ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE …

ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

ADJANNA KARLA LEITE ARAÚJO

ASPECTOS MORFOLÓGICOS DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO INDUZIDO POR Ouratea sp.

FORTALEZA – CEARÁ

2010


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FORTALEZA-CE 2010

FORTALEZA – CEARÁ 2010

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves

Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro

Co-orientadora: Profª. Drª. Regina Célia Bressan Queiroz de Figueiredo


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A663a Araújo, Adjanna Karla Leite Aspectos morfológicos do processo de cicatrização

induzido por Ouratea sp. / Adjanna Karla Leite Araújo – Fortaleza, 2010.

177 p. ; il. Orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes

Pinheiro. Dissertação (Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. 1. Ouratea sp. 2. Batiputá. 3. Óleos vegetais. 4. Pele. 5.

Cicatrização. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.

CDD: 636.089


3



Aprovada em: ____/____/_______.

BANCA EXAMINADORA

__________________________________________________________

Profª. Drª. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro (Orientadora) Universidade Estadual do Ceará – UECE

__________________________________________________________

Profª. Drª. Virgínia Cláudia Carneiro Girão Universidade de Fortaleza – UNIFOR

__________________________________________________________

Profª. Drª. Érika Freitas Mota Universidade Federal do Ceará – UFC

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.


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“Aos inesquecíveis animais utilizados nos experimentos, que olham questionando o que ocorre,

que sentem dor, medo e não compreendem, que não entendem a dor, a perda da liberdade,

que lambem as mãos do algoz confundindo-o com um amigo”.

Dedico este trabalho.


5

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual do Ceará.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fundação Instituto Oswaldo Cruz- PE.

À Professora Doutora Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro.

À Professora Doutora Regina Célia Bressan Queiroz de Figueiredo.

Aos colaboradores.

À banca examinadora.

À minha família.

Aos amigos.

...


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Resumo

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do óleo de Ouratea sp. (Batiputá) sobre a

cicatrização de feridas cutâneas em modelos experimentais in vivo. O óleo vegetal foi

adquirido comercialmente em Fortaleza, Ceará, Brasil, e analisado química e

microbiologicamente. As feridas cutâneas foram induzidas no dorso de camundongos

distribuídos em três grupos: Grupo I tratado com NaCl a 0,9%; Grupo II tratado com

óleo de Helianthus annus (grupo de referência) e Grupo III tratado com óleo de Ouratea

sp. Todos os animais receberam 100 µL de cada tratamento aplicado na lesão,

diariamente, por 12 dias consecutivos. Fragmentos das lesões foram coletados nos dias

2, 7 e 12 para avaliações histológicas e morfométricas. As avaliações dos parâmetros

macroscópicas e a mensuração da área da lesão foram realizadas diariamente. O óleo de

Ouratea sp. apresentou como principais constituintes os ácidos linoléico (40,88%) e

oléico (28,29%). O óleo de Ouratea sp. apresentou efeito cicatrizante semelhante ao

óleo de H. annus (p>0,05) e induziu inflamação em relação ao Grupo tratado com NaCl

a 0,9% (p<0,05). O óleo de Ouratea sp. iniciou o processo de retração da área da lesão

no 4º dia, enquanto que o óleo de H. annus e NaCl a 0,9% iniciaram o processo de

retração da área da lesão no 7º e 6º dia, respectivamente (p<0,05). O tratamento com o

óleo de Ouratea sp. apresentou uma colagenização mais acentuada quando comparado

aos outros tratamentos (p<0,05). Estes efeitos podem estar associados aos altos níveis

de ômega-6 e ômega-9 presentes nesse óleo. Concluiu-se que o óleo de Ouratea sp.

auxiliou e acelerou o processo de cicatrização, mostrando potencial terapêutico sobre as

lesões cutâneas, comprovando, desta forma, o seu uso popular como agente cicatrizante.

