2000). 116

A molécula CD40L é um potente mediador da resposta inflamatória. Pertence à 117

superfamília TNF, e pode ocorrer como proteína transmembrana ou na forma solúvel, o que 118

evidencia as suas funções de citocina (Vaitaitis e Wagner, 2010). A molécula é expressa 119

principalmente em células T auxiliares CD4+ ativadas, e em menor escala em CD8+. Pode 120

também ser encontrada em plaquetas, macrófagos, basófilos, eosinófilos, células natural 121

killers e monócitos, entre outros (Vaitaitis e Wagner, 2010). A molécula CD40 é expressa em 122

linfócitos B, células dendríticas, macrófagos, e em células não hematopoiéticas, tais como 123

6

queratinócitos e fibroblastos (Malheiros e Petzl-Erler, 2009). Enquanto a expressão de CD40 124

é constitutiva, CD40L é expressa somente após a interação do MHC de classe II com o 125

receptor da célula T e a ativação da célula T. A expressão de CD40L também é autorregulada 126

pela própria ligação do ligante com seu receptor (Thusberg e Vihinen, 2007). 127

A interação entre células T e B, mediada pela ligação de CD40 e CD40L, desencadeia 128

o sinal coestimulatório que induz a proliferação e diferenciação das células B, mudanças de 129

classe das imunoglobulinas, secreção de anticorpos, prevenção da apoptose das células B do 130

centro germinativo, maturação de afinidade, geração de células B de memória e produção de 131

IL-2 pelos dendrócitos (Lobo et al., 2000; Malheiros e Petzl-Erler, 2009). 132

A molécula CD40L está relacionada a várias doenças autoimunes, tais como lúpus, 133

diabetes tipo 1, artrite reumatoide e pênfigo (Goules et al., 2006; Caproni et al., 2007). 134

Associações entre variantes de CD40L com a susceptibilidade ao PF foram observadas 135

por Malheiros e Petzl-Erler (2009). Análises do SNP -726T>C (rs3092945) demonstraram 136

que este polimorfismo está associado fortemente com susceptibilidade ao PF. O objetivo 137

desse trabalho foi analisar uma amostra independente, ampliar a amostra inicialmente 138

analisada e refazer a análise de associação caso-controle do polimorfismo com o PF. 139

140

MATERIAIS E MÉTODOS 141

142

Amostra 143

Uma amostra constituída de 186 pacientes com PF e 105 indivíduos controle foi 144

genotipada para esse estudo. Entretanto, por razões de pareamento de estratos populacionais 145

que serão abordadas posteriormente, para as análises foram utilizados 155 pacientes e 95 146

controles - amostra esta que foi somada àquela anteriormente analisada por Malheiros e Petzl-147

Erler (2009), composta por 150 pacientes e 167 controles. Indivíduos consanguíneos, que 148

7

apresentavam outras doenças autoimunes e/ou aqueles com informações faltantes ou 149

incompletas sobre etnia ou sexo foram excluídos da amostra. 150

A coleta de sangue dos pacientes foi realizada principalmente no Hospital Adventista 151

do Pênfigo de Campo Grande, MS. 152

Os indivíduos controle analisados são residentes nas proximidades das regiões 153

endêmicas do PF. A coleta de sangue desses indivíduos foi realizada, em grande parte, no 154

Hospital Adventista do Pênfigo (Campo Grande, MS). 155

As coletas de sangue foram acompanhadas de uma extensa averiguação clínica e 156

pessoal de pacientes e controles, realizada através de entrevistas. Todos os indivíduos 157

assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, após terem recebido informações 158

sobre os objetivos da pesquisa. Os pacientes incluídos no estudo foram diagnosticados com 159

pênfigo foliáceo através de critérios clínicos e histológicos. 160

A amostra é bastante diversificada em relação aos grupos étnicos que a compõem. 161

Portanto, os indivíduos foram classificados segundo a sua origem: eurobrasileiros (EU, de 162

ascendência predominantemente europeia), amostra composta por 83 pacientes e 57 controles; 163

afrobrasileiros (AF), sendo 29 pacientes e pacientes e 13 controles; e mulatos claros (MC), 164

amostra composta de 43 pacientes e 25 controles. 165

Hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh166

Extração de DNA 167

O DNA dos indivíduos já havia sido obtido através da técnica de extração que utiliza 168

fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (FCI) (Sambrook et al., 1989), e as amostras encontram-169

se armazenadas sob condições adequadas no Laboratório de Genética Molecular Humana 170

(LGMH) da Universidade Federal do Paraná. A concentração de uso de todas as amostras foi 171

ajustada para 20 μg/ml. 172

8

Genotipagem 173

O polimorfismo investigado está localizado na região promotora do gene CD40L, mais 174

especificamente na posição -726T>C. Toda a parte prática do estudo foi realizada no 175

Laboratório de Genética Molecular Humana da Universidade Federal do Paraná. 176

A genotipagem do SNP (Single Nucleotide Polymorphism) -726T>C (rs3092945) foi 177

realizada através da técnica PCR-RFLP (PCR - polimorfismo de comprimento de fragmentos 178

de restrição). Através dessa técnica, o fragmento que contém a posição variável é amplificado 179

por PCR e, em seguida, o mesmo é submetido a uma digestão com enzima de restrição LweI, 180

cujo sítio de clivagem (5'GCATC3') abrange a posição polimórfica -726T>C. Os tamanhos 181

esperados do produto de PCR, bem como aqueles dos fragmentos resultantes após a digestão, 182

são mostrados na figura 2. 183

Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas amplificações foram a montante 5’ – 184

