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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO
SISTEMA REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries)
MACHOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS
Welber Daniel Zanetti Lopes Médico Veterinário
JABOTICABAL, SP – BRASIL - 2007
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CAMPUS DE JABOTICABAL
ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO
SISTEMA REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries)
MACHOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS
Welber Daniel Zanetti Lopes
Prof. Dr. Alvimar José da Costa
Orientador
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
Janeiro de 2007
Dissertação apresentada à Facul- dade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária (Medicina Veterinária Preventiva).
Trabalho realizado no “Centro de
Pesquisas em Sanidade Animal-
CPPAR/FCAV/UNESP, no departamento
de Medicina Veterinária Preventiva da
FCAV-UNESP, no Instituto Adolfo Lutz e no
Laboratório de prozoologia molecular da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS......................................................................................................... iv
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... vii
RESUMO.......................................................................................................................... 01
SUMMARY....................................................................................................................... 02
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................. 03
1.1. Aspectos Gerais................................................................................................... 03
1.2 Toxoplasmose em ovinos...................................................................................... 07
2. OBJETIVOS.................................................................................................................. 15
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................. 16
3.1. Cepas de Toxoplasma gondii............................................................................... 16
3.2 Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoítos de T. gondii.......................... 16
3.3. Obtenção de oocistos de Toxoplasma gondii...................................................... 17
3.4. Obtenção de taquizoítos de Toxoplasma gondii.................................................. 19
3.5 Confecção de lâminas com antígeno para IFI.................................................... 19
3.6. Seleção e adaptação dos ovinos reprodutores para o experimento.................... 20
3.7 Condicionamento dos reprodutores ovinos à colheita de sêmen.......................... 21
3.8 Inoculação dos ovinos reprodutores machos........................................................ 21
3.9. Exames clínicos................................................................................................... 23
3.10. Determinação de parasitemia............................................................................ 23
3.11. Resposta imune humoral (IFI)......................................................................... 24
3.12. Exames no sistema reprodutor dos ovinos infectados experimentalmente ...... 25
3.12.1. Colheita do sêmen.................................................................................... 25
3.12.2. Parâmetros espermáticos......................................................................... 25
3.12.2.1 Motilidade e vigor.................................................................................... 25
3.12.2.2 Concentração e volume.......................................................................... 25
3.12.2.3 Morfologia espermática.......................................................................... 26
3.13. Bioensaio em camundongos................................................................................... 26
3.14 Pesquisa de DNA de T. gondii pela PCR................................................................. 26
3.14.1. Extração do DNA das amostras do controle positivo e das amostras de
sêmen.......................................................................................................
27
3.14.2. Reação em cadeia da polimerase (PCR)................................................. 28
3.14.3. Eletroforese em gel de agarose para análise dos produtos amplificados
na PCR.....................................................................................................
29
3.15. Pesquisa do Toxoplasma gondii no testículo, vesícula seminal, próstata e
epidídimo dos ovinos reprodutores.........................................................................
29
3.15.1. Exames anátomo-histopatológicos nos órgãos reprodutores dos
ovinos..........................................................................................
29
3.15.2. Bioensaio em camundongos........................................................... 30
3.15.3. Imunoistoquímica em órgãos do sistema reprodutor dos ovinos.. 31
3.15.4 Pesquisa do DNA de T. gondii em tecidos pela PCR...................... 33
4. ANÁLISE ESTATÍSTICAS............................................................................................ 34
5. RESULTADOS............................................................................................................. 35
5.1. Obtenção de taquizoítos de T. gondii.................................................................. 35
5.2. Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoítos de T.gondii......................... 35
5.3. Obtenção de oocistos de T.gondii....................................................................... 35
5.4. Seleção dos ovinos reprodutores........................................................................ 36
5.5. Exames clínicos................................................................................................... 37
5.5.1 Temperatura corporal........................................................................ 37
5.5.2 Freqüência cardíaca.......................................................................... 39
5.5.3 Freqüência respiratória..................................................................... 41
5.5.4 Outros sinais clínicos........................................................................ 43
5.6 Exames nos sistema reprodutor dos ovinos infectados experimentalmente........ 45
5.6.1 Parâmetros espermáticos................................................................. 45
5.7. Determinação de Parasitemia............................................................................ 53
5.8. Resposta Imune Humoral..(RIFI)......................................................................... 55
5.9. Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos (Bioprova)..................... 58
5.10. Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos pela PCR.................... 61
5.11. Exames anátomo-histopatológicos (necropsias)................................................ 62
5.12 Exames histopatológicos.................................................................................... 62
5.13. Pesquisa do Toxoplasma gondii em tecidos dos reprodutores ovinos............... 62
5.13.1. Bioprova..................................................................................................... 62
5.13.2. Imunoistoquímica....................................................................................... 62
5.13.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).................................................. 65
6. DISCUSSÃO................................................................................................................. 66
7. CONCLUSÕES............................................................................................................. 73
6. REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 74
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Infecção toxoplásmica em ovinos pertencentes a diversas
regiões Mundiais...................................................................................... 09
Tabela 2. Delineamento experimental dos oito ovinos reprodutores
submetidos à infecção toxoplásmica experimental.................................. 22
Tabela 3. Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).......... 29 Tabela 4. Resultados sorológicos para Toxoplasmose, Neosporose,
Brucelose e Leptospirose dos ovinos examinados para seleção dos
grupos experimentais infectados com Toxoplasma gondii...................... 36
Tabela 5. Temperatura retal média mensurada dos ovinos
experimentais até 70 dias pós-inoculação com Toxoplasma
gondii........................................................................................................ 38
Tabela 6. Freqüência cardíaca média mensurada nos ovinos
experimentais até 70 dias pós-inoculação com Toxoplasma
gondii........................................................................................................ 40
Tabela 7. Freqüência respiratória média mensurada nos ovinos
experimentais até 70 dias pós-inoculação com Toxoplasma
gondii........................................................................................................ 42
Tabela 8. Parâmetros seminais de ovinos inoculados com oocistos de
Toxoplasma gondii................................................................................... 46
Tabela 9. Parâmetros seminais de ovinos inoculados com taquizoítos
de Toxoplasma gondii.............................................................................. 47
Tabela 10. Parâmetros seminais de ovinos pertencentes ao grupo
Controle.................................................................................................... 48
Tabela 11. Comparações múltiplas e resultados da análise de
variância dos parâmetros seminais de ovinos nos não inoculados
(controle) e inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106
taquizoítos de Toxoplasma gondii............................................................ 49
Tabela 12. Surtos parasitêmicos detectados em ovinos não infectados
(controle) e inoculados com Toxoplasma
gondii........................................................................................................ 54
Tabela 13. Recíproca dos títulos obtidos pela Reação de
Inumofluorescência Indireta (IFI) em ovinos não inoculados (controle) e
inoculados com 2,5 x 105 ou com 1,0 x 106
taquizoítos................................................................................................ 56
Tabela 14. Comparações múltiplas e resultados da análise de
variância do título sorológico de ovinos nos não inoculados (controle) e
inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106 taquizoítos de
Toxoplasma gondii................................................................................... 57
Tabela 15. Pesquisa de T. gondii em camundongos inoculados com
amostras seminais oriundas dos reprodutores ovinos não inoculados
(controle) e inoculados com oocistos ou
taquizoítos............................................................................................... 60
Tabela 16. Parasitismo tissular detectado pela técnica de
imunoistoquímica em testículos, epidídimos vesícula seminal e
próstata de ovinos inoculados com 2 x 10 5 oocistos ou 1 x 10 6
taquizoítos de Toxoplasma gondii............................................................ 63
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Temperaturas retais médias mensuradas nos ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x
105 oocistos de Toxoplasma gondii................................................................ 39
Figura 2. Freqüências cardíacas médias mensuradas nos ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x
105 oocistos de Toxoplasma gondii................................................................ 41
Figura 3. Freqüências respiratórias médias mensuradas nos ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x
105 oocistos de Toxoplasma gondii............................................................... 43
Figura 4. Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma
gondii no 5º DPI............................................................................................. 44
Figura 5. Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma
gondii no 7º DPI.............................................................................................. 44
Figura 6. Volume espermático médio (mL) em ovinos não inoculados
(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x 105
oocistos de Toxoplasma gondii..................................................................... 50
Figura 7. Motilidade espermática média (%) em ovinos não inoculados
(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x 105 oocistos
de Toxoplasma gondii.................................................................................... 50
Figura 8. Vigor espermático médio (0 a 5) em ovinos não inoculados
(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x 105 oocistos
de Toxoplasma gondii.................................................................................... 51
Figura 9. Concentração espermáticas médias (x 108) em ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x
105 oocistos de Toxoplasma gondii............................................................... 51
Figura 10. Patologias espermáticas médias de cabeça (%) em ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x
105 oocistos de Toxoplasma gondii............................................................... 52
Figura 11. Patologias espermáticas médias de cauda (%) em ovinos não
inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2 x
105 oocistos de Toxoplasma gondii............................................................... 52
Figura 12. Taquizoítos fluorescentes de Toxoplasma gondii (IFI). Soro de
camundongo inoculado com amostra seminal de ovino infectado com
taquizoítos. Obj. 20x....................................................................................... 58
Figura 13. Cisto de Toxoplasma gondii em cérebro de camundongo
inoculado com sêmen de ovino infectado com oocistos. Obj. 40x................. 59
Figura 14. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em
cadeia da polimerase (PCR), a partir de amostras seminais dos ovinos
experimentalmente infectados........................................................................ 61
Figura 15. Próstata demonstrando imunomarcação ao Toxoplasma gondii.
Ovino inoculado com oocistos de Toxoplasma gondii. Obj.
40x.................................................................................................................. 64
Figura 16. Vesícula seminal demonstrando agrupamento de taquizoítos
com imunomarcação ao Toxoplasma gondii. Ovino inoculado com
taquizoítos de Toxoplasma gondii. Obj. 40x................................................... 64
Figura 17. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em
cadeia da polimerase (PCR), a partir do “pool” das amostras de tecidos
(testículos, vesícula seminal, próstata e epidídimos) dos ovinos
experimentalmente infectados........................................................................
65
ASPECTOS DA INFECÇÃO TOXOPLÁSMICA NO SISTEMA
REPRODUTOR DE OVINOS (Ovis aries) MACHOS
EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS
RESUMO
Oito reprodutores ovinos, isentos de Toxoplasma gondii e quaisquer outras doenças
reprodutivas, foram distribuídos em três grupos para infecção com o respectivo
protozoário: GI - três ovinos (2,0 x 105 oocistos da cepa P), GII - três ovinos (1,0 x 106
taquizoítos da cepa RH) e GIII - dois ovinos (controle). Parâmetros clínicos foram
mensurados. Avaliações parasitêmicas e sorológicas (IFI) foram efetuadas. Qualidade
espermática foi avaliada e a presença do parasito no sêmen foi investigada por meio
das técnicas da bioprova e da PCR. Parasitismo tissular foi pesquisado pela bioprova,
PCR e imunohistoquímica. Foi possível registrar alterações hipertermia e apatia nos
ovinos infectados com oocistos de Toxoplasma gondii Parasitemia foi detectada em
cinco ovinos. Todos os ovinos inoculados responderam ao estímulo antigênico,
produzindo anticorpos contra T. gondii a partir do 5º dia pós-inoculação. Nos animais
dos grupos I e II, os títulos observados foram de 1:4096 e 1:8192, respectivamente. Nos
mesmos grupos, foram ainda, pela bioprova e PCR, constatada a presença do parasito
no sêmen. Pela PCR detectou-se o DNA de T. gondii no sêmen dos animais 02 e 09 (do
GI oocistos) e 07, 48 e 52 (do GII taquizoítos). Parasitismo tissular por T. gondii
(bioprova e PCR) foi diagnosticada nos ovinos 09, 16 (oocistos) e 07 (taquizoítos).
Vesícula seminal e próstata foram os tecidos de eleição da infecção por T. gondii
(imunohistoquímica) no sistema reprodutor dos ovinos experimentalmente infectados.
Em síntese, estes resultados sugerem a viabilidade da transmissão venérea deste
coccídio.
Palavras-chave : PCR, Sêmen, Toxoplasma gondii, ovinos, sistema reprodutor
ASPECTS OF THE TOXOPLASMIC INFECTION ON
REPRODUCTIVE SYSTEM OF SHEEP (Ovis aries)
EXPERIMENTALLY INFECTED
SUMMARY
Eight sheep reproducers exempt of Toxoplasma gondii and any other reproductive
illnesses, were distributed in three groups for infection with the respective protozoan: GI
- three sheep (2.0 x 105 oocysts from P lineage), GII - three sheep (1.0 x 106 taquizoites
from RH lineage) and GIII - two sheep (control). Clinical parameters were measured.
Parasitemics and sorologicals evaluations (IFA) were effected. Spermetic quality was
evaluated and the presence of the parasite in the semen was searched through
techniques of bioassay and PCR. Tissue parasitism was researched through bioassay,
PCR and immuneistochemistry. It was possible to registered hyperthermia and apathy
alterations in sheep infected with oocysts from Toxoplasma gondii. Parasitemia was
detected in five sheep. All inoculated sheep responded to antigenic stimulation,
producing antibodies against T. gondii upon the 5th day post-inoculation. In animals from
groups I and II, the titles observed were 1:4096 and 1:8192, respectively. The animals of
group III (control), did not present antibodies against T. gondii during all experimental
period. In the same groups, it still has been evidenced, through bioassay and PCR, the
presence of the parasite in the semen. Through PCR, T. gondii DNA was detected in the
semen of animals 02, 09 of GI (oocysts) and 07, 48 and 52 of GII (taquizoites). Tissue
parasitism by T. gondii (biotest and PCR) was diagnosed in sheep 09, 16 (oocysts) and
07 (taquizoites). Seminal vesicle and prostate were the tissues elected for infection with
T. gondii (immuneistochemistry) in the experimentally infected sheep reproductive
system. In summery, these results suggests the viability of the venereal transmission for
this coccidium.
KEYWORKS : PCR, Semen, Toxoplasma gondii, Sheep, Reproductive system
1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Aspectos Gerais
Uma das tarefas básicas da pesquisa agropecuária consiste em divulgar, reunir e
conferir informações científicas que possibilitem prevenir problemas, visando resguardar
a integridade física e sanitária do rebanho.
Em relação à criação de ovinos, tendo em vista a importância econômica que
representa no contexto pecuário, a prioridade é de aumentar a segurança dos
investimentos realizados, principalmente em regiões de expressiva produtividade.
Portanto, conhecer doenças que possam vir a ser um problema em futuro próximo, é a
importância de se manter pesquisas na área animal.
O estudo do Filo Apicomplexa, o qual compreende parasitas intracelulares
obrigatórios, que são altamente adaptados e conseguem invadir e se desenvolver
dentro das células hospedeiras, torna-se de suma importância. Este grupo possui ciclos
de vida complexo, em que cada forma evolutiva interage com células específicas de um
único hospedeiro (QUEIROZ, 1998).
Um dos membros deste filo, a família Sarcocystidae, possui mais de 200
espécies reconhecidas de coccídios heteroxenos formadores de cistos tissulares nos
hospedeiros intermediários, sendo subdividida em duas sub-famílias: Sarcocystinae e
Toxoplasmatinae (RESENDES et al., 2002). Pertence ao reino protista, filo
Apicomplexa, classe Sporoazida, ordem Eucoccidiorida, família Sarcocystidae,
subfamília Toxoplasmatinae, gênero Toxoplasma, tipo-espécie Toxoplasma gondii.
A sub-família Toxoplasmatinae compreende quatro gêneros diferentes, dentro
dos quais pelo menos duas espécies, Toxoplasma gondii e Neospora caninum, são de
importância em saúde pública e veterinária, podendo causar abortamentos, natimortos
ou doença congênita nos hospedeiros.
T. gondii foi descrito pela primeira vez em coelhos por SPLENDORE (1908), em
São Paulo, Brasil, e, por NICOLLE & MANCEAUX (1908), na Tunísia, em um pequeno
roedor, o Ctenodactylus gondii, no entanto teve seus nomes genérico e específico
determinados por NICOLLE & MANCEAUX (1909).