Palavras-chave: Ouratea sp., Batiputá, Óleos vegetais, Cicatrização, Pele.


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Abstract

The aim of this study was to evaluate the oil effects of Ouratea sp. on skin healing in

experimental models in vivo. The vegetable oil was purchased commercially in

Fortaleza, Ceará, Brazil, and analyzed chemically and microbiologically. The wounds

were induced on the backs of mice divided into three groups: Group I treated with NaCl

0.9%; Group II treated with oil of Helianthus annus (reference group) and Group III

treated with oil of Ouratea sp. All animals received 100 µL of each treatment applied to

the lesion daily for 12 consecutive days. Lesion fragments were collected on days 2, 7

and 12 for histological and morphometric evaluations. The evaluations of the

macroscopic parameters and the measurement of lesion area were performed daily.

Ouratea sp. oil presented as the main constituents linoleic (40.88%) and oleic (28.29%).

Ouratea sp. oil showed healing effect similar to oil of H. annus (p> 0.05), and induced

inflammation in relation to the group treated with NaCl 0.9% (p <0.05). Ouratea sp. oil

began the process of shrinkage of the lesion area on day 4, while the H. annus oil and

NaCl 0.9% started the process of shrinkage of the lesion area in the 7th and 6th,

respectively (p <0.05). The treatment with Ouratea sp. oil showed a more marked

collagen when compared to other treatments (p <0.05). This effect may be associated to

the high levels of omega-6 and omega-9 present in this oil. It was concluded that

Ouratea sp. oil presents a great therapeutic potential in a model of cutaneous wound

healing.

Keywords: Ouratea sp., Batiputá, Vegetables oils, Wound healing, Skin.


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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Fatores de crescimento envolvidos no processo cicatricial de lesões

cutâneas.

Tabela 2 Composição química qualitativa e quantitativa do óleo de Ouratea sp.

Tabela 3 Avaliação macroscópica durante os dias de tratamento.

Tabela 4 Avaliação histológica comparativa do efeito cicatrizante dos

tratamentos administrados nas feridas – Aspectos qualitativos.


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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Camadas e estruturas da pele.

Figura 2 Cadeias polipeptídicas - Formação da fibra colágena.

Figura 3 Esquema de uma lesão cutânea.

Figura 4 Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas.

Figura 5 Fases sequenciais do processo de cicatrização.

Figura 6 Evolução do nº relativo de células nas fases da cicatrização.

Figura 7 Ouratea sp.

Figura 8 Procedimento cirúrgico para realização da lesão.

Figura 8A Molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm).

Figura 8B e C Divulsionamento da pele.

Figura 8D Ferida realizada.

Figura 9A Bancada para Microtomia.

Figura 9B e C Visão em detalhes do processo histológico.

Figura 9D Processo de coloração das lâminas.

Figura 10A Equipamento utilizado para realização da morfometria.

Figura 10B e C Visão em detalhes do software utilizado.

Figura 11 Paquímetro Digital.

Figura 12 Cromatograma de íons totais (TIC) do óleo de Ouratea sp.

Figura 13 Aspectos Macroscópicos das lesões.

Figura 14 Avaliação microscópica das lesões, Coloração H/E.

Figura 15 Efeito dos tratamentos sobre a área da lesão (cm2) ao longo dos dias.

Figura 16 Porcentagem da deposição de colágeno durante o tratamento.


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LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

