ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CELULAR DE

BOVINOS NATURALMENTE INFECTADOS COM

MYCOBACTERIUM BOVIS E AVALIAO DE VACINA DE

SUBUNIDADE PROTICA PARA TUBERCULOSE EM

CAMUNDONGOS

Ediane Batista da Silva Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis

GOINIA 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS ESCOLA DE VETERINRIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL

ii

EDIANE BATISTA DA SILVA

ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CELULAR DE

BOVINOS NATURALMENTE INFECTADOS COM

MYCOBACTERIUM BOVIS E AVALIAO DE VACINA DE

SUBUNIDADE PROTICA PARA TUBERCULOSE EM

CAMUNDONGOS

Tese apresentada para obteno do grau de Doutor em Cincia Animal junto Escola de Veterinria da Universidade Federal de Gois

rea de concentrao: Patologia, Clnica e Cirurgia Animal

Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis

IPTSP/UFG

Comit de Orientao: Prof. Dr. Andr Kipnis - IPTSP/UFG

GOINIA 2008

iii

DEDICATRIA

Aos meus pais que sempre deram asas aos meus sonhos, permitindo-me voar. Pelo

amor e apoio incondicional dedico.

iv

O sbio l livros mas l tambm a vida. O universo um grande livro, e a vida uma grande escola (Lin Yutang)

v

AGRADECIMENTOS

Sempre acreditei que no importa o ponto de chegada, mas o caminho percorrido. Sendo

assim, considero essa conquista uma longa trajetria, que seria praticamente impossvel, caso no

tivesse o apoio de algumas pessoas e instituies ao longo do rduo e maravilhoso mundo da cincia.

Em primeiro lugar agradeo ao PAI criador pela vida, pelos amigos, pelas dificuldades, pela

f, pela perseverana e por me fazer acreditar que seria capaz de romper os limites scio-econmicos e

chegar ao doutorado. Agradeo por todas as coisas boas que tenho recebido e pela sabedoria para

entender o que momentaneamente foi ruim, mas que fizeram parte do aprendizado.

Agradeo minha maravilhosa, compreensiva e grande famlia. Especialmente aos meus

avs, pelo cuidado de sempre. Aos pais e irmos pelo amor incondicional.

minha querida orientadora, Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis, uma das pessoas

mais incrveis e inteligentes que j conheci. Agradeo profundamente por compartilhar to

generosamente o seu conhecimento e a sua amizade. Obrigada pela oportunidade de aprendizado

dirio da pura cincia com tica e sabedoria. Sou eternamente grata por cada incentivo nos vrios

momentos difceis e pela proeza de me fazer acreditar que estava no caminho certo, alm das chances

de nos deixar tentar errar e acertar. Suas distintas qualidades a minha fonte de respeito e

admirao.

Ao co-orientador Prof. Dr. Andr Kipnis, pelas sugestes neste trabalho, pela disposio e

boa vontade em ajudar sempre que solicitado.

Aos amigos do laboratrio de imunopatologia das doenas infecciosas: Eduardo, Rafael,

Arioldo, Joo, Hidelbrando, Hrica, Michelle, Cristina, Loanda, Cinthya, Mayara e Rogrio, pelas

crticas e agradvel convivncia durante esses anos de doutorado. Agradeo especialmente a

acadmica de Biomedicina Bruna Daniella da Silva Souza, a pequena grande cientista, pelo prazer

em trabalharmos juntas e dividir as coisas boas e as que no saiam como o esperado durante a

realizao de experimento.

minha amiga Karyne Oliveira Coelho, que desde sempre me incentivou e me fez enxergar

possibilidades onde aparentemente ningum as notavam. No poderia deixar de agradec-la pelo

carinho, crticas construtivas e pelos vrios momentos que somente ela poderia me resgatar da

introspeco e trazer um pouco de conforto para a alma. Foi muito importante o seu apoio na minha

jornada acadmica e portanto para a construo dessa tese.

companheira, quase irm, Liliana Borges de Menezes pela amizade desde o inicio da

minha vida acadmica, quando nem pensava na possibilidade de fazer cincia. Pela presena em todo

vi

os momentos de alegria e tristeza, pela compreenso e opinies sensatas e por sempre estar disposta a

auxiliar em qualquer circunstncia ou situao.

Aos mestres que foram fonte de admirao e motivo de superao de cada dificuldade e aos

professores que fizeram parte da banca de qualificao. Profa. Dra. Andrea Caetano da Silva, Prof.

Dr. Adilson Donizeti Damasceno, Profa. Dra. Mara Silva Carvalhares e Profa. Dra. Wilia Marta

Elsner D. Brito pelas criticas e sugestes oportunas.

Rosana Rezende Moraes in memorian pela primeira oportunidade dada no

acompanhamento de uma pesquisa. A English Teachear Linne pela perseverana no ensinamento do

ingls, que foi de suma importncia em algumas conquistas da minha vida. A amiga Beatriz Kipnis

pela assistncia na fala e escrita em Ingls.

Aos amigos que embora no participaram ativamente da elaborao desse trabalho, mas me

deram apoio moral, estando do meu lado em qualquer ocasio: Vernica, Elcimar, Vitria, Mara e

Eduardo.

Ivete Moura, Alline de Paula Reis e Marco Silva e que ajudaram na coleta.

AGRODEFESA, na pessoa dos mdicos veterinrios William Vilela e Carla Geovanna

Nunes de F. L. Coelho, pela parceria no Programa de Controle e Erradicao da Brucelose e

Tuberculose, sem os quais seria impossvel o desenvolvimento deste trabalho. Aos proprietrios que

permitiram a coleta de sangue e acompanhamento do abate de seus animais.

universidade Federal de Gois e ao Programa de Ps Graduao em Cincia Animal da

Escola de Veterinria. CAPES pela bolsa de doutorado e pelo projeto CAPES-MS-CUBA que

viabilizou a concluso desse projeto.

A todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao desse trabalho, muito

obrigada.

vii

SUMRIO

CAPTULO 1- CONSIDERAES GERAIS ...................................................... 1

1 INTRODUO ................................................................................................ 1

2 Aspectos gerais sobre tuberculose bovina ...................................................... 2

3 Aspectos gerais da resposta imune em tuberculose bovina............................ 4

4 Resposta imune inata infeco por Mycobacterium bovis ............................ 6

5 Resposta imune efetora infeco por Mycobacterium bovis ........................ 7

5.1 Subpopulaes de clulas T envolvidas na tuberculose bovina ................... 9

5.1.1 Linfcitos TCD4+ ....................................................................................... 9

5.1.2 Linfcitos TCD8 ....................................................................................... 10

5.1.3 Linfcitos T ........................................................................................... 11

5.2 Principais citocinas e outras clulas envolvidas na resposta imune ao M.

bovis ................................................................................................................. 12

5.2.1 IFN- ........................................................................................................ 12

5.2.2 TNF- ...................................................................................................... 14

5.2.3 Interleucina-2 (IL-2) ................................................................................. 14

5.2.4 Interleucina-4 (IL-4) ................................................................................. 15

5.2.5 Interleucina-12 (IL-12) ............................................................................. 15

5.2.6 Macrfagos .............................................................................................. 15

5.2.7 Natural Killer (NK) ................................................................................... 16

6 Formao de granulomas.............................................................................. 17

7 Principais antgenos de Mycobacterium bovis reconhecidos na resposta

imune ............................................................................................................... 19

8 Mtodos de diagnstico para tuberculose bovina ......................................... 21

8.1 Identificao do agente .............................................................................. 24

8.1.2 Diagnstico molecular ............................................................................. 25

8.1.2.1 Reconhecimento de cido nuclico ...................................................... 25

8.1.3 Diagnsticos imunolgicos ..................................................................... 27

8.1.3.1 Reao de Hipersensibilidade .............................................................. 27

8.1.3.2 Testes laboratoriais baseados nos componentes do sangue (clulas,

molculas e soro) ............................................................................................. 30

9 Vacinas contra Mycobacterium tuberculosis ................................................ 33

vii

viii

9.1 Vacinas com microrganismos vivos (BCG, M. tuberculosis) ...................... 34

9.2 Vacinas de DNA e subunidades ................................................................. 35

9.3 Vacinas com vetores vivos ......................................................................... 38

10 Objetivo ....................................................................................................... 38

10. Referncias Bibliogrficas .......................................................................... 39

CAPTULO 2- The use of MPT-51, BCG and Ag85 as antigen in an ELISA for

the diagnosis of bovine tuberculosis ................................................................. 68

CAPTULO 3- Bovinos tuberculosos, naturalmente infectados, apresentam

clulas TCD4+IL-4+ especficas preservando a produo de xido ntrico pelos

macrfagos....................................................................................................... 86

CAPTULO 4- Eficcia do antgeno MPT-51 recombinante na vacinao contra

Mycobacterium tuberculosis ........................................................................... 106

CAPTULO 5- CONSIDERAES FINAIS .................................................... 132

ix

LISTA DE ABREVIATURAS

Gama-Delta

72F Protena de fuso de 72 kDa

Ag85 Antgeno 85

BAAR Bacilo lcool cido Resistente

BCG Bacilo de Calmette e Gurin

CD Domnios de diferenciao cellular

CFP10 (Rv3874) Protena do filtrado de cultura de 10 kDa

CpG DNA cido desoxiribonuclico contendo citidina fosfato guanosina

CTLs Linfcito T CD8 citotxico

DNA cido desoxiribonucleico

DOT Tratamento diretamente observado

ELISA Ensaio Imunoenzimtico

GroES Rv3418c Malato Sintetase do Mycobacterium tuberculosis

ESAT-6, Antgeno de secreo primria de 6 kda

TNF- Fator de necrose tumoral-alfa

HIV Virus da Imunodeficincia Humana

HPLC Cromatografia lquida de alta performace

HSP Protena do choque trmico

IFN- Interferon-gama

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

IL Interleucina

IS 610 e 1087 Seqncia de insero IS6110 e IS1081,

KDa Kilodalton

LPS Lipopolissacardeo

LTB Enterotoxina lbil da Escherichia coli

MDR Multi Droga Resistente

MHC Molcula de Histocompatibilidade Principal

MPB64 Protena de M bovis de 64 kDa

MPB70 Protena de M bovis de 70 kDa

x

MPB83 Protena de M bovis de 83 kDa

MPT-51 (Rv3803c) Protena de M tuberculosis 51

MPT64 Antgeno de M. tuberculosis

Mtb drrC Genes presentes no M. tuberculosis que codificam peptdeos

similares ao transportadores ABC

NK Natural killer

NO xido ntrico

NOS2 xido ntrico sintetase 2

O.D. Densidade ptica

OIE Organizao Internacional de Epizootias

OMS Organizao Mundial de Sade

PBMC Clulas mononucleares do sangue perifrico

PBS Salina Tamponada com Fosfato

PCR Reao da Polimerase em Cadeia

PPD-A Derivado de protena purificada de Mycobacterium avium

PPD-M Derivado de protena purificada de Mycobacterium bovis

RD-1 Regio de Diferena 1

rRNA cido Ribonuclico Ribossmico

SPSS Pacote de Anlise Estatstica para Cincias Sociais

TB MDR Tuberculose multi droga resistente

TB PNA FISH Fluorescncia de hibridizao in situ de peptdeo de cidos

nucleicos de M. tuberculosis

TB10.4 Antgeno de M. tuberculosis de 10.4 kDa

TB27.4 Antgeno de M. tuberculosis de 27.4 kDa

TCD4+ Linfcito T com marcador de superfcie CD4

TCD8+ Linfcito T com marcador de superfcie CD8

TCR Receptor de clula T

TGF- Fator transformador-beta de crescimento

Th Linfcito T helper

TPX Tireodoxine peroxidase

TTI Teste de Tuberculina Intradrmico

UFC Unidade formadora de colnia

xi

TB XDR Tuberculose super droga resistente

WHO Organizao Mundial de Sade

http://www.euro.who.int/

xii

RESUMO

Nesta tese foram avaliados vrios aspectos da tuberculose bovina e do

Mycobacterium bovis. Primeiro caracterizou-se a imunogenicidade do MPT-51,

Ag 85 e BCG em ensaio imunoenzimtico, onde foram utilizadas 208 amostras

de soro de animais TTI positivo e 54 amostras de bovinos negativos. O BCG-M.