ATCTTCACAGCAACCTAC – 3’, e a juzante 5’ – CACTAAACTCAATGAAAGCC – 3’ 185

(Malheiros e Petzl-Erler, 2009). 186

A reação de PCR compunha-se de 0,04 μg de DNA; 0,6 μM de cada oligonucleotídeo 187

iniciador; tampão 1X (comercial, provido com a Taq polimerase Fermentas); 2 mM de 188

MgCl2; 0,2 mM de cada dNTP; 0,5 U de Taq Polimerase; e água ultrapura q.s.p. para 10 μl. 189

As amplificações foram realizadas segundo a seguinte ciclagem: desnaturação inicial por 3 190

minutos à temperatura de 95°C, seguida de 35 ciclos de desnaturação por 15 segundos a 95°C, 191

anelamento por 30 segundos a 56°C, extensão a 72°C por 40 segundos e, por fim, uma etapa 192

de alongamento por 5 minutos a 72ºC e 5 minutos a 10°C para o resfriamento. 193

A qualidade das amplificações foi verificada através de eletroforese em gel de agarose 194

1%, a 100 V durante 40 minutos. 195

Posteriormente, os amplicons foram submetidos à digestão, segundo a seguinte reação: 196

2 μl de produto de PCR; 0,3 U de enzima de restrição LweI; tampão 1X (comercial, provido 197

9

com a enzima de restrição) e água ultrapura q.s.p. para completar 6,0 μl. Para que a clivagem 198

dos amplicons ocorresse, a mistura foi submetida a uma temperatura de 37ºC por 2 horas. 199

O produto da digestão foi então misturado ao corante (tampão de carregamento e 200

GelRed) e submetido a uma corrida eletroforética em gel de agarose 3%, a uma voltagem de 201

95 V durante 1 hora e 30 minutos. 202

O padrão de bandas obtido segundo a metodologia descrita acima pode ser observado 203

na figura 3. 204

205

Análise estatística 206

As frequências genotípicas, alélicas e de indivíduos portadores foram determinadas 207

através de contagem direta, e foram comparadas entre pacientes e controles através do teste 208

exato de Fisher em tabelas de contingência 2X2. Todas as análises foram realizadas para 209

homens e mulheres separadamente. Análises comparativas entre os diferentes estratos e 210

amostras populacionais foram realizadas da mesma forma. Foram considerados 211

estatisticamente significantes os valores de P inferiores a 0,05, indicando associação da 212

variante com a doença ou diferença significativa entre amostras populacionais. As análises 213

estatísticas foram realizadas através do programa computacional GraphPad Prism 6. 214

O equilíbrio de Hardy-Weinberg para a distribuição de genótipos foi estimado com o 215

programa Hardy-Weinberg Calculator (Court, 2005-2008). 216

Para cada alelo foi estimada uma razão de chances (OR), obtida pelo método de Woolf 217

(Woolf, 1955) e utilizando-se o programa computacional GraphPad Prism 6. Os valores da 218

OR refletem o risco relativo (RR) quando se estudam características raras, como é o caso 219

desse estudo. Portanto, os valores da OR representam a chance que um portador de um 220

determinado polimorfismo genético tem de desenvolver certa patologia em relação à mesma 221

chance de um indivíduo que não possui aquela variante. Uma OR de valor 1 indica que as 222

10

chances de um portador de desenvolver a patologia são as mesmas de um não portador. ORs 223

maiores de 1 significam que as chance de desenvolver a doença são maiores para os 224

portadores do alelo e valores abaixo de 1 indicam uma menor chance. 225

226

RESULTADOS 227

228

O gene CD40L está localizado no cromossomo X e, portanto, todas as frequências e 229

análises de interesse foram calculadas para homens e mulheres separadamente. Todas as 230

amostras foram inicialmente subdivididas em eurobrasileiros (EU), mulatos claros (MC) e 231

afrobrasileiros (negros e mulatos médios e escuros, AF). 232

Na amostra genotipada para esse estudo, os estratos MC e AF foram unidos em um 233

único subgrupo denominado AFRO, sem prévios testes de homogeneidade, considerando-se 234

que o tamanho da subamostra AF era muito pequeno (apenas 29 pacientes e 13 controles). Os 235

estratos populacionais AFRO e EU foram comparados através de um teste de homogeneidade 236

para avaliar se estas etnias poderiam ser analisadas em conjunto. Não houve diferença 237

significativa entre esses estratos em pacientes (P = 0,074) ou em controles (P = 1,000) e, 238

portanto, as amostras foram agrupadas em uma amostra total. 239

Ajustes foram realizados em homens e mulheres da amostra total e dentro do subgrupo 240

AFRO para que as quantidades de indivíduos pertencentes às diferentes ancestralidades 241

fossem proporcionais nas amostras de pacientes e controles. Pacientes e controles da amostra 242

total e de ambos os subgrupos (AFRO e EU) encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg 243

(HW). 244

Foram comparadas, entre pacientes e controles da amostra total (tabela 1), as 245

frequências alélicas, genotípicas e de indivíduos portadores das variantes alélicas. Há uma 246

maior quantidade de portadores do alelo T em pacientes (OR = 2,50; P = 0,045). Não foram 247