No seu ciclo evolutivo, T. gondii se apresenta sob três formas principais: 1)
taquizoítos, de rápida multiplicação e que ocorrem na infecção aguda; 2) bradizoítos,
localizados em cistos teciduais e presentes na infecção crônica e 3) oocistos, produto
final da reprodução sexuada e que ocorre somente no trato digestivo dos felídeos, seus
hospedeiros definitivos (MILLER et al., 1972). Os oocistos são eliminados para o meio
juntamente com as fezes dos felídeos onde, após esporulação, tornam-se infectantes.
Após a ingestão, a parede do cisto ou do oocisto se rompe por ação enzimática,
liberando as formas infectantes (bradizoítos e esporozoítos, respectivamente) no trato
digestivo do hospedeiro. Penetram então nas células epiteliais do intestino parasitado
onde, após multiplicação, transformam-se em taquizoítos. A disseminação ocorre pelo
rompimento das células infectadas seguido da invasão das células vizinhas,
distribuindo-se praticamente por todo organismo via circulação sanguínea ou se
difundindo de uma célula a outra, podendo, ainda, ser disseminado por macrófagos,
linfócitos ou granulócitos, além de circular na corrente sanguínea na sua forma livre.
Os taquizoítos são encontrados somente em células nucleadas, com maior
afinidade pelos sistemas muscular e nervoso, onde se multiplicam com rapidez até
destruí-las.
Com o avanço da infecção, o hospedeiro começa a desenvolver uma resposta
imune que atua sobre a multiplicação dos taquizoítos, os quais passam a se dividir mais
lentamente, sendo então denominados bradizoítos e que se encontram confinados num
cisto no interior da célula parasitada, protegidos contra a ação do sistema imune e de
drogas. É a infecção latente ou crônica, que pode se perpetuar por vários anos
(HUTCHISON et al., 1968, 1970, 1971; WITE, PIEKARSKI, 1970; FRENKEL, 1970;
FRENKEL, 1973 e SWANGO et al., 1989).
Além deste ciclo, no hospedeiro definitivo, em especial o gato doméstico, ocorre
o ciclo entero-epitelial com esquizogonia e gametogonia, culminando com a fecundação
e produção do oocisto (FRENKEL, 1970 e WONG & REMINGTON, 1993). Os felídeos
podem se infectar pela ingestão de qualquer uma das três formas evolutivas, sendo a
ingestão de cistos com bradizoítos, por meio do carnivorismo, a via mais freqüente
(SWANGO et al., 1989; DUBEY et al., 1996 e DUBEY, 2002).
Normalmente T. gondii parasita seus hospedeiros sem a manifestação de sinais
clínicos, porém pode ser capaz de desencadear doença severa, ocorrendo graves
alterações comportamentais, como déficit de atenção e esquizofrenia (LAFFERTY,
2005) reduzindo a qualidade de vida dos indivíduos (McALLISTER, 2005). Deve-se
atentar para os fatores de risco de aquisição da infecção pré natal bem como considerar
sua patogenia e seqüelas (DUBEY, 1993; KRAVETZ, FEDERMAN, 2005;
BACHMEYER et al., 2006 e HUNG et al., 2007).
O risco de aquisição desta enfermidade na vida pós-natal, também foi
demonstrado por vários autores (DUBEY et al. 1998; GIRALDI et al. 2001 e SILVA et al.
2001).
Em humanos, a infecção é muito comum, porém a enfermidade clínica é pouco
freqüente. Estima-se que um terço, ou mais, da população possua anticorpos contra o
parasito. Somente nos EUA é provável que ocorram 1.437.500 novos casos de infecção
por T. gondii, com um custo aproximado de U$ 445 milhões por ano (TODD, 1989). No
mesmo país, segundo SAAD et al. (1996), aproximadamente 300 pessoas morrem
anualmente devido à toxoplasmose, tanto na sua forma congênita (neonatos) quanto
em indivíduos com severa imunossupressão iatrogênica (transplantados, tratamento de
neoplasias, pacientes submetidos à diálise renal) ou que sofram de enfermidades
imunossupressoras como doenças auto-imunes ou a síndrome de imunodeficiência
adquirida – AIDS (SMITH, 1993).
Em pacientes com síndrome de imunodeficiência adquirida, a toxoplasmose
manifesta-se com uma elevada freqüência, sendo considerada uma doença oportunista
(LUTF & REMINGTON, 1988; PASSOS et al., 2000) que provoca a reativação dos
cistos, principalmente os cerebrais, produzindo grave encefalite (HALONEN et al., 2001;
KHETSURIANI et al., 2002; MAMIDI et al., 2002; COLLAZOS, 2003; YADAV et al., 2004
e PRADHAN et al., 2007). POTASMAN et al. (1987) observaram uma freqüência de
encefalite por T. gondii entre seis e 10% de pacientes aidéticos nos EUA. No Brasil, em
pacientes acima de 12 anos de idade, a toxoplasmose é a terceira doença associada
mais prevalente, com 11.809 (3,72%) dos 314.582 casos notificados entre 1980 e 1996
(BRASIL, 1996).
Estudos da soroprevalência de Toxoplasma em indivíduos da cidade de
Fortaleza, Ceará, mostraram um rápido aumento na positividade, durante os primeiros
10 anos de vida, sugerindo que a maioria das infecções primárias seja adquirida
durante a infância. Fato este que pode ser associado ao contato domiciliar com gatos e
famílias numerosas, que provavelmente deixam a desejar na higiene e cuidado com as
crianças (REY & RAMALHO, 1999).
As principais vias de transmissão do T. gondii são: infecção transplacentária
(taquizoítos circulantes), sendo mais freqüente no terço final da gestação (FRENKEL,
1973; DUBEY e TOWLE 1986; MAMIDI et al., 2002); ingestão de água, como sugerem
os trabalhos de ARAMINI et al. (1998 e 1999), ou alimentos contaminados com oocistos
esporulados oriundos das fezes do gato e, ainda, ingestão de cistos teciduais em
carnes cruas e/ou mal cozidas (SILVA et al., 2000).
Menos freqüente, porém possível, a infecção pode se dar por meio de acidentes
laboratoriais (WONG & REMINGTON, 1993), transfusão sangüínea (FIGUEROA-
DAMIAN, 1998), transplante de órgãos (MUNIR et al., 2000), e ingestão de leite caprino
não pasteurizado contendo taquizoítos, já descrita em humanos por CHIARI & NEVES
(1984). Em mulheres, embora não se tenha comprovado a transmissão por meio da
amamentação, BONAMETTI et al. (1997a) descrevem um caso positivo de
toxoplasmose em uma criança, cuja dieta era constituída exclusivamente por leite
materno, e a mãe fazia parte de um grupo de 17 indivíduos que havia adquirido
toxoplasmose pela ingestão de carne ovina crua. Um inquérito sorológico na
propriedade de origem dos ovinos revelou 43% dos animais soropositivos para
protozoonose.
Outra via de transmissão recentemente reconhecida é o contato com cães,
devido ao comportamento de alguns deles de ingerir e rolar sobre fezes de gatos, talvez
atraídos pelo cheiro forte. Este comportamento foi denominado xesnomofilia e
possibilitaria a transmissão pelo contato com possíveis oocistos presentes na pelagem
de cães que vivem em áreas muito contaminadas (FRENKEL & PARKER, 1996).
1.2 Toxoplasmose em ovinos
A toxoplasmose ovina é uma doença parasitária de elevada importância
veterinária, zootécnica e de saúde pública, uma vez que acarreta prejuízos aos animais
de produção (WYSS et al., 2000; SMIELEWSKA, et al., 2001, O’ROUKE, 2002), além
de servirem de fonte direta ou indireta de infecção para o ser humano (LINDSAY et al.,
1997; GARCIA et al., 1999; WALSH et al., 1999). Na Europa, mais de 50% da carne de
ovinos e suínos, pesquisada por ACHA & SZYFRES (1986) apresentaram-se
parasitadas pelo T. gondii. A carne suína é considerada a principal fonte de transmissão
para humanos nos Estados Unidos e, provavelmente, em vários outros países
(GAMBLE, 1997). Em frangos de corte estima-se que a prevalência seja baixa, embora
KANETO et al. (1997) tenham isolado cistos viáveis de T. gondii de musculaturas
esquelética e cardíaca de animais infectados experimentalmente, e GARCIA et al.
(2000) encontraram uma soroprevalência de 10,3% em frangos de corte no estado do
Paraná.
Dentre os animais de produção, o ovino é um dos que mais comumente
apresenta-se infectado, juntamente com os suínos, caprinos e coelhos (DUBEY &
THULLIEZ, 1993).
A alta prevalência da toxoplasmose em ovinos pode estar ligada a menor
resistência desta espécie ao parasita e as próprias condições de exploração da
ovinocultura que expõe estes animais a maior probabilidade de contato com os oocistos
eliminados pelos gatos (DUBEY & HAMIR, 2002).
A toxoplasmose em ovinos foi descrita pela primeira vez por OLAFSON &
MONLUX (1942), nos Estados Unidos. Estes autores assinalaram esta enfermidade em
uma ovelha que clinicamente apresentava sintomatologia nervosa, aumento de
temperatura, rigidez muscular, entre outros. O diagnóstico para esta zoonose foi
estabelecido após necropsia e exame histopatológico do cérebro e medula espinhal do
animal.
Desordens reprodutivas, como abortos e neonatos mortos ou fracos, que
evoluem para óbito, geram perdas econômicas consideráveis em rebanhos ovinos
(PEREIRA-BUENO et al., 2004). Estudos conduzidos no Uruguai apontaram a
toxoplasmose como um problema importante nos rebanhos ovinos, promovendo
prejuízos anuais de US$ 1,4 a 4,7 milhões (FREYRE et al., 1999). MUNDAY & MASON
(1979) foram os primeiros a descreverem a toxoplasmose como importante causa de
prejuízos reprodutivos em caprino, e apesar de pouco relatada nesta espécie,
aparentemente, os danos são maiores, acometendo clinicamente tanto animais jovens,
como adultos (DUBEY, 1987). Para pequenos ruminantes, a principal via de infecção é
a ingestão de oocistos esporulados do parasito (DUBEY & BEVERLEY, 1988).
Em conseqüência disto, na Nova Zelândia e em alguns países europeus, tem
sido licenciado o uso de uma vacina (cepa atenuada “S48”) de taquizoítos, com o
objetivo de minimizar as perdas econômicas nestes sistemas de produção (MONTOYA
& LIESENFELD, 2004).
Um surto de Toxoplasmose humana foi relatado na cidade de Bandeirantes,
Estado do Paraná por BONAMETTI et al., (1997b). Os autores apresentaram 17 casos
(dentre estes, uma paciente que estava no 5º mês de gestação) com sintomatologia
aguda da doença, adquirida pela ingestão de carne crua de carneiro, servida em uma
festa. Todos apresentaram títulos séricos de anticorpos específicos (IgM) que
evidenciaram fase aguda da toxoplasmose, pela reação de Imunofluorescência Indireta
(IFI).
As taxas de infecção apontadas para rebanhos ovinos são variáveis (Tabela 1).
Esta flutuação na ocorrência deve-se principalmente ao tipo de teste sorológico
utilizado, à região e a idade dos animais estudados (Dubey, 1990).
Tabela 1: Infecção toxoplásmica em ovinos pertencentes a diversas regiões Mundiais.
Autor(es) Ano País Reação
Sorológica
Nº de
ovinos
examinados
% de
positivos
FELDMAN & MILLER 1956 Estados Unidos SF 9 100
ANGELOFF et al., 1957 Bulgária SF 138 3
ROEVER-BONNET 1957 Holanda SF 128 63
RAWAL 1959 Inglaterra SF 200 36
EYLES et al., 1959 Estados Unidos SF 29 100
COOK 1959 Austrália SF 485 6
ANGELOV et al., 1960 Bulgária FC 526 24
GUILO & DESMONTS 1960 França SF 165 72
SATO 1960 Japão SF 52 44
BERVELEY &
WASTON 1961 Inglaterra SF 200 36
JACOBS 1961 Nova Zelândia SF 18 83
MOYLE & HARTLEY 1961 Nova Zelândia SF 696 45
BERVELEY & MACKAY 1962 Inglaterra SF 77 31
BERVELY & WASTON 1962 Inglaterra SF 246 25
JACOBS et al., 1963 Nova Zelândia SF 29 100
McCULLOCH et al., 1964 Estados Unidos SF 27 81
IFI 315 55 BOCH et al., 1965 Alemanha
ELISA 315 90
ZASTERA et al., 1965 Czechoslovakia SF 127 73
BERENGO et al., 1965 Itália SF 77 43
BERGER 1966 Alemanha SF 146 99
ELIAS 1966 Romênia SF 635 53
WORK 1967 Dinamarka SF 70 61
SINGH et al., 1967 Singapura HAI 24 25
continua
continuação
JANITSCHKE et al., 1968 Alemanha SF 49 87
HARTLEY & MOYLE 1968 Austrália SF 230 88
CATAR et al., 1969 Czechoslovakia FC 429 27
ROEVER-BONNET 1969 Argentina SF 37 62
GILL & PRAKASCH 1970 Índia HAI 488 9
FRENCH et al., 1970 Kwait SF 70 70
WEILAND &
DALCHOW 1970 Turquia SF 250 38
MUNDAY &
CORBOULD 1971 Austrália IFI 1022 14
TATEYMA et al., 1971 Japão HAI 11 27
GARIN et al., 1971 Senegal IFI 83 46
WASTON &
BERVELEY 1971 Inglaterra SF 270 92
DONEV 1972 Bulgária FC 968 31
MARONPOT et al., 1972 Egito IFI 389 12
MUNDAY 1972 Austrália IFI 493 9
BERENGO et al., 1972 Itália SF 88 99
IANNUZZI & RENIERI 1973 Itália HAI 371 48
PLANT et al., 1974 Austrália SF 48 84
CAMPANA et al., 1974 França IFI 583 72
VANDERWAGEN et al., 1974 Estados Unidos HAI 68 28
FRANTI et al., 1975 Estados Unidos IFI 405 13
IFI 144 (M) 62 MUNDAY 1975 Tasmânia
IFI 160 (F) 17
KOZOJED et al., 1976 Afeganistão HAI 117 21
continua
continuação
CHHABRA &
MAHAHAN 1976 Índia HAI 189 19
ARNAUDOV 1977 Estados Unidos HAI 1579 38
HASGAWA et al., 1977 Japão SF 17 18
MAITANI 1977 Japão SF 34 44
SHARMA & GAUTAM 1977 Índia HAI 122 7
WYNNE & MARTIN 1977 Argentina HAI 105 54
PECHERE et al., 1977 Canadá HAI 26 23
ARNAUDOV et al., 1977 Czechoslovakia IFI 493 33
RIFAAT et al., 1977 Egito SF 52 27
2164 (M) 24 RIEMANN et al., 1977 Estados Unidos HAI
699 (F) 4
MICHAEL 1977 Egito SF 100 51
AMARAL et al., 1978 Brasil HAI 100 23
HAGIQARA et al., 1978 Japão SF 26 65
APARICIO et al., 1978 Espanha IFI 84 50
PERRY 1978 Colômbia HAI 1655 58
TIZARD et al., 1978 Canadá SF 273 65
RIFAAT et al., 1978 Egito SF 54 18
CHABASSE et al., 1978 França IFI 60 15
AMARAL et al., 1978 Brasil (Bahia e
RS) SF 100 23
PERRY et al., 1979 Colômbia IFI 1655 58
RIFAAT et al., 1979 Egito SF 76 47
FAHMY et al., 1979 Egito SF 169 68
Larsson et al., 1980 Brasil
(Uruguaiana/RS) SF 100 39
continua
continuação
Larsson et al., 1980 Brasil
(Uruguaiana/RS) SF 100 39
SHARMA 1980 Romênia IFI 502 37
PLANT et al., 1980 Austrália IFI 5724 42
PROSECK & HEIJECK 1980 Czechoslovakia SF 89 11
IFI 1092 (M) 29 RUTHERFORT 1980 Nova Zelândia
IFI 50 (F) 0
RAMISSE et al., 1981 França HAI 263 22
OKHO et al., 1981 Nigéria HAI 479 27
SILVA & COSTA 1981 Brasil
(Guaíba/RS) IFI 310 12
AGANGA et al., 1983 Nigéria IFI 200 9
GHORBANIi et al., 1983 Irã AL 203 32
UGGLA & HJORT 1984 Suécia IFI 155 62
SRIVASTAVA et al., 1984 Índia HAI 202 34
DUBEY & KIRKBRIDE 1984 Estados Unidos SF 15 100
RHYAN & DUBEY 1984 Estados Unidos SF 12 91
NISHIKAWA et al., 1984 Brasil (Rio
Grande do Sul) AL 655 8
DUBEY et al., 1985 Estados Unidos SF 78 41
DUBEY 1985 Estados Unidos SF 649 13
ALI ABBAS et al., 1986 Índia HAI 177 26
FESHASKI - HASHENI 1996 Iran IFI 3311 24,5
GONDIN et al., 1999 Brasil (Bahia) IFI 240 18,75
IFI 352 55 LANGONI et al., 1999
Brasil (Estado
de São Paulo) HAI 352 30
continua
continuação
MEIRELLES 2003 Brasil (São
Manuel/SP) ELISA 200 31
SILVA et al., 2003 Brasil
(Pernambuco) IFI 173 35,3
FIGIOULO et al., 2004 Brasil (Estado
de São Paulo) IFI 597 34
SAWADOGO et al., 2005 Moroccos ELISA 261 27,6
KLUN et al., 2006 Sérvia
Montenegro IFI 511 84,5
DUMETRE et al., 2006 França AD 257 44
LOPES et al., 2006 Brasil
(Jaboticabal/SP) IFI 134 56
SHARIF et al., 2006 Iran IFI 588 35
Convenções: SF: Reação de Sabin & Feldman; HAI: Reação de Hemoaglutinação Indireta; AL: Aglutinação em Látex; FC: Fixação de Complemento; IFI: Reação de Imunofluorêscencia Indireta; AD: aglutinação direta; ELISA: Ensaio Imunoenzimático.
