Asociacin de mutaciones del gen dihidrofolato reductasa de Plaglifos.concyt.gob.gt/digital/fodecyt/fodecyt 2003.22.pdfdentro del fondo nacional de ciencia y tecnologÍa –fonacyt-,

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

-FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA

INFORME FINAL

“DIVERSIDAD GENÉTICA DE Plasmodium vivax EN REGIONES DE ALTO RIESGO DE MALARIA EN GUATEMALA”

PROYECTO FODECYT No. 22-2003

Licda. RENATA DE CABRERA Investigador Principal

GUATEMALA, FEBRERO DEL 2011

AGRADECIMIENTOS:

LA REALIZACIÓN DE ESTE TRABAJO HA SIDO POSIBLE GRACIAS AL APOYO FINANCIERO DENTRO DEL FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –FONACYT-, OTORGADO POR LA SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –SENACYT- Y AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –CONCYT-.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

RESUMEN.....................................................................................................................................................5

ABSTRACT ...................................................................................................................................................6

PARTE I.........................................................................................................................................................7 I.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................7 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.............................................................................................9

I.2.1 Justificación................................................................................................................................10 I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS ...............................................................................................................11

I.3.1 Objetivos......................................................................................................................................11 1.4 METODOLOGÍA...............................................................................................................................13

I.4.1 Localización ...............................................................................................................................13 I.4.2 Definición de variables...............................................................................................................14 I.4.3 Tipo y diseño general del estudio ................................................................................................14 I.4.4 Estrategia Metodológica ............................................................................................................14 I.4.5 Método........................................................................................................................................15 I.4.6 Análisis .......................................................................................................................................16 I.4.7 Instrumentos de Análisis.............................................................................................................17

PARTE II .....................................................................................................................................................18 II. MARCO TEÓRICO .............................................................................................................................18

II.1 Aspectos Generales de la Malaria ...............................................................................................18 II.2 Diversidad genética de los parásitos de malaria .........................................................................19 II.3 Diversidad genética de P. vivax...................................................................................................20

PARTE III....................................................................................................................................................22 III.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN...............................................................................................................22

III.1.1 Recolección y Selección de Muestras .......................................................................................22 III.1.2 Confirmación de Especie. ........................................................................................................22 III.1.3 Amplificación de genes marcadores. .......................................................................................22 III.1.4 Secuenciación. .........................................................................................................................23 III.1.5 Análisis de Secuencias. ............................................................................................................23 III.1.6 Elaboración de Árboles Filogenéticos.....................................................................................31 III.1.7 Genética de Poblaciones..........................................................................................................33 III.1.8 Análisis Estadístico..................................................................................................................36

PARTE IV....................................................................................................................................................37 IV.1 CONCLUSIONES ................................................................................................................................37 IV.2 RECOMENDACIONES .........................................................................................................................38 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................................39 IV.4 ANEXOS............................................................................................................................................41

IV.4.1 Anexo 1......................................................................................................................................42 IV.4.2 Anexo 2......................................................................................................................................43 IV.4.3 Anexo 3......................................................................................................................................47 IV.4.4 Anexo 4......................................................................................................................................51 IV.4.5 Anexo 5.....................................................................................................................................53 IV.4.6 Anexo 6......................................................................................................................................54 IV.4.7 Anexo 7......................................................................................................................................55 IV.4.8 Anexo 8......................................................................................................................................58

PARTE V .....................................................................................................................................................59 V.1 INFORME FINANCIERO .......................................................................................................................59

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ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Datos geográficos y ambientales de las regiones de estudio.

13

Cuadro 2. Número de muestras y período de colecta.

22

Cuadro 3. Porcentaje de muestras con amplificación positiva

22

Cuadro 4: Porcentaje de muestras con amplificación y secuencia positiva

23

Cuadro 5: Número de residuos de glutamina identificados en cada uno de los sub-tipos

29

Cuadro 6. El número de alelos diferentes encontrados para cada uno de los genes analizados

33

Cuadro 7. Frecuencia de cada sub-tipo en las muestras analizadas.

34

Cuadro 8. Diversidad genética por sub-tipo, para las poblaciones estudiadas.

34

Cuadro 9. Valores de P calculados para la prueba de significancia estadística de Fisher

58

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Áreas geográficas de procedencia de las muestras.

13

Figura 2: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de siete sub-tipos del gen para la CSP

25

Figura 3: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de cinco sub-tipos del gen para la MSP1, región 2/3

27

Figura 4: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 9 sub-tipos del gen para la MSP1, región 5

30

Figura 5: Árbol de distancia para el gen CSP

31

Figura 6: Árbol de distancia para el gen MSP1D2/3

32

Figura 7: Árbol de distancia para el gen MSP1D5

33

Figura 8: Electroferograma parcial para la hebra sentido de la muestra E16

51

Figura 9: Electroferograma parcial para la hebra sentido de la muestra P32

51

Figura 10: Electroferograma parcial para la hebra sentido de la muestra T74

52

Figura 11: Electroferograma parcial para la hebra contrasentido de la muestra P46

53

4

RESUMEN

La malaria es una enfermedad parasitaria ocasionada por parásitos unicelulares del

género Plasmodium, dentro del cual existen cuatro especies que infectan al ser humano. Una de ellas es Plasmodium vivax, responsable de aproximadamente 98% de las infecciones en Guatemala. De todas las regiones endémicas del país, la región norte reporta más del 65% de los casos, en particular los departamentos de Quiché, Petén y Alta Verapáz.

A pesar de la alta incidencia de malaria por P. vivax, los parásitos de esta especie aún no han sido caracterizados en el país. Esta caracterización es importante, ya que permite conocer la genética de población de los parásitos que están circulando actualmente en Guatemala. Esto constituye información importante para las acciones que realiza el Ministerio de Salud Pública en el control de la malaria en el país, ya que permite conocer (1) la localización de regiones en donde circulan genotipos asociados a mayor incidencia de malaria o a infecciones más severas, (2) el posible patrón de dispersión de estos genotipos, (3) la identificación de los genes que codifican para varias de las proteínas que se están utilizando a nivel internacional para la generación de posibles vacunas para prevenir la enfermedad, (4) la utilidad de esta caracterización como nueva herramienta para medir el impacto de medidas de control de la malaria utilizadas actualmente en Guatemala y, finalmente, (5) sentar las bases para el futuro desarrollo de un enfoque molecular para el monitoreo de resistencia de P. vivax a cloroquina y primaquina, antimaláricos de primera línea en Guatemala.

El principal objetivo del estudio fue describir la diversidad genética de los parásitos de Plasmodium vivax en Guatemala, para lo cual se analizaron muestras de ADN obtenidas a partir de láminas de gota gruesa de pacientes con infecciones positivas por P. vivax, procedentes de áreas endémicas del norte, sur y sur-este de Guatemala. Cada muestra fue analizada para el gen de la proteína del circumsporozoito (CSP) y para dos regiones variables del gen de la proteína 1 de superficie del merozoito (MSP1), la primera localizada entre los bloques conservados (ICB por sus siglas en inglés - Interspecies Conserved Block-) ICB2-ICB3, y la segunda entre los bloques ICB5-ICB6. Los resultados mostraron que para el gen CSP, todos los aislados de las tres regiones estudiadas pertenecen al tipo VK210, dentro del cual se encontraron siete variantes genéticas. En cuanto al gen MSP1 ICB2-ICB3, se identificaron cinco subtipos diferentes, mientras que para el gen MSP1 ICB5-ICB6, se encontraron nueve subtipos. No se encontró ninguna asociación estadísticamente significativa entre el genotipo identificado y las características generales de los pacientes o el grado de infección.

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ABSTRACT

Malaria is a parasitic disease caused by unicellular parasites of genus Plasmodium, within this genus, there are four species that infect humans. One of them is Plasmodium vivax, responsible of approximately 98% of the infections in Guatemala. From all the endemic regions of the country, the Northern region reports more than 65% of the cases, in particular the departments of Quiche, Petén and Alta Verapáz.

Although the high incidence of malaria by P. vivax, the parasites of this species have not been characterized in the country. This characterization is important, since it will allow knowing the genetics population of the parasites that are circulating at the moment in Guatemala. This constitutes important information for the actions of the Ministry of Public Health in malaria control in the country, since it will allow to know (1) the regions where genotypes associated to greater incidence of malaria or more severe infections circulate, (2) the possible pattern of dispersion of these genotypes, (3) the identification of the genes that code for several of the proteins that are being tested worldwide for the generation of possible vaccines to prevent the disease, (4) the usefulness of this characterization as a new tool to determine the impact of measures of control of malaria in Guatemala and, finally, (5) create the bases for the future development of a molecular approach for the monitoring of resistance of P. vivax to chloroquine and primaquine, first line of antimalarial treatment in Guatemala.

The main objective of the study was to describe the genetic diversity of the parasites of Plasmodium vivax in Guatemala, for which DNA samples obtained from thick smears of patients with positive infections by P. vivax were analyzed. These smears were obtained from endemic areas of the north, south-east and south of Guatemala. Each sample was analyzed for the circumsporozoite protein (CSP) gene and for two variable regions of the gene of the merozoite surface protein 1 (MSP1), the first located between interspecies conserved blocks (ICB) ICB2-ICB3, and the second between blocks ICB5-ICB6. For the CSP gene, all the isolates from the three studied regions belonged to type VK210, within which were seven genetic variants. For MSP1 ICB2-ICB3 gene there were identified five different subtypes, whereas for MSP1 ICB5-ICB6 gene, were identified nine subtypes. There was not statistically significant association between the identified genotypes and the general characteristics of the patients or the severity of infection.

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PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN

El principal objetivo de este estudio fue la caracterización de la estructura poblacional de P. vivax en regiones con alto riesgo de malaria en Guatemala: departamentos de Petén sur-oriental, Quiché (municipio de Ixcán), Izabal y Escuintla. Dicha caracterización se realizó a través del análisis molecular de seis genes que codifican para las proteínas CS, MSP-1 regiones 2/3 y 5, MSP-3 alfa y beta, y AMA-1 de P. vivax. Con la información obtenida se determinará la frecuencia de alelos presentes en cada una de las áreas analizadas, las diferencias entre sub-poblaciones, la diversidad de sustituciones sinónimas y no-sinónimas entre secuencias y el desequilibrio de ligamiento entre locus. Con la información de las secuencias de los haplotipos identificados, se elaborarán árboles filogenéticos para establecer las relaciones evolutivas de los mismos. Finalmente, se determinará si existe alguna asociación estadísticamente significativa entre los genotipos encontrados y las características generales de los pacientes (género, edad, lugar de residencia), grado de infección que presentaban (densidad parasitaria) y datos epidemiológicos de las regiones estudiadas (incidencia de malaria e índice de inoculación entomológico).