11

encontradas outras diferenças estatisticamente significantes entre pacientes e controles dessa 248

amostra. Todas as subamostras encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW). 249

Análises realizadas nas subamostras EU e AFRO também não mostraram diferenças 250

significativas entre pacientes e controles. 251

No estudo realizado por Malheiros e Petzl-Erler (2009), 150 pacientes e 167 controles 252

haviam sido genotipados. Para assegurar a qualidade das genotipagens, foi realizada uma 253

tipagem confirmatória de 45 dos 54 indivíduos que apresentavam genótipo T/C, C/C ou C. 254

Nesta retipagem, o genótipo de 27 indivíduos foi confirmado. Dos restantes, 14 tinham sido 255

genotipados anteriormente como T/C, mas foram alterados para T/T; 3 eram C/C mas foram 256

retipados como T/C e 1 homem teve seu genótipo alterado de C para T. Deste modo, as 257

frequências alélicas e de portadores dos alelos foram calculadas novamente para todos os 258

estratos populacionais. 259

O subgrupo AF foi unido ao MC em um subgrupo AFRO, já que o primeiro era muito 260

pequeno (29 pacientes e 24 controles) para que testes de homogeneidade fossem realizados. 261

Os subgrupos não se mostraram homogêneos para que as amostras pudessem ser reunidas em 262

uma única amostra total. Contudo, como possivelmente a diferença entre África e Europa é 263

significativa (com base nos resultados dos estudos populacionais citados adiante, na 264

Discussão), justifica-se a união dos estratos em uma amostra total, mesmo sem a realização de 265

testes de homogeneidade, desde que sejam feitos ajustes das proporções dos diferentes 266

estratos. As proporções também foram ajustadas no subgrupo AFRO. Todas as amostras 267

encontram-se em equilíbrio de HW. 268

Os resultados das análises da amostra total são mostrados na tabela 2. Foram 269

encontradas diferenças estatisticamente significativas entre pacientes e controles. Na amostra 270

conjunta de homens e mulheres pacientes, há um aumento da frequência de alelos T (OR = 271

2,66; P = 0,005), e diminuição de C (OR = 0,37). Este efeito é provavelmente causado pela 272

12

frequência aumentada de homens hemizigotos T (OR = 10,71; P = 0,009) em pacientes, e 273

diminuição da frequência de homens C também em pacientes (OR = 0,09). Pelo mesmo 274

motivo, há um aumento significativo de portadores de T em pacientes da amostra conjunta de 275

homens e mulheres (OR = 2,81; P = 0,001), e uma tendência de diminuição do número de 276

portadores de C em pacientes (OR = 0,49; P = 0,061). 277

Em eurobrasileiros (tabela 3) da amostra de Malheiros e Petzl-Erler (2009), há um 278

aumento significativo na freqüência de alelos T (OR = 3,02; P = 0,021), assim como uma 279

diminuição na freqüência de alelos C (OR = 0,33) em pacientes. Os portadores do alelo T são 280

mais frequentes em pacientes (OR = 16,88; P = 0,004). Essas associações na amostra 281

conjunta de homens e mulheres refletem as associações encontradas em homens, nos quais há 282

um aumento de alelos T (OR = 10,87; P = 0,040) e uma diminuição de alelos C (OR = 0,09) 283

em pacientes, sendo que nenhuma associação foi encontrada em mulheres. 284

As frequências alélicas, genotípicas e de indivíduos portadores dos diferentes alelos da 285

amostra AFRO de Malheiros e Petzl-Erler estão descritas na tabela 4. Há um aumento 286

estatisticamente significativo do número de portadores do alelo T (OR = 3,03; P = 0,017) em 287

pacientes. Não foram diferenças significativas nas outras comparações. 288

Testes de homogeneidade foram feitos entre todos os estratos da amostra genotipada 289

para este estudo com os estratos da amostra analisada anteriormente. Os subgrupos EU foram 290

homogêneos em pacientes e controles, ao contrário de AFRO em controles (P = 0,04). 291

Entretanto, como todos os indivíduos são teoricamente pertencentes a uma mesma amostra, 292

esses estratos também foram analisados conjuntamente. Apesar de os estratos totais EU e 293

AFRO não apresentarem homogeneidade, esses subgrupos foram unidos em uma única 294

amostra, o que se justifica devido às diferenças significativas entre africanos e europeus (ver 295

acima na linha 265). Ajustes foram realizados em homens e mulheres para que a quantidade 296

13

de indivíduos de diferentes ancestralidades fosse proporcional em pacientes e controles das 297

amostras total e AFRO. 298

As frequências alélicas, genotípicas e de indivíduos portadores dos diferentes alelos da 299

amostra total estão descritas na tabela 5. Pacientes e controles encontram-se em equilíbrio de 300

HW. Diferenças significativas foram encontradas nas frequências alélicas, genotípicas e de 301

portadores da amostra conjunta de homens e mulheres e nos homens. A frequência do alelo T 302

é maior em homens pacientes (OR = 3,34, P = 0,017), e a frequência do alelo C, por sua vez, 303

é menor em pacientes (OR = 0,29). Também foi observada uma maior frequência de alelos T 304