SPOSITO-FILHA et al. (1992), isolaram 20 cepas de Toxoplasma a partir do
diafragma de 136 ovinos. DA SILVA & LANGONI (2001) identificaram o T. gondii do
cérebro e diafragma de 34 dos 40 ovinos sorologicamente reagentes à
imunofluorescência indireta. Estes trabalhos de isolamento de parasitos viáveis em
tecidos comestíveis, bem como no leite caprino (CHIARI & NEVES, 1984) revelam a
importância destas espécies como fonte de infecção para o homem. O isolamento do T.
gondii no sêmen de animais domésticos, foi comprovado em caprinos (DUBEY &
SHARMA, 1980), bovinos (SCARPELLI, 2001), suínos (MOURA, 2004) e caninos
(ARANTES, 2005).
Apenas três trabalhos na literatura (SPENCE et al., 1978; TEALE et al., 1982;
AGANGA et al., 1988) relatam o isolamento de T. gondii em sêmen de ovinos.
Diferentemente destes autores, no presente trabalho foram utilizadas duas
metodologias (bioprova e PCR) nas tentativas de recuperar este coccídio. Todos os
resultados relativos ao sistema reprodutor de ovinos (parâmetros espermáticos,
histopatologia, bioensaio, imunohistoquímica e PCR) são inéditos na literatura
consultada.
2. OBJETIVOS
2.1 - Avaliar a infecção experimental, em ovinos machos, em idade reprodutiva,
inoculados com oocistos e taquizoítos de T. gondii;
2.2 - Compilar dados clínicos e laboratoriais para melhor conhecimento da infecção
toxoplásmica em reprodutores ovinos;
2.3 - Avaliar a resposta imune humoral dos animais infectados por meio da Reação de
Imunofluorescência Indireta (IFI);
2.4 - Pesquisar pelas técnicas da bioprova e da PCR, a eventual presença de T. gondii
em amostras de sêmen colhidas dos ovinos infectados experimentalmente.
2.5 - Investigar a presença de T. gondii em testículos, próstata, vesícula seminal e
epidídimo dos ovinos infectados experimentalmente por meio do bioensaio (inoculação
em camundongos), da Imunoistoquímica e da PCR.
2.6 - Dos resultados obtidos, devidamente analisados, extrair inferências sobre a
importância do T. gondii no sistema reprodutor de ovinos experimentalmente infectados.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Cepas de Toxoplasma gondii
Foram utilizadas as cepas “P” (JAMARA & VIEIRA, 1991) e ”RH” (SABIN, 1941),
mantidas no “CPPAR - Centro de Pesquisas em Sanidade Animal” da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP - Campus de Jaboticabal. A cepa “P” produz
infecções letais nos camundongos experimentalmente infectados. Os sobreviventes à
infecção normalmente apresentam razoável quantidade de cistos teciduais em cérebro.
Os oocistos desta cepa apresentam-se infectantes para camundongos (VIDOTTO et al.,
1986b) mesmo depois de mantidos durante cinco anos em temperatura de refrigeração
(4oC a 8oC).
3.2 Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoít os de T. gondii
Camundongos albinos suíços, fêmeas, com idade média de 35 dias foram
inoculados intraperitonealmente com aproximadamente 10 cistos (cepa “P”) cada, e
observados diariamente até o 42o dia pós-inoculação, quando, então, eram
eutanasiádos. Os camundongos inoculados foram medicados com sulfadiazina (500
mg) misturada à ração (100g) na dose de 3,5g/animal/dia de ração do segundo ao 11o
dia pós-inoculação de T. gondii. A maioria dos camundongos sobreviventes à infecção
apresentavam cistos cerebrais.
Para pesquisa de cistos de T. gondii os camundongos foram eutanasiádos e
posicionados em decúbito esternal. Com o auxílio de pinça e tesoura, cada cérebro foi
removido e transferido para um graal estéril e macerado com cerca de 1,0 ml de
solução fisiológica estéril. Uma alíquota de 50 µl foi examinada ao microscópio óptico,
com objetiva de 40X, para identificação e quantificação dos cistos de T. gondii
eventualmente presentes. Nos camundongos que morreram antes do 11o dia pós-
inoculação, realizou-se pesquisa de taquizoítos no exsudato peritoneal. Os taquizoítos,
assim obtidos, dependendo da concentração e viabilidade, foram também inoculados
em outros camundongos com o objetivo de se obter cistos cerebrais.
3.3 – Obtenção de oocistos de T. gondii
Foram utilizados dois gatos, SRD (sem raça definida), entre dois e três meses de
idade, todos sorologicamente negativos (IFI) para a presença de T. gondii (anticorpos e
oocistos). Cada um deles recebeu aproximadamente 3 mL de um inóculo, contendo
aproximadamente 1500 cistos de T. gondii provenientes de cérebros dos camundongos
cronicamente infectados (cepa “P”). Para a inoculação dos gatos, adotou-se a
metodologia proposta por COSTA et al. (1977), tomando-se o cuidado de realizar a
lavagem da seringa utilizada com solução fisiológica, a fim de remover os cistos que
porventura estivessem aderidos às paredes da mesma. Além do macerado cerebral, os
gatos receberam vísceras (pulmão, coração e fígado) e, ainda, a carcaça dos
camundongos positivos para cistos, com o objetivo de aumentar o inóculo administrado.
Os felinos foram mantidos, isoladamente, em gaiolas metálicas, devidamente
adaptadas para recebê-los. Os animais foram colocados em ambiente fechado, sendo a
água e a ração fornecidas “ad libitum”. A cada 24 horas, os animais foram transferidos
para gaiolas limpas e os comedouros e bebedouros trocados. Os papéis utilizados para
forrar as gaiolas foram acondicionados em sacos de papel e incinerados. As gaiolas e o
recinto (piso e paredes) ocupados pelos gatos infectados foram tratados com água
quente (80ºC).
Exames coproparasitológicos (Método de Sheather), utilizando-se do volume
total de fezes excretadas durante 24 horas pelos gatos, foram realizados, diariamente,
durante 15 dias consecutivos pós-inoculação. As fezes recentemente colhidas foram
misturadas com água até a formação de uma massa pastosa. Uma solução de
sacarose (500g de açúcar dissolvidas em 320mL de água destilada) foi adicionada na
proporção 1:1 para homogeneização do material. Em seguida, este material foi filtrado
para a remoção das partículas maiores e transferido para tubos cônicos de centrífuga
de 50mL (Falcon). Do material, assim obtido, após centrifugação (3000 a 4000 rpm por
10 minutos), foram aspiradas alíquotas do sobrenadante, com auxílio de uma pipeta
Pasteur, para a pesquisa de oocistos de T. gondii em microscópio óptico (objetiva de
40X). Em cada uma das amostras de oocistos, assim obtidos, foi adicionada soluções
de ácido sulfúrico a 2% para auxiliar na esporulação. Assim, o material colhido
diariamente, foi mantido em temperatura ambiente em frasco, parcialmente fechado e
aerado mecanicamente duas vezes ao dia, durante 10 dias até a completa esporulação
dos oocistos (DUBEY et al., 1972).
Os oocistos esporulados foram lavados em solução fisiológica, por meio de
sucessivas centrifugações, para remoção do ácido sulfúrico 2% e estocados em
temperatura de refrigeração (4oC a 8oC), imersos em solução salina a 0,85%.
A identificação dos oocistos esporulados foi realizada utilizando-se critérios
morfológicos (ZAMAN, 1970), por meio da mensuração dos oocistos (10 a 12
micrômetros) em régua micrométrica ocular calibrada para a objetiva de aumento 40X
do microscópio óptico e por meio de inoculações intraperitoneais em camundongos
(DUBEY et al., 1972). Após a identificação, foi efetuada a quantificação total dos
oocistos em cada uma das datas de emissão das fezes, para cada um dos dois felinos,
por meio de cinco contagens em câmara de Neubauer, de acordo com a técnica
adotada por COSTA et al. (1977).
Para a inoculação nos ovinos, procedeu-se uma mistura de todas as amostras
fecais positivas, nos respectivos dias em que foram colhidas, para cada um dos felinos,
resultando assim em duas soluções (oriundas dos dois felinos). Posteriormente estas
soluções foram novamente examinadas, sendo o tamanho do inóculo definido mediante
contagem de oocistos em câmara de Neubauer.
3.4 – Obtenção de taquizoítos de T. gondii
Para a obtenção dos taquizoítos e padronização dos inóculos que posteriormente
foram administrados aos ovinos procedeu-se da seguinte forma: camundongos albinos
suíços fêmeas, com idade de 35 dias, receberam por via subcutânea exsudato
(contendo T. gondii) colhidos de outros camundongos previamente inoculados com
taquizoítos de T. gondii (cepa RH). Freqüentemente, alguns destes camundongos eram
eutanasiádos e posicionados em decúbito dorsal. Após o acesso à cavidade abdominal,
era feito um lavado intraperitoneal com injeção de 1,0 mL de solução fisiológica estéril e
posterior aspiração deste conteúdo.
Com o auxílio de microscopia óptica (objetiva de 40X), a concentração,
viabilidade e morfologia dos taquizoítos foram avaliadas para obtenção dos inóculos. A
padronização desta metodologia permite a obtenção de taquizoítos, em concentrações
variadas, presentes no exsudato intraperitoneal dos camundongos previamente
infectados por T. gondii (COSTA, 1979).
3.5 - Confecção de lâminas com antígeno para IFI
Para a realização da IFI foi utilizado, como antígeno, taquizoítos da cepa RH de
T. gondii, mantidos em solução salina estéril acrescida de heparina (25µl de heparina
em 50 mL de solução salina), obtidos de camundongos no segundo dia pós-infecção, e
inativados por formol a 0,5%, em estufa a 37oC por 30 minutos. Após centrifugação (um
minuto a 500 rpm), para sedimentar impurezas, o sobrenadante recolhido foi novamente
centrifugado (10 minutos a 1500 rpm), sendo descartado o novo sobrenadante. O
sedimento foi então ressuspenso em PBS e centrifugado mais uma vez. Após nova
ressuspensão do sedimento, o mesmo foi avaliado (microscopia óptica, objetiva de 40X)
quanto à quantidade de taquizoítos e então diluído em PBS até obter-se uma média de
20 a 30 taquizoítos por campo. Dez microlitros desta suspensão de taquizoítos foram
colocados em “poços” (impressos em lâminas de microscopia pela técnica de “Silk
Screen”). As lâminas contendo o antígeno foram mantidas à temperatura ambiente
(“overnight”), cobertas para evitar contaminação por poeira, para secarem. Em seguida,
as mesmas foram envoltas em papel alumínio e estocadas a –20oC até a utilização.
3.6 - Seleção e adaptação dos reprodutores ovinos p ara o experimento
Oito ovinos machos sorologicamente negativos para toxoplasmose, neosporose,
brucelose e leptospirose, clinicamente saudáveis, em idade reprodutiva, foram
selecionados de um total de 74 animais examinados, oriundos de propriedades rurais
dos municípios paulistas de Viradouro, Pitanguerias, Morro Agudo e Jaboticabal.
Amostras de sangue dos animais foram colhidas por venopunção jugular, em
tubos de vacutainer, sem anticoagulante. O material foi centrifugado a 2000 rpm, por 10
minutos, e os soros obtidos foram estocados a -20ºC, até o processamento. A técnica
sorológica empregada para detecção de anticorpos contra T. gondii foi a IFI - Reação
de Imunofluorescência Indireta (CAMARGO, 1964), utilizando-se de conjugado anti-IgG
específico para ovinos, marcado com isotiocianato de fluoresceína, sendo utilizadas as
diluições de 1:16 e 1:64. Foram consideradas como amostras positivas os soros que
apresentaram títulos iguais ou superiores a 1:16 (MAINARDI et al, 2003).
Empregou-se, também, a IFI para detectar a presença de anticorpos contra
Neospora caninum (CONRAD et al. 1993) sendo os soros dos animais usados nas
diluições de 1:50 e 1:100. Os ovinos com títulos sorológicos a partir de 1:50, foram
considerados positivos (FIGLIUOLO et al., 2004) e, conseqüentemente, descartados do
experimento.
Para pesquisa de anticorpos contra brucelose foi utilizada a Técnica do Antígeno
Acidificado Tamponado, também conhecida como Teste do Rosa Bengala ou “Card
Test” (ALTON et al., 1988). Para este teste, 0,03 mL do soro foi colocado em contato
com 0,03 mL do antígeno em placa de vidro própria. Em seguida, a mistura foi
homogeneizada e a placa mantida em movimentos rotatórios durante quatro minutos,
para observar a ocorrência, ou não, de grumos de aglutinação, indicativos da
soroconversão. Testou-se somente o antígeno Brucela abortus, em decorrência da
impossibilidade de obtenção do antígeno referente a Brucela canis, não mais produzido
pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento).
Quanto à leptospirose, a técnica empregada foi a Prova de Soroaglutinação
Microscópica. Os soros foram testados contra os sorovares pomona,
icterohaemorrhagiae e canicula. O critério adotado para considerar um soro reagente foi
de 50% de aglutinação no título final de 1:100, ou seja, metade das leptospiras
aglutinadas no campo microscópico, observado no aumento de 100X. Para a realização
da técnica e interpretação do grau de aglutinação foram adotadas as recomendações
do CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS (1985).
Após a realização de todos os exames sorológicos, os animais selecionados
foram alocados em boxes individuais descontaminados, pertencentes ao “Setor de
Ovinos e Caprinos” do CPPAR - Centro de Pesquisas em Sanidade Animal da FCAV –
UNESP, Campus de Jaboticabal. Posteriormente, foram desverminados, examinados
clinicamente e submetidos a quarentena (quatro semanas) para detecção de eventuais
alterações clínicas e/ou laboratoriais que pudessem interferir nos resultados
experimentais. Durante o período de adaptação pré-experimental (40 dias) os ovinos
receberam água e ração “ad libitum”.
3.7 – Condicionamento dos reprodutores ovinos à col heita de sêmen
Durante esta fase pré-experimental, os animais foram submetidos à colheita de
sêmen pelo método artificial, com o uso de eletro-ejaculador, a cada sete dias, por um
período de quatro semanas, para obtenção de sêmen e, conseqüentemente, para que
estivessem aptos a doarem sêmen no decorrer do experimento.
3.8 – Inoculação dos ovinos reprodutores machos.
Após o período de adaptação, os animais foram identificados, sorteados e
distribuídos em grupos, conforme o delineamento experimental descrito na Tabela 2.
Tabela 2 . Delineamento experimental dos oito ovinos reprodutores submetidos à
infecção experimental por Toxoplasma gondii.