EGF Fator de crescimento epidérmico FGF Fator de crescimento de fibroblastos TGF-β Fator de crescimento transformante beta TGF- α Fator de crescimento transformante alfa TNF-α Fator de necrose tumoral alfa VEGF Fator de crescimento endotelial vascular PGDF Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta KGF Fator de Crescimento de Queratinócitos IL1α Interleucina 1alfa IL2 Interleucina 2 ILβ Interleucina beta PMN Polimorfonucleares FC Fator de crescimento NO Óxido Nítrico C3a Complemento 3a C5a Complemento 5a RLO Radicais livres de oxigênio MAF Fator ativador de macrófagos MBP Proteína Básica Principal CL células de Langerhans kg Quilograma g grama L Litro m Metro mg Miligrama min Minuto mL Mililitro µL Microlitro mm Milímetro µm Micrômetro h Hora IM Intramuscular He Gás hélio µg Micrograma p.o. pós-operatório PBS Solução salina fosfato- tamponada M Molar pH Pontes de Hidrogênio H/E Hematoxilina/Eosina TM Tricrômico de Masson ANOVA Análise de variância TIC Cromatograma de íons totais SPU Sistema de Protocolo Único COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CPqAm Centro de pesquisas Aggeu Magalhães FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz PADETEC Parque de desenvolvimento Tecnológico


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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

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2.REVISÃO DE LITERATURA 14 2.1 Morfologia e Fisiologia da Pele 14 2.1.1 Epiderme 14 2.1.2 Derme 16 2.1.3 Colágeno 18 2.2 Processo de Cicatrização 19 2.2.1 Fase Hemostática 22 2.2.2 Fase Inflamatória 23 2.2.3 Fase Proliferativa 24 2.2.4 Fase de Remodelação 25 2.3 Plantas Medicinais 27 2.3.2 Ouratea sp.

29

3. JUSTIFICATIVA

31

4. HIPÓTESE CIENTÍFICA

32

5. OBJETIVOS 33 5.1 Objetivo Geral 33 5.2 Objetivos Específicos

33

6. MATERIAL E MÉDOTOS 34 6.1 Óleo Vegetal 34 6.1.1Análise Fitoquímica 34 6.2 Animais 34 6.2.1 Procedimento cirúrgico 35 6.2.2 Tratamento da lesão 36 6.2.3 Análises Histológicas 36 6.2.4 Análise Morfométrica 37 6.2.5 Análise Macroscópica 37 6.2.6 Contração da área da lesão 37 6.3 Análise Estatística

38

7. RESULTADOS 39 7.1 Análise química do óleo de Ouratea sp. 39 7.2 Avaliação Macroscópica 40 7.3 Análises Histopatológicas 41 7.4 Contração da Área da Lesão 43 7.5 Análise Morfométrica

44

8. DISCUSSÃO

45

9. CONCLUSÃO 49

10. PERSPECTIVAS

50

11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 51


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1 INTRODUÇÃO

A pele exerce funções consideradas vitais para os animais, tais como: proteção

mecânica contra a entrada de micro-organismos, a regulação térmica e proteção contra a

perda corpórea de água, eletrólitos e macromoléculas. Neste sentido, as dermatopatias

assumem papel importante na clínica médica veterinária e estão inseridas entre as

principais patologias que acometem os animais.

O tecido epitelial que constitui a pele apresenta uma grande coesão entre suas

células, mas é sensível a solução de continuidade, que pode ocorrer devido a algum tipo

de acidente tais como: mordeduras de animais, cortes produzidos por objetos,

intervenções cirúrgicas, queimaduras, ou ainda aqueles provocados por enfermidades

como alergias (picada de pulgas) e endocrinopatias (hipotireoidismo), expondo o tecido

conjuntivo subjacente (Nitz et al., 2006).

O processo de cicatrização é caracterizado pela sucessão complexa de eventos

celulares e moleculares que interagem e se sobrepõem para a reconstrução tecidual em

resposta à lesão. Este processo envolve os eventos da inflamação, proliferação celular,

deposição de matriz extracelular, remodelação do tecido, colagenização e epitelização

(Carvalho et al., 2002). No entanto, os mecanismos moleculares e bioquímicos

envolvidos na regulação da reparação tecidual ainda não estão completamente

elucidados (Carvalho, 2002; Park e Barbul, 2004; Mendonça, 2009).