(OR = 1,69; P = 0,030) e um decréscimo de alelos C (OR = 0,58) em pacientes da amostra 305

conjunta de homens e mulheres. Devido a esses resultados, a quantidade de portadores de T é 306

significativamente maior em pacientes do que em controles (OR = 4,80, P≤10-3

). Apesar de 307

não terem sido encontradas diferenças estatisticamente significantes para mulheres, existem 308

tendências de um aumento do número de portadoras do alelo T em pacientes (OR = 6,76; P = 309

0,070). 310

As análises dos subgrupos AFRO das duas amostras podem ser observadas na tabela 6. 311

Há um aumento do número de portadores do alelo T em pacientes (OR = 3,84; P = 0,021) da 312

amostra conjunta de homens e mulheres. Isso é efeito do aumento de homens hemizigotos 313

para o alelo T em pacientes (OR = 4,53; P = 0,038), acompanhado de uma diminuição de 314

homens de genótipo C em pacientes (OR = 0,22). Não houve diferenças significativas entre as 315

mulheres. Pacientes e controles encontram-se em equilíbrio de HW. 316

Diferenças estatisticamente significativas também foram encontradas nos 317

eurobrasileiros da amostra conjunta (tabela 7). Há um aumento significativo na freqüência do 318

alelo T (OR = 2,28; P = 0,015) e uma diminuição da freqüência de alelos C (OR = 0,44). 319

Também há um aumento do número de portadores do alelo T em pacientes (OR = 5,97; P = 320

0,010). Não foi encontrada qualquer associação do polimorfismo em homens, mas há uma 321

14

tendência de associação negativa do genótipo C/C com a doença em mulheres (OR = 0,10; P 322

= 0,074). Há também tendências de aumento da freqüência do alelo T (OR = 2,17; P = 0,057) 323

e de diminuição da freqüência de alelos C em pacientes mulheres (OR = 46). A amostra de 324

mulheres controles está fora do equilíbrio de HW (HW = 0,038), porém o valor está próximo 325

ao limiar. 326

327

DISCUSSÃO 328

329

Considerações sobre a composição da amostra 330

O tamanho das amostras de pacientes e de indivíduos controle é um importante 331

indicador de qualidade de um estudo de associação. Tendo consciência desse fato, os 332

indivíduos genotipados nesse trabalho foram analisados independentemente e conjuntamente 333

com a amostra previamente analisada por Malheiros e Petzl-Erler (2009). Ainda assim, o 334

tamanho amostral não é o ideal para estudos de associação com genótipos ou alelos pouco 335

frequentes na população. Contudo, deve-se levar em conta que o PF é uma doença rara e, 336

deste modo, o tamanho das amostras do nosso estudo é considerável. Além disso, estudos 337

iniciais, mesmo com falta de significância estatística, podem indicar possíveis tendências que 338

podem ser reproduzidas em estudos posteriores. 339

A escolha de quais populações serão amostradas é também um fator importante, pois 340

uma das principais fontes de resultados espúrios em análises de associação é a estratificação 341

populacional (Balding, 2006), que ocorre quando casos e controles apresentam frequências 342

alélicas distintas devido a diferentes ancestralidades (Cardon e Palmer, 2003). Para que uma 343

falsa associação seja encontrada em razão da estratificação populacional, duas condições 344

devem ser atendidas: 1) a frequência do alelo de interesse deve variar substancialmente entre 345

os estratos, e 2) a prevalência da doença deve também variar nas diferentes etnias (Marchini 346

15

et al., 2004). Para evitar falsos resultados e com o objetivo de efetuar as análises de 347

associação nos diferentes estratos, a amostra foi inicialmente subdividida em três subgrupos: 348

um com indivíduos de origem predominantemente europeia (EU), outro com indivíduos 349

mestiços de origem predominantemente africana (AF) e um terceiro composto por indivíduos 350

também mestiços, mas com predominância de ancestralidade europeia (MC). 351

352

Considerações sobre a qualidade das genotipagens 353

A técnica utilizada para genotipagem foi PCR-RFLP, e possíveis erros inerentes a essa 354

técnica são: digestão parcial do amplicon pela enzima de restrição e erros de leitura ou de 355

interpretação. Para mitigar tais erros, as seguintes medidas foram tomadas. (1) Em todas as 356

digestões, foram incluídos no mínimo três indivíduos de genótipos já conhecidos (um 357

homozigoto para o alelo T, um homozigoto para o alelo C e um heterozigoto). (2) Foi feita a 358

tipagem cega de 20 indivíduos, cujos genótipos eram desconhecidos no momento da digestão, 359

e depois comparados por outro pesquisador no banco de dados do laboratório; todos os 20 360

genótipos (T/T) foram confirmados para o SNP em questão. (3) Para evitar erros de 361

genotipagem devido à digestão parcial, todos os indivíduos heterozigotos T/C e homo e 362

hemizigotos C/C e C foram genotipados no mínimo três vezes. 363

364

Considerações sobre a análise da posição -726 T>C 365

Polimorfismos de CD40L vêm sendo associados a diversas doenças que envolvem o 366

sistema imunitário. Até o ano de 1999, eram conhecidas pouco mais de 74 mutações desse 367

gene, muito heterogêneas entre si e com diferentes resultados na funcionalidade e estrutura da 368

molécula (Garber et al., 1999). 369

Alelos deletérios que causam a falha na expressão de proteínas CD40L funcionais são 370

a causa da síndrome do hiper-IgM ligada ao X, uma imunodeficiência causada pela não 371