bovis e o Ag 85 foram fortemente reconhecidos pelos anticorpos dos bovinos

naturalmente infectados. Segundo correlaciounou-se o estado clnico do animal

positividade ao teste intradrmico, com a produo especfica de IL-4 por

linfcitos TCD4+ e TCD8+ e a produo de xido ntrico por macrfagos do

sangue perifrico de bovinos naturalmente infectados com tuberculose. Foi

observado que os bovinos TTI positivos apresentaram clulas CD4+IL-4+

especficas para extrato protico de M. bovis-BCG. Observaram-se altos nveis

basais de linfcitos TCD8+IL-4+ independente de estmulos nos animais

reatores. Quando as culturas foram estimuladas com extrato protico de BCG,

no houve diferena quanto produo de NO. Os bovinos tuberculosos,

naturalmente infectados, apresentaram clulas TCD4+IL4+ especficas para M.

bovis-BCG, preservando a produo de NO pelos macrfagos. Finalmente, a

imunogenicidade do MPT-51 como vacina de sub-unidade protica foi avaliada

em camundongos BALB/c, testando o MPT-51 com dois adjuvantes, o

incompleto de Freund e o CpG DNA. Os camundongos foram imunizados e

posteriormente desafiados com M. tuberculosis. No pulmo, a imunizao com

antgeno rMPT-51 a 20g/ml + adjuvantes de Freund Incompleto e CpG DNA

induziu aumento da migrao de clulas TCD5+IFN- + especficas para o MPT-

51 para o local da infeco, quando comparados com o controle (p

xiii

ABSTRACT

Several aspects of the bovine tuberculosis were analyzed in this study. The

immunogenicity of recombinant MPT-51 (rMPT-51), Ag-85 and M. bovis-BCG

were characterized in an immunosorbent assay, where 208 serum samples

from positive intradermal tuberculin test (ITT) animals and 54 serum samples

from ITT negative animals where analyzed. M. bovis-BCG and Ag-85 were

strongly recognized by antibodies from naturally infected cattle. Additionally, the

clinical status of the animals were correlated with the ITT positivity, with the

specific production of IL-4 by TCD4 and TCD8 positive lymphocytes, and with

nitric oxide (NO) production by macrophages from naturally tuberculosis

infected bovine peripheral blood. ITT positive animals showed TCD4+IL4+ cells

specific to M. bovis-BCG extract. High background levels of TCD8+IL-4+

lymphocytes were observed in ITT positive animals independent of the stimuli.

When cell cultures where stimulated with M. bovis-BCG protein extract, there

was no observed difference in NO production between the groups. Naturally

tuberculosis infected bovine presented TCD4+IL4+ cells specific for M. bovis-

BCG and a preserved NO production. Finnally, the immunogenicity of rMPT-51

use as a proteic sub-unit vaccine was evaluated in BALB/c mice, with two

different adjuvants, incomplete Freund and CpG DNA. For this, mice were

immunized and challenged with M. tuberculosis. Immunization with rMPT-51

antigen and either adjuvant induced, in the lungs, a migration increase of

TCD5+IFN + cells specific for rMPT-51, when compared to controls (P

CAPTULO 1- CONSIDERAES GERAIS

1 INTRODUO

A tuberculose uma das mais antigas enfermidades conhecidas e

at os dias atuais continua ameaando a sade do homem e dos animais.

Sabe-se que um tero da populao mundial est infectada pelo Micobacterium

tuberculosis e estima-se que a cada ano ocorre oito milhes de novos casos,

causando 3 milhes de mortes em humanos e infeco de 300 milhes de

bovinos.

Para controle e erradicao dessa enfermidade dos rebanhos

bovinos mundiais e diminuio do risco potencial sade humana, so

necessrios diagnsticos e mtodos preventivos eficazes alm de abate dos

animais reagentes. Nesse sentido, requer-se um amplo conhecimento da

resposta imunolgica ao Mycobacterium bovis, pois, a forma pela qual a

resposta imune est envolvida no progresso da doena crucial para a

compreenso da tuberculose bovina.

A partir do estudo da resposta imune tuberculose e principalmente

devido falta de praticidade e elevado nmero de resultados falso-positivo e

falso-negativo do teste intradrmico de tuberculina (TTI), pesquisamos um teste

baseado na resposta imune humoral. O ensaio imunoenzimtico utilizou trs

antgenos para aplicao no diagnstico da tuberculose bovina.

Uma vez que a proteo infeco realizada principalmente pela

resposta imune celular, estudou-se tambm as clulas TCD4+IL-4+ e TCD8+IL-

4+ e a produo de xido ntrico pelas clulas mononucleares para

compreenso da funo dessas clulas e molculas durante a enfermidade.

Entendendo-se a necessidade de controlar a tuberculose antes da

sua instalao nos indivduos realizou-se um protocolo de vacinao utilizando-

se uma subunidade protica, o MPT-51, adicionada a dois adjuvantes com o

propsito de avaliar o controle da infeco quando os camundongos eram

desafiados com Mycobacterium tuberculosis e com perspectivas de aplicar

esse protocolo de imunizao em bovinos e humanos no combate da

tuberculose nos animais e em humanos.

2

2 Aspectos gerais sobre tuberculose bovina

A tuberculose bovina (TB bovina) uma enfermidade crnica

caracterizada por leses granulomatosas, associadas principalmente ao trato

respiratrio e aos linfonodos (NEILL et al., 1994).

A doena causada por Mycobacterium bovis (M. bovis) e possui

distribuio mundial, ocorrendo principalmente em pases em desenvolvimento

e em criaes intensivas, como em rebanho leiteiro. BELCHIOR (2001)

encontraram prevalncia geral de 5% de rebanhos positivos e 0,8% de animais

positivos para tuberculose bovina no estado de Minas Gerais. A maior

freqncia de casos de tuberculose bovina concentra-se na Amrica do Sul,

que tambm detm a maior populao bovina. Na Amrica Latina e Caribe

existem aproximadamente 300 milhes desses animais, dos quais 73,7% esto

alojados em reas com prevalncia de tuberculose maior do que 1%. Estima-se

que o Brasil e a Argentina juntos possuam 3,5 milhes de bovinos infectados

pelo bacilo da tuberculose, espalhados por todo o territrio, o que representa

quase 2% da populao existente nesta rea (KANTOR & RITACCO, 1994).

Atualmente j se encontra em execuo o Programa Nacional de

Controle e Erradicao de Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), cujo objetivo

diminuir o impacto negativo dessa zoonose e promover a competitividade da

pecuria nacional. J que de acordo com as notificaes oficiais, o pas ainda

mantm uma prevalncia mdia nacional de 1,3% (no perodo de 1989 a 1998).

No existem dados oficiais acerca da prevalncia da tuberculose em dias

atuais no Estado de Gois (LAGE et al., 2006).

Ao avaliar os principais fatores de risco associados tuberculose

bovina, GONALVES (1998) citou o confinamento de animais por longos

perodos e o intenso trnsito de bovinos para a compra e venda desses

animais.

O diagnstico dessa enfermidade pode ser feito in vivo pelo exame

clnico e o teste tuberculnico intradrmico; ou post-mortem por exames

histopatolgico e bacteriolgico, que incluem isolamento do agente por tcnicas

padres e avanadas (HAAGSMA, 1995). At o presente, segundo o Manual

Tcnico do PNCEBT (2006) o diagnstico padro para a tuberculose bovina o

TTI, cujo princpio avaliar a resposta de hipersensibilidade tardia mediada por

3

linfcitos T sensibilizados, em animais previamente expostos ao bacilo da

tuberculose.

A principal via de infeco dos bovinos adultos atravs da inalao

de partculas de aerosol e a via digestiva o principal mecanismo de

contaminao dos bezerros (LAGE et al., 2006), no entanto, o processo da

exposio ao bacilo e o desenvolvimento da doena no esto totalmente

esclarecidos (POLLOCK, et al., 2006).

Quando a via de infeco ocorre pelo trato respiratrio, por meio de

aerossis, o pulmo o rgo primeiramente atingido, assim como os

linfonodos regionais. Na primo infeco pulmonar os bacilos se alojam no

tecido, promovendo uma reao inflamatria, denominada pneumonia. A

doena se instala basicamente nos pulmes, formando ndulos caseosos, de

tamanhos variados, atingindo todo o parnquima pulmonar e formando leses

cavitrias. Quando a resistncia orgnica do animal baixa ocorre

disseminao do agente pelo parnquima pulmonar, por via area ou pela via

hematgena, alcanando os linfonodos regionais e formando metstases em

outros rgos. No foco inicial ocorre infiltrao celular, necrose de caseificao

e circunscrio da leso, que pode evoluir para resoluo e calcificao. J

quando a penetrao do bacilo pela via digestiva, a leso inicial se d no stio

de entrada, principalmente nos linfonodos farngeos e mesentricos.

Entretanto, pode atingir praticamente todos os rgos quando ocorre a

generalizao do processo (PRITCHARD, 1988; OREILLY & DABORN, 1995).

Aps a infeco por M. bovis observa-se na leso uma infiltrao de

clulas mononucleares, incluindo macrfagos e linfcitos (CASSIDY et al

2001). Sendo que os macrfagos so as primeiras clulas onde ocorre o

crescimento intracelular de M. bovis, seguido pela deposio do bacilo na

superfcie respiratria, posteriormente outras clulas do sistema imune inato e

adquirido so envolvidas (NEILL et al., 2001).