Número do
Ovino
Grupo
Oocistos de
Toxoplasma
gondii
Taquizoítos de
Toxoplasma gondii
Via de
inoculação
02 2x 105 -- Oral
09 2x 105 -- Oral
16
I
2x 105 -- Oral
07 -- 1 x 106 Subcutânea
48 -- 1 x 106 Subcutânea
52
II
-- 1 x 106 Subcutânea
43 Placebo Oral
44 III
Placebo Oral
Os oocistos foram administrados por meio de seringa acoplada a uma sonda de
metal, para deposição direta no esôfago dos animais. Em seguida a inoculação dos
oocistos, foram administrados mais 100 mL de solução fisiológica estéril em cada
animal, para lavagem das paredes da seringa e/ou sonda, onde eventualmente os
oocistos pudessem estar aderidos.
Os taquizoítos foram administrados via subcutânea (na região da paleta),
utilizando-se seringas e agulhas estéreis conforme descrito por BRESCIANI (2003).
Posteriormente, os últimos dois animais foram inoculados com 100 mL de solução
fisiológica estéril, por via oral, constituindo, assim, o grupo controle.
Todos os animais foram mantidos isolados, em baias individuais, no Setor de
Ovinos e Caprinos – CPPAR, durante todo o período experimental. Exames sorológicos
para a detecção de anticorpos contra outras doenças infecciosas que possam provocar
desordens reprodutivas, (brucelose, neosporose e leptospirose) também foram
realizados em todos os ovinos experimentais, pré e pós-inoculação.
3.9 – Exames clínicos
Os reprodutores foram submetidos a exames clínicos (Freqüência cardíaca,
respiratória e temperatura retal), desde o primeiro dia antes da infecção e a cada três
dias até o 14º dia pós-inoculação (DPI). A partir desta data, tais exames passaram a ser
realizados semanalmente até 70º DPI.
3.10 – Determinação da parasitemia
A avaliação parasitêmica em camundongos, segundo a técnica descrita por
OLIVEIRA (1997). Amostras de sangue (10 mL) dos animais inoculados e controles
foram colhidas em tubo estéril contendo EDTA, nas mesmas datas dos exames clínicos.
Após centrifugação (3000 rpm por 15 minutos), a camada leucocitária foi
cuidadosamente aspirada com auxílio de pipeta Pasteur e inoculada,
intraperitonealmente, em grupos de três camundongos. Esses camundongos foram
observados por 15 minutos após as inoculações para avaliar possíveis efeitos adversos
à inoculação. Em seguida, avaliações diárias foram efetuadas até 42 dias pós-
inoculação para verificação de manifestações da infecção toxoplásmica.
Nos animais que apresentaram aumento de volume abdominal ou que morreram
até o 10o DPI, foi pesquisada a presença de taquizoítos de T. gondii por meio da
microscopia do exsudato peritoneal e “imprint” de pulmão dos mesmos. Nos animais
que morreram a partir do 11o até o 42o DPI, realizou-se a pesquisa de anticorpos
séricos contra T. gondii (IFI) (CAMARGO, 1964).
3.11 – Resposta imune humoral
Nos soros de todos os ovinos reprodutores infectados experimentalmente e dos
controles, obtidos um dia anterior à inoculação e nos dias 3, 5, 7, 11, 14 após a infecção
e, semanalmente, até o fim do experimento foram pesquisados anticorpos contra
T.gondii por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI), segundo CAMARGO
(1964).
A colheita de sangue foi feita por meio de punção da veia jugular com agulha 40
x 12 mm. Foram colhidos aproximadamente 10 mL de sangue sem anticoagulante de
cada animal. Este material foi processado para obtenção do soro, sendo centrifugado
por 10 minutos a 3000 rpm. O soro foi retirado com auxilio de pipeta de vidro e
acondicionado em microtubos previamente autoclavados, e mantidos sob congelamento
(-20oC).
Os soros dos ovinos foram diluídos em PBS (1:16 até 1:8192). A diluição de 16
microlitros de cada diluição de cada soro, foram depositados nos poços das lâminas
contendo o antígeno. As lâminas, assim preparadas, foram acondicionadas em câmara
úmida e incubadas a 37oC por 40 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas três
vezes (em tampão PBS, 10 minutos cada vez) e colocadas para secarem (seis minutos
em estufa a 37oC). Posteriormente, adicionou-se o conjugado gamaglobulina anti-IgG
total de ovino marcado com isotiocianato de fluoresceína, e as lâminas foram
novamente incubadas em câmara úmida (37oC por 40 minutos) em estufa. Nova
lavagem por duas vezes foi procedida com tampão PBS e uma vez com água
bidestilada (10 minutos cada lavagem) para remoção do excesso de sais. Após a
secagem definitiva das lâminas, glicerina tamponada foi adicionada às mesmas,
recobertas com lamínulas e examinadas em microscópio de fluorescência (objetiva de
40X).
3.12 – Exames no sistema reprodutor dos ovinos infe ctados experimentalmente
3.12.1- Colheita do sêmen
A cada sete dias, por um período de quatro semanas, os oito ovinos foram
submetidos ao “condicionamento” para a colheita de sêmen, com o uso de eletro-
ejaculador. Dos oito ovinos experimentais foram obtidos ejaculados um dia antes da
inoculação, prosseguindo, no período de 3, 5, 7, 11, 14 e, semanalmente, até o 70º DPI.
Os ejaculados foram recolhidos em tubos graduados acoplados à funis plásticos
previamente esterilizados. Estes foram mantidos a 37ºC e, no momento da colheita,
acoplados a um recipiente aquecido para evitar o choque térmico, que poderia
ocasionar mortalidade dos espermatozóides e alterações morfológicas.
Imediatamente após o término da ejaculação, o tubo contendo o sêmen foi
colocado em banho-maria (37ºC) para garantir a integridade espermática.
3.12.2 Parâmetros espermáticos
3.12.2.1 Motilidade e Vigor
Para avaliação da motilidade (expressa em % de espermatozóides que se
movimentam em trajetória retilínea e para frente) e do vigor (intensidade com que esta
motilidade é exercida), imediatamente após a colheita, uma alíquota do sêmen
(aproximadamente 10µL) foi colocada sobre lâmina e recoberta por lamínula
(previamente aquecidas a 37ºC) e observada ao microscópio óptico (aumentos de 10 e
40X). Os dados foram expressos em porcentagem (motilidade), numa escala de 0 a 5
(vigor), e anotados em fichas próprias para posterior análise.
3.12.2.2 Concentração e volume
Para análise da concentração espermática foram obtidas alíquotas de 5µl,
diluídas em 4.995µl de solução salina formol. A concentração foi estimada por meio da
contagem em câmara de Neubauer, conforme MAIA (1998). O volume seminal
mensurado por meio da observação direta dos tubos graduados.
3.12.2.3 Morfologia espermática
Para a análise da morfologia espermática foram obtidas alíquotas de 50µl,
diluídas em 1 mL de solução salina formol (0,9%). A morfologia seminal, para evidenciar
possíveis patologias espermáticas, foi realizada de acordo com critérios padronizados
por BLOM (1973), utilizando-se de microscopia de contraste de fase, conforme o
Manual de Exame Andrológico e Avaliação de Sêmen Animal do COLÉGIO
BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL (1998).
3.13 – Bioensaio em Camundongos
Para o isolamento de T. gondii das amostras de sêmen (todas as frações)
colhidas, foi utilizada a metodologia proposta por TEALE et al. (1982), modificada.
Foram separadas duas amostras de sêmen (0,5mL cada amostra) de cada animal. Em
0,5 mL da amostra seminal, foi acrescido 0,5mL da solução tampão (PBS), com pH 7,2,
autoclavado e antibiótico (ampicilina, 1 mg/mL). Cinco camundongos foram inoculados,
via intraperitoneal, com 1mL da alíquota espermática diluída. Os camundongos foram
observados e examinados conforme metodologia adotada por OLIVEIRA (1997) e
BRESCIANI (1999).
3.14 – Pesquisa do DNA de T. gondii pela PCR
Alíquotas de 1mL de sêmen (não diluído) de cada animal infectado, foram
devidamente armazenadas para posterior processamento da técnica de PCR (BURG et
al. 1989 e FUENTS et al. 1996).
Escalas de diluição de taquizoítos de T. gondii (cepa RH) foram realizadas,
usando como diluente tampão PBS ou sêmen. Após obtenção dos taquizoítos por
lavagem intraperitoneal dos camundongos, previamente inoculados, a concentração foi
aferida em câmara de Neubauer e o volume final ajustado para 1,0 x 107 taquizoítos/mL
(de PBS ou sêmen ou tecido). A partir desta diluição inicial, 500µL da mesma foram
diluídos em 9,5 mL de água de MiliQ estéril e assim sucessivamente, obtendo-se as
diluições de 107, 106 , 105, 104 , 103 , 102 , 101 e 100 parasitos por mL. O material assim
obtido foi mantido congelado (-20oC) até a extração do DNA.
3.14.1 - Extração do DNA das amostras do controle p ositivo e das amostras de
sêmen e tecidos
Todas as amostras de sêmen (positivas para a presença de T. gondii em
camundongos inoculados) obtidas ao longo do experimento foram avaliadas quanto à
presença do T. gondii pela técnica de PCR.
O DNA de T. gondii das escalas de diluição (controle positivo) e das amostras de
sêmen para a detecção do DNA de T. gondii foi extraído segundo metodologia
preconizada por SAMBROOK & RUSSELL (2001).
Uma alíquota de 100µL (sêmen e tecido) previamente preparado para a extração
de DNA, foi transferida para um microtubo de 1500 µL. A esta, foram acrescidos 900 µL
de tampão PBS, pH 7,2, previamente autoclavado. Após homogeneização, o material
foi então centrifugado (8000 rpm por 6 min) para lavagem, sendo o sobrenadante
removido por inversão. Ao sedimento, foram acrescentados 100 µL de PBS e 400 µL da
solução de lise (2% β-mercaptoetanol, 10 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5%
SDS e 100 mM de NaCl). Após agitação em vortex, a amostra foi incubada em banho
Maria (37oC) por 30 minutos. Foram então adicionados 5µL de Proteinase K (200µg/mL)
e nova incubação em banho Maria (37oC por 12 a 16 horas). Na seqüência, foram
realizadas duas extrações de DNA com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). Em
seguida, foram acrescentados 10% do volume de uma solução de Acetato de Sódio
para precipitação do DNA. Na seqüência, foi adicionado etanol 100%, gelado (duas
vezes o volume). O material foi então agitado levemente com movimentos manuais até
a formação da “medusa” de DNA. Em seguida, o material foi centrifugado (12000-16000
rpm por 20 min), o sobrenadante descartado por inversão e 900µL de etanol 70% foram
acrescidos. O DNA precipitado foi submetido à agitação (vortex) para se desprender o
pellet. Nova centrifugação (12000-16000 rpm por 20 min) e o sobrenadante foi
desprezado por inversão e o tubo contendo o DNA foi deixado a secar de boca para
baixo em papel absorvente. O DNA foi ressuspendido em 50 µL de água miliQ
autoclavada e mantido em temperatura ambiente “overnight” para, em seguida, ser
estocado sob temperatura de congelamento (-20oC) até realização da PCR.
A quantificação do DNA foi realizada por meio de espectrofotometria em
absorbância de 260nm e corrida eletroforética, em gel de agarose 0,8% corado com
brometo de etídio, de 5µL do DNA previamente extraído. Foi utilizado o padrão de peso
molecular λ (50ng/10µL) e, por comparação visual, a quantidade de DNA foi estimada.
3.14.2 – Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para a detecção do DNA de T. gondii nas amostras de sêmen e tecidos
analisadas, foi amplificado um fragmento do gene B1 de T. gondii de 194 pares de
bases (bp) utilizando-se os “primers” 5’–GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3’ (B11) e
5’TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC –3’ (B12), descritos por BURG et al. (1989) e
FUENTES et al. (1996). A reação de polimerização em Cadeia (Polimerase Chain
Reaction) SAIKI et al. (1988) foi feita pela adição de 500ng de DNA molde em um meio
de reação contendo MgCl2 2mM, KCl 50mM, Tris-HCl 10mM pH 9, Triton X-100 0,01%,
dNTPs 0,2mM, 10pmoles de iniciador e 5,0 unidades de TaqDNA polimerase.
Tabela 3 . Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR):
PASSO TEMPO TEMPERATURA (ºC)
1 2 minutos 95
2 1 minuto 95
3 30 segundos 55
4 1 minuto 72
5 35 vezes (passo 2 a 4) -
6 7 minutos 72
7 - 4
As reações foram realizadas em termociclador modelo Mastercycler gradient®
(Eppendorf).
3.14.3 – Eletroforese em gel de agarose para anális e dos produtos amplificados
na PCR
A análise dos produtos amplificados foi feita por eletroforese em gel de agarose
2% preparado em tampão de TAE 1X (Tris-Acetato 40 mM, EDTA 0,1 mM). As
eletroforeses foram realizadas neste mesmo tampão à temperatura ambiente. Géis de
agarose contendo fragmentos de restrição separados por eletroforese foram corados
em solução de Brometo de Etídeo 0,5 µg/mL em água por 20 minutos e observados em
trans-iluminados UV.
3.15 - Pesquisa do Toxoplasma gondii em testículos, epidídimos, vesícula seminal
e próstata dos ovinos reprodutores
3.15.1 – Exames anátomo-histopatológicos nos órgãos reprodutores dos ovinos
Os animais foram necropsiados para realização de exames anátomo-
histopatológicos dos ovinos, inclusive os do grupo controle. Amostras dos seguintes
tecidos foram colhidas para exames histopatológicos e para isolamento de T. gondii por
meio da técnica da bioprova, Imunoistoquímica e PCR: testículos, epidídimos, vesícula
seminal e próstata. Para exames histopatológicos e imunoistoquímica, o material
colhido foi fixado em formol tamponado a 10%, por um período de 24 horas, sendo
então transferido para uma solução de álcool 70%. Em seguida o material foi
emblocado em parafina histológica e armazenado desta forma até a realização dos
exames.
3.15.2 - Bioensaio em camundongos
O bioensaio de amostras de testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata
colhidas, inclusive do grupo controle, foi realizado de acordo com o protocolo descrito
por DUBEY (1998). Os tecidos foram primeiramente cortados em pequenos pedaços,
sendo removidos o tecido conectivo e a gordura. A vesícula seminal e a próstata foram
utilizadas integralmente, enquanto que o testículo e epidídimo foram utilizados para
completar 100g de tecidos. O “pool” de tecidos foi homogeneizado com cinco volumes
de NaCl 0,15M (salina) sendo usado um homogenizador de uso doméstico.
Ao material homogeneizado adicionou-se o mesmo volume de uma solução de
pepsina ácida, pH 1,1 – 1,2 (pepsina, 2,6g; HCl, 7,0mL; água destilada suficiente para
500mL de solução), recém preparada e aquecida em banho-maria a 37ºC. A mistura foi
incubada em estufa a 37ºC por uma hora sobre agitador magnético.
Após a incubação, a suspensão foi coada por meio de duas camadas de gaze, o
coado transferido para cinco tubos cônicos de 50mL e centrifugado a 1.200 giros por 10
minutos. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento de cada tubo foi então
neutralizado pela adição gradual de bicarbonato de sódio a 1,2%, pH 8,3, recém-
preparado (ao redor de 5,0mL por tubo). A neutralização foi percebida visualmente pela
mudança de cor do sedimento. Após homogeneização, o material foi transferido para
um vidro único tubo cônico, completando-se o volume para 50mL com salina, e
centrifugado a 1.200 giros por 10 minutos. Novamente, o sobrenadante foi desprezado
e o sedimento homogeneizado com salina (v/v) contendo 2000U de penicilina e 200ug
de estreptomicina por mililitro.
Imediatamente a amostra foi inoculada em grupo de 15 camundongos.
Esses camundongos inoculados (1mL/camundongo) foram observados
diariamente, por seis semanas (COSTA et al., 1977), para a avaliação da presença de
sinais clínicos da toxoplasmose. Naqueles que apresentaram pêlos eriçados e/ou
aumento de volume abdominal durante este período, foi pesquisada a presença de
taquizoítos de T. gondii no exsudato peritoneal e “imprint” de pulmão. Os sobreviventes
foram exsanguinados para pesquisa de anticorpos (IFI - CAMARGO, 1964) e cistos
cerebrais de T. gondii, em amostras de soros e cérebros dos camundongos
respectivamente.