16

produção de IgG, IgA e IgE (Thusberg e Vihinen, 2007). A superexpressão de CD40L está 372

relacionada com diversas doenças autoimunes, tais como lúpus, diabetes tipo 1 e artrite 373

reumatoide (Goules et al., 2006; Caproni et al., 2007). Lleo et al.(2012) demonstraram que 374

pacientes com cirrose primária biliar têm menores níveis de DNA metilado no promotor do 375

gene CD40L em células T CD4+, o que resulta em superexpressão da molécula transcrita. Um 376

SNP localizado no íntron 4 do gene CD40L foi analisado em populações asiáticas e está 377

associado positivamente com a ocorrência da doença de Kawasaki, uma vasculite 378

imunológica que atinge jovens e crianças (Onouchi et al., 2004). A superexpressão de CD40L 379

observada nesses pacientes pode levar à superestimulação de CD40, assim estabelecendo e 380

perpetuando o desenvolvimento da doença (Vaitaitis e Wagner, 2010). 381

Existem também evidências de participação do sistema CD40-CD40L na patogênese 382

do pênfigo. Caproni et al. (2007) demonstraram que o número de células CD40+ e CD40L+ 383

infiltrantes na derme, de cópias de RNAm de CD40L e de quantidade de CD40L solúvel em 384

pacientes com pênfigo vulgar (PV) e PF é maior do que nos controles. Segundo Aoki-Ota et 385

al. (2006), administração de anticorpos anti-CD40L no inicio do desenvolvimento de PV em 386

camundongos foi o bastante para inibir a produção de autoanticorpos anti-Dsg3. 387

Estes estudos (Caproni et al., 2007; Aoki-Ota et al., 2006; Malheiros e Petzl-Erler, 388

2009) sugerem que a interação CD40-CD40L seja crucial nos processos imunológicos que 389

precedem à síntese de autoanticorpos no pênfigo. A interação das células T CD40L+

com 390

dendrócitos CD40+

é necessária para iniciar a função da célula T e subsequente ativação da 391

resposta imune humoral dependente de células T, levando à proliferação e diferenciação das 392

células B. Além disso, a ativação de queratinócitos e células endoteliais pelo CD40L pode 393

levar à superexpressão de moléculas de adesão e produção de mediadores parácrinos, como 394

quimiocinas e citocinas, assim aumentando a resposta inflamatória. Queratinócitos e células 395

endoteliais, quando ativadas, podem secretar IL-1, IL-6, TNF-α e óxido nítrico, mediadores 396

17

químicos que podem contribuir com a acantólise (Caproni et al., 2007). No pênfigo, ocorre 397

também uma superexpressão de CD40L solúvel em pacientes. O CD40L solúvel é produzido 398

por células T ativadas, e pode mediar a produção de anticorpos ao se ligar ao receptor CD40 399

em células B em linfonodos e outros tecidos, e atuar como citocina em células epiteliais, 400

aumentando a apresentação de antígenos no epitélio (Goules et al., 2006). 401

A expressão da molécula CD40L em células T é regulada de acordo com o estágio de 402

desenvolvimento das células – o ligante é expresso em células T maduras ativadas, simples 403

positivas, e quase que exclusivamente em células T CD4+ (Lobo et al., 2000). Essa regulação 404

da expressão de CD40L sugere que polimorfismos nas regiões regulatórias 5’ e 3’ podem ser 405

importantes na resposta imune (Malheiros e Petzl-Erler, 2009). O conhecimento das regiões 406

regulatórias do promotor do gene CD40L é de grande importância para a compreensão da 407

sequência de eventos que levam à produção de citocinas em estágios inflamatórios iniciais. 408

Esses fatores motivaram o estudo do polimorfismo -726T>C. 409

Alterações em nucleotídeos em uma região promotora podem mudar a própria 410

conformação do promotor, incluindo seus elementos regulatórios, afetar a ligação de fatores 411

de transcrição, e regular a expressão gênica (Crow e Yixin, 2001). Steiper et al. (2008) 412

evidenciou a importância da região promotora do CD40L ao comparar a sua sequência entre 413

várias espécies de mamíferos, e descobriu que diversas regiões no promotor do gene CD40L 414

são altamente conservadas. 415

A regulação do transcrito do gene CD40L pode ocorrer através do reconhecimento de 416

sequências na região promotora do gene por intermédio de vários elementos – NF-AT, EGR, 417

AP-1, NF-kB, AKNA, e TFE3/TFEB (Steiper et al., 2008). O fator de transcrição NF-AT tem 418

um papel essencial na transcrição de citocinas e fatores de transcrição expressos em células T 419

logo após sua estimulação. Na região 5’ do gene CD40L, existem três sítios de ligação de 420

fatores de transcrição NF-AT, localizados em -62 a -69, -258 a -265 e -761 a -756 a montante 421

18

do sítio de início de transcrição. O mais distal tem o maior efeito entre os três na regulação da 422

transcrição de CD40L (Lobo et al., 2000). Steiper et al.(2008) demonstrou que esse sítio de 423

ligação de 6 pb é conservado em todos os primatas, o que evidencia ainda mais a importância 424

dessa região. Essa é a única região regulatória conhecida que fica perto da região da variante -425