Quanto associao da resposta imune e o desenvolvimento da

enfermidade, o comeo da resposta imune celular est associado com o

desenvolvimento de leses visveis. A progresso de leso est associada com

o elevado potencial de transmisso da doena (CASSIDY et al., 1998;

McCORRY et al., 2005).

4

3 Aspectos gerais da resposta imune em tuberculose bovina

A resposta imune ao M. bovis uma complexa interao entre

patgeno-hospedeiro e o conhecimento detalhado dessa interao, nos

bovinos naturalmente infectados, limitado. Alguns estudos da resposta imune

tm sido realizados em modelos experimentais (BOOM, 1996; POLLOCK et al.,

2001).

Estudos imunohistolgicos de leses granulomatosas em bovinos,

causados pela infeco experimental de M. bovis, indicam que as clulas T so

as primeiras clulas envolvidas nessa reao (CASSIDY et al., 2001).

POLLOCK et al. (2001) afirmaram que a resposta imune mediada por clulas

importante tanto nos animais natural quanto nos experimentalmente infectados.

Segundo POLLOCK et al. (1996), todos os tipos de linfcitos T ( ,

CD4 e CD8) esto envolvidos na resposta imune anti-micobacteriana nos

bovinos. Os autores acrescentaram ainda que a importncia da defesa contra

patgenos intracelulares estabelecida na resposta imune Th1 que

caracterizada pela produo de IFN- , cuja presena essencial para a

ativao da funo microbicida de macrfagos.

Nos bovinos infectados com M. bovis, as clulas TCD4+ de memria

so a populao celular dominante na produo de IFN- , que levam ativao

de macrfagos com capacidade anti-microbiana. As clulas TCD8+ de memria

tambm tm sido identificadas como importantes produtoras de IFN- (HOPE et

al., 2000; SMYTH et al., 2001), alm de estarem envolvidas na lise de clulas

infectadas (LIBANA et al., 2000; SKINNER et al., 2003). Segundo SMYTH et

al. (2001), as clulas T so tambm fonte potencial de IFN- , apesar de

menor liberao quando comparadas aos linfcitos TCD4+. Entretanto h

evidncias de que os linfcitos T faam uma ligao entre o sistema imune

inato e o adaptativo (KENNEDY et al., 2002). Segundo POLLOCK et al. (1996)

e CASSIDY et al. (2001), os linfcitos T- esto presentes no estgio inicial da

infeco e no incio da formao da leso granulomatosa.

Apesar do predomnio da resposta imune celular, existem pesquisas

importantes quanto participao da resposta imune humoral (FIFIS et al.,

1994; LYASHCHENKO et al., 1998). Segundo LYASHCHENKO et al. (1998), a

5

resposta imune humoral de bovinos experimentalmente infectados, envolve

mltiplos antgenos que so reconhecidos pelos animais em diferentes estgios

da doena.

As citocinas exercem papel importante na determinao da resposta

imune infeco. MOSMANN & COFFMAN (1989) afirmaram existir o

paradigma da resposta Th1/Th2. Segundo os autores, a diferena no perfil das

citocinas deve-se induo de diferentes aspectos do sistema imune. Nesse

sentido, tem sido postulado que durante os estgios iniciais de infeces

micobacterianas, h a predominncia da resposta imune mediada por clulas;

no entanto, com o progresso da doena pode ser observada uma alterao da

relao Th1/Th2, que se associa a uma fase onde a produo de anticorpos

predominante (Figura 1) (RITACCO et al., 1991).

Figura 1: Representao dinmica da resposta imune de bovinos ao

M. bovis. A resposta imune mediada por clulas desenvolve-se inicialmente e a humoral apresenta-se com o aumento da carga bacilar.

Fonte: Adaptado de POLOCK & NEILL (2002).

6

4 Resposta imune inata infeco por Mycobacterium bovis

Aps o bacilo entrar e ultrapassar as barreiras fsicas do trato

respiratrio, os macrfagos alveolares fagocitam as micobactrias e

geralmente as destroem, dependendo da capacidade microbicida intrnseca

dos fagcitos do hospedeiro e ainda dos fatores de virulncia dos bacilos

ingeridos. As micobactrias que escapam da destruio intracelular se

multiplicaro, causando a ruptura dos macrfagos. Esse evento culminar com

a infiltrao de clulas inflamatrias no tecido pulmonar e crescimento de

bacilos nos moncitos (FLINN et al., 2001; VAN CREVEL et al., 2002).

A endocitose dos bacilos da tuberculose envolve muitos receptores

que podem se ligar a micobactria no opsonizada ou reconhecer opsoninas

na superfcie do bacilo (SCHLESINGER, 1993; HIRSCH et al., 1994; ADEREM

& UNDERHILL, 1999)

Os receptores Toll-like so mediadores da imunidade inata

filogeneticamente conservados essenciais para o reconhecimento

micobacteriano em macrfagos e clulas dendrticas, que tem funo de

ativao dos fagcitos. Entretanto, a interao entre Mycobacterium sp. e

macrfagos complexa (FLYNN et al., 2001). Estudos in vitro usando TLR2

e/ou TLR4 expressos em macrfagos, relataram evidncias de que as clulas

so ativadas via tais receptores independente da CD14 (MEANS et al., 1999).

Vrios componentes micobacterianos, incluindo AraLAM (complexo

micolilarabinogalactan-peptidioglicano) e lipidio total de micobacteria podem

ativar macrfagos a produzirem TNF- dependente de TLR2 (ADEREM &

UNDERHILL et al., 1999).

Os macrfagos e clulas dendrticas so clulas envolvidas na

resposta imune inata micobactria. Essas so as clulas responsveis pela

apresentao do antgeno e assim para o incio da imunidade adaptativa. As

primeiras molculas de MHC II apresentam a protena micobacteriana para a

clula TCD4+ antgeno especfica. A molcula de MHC I apresenta para os

linfcitos TCD8+ antgeno especfica (MAZZACCARO et al.,1996; GELUK et al.,

2000; CHO et al., 2000).

7

5 Resposta imune efetora infeco por Mycobacterium bovis

A resposta ao patgeno bacteriano intracelular, tal como ocorre com

o Mycobacterium sp. denominada de hipersensibilidade tardia ou

hipesensibilidade do tipo IV (DANNENBERG, 1993).

Os macrfagos interagem com a bactria e se ativam produzindo

quimiocinas e citocinas, as quais tm potencial para controlar infeces

micobacterianas. A partir dessa interao o bacilo pode ser destrudo e

eliminado do hospedeiro ou ainda tornar-se quiescente. Nesse caso, poder

levar ao desenvolvimento de tuberculose ativa ou ser reativado da dormncia

em estgios futuros oportunos (WELSH et al., 2005).

As clulas T respondem aos antgenos micobacterianos com

expanso clonal, levando ao desenvolvimento de populaes celulares de

memria (MONAGAHAN et al., 1994). A partir dessa etapa ocorre a liberao

de citocinas tais como interleucina-2 (IL-2), TNF- , interleucina-12 (IL-12) e

IFN- que so responsveis pela ativao de macrfagos (WOOD et al., 1991;

ONULLAIN et al., 1997).

Acreditava-se que somente os peptdeos derivados de protenas de

Mycobacterium sp, eram apresentados s clulas T, em molculas de

complexo de histocopatibilidade principal de classe I ou II (MHC I ou II).

Entretanto, tem-se demonstrado que estruturas no proticas como lipdeos

micobacterianos, podem ser reconhecidos pelas clulas T de humanos em

molculas de MHC no polimrficas como CD1 (PORCELLI et al., 1992;

ROSAT et al., 1999). Essa via diferente para apresentao de antgenos

micobacterianos, ainda necessita de maiores estudos nos bovinos.

A imunidade mediada por clulas de grande importncia no

controle de patgenos intracelulares. Na tuberculose, a funo de proteo tem

sido atribuda s clulas TCD4+, TCD8+ e T (FLYNN & CHAN, 2001). Esse

papel tem sido comprovado a partir de experimentos em camundongos, nos

quais se observou que animais em que linfcitos TCD4+ e TCD8+ eram

ausentes apresentam maior susceptveis infeco por M. tuberculosis

(BEHAR et al., 1999; CARUSO et al., 1999; FLYNN & CHAN, 2001).

8

Quanto cintica dos linfcitos na resposta imune celular ao M.

bovis, em animais experimentalmente infectados, existe o envolvimento, a

princpio de clulas T , posteriormente linfcitos TCD4+ e nas infeces

crnicas h participao proeminente do linfcito TCD8+ (POLLOCK et al.,

1996). Em camundongos, uma semana aps a infeco com M. tuberculosis, o

nmero de linfcitos TCD4+ e TCD8+ aumenta nos linfonodos associados ao

pulmo, demonstrando que as duas clulas envolvidas devem atuar nas fases

iniciais da infeco (FLYNN & CHAN, 2001).

JOARDAR et al. (2002) estudaram a dinmica da resposta immune

mediada por clulas tuberculose bovina e observaram que a resposta maior

entre a 9, e 20, semanas ps-infeco. A presena inicial das clulas T foi

seguida pela predominncia de TCD4+ e finalmente pelas TCD8+. A atividade

efetora dos linfcitos foi observada durante a 9 e 20 semanas. J a resposta

citotxica foi evidente na 12 semana ps-infeco. A cintica das citocinas

liberadas quando avaliadas in vitro tais como a IL-2 e IFN- elevaram-se entre

a 9 e 20 semanas ps-infeco.

Quanto a quantidade de bacilos necessria para causar leso,

McCORRY et al. (2005) estudaram dois grupos de bovinos, sendo um grupo de

bezerros infectado com elevada dose (106 CFU) e outro grupo com baixa dose

(104CFU) de M. bovis. Decorridos 6 meses aps a infeco, os animais foram

sacrificados e submetidos ao exame post-mortem. Para cada animal foi

atribudo um escore, baseado na existncia das alteraes patolgicas. Os

animais infectados com altas doses tiveram maior escore e desses, 18% foram

positivos para M. bovis quando realizou-se swab nasal e posterior isolamento

do microorganismo.

A caracterizao do desenvolvimento de alteraes patolgicas nos

bovinos foi estudada por CASSIDY et al. (1999), infectando bovinos jovens

experimentalmente com M. bovis. Vrios parmetros de desenvolvimento da

resposta imune celular em diferentes estgios da doena foram observados.

Segundo os autores, a produo do IFN- foi anterior ao desenvolvimento da

resposta proliferativa dos linfcitos e a primeira leso granulomatosa foi

evidente aps a resposta proliferativa dos linfcitos.

9

5.1 Subpopulaes de clulas T envolvidas na tuberculose bovina

Estudos direcionados tuberculose humana e em modelos murinos

de infeco tm indicado que diversas subpopulaes de clulas T apresentam

funes importantes, na resposta imune anti-micobacteriana (POLLOCK et al.,

2001). As clulas TCD4+, MHC II restritas, tem sido consideradas clulas chave

na resposta imune micobacteriana. Entretanto, as clulas TCD8+ e MHC I

restritas, tambm apresentaram funo protetora contra esse tipo de

microorganismos (BEHAR et al., 1999). Os linfcitos TCD4+ e TCD8+

expressam receptores de antgenos (KUNG, 1987). Nenhuma dessas

subpopulaes de linfcitos T poder repor a funo anti-micobacteriana de

outras (CARUSO et al., 1999).