Estos resultados permitirán conocer la genética de población de los parásitos que están circulando actualmente en Guatemala lo que generará información de utilidad para las acciones que realiza actualmente el Ministerio de Salud Pública en el control de la malaria en el país, ya que permitirán no solo conocer si existen regiones en donde circulan genotipos asociados a mayor incidencia de malaria o a infecciones más severas, sino también permitirán contar con información sobre el posible patrón de dispersión de estos genotipos.

La caracterización planteada en este proyecto permitirá tener plenamente identificados los genes que codifican para varias de las proteínas que se están utilizando a nivel internacional para la generación de posibles vacunas para prevenir la enfermedad. Dado que muchas de estas proteínas se encuentran bajo presión de selección por parte del hospedero, tienden a ser muy variables entre una región geográfica y otra, lo que limita su utilidad universal. El contar con la secuencia completa de estos genes para Guatemala, permitirá poder evaluar la posible utilidad de las futuras vacunas generadas por la comunidad internacional en el país, de acuerdo con la naturaleza de los genotipos identificados localmente.

El estudio de la diversidad genética de P. vivax proporcionará también una nueva herramienta para medir el impacto de medidas de control de la malaria utilizadas actualmente en Guatemala; en la mayoría de los casos, el impacto de las medidas de control se miden a través de indicadores como incidencia de casos clínicos, fallas en el tratamiento, etc. Sin embargo, estos indicadores no tienen la capacidad de medir cambios más sutiles en la población de parásitos, a diferencia de los estudios de genética de poblaciones. En el país se están realizando estudios para implementar nuevas medidas de control, como el uso de mosquiteros impregnados, por lo que es importante contar con un método más sensible de evaluación de impacto de dichas medidas a corto plazo. La tipificación de los parásitos antes y después del uso de las muestras provenientes del estudio del impacto del uso de mosquiteros impregnados

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con insecticidas en Guatemala generará información importante para elaborar los protocolos que permitirán evaluar el impacto de estas medidas.

Por último, este estudio proveerá las bases para el futuro desarrollo de un enfoque molecular para el monitoreo de resistencia de P. vivax a cloroquina y primaquina, antimaláricos utilizados en Guatemala como primera línea, y a otros posibles esquemas de tratamiento.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En Guatemala se reportan alrededor de 57,000 casos de malaria anualmente, que corresponden a una tasa de incidencia del 9.07 por mil habitantes. Aproximadamente, el 98% de las infecciones son debidas a Plasmodium vivax, mientras que el restante 2% a Plasmodium falciparum. La región norte del país aporta más del 65% de los casos de malaria debido, en parte, a la constante colonización de grandes áreas de territorio y al difícil acceso de la población al diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. De acuerdo a datos del IPA del año 2001, la mayor incidencia de malaria se reportó en los departamentos de Quiché, en específico el municipio de Ixcán (66.71); Petén (65.37); y Alta Verapáz (46.30) (Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social –MSPAS-, datos no publicados).

En varias regiones del mundo se ha determinado que los parásitos responsables de la malaria presentan una diversidad genética significativa, la cual se ha descrito en términos morfológicos, bioquímicos, clínicos y moleculares. Dentro de los estudios moleculares, se han realizado diversos trabajos sobre estructura poblacional en Plasmodium falciparum y en menor escala en Plasmodium vivax. En Guatemala no se han realizado estudios específicos acerca de la estructura poblacional de P. vivax, a pesar que entre el 96 a 98% de la infecciones de malaria son ocasionadas por esta especie. Sin embargo, ya se han realizado estudios preliminares acerca de la epidemiología molecular de esta especie utilizando como marcador la proteína 1 de superficie del merozoito (MSP-1), región 5 en poblaciones del sur del país (Tiquisate, Escuintla). Estos estudios fueron realizados mediante el uso de las técnicas de PCR y SSCP (De Urioste, datos no publicados) y se identificó la presencia de cinco diferentes genotipos de P. vivax en muestras de pacientes para el día cero (previo al tratamiento) y días de recurrencia. En la mayoría de los casos, los genotipos identificados en los días de recurrencia correspondieron a los genotipos identificados en el día 0 y no se encontró ninguna asociación significativa entre el genotipo responsable de la infección y la presencia de recurrencias. Tampoco se encontró asociación estadísticamente significativa entre los genotipos identificados y el género o edad del paciente, así como tampoco entre el total de formas sexuadas y asexuadas en gota gruesa. Sin embargo, si se observó asociación entre la temperatura corporal y las infecciones causadas por diferentes alelos del parásito, lo cual sugiere que el genotipo del parásito si influye en las manifestaciones clínicas de la enfermedad.

En relación con este estudio, un análisis preliminar del gen para la MSP-1, región 5 en muestras provenientes del norte del país (Ixcán, Quiché) mostró la presencia de alelos diferentes para este gen, los cuales forman un grupo genéticamente distinto al grupo de alelos encontrados en el área sur (datos no publicados). Esto sugiere la presencia de diferentes genotipos de P. vivax en distintas áreas del país, lo cual cobra mayor importancia por el hecho que estas localidades (norte y sur) presentan características epidemiológicas distintas en cuanto a tasas de incidencia, niveles de transmisión, inmunidad de la población y

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niveles de exposición a medicamentos. Todo esto hace necesaria una evaluación geográficamente más amplia de la estructura poblacional de P. vivax.

I.2.1 Justificación

La caracterización genética de las cepas de P. vivax circulantes en el país permitirá conocer la genética de las poblaciones de parásitos que están circulando actualmente en Guatemala lo que generará información de utilidad para las acciones que realiza actualmente el Ministerio de Salud Pública en el control de la malaria en el país. Este estudio permitirán no solo conocer si existen regiones en donde circulan genotipos asociados a mayor incidencia de malaria o a infecciones más severas, sino también permitirán contar con información sobre el posible patrón de dispersión de estos genotipos.

La caracterización planteada en este proyecto permitirá tener plenamente identificados los genes que codifican para varias de las proteínas que se están utilizando a nivel internacional para la generación de posibles vacunas para prevenir la enfermedad. Dado que muchas de estas proteínas se encuentran bajo presión de selección por parte del hospedero, tienden a ser muy variables entre una región geográfica y otra, lo que limita su utilidad universal. El contar con la secuencia completa de estos genes para Guatemala, permitirá poder evaluar la posible utilidad de las futuras vacunas generadas por la comunidad internacional en el país, de acuerdo con la naturaleza de los genotipos identificados localmente.

El estudio de la diversidad genética de P. vivax proporcionará también una nueva herramienta para medir el impacto de medidas de control de la malaria utilizadas actualmente en Guatemala; en la mayoría de los casos, el impacto de las medidas de control se miden a través de indicadores como incidencia de casos clínicos, fallas en el tratamiento, etc. Sin embargo, estos indicadores no tienen la capacidad de medir cambios más sutiles en la población de parásitos, a diferencia de los estudios de genética de poblaciones. En el país se están realizando estudios para implementar nuevas medidas de control, como el uso de mosquiteros impregnados, por lo que es importante contar con un método más sensible de evaluación de impacto de dichas medidas a corto plazo. La tipificación de los parásitos antes y después del uso de las muestras provenientes del estudio del impacto del uso de mosquiteros impregnados con insecticidas en Guatemala generará información importante para elaborar los protocolos que permitirán evaluar el impacto de estas medidas.

Por último, este estudio proveerá las bases para el futuro desarrollo de un enfoque molecular para el monitoreo de resistencia de P. vivax a cloroquina y primaquina, antimaláricos utilizados en Guatemala como primera línea, y a otros posibles esquemas de tratamiento.

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I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General Caracterizar la estructura poblacional de Plasmodium vivax en los departamentos de Petén, Quiché (municipio de Ixcán), Izabal y Escuintla en Guatemala, a través del análisis molecular de los genes que codifican para la proteína del circunsporozoito (CS), proteína 1 de la superficie del merozoito (MSP-1) regiones 2/3 y 5, proteína 3 de la superficie del merozoito (MSP-3) alfa y beta, y antígeno apical 1 de la membrana (AMA-1).

I.3.1.2 Específicos

a. Estandarizar la amplificación por PCR de los genes que codifican para la

proteína CS; proteína MSP-1, regiones 2/3 y 5; proteína MSP-3 alfa y beta; y antígeno AMA-1 de Plasmodium vivax a partir de muestras de sangre en papel filtro y en láminas de gota gruesa.

b. Identificar los alelos presentes en las poblaciones analizadas para cada uno de

los genes estudiados a través del análisis de los productos de PCR por secuenciación.

c. Determinar la frecuencia de alelos para cada uno de los genes propuestos, en

cada una de las regiones estudiadas.

d. Determinar, a través del cálculo del índice de fijación (Fst), si existen divergencias genéticas entre y dentro de las poblaciones estudiadas, y en diferentes épocas del año (seca-fría, seca-cálida y lluviosa).

e. Calcular si existe flujo genético entre sub-poblaciones de las áreas analizadas.

f. Determinar la diversidad de sustituciones sinónimas y no-sinónimas entre los

distintos alelos identificados para cada gen.

g. Establecer el tipo de asociación entre alelos presentes en loci diferentes (desequilibrio de ligamiento).

h. Elaborar un árbol filogenético entre los genotipos identificados.

i. Determinar si existe asociación entre los alelos identificados y características

generales de los pacientes (género, edad, lugar de residencia), grado de infección que presentaban (densidad parasitaria) y datos epidemiológicos de las regiones estudiadas (incidencia de malaria e índice de inoculación entomológico).

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I.3.1.3 Hipótesis

Existe diversidad genética en los genes que codifican para la proteína del circunsporozoito (CS), proteína 1 de la superficie del merozoito (MSP-1) regiones3 y 5, proteína 3 de la superficie del merozoito (MSP-3) alfa y beta, y antígeno apical 1 de la membrana (AMA-1) entre las poblaciones de parásitos de Plasmodium vivax presentes en los departamentos de Petén, Quiché (municipio de Ixcán), Izabal y Escuintla en Guatemala, a través del análisis molecular de.