726T>C (Cron, 2003). Porém, não existem evidências de que esse polimorfismo mude a 426

afinidade com esses fatores de transcrição. 427

Não existem muitas informações sobre a frequência da variante CD40L -726T>C em 428

populações mundiais. A frequência alélica de -726C em controles eurobrasileiros observada 429

nesse estudo (10,5%) é mais alta do que aquela descrita pelo projeto HapMap em duas 430

amostras de eurodescendentes (5% e 2,8%). Contudo, ambas as amostra descritas pelo 431

HapMap estão fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg, e a amostra de eurodescendentes 432

analisada neste estudo não é composta por europeus, mas por indivíduos miscigenados com 433

origem predominantemente europeia. A frequência do alelo C observada no presente estudo 434

(18%) é próxima àquela encontrada na amostra de controles afrobrasileiros (N = 4101) 435

analisada por Ndila (2009) (C = 22,6%), da amostra de afrodescendentes disponível no 436

HapMap, na qual a frequência do alelo C é de 31%. De modo geral, observando as 437

frequências alélicas de -726C descritas em amostras europeias pelo projeto HapMap e em 438

amostras africanas descritas pelo HapMap e por Ndila (2009), há uma tendência no aumento 439

da frequência do alelo C em africanos em comparação com europeus. Essa diferença foi 440

corroborada pelo presente estudo. 441

Estudos sobre associações do polimorfismo deste gene com doenças também são 442

escassos. Sabeti et al. (2002) encontraram uma pequena e significante redução no risco para a 443

malária (OR=0,52; P=0,002) em homens hemizigotos para o alelo -726C, e uma tendência à 444

associação foi encontrada para as mulheres. Ndila (2009) encontrou também forte evidência 445

de proteção contra a malária exercida pelo alelo C do polimorfismo rs3092945 (OR=0,65, 446

19

P=3,4x10-8

). Manjurano et al. (2012) encontrou um aumento significativo do genótipo T/T 447

em relação a T/C e C/C em pacientes de malária do sexo feminino (OR = 5,27; P = 0,01), mas 448

não encontrou a associação em homens. Até o momento, outras análises desse SNP e 449

associação com doenças são inexistentes. 450

No PF, a frequência do alelo T está aumentada em pacientes, enquanto que o oposto 451

ocorre com o alelo C e, portanto, o risco de PF diminui pela presença do alelo C. Malheiros e 452

Petzl-Erler (2009) descreveram associação do polimorfismo com o PF em mulheres e homens 453

da amostra total. A frequência do alelo T estava aumentada (OR = 3,65), acompanhada de um 454

decréscimo do alelo C (OR = 0,27; P = 10-6

) em pacientes. Após a tipagem confirmatória e 455

alteração dos genótipos de alguns indivíduos, as análises foram refeitas na amostra total, de 456

eurobrasileiros e de afrobrasileiros. A associação permaneceu nas amostras conjuntas de 457

homens e mulheres e em homens da amostra total e de eurobrasileiros, mas desapareceu em 458

mulheres em ambos os casos, apesar de existirem tendências de associação em mulheres 459

eurobrasileiras. Na amostra conjunta de homens e mulheres da amostra total, a frequência do 460

alelo T está aumentada (OR = 2,66) e a de C diminuída (OR = 0,37; P = 0,005) em pacientes. 461

Na amostra de indivíduos genotipados para esse estudo, foram encontradas diferenças 462

estatisticamente significantes em relação ao aumento do número de portadores do alelo T em 463

pacientes. Além disso, as frequências alélicas, genotípicas e de portadores mantiveram-se no 464

sentido do aumento da frequência do alelo T em pacientes quando comparados aos controles, 465

o que pode ser observado na amostra de homens, mulheres e amostra conjunta de homens e 466

mulheres. A não reprodutibilidade total do estudo, porém, não significa que a associação não 467

é verdadeira, especialmente se o efeito genético da variante for fraco. Normalmente, estudos 468

de associação com pequeno tamanho amostral não têm poder suficiente para detectar 469

pequenos efeitos (Hirschhorn et al., 2002), o que pode ser o caso deste estudo. Portanto, 470

provavelmente o limitado tamanho da amostra do presente estudo influenciou a não 471

20

observância de diferenças estatisticamente significativas entre pacientes e controles (exceto 472

pelo número de portadores do alelo T que foi significativamente maior em pacientes). 473

Desta maneira, fica evidenciada a importância deste trabalho no que concerne ao 474

aumento do número amostral analisado para esta variante. A associação encontrada por 475

Malheiros e Petzl-Erler (2009) foi confirmada com a análise conjunta das amostras do estudo 476

anterior e deste estudo. Foram observadas diferenças estatisticamente significativas em 477

homens afrobrasileiros e da amostra total, e nas amostras conjuntas de homens e mulheres da 478

amostra total e das subamostras de eurobrasileiros e afrobrasileiros. Foram encontradas 479

tendências de associação em mulheres de origem predominantemente européia e da amostra 480

total. Os resultados são similares àqueles de Sabeti et al. (2002), que encontrou significante 481

redução no risco para a malária em homens C+, e tendências de associação em mulheres. 482