Nos bovinos, tem sido designada uma terceira subpopulao de

linfcitos, o T , que desempenha importante funo de proteo contra

agentes mycobacterianos (VESOSKI et al., 2004). Esses linfcitos so CD3+ e

expressam TCR (BRENNER et al., 1986; KUNG, 1987).

5.1.1 Linfcitos TCD4+

Segundo LIBANA et al. (1999), as clulas TCD4+ de bovinos

infectados por M. bovis proliferam na presena de antgenos micobacterianos.

Essas clulas produzem citocinas, que ativam macrfagos infectados para

destruir a bactria intracelular.

Outra possvel funo dos linfcitos TCD4+ a sua atividade citoltica

contra moncitos infectados com micobactrias, sendo esta j observada em

humanos e em camundongos (TAN et al., 1997). Contudo, esse mecanismo

efetor ainda no conclusivo com dados obtidos a partir de estudo nos bovinos

(LIBANA et al., 2000). SKINNER et al. (2003) avaliaram a atividade citoltica

dos linfcitos T na defesa contra infeco na tuberculose bovina. Os autores

observaram que as clulas citolticas possuem habilidade especfica para lisar

macrfagos infectados com M. bovis, entretanto, os principais linfcitos com tal

atividade foram os TCD8+.

Quanto avaliao da ativao de clulas TCD4+ em infeco

tuberculosa, sabe-se que em camundongos, as clulas TCD4+ que esto

presentes no local da infeco por M. tuberculosis, possuem um fentipo

10

ativado, definido pelo aumento da expresso de CD25, CD44 e CD69 e

diminuio da expresso de CD62L (ANDERSEN & SMELEGAARD, 2000

JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2005). Nos bovinos, em resposta ao derivado de

protena purificada (PPD), clulas TCD4+ infectadas por M. bovis apresentam

tambm CD25 e CD44 e diminuem a expresso de CD62L.

5.1.2 Linfcitos TCD8+

Assim como os linfcitos TCD4+, os TCD8+ de bovinos infectados

por M. bovis proliferam significativamente na presena de antgenos

micobacterianos, entretanto, essas clulas respondem no apenas ao M. bovis

intacto, mas tambm ao seu antgeno solvel (LIBANA et al., 1999).

A principal funo efetora dos linfcitos TCD8+ a lise de clulas

infectadas, o que resulta na liberao do patgeno no ambiente extra-celular.

Posteriormente, a bactria poder ser apreendida e destruda por macrfagos

recm ativados (KAUFMANN, 1998).

Estudos realizados por VILLARREAL-RAMOS et al. (2003)

demonstraram que as clulas TCD8+ desempenham relevante funo na

resposta ao M. bovis, na secreo de IFN- . Essa citocina crucial na ativao

de macrfagos e este por sua vez tem ao importante no desfecho da

tuberculose, ou seja, na formao do granuloma e no controle do crescimento

micobacteriano (VILLARREAL-RAMOS et al., 2003).

Estudos realizados por DELIBERO et al. (1988) demonstraram que

as clulas T CD8+ podem induzir atividade tuberculosttica nos macrfagos da

medula ssea. O papel funcional dos CTLs na imunidade contra infeces

intracelulares o de matar as clulas infectadas via granulo-exocitose, que

pode liberar uma ou mais molculas efetoras com a capacidade de matar

diretamente o patgeno microbiano intracelular (STENGER & MODLIN, 1999);

ou seja, as clulas TCD8+ liberam granulosimas dentro dos macrfagos

infectados seguido de perforina, que poder destruir a clula hospedeira e

posteriormente matar a micobactria (STENGER et al., 1998). Entretanto,

durante este mecanismo, mais macrfagos so ativados, induzindo maior

atividade ltica do T CD8+. Nesse aspecto, VILLARREAL-RAMOS et al. (2003)

alertaram quanto ao efeito deletrio dessas clulas, pois o aumento da carga

bacteriana poder levar destruio tecidual.

11

5.1.3 Linfcitos T

Os linfcitos T so proporcionalmente os mais numerosos dentre

as clulas mononucleares do sangue perifrico dos ruminantes (SMYTH et al.,

2001). Constituem aproximadamente 75% da populao circulante em animais

jovens e 40% nos animais adultos (MACKAY & HEIN, 1989). Em humanos

essas clulas T se constituem apenas 7% e nos camundongos 2 a 3% da

papulao total (ITOHARA et al., 1989).

Uma caracterstica importante desse TCR ( ) em ruminantes que

a maioria desses receptores expressa apenas uma molcula de superfcie,

identificada como WC1 (MORRISON & DAVIS, 1991; WJINGAARD et al.,

1992) a qual no expressa em linfcitos T de humanos e camundongos

(SMYTH et al., 2001). Segundo MACHUGH et al. (1997) quando alguns

linfcitos T so WC1 negativos, expressam CD2 e CD8 e apresentam o

fentipo WC12CD21CD81/2. A poro extracelular dessa molcula possui 11

domnios ricos em cistena (WJINGAARD et al., 1992).

H indcios de que WC1 esteja envolvido no recrutamento de clulas

para a formao do granuloma em tuberculose (LIBANA et al., 1999;

POLLOCK et al., 2001). Apesar da precisa funo do WC1 e at mesmo dos

linfcitos T ainda no estarem totalmente estudados, sabe-se que

desempenham funo citotxica em resposta a mitgenos, parasitas, antgenos

bacterianos e virais (CHIODINI & DAVIS, 1992; AMADORI et al., 1995;

COLLINS et al, 1996), dentre essas funes, inclui-se a defesa contra M. bovis

(POLLOCK et al., 1996; SMYTH et al., 2001).

Estudo realizado por SMYTH et al., (2001), comparou a resposta in

vitro de linfcitos T e T ao M. bovis. Neste, observou-se que 24 horas aps

a exposio de antgenos de M. bovis, a maioria das clulas T de animais

infectados tornou-se altamente ativada, comparado a baixa proporo de

ativao da populao de linfcitos T . No estudo da cintica dessa resposta,

as clulas T estiveram ativadas durante os sete dias de cultivo, enquanto os

T declinaram durante esse perodo. Alm disso, em comparao com o que

foi encontrado para as clulas T CD4+, observou-se que os antgenos de M.

bovis induzem proliferao celular, mas relativamente pouca liberao de

IFN- pelas clulas T WC11 purificadas.

12

RHODES et al. (2001) descreveram a resposta proliferativa e o

efeito imunomodulatrio do linfcito T a antgenos proticos de M. bovis.

Segundo os autores, a proliferao de clulas T na presena de antgenos

como PPD-A M, PPD-M, ESAT-6, 6 kDa, Ag85, lipoprotena glicosilada 38

kDa, MPB64, MPB70, MPB83, HSP16.1, HSP65, HSP70, produziu elevados

nveis de IFN- e TGF- , entretanto, no produziu IL-2. Os autores

acrescentaram ainda que ocorra supresso do efeito do T quando h

resposta simultnea de outras clulas como o linfcito T pois, com a

depleo do T houve aumento da proliferao antgeno-especfico em um

quarto dos animais testados.

Para comprovar a funo das clulas T WC1+ na infeco

micobacteriana de bovinos, KENNEDY et al. (2002) descreveram um modelo

de tuberculose bovina in vivo, onde depletaram essas clulas tanto do sangue

circulante, quanto do trato respiratrio. Apesar das clulas T WC1+ tornarem-

se significativamente ativadas (CD25) na circulao, no foi observado efeito

sobre a progresso da doena. Alm disso, essas clulas podem iniciar a

resposta immune ao M. bovis, contribuindo direta e indiretamente para a

resposta imune em Th1. POLLOCK et al. (1996) infectaram bovinos com M.

bovis e avaliaram a cintica do T WC1+. Os autores observaram que aps a

infeco, o nmero dessas clulas aumentou proporcionalmente dentre os

subtipos de linfcitos T. Somente aps a mudana inicial dos T WC1+ houve

evidncias do envolvimento das clulas T , devido a mudana na razo de

clulas CD4:CD8.

5.2 Principais citocinas e outras clulas envolvidas na resposta imune ao

M. bovis

5.2.1 IFN-

Na resposta celular ao M. bovis, as clulas apresentadoras de

antgenos especficos liberam citocinas (DANDREA et al., 1992) as quais

induzem as clulas NK e linfcitos T a produzir IFN- (TRINCHIERI, 1993). A

presena dessas citocinas direcionam a diferenciao dos linfcitos TCD4+ com

fentipo Th0 em clulas Th1, inibindo a diferenciao e funo efetora de Th2,

13

ou seja, direciona a resposta dominante em Th1 (MAGGI et al., 1992) e

aumenta a atividade bactericida dos fagcitos (FLESCH & KAUFMANN 1987).

Os linfcitos TCD4+-Th1, TCD8+, T contribuem para a produo de

IFN , que requerido no processo de ativao de macrfagos (FLYNN &

CHAN, 2001). O IFN- um componente indispensvel na resposta

antimicrobiana uma vez que camundongos com deleo gnica para o IFN- ,

ou para os seus receptores so altamente susceptveis a infeces

micobacterianas (COOPER et al., 1993; OTTENHOF et al., 1998).

DAZ et al. (1999) testaram a habilidade de protenas antignicas, de

M. bovis em estimular a produo de IFN- pelas clulas mononucleares do

sangue perifrico de bovinos, apresentando infeco tuberculosa. Os autores

concluram que a induo da produo dessa citocina aumenta com o

progresso da doena, coincidindo com a alta reatividade de PPD no TTI. Outra

caracterstica importante quanto produo do IFN- na tuberculose bovina foi

que a citocina antgeno independente no estgio anrgico da doena.

AMENI & TIBBO (2002) avaliaram a cintica do IFN- em resposta

vacinao com o BCG e observaram que essa citocina apresenta uma fase de

ascenso imediatamente aps a vacinao, seguida de declnio nas semanas

seguintes vacinao para apresentar posterior equilbrio. Essa mudana na

concentrao deve ser atribuda funo de proteo contra infeco com o M.

bovis em bovinos.

DENIS & BUDDLE (2005) avaliaram o impacto do IFN- sobre a

interao entre M. bovis e macrfagos bovinos. Os autores observaram que os

macrfagos secretaram pouco xido ntrico (NO), TNF-alfa, IL-1 beta e IL-12,

quando infectados com o BCG. Quando os macrfagos previamente tratados

com M. bovis virulento foram infectados, houve liberao de elevados nveis de

mediadores pr-inflamatrios, mas no houve modificao na replicao

bacterina. Esse fato s foi observado quando os macrfagos foram

previamente tratados com IFN- e lipopolissacarideo (LPS). A virulncia da

micobactria um fator determinante na liberao de citocinas pelos

macrfagos, o IFN- amplifica a liberao de citocinas pelos macrfagos e a

induo da apoptose depende da liberao de TNF- .