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1.4 METODOLOGÍA

I.4.1 Localización

La recolección de muestras se realizó en los municipios de Poptún (Petén), El Estor (Izabal), Ixcán (Quiché) y Tiquisate (Escuintla) (Fig.1), cuyos datos geográficos y ambientales se detallan a continuación:

Cuadro 1. Datos geográficos y ambientales de las regiones de estudio.

Municipio Latitud

Longitud

Temperatura

máxima (°C)

Temperatura mínima

(°C)

Promedio de Temperatura

(°C)

Humedad Relativa

(%)

Altura sobre el nivel del mar (m)

Poptún 16°19'N 89°25'O 30 20 25 80 150 El Estor 15°30’N 90°15’O 35 21 27 85 100 Ixcán 20°4'N 96°55'O 30 18 25 80 200 Tiquisate 36°16'N 74°41'E 32 20 27 75 69

Fuente: INSIVUMEH

Figura 1: Áreas geográficas de procedencia de las muestras.

Fuente: MERTUG-CDC

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I.4.2 Definición de variables

En este estudio se consideraron como variables dependientes los diferentes genotipos que se identifiquen para los genes que codifican para la proteína CS; proteína MSP-1, regiones 2/3 y 5; proteína MSP-3 alfa y beta; y antígeno AMA-1 de Plasmodium vivax. Esta variable es de tipo categórico y asumió varias categorías, dependiendo del número de genotipos identificados para cada gen. En el caso del gen de la proteína CS, las categorías fueron de la A a la G, para el gen MSP1D2/3 de la A a la E y para el gen MSP1D5, de la A a la I. El resto de variables se consideraron como independientes y asumieron los valores o categorías correspondientes a su naturaleza, por ejemplo, sexo (femenino o masculino), edad (numérica), índice de inoculación entomológico (numérica), etc.

I.4.3 Tipo y diseño general del estudio

Este estudio es de tipo descriptivo; en él se identificaron los distintos genotipos, para las proteínas CS y MSP1 (regiones 2/3 y 5), presentes en los parásitos responsables de la malaria por P. vivax en las áreas geográficas que abarcó el estudio.

I.4.4 Estrategia Metodológica

I.4.4.1 Población y Muestra

Con la colaboración del Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social, se recolectaron la totalidad de muestras de gota gruesa de pacientes febriles con diagnóstico microscópico positivo para P. vivax, en las Direcciones de Áreas de Salud (DAS) de Petén Sur-Occidental (municipio de Poptún), Izabal (municipio de El Estor), Ixcán y Escuintla (municipio de Tiquisate). Estas muestras, y los respectivos formularios de orden de examen E-1 (donde se incluyen los datos generales del paciente), se recolectaron entre los meses de agosto de 2004 a mayo de 2005.

Para mantener la confidencialidad de la información del paciente, se le asignó un código a cada muestra, consistente en una letra (correspondiente a la inicial de su departamento de procedencia) y un número correlativo, de forma que la información no tuviera vínculo alguno con la identidad del paciente. El análisis de muestras e información que se propone sigue los lineamientos establecidos por la Declaración de Helsinki y sus enmiendas, y no conlleva ningún riesgo para la integridad física y mental de los participantes, como tampoco para el medio ambiente.

De las muestras obtenidas, se escogieron para su análisis únicamente las

muestras que cumplieron con los siguientes criterios de selección:

1. Contar con boleta de datos generales, completa.

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2. Diagnóstico microscópico positivo para malaria por Plasmodium vivax; no se analizaron las muestras con infecciones asociadas (P. vivax – P. falciparum), ni con infecciones por P. falciparum.

3. Cantidad de muestra adecuada, o sea, que pudieran contarse 1,000 o más leucocitos por gota gruesa.

4. Tinción adecuada de la gota gruesa, ya que el exceso de colorante puede inhibir la reacción de PCR.

5. Parasitemia mayor a 25 formas asexuadas por cada 1,000 leucocitos. I.4.5 Método

I.4.5.1 Extracción de ADN. Se extrajo el ADN del parásito de la lámina de gota gruesa, siguiendo el protocolo descrito por Edoh et al., 1997 con algunas modificaciones (Anexo 1).

I.4.5.2 Confirmación molecular de la especie de parásito. Se amplificó el gen que codifica para la región 18S del ARN ribosomal de Plasmodium, utilizando un PCR anidado (Anexo 2). En el primer PCR se amplificó la región género específica, mientras que en el segundo PCR se amplificó la región especie-específica para P. vivax y P. falciparum. Para el resto del análisis, únicamente se tomaron en cuenta las muestras positivas para P. vivax y negativas para P. falciparum.

I.4.5.3 Amplificación. Se amplificaron los genes CS; MSP-1 regiones 2/3 y 5; MSP-3 alfa y beta y AMA-1 a través de dos PCR anidados, utilizando iniciadores de secuencias diseñadas por el Dr. John Barnwell del Centro para Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (CDC, Atlanta) (Anexo 3).

I.4.5.4 Secuenciación. Se purificaron los productos de PCR utilizando filtros Montage PCR (Millipore EW-29951-20, EEUU), según el protocolo sugerido por el fabricante. La secuenciación automática de los productos con amplificación positiva para los genes analizados se realizó tanto en la hebra sentido (“forward”), como en la hebra contra-sentido (“reverse”), obteniéndose entonces dos secuencias por cada producto de PCR.

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I.4.6 Análisis

I.4.6.1 Análisis de Secuencias a. Obtención de secuencias consenso. Las secuencias obtenidas se editaron y

asignaron manualmente las bases ambiguas o faltantes, se alinearon las hebras sentido y contrasentido de cada producto de PCR, para obtener la secuencia consenso entre ambas, y se identificó el marco de lectura correcto.

b. Alineación de secuencias. Las secuencias consenso de las muestras que

amplificaron fueron alineadas, obteniéndose una alineación para cada uno de los genes analizados.

c. Traducción de la secuencia de nucleótidos a proteínas. Se tradujo las

secuencias de nucleótidos a secuencia de aminoácidos. d. Identificación de variantes y clasificación de muestras. Se analizaron las

secuencias de aminoácidos generadas y se clasificaron las variantes identificadas en sub-tipos. Las muestras amplificadas para cada gen fueron asignadas a cada uno de los sub-tipos identificados.

e. Determinación de similitudes con tipos reportados en bases de datos

internacionales. La secuencia nucleotídica y aminoácida de cada uno de los sub-tipos identificados se comparó contra bases de datos internacionales para determinar su similitud contra secuencias de referencia, reportadas a nivel mundial.

I.4.6.2 Elaboración de Árboles Filogenéticos

Utilizando los sub-tipos identificados, se calculó un árbol filogenético para

cada uno de los genes estudiados, utilizando el método de inferencia de Neighbor-Joining, con el modelo de sustitución nucleótida de Tamura-Nei y una evaluación por bootstrap de 5,000 réplicas.

I.4.6.3 Genética de Poblaciones

Se calcularon los parámetros siguientes: a. Número de alelos. b. Frecuencia de genotipos. c. Diversidad genética entre poblaciones estudiadas. d. Diversidad genética dentro de las poblaciones estudiadas. e. Desequilibrio de ligamiento entre locus.

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I.4.6.4 Análisis Estadístico

Se evaluó el grado de asociación entre los genotipos identificados y las características generales de los pacientes (género y edad), grado de infección que presentaban (densidad parasitaria), época del año en que se adquirió la infección y área geográfica de procedencia de la misma, a través de la prueba de Fisher, con un nivel de confianza del 95%.

I.4.7 Instrumentos de Análisis.

Para cada uno de los análisis realizados, se utilizaron los instrumentos

siguientes:

I.4.7.1 Análisis de Secuencias SeqMan II, versión 5.3 (DNASTAR, EEUU) EditSeq, versión 5.3 (DNASTAR, EEUU) MEGA, versión 3.0 (Kumar, Tamura, Nei, 2004). MEGABLAST, Nacional Center for Biotecnology Information

I.4.7.2 Elaboración de Árboles Filogenéticos MEGA, versión 3.0 (Kumar, Tamura, Nei, 2004).

I.4.7.3 Genética de Poblaciones PopGene versión 1.31 (Alberta, Canadá) GenePop web version 3.4 Genotypic disequilibrium (Raymond & Rousset, 1995)

I.4.7.4 Análisis Estadístico SAS versión 8.01 (EEUU)

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Parte II II. Marco Teórico

II.1 Aspectos Generales de la Malaria

La malaria es una enfermedad parasitaria ocasionada por parásitos unicelulares del género Plasmodium, dentro del cual se han identificado alrededor de 100 especies. De todas las especies que causan malaria, solo cuatro infectan al ser humano, cada una produciendo una enfermedad que se caracteriza por un determinado patrón de síntomas. Las especies de Plasmodium que infectan al ser humano son (NIH, 2000): • Plasmodium falciparum, que es una de las principales causas de muerte en África. La severidad de la infección por esta especie obedece a que se desarrolla repentinamente y es muy proclive a presentar complicaciones. • Plasmodium vivax, es la especie más ampliamente distribuída a nivel mundial; se encontra en regiones sub-trópicales y ampliamente distribuida en Asia. En áreas endémicas es posible identificar personas infectadas que no presentan síntomas, pero que sí contribuyen activamente a la transmisión de la infección. La malaria causada por esta especie puede provocar recaídas por hasta tres años, mientras que la morbilidad de la enfermedad crónica es alta. • Plasmodium malarie. Los síntomas que se presentan en infecciones por esta especie son inusuales y el parásito se caracteriza por su capacidad de permanecer en la sangre por períodos muy largos de tiempo, muchas veces sin llegar a producir síntomas. Al igual que en los casos asintomáticos de P. vivax puede continuar la transmisión. Actualmente se considera que P. malarie ha sido erradicado de los climas templados pero persiste en África. • Plasmodium ovale es rara y la mayoría de los casos ocurren en la región de África occidental. Las infecciones por esta especie también presentan recaídas. El ciclo de vida de los parásitos del género Plasmodium requiere de un hospedero humano (portador) y de un hospedero insecto (vector). Los vectores de la malaria son los mosquitos del género Anopheles, dentro de los cuales el parásito se reproduce de forma sexual. En el humano, el parásito se reproduce asexualmente, inicialmente en los hepatocitos y posteriormente en los glóbulos rojos. La infección en el humano inicia con la picadura de un mosquito hembra infectado. El mosquito ingiere sangre para alimentar a sus huevos, pero simultáneamente, introduce saliva a la herida. Junto con esta saliva, son introducidos también parásitos en su forma infecciosa, conocidos como esporozoitos. Los esporozoitos se alojan en los hepatocitos para evadir la respuesta inmune del hospedero. Dentro del hígado, los parásitos pueden seguir dos rutas (1) Desarrollarse a esquizontes, durante un intervalo de tiempo que varía dependiendo de la especie, los cuales contienen miles de parásitos en un estadío conocido como de merozoito. Cuando el esquizonte alcanza su madurez, se rompe y libera los merozoitos directamente a la sangre. (2) Transformarse en hipnozoitos (solo P. vivax y P. ovale), una forma latente del parásito que puede permanecer en el hígado por meses o años, hasta su reactivación, responsable de las recaídas en personas infectadas (NIH, 2000).