Em suma, os resultados levam-nos a concluir que o polimorfismo analisado influencia 483

a susceptibilidade/resistência ao PF. É possível que isso seja efeito do aumento de afinidade 484

que o polimorfismo rs3092945 exerce entre os fatores de transcrição e seus sítios de ligação 485

que se localizam na região promotora do gene CD40L, aumentando a expressão dessa 486

molécula e propiciando um aumento da resposta inflamatória e da resposta imune humoral na 487

patogenia do PF. O polimorfismo rs3092945 poderia também estar em desequilíbrio de 488

ligação (LD) com o marcador genético que realmente apresenta associação com a 489

susceptibilidade ao pênfigo. 490

Possivelmente, como sugerido para a malária, as associações seguem um modelo de 491

herança cujo poder de detecção é mais limitado em mulheres, ou poderia haver diferença real 492

entre homens e mulheres no efeito biológico do alelo (Sabeti et al.,2002), o que explicaria os 493

resultados distintos observados em homens e mulheres. 494

495

496

21

AGRADECIMENTOS 497

498

À Universidade Federal do Paraná, ao LGMH, e à Universidade Positivo pelo apoio 499

financeiro. 500

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690

691

692

693

29

Figura 1. Etiopatogenia do FS (AOKI et al., 2008). 694

695

696

Figura 2. Localização da posição variável –726C>T no fragmento amplificado por PCR, 697

mostrando que o alelo T é clivado pela enzima de restrição, originando dois fragmentos. O 698

perfil eletroforético esperado para os três genótipos é: 447 bp (pares de bases) para o genótipo 699

C/C; 196 e 251 bp para o genótipo T/T e 196, 251 e 447 bp para o genótipo T/C. *Sítio de 700

restrição. 701

702

703

704

705

706

30

Figura 3. Padrão de bandas em gel de agarose dos fragmentos de restrição. Genótipos 707

possíveis: T/T, T/C, C/C. 708

709

710

711

Tabela 1. Frequências alélicas, genotípicas e de portadores de CD40L -726 (T,C) na amostra 712

total de indivíduos analisados no presente estudo. 713

Pacientes

Controles

OR 95% IC P

150 % 86 %

T 214 91,8 T 118 90,1 1,24 0,59-2,60 0,700

C 19 8,2 C 13 9,9 0,80 0,38-1,69

T+ 145 96,7 T+ 81 94,2 2,50 1,06-5,89 0,045

C+ 18 12,0 C+ 12 14,0 0,90 0,41-1,98 0,842

Mulheres 83 Mulheres 45

T/T 69 83,1 T/T 37 82,2

T/C 13 15,7 T/C 7 15,6 0,99 0,36-2,71 1,000

C/C 1 1,2 C/C 1 2,2 0,53 0,03-8,82 1,000

T 151 91,0 T 81 90,0 1,12 0,46-2,67 0,824

C 15 9,0 C 9 10,0 0,89 0,37-2,13

T+ 82 98,8 T+ 44 97,8 1,86 0,11-30,52 1,000

C+ 14 169 C+ 8 17,8 0,94 0,36-2,44 1,000

HW 0,666 HW 0,362

Homens 67 Homens 41

T 63 94,0 T 37 90,2 1,70 0,40-7,21 0,707

C 4 6,0 C 4 9,8 0,58 0,14-2,48

OR = Odds ratio; HW = Hardy-Weinberg; IC = intervalo de confiança. 714

715

716

+

Sentido da

corrida

447 pb

251 pb

196 pb

-

31

Tabela 2. Frequências alélicas, genotípicas e de portadores de CD40L -726T>C na amostra 717

total de Malheiros e Petzl-Erler (2009), após retipagem e correção de alguns genótipos. 718

Pacientes Controles OR 95% IC P

135 % 141 %

T 204 94,0 T 171 85,5 2,66 1,34-5,27 0,005

C 13 6,0 C 29 14,5 0,37 0,18-0,74

T+ 134 99,3 T+ 125 88,7 2,81 1,50-5,25 0,001

C+ 13 9,6 C+ 27 19,1 0,49 0,24-0,99 0,061


T/T 70 85,4 T/T 46 78,0

T/C 12 14,6 T/C 11 18,6 0,72 0,29-1,76 0,493

C/C 0 0 C/C 2 3,4 0,13 0,00-2,81 0,163

T 152 92,7 T 103 87,3 1,84 0,82-4,10 0,152

C 12 7,3 C 15 12,7 0,52 0,24-1,20

T+ 82 100,0 T+ 57 96,6 7,17 0,33-152,24 0,173

C+ 12 14,6 C+ 13 22,0 0,60 0,25-1,44 0,272

HW 0,475 HW 0,219

Homens 53 Homens 82

T 52 94,1 T 68 82,9 10,71 1,36-84,05 0,009

C 1 5,9 C 14 17,1 0,09 0,01-0,73


720

Tabela 3. Frequências alélicas, genotípicas e de portadores de CD40L -726T>C em 721