Com as possibilidades de uma solução de continuidade de qualquer origem,

infeccionar, desenvolver excesso de tecido conjuntivo, gerar uma contratura da pele ou

até mesmo tornar-se uma ferida crônica, é de grande importância uma cicatrização

rápida e controlada, diminuindo os possíveis efeitos negativos que possam acometer o

paciente, bem como o tempo de morbidade desse indivíduo (Smith et al., 2000). Neste

sentido, protocolos terapêuticos são utilizados para favorecer o processo cicatricial,

como resultados de intensas pesquisas para desenvolver os melhores agentes

promotores da cura.

A fitoterapia acompanha a humanidade desde os tempos primitivos e, o homem

durante toda sua evolução, utilizou-se de plantas para a cura dos seus males e injúrias,

mesmos que empiricamente. Acredita-se que 70% dos medicamentos derivados de

plantas tenham sido desenvolvidos com base no conhecimento folclórico (Garcia et al.,

2003). Algumas pesquisas científicas que têm como base a comprovação da identidade

botânica, composição química de compostos vegetais e análises de princípios ativos,


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tem tornado possível a identificação e caracterização de vários princípios químicos que

representam não apenas um novo grupo de substâncias, mas a descoberta de novas

intervenções terapêuticas, inclusive nas doenças de origem cutânea como feridas , cortes

ou queimaduras (Ferreira, 2008; Govindrajan et al., 2007).

Entre as plantas utilizadas pelas populações por possuírem efeito cicatrizante

destacam-se: Amburana cearensis (Allemão) A. C. Sm. (Cumarú), Kalanchoe

brasiliensis Cambess (Courama), Cajanus cajan (L.) Millsp (Feijão cuandu), Ximenia

americana L. (Ameixa), Astronium urundeuva (Allemão) Engl. (Aroeira-do-sertão),

Helianthus annus Linné (girassol).

Plantas pertencentes ao gênero Ouratea, apresentam propriedades

antimicrobiana e anti-inflamatória e, têm sido utilizadas na medicina popular no

tratamento de doenças da pele. Apesar do seu uso tradicional, esta planta, ainda não

possui sua eficácia comprovada cientificamente. Neste sentido, o presente trabalho tem

tem como objetivo avaliar o potencial de cicatrização do óleo de Ouratea sp. em

modelo experimental murino, e espera-se contribuir para aumentar os conhecimentos

sobre a ação farmacológica observada na utilização empírica do óleo de Ouratea sp. no

tratamento das afecções cutâneas.


14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Morfologia e Fisiologia da pele

O tecido epitelial, a depender do órgão no qual se localiza, desempenha várias

funções no organismo, tais como: proteção do corpo, absorção e secreção de substâncias

do meio e percepção de sensações. Os tecidos epiteliais são classificados em dois tipos

principais: epitélio glandular e epitélio de revestimento. O epitélio glandular é

especializado na produção e eliminação de secreções e, o epitélio de revestimento tem

como principal função a proteção das estruturas internas do organismo (Kumar et al.,

2005).

Dentre os tecidos epiteliais de maior importância encontra-se a pele, considerada

o maior órgão do corpo, recobrindo toda a sua superfície externa. A pele pode ser

considerada como primeira linha de defesa do organismo, constituindo uma barreira

mecânica, promovendo proteção imunológica, termorregulação e secreção. Esta

estrutura é dividida em duas camadas distintas, a epiderme e a derme que estão

firmemente unidas entre si (Santos et.al., 2000). A camada subcutânea adiposo

subcutânea, situada abaixo da derme também conhecido como hipoderme também tem a

mesma origem embrionária da derme, porém não faz parte dela (Fig.1). A hipoderme

aumenta o isolamento da pele e é responsável pela união da pele com os órgãos

adjacentes e a protege das lesões causadas por pressão ou estiramento (De Almeida,

2009).