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Los merozoitos liberados a la sangre invaden los glóbulos rojos y continúan su reproducción asexual, formando nuevos esquizontes, los cuales al madurar liberan más merozoitos. De esta forma, la infección continúa su ciclo. Algunos de los merozoitos no se desarrollan asexualmente en esquizontes sino que cambian a formas sexuales llamadas gametocitos, las cuales circulan también en la sangre. Cuando la hembra de Anopheles pica a una persona infectada ingiere, junto con la sangre, los gametocitos, los cuales se desarrollan a gametos masculinos o femeninos. La fertilización de los gametos da origen a un ooquiste, que contiene a los esporozoitos. Al alcanzar su madurez, el ooquiste se rompe y libera los esporozoitos, los cuales migran a las glándulas salivares del mosquito, de forma que cuando este se alimenta de nuevo, los esporozoitos pasan de nuevo al hospedero para iniciar el ciclo nuevamente (NIH, 2000). II.2 Diversidad genética de los parásitos de malaria

El método tradicional de diagnóstico de la malaria a través del examen

microscópico proporciona muy poca información adicional acerca de las variaciones entre parásitos de la misma especie. Por esto y por la creciente necesidad de obtener datos epidemiológicos de la enfermedad, se recurrió al desarrollo de otras técnicas que iniciaron con el análisis de isoenzimas y el uso de anticuerpos monoclonales orientados a antígenos de superficie del parásito. Los resultados de estas investigaciones probaron que muchas de las infecciones de malaria son causadas por parásitos pertenecientes a más de un tipo genético. Sin embargo, la dificultad de cultivar y mantener en cultivo los parásitos de Plasmodium vivax fueron un obstáculo para el desarrollo de estas técnicas. Con los adelantos de la biología molecular y, en particular, de la técnica de PCR, se permitió que el estudio de estas variantes genéticas fuera posible a mayor escala y con menor inversión de tiempo (Greenwood, 2002). Los métodos más comúnmente utilizados para estos estudios moleculares incluyen el diseño de iniciadores específicos a determinados alelos, los cuales pueden ser luego identificados por polimorfismos de tamaño de los productos de PCR, polimorfismo de tamaño de regiones repetitivas, PCR y polimorfismo de tamaño de fragmentos de restricción y, en menor escala, hibridación de productos de PCR con sondas específicas a determinados alelos (Cui et al., 2003).

Los estudios moleculares que se han realizado en relación a la genética de los

parásitos de la malaria se han enfocado en dos aspectos principales: la estructura de la genética de poblaciones de los parásitos y su dinámica dentro del hospedero; y la diversidad de genes específicos que codifican para proteínas inmunogénicas (antígenos para vacunas) y genes que codifican para proteínas asociadas con resistencia a medicamentos antimaláricos (Cui et al., 2003; Rich et al., 1998). Estos estudios permiten conocer los genotipos presentes en una región determinada, lo cual es importante ya que determina características importantes de los parásitos como su origen, antigenicidad, respuesta a medicamentos, surgimiento de cepas resistentes a una o varias drogas, respuesta a posibles vacunas y el impacto de medidas de control como los mosquiteros impregnados (Cui et al., 2003). Conocer la estructura poblacional de una especie en particular, permite también explicar la posible tasa de

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dispersión de nuevos genotipos y la forma como estos evolucionan y se ven afectados por la selección (Rich et al., 1998).

II.3 Diversidad genética de P. vivax

La diversidad genética de P. vivax ha sido descrita a través del análisis de varios

genes, en particular los que codifican para antígenos que están bajo selección por presión causada por el sistema inmune del hospedero, como los genes que codifican para las proteínas de superficie del merozoito (MSP), en particular para la MSP1 y MSP3α, antígenos de la membrana apical (AMA1), proteína del circumsporozoito (CSP), proteínas “Duffy binding”, genes que codifican para la sub-unidad 18S del ARN ribosomal y DHFR (dihidrofolato reductasa) (Cui et al., 2003).

El gen que codifica para la proteína del circumsporozoito (CS) de P. vivax ha sido estudiado ampliamente; es un gen de una sola copia que posee un dominio central de secuencias repetidas en serie, rodeado por secuencias conservadas, no repetitivas. Entre las diferentes especies de Plasmodium, las secuencias repetitivas de la región central son variables en tamaño y en naturaleza de la secuencia. Se han identificado dos variantes la VK247 y VK210 (Gordon et al., 1990 & Rosemberg, 1989). Estas variantes se han detectado en varios países de América como infecciones ocasionadas por una sola variante o como infecciones mixtas. Se ha sugerido que la presencia de infecciones mixtas depende del grado de prevalencia de malaria en la región, siendo menor en regiones de baja prevalencia. También se ha encontrado asociación entre la variante del parásito responsable de la infección, el ecosistema y la especie del vector encontrado en esa región determinada (Kain et al., 1992).

También se han realizado estudios sobre la diversidad genética de P. vivax a través de los genes que codifican para las proteínas de superficie del merozoito (MSP), de las cuales ya se han clonado siete genes. Entre estos ya ha sido descrito el gen para la MSP-1 el cual comparte muchas similitudes con los genes que codifican para esta proteína en parásitos de especies como P. falciparum y P. yoelli. El gen para la MSP-1 consta de diez bloques de secuencias conservadas (ICB por sus siglas en inglés “interspecies conserved block”) en relación con otras especies, las cuales están alternadas por regiones variables (Del Portillo, 1991). Estas regiones variables han sido el blanco de las investigaciones sobre diversidad genética, ya que el gen completo es demasiado largo para su estudio. El bloque variable entre las regiones ICB5 e ICB6 ha sido de mucha utilidad en estudios de polimorfismo ya que posee repeticiones de CAA/CAG de largo variable, lo que permite distinguir fácilmente entre genotipos (Figtree et al, 2000). También se han observado diferentes grados de polimorfismo entre otras regiones (ICB2 e ICB4, ICB4 e ICB5, ICB8 e ICB10) (Cheng et al., 1993; Gutiérrez et al., 2000).

Dentro de las proteínas de superficie del merozoito, también se ha descrito plenamente la llamada familia de la MSP-3 inter-especie, de las cuales se identificó inicialmente la MSP-3α, la cual se cree que está asociada con la superficie del merozoito a pesar de no contar con un mecanismo de anclaje a la membrana (Galinski et al., 1999). Posteriormente fueron identificados otros dos genes con similitudes estructurales y de secuencia a la PvMSP-3α, denominados como PvMSP-3 ß y Γ (Galinski et al., 2001). A través del análisis con RFLP se han identificado varios

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alelos para la MSP-3α en comunidades endémicas restringidas, lo que pone de manifiesto su potencial utilidad como marcador epidemiológico para infecciones con P. vivax. Adicionalmente, se ha comprobado que es útil para el diagnóstico de infecciones múltiples (Bruce et al., 1999).

Por su potencial como candidato para vacuna de malaria, el gen que codifica para el antígeno 1 de la membrana apical del merozoito (AMA-1) ha sido clonado y secuenciado en varias de las especies de Plasmodium. En Plasmodium vivax la secuencia completa para el gen de la AMA-1 fue descrito por primera vez por Cheng y Saul, 1994, quienes reportaron también variaciones en la secuencia de una región polimórfica del gen en aislados de pacientes provenientes de varias regiones geográficas. La mayoría de variaciones encontradas fueron sustituciones no sinónimas, o sea, que dan como resultado un cambio en el tipo de aminoácido, lo que provee un gran número de alelos potenciales y hace a este gen útil como marcador para el estudio de poblaciones de P. vivax. Dado que muchos de los alelos son producto de sustituciones puntuales, no se han identificado polimorfismos en cuanto a tamaño. Sin embargo, el análisis de las secuencias ha mostrado la presencia al menos de dos genotipos diferentes en países de Asia (Han et al., 2002).

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Parte III III.1 Resultados y Discusión

III.1.1 Recolección y Selección de Muestras

Las muestras que se recolectaron durante los años 2004 y 2005 en las Direcciones de Área de Salud involucradas en el estudio y que cumplieron con los criterios de selección, fueron las siguientes:

Cuadro 2. Número de muestras y período de colecta.

Dirección de Área de

Salud Período colecta Muestras

seleccionadas Petén Sur-occidental Agosto 2004 – Mayo 2005 33

Ixcán Junio 2004 – Mayo 2005 31 Izabal Enero – Mayo 2005 28

Escuintla Octubre 2004 – Mayo 2005 31 Total 123

Fuente: Proyecto FODECYT FD-22-03 III.1.2 Confirmación de Especie.

Del total de muestras seleccionadas, se confirmaron como P. vivax (a través

del PCR del gen para la 18S) 96 de las 123 (29 de Poptún, 19 de Ixcán, 20 de El Estor y 28 de Tiquisate).

III.1.3 Amplificación de genes marcadores.