eurobrasileiros (EU) da amostra de Malheiros e Petzl-Erler (2009). 722


95 % 116 %

T 145 96,0 T 152 88,9 3,02 1,17-7,77 0,021

C 6 4,0 C 19 11,1 0,33 0,13-0,85

T+ 95 100,0 T+ 107 92,2 16,88 0,97-293,90 0,004

C+ 6 6,3 C+ 17 14,7 0,39 0,14-1,03 0,074


T/T 50 89,3 T/T 45 81,8

T/C 6 10,7 T/C 8 14,5 0,67 0,21-2,09 0,574

C/C 0 0 C/C 2 3,6 0,18 0,00-3,85 0,232

T 106 94,6 T 98 89,1 2,16 0,78-5,98 0,147

C 6 5,4 C 12 10,9 0,46 0,16-1,28

T+ 56 100,0 T+ 53 96,4 5,28 0,24-112,54 0,243

C+ 6 10,7 C+ 10 18,2 0,54 0,18-1,60 0,292

HW 0,672 HW 0,062

Homens 39 Homens 61

T 39 100,0 T 54 88,5 10,87 0,60-195,98 0,040

C 0 0 C 7 11,5 0,090 0,00-1,65


32


em afrobrasileiros (AFRO) da amostra de Malheiros e Petzl-Eler (2009). 725


55 % 41 %

T 71 87,7 T 44 75,9 2,25 0,92-5,52 0,109

C 10 12,3 C 14 24,1 0,44 0,18-1,08

T+ 46 83,6 T+ 32 78,0 3,03 1,21-7,55 0,017

C+ 10 18,2 C+ 13 31,7 0,70 0,27-1,77 0,480


T/T 20 76,9 T/T 12 70,6

T/C 6 23,1 T/C 4 23,5 0,90 0,21-3,85 1,000

C/C 0 0 C/C 1 5,9 0,20 0,00-5,38 0,394

T 46 88,5 T 28 82,4 1,64 0,48-5,59 0,528

C 6 11,5 C 6 17,6 0,61 0,18-2,07

T+ 26 100,0 T+ 16 94,1 4,81 0,18-125,40 0,395

C+ 6 23,1 C+ 5 29,4 0,72 0,18-1,87 0,728

HW 0,506 HW 0,432

Homens 29 Homens 24

T 25 86,2 T 16 66,7 3,12 0,80-12,10 0,111

C 4 13,8 C 8 33,3 0,32 0,08-1,24


727


conjunta total de Malheiros e Petzl-Eler (2009) e do presente estudo. 729


277 % 239 %

T 412 92,17 T 298 86,9 1,69 1,06-2,71 0,030

C 35 7,83 C 43 12,5 0,58 0,36-0,94

T+ 271 97,8 T+ 216 90,4 4,80 1,92-12,02 ≤10-3

C+ 34 12,3 C+ 40 16,7 0,69 0,42-1,14 0,166


T/T 141 82,9 T/T 82 78,8

T/C 28 16,5 T/C 18 17,3 0,90 0,47-1,74 0,867

C/C 1 0,6 C/C 3 2,9 0,19 0,01-1,89 0,148

T 310 91,2 T 182 87,5 1,36 0,77-2,40 0,302

C 30 8,8 C 24 11,5 0,73 0,41-1,29

T+ 169 99,4 T+ 100 96,2 6,76 0,74-61,33 0,070

C+ 29 17,1 C+ 21 20,2 0,80 0,43-1,49 0,520

HW 0,757 HW 0,125

Homens 107 Homens 135

T 102 95,3 T 116 85,9 3,34 1,20-9,27 0,017

C 5 4,7 C 19 14,1 0,29 0,11-0,83


731

33


conjunta de afrobrasileiros (AFRO) de Malheiros e Petzl-Eler (2009) e do presente estudo. 733

Pacientes

Controles

OR 95% IC P

94 % 89 %

T 124 86,7 T 109 82,0 1,43 0,74-2,76 0,320

C 19 13,3 C 24 18,0 0,69 0,36-1,33

T+ 90 95,7 T+ 76 85,4 3,84 1,20-12,29 0,021

C+ 18 19,1 C+ 22 24,7 0,72 0,35-1,46 0,377


T/T 34 69,4 T/T 33 75,0

T/C 14 28,6 T/C 9 20,5 1,51 0,57-3,96 0,472

C/C 1 2,0 C/C 2 4,5 0,48 0,04-5,61 0,999

T 82 83,7 T 75 85,2 0,88 0,40-1,96 0,841

C 16 16,3 C 13 14,8 1,12 0,51-2,49

T+ 48 98,0 T+ 42 95,5 2,28 0,20-26,11 0,601

C+ 15 30,6 C+ 11 25,0 1,32 0,53-3,30 0,645

HW 0,748 HW 0,213

Homens 45 Homens 45

T 42 93,3 T 34 75,6 4,53 1,17-17,54 0,038

C 3 6,7 C 11 24,4 0,22 0,05-0,85


735


conjunta de eurobrasileiros (EU) de Malheiros e Petzl-Eler (2009) e do presente estudo. 737

Pacientes

Controles

OR 95% IC P

178 % 173 %

T 271 95,1 T 229 89,5 2,28 1,16-1,45 0,015

C 14 4,9 C 27 10,5 0,44 0,22-0,85

T+ 176 98,9 T+ 162 93,6 5,97 1,30-27,36 0,010

C+ 14 7,9 C+ 24 13,9 0,53 0,26-1,06 0,085


T/T 95 88,8 T/T 67 80,7

T/C 12 11,2 T/C 13 15,7 0,65 0,27-1,51 0,386

C/C 0 0 C/C 3 3,6 0,10 0,00-1,98 0,074

T 202 94,4 T 147 88,6 2,17 1,02-4,62 0,057

C 12 5,6 C 19 11,4 0,46 021-0,97

T+ 107 100,0 T+ 80 96,4 9,34 0,47-183,54 0,082

C+ 12 11,2 C+ 16 19,3 0,53 0,23-1,19 0,149

HW 0,538 HW 0,038

Homens 71 Homens 90

T 69 97,2 T 82 91,1 3,36 0,69-16,37 0,187

C 2 2,8 C 8 8,9 0,290 0,06-1,44