3.15.3 – Imunoistoquímica em órgãos do sistema repr odutor dos ovinos
Fragmentos de testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata dos ovinos
reprodutores (controle e inoculados), colhidos e processados conforme item 3.15.1,
foram analisados pela Imunoistoquímica para pesquisa de possíveis antígenos de T.
gondii. Para tanto, foi utilizado o método imuno-enzimático de amplificação com o
complexo estrepto-avidina com peroxidase-biotina (Kit LSAB/HRP, Dako, USA)
conforme GUESDON et al. (1979).
Os tecidos incluídos em parafina foram submetidos à microtomia para obtenção
de secções histológicas de 3µm de espessura, estendidas em lâminas silanizadas e
incubadas em estufa a 55oC por seis horas para fixação dos cortes. Os cortes
histológicos foram submetidos a desparafinização em xilol, seguida de banhos em
álcoois gradualmente hidratados (álcool absoluto, álcool a 95%, álcool a 80%) e em
água destilada.
Foi empregado anticorpo policlonal contra T. gondii produzido por MINEO (2002
– comunicação pessoal), cuja diluição otimizada para o ensaio imunoistoquímico foi de
1:5000.
Após desparafinização e hidratação, os cortes foram submetidos a dois banhos
(10 min) em peróxido de hidrogênio a 6%, para bloqueio da peroxidase endógena,
seguidos de lavagens em água destilada e solução tampão (PBS – pH 7,2).
O anticorpo foi diluído a 1:5000 em solução de soroalbumina bovina (BSA) a 1%
em PBS contendo 0,1% de azida sódica. O BSA foi utilizado para o bloqueio de
possíveis ligações inespecíficas entre outras proteínas presentes na solução de
anticorpos e os tecidos em estudo, evitando-se, desta forma, reações espúrias (“de
fundo”).
O anticorpo diluído foi, então, aplicado aos cortes e estes incubados em câmara
úmida a 37oC por 30 minutos e, em seguida, a 4oC por 18 horas. Após este
procedimento, foram realizadas três lavagens em PBS, de 5 minutos cada, seguindo-se
nova incubação com anticorpo biotinilado (solução de anticorpos biotinilados contra
imunoglobulinas de coelho/camundongo/cabra), em câmara úmida a 37oC por 30
minutos. Em seguida, foram realizadas três lavagens em PBS (5 min cada) e o material
foi então incubado com estrepto-avidina-biotina-peroxidase, em câmara úmida a 37oC
por 30 min.
Após nova etapa de lavagens em PBS (3 banhos de 30 min cada), as amostras
foram reveladas por meio de um banho em solução contendo substrato (peróxido de
hidrogênio a 0,1%) e cromógeno (diaminobenzidina 60 mg%, Sigma D5637, USA) em
PBS. Na seqüência, o material foi lavado em água corrente e em água destilada e
submetido a contracoloração com hematoxilina de Harris. Finalizando o procedimento, o
material foi desidratado em álcoois, diafanizado em xilol e montado entre lâmina e
lamínula empregando resina sintética (Entellan, Merck, Germany).
A reação foi acompanhada de controles positivo e negativo, sendo este último
submetido a todas as etapas do procedimento técnico, suprimindo-se, entretanto, a
aplicação do anticorpo primário contra T. gondii. A presença do antígeno foi revelada
pela coloração acastanhada assumida pelo parasita presente no tecido.
3.15.4 Pesquisa do DNA de T. gondii em tecidos pela PCR
Um pool dos respectivos tecidos (testículos, epidídimos, vesícula seminal e
próstata) dos ovinos reprodutores (inoculados e controle) foi realizado conforme item
3.15.2, e devidamente armazenados para posterior processamento da técnica de PCR
conforme item 3.14.2.
4 – ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os parâmetros pré e pós-inoculação foram avaliados por meio de um
delineamento em parcela subdividida no tempo (“Split Plot in Time”), considerando-se
os inoculados e controle. Testes de F, para efeitos dos tratamentos, e de Tukey, para
as comparações entre os tratamentos, foram aplicados. Todas as análises estatísticas
foram realizadas com auxílio do programa SAS, (2001).
5. RESULTADOS
5.1 Obtenção de taquizoítos de T. gondii
Após padronização da técnica para manutenção da cepa “RH” de T.gondii em
camundongos, foi possível obter lavados peritoneais ricos em taquizoítos. Após
avaliação, os mesmos eram inoculados via subcutânea em novos camundongos,
procedendo assim, a cada dois dias a fim de se manter a cepa em condições de uso.
Para obtenção dos inóculos, contendo taquizoítos, destinados aos ovinos
experimentais, camundongos foram eutanasiádos, os taquizoítos recuperados de
lavados peritoneais, padronizados e imediatamente inoculados nos reprodutores.
5.2 Obtenção de cistos cerebrais contendo bradizoít os de T.gondii
Camundongos inoculados intraperitonealmente com a cepa “P” foram medicados
com sulfadiazina, durante 10 dias, para obtenção de maiores quantidades de cistos de
T. gondii. Decorridos 30 dias pós-inoculação, 20 camundongos foram eutanasiádos,
sendo removidos os respectivos encéfalos. A padronização e a quantificação de cistos,
para serem inoculados nos gatos, obedeceram os critérios já descritos anteriormente
nas etapas experimentais executadas.
5.3 Obtenção de oocistos de T.gondii
Do primeiro gato inoculado, via oral, com 1500 cistos cerebrais de T.gondii, foi
possível recolher de suas fezes aproximadamente 1,0 x 106 oocistos esporulados após
somatória dos valores diários, encontrados do quarto até o nono dia pós-inoculação. O
pico de eliminação ocorreu no quarto dia, obtendo-se aproximadamente 485000
oocistos esporulados.
Do segundo gato, inoculado com 885 cistos de T. gondii, foi possível recolher
612500 oocistos esporulados eliminados em três dias (5º, 6º e 7º DPI), ocorrendo o pico
de liberação no sexto dia pós-inoculação .
Os oocistos produzidos foram identificados como de T. gondii por meio de
critérios morfológicos (ZAMAN, 1970) e pela sua infectividade, avaliada por inoculação
intraperitoneal em camundongos (2500 oocistos por animal, totalizando 15
camundongos). Tais camundongos vieram a óbito entre o 10º e o 12º dia pós-
inoculação. No lavado peritoneal de 80,0% dos camundongos que vieram a óbito, foram
encontrados taquizoítos viáveis em quantidades variadas. Os camundongos
sobreviventes, após seis semanas de inoculação, apresentaram cistos cerebrais de T.
gondii.
5.4 Seleção dos ovinos reprodutores
Os resultados dos exames sorológicos realizados em 74 ovinos machos,
relativos à presença de anticorpos contra Toxoplasma gondii, Neospora caninum,
Brucela abortus e Leptospira sorovares pomona, icterohaemorrhagiae e canicula, foi
possível selecionar oito ovinos negativos para as quatro enfermidades supracitadas.
Estes resultados sorológicos encontram-se sumariados na Tabela 4.
Tabela 4 . Resultados sorológicos para Toxoplasmose, Neosporose, Brucelose e
Leptospirose dos ovinos examinados para seleção dos grupos experimentais infectados com Toxoplasma gondii.
Enfermidade avaliada/ nº de ovinos
Resultado da Sorologia Toxoplasmose Neosporose Brucelose Leptospirose
Positiva 39 06 20 13
Negativa 35 68 54 61
Total 74 74 74 74
5.5 Exames clínicos
Durante as quatro semanas que antecederam a inoculação (período de
treinamento para as colheitas de sêmen) não foram observadas quaisquer alterações
clínicas nos ovinos, com relação aos parâmetros de temperatura corporal, freqüências
respiratória e cardíaca, avaliados semanalmente durante esta fase.
Nas Tabelas 5, 6 e 7 e Figuras 1, 2 e 3 estão registrados os dados clínicos
(temperatura corporal, freqüências cardíaca e respiratória, respectivamente) dos
animais, obtidos um dia antes da inoculação e nos dias 1, 3, 5, 7 e, semanalmente, até
o 70º DPI.
5.5.1 Temperatura corporal
A temperatura corporal (retal) média dos ovinos do grupo controle (média
aritmética), nas condições climáticas verificadas durante o experimento, foi de 38ºC.
Considerando que a temperatura normal de ovinos oscila entre 37,5°C e 39,5°C,
adotou-se essa faixa como sinal de normotermia. Analisando-se a média de cada um
dos grupos experimentais, observamos a ocorrência de hipertermia nos ovinos
inoculados com taquizoítos no 3°, 5° e 7° DPI. Nos animais inoculados com oocistos de
T. gondii, o aumento da temperatura corporal foi assinalado, de forma similar, no 5º e 7º
DPI. A Tabela 5 e Figura 1 permitem uma melhor visualização destes resultados.
Tabela 5: Temperaturas retais médias mensuradas nos ovinos experimentais até 70 dias pós- inoculação com T. gondii .
43 38,7 38,3 38,2 38 37,9 38,2 38,3 39,2 38,3 38,5 39,8 38,6 37,9 38,9
44 38,1 38,7 38,4 38 37,8 37,4 37,7 39,1 37,5 38,3 39,1 38,3 37,5 38,5
Média 38,40 38,50 38,30 38,00 37,85 37,80 38,00 39,15 37,90 38,40 39,45 38,45 37,70 38,70
7 39 40 40,7 41 39 38,6 39,2 39,1 38,7 39,2 38,3 39,2 38,3 39
48 39,1 41 40,9 38,7 38,7 39,3 39,3 38,9 39,5 39,1 38,9 38,1 38,1 38,6
52 39,3 39,6 40,3 39,7 39 38,4 38,9 39,3 39 39,4 39,1 39 37,9 38,8
Média 39,13 40,20 40,63 39,80 38,90 38,77 39,13 39,10 39,07 39,23 38,77 38,77 38,10 38,80
2 38,2 37,7 41,9 39,2 38,5 37,9 38,8 39,1 39,6 38,6 39 38,3 38,8 38,5
9 39,3 39,6 41,9 40,6 39,3 38,8 38,9 39,2 38,9 38,8 39 38,9 39,1 38,9
16 39,3 39,3 41,9 40,5 38,8 38,4 38,5 39,2 39,1 39 39,5 38,7 38,8 38,4
Média 38,93 38,87 41,90 40,10 38,87 38,37 38,73 39,17 39,20 38,80 39,17 38,63 38,90 38,60
Taq
uizo
ítos
InóculoOvino
Nº 497 14 7028 35 42
Ooc
isto
s
Temperatura °C/Dias pós inoculação
Con
trol
e
-1 3 5 11 21 56 63
35,0
36,0
37,0
38,0
39,0
40,0
41,0
42,0
43,0
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias pós-inoculação
Tem
pera
turt
a re
tal (
ºC)
Controle (GI) Taquizoíto (GII) Oocisto (GIII)
Figura 1 . Temperaturas retais médias mensuradas nos ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
5.5.2 Freqüência cardíaca
Com base na variação das freqüências cardíacas médias obtidas dos ovinos do
grupo controle, de forma análoga à temperatura corporal, estabeleceu-se, como
parâmetro de freqüência cardíaca, o valor de 84 a 137 batimentos por minuto como
padrão da normalidade.
Para os animais inoculados com taquizoítos, bradicardia pôde ser observada no
56o DPI, sendo que os dias restantes mantiveram-se dentro dos parâmetros de
normalidade. Nos ovinos que receberam oocistos, taquicardia foi registrada no 63o DPI.
Estes resultados também estão registrados na Tabela 6 e Figura 2.
Tabela 6: Freqüências cardíacas médias mensuradas n os ovinos experimentais até 70 dias pós- inoculação com T. gondii.
43 134 174 124 88 100 120 120 80 104 120 120 108 96 160
44 84 100 140 80 100 88 96 108 98 140 96 84 100 108
Média 109,00 137,00 132,00 84,00 100,00 104,00 108,00 94,00 101,00 130,00 108,00 96,00 98,00 134,00
7 76 108 112 90 80 100 100 100 80 152 108 60 100 104
48 152 160 152 120 124 88 116 100 124 128 72 56 80 92
52 124 120 100 148 132 116 96 120 128 120 112 68 88 128
Média 117,33 129,33 121,33 119,33 112,00 101,33 104,00 106,67 110,67 133,33 97,33 61,33 89,33 108,00
2 72 88 62 85 120 96 96 108 106 128 80 104 120 150
9 108 100 152 88 120 92 100 104 112 160 148 136 190 120
16 84 84 156 120 100 92 96 156 124 160 116 148 120 120
Média 88,00 90,67 123,33 97,67 113,33 93,33 97,33 122,67 114,00 149,33 114,67 129,33 143,33 130,00
Ovino Nº
Inóculo42 4914 21 285 7 11
Taq
uizo
ítos
Ooc
isto
s
Frequência cardíaca (bpm)/Dias pós inoculação
-1 353 7056 63
Con
trol
e
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias pós-inoculação
Fre
qüên
cia
card
íaca
(bp
m)
Controle (GI) Taquizoíto (GII) Oocisto (GIII)
Figura 2 . Freqüências cardíacas médias mensuradas nos ovinos não inoculados
(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
5.5.3 Freqüência respiratória
A média da freqüência respiratória detectada nos ovinos do grupo controle foi de
16 a 32 movimentos respiratórios por minuto, sendo esta amplitude indicativa de
normopnéia. Com base nestes dados, taquipnéia foi observada naqueles animais
inoculados com taquizoítos no 3o dia pós-infecção. Nos ovinos que receberam oocistos,
aumento dos movimentos respiratórios ocorreu no 5o dia pós-inoculação. Tais
resultados estão registrados na Tabela 7 e Figura 3.
Tabela 7: Freqüências respiratórias médias mensurad as nos ovinos experimentais até 70 dias pós- inocul ação com T. gondii .
43 28 28 28 28 24 24 28 32 12 24 20 24 28 24
44 20 20 20 24 31 24 24 32 20 16 20 20 24 20
Média 24 24 24 26 27,5 24 26 32 16 20 20 22 26 22
7 20 36 24 20 28 24 24 28 20 28 20 20 28 24
48 36 40 36 28 32 24 32 28 28 28 32 24 32 32
52 20 24 32 24 20 32 24 24 28 16 24 24 28 28
Média 25,33 33,33 30,67 24,00 26,67 26,67 26,67 26,67 25,33 24,00 25,33 22,67 29,33 28,00
2 20 16 20 20 20 24 28 24 20 20 20 20 24 20
9 36 40 40 20 28 24 32 24 28 24 36 32 28
16 24 32 44 24 27 24 24 24 20 24 32 28 28 20
Média 26,67 29,33 34,67 22,00 22,33 25,33 25,33 26,67 21,33 24,00 25,33 28,00 28,00 22,67
6314 21 28 35
Frequencias respiratórias (mpm)/Dias pós inoculação
-1 3 5 7 11 7042 49 56
Con
trol
eT
aqui
zoíto
sO
ocis
tos
Ovino Nº
Inóculo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias pós-inoculação
Fre
qüên
cia
resp
irató
ria (
mpm
)
Controle (GI) Taquizoíto (GII) Oocisto (GIII)
Figura 3 . Freqüências respiratórias médias mensuradas nos ovinos não inoculados
(controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
5.5.4 Outros sinais clínicos
Sinais clínicos, além dos parâmetros vitais (temperatura corporal, freqüências
cardíaca e respiratória), também puderam ser observados durante o experimento. Os
três ovinos inoculados com oocistos apresentaram fezes pastosas, inapetência e apatia
no 5º e 7° DPI, coincidindo com o quadro de hiperte rmia (Figuras 4, e 5).
Figura 4 . Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma gondii no 5º DPI.
Figura 5 . Apatia dos animais inoculados com oocistos de Toxoplasma gondii no 7º DPI.
5.6 Exames do sistema reprodutor dos ovinos infecta dos experimentalmente
5.6.1 Parâmetros espermáticos
Conforme a literatura consultada, o volume de ejaculado considerado normal
para ovinos a partir de dez meses de idade é de, no mínimo, 1,0 mL. No entanto,
considerou-se a média do volume ejaculado dos ovinos do grupo controle,
aproximadamente 1,1 mL, como valor de normalidade. A motilidade espermática, pelos
mesmos critérios, não deve ficar aquém dos 70% dos espermatozóides de um
reprodutor normal e o vigor, determinado por MAIA, (1998), teve seu limite fixado entre
0 e 5.