Previo a la amplificación de los genes marcadores en las muestras del estudio,

se realizó una prueba preliminar, evaluando la amplificación de dichos genes, utilizando 58 muestras de Ixcán, Quiché, colectadas previamente en papel filtro IsoCode (Schleicher & Schuell, EEUU), especial para extracción de ADN. Los resultados mostraron un bajo porcentaje en la amplificación de los genes MSP3α, MSP3β y AMA-1 (Cuadro 3), por lo que se decidió no evaluarlos en las muestras del estudio. El bajo porcentaje de amplificación estos genes pudo deberse a que los iniciadores que se utilizaron para la reacción de PCR fueron diseñados en base a secuencias obtenidas de material genético proveniente de otras regiones maláricas del mundo, principalmente Asia. Dado que estos genes han sido reportados como polimórficos para P. vivax, es muy posible que las variaciones en la secuencia de nucleótidos entre las cepas de Guatemala y las cepas para las que fueron diseñadas se ubiquen en la región donde se espera que alineen los iniciadores. Si este fuera el caso, al no ocurrir la alineación de los iniciadores, la enzima polimerasa no puede extender la hebra y no ocurre la amplificación del

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gen. También es posible que las muestras no contaran con suficiente ADN del parásito, dada la baja parasitemia de las muestras, muy común en regiones de baja transmisión, como lo es Guatemala.

Cuadro 3: Porcentaje de muestras con amplificación positiva realizada en 58 muestras del municipio de Ixcán, departamento de Quiché, con los seis genes marcadores. Los genes sombreados no se utilizaron para el estudio por su bajo porcentaje de amplificación.

Marcador Molecular Porcentaje de muestras con amplificación

positiva CS 88

MSP1, región 2/3 79 MSP1, región 5 90

MSP3 α 64 MSP3β 17 AMA-1 45

Fuente: Proyecto FODECYT FD-22-03

III.1.4 Secuenciación.

En el cuadro 4 se muestra el porcentaje de muestras con amplificación

positiva para cada uno de los genes marcadores, así como el porcentaje de muestras para las que se obtuvo una secuencia satisfactoria.

Cuadro 4: Porcentaje de muestras con amplificación y secuencia positiva para cada uno de los genes analizados, correspondientes a las cuatro áreas geográficas evaluadas.

Muestras con amplificación positiva (%)

Muestras con secuencia positiva (%)

Área geográfica

CS MSP1,2/3 MSP1,5 CS MSP1,2/3 MSP1,5 Petén 38 59 52 72 65 80 Quiché 11 0 5 50 0 100 Izabal 60 35 75 100 100 100 Escuintla 75 46 64 100 92 100

Total 48 39 51 91 81 94 Fuente: Proyecto FODECYT FD-22-03

III.1.5 Análisis de Secuencias.

Las secuencias obtenidas para cada uno de los genes evaluados (Anexo 4), se

analizaron y se eliminaron las muestras para las cuales se obtuvo fragmentos incompletos en la región amplificada. En el caso del gen CS, fueron eliminadas 25 muestras (Anexo 5), para las cuales se obtuvo secuencias incompletas para las

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hebras sentido, contra-sentido o ambas, lo cual no permitió obtener la secuencia de consenso. En el caso del gen MSP1 región 2/3 se eliminó una muestra y para el gen MSP1 región 5, se eliminaron 6 muestras por esta misma causa. La secuencia del resto de las muestras se editó, eliminando los extremos 5’ y 3’ de cada una, con la finalidad que todas las secuencias iniciaran y finalizaran en la misma región conservada. En los casos donde se identificaron residuos ambiguos (R, Y, K o M)1 o faltantes, se analizaron directamente los electroferogramas para asignar la base correcta de forma manual.

Ya editadas las secuencias, se identificó el marco de lectura correcto dentro de los seis posibles. En base a esta información, fue necesario obtener la secuencia complementaria reversa de todas las muestras, para luego realizar la traducción a secuencia de aminoácidos.

Se realizó un alineamiento preliminar de todas las secuencias para cada gen, utilizando el protocolo de Clustal (MEGA3). Se terminaron de alinear las secuencias manualmente, utilizando como referencia el extremo conservado carboxilo terminal de las moléculas. De esta forma, se clasificaron las muestras de acuerdo a su similitud, estableciéndose los sub-tipos para cada gen. Finalmente, la secuencia nucleotídica y aminoácida de cada uno de los sub-tipos identificados se comparó contra bases de datos internacionales para determinar su similitud con secuencias ya reportadas a nivel mundial. Esta comparación se realizó de las tres formas siguientes:

1. Secuencia nucleotídica contra base de datos de secuencias nucleotídicas. 2. Secuencia nucleotídica traducida a proteína contra base de datos de

secuencias proteínicas. 3. Secuencia nucleotídica traducida contra base de datos de secuencias

nucleotídicas traducidas. Con los tres procedimientos anteriores se obtuvo como resultado similitud

hacia las mismas secuencias, las cuales se incluyeron como referencia para la elaboración de los árboles filogenéticos.

Gen CS

Se determinó que las secuencias de las 17 muestras obtenidas de los tres

municipios muestreados (El Estor, Poptún y Tiquisate) pertenecen al tipo VK210. Se identificaron 7 sub-tipos que muestran variaciones en cuanto al número y tipo de residuo peptídico repetitivo entre GDRAAGQPA y GDRADGQPA, los cuales se originan por la presencia de codones no sinónimos en las secuencias, los cuales dan origen a un residuo de alanina (A – GCT-) o de ácido aspártico (D – GAT-). A pesar de pertenecer al tipo VK210, los 7 sub-tipos identificados tienen secuencias similares a las reportadas para el gen CSP del tipo Honduras III, Salvador I, Belem, y recombinantes entre las anteriores (Figura 2). De los 7 subtipos, únicamente uno de ellos (G) presenta una mutación no sinónima en el extremo 3’, GDRAAGQAA. El sub-tipo más frecuente para el gen CS fue el E (Cuadro 7).

1 R = Purina (A o G); Y = pirimidina (C o T); K = grupo ceto (G o T) y M = grupo amino (A o C)

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Figura 2: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de siete sub-tipos del gen para la CSP identificados a partir de 17 muestras provenientes de tres áreas endémicas para malaria en Guatemala (Izabal, Petén y Escuintla). Los puntos indican los residuos aminoácidos iguales, en referencia a la secuencia superior (VK210). Se incluyen las secuencias reportadas para los tipos VK210, Honduras III, Salvador I y Belem (Acc. No. M28746.1, DQ156131.1, DQ156134.1 y M11926.1, respectivamente).


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Gen MSP1, región 2/3

Para las muestras amplificadas para el gen MSP1, región 2/3 (31), se identificaron 5 sub-tipos correspondientes a aislados reportados previamente (Figura 3). La mayoría de las muestras (10), identificadas como sub-tipo D, pertenecían al tipo del aislado de Brasil, BR44. Las 4 muestras del sub-tipo C pertenecen al tipo del aislado Belem. Los restantes sub-tipos parecen ser producto de la recombinación entre aislados; el sub-tipo A producto de la recombinación entre los aislados TC103 y TG46, aunque presenta mutaciones no sinónimas que dan origen a un cambio en la secuencia de cuatro aminoácidos en el extremo 3’ de la región amplificada. Estas mutaciones no se observaron en ninguno de los otros sub-tipos identificados. El sub-tipo B se cree que es producto de la recombinación entre los tipos TG46 y Belem, mientras que el sub-tipo E entre los aislados BP30 y TC103. El sub-tipo más frecuente para el gen MSP1, región 2/3 fue el sub-tipo D (Cuadro 7).

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Figura 3: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de cinco sub-tipos del gen para la MSP1, región 2/3 identificados a partir de 31 muestras provenientes de tres áreas endémicas para malaria en Guatemala (Izabal, Petén y Escuintla). Los puntos indican los residuos aminoácidos iguales, en referencia a la secuencia superior (TC103). Se incluyen las secuencias reportadas para los aislados TC103, TG46, Belen, BR44 y BP30 (Acc. No. AF435603.1, AF435611.1, AF435594.1, AF435631.1 y AF435625.1, respectivamente).


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Gen MSP1, región 5

Se determinó que las secuencias obtenidas de las 40 muestras analizadas

en las tres áreas geográficas estudiadas (Izabal, Petén y Escuintla) pertenecen a los tipos Salvador I y Belem, con algunas variantes, producto de mutaciones no sinónimas o recombinación entre estos tipos. La mayoría de las muestras (15), identificadas como sub-tipo E, pertenecen al tipo Salvador I, con tres mutaciones no sinónimas, que dan como producto aminoácidos diferentes en los residuos 53, donde la valina (V) cambia por un residuo de alanina (A), 104, donde cambia una isoleucina (I) por una treonina (T), y 48, donde cambia una prolina (P) por una glutamina (Q). También presenta una inserción que origina un residuo de Q en la posición 47. El sub-tipo C, representado por una muestra proveniente del departamento de Escuintla, muestra una mutación no sinónima que origina un cambio en el la posición 15 donde el residuo de alanina (A) es reemplazado por uno de valina (V). Además, también presenta una inserción que origina un residuo adicional de prolina (P) en la posición 47. Esta inserción también se observa en las muestras pertenecientes al sub-tipo B (n=9). En cuanto al sub-tipo A presenta una única mutación no sinónima, en relación al tipo Salvador I, en el residuo 24, donde el residuo de serina (S) es reemplazado por uno de alanina (A).

En cuanto a las muestras del tipo Belem, la identificada como sub-tipo F,

proveniente del departamento de Petén, presenta una deleción del residuo 73 de glutamina. El sub-tipo G muestra una inserción de tres codones repetitivos que originan tres residuos adicionales de glutamina en las posiciones 80, 81 y 82. El sub-tipo H (4 muestras) parece ser producto de la recombinación de los aislados Salvador I y Belem, ya que en el extremo 5’ presenta una secuencia similar al tipo Salvador I, mientras que el extremo 3’ y la región de poli-Q es similar al aislado Belem. Además, presenta una mutación no sinónima que origina un cambio en el residuo aminoácido 87, donde una valina (V) cambia por una leucina (L). El mismo tipo de recombinación se observa en las muestras del tipo I (n=4), en el que además se observa una deleción de tres codones respecto al tipo Belem, lo que ocasiona la ausencia de tres residuos de glutamina (Q) en las posiciones 77, 78 y 79. En el cuadro 5 se muestra un resumen de número de residuos repetitivos de glutamina para cada uno de los sub-tipos identificados.

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Cuadro 5: Número de residuos de glutamina identificados en cada uno de los sub-tipos correspondientes al aislado Belem y recombinantes, para el gen MSP1, región 5.

Tipo o sub-tipo

(n) Número de residuos de

glutamina (Q) Belem 23

Sub-tipo F (1) 22 Sub-tipo G (3) 26 Sub-tipo H (4) 21 Sub-tipo I (4) 18


El sub-tipo más frecuente para el gen MSP1, región 5 fue el sub-tipo E (Cuadro 7).