2.1.1 - A epiderme

A epiderme é constituída por um epitélio estratificado pavimentoso,

queratinizado caracterizado por células dispostas em várias camadas. A epiderme serve

como barreira que protege o organismo contra o estresse ambiental, tais como: invasão

por micróbios, perda de água e injúrias mecânicas e térmicas. Para desempenhar esse

papel, a epiderme conta com uma variedade de apêndices, incluindo unhas, folículos

pilosos, glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas (De Almeida, 2009).

A epiderme é subdividida em cinco camadas ou estratos. A partir da camada

mais interna para a superfície encontram-se: o estrato basal, o estrato espinhoso, o

estrato granuloso, o estrato lúcido e o estrato córneo. Estes estratos refletem a


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progressão das células germinativas, encontradas na base, para células corneificadas

diferenciadas, presentes na superfície (De Almeida, 2009).

O estrato basal também chamado de germinativo é uma camada contínua de

célula e pode ser considerado como um local onde as células são diferenciadas e

altamente proliferativas. Suas células são prismáticas ou cúbicas e repousam sobre a

membrana basal a qual separa a epiderme da derme. O estrato espinhoso é formado por

células poligonais cúbicas ou ligeiramente achatadas – células de Malpighi, as quais

possuem mais queratina do que as da camada basal. As células de Malpighi formam

junções celulares ricas em desmossomos e ao migrarem para a camada espinhosa

tornam-se progressivamente mais achatadas e começam a produzir grânulos

intracelulares. Possuem pequenas expansões citoplasmáticas que contem tonofibrilas as

quais propocionam resistência ao atrito. O estrato granuloso é formado por células

achatadas que possuem grânulos de queratina e como substância extracelular, lipídeos e

proteínas (colágeno). Algumas células do estrato granuloso possuem grânulos

revestidos por membrana denominados corpos lamelares que são revestidos

principalmente por lipídeos, os quais conferem a impermeabilidade da pele. O estrato

lúcido é constituído por uma camada acidófila, cujas células não mais possuem

organelas e apresentam núcleo picnótico, não é visível em toda região do corpo e está

presente apenas em áreas nas quais a pele é mais espessa, como as regiões palmo-

plantares. O estrato córneo é a camada mais externa constituídas por células mortas e

achatadas e citoplasma repleto de queratina (De Almeida, 2009).

A epiderme deve se renovar constantemente ao longo de sua vida para manter a

homeostase e para reparar danos após ferimentos. A capacidade regenerativa do epitélio

e sua homeostase dependem do balanço entre a proliferação e diferenciação/apoptose de

seu principal tipo celular, os queratinócitos (Pincelli e Marconi, 2010), os quais

produzem a queratina, uma proteína resistente e permeável responsável pela proteção

(barreira física). Tradicionalmente essas células têm sido consideradas constituintes

inertes das camadas múltiplas da epiderme, no entanto estudos atuais têm reconhecido o

papel ativo destas células na renovação epidérmica desempenhado também papel chave

na defesa imune da pele, sob condições de homeostase, acredita-se que células

progenitoras dos queratinócitos se dividem e terminam por diferenciar-se e construir as

camadas sobrepostas da epiderme. Em oposição a esse processo coordenado de

equilíbrio estão os sinais de ferimentos e inflamação. Ambos alteram o destino dos

queratinócitos e sua resposta ao ambiente através de alterações nas suas moléculas de


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adesão e receptores de superfície, disparando uma resposta inflamatória imediata em

termos de secreção de citocinas e peptídeos antimicrobianos. Quando não controladas

essas respostas podem levar a lesões severas da pele, incluindo as desordens

inflamatórias crônicas (Suter et al. 2009).