Diminuição do volume do ejaculado pôde ser observada nos ovinos inoculados
com taquizoítos no 42º DPI e somente no 63o DPI, naqueles que receberam oocistos.
Para os animais inoculados com taquizoítos, diminuição da motilidade
espermática (<70%) foi observada nos 3o, 7o, 11o, 21o, 35o, 42o, 49o, 56o, 63o e 70o DPI
(P>0,05). De forma semelhante, o mesmo ocorreu com o sêmen dos ovinos do grupo
inoculado com oocistos nos dias 3, 5, 7, 35, 42, 49, 63 e 70 pós-inoculação (P>0,05).
No 49º DPI observou-se uma diminuição (P<0,05) na avaliação do vigor dos
espermatozóides nos animais inoculados com taquizoítos, em relação ao grupo
controle. Também foi verificada (no 21º DPI), diferença estatística (P<0,05) no volume
seminal dos animais de ambos grupos inoculados (oocistos e taquizoítos) quando
comparados com aqueles pertencentes do grupo controle.
Os resultados acima descritos podem ser visualizados nas Tabelas 8, 9, 10 e 11
e Figuras 6, 7, 8, 9 e 10.
Tabela 8. Parâmetros seminais e patologias espermát icas de ovinos inoculados com oocistos
Cabeça Cauda
2 4 75 2 117 0 3 Positivo
9 1 40 2 17,6 0 2 Positivo
16 3,5 75 4 15,9 1 2 PositivoMédia 2,83 63,33 2,67 50,17 0,33 2,33
2 1,5 0 0 6 1 2 Positivo
9 1,1 90 5 70 1 1 Negativo
16 3,8 0 0 59,25 0 0 NegativoMédia 2,13 30,00 1,67 45,08 0,67 1,00
2 1,8 20 1 143,4 0 2 Negativo
9 2,4 80 4 226,5 0 3 Positivo
16 2,1 5 0 113,5 0 1 PositivoMédia 2,10 35,00 1,67 161,13 0,00 2,00
2 1,6 40 2 55,5 0 1 Negativo
9 1,7 80 4 103 2 3 Positivo
16 1,5 60 4 125 1 1 NegativoMédia 1,60 60,00 3,33 94,33 1,00 1,67
2 1,5 80 4 202 1 1 Negativo
9 1,5 80 , 4 176 1 1 Positivo
16 0,8 75 4 37,5 4 2 NegativoMédia 1,27 78,33 4,00 138,50 2,00 1,33
2 1,3 80 4 12 0 3 Positivo
9 2 70 3 23 0 2 Positivo
16 1,5 90 5 46 1 2 PositivoMédia 1,60 80,00 4,00 27,00 0,33 2,33
2 1 50 3 35 1 7 Negativo
9 1 80 4 59 0 2 Positivo
16 1 95 5 29 1 1 NegativoMédia 1,00 75,00 4,00 41,00 0,67 3,33
2 2,2 80 4 12,5 0 6 Positivo
9 1 70 4 36,5 0 4 Positivo
16 1,1 90 5 73 0 1 NegativoMédia 1,43 80,00 4,33 40,67 0,00 3,67
2 1 50 2 36 0 10 Positivo
9 1 30 1 27 0 5 Positivo
16 2 90 5 132 0 4 NegativoMédia 1,33 56,67 2,67 65,00 0,00 6,33
2 1,8 10 0 16 1 5 Negativo
9 1 10 0 53 1 2 Negativo
16 1 90 5 24 1 2 NegativoMédia 1,27 36,67 1,67 31,00 1,00 3,00
2 1,7 90 4 216 0 6 Negativo
9 1 80 3 36 1 3 Positivo
16 1 90 4 55 0 1 NegativoMédia 1,23 86,67 3,67 102,33 0,33 3,33
2 1,5 80 4 44 1 4 Negativo
9 1 60 2 56 1 5 Positivo
16 1,2 90 4 18 0 4 NegativoMédia 1,23 76,67 3,33 39,33 0,67 4,33
2 1 70 3 13 1 7 Positivo
9 1 25 3 21 0 4 Positivo
16 0,9 80 4 39,50 0 1 NegativoMédia 0,97 58,33 4,00 24,50 0,33 4,00
2 0,8 50 2 47,7 0 5 Positivo
9 1,2 35 1 18,5 0 4 Positivo
16 1 5 1 40 0 1 NegativoMédia 1,00 30,00 1,33 35,40 0,00 3,33
Parâmetros Seminais
Vigor (0-5)Concentração
(x106 sptz/mL)Celularidade
Patologias (%)
7
11
Volume (mL)
Motilidade (%)
63
70
28
35
42
49
de Toxoplasma gondii .
* Dias pós-inoculação
DPI*Número do
ovino
5
14
21
-1
3
56
Tabela 9. Parâmetros seminais e patologias espermát icas de ovinos inoculados com taquizoítos
Cabeça Cauda7 1 90 4 16,5 1 5 Positivo
48 1,3 75 3 15,25 2 4 Positivo
52 1 85 4 135,5 2 5 PositivoMédia 1,10 83,33 3,67 55,75 1,67 4,67
7 0,4 70 3 20,7 2 4 Negativo
48 1,5 30 2 30 2 1 Positivo
52 1,5 80 3 52 1 1 NegativoMédia 1,13 60,00 2,67 34,10 1,67 2,00
7 1,5 80 3 78,5 1 5 Positivo
48 1 60 3 54,25 0 4 Negativo
52 1 80 3 55,00 0 2 NegativoMédia 1,17 73,33 3,00 62,58 0,33 3,67
7 1,7 60 3 41 0 3 Positivo
48 0,8 5 0 38 0 1 Negativo
52 1,8 80 4 68 0 3 NegativoMédia 1,43 48,33 2,33 49,00 0,00 2,33
7 1,8 85 4 185 2 3 Positivo
48 1 20 , 1 78,5 1 4 Positivo
52 1,4 75 4 150,5 0 2 NegativoMédia 1,40 60,00 3,00 138,00 1,00 3,00
7 1 90 4 91,5 1 2 Negativo
48 1,5 90 5 34 1 1 Positivo
52 1,6 70 4 46,5 1 2 PositivoMédia 1,37 83,33 4,33 57,33 1,00 1,67
7 1,2 85 4 145 1 1 Negativo
48 2 80 4 57 0 3 Positivo
52 1 10 1 5 0 1 PositivoMédia 1,40 58,33 3,00 69,00 0,33 1,67
7 1,4 90 5 23 0 5 Positivo
48 0,8 90 5 54 0 2 Positivo
52 2 90 4 36 0 2 PositivoMédia 1,40 90,00 4,67 37,67 0,00 3,00
7 1,4 10 2 93 0 4 Negativo
48 1,2 90 5 60 0 5 Negativo
52 1,5 40 2 35 1 1 NegativoMédia 1,37 46,67 3,00 62,67 0,33 3,33
7 1 60 3 44 0 2 Positivo
48 0,8 50 2 70 2 4 Positivo
52 0,5 50 0 33 1 2 PositivoMédia 0,77 53,33 1,67 49,00 1,00 2,67
7 0,8 5 1 54 0 2 Positivo
48 1,3 70 3 66 0 4 Positivo
52 2,8 20 2 33,2 0 4 PositivoMédia 1,63 31,67 2,00 51,07 0,00 3,33
7 1,5 90 5 39 1 3 Negativo
48 1 25 1 43 1 2 Negativo
52 2,5 45 3 75,5 1 2 PositivoMédia 1,67 53,33 3,00 52,50 1,00 2,33
7 1 90 5 138 2 4 Negativo
48 1 70 1 25 0 5 Negativo
52 1 35 0 19,40 1 1 NegativoMédia 1,00 65,00 4,00 60,80 1,00 3,33
7 1,3 60 3 45,5 1 5 Negativo
48 0,8 12 0 12 1 4 Negativo
52 1,2 0 0 36 0 1 PositivoMédia 1,10 24,00 1,00 31,17 0,67 3,33
Parâmetros Seminais
CelularidadeMotilidade (%) Vigor (0-5)Concentração (x10 6
sptz/mL)
Volume (mL)
Patologias (%)
3
-1
14
21
56
35
42
28
de Toxoplasma gondii .
* Dias pós-inoculação
DPI*Número do ovino
63
70
11
5
7
49
Tabela 10. Parâmetros seminais e patologias espermá tica de ovinos pertencentes ao grupo controle.
Cabeça Cauda
43 0,3 20 2 14,85 0 0 Negativo
44 1,5 60 2 24,08 1 0 Positivo
Média 0,90 40,00 2,00 19,47 0,50 0,00
43 0,3 60 3 25,85 0 3 Negativo
44 1,8 30 1 11,10 0 1 Negativo
Média 1,05 45,00 2,00 18,48 0,00 2,00
43 0,3 70 3 56,56 1 4 Positivo
44 1 60 2 57,00 0 3 Negativo
Média 0,65 65,00 2,50 56,78 0,50 3,50
43 0,8 40 2 22,5 0 3 Positivo
44 1 90 4 43,50 0 3 Negativo
Média 0,90 65,00 3,00 33,00 0,00 3,00
43 1,4 75 , 4 17,5 1 4 Negativo
44 1,4 65 3 54 2 1 Negativo
Média 1,40 70,00 3,50 35,75 1,50 2,50
43 1 50 3 12,6 2 1 Positivo
44 1 90 5 25,5 1 1 Positivo
Média 1,00 70,00 4,00 19,05 1,50 1,00
43 3 80 4 22,5 3 2 Positivo
44 2 90 4 95 1 1 Positivo
Média 2,50 85,00 4,00 58,75 2,00 1,50
43 0,1 70 3 5 1 2 Positivo
44 1,3 1 0 13,5 1 1 Positivo
Média 0,70 35,50 1,50 9,25 1,00 1,50
43 0,5 50 1 15 0 20 Positivo
44 1,2 40 1 45 0 1 Negativo
Média 0,85 45,00 1,00 30,00 0,00 10,50
43 1 60 2 30 2 4 Positivo
44 1,47 80 4 64 2 4 Positivo
Média 1,24 70,00 3,00 47,00 2,00 4,00
43 0,5 40 5 25 1 4 Positivo
44 0,5 90 4 55 1 1 Positivo
Média 0,50 65,00 4,50 40,00 1,00 2,50
43 0,8 10 2 19 0 2 Negativo
44 1,5 90 4 52 0 2 Positivo
Média 1,15 50,00 3,00 35,50 0,00 2,00
43 0,8 10 0 22 0 3 Positivo
44 1 3 0 67 0 2 Negativo
Média 0,90 6,50 4,00 44,50 0,00 2,50
43 0,9 10 1 35 1 2 Positivo
44 1,2 90 5 46 1 1 Positivo
Média 1,05 50,00 3,00 40,50 1,00 1,50* Dias pós-início do experimento
49
56
21
Parâmetros Seminais
35
42
-1
3
Motilidade (%)
7
63
70
CelularidadeConcentração (x10 6
sptz/mL)Vigor (0-5)
Patologias (%)
28
5
Volume (mL)
11
14
DPI*Número do ovino
Tabela 11. Comparações multiplas e resultados da análise de variância dos parâmetros seminais e patologias espermáticas de ovinos
nos não inoculados (controle) e inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106 taquizoítos de Toxoplasma gondii.
B A B A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab a a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a
B A AB A A A A A A A A A A A A A A A A A Aab ab a a a a ab a a a a a b b a b ab a a a a
B A AB A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a ab a a a a a b ab a b b ab a a a
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a ab a a a a a b ab a a a a a a a
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Aab b a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a a a a a a a b ab a b ab a a a a
A B B A A A A A A A A A A A A A A A A A Aa b a a a a a a a a a a b ab a b a a a a a
A A A A A A B A A A A A A A A A A A A A Ab ab a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a
A A A A A A A A A A A A A B B A A A A A Ab b a a a a ab a a a a a a a a b ab a a a a
A A A A A A A A A A A A A A A A B A A B A ab b a a a a ab a a a a a b ab a a a a a a a
B AB A A A A A AB B A A A A A A A A A A A Ab b a a a a a a a a a a b ab a a ab b a a a
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Aab b a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a
A A A A A A B A AB A A A A A A A A A A A Ab b a a a a b a a a a a b ab a a a a a a a
A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Aab b a a a a ab a a a a a b ab a b ab a a a a
3,64 NS 0,48 NS 0,27 NS 5,97 * 0,01 NS 0,01 NS 0,32 NS
1,35 NS 2,01 * 3,05 ** 3,33 ** 4,17 ** 4,98** 2,82 **
Grupos X Período 2,56 ** Grupos X Período 1,60 NSGrupos X Período 1,64 * Grupos X Período 1,39 NS
Grupos X Período 1,65 * Grupos X Período 1,56 * Grupos X Período 1,78 * *médias seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem entre si pelo Teste Tukey (P>0,05)
Análise de Variância
Grupos
Período
0,50 0,67 0,00
1,00 0,67 0,33
1,00 0,33 1,00
0,50 0,33 0,33
0,50 0,67 0,00
1,00 0,00 1,00
1,00 0,33 0,67
1,00 0,67 1,00
0,00 0,33 0,67
1,00 1,00 0,67
0,50 0,67 0,33
0,50 0,33 0,33
0,50 1,00 1,00
0,00 0,33 0,33
CelularidadeControle Oocistos Taquizoitos
0,90
1,07
0,67
0,90
1,40
1,00
2,50
0,70
0,87
1,23
0,50
1,17
0,90
1,07
2,83 1,10
2,13 1,13
2,10 1,17
1,60 1,43
1,27 1,40
1,60 1,37
Volume
0,97 1,00
1,00 1,10
1,23 1,63
1,23 1,67
1,33
1,67 4,33 4,67
Controle Oocistos Taquizoitos
1,00 1,40
1,43 1,40
4,00 4,00 4,33
4,00 4,00 3,00
3,00 3,33 2,33
3,67 4,00 3,00
2,67
2,67 1,67 3,00
Grupos
21
28
35
42
49
56
1,37
1,27 0,77
Análise de Variância
Val
or d
e F
e
Grupos
Período
Diapós-inoculação
Sig
nific
ânci
a
-1
3
5
7
11
14
63
70
MotilidadeControle Oocistos Taquizoitos
40,00 63,33 83,33
45,00 30,00 60,00
65,00 35,00 73,33
65,00 60,00 48,33
70,00 78,33 60,00
70,00 80,00 83,33
85,00 75,00 58,33
35,50 80,00 90,00
45,00 56,67 46,67
70,00 36,67 53,33
65,00 86,67 31,67
50,00 76,67 53,33
6,50 58,33 65,00
50,00 30,00 24,00
Análise de Variância
Período
Vigor (0 a 5)Controle Oocistos Taquizoitos
2,00 2,67 3,67
2,00 1,67
1,00 2,67 3,00
3,00 1,67 1,67
4,67 3,67 2,00
3,00 3,33 3,00
Análise de Variância
Grupos
Período
0,00 3,33 2,00
3,00 1,33 1,00
19,47 50,17 55,75
18,48 45,08 34,10
Concentração (x106 sptz/mL)Controle Oocistos Taquizoitos
56,78 161,13 62,58
33,00 94,33 49,00
35,75 138,50 138,00
19,05 27,00 57,33
58,75 41,00 69,00
9,25 40,67 37,67
30,00 65,00 62,67
47,00 31,00 49,00
40,00 102,33 51,07
35,50 39,33 52,50
44,50 24,50 60,80
40,50 35,40 31,17
Análise de Variância
Grupos
Período
Patologia de CabeçaControle Oocistos Taquizoitos
0,50 0,33 1,67
0,00 0,67 2,00
0,50 0,00 3,67
0,00 1,00 2,33
1,50 2,00 3,00
1,50 0,33 1,67
2,00 0,67 3,00
1,00 0,00 3,33
0,00 0,00 2,67
2,00 1,00 3,33
1,00 0,33 2,33
0,00 0,67 3,33
0,00 0,33 3,33
1,00 0,00 3,33
Análise de Variância
Grupos
Período
Patologia de CaudaControle Oocistos Taquizoitos
0,50 2,33 4,67
0,00 1,00 2,00
0,50 2,00 3,67
0,50 1,67 2,33
0,00 1,33 3,00
1,00 2,33 1,67
1,00 3,33 3,00
1,00 3,67 3,33
0,50 6,33 2,67
1,00 3,00 3,33
1,00 3,33 2,33
0,33
Análise de Variância
0,50 4,33 3,33
0,50 4,00 3,33
Grupos
Período
1,00 3,33
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias Pós-inoculação
Vol
ume
Esp
erm
átic
o M
édio
(m
L)
Controle Taquizoítos Oocistos
Figura 6 . Volume espermático médio (mL) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0
100,0
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias Pós-inoculação
Mot
ilida
de E
sper
mát
ica
Méd
ia (
%)
Controle Taquizoítos Oocistos
Figura 7 . Motilidade espermática média (%) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias Pós-Inoculação
Vig
or E
sper
mát
ico
Méd
io (0
a 5
)
Controle Taquizoítos Oocistos
Figura 8 . Vigor espermático médio (0 - 5) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
0,0
25,0
50,0
75,0
100,0
125,0
150,0
175,0
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias Pós-Inoculação
Con
cent
raçã
o E
sper
mát
ica
Méd
ia (
x10
8 )
Controle Taquizoítos Oocistos
Figura 9 . Concentração espermática média (x 106) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias pós-inoculação
Pat
olog
ias
Esp
erm
átic
as
Cab
eça
(%)
Controle Taquizoítos Oocistos
Figura 10 . Patologias espermáticas médias de cabeça (%) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70
Dias pós-inoculação
Pat
olog
ias
Esp
erm
átic
as
Cau
da (
%)
Controle Taquizoítos Oocistos
Figura 11 . Patologias espermáticas médias de cauda (%) em ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 1 x 106 taquizoítos ou com 2,0 x 105 oocistos de Toxoplasma gondii.