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Figura 4: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de 9 sub-tipos del gen para la MSP1, región 5 identificados a partir de 40 muestras provenientes de tres áreas endémicas para malaria en Guatemala (Izabal, Petén y Escuintla). Los puntos indican los residuos aminoácidos iguales, en referencia a la secuencia superior (Salvador I). Se incluyen las secuencias reportadas para los aislados Salvador I y Belen (Acc. No.M75674.1 y AF435594.1, respectivamente).


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III.1.6 Elaboración de Árboles Filogenéticos

Gen CS

Con las secuencias obtenidas de las muestras (603 nucleótidos cada una), se calculó un árbol de distancia genética entre los sub-tipos identificados (Figura 5). Se incluyen como referencia las secuencias reportadas para los tipos VK210, Honduras III, Salvador I y Belem (Acc. No. M28746.1, DQ156131.1, DQ156134.1 y M11926.1, respectivamente). Se utilizó el método de inferencia de Neighbor-Joining, con el modelo de sustitución: nucleotídica de Tamura-Nei y un análisis de bootstrap de 5,000 réplicas.

Figura 5: Árbol de distancia para el gen CSP y secuencias reportadas para los tipos VK210, Honduras III, Salvador I y Belem. Las muestras pertenecientes a cada sub-tipo se muestran en gris y los códigos corresponden a P=Poptún, T=Tiquisate y E=El Estor.


Gen MSP1, región 2/3

Con las secuencias obtenidas de las muestras (567 nucleótidos cada una), se calculó un árbol de distancia genética entre los sub-tipos identificados (Figura 6). Se incluyen como referencia las secuencias reportadas para los aislados TC103, TG46, Belen, BR44 y BP30 (Acc. No. AF435603.1, AF435611.1, AF435594.1, AF435631.1 y AF435625.1, respectivamente). Se utilizó el método de inferencia de Neighbor-Joining, con el modelo de sustitución: nucleotídica de Tamura-Nei y un análisis de bootstrap de 5,000 réplicas.

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Figura 6: Árbol de distancia para el gen MSP1D2/3 y secuencias reportadas para los aislados TC103, TG46, Belen, BR44 y BP30. Las muestras pertenecientes a cada sub-tipo se muestran en gris y los códigos corresponden a P=Poptún, T=Tiquisate y E=El Estor.


Gen MSP1, región 5

Con las secuencias obtenidas de las muestras (429 nucleótidos cada

una), se calculó un árbol de distancia genética entre los sub-tipos identificados (Figura 7). Se incluyen como referencia las secuencias reportadas para los aislados Salvador I y Belen (Acc. No.M75674.1 y AF435594.1, respectivamente). Se utilizó el método de inferencia de Neighbor-Joining, con el modelo de sustitución: nucleotídica de Tamura-Nei y un análisis de bootstrap de 5,000 réplicas.

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Figura 7: Árbol de distancia para el gen MSP1D5, y secuencias reportadas para los aislados Salvador I y Belen (Acc. No.M75674.1 y AF435594.1, respectivamente). Las muestras pertenecientes a cada sub-tipo se muestran en gris y los códigos corresponden a P=Poptún, T=Tiquisate y E=El Estor.


III.1.7 Genética de Poblaciones

III.1.7.1 Número de alelos. El número de alelos diferentes encontrados para cada uno de los genes analizados, en todas las muestras analizadas, se detalla en el cuadro siguiente:

Cuadro 6. El número de alelos diferentes encontrados para cada uno de los genes analizados

Gen Número de alelos CS 7

MSP1, región 2/3 5 MSP1, región 5 9


III.1.7.2 Frecuencia de genotipos.

Es la frecuencia con que se presenta un sub-tipo en relación a los otros sub-tipos del mismo gen en una población. En el cuadro 7 se muestran las frecuencias para cada uno de los sub-tipos identificados. La mayor frecuencia de alelos se reporta para el sub-tipo E del gen CS, mientras que para los genes de la MSP1 se reportan valores similares en la frecuencia de los subtipos más abundantes D y E para las regiones 2/3 y 5. Era de esperarse que los valores para el alelo más frecuentes fueran de estas últimas regiones fueran similaries, ya que ambas se encuentran localizadas en el mismo gen.

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Cuadro 7. Frecuencia de cada sub-tipo en las muestras analizadas. En color gris se indica el sub-tipo con mayor frecuencia para cada gen marcador.

Frecuencia Sub-tipo

CS MSP1D2/3 MSP1D5 A 0.0588 0.1290 0.0250 B 0.1765 0.1290 0.2250 C 0.0588 0.1290 0.0250 D 0.0588 0.3226 0.0500 E 0.5294 0.2903 0.3750 F 0.0588 0.0250 G 0.0588 0.0750 H 0.1000 I 0.1000


III.1.7.3 Diversidad genética entre y dentro de las poblaciones. La diversidad genética fue analizada por el método de Nei. La diversidad

genética de la población total (Ht) está formada por la diversidad genética dentro (Hs) y entre cada sub-población (Dst). El índice Gst (Dst/Ht) mide la magnitud relativa de la diferenciación genética entre las variedades o sub-tipos. En el cuadro 8 se pueden observar estos valores para uno de los genes analizados.

Cuadro 8. Diversidad genética por sub-tipo, para las poblaciones estudiadas.

Gen Ht Hs Dst Gst CS 0.7224 0.5337 0.1887 0.2611

MSP1D2/3 0.7614 0.6925 0.0689 0.0905 MSP1D5 0.7743 0.7037 0.0706 0.0912 Promedio 0.7527 0.6433 0.1094 0.1453


El gen MSP1D5 mostró la máxima diversidad genética en la población total (0.7743), seguido del gen MSP1D2/3 y del gen CS. Los valores de Gst fueron todos menores de 0.0500, lo cual indica que la diversidad genética en un gen se encuentra principalmente dentro de las poblaciones. El valor promedio para el Gst fue de 0.1453, lo que sugiere que el 85.47% de la diversidad genética está contenida dentro de las poblaciones mismas, mientras que el 14.53% se encuentra entre las poblaciones.

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III.1.7.4 Flujo genético entre sub-poblaciones.

El análisis de flujo genético se realizó utilizando 32 de las muestras analizadas. Se seleccionaron las muestras que amplificaron por lo menos en dos de los genes evaluados. De estas muestras, 9 procedían de Izabal, 10 de Petén y 13 de Escuintla. Siete muestras amplificaron para los tres genes evaluados y 25 muestras para cualquier combinación de amplificación entre dos genes.

Se determinó (Anexo 6) que el número de migrantes efectivos (Nm) fue de 0.89, lo que sugiere que las tres poblaciones analizadas están evolucionando de forma independiente una de la otra. Sin embargo, para poder obtener resultados más precisos, es necesario aumentar el número de muestras de cada población y el número de genes a analizar, tal como lo sugieren estudios recientes (Carling y Brumfield, 2007). El número de muestras que debe incluirse en estudios de genética de poblaciones está determinado por el intervalo de confianza y por la frecuencia de alelos en la población. Utilizando los resultados para la frecuencia de alelos estimada para cada uno de los genes analizados en este estudio, se pueden realizar cálculos más precisos del número adecuado de muestras a analizar para futuros estudios de genética de poblaciones en P. vivax.

III.1.7.5 Tipo de asociación entre alelos presentes en loci diferentes. El análisis de desequilibrio de ligamiento se realizó utilizando 32 de las muestras analizadas. Se seleccionaron las muestras que amplificaron por lo menos en dos de los genes evaluados. De estas muestras, 9 procedían de Izabal, 10 de Petén y 13 de Escuintla. Siete muestras amplificaron para los tres genes evaluados y 25 muestras para cualquiera combinaciones de amplificación entre dos genes. El análisis se realizó de dos formas: (1) separando las muestras en tres poblaciones, de acuerdo al sitio de procedencia, y (2) analizando las muestras como una sola población. Los resultados (Anexo 7) muestran que con ambos tipos de análisis se encontró una asociación estadísticamente significativa entre los loci MSP1, región 2-3 y MSP1, región 5, lo cual era predecible, ya que se sabe que ambos están localizados en el mismo gen, a una distancia genética pequeña. No se encontró ninguna asociación entre los alelos del gen MSP-1 y los del CSP, lo que sugiere que no hay asociación entre ambos genes. Sin embargo, para poder concluir sobre este tipo de asociación, es necesario analizar mayor cantidad de muestras.

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III.1.8 Análisis Estadístico

No se encontró ninguna asociación estadísticamente significativa entre los sub-tipos de los tres genes analizados y la edad o sexo del paciente, así como tampoco entre el grado de parasitemia (formas asexuadas o formas sexuadas). Tampoco entre los sub-tipos de los genes y la época del año en que fue reportada la infección (P>0.05) (Anexo 8). Sin embargo, al analizar el lugar de procedencia de las muestras y las variantes de los genes, sí se determinó que existe asociación significativa con las variantes del gen MSP1 ICB5-6.

36

Parte IV

IV.1 Conclusiones

Se estandarizó la amplificación por PCR de los genes que codifican para la proteína CS y de la proteína MSP-1, regiones 2/3 y 5; de Plasmodium vivax a partir de muestras de sangre en papel filtro y de láminas de gota gruesa teñidas con colorante de Giemsa.

Se identificaron siete sub-tipos para el gen de la proteína CSP; cinco para la

proteína MSP1, región 2/3 y nueve para la región 5 de la misma proteína.

Se determinó la frecuencia de alelos para todas las variantes identificadas de cada uno de los genes analizados, siendo las mayores para el sub-tipo E del gen CS (0.5294), sub-tipo D del gen MSP1, región 2/3 (0.3226) y sub-tipo E del gen MSP1, región 5 (0.3750).

El cálculo de índice de diversidad mostró que el mayor porcentaje (85.47%) de la

diversidad genética está contenida dentro de las poblaciones analizadas, esto es, dentro de una misma región geográfica, mientras que el 14.53% se encuentra entre poblaciones, o sea, entre una región y otra.

Se estimó que el flujo genético entre poblaciones es de 0.89, lo cual sugiere que

las poblaciones analizadas están evolucionando de forma independiente.

En todas la variantes identificadas se encontró que las diferencias obedecieron principalmente a la presencia de sustituciones no-sinónimas en la secuencia de ADN, sin embargo, la mayor proporción de estas sustituciones, se identificó entre los sub-tipos del gen MSP1, región 5 (6 sustituciones), donde también se identificaron 5 inserciones y 4 deleciones.