14

5.2.2 TNF-

O TNF- tem mltiplas funes na resposta imune tuberculose,

sendo requerido no controle da mesma. Essa citocina um importante

componente para ativao de macrfagos. O TNF- juntamente com o IFN-

induz a expresso de xido ntrico sintetase induzvel (NOS2) (FLESCH &

KAUFMANN, 1990).

Estudos realizados por MOHAN et al. (2001) demonstraram o papel

dessa citocina na formao do granuloma da tuberculose e outras doenas

micobacterianas. Utilizando modelos de tuberculose em camundongos, os

autores constataram que na ausncia do receptor para TNF- , a formao do

granuloma ocorreu de forma desorganizada e com poucos macrfagos

epiteliides ativados. Os autores concluram que essa citocina afeta a migrao

celular para o local da leso e exerce influncia na expresso de adeso

molecular, o que afeta a formao funcional de granulomas no tecido infectado.

Entretanto os autores no explicaram os mecanismos pelos quais o TNF-

promove a formao e manuteno do granuloma.

Quanto ao efeito inflamatrio deletrio dessa citocina, estudo

realizado por BEKKER et al. (2000) utilizando BCG recombinante, indicou que

elevados nveis de TNF- causam inflamao destrutiva. Entretanto,

experimentos realizados em camundongos mostram que a presena do TNF-

era necessrio para limitar a enfermidade no pulmo. O exame histolgico

mostrou que o pulmo dos camundongos TNF- neutralizados exibiu leso

severa com granulomas desorganizados e inflitrao celular difusa. Portanto,

essa citocina contribuiu para limitar a resposta patolgica.

5.2.3 Interleucina-2 (IL-2)

A interleucina-2 uma citocina secretada pelas clulas T auxiliares

ativadas. Essa citocina modula a proliferao de clulas T auxiliares, T

citotxicas, clulas B ativadas e NK (SAPAROV et al., 1999), e exerce o papel

de fator de crescimento para clula T, o que implica numa estimulao agonista

da resposta immune. A manuteno da tolerncia perifrica pela sobrevivncia

e funo reguladora das clulas T CD25+CD4+ tambm funo desta citocina

(FEHERVARI et al., 2006).

15

Na resposta tuberculose bovina, a IL-2 exerce uma importante

funo. Segundo estudos realizados por ALDWELL et al. (1997) demonstrou-se

que essa citocina secretada em bovinos experimentalmente infectados.

YOUNG et al. (2002) demonstraram que a sua secreo biologicamente

ativada por BCG recombinante aumentou a sua capacidade em induzir e

manter resposta immune do tipo 1 em camundongos BALB/c.

5.2.4 Interleucina-4 (IL-4)

Diferentes tipos de clulas podem secretar IL-4, tais como: clulas T,

eosinfilos, basfilos, NK e clulas apresentadoras de antgenos. Tem-se

demonstrado que a IL-4 est envolvida no direcionamento da resposta Th2

(MIETHKE et al., 1988). Na tuberculose, h possibilidade dessa citocina ter

funo reguladora ou anti-inflamatria, juntamente com a IL-10 e TGF- . Na

infeco de bovinos com M. bovis, h aumento dos nveis de IFN- e de IL-4

(SEDDON & MASON, 1999). Existe uma correlao positiva quanto a extenso

da leso pulmonar e a produo de IL-4 pelas PBMC estimuladas com PPD

(WEDLOCK et al., 2003).

5.2.5 Interleucina-12 (IL-12)

Acredita-se que a IL-12 tenha um importante papel na imunidade

mediada por clulas. A citocina age principalmente em infeces intracelulares

primrias pela ao sobre as clulas T e NK, direcionando a resposta imune

Th1, por meio da produo de IFN- (SANO et al., 1999).

XING & SANTOSUOSSO (2000) avaliaram a funo da IL-12, em

um modelo de infeco celular in vitro, na sua capacidade de induzir TNF- e

NO pelos macrfagos. Segundo os autores a IL-12 sozinha induz pouca

secreo de TNF- e NO. Entretanto, a IL-12 quando associada micobactria

causa a induo de um aumento sinrgico da liberao de TNF e NO. Portanto,

a IL-12 pode ativar macrfagos durante a infeco intracelular.

5.2.6 Macrfagos

A funo do macrfago na tuberculose complexa, pois, ao mesmo

tempo em que essas clulas so as preferidas pelas micobactrias

16

intracelulares, eles tambm so as clulas efetoras no controle e destruio

desses patgenos (POLLOCK & NEILL, 2002).

M. bovis pode crescer relativamente livre dentro do macrfago

bovino (ALDWELL et al., 1996; LIBANA et al., 2000). Especialmente em

tuberculose humana, consideram-se tambm que os bacilos so eliminados por

meio de uma resposta inata, ou seja, resposta que envolve mecanismos como

pH do lisossomo, hidrolases lisossomial, peptdeos bactericidas e superxido

dos macrfagos (RUSSEL, 1999).

Segundo ARMSTRONG & HART (1975), o vacolo fagoctico

contendo micobactria metabolicamente ativa escapa da fuso com o

lisossomo, sendo essa caracterstica um mecanismo de evaso e

sobrevivncia desse organismo. Os autores acrescentam ainda que a interao

macrfago-micobactria define os eventos subseqentes da resposta ao M.

bovis.

As clulas mononucleares produzem xido ntrico (NO), uma

molcula efetora do sistema imune inato, que um dos componentes de

defesa contra a tuberculose, inibindo a replicao do bacilo Mycobacterium sp.

(MacMICKING et al., 1997; NATHAN, 1992; NATHAN & SHILOH, 2000). O

xido ntrico um radical livre, gasoso, inorgnico, incolor, que possui sete

eltrons de nitrognio e oito de oxignio, tendo um eltron desemparelhado

(BECKMAN & KOPPENOL, 1996). O estmulo da produo de NO por

macrfagos e subseqente gerao de nitrognio reativo so mecanismos

potentes para a morte micobacteriana (DENIS, 1991; FLESCH et al., 1991;

CHAN et al., 1995; MacMICKING et al., 1997, HIBBS, 1988).

Aps os mecanismos efetores da resposta imune inata, M. bovis

torna-se estvel dentro do macrfago, produzem e secretam antgenos, os

quais podem ser apresentados s clulas T.

5.2.7 Natural Killer

Apesar do papel fundamental dos macrfagos, outras clulas, tais

como as natural killer e neutrfilos, podem estar envolvidas na resposta imune,

principalmente na fase inicial da infeco por M. bovis (POLLOCK & NEILL,

2002).

17

A clula NK um tipo de linfcito, grande e granular do sistema

imune inato. Essas clulas esto envolvidas na resposta inicial a uma

variedade patgenos intracelulares, produzindo IFN- , bem como, lisando

clulas alvo especficas, na ausncia do antgeno (HAMERMAN et al., 2005).

Essas clulas podem produzir IFN- e lisar clulas alvos infectadas

com micobactria (YONEDA & ELLNER, 1998; JUNQUEIRA KIPNIS et al.,

2004). Entretanto, so escassos os conhecimentos acerca do envolvimento

dessas clulas na tuberculose bovina. Estudos recentes realizados por

ENDSLEY et al. (2006) demonstraram que as clulas CD3--CD8--CD11B- do

sangue perifrico de bovinos tiveram a atividade celular NK. Alm disso,

quando as clulas NK purificadas de bovinos so ativadas pela IL-12 e

cultivadas com macrfagos autlogos, infectados com BCG, a replicao

bacteriana foi reduzida.

DENIS et al. (2006) estudaram o impacto das clulas NK sobre a

resistncia da tuberculose bovina. Segundo os autores, a habilidade de NK em

reduzir o crescimento bacteriano independe da liberao de IFN- . Os

autores observaram tambm que a NK aumenta a produo de interleucina-12

e de xido ntrico pelos macrfagos infectados com M. bovis. Outro aspecto

relevante que os autores constataram foi quanto dependncia do contato

direto entre NK e macrfagos infectados na reduo do crescimento

micobacteriano.

6 Formao de granulomas

A resposta imume mediada por clulas na tuberculose bovina

desencadeia a formao de granuloma, que considerado um indicativo de

tuberculose (WANGOO et al., 2005).

O mecanismo que desencadeia a formao do granuloma ocorre da

seguinte forma: na resposta imune ao M. bovis, aps exposio ao antgeno,

o TNF- pr-estocado, liberado pelos mastcitos, recruta neutrfilos e

moncitos circulantes. Ao mesmo tempo, o IFN- produzido pela NK e T ,

ativam macrfagos e clulas dendrticas. Essas clulas liberam quimiocinas e

mais TNF, os quais alteram a microcirculao local e facilitam o trfego celular

para o tecido. Aps um perodo ainda no determinado as clulas dendrticas

18

carregadas com antgenos migram para o linfonodo iniciando a resposta

linfoctica. Essas clulas dendrticas produzem interleucina-12 (IL-12) e

apresentam o antgeno para as clulas TCD4+ virgens. Sobre a influncia da

IL-12 as TCD4+ virgens diferenciam-se em Th1. Estas por sua vez, secretam

IL-2, que leva a expanso clonal da clula Th1 antgeno especfica. Cerca de

10 a 20 dias aps a exposio ao antgeno do M. bovis as clulas TCD4+

ativadas vo para o local onde ocorreu a alterao da microcirculao. Caso a

fonte do antgeno no tenha sido erradicada, a inflamao persiste. A interao

entre TH1CD4+ e macrfagos ativados leva produo de IFN- e TNF que

resulta na maturao de mais macrfagos, formando uma leso endurecida e

tumefeita, o granuloma ou tubrculo (WANGOO et al., 2005).

O influxo de moncito/macrfago e clulas T est associado ao

mecanismo de morte ou inibio da micobactria. Em muitos casos a

progresso da doena retida neste estgio, no entanto, o bacilo presente no

tubrculo pode no ser completamente eliminado (STEAD, 1967; VAN

CREVEL et al., 2002).

Quando a formao desse granuloma progride, o seu centro torna-

se necrtico, devido falta de irrigao sangunea e diminuio da oxigenao.

Esse processo classificado como hipersensibilidade do tipo tardia, sendo

associado ao incio efetivo no controle do crescimento da micobactria

(DANNENBERG, 1991).

PALMER et al. (1999) analisaram as clulas presentes nos

granulomas de bovinos experimentalmente infectados por M. bovis e

observaram um agregado de macrfagos com poucos neutrfilos, quatro

semanas aps a inoculao. Decorridas seis a oito semanas, encontrou-se

necrose da rea central do granuloma, presena de fibrose, numerosos

macrfagos, plasmcitos, clulas gigantes multinucleadas e neutrfilos.