5.7 Determinação da Parasitemia
De cada amostra sanguínea obtida dos ovinos, três camundongos foram
inoculados intraperitonealmente com camada leucocitária conforme descrito no item
3.10. A parasitemia foi determinada de forma indireta, pela sorologia dos camundongos
inoculados, sendo considerados positivos aqueles que apresentaram títulos sorológicos
≥ 1:64. Desta forma, surtos parasitêmicos foram detectados no 7º, 11º, 35º, 56º e 63º
dis pós-inoculação (DPI) em um ovino inoculado com taquizoítos e no 7º, 21º, 35º e 63º
DPI para animais inoculados com oocistos. Na Tabela 12, estão registrados estes
achados.
Tabela 12. Surtos parasitêmicos detectados em ovino s não infectados (controle) e inoculados com Toxoplasma gondii
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Total
43 - - - - - - - - - - - - - - 0
44 - - - - - - - - - - - - - - 0
Total 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 - - NR Positivo - - Positivo - - - - - Positivo - 3
48 - - - - - - - - Positivo - - - - - 1
52 - - - - - - - - Positivo - - - - - 1
Total 0 0 0 1 0 0 1 0 2 0 0 0 1 0 5
2 - - - - Positivo - - - Positivo - - - - - 2
9 - - - - - - - - - - - - - - 0
16 - - - Positivo - - - - - - - Positivo Positivo - 3
Total 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 5
Positivo = RIFI para T. gondii (≥ 1:64) em camundongos inoculados
– = Sorologia negativa (camundongos)
NR = Não realizado
Taq
uizo
ítos
O
ocis
tos
Nº do Ovino
InóculoBioprova/dias pós-inoculação
Con
trol
e
5.8 Resposta Imune Humoral
As recíprocas dos títulos obtidos por meio da Reação de Imunofluorêscencia
Indireta - IFI (Camargo, 1964), estão expressas na Tabela 13. Verificou-se a
soroconversão (título ≥ 1:16), a partir do 5º DPI nos ovinos inoculados com oocistos e
taquizoítos, respectivamente. Título sorológico máximo (1: 8192) foi detectado no ovino
52 inoculado com taquizoítos (28º DPI). Naqueles que receberam oocistos a recíproca
sorológica máxima foi de 1:4096, foi diagnosticada nos três ovinos no 49º e 56º DPI.
Embora tenham ocorrido alterações nos títulos de anticorpos no decorrer do
experimento, decréscimos acentuados destes títulos foram observados a partir do 63º
DPI nos ovinos do grupo I (oocistos) e II (taquizoítos).
Diferenças estatísticas (P<0,05) foram verificadas nas recíprocas de títulos de
anticorpos contra T. gondii (Tabela 14), em algumas datas pós-inoculação, entre os dois
grupos inoculados (taquizoítos e oocistos).
Os animais do grupo controle não apresentaram anticorpos contra T. gondii ao
longo de todo experimento.
Tabela 13: Recíproca dos títulos sorológicos obtidos pela Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) em
ovinos não inoculados (controle) e inoculados com 2,5 x105 oocistos ou com 1,0 x 106 taquizoítos.
2 9 16 7 48 52 43 44
-1 - - - - - - - -
3 - - - - - - - -
5 16 - 16 - - 16 - -
7 32 - 32 32 32 - - -
11 32 - 32 256 64 64 - -
14 64 32 64 4096 256 256 - -
21 4096 1024 4096 1024 256 256 - -
28 1024 256 256 528 256 8192 - -
35 1024 256 528 528 256 528 - -
42 4096 1024 1024 4096 1024 1024 - -
49 4096 4096 4096 4096 528 4096 - -
56 4096 4096 4096 4096 4096 4096 - -
63 256 256 256 256 528 528 - -
70 256 528 256 528 256 1024 - -
Recíproca dos títulos sorológicosDia pós-inoculação
NR = Não realizado
– = Sorologia negativa
Nº ovino/ oocistos Nº ovino/ taquizoítos Nº ovino/ controle
Tabela 14. Comparações múltiplas e resultados da análise de variância do título sorológico de ovinos
não inoculados (controle) e inoculados com 2,0 x 105 oocistos ou com 1,0 x 106
taquizoítos de Toxoplasma gondii.
A A Aa f eA A Aa f deB A ABa ef d B A A a e c C B A a e abc C B A a de bc C A B a ab ab B A A a bcd bc B A A a abc eB A A a abc ab B A A a a ab B A A a a a B A A a cd bc B A A a bcd abc
147,59 **
53,85 **
Grupos X Período 15,09 ***médias seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não diferem
entre si pelo Teste Tukey (P>0,05)
Recíproca dos títulos sorológicos / Média*=Σlog(x+1)/nControle
Dia pós-inoculação
56
28
35
42
49
Oocistos Taquizoitos
63
70
Val
or d
e F
e
Sig
nific
ânci
a
Período
-1
3
5
7
11
14
21
Análise de Variância
Grupos
0,0000 2,4099 2,6190
0,0000 2,5144 2,7147
0,0000 3,6125 3,3162
0,0000 3,6125 3,6125
0,0000 2,7147 0,0000
0,0000 3,2113 3,2113
0,0000 3,4119 3,0156
0,0000 2,6102 2,6190
0,0000 1,0123 2,8108
0,0000 1,7148 2,6102
0,0000 0,8203 1,0123
0,0000 1,0123 2,0119
0,0000 0,0000 0,0000
0,0000 0,0000 0,4101
5.9 Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos (Bioprova)
Foi possível detectar a presença de T. gondii por meio da comprovação
sorológica (Figura 12) e presença de cistos cerebrais (Figura 13) em camundongos no
5º, 11º, 14º, 21º, 49º, 56º e 70º dias pós-inoculação de taquizoítos e no 14º, 35º, 42º,
49º, 56º e 63º DPI de oocistos (Tabela 15).
Figura 12 . Taquizoítos fluorescentes de Toxoplasma gondii (IFI). Soro de camundongo inoculado com amostra seminal de ovino infectado com taquizoítos. Obj. 20x.
Figura 13 . Cisto de Toxoplasma gondii em cérebro de camundongo inoculado com sêmen de ovino infectado com oocistos. Obj. 40x.
Tabela 15. Pesquisa de T. gondii em camundongos inoculados com amostras seminais oriun das dos reprodutores ovinos não
inoculados (controle) e inoculado s com oocistos ou taquizoítos.
-1 3 5 7 11 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Total
43 - - - - - - - - - - - - - - 0
44 - - - - - - - - - - - - - - 0
Total 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 - - Positivo* - - - - - - - NR - - Positivo* 2
48 - - - - - Positivo* - - - - - - - - 1
52 - - - - Positivo* - Positivo* - - - Positivo* Positivo* - - 4
Total 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 7
2 - - - - - Positivo* - - - Positivo* - - Positivo* - 3
9 - - - - - - - - Positivo* - - Positivo* Positivo* - 3
16 - - - - - - - - - - Positivo* - - - 1
Total 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 7
Positivo* = RIFI para T. gondii (≥ 1:64) e presença de cistos cerebrais em camundongos inoculados
– = Sorologia negativa (camundongos)
NR = Não realizado (amostra seminal insuficiente)
Ovino N O InóculoBioprova/dias pós-inoculação
Con
trol
e T
aqui
zoíto
s
Ooc
isto
s
5.10 Pesquisa do Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos pela PCR
Das amostras seminais positivas na sorologia (IFI) e bioprova em camundongos
(presença de cistos cerebrais), foi possível detectar a presença de T. gondii pela técnica
da PCR no 11º, 14º, 21º, 56º e 70º dias pós-inoculação de taquizoítos e no 14º, 35º,
42º, 56º e 63º DPI de oocistos. A Figura 13 ilustra o produto de PCR amplificado de 194
bp (pares de base) para as datas supracitadas, indicando a presença/ausência do
parasita.
Figura 14. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir de amostras seminais dos ovinos experimentalmente infectados. (1) Marcador de peso molecular DNA Ladder (100bp). (2) Sêmen do ovino 02 (14 dias pós-inoculação). (3) Sêmen do ovino 09 (35 dias pós-inoculação). (4) Sêmen do ovino 02 (42 dias pós-inoculação). (5) Sêmen do ovino 16 (49 dias pós-inoculação). (6) Sêmen do ovino 09 (56 dias pós-inoculação). (7) Sêmen do ovino 02 (63 dias pós-inoculação). (8) Sêmen do ovino 09 (63 dias pós-inoculação). (9) Sêmen do ovino 07 (05 dias pós-inoculação). (10) Sêmen do ovino 52 (11 dias pós-inoculação). (11) Sêmen do ovino 48 (14 dias pós-inoculação). (12) Sêmen do ovino 52 (21 dias pós-inoculação). (13) Sêmen do ovino 52 (49 dias pós-inoculação). (14) Sêmen do ovino 52 (56 dias pós-inoculação). (15) Sêmen do ovino 07 (70 dias pós-inoculação). (16) Controle positivo. (17) Controle negativo.
1 2 3 5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
2,072
1,500
600
194 100
Kb
5.11 Exames anatomopatológicos (necropsias)
Nos ovinos inoculados com T. gondii e nos não inoculados (controle),
necropsiados ao 78º DPI, não foram observadas lesões anatomopatológicas.
5.12 Exames histopatológicos
Os exames realizados não permitem visualizar alterações sugestivas de
toxoplasmose nos ovinos inoculados, e nem foi detectada a presença de T. gondii por
meio desta técnica.
5.13 Pesquisa do Toxoplasma gondii em tecidos dos reprodutores ovinos
5.13.1 Bioprova
Foi possível detectar o parasitismo tissular por T. gondii (bioensaio) IFI positiva e
presença de cistos cerebrais de T. gondii em camundongos inoculados com tecidos dos
ovinos 09 e 16 (infectado com oocistos) e 07 (infectado com taquizoítos).
5.13.2 Imunoistoquímica
Os resultados da Imunoistoquímica estão descritos na Tabela 14 e nas Figuras
14 e 15 as quais ilustram marcação antigênica, característica de reações positivas.
Tabela 16 . Parasitismo tissular detectado pela técnica de Imunoistoquímica em
testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata de ovinos inoculados
com 2 x 10 5 oocistos ou 1 x 10 6 taquizoítos de Toxoplasma gondii.
Tecidos Nº do
Ovino Grupo
Testículos Epidídimos Vesícula
Seminal Próstata
Total de
positivos
02 Oocistos Neg Neg Pos Pos 2
09 Oocistos Neg Pos Pos Pos 3
16 Oocistos Neg Pos Pos Pos 3
Total 0 2 3 3 8
07 Taquizoítos Neg Neg Pos Neg 1
48 Taquizoítos Neg Neg Neg Pos 1
52 Taquizoítos Neg Neg Neg Pos 1
Total 0 0 1 2 3
43 Controle Neg Neg Neg Neg 0
44 Controle Neg Neg Neg Neg 0
Total 0 0 0 0 0
Neg -Negativo
Pos – Positivo
Figura 15 . Próstata demonstrando imunomarcação ao Toxoplasma gondii. Ovino
inoculado com oocistos de Toxoplasma gondii. Obj. 40x.
Figura 16 . Vesícula seminal demonstrando agrupamento de taquizoítos com
imunomarcação ao Toxoplasma gondii. Ovino inoculado com taquizoítos de Toxoplasma gondii. Obj. 40x.
5.13.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A Figura 16 ilustra a presença/ausência do DNA de T. gondii do “pool” de tecidos
(testículos, epidídimos, vesícula seminal e próstata) de cada animal. Nas amostras
analisadas, somente aquelas dos ovinos 09 e 16 (inoculados com oocistos) e 07
(inoculado com taquizoítos), respectivamente, foi verificada a presença de T. gondii por
meio da técnica de PCR.
Figura 17. Eletroforese em gel de agarose 2% de produto da reação em cadeia da polimerase (PCR), a partir do “pool” das amostras de tecidos (testículos, vesícula seminal, próstata e epidídimos) dos ovinos experimentalmente infectados. (1) Marcador de peso molecular DNA Ladder (100bp). (2) Ovino 02 (inoculado com oocistos). (3) Ovino 09 (inoculado com oocistos). (4) Ovino 16 (inoculado com oocistos). (5) Ovino 07 (inoculado com taquizoítos). (6) Ovino 48 (inoculado com taquizoítos). (7) Ovino 52 (inoculado com taquizoítos). (8) Ovino 43 (controle). (9) Ovino 44 (controle). (10) Controle positivo. (11) Controle negativo.
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6. DISCUSSÃO
A infecção toxoplásmica dos ovinos reprodutores utilizados nesta pesquisa, após
a inoculação de taquizoítos ou oocistos de T. gondii, confirmou-se pela parasitemia e
também pela soroconversão de todos os animais inoculados (Tabelas 12 e 13). Sinais
clínicos como hipertermia, apatia, anorexia e fezes amolecidas, foram observadas nos
animais que receberam oocistos (cepa P) entre o 5º e 7º DPI (Figuras 4 e 5). Nos
animais inoculados com taquizoítos observou-se, de modo geral, um quadro
assintomático.
COLE et al. (1954), utilizando-se de uma amostra de T. gondii isolada de um
caso natural, inocularam 10 ovelhas e três cordeiros. O período de incubação variou de
um a seis dias, e os sinais clínicos mais freqüentes em nove ovelhas e nos três
cordeiros foram febre, dispnéia e incoordenação motora. A infecção foi fatal em duas
ovelhas e em um cordeiro.
GARNHAN & LAISON (1960) infectaram cordeiros com duas semanas de idade,
com aproximadamente 100 cistos de T. gondii (cepa não mencionada), pelas vias
intraperitoneal (IP), endovenosa (EV) e oral (VO). Sinais clínicos não foram observados,
mas de duas semanas até nove meses pós-inoculação, anticorpos contra-Toxoplasma
foram detectados, utilizando-se a reação de Sabin & Feldman, nos ovinos inoculados.
DUBEY (1986) relata que as manifestações clínicas da toxoplasmose
experimental em ovinos são influenciadas principalmente pela patogenicidade da cepa
e dose do inóculo. Além disso, características individuais dos animais, como resistência
do hospedeiro, também parecem influir na manifestação clínica da toxoplasmose. Outro
aspecto a ser considerado, são as cepas de T. gondii (P e RH) utilizadas no presente
trabalho, uma vez que, nenhuma referência sobre a utilização destas cepas em ovinos
foi detectada na literatura, o que dificulta uma discussão mais profunda.