Se determinó que existe asociación estadísticamente significativa entre los loci

MSP1, región 2-3 y MSP1, región 5, no así entre estos loci y el gen CSP.

Se elaboraron árboles filogenéticos para cada uno de los genes estudiados, donde se mostró la distancia genética entre las variantes identificadas.

Se estableció que no existe asociación significativa entre los alelos identificados

para cada gen y las características generales de los pacientes (género y edad) así como tampoco con el grado de infección que presentaban (densidad parasitaria). Sin embargo, sí se determinó que existe asociación significativa entre las variantes del gen MSP1 ICB5-6 y el lugar de procedencia de las muestras.

37

IV.2 Recomendaciones

Se recomienda diseñar nuevos iniciadores para la amplificación de los genes que codifican para las proteínas MSP-3 alfa y beta; y antígeno AMA-1 de Plasmodium vivax, en base a cepas del país, ya que no se obtuvo amplificación satisfactoria para estos genes en las muestras evaluadas.

Utilizar las mutaciones identificadas en este estudio (deleciones, inserciones,

sustituciones sinónimas y sustituciones no sinónimas) en las variantes de cada gen estudiado, para diseñar nuevos marcadores moleculares para cepas de P. vivax de Guatemala.

Clonar los productos de amplificación de los genes estudiados, con la finalidad de

establecer si las infecciones primarias con P. vivax son mono o poli-clonales. Utilizar mayor cantidad de muestras (100 o más) de cada área malárica del país,

para evaluar lo siguiente:

o Si se mantiene el número de sub-tipos identificado para cada gen evaluado.

o Si es consistente la frecuencia de alelos determinada para cada variante. o Para determinar el flujo genético entre sub-poblaciones, si hay asociación

entre alelos presentes en loci diferentes y, de encontrarse, a qué tipo corresponde.

o Si al aumentar el número de muestra se logra identificar alguna asociación entre los alelos identificados para cada gen y las características generales de los pacientes (género, edad), grado de infección que presentaban (densidad parasitaria) o datos epidemiológicos de las regiones estudiadas.

Elaborar árboles filogenéticos para cada uno de los genes estudiados, utilizando

metodologías alternas, con otros modelos de sustitución, para determinar si las distancias genéticas son consistentes con las determinadas en este estudio.

38

IV.3 Referencias Bibliográficas 1. Bruce, M.C., M.R. Galinski, J. W. Barnwell, G. Snounou & K.P. Day. 1999.

Polymorphism at the merozoite surface protein-3α locus of Plasmodium vivax: global and local diversity. Am. J. Trop. Med. Hyg. 61(4): 518-525.

2. Carling, M. D. y R. T. Brumfield. 2007. Gene Sampling Strategies for Multi-Locus Population Estimates of Genetic Diversity (θ). PlusOne, Issue 1, e160.

3. Cheng, Q. & A. Saul. 1994. Sequence analysis of the apical membrane antigen I (AMA-1) of Plasmodium vivax. Mol. Biochem. Parasitol. 65:183-187.

4. Cheng Q., A. Stowers, T.Y. Huang, D. Bustos, Y.M. Huang, C. Rzepczyk & A. Saul. 1993. Polymorphism in Plasmodium vivax MSA1 gene--the result of intragenic recombinations? Parasitol 106:335-345.

5. Cui, L., A.A. Escalante, M. Imwong & G. Snounou. 2003. The genetic diversity of Plasmodium vivax populations. TRENDS in Parasitol, 19(5): 220-226.

6. Edoh, D. S. Steiger, B. Genton & H.P. Beck. 1997. PCR amplification of DNA from malaria parasites on fixed and stained thick and thin blood films. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91(3):361-363.

7. Figtree, M. C.J. Pasay, R. Slade, Q. Cheng, N. Cloonan, J. Walker & a. Saul. 2000. Plasmodium vivax synonymous substitution frequencies, evolution and population structure deduced from diversity in AMA 1 and MSP 1 genes. Mol. Biochem. Parasitol. 108: 53-66.

8. Galinski, M.R., C. Corredor-Medina, M. Povoa, J. Crosby, P. Ingravallo & J. W. Barnwell. 1999. Plasmodium vivax merozoite surface protein-3 contains coiled-coil motifs in an alanine-rich central domain. Mol. Biochem. Parasitol. 101: 131-147.

9. Galinski, M.R., P. Ingravallo, C. Corredor-Medina, B. Al-Khedery, M. Povoa & J. W. Barnwell. 2001. Plasmodium vivax merozoite surface protein-3beta and -3gamma share structural similarities with P. vivax merozoite surface protein-3alpha and define a new gene family. Mol. Biochem. Parasitol. 115(1): 41-53.

10. Gordon, D.M., T.M. Cosgriff, I. Schneider, G.F. Wasserman, W.R. Majarian, M.R. Hollingdale & J.D. Chulay. 1990. Safety and immunogeneicity of a Plasmodium vivax sporozoite vaccine. Am. J. Trop. Med. Hyg. 42:527-531.

11. Greenwood, B. 2002. The molecular epidemiology of malaria. Trop. Med. Intl. Health. 7(12): 1012-1021.

12. Gutiérrez A, Vicini J, Patarroyo ME, Murillo LA, Patarroyo MA. 2000. Plasmodium vivax: polymorphism in the merozoite surface protein 1 gene from wild Colombian isolates. Exp Parasitol. 95(3):215-9

13. Han, E.T., J.H. Park, E.H. Shin, M.H. Choi, M.D. Oh & J.Y. Chai. 2002. Apical membrane antigen-1 (AMA-1) gene sequences of re-emerging Plasmodium vivax in South Korea. Korean J. Parasitol 40(3): 157-162.

14. Kain, K.C., R.A. Wirtz, I. Fernandez, E.D. Franke, M.H. Rodriguez & D.E. Lanar. 1992. Serologic and genetic characterization of Plasmodium vivax

39

from whole blood-impregnated filter paper discs. Am. J. Trop. Med. Hyg. 46(4): 473-479.

15. NIH. 2000. National Institutes of Health. U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. NIH Publicación No. 00-4715.

16. Raymond M. & Rousset F. 1995. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. J. Heredity, 86:248-249

17. Rich, S.M., M.C. Licht, R. R. Hudson & F. J. Ayala. 1998. Malaria’s Eve: Evidence of a recent population bottleneck throughout the world populations of Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4425-4430.

18. Rosenberg, R., R.A. Wirtz, D.E. Lanar, J. Sattabongkot, T. Hall, A.P. Waters & C. Prasittisuk. 1989. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science 245: 973-976.

40

IV.4 Anexos

41

IV.4.1 Anexo 1

Extracción de ADN de láminas de gota gruesa teñidas con Giemsa (modificado de Edoh et al., 1997)

1. Se lava tres veces la lámina de gota gruesa con metanol absoluto.

2. Se deja secar toda la noche en una desecadora con agente secante.

3. Se lava la lámina tres veces con solución de Na2HPO4 100 mM.

4. Se raspa el extendido utilizando un escalpelo estéril y el raspado se colecta en un

tubo cónico de 0.5 mL. Se centrifuga ligeramente con una centrífuga personal,

para que todo el extendido quede en el fondo del tubo.

5. Se agregan 200 uL de Na2HPO4 5 mM, se agita el contenido en agitador vortex y

se centrifuga a 12,000 rpm durante 5 minutos.

6. Se descarta el sobrenadante utilizando una micropipeta y se repite el lavado.

7. El sedimento se resuspende en 30 uL de ddH2O.

8. Se hierve en baño de agua por 10 minutos, agitando en el agitador Vortex después

de los primeros 5 minutos. Se centrifuga nuevamente a 12,000 rmp durante 3

minutos.

9. El sobrenadante se toma directamente para el PCR.

PREPARACION DE SOLUCIONES:

1. Fosfato dibásico de sodio, 100 mM Na2HPO4 14.196 g dH2O 800 mL Se disuelve el fosfato de sodio en el agua destilada y se ajusta a la marca de 1 litro. Se esteriliza en autoclave

2. Fosfato dibásico de sodio, 5 mM

Fosfato dibásico de sodio 100 mM 5 mL ddH2O 95 mL

42

IV.4.2 Anexo 2

Confirmación Molecular de Especie de Plasmodium por Amplificación del Gen que Codifica para la Región 18 S del rARN

Primer PCR: región género-específica: Se preparan 20 uL de reacción de PCR para cada muestra y los controles respectivos (control de extracción, control de reactivos, control positivo para P. falciparum y control positivo para P. vivax), como se detalla a continuación:

Reactivo Concentración stock

Concentración final

Volumen (µL) 1 reacción

Agua destilada desionizada

--- --- 10.92

Buffer 10 X, sin MgCl2 (CLP, EEUU)

10X 1X 2

Cloruro de magnesio (MgCl2) (CLP, EEUU)

25 mM 2.5 mM 2

Primer-rPLU5

100 ng/µL 2.5 ng/µL 0.5

Primer-rPLU6

100 ng/µL 2.5 ng/µL 0.5

dNTPs (CLP, EEUU)

2 mM 0.2 mM 2

TAP polimerasa (CLP, EEUU)

5 U/µL 0.4 U 0.08

ADN 2 Total 20

Se amplifican las muestras utilizando un termociclador iCycler (Bio-Rad, EEUU), con el programa siguiente:

Etapa Temperatura (°C) Tiempo (min) Ciclos Desnaturalización inicial

95 15 1

Desnaturalización 94 1 30 Hibridación 60 2 Extensión 72 2 Extensión final 72 10 1

43

Segundo PCR: especie-específico para P. vivax

Se preparan 20 uL de reacción de PCR para cada muestra y los controles respectivos (control de extracción, control de reactivos, control positivo para P. falciparum y control positivo para P. vivax), como se detalla a continuación:

44

Reactivo Concentración

stock Concentración

final Volumen (µL)

1 reación Agua destilada desionizada

--- --- 10.52


10X 1X 2


50 mM 2.5 mM 1

Primer-rVIV1 100 ng/µL 2.5 ng/µL 0.7 Primer-rVIV2 100 ng/µL 2.5 ng/µL 0.7 dNTPs (CLP, EEUU)

2 mM 0.2 mM 2


5 U/µL 0.4 U 0.08

DNA (productos del primer PCR)