CHAVEZ et al. (2001) encontraram elevado nvel da expresso da protena

NRAMP1, que est relacionada com a exploso oxidativa dos fagcitos, alm

da presena de macrfagos epiteliides e clulas gigantes multinucleadas no

granuloma de bovinos infectados por M. bovis.

19

Figura 2 - Principais tipos celulares que formam o granuloma da tuberculose.

Fonte: Adaptado de GOLDSBY et al. (2000)

7 Principais antgenos de Mycobacterium bovis reconhecidos na resposta

imune

A purificao e caracterizao de protenas antignicas so

essenciais para a compreenso dos mecanismos patognicos e a resposta

imune contra a M. bovis (ALITO et al., 2003).

O BCG foi obtido a partir de uma cepa patognica de

Mycobacterium bovis, aps 230 passagens seriadas em laboratrio. Devido

baixa virulncia dessa cepa, tem-se utilizado por longo perodo como vacina

contra a tuberculose em humanos (DOHERTY & ANDERSEN, 2002; SKEIKY &

SADOFF, 2006) e experimentalmente em animais (BUDDLE et al., 1995).

As protenas do complexo 85 so produzidas por M. tuberculosis em

abundncia. Tem sido demonstrado que proporcionam imunogenicidade em

coelhos infectados com M. tuberculosis. A importncia e relevncia destas

protenas se devem, provavelmente, ao seu papel na sntese da parede celular

da micobactria. Esta sntese deve-se a sua atividade micolil transferase. De

20

modo igual, demonstrou-se que quando os moncitos humanos so infectados

por M. tuberculosis, estas micobactrias secretam o complexo 85, isto poderia

ser vantajoso para desenvolver uma vacina, visto que a liberao destas

protenas de suma importncia para o processamento intracelular deste

patgeno via MHCII (WHO, 2004; HAUEBNER, 1994; VORDERMEIER et al.,

2006; SABLE et al., 2007). Em bovinos esse antgeno recombinante tem sido

estudado com o propsito de aplicao no diagnstico (LILENBAUM et al.,

2001).

O MPT-51 (Rv3803c) um antgeno recombinante de 27 KDa

codificado na regio FbpC1 adjacente ao gene FbpA do M. tuberculosis

tambm denominado como Ag85 D ou MPB 51 (NAGAI et al., 1991;

RAMBUKKANA et al., 1993). Apesar de possuir 40% de homologia ao

complexo Ag 85, o antgeno MPT-51 no possui atividade micolil transferase

(RINKE de WIT et al., 1993; WILSON et al., 2003). O MPT51 um antgeno

protico, tambm expresso em outras micobactrias como M. leprae (RINKE

de WIT et al., 1993), M. avium (OHARA et al. 1997a) e M. bovis BCG (OHARA

et al. 1997b). Ele se liga fibronectina podendo estar envolvido na virulncia

do bacilo (KITAURA et al., 2000).

Outros antgenos proticos de M. bovis (12, 19, 22a, 22b, 24, 25,

30, 32, 39 e 70 kDa) foram avaliados quanto capacidade de estimular a

resposta imune celular, por meio da proliferao celular e secreo de IFN-

Observando esta resposta nos bovinos infectados por 36 meses, notou-se

que todos os antgenos foram reconhecidos pela resposta imune celular, mas a

magnitude dessa resposta variou entre os animais (FIFIS et al.,1994).

Algumas protenas como ESAT-6, CFP10, 85B, MPB70 e novos

antgenos, tais como o TPX e TRB-B, foram obtidas atravs de cromatografia

de troca inica e identificadas por meio de eletroforese em gel bidimensional,

sendo considerados antgenos dominantes do M. bovis, pois foram

reconhecidas pelo sistema imune celular dos bovinos. As protenas de baixo

peso molecular como a ESAT-6 e CFP10 desempenham importante papel na

resposta imune celular. As fraes proticas com elevada atividade

linfoproliferativa podem ser caracterizadas e associadas tanto a antgenos j

identificados quanto a novos antgenos proticos presentes no M. bovis (ALITO

et al., 2003).

21

RHODES et al. (2000) estudaram a cintica da clula T em resposta

a um painel de antgenos micobacterianos do M. bovis (PPD-M, PPD-A, ESAT-

6, Ag85, 38kD, MPB64, MPB70, MPB83, hsp16.1, hsp65, e hsp70). Os autores

observaram aumento da proliferao de linfcitos antgeno-especfico, bem

como aumento na secreo de IFN- e IL-2. A resposta ao PPD-M e ESAT-6 foi

mais expressiva durante o perodo estudado, entretanto a resposta a todos os

outros antgenos foi mais varivel, sugerindo que o coquetel de antgenos

mais aplicvel do que um antgeno individual para o imunodiagnstico.

Com o objetivo de diferenciar bovinos infectados por M. bovis e os

vacinados com BCG, BUDDLE et al. (1999) avaliaram a secreo de IFN- ,

estimulado pelas protenas antigncias MPB59, MPB64, MPB70 e ESAT-6. A

resposta ao MPB59, MPB64 e MPB70 foi significativamente maior em ambos

os grupos, portanto esses antgenos no so capazes de discriminar animais

vacinados de tuberculosos. Dentre todos os antgenos testados, apenas o

ESAT-6 diferenciou BCG vacinados dos bovinos infectados com M. bovis.

POLLOCK et al. (2003) realizou o teste intradrmico bovino para diagnstico de

tuberculose, utilizando o ESAT-6. Esse antgeno foi reconhecido pelas clulas

T e estimulou alta produo de IFN- . Apesar da resposta do ESAT-6 ao teste

intradrmico ter sido detectada tardiamente (96 h), esse antgeno demonstrou

sensibilidade de 86% e especificidade de 100%, sendo, portanto, um antgeno

em potencial para diagnstico in vivo para tuberculose bovina.

8 Mtodos de diagnstico para tuberculose bovina

O principal mtodo de diagnstico nos animais baseado na reao

de hipersensibilidade, por meio do derivado de protena purificada (PPD), cuja

reao avaliada por meio de teste de tuberculina intradrmico. Apesar desse

teste ser adotado em muitos pases como mtodo padro na identificao da

tuberculose animal, muitos estudos tm apontado falhas, pois so relatados

tanto resultados falso negativos como falso positivos. Portanto, novos testes

que permitam discriminar os animais infectados so necessrios.

Em alguns pases que implementaram o programa de controle e

erradicao da tuberculose bovina, os animais foram classificados em

22

reagentes ou no reagentes, utilizando algumas das variantes do teste de

tuberculina intradrmica (ANON, 2004). Esse teste preconizado pela

Organizao Internacional de Epizootias (OIE) para o comrcio internacional de

bovinos.

Segundo RUA-DOMENECH et al. (2006), devido a alguns fatores

como a dinmica da transmisso da tuberculose entre os animais, o tamanho

das leses que inicialmente so microscpicas e o tempo que o animal leva

para montar uma resposta imune detectvel, nenhum mtodo totalmente

eficaz para detectar todos os animais infectados. Conseqentemente, tem-se

desenvolvidos testes com fins de diagnsticos, tais como a dosagem do IFN-

produzido especificamente antgenos micobacterianos, avaliao da

proliferao de linfcitos e polarizao florescente. Tambm a deteco do M.

bovis nas leses dos animais abatidos facilitariam a confirmao do diagnstico

obtido pelo TTI (COUSINS & FLORESSON, 2005).

Existem diversas tcnicas de diagnstico aplicadas para detectar a

tuberculose. O diagnstico pr-clnico pode ser realizado por meio de uso de

testes da imunidade celular e humoral, alm de tecnologias moleculares (RUA-

DOMENECH, 2006). Para avaliao do melhor mtodo a ser aplicado na

deteco da tuberculose bovina, WATRELOT-VIRIEUX et al (2006) utilizaram

trs mtodos: a colorao Ziehl-Neelsen, fluorescncia com auramina e imuno-

histoquimica, usando anticorpo policlonal anti-M. bovis. A tcnica de imuno-

histoquimica foi mais sensvel ao detectar maior nmero de bovinos positivos.

Apesar de existir diversas pesquisas acerca de vrios mtodos de

diagnstico da tuberculose, o melhor mtodo a ser aplicado depender de

vrios fatores, dentre eles o tipo de tuberculose, a fase da enfermidade, alm

da situao endmica de cada regio. No quadro 1 so apresentados algumas

espcies animais que so infectadas por tuberculose e os testes mais

usualmente aplicados.

23

QUADRO 1- Testes para diagnstico de tuberculose causada por M. bovis em algumas espcies animais e no homem.

Espcie animal Teste Sensibilidade Especificidade

Bovinos Teste simples de tuberculina Intradrmico

68%-95% 96%-99%

Teste comparativo de tuberculina intradrmico

No estimado >99%

IFN- BOVIGAM 76%-93,6% 92,2%-98,1%

Exame ps-morte No estimado No estimado

Cultura bacteriolgica No estimado No estimado

ELISA (Ag: ESAT-6, MTSA-10, MPTS1, MPT63, MPB59, MPB64, MPB70, MPB83

57,1% No estimado

ELISA (Ag: ESAT-6, MPB70) 98,6% ESAT-6 96,8% MPB70

98,5% ESAT-6 90,1% MPB70

Imunocromatografia (Ag MPB70) 83% 99,4%

Polarizao fluorescente 79% 99,8%

Bfalos Comparativo com tuberculina intradrmico na prega caudal

No estimado No estimado

Tuberculina intradrmico 95,3% 97,7%

IFN- BOVIGAM No estimado No estimado

Camelos Simples com tuberculina intradrmico

100% 100%

Comparativo com tuberculina intradrmico

87,5% 100%

ELISA (PPD bovino e avirio) 100% 100%

Ces Teste de tuberculina simples No estimado No estimado

Elefantes Teste de tuberculina intradrmico Pouca Pouca

Imunoblot (Ag de sonicado de M. bovis)

No estimado No estimado

IFN- No estimado No estimado

ELISA (multiantgenos) No estimado No estimado

Caprinos Teste simples de tuberculina intradrmico

100% 100%

Teste comparativo de tuberculina intradrmico

83,7% 100%

IFN- No estimado No estimado

ELISA (Ag de PPD bovino) 54,9% 88%

Humanos Teste de tuberculina intradrmico 75%-90% 70%-100%

IFN- (Quantiferon) 82%-89% No estimado

Sunos Teste comparativo de tuberculina intradrmico

100% 100%

IFN- No estimado No estimado

Fonte: Adaptado de COUSINS & FLORISSON (2005)

24

8.1 Identificao do agente

Para a identificao do M. bovis so necessrios cuidados

especficos com as amostras. No transporte dos espcimes clnicos para o

laboratrio deve-se tomar algumas precaues, tais como uso de recipientes

plsticos selados, para prevenir o vazamento desse material para o meio

exterior, preservar o material e evitar contaminao. A associao de

transporte areo internacional possui um regulamento para embarcao de

espcimes de carter zoontico. Os epcimes clnicos devem ser refrigerados

ou congelados para retardar o crescimento do Mycobacterium sp. Em

condies onde o uso da refrigerao no for possvel, pode-se adicionar o

cido brico, na concentrao de 0,5%, como um agente bacteriosttico,

entretanto, essa substncia garante a preservao por perodos limitados de

apenas uma semana (OIE, 2004).