A detecção do T. gondii na corrente sanguínea (parasitemia) dos ovinos
experimentais foi verificada de forma indireta, por meio de soroconversão dos
camundongos inoculados com camadas leucocitárias. Os surtos parasitêmicos
ocorreram em cinco dos seis ovinos inoculados. Dos 10 picos de parasitemia
detectados, três foram entre o 7º e 11º DPI, três no 35º e outros três entre o 56º e 63º
DPI (Tabela 12). A alta freqüência de surtos parasitêmicos, observadas nesta pesquisa,
pode estar relacionada à susceptibilidade do hospedeiro frente às cepas empregadas
(P e RH). Resultados semelhantes foram observados por DUBEY & SHARMA (1980),
que inocularam ovinos com oocistos via oral (cepa GT-1). Detectaram parasitemia nos
sete ovinos no 6º e 11º DPI. TEALE et al (1982) de oito ovinos inoculados, recuperaram
T. gondii (parasitemia) somente em dois, sendo um no 21º e outro no 26º DPI.
A utilização da IFI para o diagnóstico e levantamentos epidemiológicos de
infecção toxoplásmica tem tido aceitação universal, tanto para espécie humana como
para outras espécies animais, principalmente por ser considerada de fácil execução e
boa sensibilidade (ARAÚJO et la., 1998). Além disso, os antígenos de superfície de T.
gondii parecem ser comuns a diferentes cepas do protozoário e apresentam papel
predominante na reação de imunofluorescência indireta (BEKNER DA SILVA et al.,
1994). Embora a IFI não seja adequada para distinguir sorologicamente diferentes
amostras de T. gondii (a técnica de Western & Blot é mais indicada para esta função),
ela foi eleita para avaliação da resposta imune humoral dos ovinos do presente estudo.
A infecção experimental em ovinos com T. gondii desencadeou um resposta
imunológica rápida, com detecção de anticorpos a partir do 5º DPI, conforme pode ser
observado na Tabela 13. Esta precocidade na resposta humoral em infecções
experimentais de T. gondii, foi também detectada por SCARPELLI (2001) em bovinos,
MOURA (2004) em suínos e por ARANTES (2005) em cães. BERVERLEY & WASTON
(1971), estudando um rebanho de 22 ovelhas com histórico de aborto natural há mais
de um ano, observaram títulos de anticorpos (detectados por meio do teste de Sabin &
Feldman) de 1:1024 (cinco fêmeas), 1:256 (nove fêmeas), 1:64 (seis fêmeas) e 1:16
(duas fêmeas).
A curva de IgG observada neste experimento (Tabela 13 e 14) teve seu início a
partir do 5º DPI (ovinos 02 e 16 inoculados com oocistos e o reprodutor 52 inoculado
com taquizoítos) todos apresentando títulos de 1:16. Picos de 1:4096 foram atingidos
pelos seis animais inoculados no 28º DPI. O ovino 52, infectado com taquizoítos, atingiu
título de 1:8192 nesta mesma data pós-inoculação. Convém salientar que a resposta
imune humoral (para os seis animais inoculados) permaneceu em patamares elevados,
do 21º ao 56º DPI, decrescendo posteriormente. Estes achados harmonizam-se com os
relatados por SHARMA & SHIMIZU (1974), citados por DUBEY (1986). Estes autores
relatam que anticorpos relacionados à infecção crônica (IgG) apresentam a capacidade
de manterem “ativos” por longo período (até 70º DPI no presente trabalho), quando
comparados com as imunoglobulinas da classe IgM, notadamente identificadas apenas
nas primeiras semanas após infecção.
A avaliação espermática é largamente utilizada no manejo reprodutivo de
diversas espécies animais, sendo considerada de extrema importância para o
monitoramento de ovinos reprodutores. Frequentemente realiza-se tal avaliação, como
exame de rotina em animais selecionados para acasalamento, ou como meio de
diagnóstico de alterações da esfera reprodutiva (VANNUCHI et al., 1998).
Diminuição no volume do ejaculado e no vigor dos espermatozóides pode ser
constatada em algumas datas pós-inoculação, nos animais dos grupos I e II (oocistos e
taquizoítos respectivamente) (Tabelas 8, 9 e 11). Semelhantemente, TEALE et al.
(1982) também avaliaram a qualidade espermática (concentração por meio da análise
visual da densidade e motilidade) para estudar possíveis influências do T. gondii nas
funções reprodutivas. É importante ressaltar que, embora alterações e variações
tenham sido observadas, no presente ensaio, estas foram aleatórias, não podendo ser
impingidas ao T. gondii. Outro fator que também pode ter contribuído para diminuição
do volume e da motilidade, pode ter sido as elevadas temperaturas constatadas ao
longo do experimento, à semelhança do ocorrido em outros estudos (KUNAVONGKRIT
& PRATEEP 1995; KUO et al., 1997 e MOURA, 2004).
PRIETO et al. (1996) e OWSIANNY et al. (1998) afirmam, ainda, que os
parâmetros seminais e a morfologia espermática podem ser influenciados por diversos
fatores, tais como: causas infecciosas (ex.: vírus da síndrome respiratória), condições
climáticas e até mesmo por características fenotípicas como tamanho/volume testicular.
Alterações anatomopatológicas decorrentes da infecção toxoplásmica induzida,
não foram observadas no presente estudo. Achados necroscópicos, inclusive
histológicos, descritos em diversos experimentos comprovam a existência de
controvérsias no que concerne aos resultados poderem ou não ser atribuídos ao T.
gondii
A primeira notificação de isolamento de T. gondii em amostras seminais de
ovinos, encontrada na literatura, pertence a SPENCE et al. (1978). DISKO et al. (1971)
tiveram sucesso na tentativa de recuperação deste agente em amostras seminais de
três de 125 homens com infecção toxoplásmica natural. SPENCE et al (1978), TEALE
et al. (1982) e AGANGA et al. (1988) pesquisando amostras seminais de ovinos,
DUBEY & SHARMA (1980) em caprinos, SCARPELLI (2001) em bovinos, MOURA
(2004) em suínos e ARANTES (2005) em caninos, obtiveram resultados positivos, pela
bioprova detectando T. gondii nos ejaculados colhidos de animais experimentalmente
infectados.
Os resultados do presente trabalho constituem a primeira descrição do
isolamento de T. gondii de amostras seminais de ovinos experimentalmente infectados,
utilizando-se de duas técnicas (bioprova e PCR) (Tabela 15 e Figura 13
respectivamente). Os autores supramencionados isolaram T. gondii apenas pela
bioprova. A despeito das diferentes cepas, inóculos e vias de infecção, os resultados
referentes à recuperação do protozoário de amostras seminais (neste trabalho)
parecem discordar com alguns autores, principalmente em relação ao período em que
se logrou êxito. SPENCE et al. (1978) inocularam T. gondii (cepa não descrita) em dois
ovinos e detectaram sêmen infectado no 20º DPI de um dos animais e no 25º DPI do
segundo ovino. Em um segundo experimento, T. gondii foi isolado de um dos ovinos de
forma constante, do 7º ao 32º DPI. Do outro animal, estes autores conseguiram
recuperar o agente somente em duas ocasiões (14º e 32º DPI).
Ainda em ovinos, TEALE et al. (1982) inocularam seis animais com 2000 cistos
cada (cepa não mencionada), pela via subcutânea. A presença de T. gondii nas
amostras seminais dos carneiros foi observada em três dos seis animais inoculados, em
duas ocasiões para cada um dos ovinos (16º e 26º DPI). Também em ovinos, AGANGA
et al. (1988), na Nigéria, num trabalho envolvendo inoculação de reprodutores ovinos
(cepa TS-1), puderam recuperar T. gondii em amostras seminais colhidas no 21º DPI de
todos os machos infectados.
Em caprinos, DUBEY & SHARMA (1980) inocularam, por via oral, 104 oocistos
da cepa GT-1 (isolada de caprinos), e conseguiram detectar T. gondii no sêmen por
meio do bioensaio (bioprova), durante um período mais prolongado (do 7º ao 59º DPI).
Os autores basearam-se na sorologia positiva e na presença de cistos cerebrais dos
camundongos inoculados com amostras seminais dos animais experimentalmente
infectados com T. gondii.
SCARPELLI (2001) na espécie bovina, detectou em amostras seminais o T.
gondii (cepas P e RH), por meio da bioprova, em diversas datas pós-inoculação (do 7º
ao 84º DPI). Entretanto, a técnica de PCR não foi tão sensível/específica na detecção
do parasito no sêmen de bovinos experimentalmente infectados. Semelhantemente
MOURA (2004), em suínos, obteve pouco sucesso no emprego da PCR para detecção
de T. gondii no sêmen de cachaços infectados experimentalmente. Por outro lado, este
autor isolou T. gondii em amostras seminais de reprodutores experimentalmente
infectados (cepas P e RH respectivamente), no 3º, 49º e 56º DPI de um suíno inoculado
com oocistos, no 5º e 49º DPI de outro cachaço inoculado com taquizoítos e no 49º DPI
de um terceiro suíno infectado também com taquizoítos. Pesquisando o DNA
toxoplásmico por meio da PCR, detectou o coccídio no 84º DPI em amostras de dois
suínos (um inoculado com oocistos e outro com taquizoítos de T. gondii).
Em cães, ARANTES (2005) isolou T. gondii (bioprova) em ejaculados de dois
dos três inoculados com taquizoítos (no 7º e 21º DPI, nas amostras seminais do cão 01
e no 35º DPI nos ejaculados do cão 24). Nos animais inoculados com oocistos, a
presença do parasito foi detectada em amostras seminais apenas do cão 31 no 7º DPI.
Utilizando a técnica da PCR, detectou o DNA de T. gondii no sêmen do cão 01
(inoculado com taquizoítos) no 7º, 21º e 35º DPI (detectados também pela bioprova).
Nas amostras seminais do cão 24 (inoculado com taquizoítos), o DNA do parasito foi
detectado no 35º DPI, confirmando os achados da bioprova das mesmas amostras. A
amostra seminal do cão 31 (inoculado com oocistos) não se mostrou positiva para T.
gondii por meio da PCR.
No presente trabalho, pela bioprova (Tabela 15) isolou-se T. gondii em
ejaculados dos três ovinos inoculados com taquizoítos (no 5º e 70º DPI nas amostras
do ovino 07, no 14º DPI do reprodutor 48 e no 11º, 21º, 49º e 56º DPI do ovino 52). Nos
ovinos que receberam oocistos, a presença do parasito também foi detectada em
amostras seminais dos três ovinos inoculados (no 14º, 42º e 63º DPI do ovino 02, 35º,
no 56º e 63º DPI do número 09 e no 49º DPI do ovino 16). Utilizando a técnica da PCR,
para amostras seminais positivas na bioprova, detectou-se o DNA de T. gondii (Figura
13) no sêmen dos ovinos inoculados com taquizoítos no 70º DPI (ovino 07), no 14º DPI
(ovino 48) e no 11º, 21º e 56º DPI (ovino 52). Nas amostras seminais dos reprodutores
inoculados com oocistos, o DNA do parasito pode ser detectado no ovino 02 (14º, 42º e
63º DPI) e no macho 09 (35º e 56º DPI). Amostras seminais (positivas na bioprova) dos
ovinos 07 (5º DPI), 52 (49º DPI), 09 (63º DPI) e 16 (49º DPI) não se mostraram
positivas para T. gondii por meio da PCR (Figura 13).
Salienta-se que, além de todos reprodutores (inoculados) produzirem anticorpos
contra-Toxoplasma, e amostras seminais mostraram-se positivas para T. gondii
(bioprova e PCR), foi possível, ainda, isolar este coccídio por meio da bioprova e da
técnica de PCR (Figura 16), no “pool” de tecidos (testículos, epidídimos, vesícula
seminal e próstata) de dois ovinos infectados experimentalmente com oocistos (ovino
02 e 16) e um inoculado com taquizoítos (ovino 07).
A ausência de positividade de parasitismo, detectada pela PCR, de algumas
amostras genômicas seminais e do “pool” tecidual dos ovinos infectados
experimentalmente, a possibilidade de T. gondii estar presente nas mesmas não pode
ser descartada, uma vez que parte destes possa ter sido perdido com a técnica de
extração de DNA, além de que, 500ng de DNA “genômico” (hospedeiro+parasito) por
reação, pode conter uma baixa quantidade de DNA do parasito, que pode ser
insuficiente para visualizar a amplificação de 194 bps no gel de eletroforese 2% corado
com brometo de etídeo (DUBEY & THULLIEZ, 1993; ESTEBANREDONDO et al 1999 e
AQUIZERATE et al 1993). Alguns autores afirmam que a técnica da PCR pode ser um
método vantajoso, quando associado a outro meio de diagnóstico (STEUBER et al 1995
e ELLIS 1998).
Deste modo, os achados da PCR apenas reforçam os achados da bioprova e
evidenciam que esta técnica pode ser uma ferramenta auxiliar no diagnóstico da
infecção toxoplásmica. Neste trabalho, um segmento de 194 bps do gene B1 de T.
gondii foi amplificado, uma vez que este gene está presente em pelo menos 35 lócus do
genoma de T. gondii e por ser amplamente conservado nos várias cepas analisadas
(BURG et al., 1989 e FUENTES et al., 1996).
Recentemente, um fragmento do DNA de T. gondii de 529 bps, que se repete
entre 200 a 300 vezes no genoma do parasito, foi mapeado, o que possivelmente
amplia a sensibilidade do teste. Este fragmento apresentou sensibilidade variando de
idêntica a dez vezes superior, dependendo do tipo de material utilizado, quando
comparado com os resultados da PCR empregando-se o gene B1 (HOMAN et al. 2000).
O gene B1, porém tem seu uso mais difundido na pesquisa do T. gondii, a partir de
diversos tecidos e fluídos.
GARNHAM & LAIHSOM (1960) notificaram o primeiro relato de T. gondii em
tecidos de ovinos. Tais ovinos foram inoculados com cistos e eutanasiádos no 112º DPI
(três animais) e no 150º DPI (um ovino). T. gondii foi isolado no cérebro, musculatura
esquelética, coração e fígado pelo bioensaio em camundongos.
JACOBS et al. (1963) isolaram T. gondii de 67% dos ovinos sorologicamente
positivos, sendo que o diafragma foi o tecido mais parasitado, seguido pela musculatura
esquelética e cérebro. WORK (1967) na Dinamarca realizou tentativas de isolamento de
T. gondii em diafragma de 30 ovinos, dos quais sete se mostraram positivos. HARTLEY
& MOYLE (1974) isolaram T. gondii em 14 de 15 cordeiros com infecção congênita.
Neste caso, cérebro e musculatura esquelética apresentaram-se positivos para este
parasito. Em oito ovinos inoculados com 10.000 oocistos da cepa GT-1, eutanasiádos
no 97 º e 173º DPI, DUBEY (1984) verificou a presença de T. gondii no coração de sete
destes animais, diafragma, fígado e musculatura esquelética em seis ovinos e quatro
animais apresentaram o cérebro parasitado por este protozoário.
7. CONCLUSÕES
Dos resultados obtidos, por meio do delineamento experimental executado, as
seguintes conclusões puderam ser extraídas.
a) A infecção toxoplásmica dos ovinos inoculados com oocistos ou
taquizoítos, ficou comprovada pela parasitemia e também pela produção de anticorpos
contra Toxoplasma gondii.
b) Foi possível registrar alterações na temperatura retal (hipertermia) e apatia
nos ovinos infectados com oocistos de Toxoplasma gondii.
c) Embora alterações na qualidade e morfologia do sêmen tenham sido
observadas ao longo do experimento, estas foram aleatórias não podendo ser
atribuídas à infecção toxoplásmica.
d) Toxoplasma gondii pode ser isolado no sêmen dos ovinos inoculados, por
meio da bioprova e pela técnica de PCR.
e) Parasitismo tissular por Toxoplasma gondii foi diagnosticado nos ovinos
inoculados, por meio da bioprova, PCR e imunoistoquímica.
f) O isolamento de Toxoplasma gondii no sêmen dos ovinos infectados
experimentalmente, associado ao parasitismo tissular em fragmentos do sistema
reprodutor (bioprova, PCR e imunoistoquímica) sugerem a viabilidade da transmissão
venérea deste coccídio.
8. REFERÊNCIAS
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