Entre outras células presentes na epiderme temos as células de Langerhans (CL),

as quais são células dendríticas residentes da epiderme nas mucosas e na pele. Na pele

as CL funcionam como sentinelas, com função de captar, processar e apresentar

antígenos aos linfócitos T. Estes últimos quando ativados multiplicam-se e produzem

citocinas e outros mediadores responsáveis pela defesa do organismo contra essas

invasões (Cunningham et al. 2010). Os melanócitos são células dendríticas encontrados

na camada basal da epiderme e são responsáveis pela produção de melanina, substância

pigmentar que é produzida e armazenada em estruturas citoplasmática denominadas

melanossomas. Os melanossomas maduros acumulam-se na periferia celular, e são

subsequentemente transferidos via processos dendríticos aos queratinócitos vizinhos,

onde desempenharão papel importante na fotoproteção contra os raios ultravioletas,

conferindo também cor a pele, aos pelos e cabelos (Schiaffino, 2010). Menos

abundantes na epiderme, estão as células de Merkel as quais formam terminações

nervosas livres e especializadas conhecidas como corpúsculo de Merkel. Estas células

estão em íntima associação com as terminações nervosas e possuem vesículas

citoplasmáticas que funcionam como mecano-receptores (Dângelo et. al. 1988).

2.1.2 – Derme

A derme está localizada logo abaixo da epiderme conferindo e permitindo uma

base firme para sua sustentação. Apresenta uma complexa organização, com um tecido

conjuntivo rico em vasos, glândulas sebáceas e sudoríparas, folículos pilosos e

corpúsculos tácteis. O controle do fluxo sanguíneo dos plexos vasculares presentes na

derme é feito por estímulos oriundos do hipotálamo e das fibras nervosas simpáticas, e

além da nutrição, proporcionam o mecanismo de termorregulação. As terminações

nervosas sensoriais mantêm o indivíduo em contato com o meio ambiente (Arnold et al.,

2002).

A derme pode ser dividida em duas camadas: a camada papilar/subepitelial mais

superficial, na qual são encontradas as papilas dérmicas, as fibras conjuntivas frouxas e

as fibras elásticas que estão perpendiculares à junção dermoepidérmica, sendo esta


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camada bastante vascularizada. E a camada reticular que é mais profunda, mais densa,

na qual são encontradas as fibras conjuntivas não-remodeladas e as fibras elásticas em

plexos. Feixes de fibras colágenas e elásticas estão localizados na substância

fundamental amorfa a qual é constituída por glicosaminoglicanas formando o tecido

conjuntivo dérmico (De Almeida, 2009).

Diferentes tipos celulares compõem a derme, tais como: fibroblastos e fibrócitos,

células imunológicas - macrófagos, mastócitos e leucócitos sangüíneos, particularmente

neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos (Arnold et al., 2002).

Os fibroblastos são células fusiformes, com núcleo oval e que participam da síntese

dos componentes da matriz extracelular permitindo e promovendo a formação do tecido

de granulação, levando a reepitelização, garantindo a manutenção da integridade do

tecido conjuntivo. Portanto são as principais células envolvidas no processo de

cicatrização (Carvalho, 2002; Amadeu et al., 2003; Pagnano et al., 2008). Os

fibroblastos são capazes de sintetizar fibras colágenas, elastina, fibronectina,

glicosaminoglicanas e proteases, sendo também responsáveis pelo debridamento e

remodelamento fisiológicos da célula (Hildebrand et al., 2005).

Os fibrócitos são encontrados em vários tecidos, tanto em condições fisiológicas

quanto patológicas (Bucala et al., 1994). Eles são considerados importantes no processo

cicatricial por contribuírem no mecanismo de formação do granuloma, na atividade

antigênica, na produção de colágeno e da matriz extracelular. Participam também na

remodelagem da pele e nos processos inflamatórios, através da produção de fatores de

crescimento e fatores angiogênicos, (Abe et. al.; Metz, 2002; Quan, 2004). Estas células

são derivadas de precursores da medula óssea e contribuem para a presença de

miofibroblastos no tecido cicatricial (Mori et al., 2005).

A hipoderme é a camada mais profunda do tecido epitelial e composta

principalmente por células adiposas (tecido conectivo gorduroso). É um depósito de

gordura de reserva, um isolante térmico e protege o organismo mecanicamente (Harris,

2005).