A presena do Mycobacterium sp. em espcimes clnicos e ps-

morte dos animais pode ser demonstrada por meio de esfregaos e posterior

colorao, cultivo e isolamento do microorganismo. Para o cultivo desse

bacilo, deve-se utilizar todo material devidamente esterilizado, pois o uso de

recipientes contendo micobactria ambiental pode resultar na falha no

processo de identificao, devido ao rpido crescimento das micobactrias

ambientais (CHIODINI et al., 1984).

Uma diferenciao importante quanto ao crescimento do M. bovis e

do M. tuberculosis quanto restrio do glicerol, cujo componente

necessrio para o M. tuberculosis, mas pode retardar o crescimento do M.

bovis. Portanto no preparo do meio para esta micobacteria deve-se substituir o

glicerol por piruvato (MOTA et al., 2001).

Os bacilos M. bovis podem ser demonstrados microscopicamente

por meio de esfregaos diretos de espcimes clnicos e preparados de

materiais teciduais. Quanto colorao pode-se aplicar a clssica Ziehl-

Neelsen e o cido fluorescente alm da tcnica de imunoperoxidase que tem

dado resultados satisfatrios (SELVAKUMAR et al., 2006).

O perodo mdio para o crescimento do M. bovis de trs a seis

semanas. As caractersticas do crescimento e a morfologia colonial podem

25

demonstrar um diagnstico presuntivo, entretanto a confirmao obtida por

meio de avaliao bioqumica (MILLER et al., 1997).

8.1.2 Diagnstico molecular

Atualmente, as tcnicas moleculares permitem a identificao das

espcies de micobactrias nas amostras cujos mtodos tradicionais de

identificao foram negativos (BARRN et al., 2006).

Dentre as tcnicas da biologia molecular encontra-se: a amplificao

e deteco de segmentos genticos espcie-especficos pelo PCR, o

sequenciamento gentico por PCR, pela tcnica de microarranjos do cido

desoxiribonucleico (DNA), tcnica da PCR aplicada para a deteco de

protena hsp65 (AGRANOFF et al., 2006).

Um teste j comercializado, mas ainda sob observao o TB PNA

FISH, que baseado na utilizao de sondas de peptdeos do cido nuclico,

que devido s suas caractersticas hidrofbicas, penetram a parede

micobacteriana e podem se ligar a regies selecionadas do 16S rRNA,

permitindo a diferenciao entre M. tuberculosis e outras micobacterias

(DALCOMO et al., 2004).

A tcnica de HPLC (Cromatografia Lquida de Alta performance) se

baseia no fato de que cada espcie de micobactria sintetiza um nico padro

de cidos miclicos na composio de sua parede celular (THIBERT &

LAPIERRE (1993). Entretanto, essa tcnica no diferencia M. tuberculosis de

M. bovis, apesar de diferenciar M. bovis BCG do complexo M. tuberculosis

(FLOYD et al., 1992).

8.1.2.1 Reconhecimento de cido nuclico

A reao da polimerase em cadeia (PCR) tem sido amplamente

empregada para a deteco do complexo M. tuberculosis em espcimes

clnicos, especialmente escarro, em pacientes humanos e mais recentemente

tem sido aplicada tambm no diagnstico da tuberculose nos animais

(ARAJO et al., 2005). A tcnica se baseia na habilidade de replicar ou

amplificar DNA sem proliferao biolgica do organismo portador de tal

26

genoma. A reao da PCR pode ser realizada atravs da tcnica caseira ou

atravs de kits comerciais (KRITSKI et al., 2005).

J existe um nmero considervel de kits que podem ser utilizados

para deteco de bactrias do complexo M tuberculosis a fresco e em tecidos

fixados. Vrios oligonucleotideos indicadores tm sido usados, incluindo os que

amplificam seqncias de rRNA 16S-23S, seqncia de insero IS6110 e

IS1081, genes codificadores de protenas especficas para o complexo de M

tuberculosis, tal como MPB70, hsp65 e antgeno de 38 kDa. Os produtos

amplificados tm sido analisados por meio de hibridizao com sonda ou com

eletroforese em gel de agarose (NOREDHOEK et al., 1996).

Resultados falso-positivo e falso-negativo, particularmente em

espcimes contendo baixo nmero de bacilos, tm reduzido a acurcia do

PCR. Esse fato pode ser atribudo ao baixo nmero de cpias da seqncia no

genoma dos bacilos, combinado ainda pela baixa quantidade destes bacilos. A

variabilidade tem sido tambm atribuda ao mtodo de descontaminao, o

procedimento da extrao de DNA, tcnicas para a eliminao de enzimas

inibidoras da polimerase, controle interno e externo e procedimentos para a

preveno de contaminaes cruzadas (MILLER et al.2002; MILLER et al.,

1997).

Segundo ESPINOSA et al. (1998), as tcnicas de anlises de DNA

promovem uma avaliao mais rpida e com melhor acurcia quando

comparados aos mtodos bioqumicos, no processo de diferenciao das

micobacterioses. No entanto, ZANINI et al. (1998) afirmaram existir algumas

dificuldades na extrao de DNA cromossmico, que seriam responsveis

pelos entraves observados na aplicao dos mtodos moleculares para a

deteco de Mycobacterium sp., ressaltando a excessiva resistncia da parede

celular das micobactrias lise ou rompimentos por agentes externos.

CEDENO et al. (2005) extraram o DNA de 60 amostras de muco

nasal de bovinos, coletaram de trs diferentes propriedades no Panam,

localizadas em uma rea endmica para M. bovis. Os autores encontraram

65% das amostras positivas para a micobactria por meio da PCR.

27

8.1.3 Diagnsticos imunolgicos

8.1.3.1 Reao de Hipersensibilidade

O extrato de glicerol de cultura lquida pura de bacilos foi descoberto

por Robert Koch em 1890. Sofreu refinamento ao longo de vrios anos, sendo

desenvolvido um derivado de protena purificada (PPD). O organismo

cultivado em meio lquido sinttico, tratado pelo calor, filtrado, concentrado por

precipitao, lavado e posteriormente redissolvido dentro de uma preparao

estril, livre de micobactria (MONAGHAN et al., 1994).

A tuberculina bovina similar a tuberculina aviria e humana, as

quais so obtidas de bacilos de M. avium supesp. Avium e M. bovis AN5,

respectivamente. Quando a tuberculina bovina injetada na pele do animal no

sensibilizado no ocorre resposta inflamatria no local da aplicao. Entretanto,

se a tuberculina injetada em animal cujo sistema imune j foi sensibilizado

por meio de uma infeco por micobactria, ou pela exposio a outros

patgenos micobacterianos, haver a formao de uma reao inflamatria no

local, onde nota-se maior intensidade entre 48-72 horas aps a injeo (LAGE

et al., 2006; POLLOCK et al., 2003). Essa reao de hipersensibilidade tardia

mediada pela populao de clulas T sensibilizadas (THORNS & MORRIS,

1983).

O teste de tuberculina realizado por meio de injeo intradrmica

de PPD de M. bovis e a subseqente deteco de reao de hipersensibilidade

tardia (ANON, 2004). Esse tipo de reao o mtodo de escolha para os

programas de controle e erradicao da tuberculose bovina, em vrios pases

(MONAGHAN et al., 1994). H basicamente duas formas de aplicao do teste

intradrmico nos animais: o teste intradrmico simples ou nico e o teste de

tuberculina comparado, que realiza a comparao entre a reao tuberculina

aviria e a reao tuberculina bovina (RUA-DOMENECH et al., 2006).

O teste intradrmico simples pode ser aplicado na regio cervical

mdia ou na prega caudal (ANON, 2004). O princpio do teste intradrmico

simples para bovinos similar ao teste cutneo para diagnstico de

tuberculose nos humanos (SNIDER, 1982).

28

O teste comparativo intradrmico requer mais tempo para a

aplicao do que o simples, pois ele se aplica injeo simultnea de tuberculina

bovina e aviria, uma ao lado da outra, na regio cervical. A interpretao

desse teste baseada na observao da maior resposta tuberculina bovina,

nos animais infectados pelo M. bovis, por outro lado, animais infectados com

outras micobactrias desenvolvem maior reao a tuberculina aviria

(POLLOCK et al., 2003). No Brasil, a positividade do teste estabelecida

quando a diferena do aumento da dobra da pele provocada pela inoculao

da tuberculina PPD bovina e da tuberculina PPD aviria, aps 72 h da

aplicao maior ou igual a 4 mm (LAGE et al., 2006).

O teste de tuberculina o nico teste para a tuberculose bovina

prescrito pela OIE, alm disso, ele utilizado em diferentes pases. Por

exemplo, na Austrlia utiliza-se com maior freqncia o teste na prega caudal

usando dose elevada de tuberculina, ao passo que o teste de tuberculina

comparativo raramente usado. Situao contrria ocorre em pases

europeus, onde o simples teste de tuberculina usando PPD bovino raramente

usado e na Repblica da Irlanda e Gr Bretanha o teste de tuberculina

comparativo, aplicado no pescoo do animal usado rotineiramente. Portanto,

cada pas estabelece seu prprio protocolo para uso e interpretao do teste

de tuberculina, baseado nas circunstncias locais e requerimento de

programas.

Segundo WATRELOT-VIRIEUX et al. (2006), a cintica de

desenvolvimento da reao de hipersensibilidade tardia em bovinos infectados

pode ser identificada a partir de trs semanas ps-infeco, nesse perodo,

poder ser correlacionada com a deteco da resposta do IFN- antgeno

especfico.

SNIDER (1982) cita alguns fatores que podem influenciar em

resultados falso-negativos e falso-positivos no teste de tuberculina em bovinos,

dentre esses fatores destacam-se: os relacionados ao prprio animal, tais

como a aplicao do teste logo aps um prvio teste de tuberculina, aplicao

do teste logo aps a infeco pela tuberculose, anergia, co-infeco com

micobacterioses ambientais, vacinao contra M. avium sp., Paratuberculosis,

infeco concomitante por vrus, stress de transporte e nutricional; os advindos

da tuberculina utilizada, sobretudo quanto ao uso de produtos sub-potentes e

29

finalmente aqueles relacionados ao mtodo de administrao, principalmente

quanto aos erros devido inexperincia e falta de ateno do aplicador,

dificuldades durante a aplicao e pobre qualidade do equipamento usado para

a aplicao da tuberculina nos animais.