3

Total 20 Se amplifican las muestras utilizando un termociclador iCycler (Bio-Rad, EEUU), con el programa siguiente:


95 15 1

Desnaturalización 94 1 30 Hibridación 55 2 Extensión 72 2 Extensión final 72 10 1 Segundo PCR: especie-específico para P. falciparum



Volumen (µL) 1 reación


--- --- 10.52


10X 1X 2


50 mM 2.5 mM 1

Primer-rFAL1 100 ng/µL 2.5 ng/µL 0.7 Primer-rFAL2 100 ng/µL 2.5 ng/µL 0.7

45

dNTPs (CLP, EEUU)

2 mM 0.2 mM 2


5 U/µL 0.5 U 0.08


3

Total 20 Se amplifican las muestras utilizando un termociclador iCycler (Bio-Rad, EEUU), con el programa siguiente:


95 15 1

Desnaturalización 94 1 30 Hibridación 55 2 Extensión 72 2 Extensión final 72 10 1

Se toman cinco microlitros de productos del segundo PCR se mezclan con 1 uL de colorante (Sigma PCR Marker, EEUU) y se separan en un gel de agarosa al 1.5% en buffer de Tris-Boratos-EDTA (TBE) 1X, conteniendo bromuro de etidio (1:32000). Se cargan en el gel 4 uL de marcador de masa molecular (Sigma PCR Marker, EEUU) y la electroforesis se realiza durante 30 min. a 80 volts. Luego se expone el gel a luz UV y se captura la imagen digital con un sistema de documentación. PREPARACION DE SOLUCIONES: 1. Buffer TBE 10X Tris base 108.00 g Acido Bórico 55.00 g EDTA 0.5 M, pH 8.0 40.00 mL (7.44 g de EDTANa2.2H2O en 40 mL,

se ajusta el pH con hidroxido de sodio en perlitas). Agua destilada desionizada hasta los 1000 mL

46

IV.4.3 Anexo 3

Marcadores Molecular de Plasmodium vivax Primer PCR: Se preparan 20 uL de reacción de PCR para cada muestra y los controles respectivos (control de extracción, control de reactivos, control positivo para P. vivax), como se detalla a continuación:



Volumen (µL) 1 reacción


--- --- 12.88


10X 1X 2


50 mM 2.5 mM 1

Primer-forward* 10 uM 0.26 uM 0.52 Primer-reverse* 10 uM 0.26 uM 0.52 dNTPs (CLP, EEUU)

2 mM 0.2 mM 2


5 U/µL 0.4 U 0.08

ADN 1 Total 20

* gen CS: PVCSF1 y PVCSR1; gen MSP1, región 2/3: PVMS1D2/3F1 y PVMS1D2/3R1; gen MSP1, región 5: PVMS1D5F1 y PVMS1D5R1. Se amplifican las muestras utilizando un termociclador iCycler (Bio-Rad, EEUU), con el programa siguiente:

Etapa Temperatura (°C) Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial

95 15 min 1

Desnaturalización 95 30 s 30 Hibridación CS MSP1, región 2/3 MSP1, región 5

57 50 50

30 s

Extensión 72 3 Extensión final 72 10 1

47

Segundo PCR:

Se preparan 20 uL de reacción de PCR para cada muestra y los controles respectivos (control de extracción, control de reactivos, y control positivo para P. vivax), como se detalla a continuación:

48

Reactivo Concentración

stock Concentración

final Volumen (µL)

1 reación Agua destilada desionizada

--- --- 12.88


10X 1X 2


50 mM 2.5 mM 1

Primer-forward* 10 uM 0.26 uM 0.52 Primer-reverse* 10 uM 0.26 uM 0.52 dNTPs (CLP, EEUU)

2 mM 0.2 mM 2


5 U/µL 0.4 U 0.08


1

Total 20 * gen CS: PVCSF2 y PVCSR2; gen MSP1, región 2/3: PVMS1D2/3F2 y PVMS1D2/3R2; gen MSP1, región 5: PVMS1D5F2 y PVMS1D5R2. Se amplifican las muestras utilizando un termociclador iCycler (Bio-Rad, EEUU), con el programa siguiente:

Etapa Temperatura (°C) Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial

95 15 min 1

Desnaturalización 95 30 s 30 Hibridación CS MSP1, región 2/3 MSP1, región 5

46 50 50

30 s

Extensión 72 3 Extensión final 72 10 1

Se toman cinco microlitros de productos del segundo PCR se mezclan con 1 uL de colorante (Sigma PCR Marker, EEUU) y se separan en un gel de agarosa al 1.5% en buffer de Tris-Boratos-EDTA (TBE) 1X, conteniendo bromuro de etidio (1:32000). Se cargan en el gel 4 uL de marcador de masa molecular (Sigma PCR Marker, EEUU) y la electroforesis se realiza durante 30 min. a 80 volts. Luego se expone el gel a luz UV y se captura la imagen digital con un sistema de documentación. PREPARACION DE SOLUCIONES:

49

1. Buffer TBE 10X Tris base 108.00 g Acido Bórico 55.00 g EDTA 0.5 M, pH 8.0 40.00 mL (7.44 g de EDTANa2.2H2O en 40 mL,

se ajusta el pH con hidroxido de sodio en perlitas). Agua destilada desionizada hasta los 1000 mL

50

IV.4.4 Anexo 4 Ejemplos de electroferogramas parciales obtenidos de la secuenciación automática

de las muestras del estudio.

Figura 8: Electroferograma parcial (0-100 bases) para la hebra sentido de la muestra E16 (El Estor, Izabal), amplificada para el gen CS.

Figura 9: Electroferograma parcial (0-100 bases) para la hebra sentido de la muestra P32 (Poptún, Petén), amplificada para el gen MSP1, región 2-3

51

Figura 10: Electroferograma parcial (0-100 bases) para la hebra sentido de la muestra T74 (Tiquisate, Escuintla), amplificada para el gen MSP1, región 5

52

IV.4.5 Anexo 5

Electroferogramas con secuencias incompletas

Figura 11: Electroferograma parcial para la hebra contrasentido de la muestra P46 (Poptún, Petén), amplificada para el gen MSP1, región 5

53

IV.4.6 Anexo 6

Resultados Flujo Genético entre Poblaciones -------------------------------------------------------------------------------- Results from GENEPOP -------------------------------------------------------------------------------- Genepop Web Version of 3.4 : Number of migrants using private alleles (see Barton & Slatkin, Heredity (1986),56:409-415) File: 141429 (FD-22-2003) Mean sample size: 3.889 Mean frequency of private alleles p(1) = 0.1882364 Number of migrants for Nmoy=10: 0.3454923 Number of migrants for Nmoy=25: 0.2148383 Number of migrants for Nmoy=50: 0.1614361 Number of migrants after correction for size = 0.8884087

54

IV.4.7 Anexo 7

Resultados Desequilibrio de Ligamiento Poblaciones separadas por área geográfica

-------------------------------------------------------------------------------- Results from GENEPOP -------------------------------------------------------------------------------- GenePop web version 3.4 Genotypic disequilibrium File: 121611 (LINKAGE DISEQUILIBRIUM FD-22-2003) Number of population detected: 3 Numer of loci detected: 3 Markov chain parameters Dememorization: 1000 Batches: 100 Iterations per batch: 1000 Pop Locus#1 Locus#2 P-Value S.E. ------- ------- ------- ------- ------- E CS MSP1_2-3 no information E CS MSP1_5 no information E MSP1_2-3 MSP1_5 0.02787 0.00302 P CS MSP1_2-3 Not possible P CS MSP1_5 Not possible P MSP1_2-3 MSP1_5 1.00000 0.00000 T CS MSP1_2-3 1.00000 0.00000 T CS MSP1_5 0.52475 0.00689 T MSP1_2-3 MSP1_5 0.03305 0.00369 P-value for each locus pair across all populations (Fisher's method) -------------------------------------------------------- Locus pair Chi2 df P-value ----------------- --------- ---- ---------- CS & MSP1_2-3 0.000 2 1.000 CS & MSP1_5 1.290 2 0.525 MSP1_2-3 & MSP1_5 13.980 6 0.030

55

Clave: E = Izabal P = Petén T = Escuintla

_ = Significativo P < 0.05

56

Resultados Desequilibrio de Ligamiento Muestras analizadas sin separar por área geográfica de procedencia

Results from GENEPOP

GenePop web version 3.4 Genotypic disequilibrium File: 122347 (LINKAGE DISEQUILIBRIUM FD-22-2003) Number of population detected: 1 Numer of loci detected: 3 Markov chain parameters Dememorization: 1000 Batches: 100 Iterations per batch: 1000 Pop Locus#1 Locus#2 P-Value S.E. ------- ------- ------- ------- ------- TODAS CS MSP1_2-3 0.82858 0.00599 TODAS CS MSP1_5 0.05941 0.01002 TODAS MSP1_2-3 MSP1_5 0.00000 0.00000 P-value for each locus pair across all populations (Fisher's method) -------------------------------------------------------- Locus pair Chi2 df P-value ----------------- --------- ---- ---------- CS & MSP1_2-3 0.376 2 0.829 CS & MSP1_5 5.647 2 0.059 MSP1_2-3 & MSP1_5 Infinity 2 Highly sign. Clave: E = Izabal P = Petén T = Escuintla _ = Significativo P < 0.05

57

58

IV.4.8 Anexo 8 Cuadro 9. Valores de P calculados para la prueba de significancia estadística de Fisher. Se elaboraron tablas de contingencia de 2 X 2 entre cada una de las variables y las variantes de cada uno de los genes estudiados. * P < 0.05, estadísticamente significativo.

Valor de P para cada variante del gen Variable CSP MSP1 ICB2-3 MSP1 ICB5-6

Rango de edad 0.0804 0.7434 0.2110

Parasitemia – formas asexuadas 0.9735 0.8320 0.8391

Parasitemia - gametos 0.2201 0.7778 0.7028

Género 0.7643 0.3301 0.3107

Época del año en que se presentó la infección

0.7782 0.6663 0.8493

Localidad del paciente 0.4199 0.1103 0.0103*

Parte V

V.1 Informe Financiero

Documents

Asociacin de mutaciones del gen dihidrofolato reductasa de Plaglifos.concyt.gob.gt/digital/fodecyt/fodecyt 2003.22.pdfdentro del fondo nacional de ciencia y tecnologÍa –fonacyt-,