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2.1.3 – Colágeno

Os colágenos pertencem a uma família de proteínas da matriz extracelular

(MEC) que desempenha um papel importante na manutenção da estrutura de vários

tecidos e também possuem outras importantes funções, como por exemplo: adesão

celular, quimiotaxia, migração (Heino et al., 2009).

A relação dinâmica entre as células e o colágeno regula a remodelagem do

tecido durante o crescimento, diferenciação, morfogêneses e cicatrização bem como

estão envolvidos em várias patologias (Heino et al., 2009). Todas as moléculas de

colágenos consistem em três cadeias polipeptídicas chamadas cadeias α, e contém no

mínimo um domínio composto por sequências repetitivas de gly–X–Y. A presença de

glicina (gly–X–Y) é essencial para empacotamento dessa estrutura helicoidal (Fig 2). O

X e o Y pode ser qualquer aminoácido, porém a prolina é normalmente encontrado na

posição X enquanto a posição Y é frequentemente ocupada pela 4-hidroxiprolina. Estas

últimas são particularmente importante para estabilidade da proteína. Os colágenos são

uma das mais abundantes proteínas no corpo, constituindo 30% de massa protéica. As

superfamílias dos colágenos podem ser subdividas com base na forma de associação ou

outras características sendo numeradas de I a XXVII de acordo com sua ordem de

descobrimento. Alguns colágenos são restritos em determinados tipos de tecido: por

exemplo, tipo II e X e XI são exclusivamente encontrado nas cartilagens; a família do

tipo IV nas membranas basais; e tipo XVII nos hemidesmossomas da pele. Por outro

Fig1: Camadas e estruturas da pele. Fonte: Banco de Imagens Free (Stock.Xchng version 6.00, 2010).


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lado, alguns tipos de colágenos são encontrados na maioria das MECs. As fibrilas do

colágeno frequentemente consistem de mais que um tipo de colágeno (Myllyharju et. al.

2004).

2.2 Processo de Cicatrização

A cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve a organização de

células, sinais químicos e remodelamento MEC com objetivo de reparar tecido

lesionado. Por sua vez, o tratamento de feridas busca o fechamento rápido da lesão de

forma a restabelecer a integridade do tecido lesionado. Diante disso é imprescindível a

compreensão do processo biológico da cicatrização de feridas e regeneração tecidual

(Mendonça, 2009). Com o rompimento tecidual nos animais vertebrados logo se inicia o

processo de reparo ou cicatrização (Potter e Perry, 2003; Ferreira et al., 2008).

Uma ferida pode ser definida como qualquer lesão que leve a uma

descontinuidade cutânea (Fig 3), existindo várias causas, entre as quais as mais

frequentes são: o trauma (mecânico, físico ou químico), a isquemia, a pressão no local e

devido a procedimentos cirúrgicos (Strodtbeck, 2001). Baseado na natureza do processo

de reparação, as feridas podem ser classificadas como agudas ou crônicas. Sua

classificação constitui importante forma de sistematização necessária para o processo de

avaliação. Feridas agudas são injúrias causadas por corte ou incisão cirúrgica que

completam o processo de cicatrização dentro do tempo esperado. Em contraste, estão às

feridas crônicas que são injúrias teciduais aonde a cicatrização ocorre de forma lenta

Fig.2: Cadeias polipeptídicas - Formação da fibra colágena. Stock.Xchng version 6.00, 2010).


20

devido a repetidos insultos ao tecido e também a um processo patológico secundário

que interfira na organização e duração do processo cicatricial. (Strodtbeck, 2001,

Blanes, 2002). Outra classificação refere-se às estruturas comprometidas, e consiste na

descrição anatômica da profundidade da ferida, que engloba: a ferida superficial

(limitada à epiderme), a ferida com perda parcial (limitada à epiderme e porção superior

da derme) e a ferida com perda total (quando há destruição da epiderme, derme, tecido

subcutâneo, podendo invadir músculos, tendões e ossos). Este sistema é adotado para

estadiar alguns tipos de feridas crônicas, como as úlceras por pressão e as queimaduras

(Santos, 2000).