Em algumas situaes, os animais so reagentes, porm no se

encontram leses visveis. RUA-DOMENECH et al. (2006) relataram que este

fenmeno pode ocorrer quando os animais encontram-se nos estgios iniciais

da infeco pelo M. bovis ou quando os animais foram infectados pelo M.

bovis, porm sem manifestao da doena, principalmente quando os bacilos

esto latentes; ou at mesmo animais no infectados expostos a antgenos

micobacterianos ambientais que induzem a reao cruzada com a tuberculina

bovina ou a outros antgenos de M. bovis.

Outro mtodo de avaliao da reao de hipersensibilidade tardia

nos animais portadores de tuberculose o uso do antgeno ESAT-6. Esse

antgeno oferece a vantagem de possuir distribuio limitada entre as espcies

de micobacteria, conseqentemente, possui pouca ou nenhuma reao

cruzada (POLLOCK & ANDERSEN, 1997). POLLOCK et al. (2003) realizaram

o teste intradrico bovino para diagnstico de tuberculose, utilizando o ESAT-6.

Apesar da resposta do ESAT-6 ao teste intradrmico ter sido detectada

tardiamente (96 h) e necessitar de dose maior, comparada ao PPD, esse

antgeno demonstrou sensibilidade de 86% e especificidade de 100%, sendo,

portanto um antgeno em potencial para diagnstico in vivo para tuberculose

bovina. AAGAARD et al. (2006) testaram antgenos como o ESAT-6, CFP10,

PE13, PE5, MPB70, TB10.4 e TB27.4 com potencial de diagnstico nos

rebanhos de bovinos da Irlanda do Norte, Mxico e Argentina. Em todos os

pases testados, o ESAT-6 e o CFP10 foram superiores no diagnstico da

tuberculose. A maior sensibilidade do teste intradrmico do grupo reagente,

combinada com a maior especificidade do grupo livre de tuberculose, indicou

que 85 % dos animais infectados e no infectados podem ser diagnosticados,

baseado na resposta a estes dois antgenos.

30

8.1.3.2 Testes laboratoriais baseados nos componentes do sangue (clulas,

molculas e soro)

a) Proliferao de linfcitos e produo de citocinas

Devido funo desempenhada por essas subpopulaes de

linfcitos durante a infeco de tuberculose, as mesmas podem ser usadas

como parmetro de avaliao da resposta imune a essa enfermidade e

conseqentemente como um meio de diagnstico, nos animais e no homem.

Dois aspectos so importantes na responsividade das clulas T na infeco de

tuberculose. O primeiro seria a descoberta do antgeno dominante, ou seja, o

que capaz de ativar maior quantidade de clulas T e discriminao dentre as

populaes desses linfcitos (POLLOCK et al., 2001). Pesquisas tem

apontados alguns antgenos presentes no M. bovis, e que so capazes de

causar maior responsividade nos linfcitos T, sendo, portanto molculas

candidatas a diagnstico, tais como o MPB70, MPB64 (LIGHTBODY et al.,

1998), ESAT-6 e CFP10 (FIFIS et al., 1994).

Quando um animal infectado por M. bovis, as clulas T

respondem aos antgenos micobacterianos, sob expanso clonal levando ao

desenvolvimento de clulas de memria (POLOCK et al., 2001). Segundo

LIBANA et al., (1999) as clulas TCD4+ e TCD8+ de bovinos infectados por M.

bovis proliferam-se significativamente na presena de antgenos

micobacterianos.

O IFN- uma citocina predominantemente liberada pelas clulas T

aps estimulao antignica. Alm disso, essa molcula est envolvida na

imunidade a infeces micobacterianas (POLLOCK et al., 2005; BAROJA &

CEUPPENS, 1987). Essas caractersticas do IFN- fizeram com que WOOD et

al. (1990) avaliassem experimentalmente o IFN- , por meio da incubao do

sangue fresco com PPD de M. bovis. Assim como o teste intradrmico, o

princpio do teste a deteco da resposta imune mediada por clulas do

hospedeiro contra a infeco causada pelo M. bovis (POLOCK et al., (2005).

Outra caracterstica similar de ambos os testes, que comparam a resposta

imune celular pela estimulao com antgenos de M. bovis e M avium. A partir

31

de uma a quatro semanas de infeco, as clulas T do sangue perifrico de

bovinos liberam in vitro quantidades mensurveis de IFN- , quando estimulado

por tuberculina bovina ou antgenos similar ao M. bovis. Caso o animal esteja

infectado por M avium ou outra micobactria ambiental, a produo dessa

citocina ser maior quando for incubada com a tuberculina aviria (WOOD &

JONES, 2001).

O teste do IFN- realizado in vitro em dois estgios. No primeiro o

sangue heparinizado distribuido em duplicatas. As amostras so incubadas

por 28h a 37C na presena de antgenos, principalmente PPD bovino ou o

avirio, alm do controle negativo. Aps 16 a 24 horas de incubao, retira-se

o sobrenadante. No segundo estgio, quantifica-se a produo do IFN- por

meio de ELISA de captura, utilizando um kit comercial (RUA-DOMENECH et

al., 2006). Este teste utiliza como antgenos tuberculina bovina e aviria. O kit

patentiado com o nome comercial de BOVIGAM. Tem-se utilizado kit similar

para o diagnstico de tuberculose em cabras, ovelhas, bfalo africano e

teoricamente pode ser aplicado em toda famlia bovidae. O teste do

BOVIGAM no diretamente aplicado a outros mamferos, mas o princpio

deste teste pode ser adaptado para o diagnstico da tuberculose em humanos

(QuantiFERON -TB, Cellestis Ltd, Austrlia) (CONNELL et al., 2006;

BRITTON et al., 2005).

O estudo em larga escala da avaliao do IFN- foi conduzido na

Austrlia por WOOD et al. (1991). Os autores testaram 6000 bovinos e bfalos

de rebanhos infectados por M. bovis e observaram 125 animais positivos para

M. bovis na cultura de materiais de bipsia. Destes animais 93,6% foram

tambm positivos quando analisados pela tcnica do IFN- , comparado com

65,6% pelo teste intradrmico de tuberculina. Os resultados apresentaram

sensibilidade de 95,2% e especificidade de 96,3%, provando que essa tcnica

mais sensvel do que o teste de tuberculina intradrmico para o diagnstico

da tuberculose bovina.

A avaliao do IFN- tem sido testada mundialmente, a partir dos

estudos realizados na Austrlia. Na Irlanda 87,7% dos animais com culturas

positivas para M. bovis tiveram resultados positivos para o IFN- (MONAGHAN

et al., 1997). Nos Estados Unidos WHIIPPLE et al. (1995) relataram que a

32

sensibilidade do teste intradrmico de 80,4-84,4% e do IFN- variou entre

55,4-94,7%. Na Itlia, BUONAVOGLIA et al. (1995) demonstraram que a

avaliao da citocina mais sensvel do que o teste intradrmico nos animais

com leso sugestiva de tuberculose. Em estudo subseqente realizado por

DONDO et al. (1996) relataram que a sensibilidade e especificidade do IFN-

foi de 96,6% e 98%, respectivamente.

A partir de estudo experimental realizado por BUDDLE et al. (1995)

foi concludo que o IFN- capaz de detectar infeco por M. bovis 14 dias

aps a inoculao da micobactria nos animais. LILENBAUM et al. (1999)

observaram que o IFN- pode detectar mais precocemente os animais

tuberculosos em mdia 60 a 120 dias do que o teste de tuberculina. Segundo

WOOD & JONES (2001) isso deve ser a explicao para o aumento aparente

da sensibilidade, comparado com o teste intradrmico e a relativa maior

proporo de IFN- positivo e intradrmico negativo em animais infectados pelo

M. bovis.

No Brasil, LILENBAUM et al. (1999) realizaram uma comparao

entre o teste intradrmico de tuberculina e a avaliao do IFN- de bovinos. Um

total de 1632 de animais foram avaliados pelo teste intradrmico cervical.

Dentre esses animais 220 foram selecionados por representar grupo de alto

risco e testados com o teste de IFN- , sendo que 207 apresentaram reao

significativa para o teste. Nesse grupo selecionado 126 animais (57,3%) foram

reativos ao IFN- , e 106 (48.2%) apresentaram reao positiva para

tuberculina. SOPP et al. (2006) afirmaram que a avaliao do IFN- pode

discriminar bovinos vacinados por BCG de infectados por M. bovis.

b) Anticorpos

A resposta tuberculose nos animais no incio da infeco

predominantemente celular. Com o progresso da doena, h maior resposta

imune humoral (WATERS et al., 2006; POLOCK et al., 2005; WELSH et al.,

2005; POLLOCK & NEILL, 2002). Uma das desvantagens do diagnstico por

meio da tuberculina intradrmica nos estgios avanados da doena que os

animais falham em responder, sendo chamados de anrgicos ao TTI. Esses

33

animais, entretanto, mantm os bacilos circulando nos rebanhos. Os animais

anrgicos podem ser detectados por meio sorolgico, mais especificamente

pela tcnica de ELISA (YEARSLEY et al., 1998).

Os testes para deteco de anticorpos especficos para a

tuberculose so semelhantes para os animais e os humanos (FIFIS et al.

1992). Especialmente para bovinos, a incluso de antgenos soro dominantes

como o MPB70 e MPB83 tem aumentado a especificidade, mas no resulta em

maior sensibilidade. Estudos realizados por THOM et al. (2004) mostraram que

a resposta dos animais anrgicos maior em relao aos anticorpos

especficos do que pelo teste intradrmico. Esse aumento correlacionado

com a severidade da doena, sendo que animais com a doena mais

generalizada apresentam maior ttulo de anticorpos (LYASHCHENKO et al.,

2004).

WATERS et al. (2006) avaliaram o soro de bovinos infectados por M.

bovis por sororeatividade a antgenos micobacterianos. A resposta ao MPB83

foi detectada em todos os animais, quatro semanas aps a inoculao. Outros

antgenos como o ESAT-6, CFP-10, e MPB70 foram menos reconhecidos. A

deteco da IgM especfica para MPB83 ocorreu antes da IgG.

Os testes para deteco de anticorpos so simples e no onerosos,

oferecendo uma alternativa para detectar animais que foram negativos ao TTI e

ao IFN- . Conseqentemente, os pases em desenvolvimento podem adotar os

testes sorolgicos nos programas de erradicao da tuberculose como uma

alternativa barata para deteco e remoo de animais em estados avanados

da doena de seus rebanhos (POLLOCK et al., 2005).

9 Vacinas contra Mycobacterium tuberculosis

Considerando a baixa eficcia da BCG na proteo da tuberculose

pulmonar em adolescentes e adultos h necessidade de nova vacina contra a

tuberculose, especialmente nos pases onde a prevalncia da enfermidade

elevada.

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9.1 Vacinas com microrganismos vivos (BCG, M.tuberculosis)

As vacinas compostas de microrganismos vivos so alternativas em

potencial, pois induzem resposta imunolgica celular e humoral. Alm disso,

no necessitam de adio de