O processo de cicatrização é didaticamente dividido nas seguintes fases: a)

hemostática; b) inflamatória; c) proliferativa ou de granulação e d) de remodelação

da matriz extracelular (Fig 4 e 5). Diferentes tipos de células, matriz extracelular,

proteínas e seus receptores estão envolvidos no processo biológico da cicatrização,

o qual é mediado por citocinas e fatores de crescimento (Tabela 1). A liberação de

vários fatores de crescimento na ferida, como fator de crescimento derivado

plaqueta-PDGF, fator de crescimento epidérmico-EGF, fator de crescimento básico

de fibroblastos-FGF, fator de crescimento transformante beta-TGF-β1, e o fator de

crescimento transformante alfa-TGF-α, afetam o recrutamento, a ativação, a

migração e a diferenciação de células no leito da ferida (Ferreira et al., 2008). Entre

as proteínas da matriz envolvidas neste processo estão a fibronectina, laminina,

tenascina e colágeno. Estas proteínas são de extrema importância por estarem

envolvidas na fase inicial da cicatrização das feridas, pois interagem entre si e

apoiam a adesão de fibroblastos com as células endoteliais (Pereira et al., 2005).

Fig. 3: Esquema de uma lesão cutânea. Fonte: Banco de Imagens Free (Stockxchng version 6.00, 2010).

ARAÚJO, A.K.L. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por

Fig. 4: Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas. in Molecular Medicine

Fig. 5: Fases sequenciais do processo de cicatrihttp://patologiafacil.blogspot.com

. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por

Etapas do processo cicatricial de lesões cutâneas. Fonte: Experts Reviews olecular Medicine©.

Fases sequenciais do processo de cicatrização em função do tempo em dias. http://patologiafacil.blogspot.com , 2010.

. Aspectos Morfológicos do Processo de Cicatrização Induzido por Ouratea sp.

21

Experts Reviews

em função do tempo em dias. Fonte:


22

2.2.1 Fase Hemostática

Esta fase inicia-se no momento da injúria e permanece por algumas horas. A

primeira resposta dos vasos sanguíneos à lesão é a vasoconstricção mediada por

componentes vasoativos (catecolaminas), limitando, desta forma, a hemorragia e o

subsequente extravasamento de fluido e proteína. A vasoconstricção é seguida por uma

fase de vasodilatação e um aumento da permeabilidade vascular, onde se acredita que a

histamina seja o mediador bioquímico responsável (Mandelbaum et al., 2003).

Com o aumento da permeabilidade vascular, há o extravasamento de fluidos e

proteínas para o espaço extravascular. Consequentemente ocorre a diapedese de células.

Neste ponto, fatores de coagulação liberados pelas células lesadas, ativam a via

extrínseca da coagulação e da agregação plaquetária, expondo o colágeno da pele lesada

o qual ativará a via intrínseca da coagulação (Theoret, 2004).

Fator de Crescimento Fonte Efeito Fator de Crescimento de

Fibroblastos (FGF) 1, 2 e 4

Macrófagos, cél. endoteliais

Proliferação dos fibroblastos e angiogênese

Fator de Crescimento Transformante-α (TGF-α)

Macrófagos, queratinócitos

Reepitelização

Fator de Crescimento Transformante- β1 e β2 (TGF-β1 e β2)

Plaquetas, macrófagos

Quimiotaxia de fibroblastos e macrófagos; síntese da MEC; secreção de inibidores da protease

Fator de Crescimento Epidermal (EGF)

Plaquetas Reepitelização

Fator de Crescimento Derivado de Plaqueta (PGDF), isoformas AA,

AB e BB

Plaquetas, macrófagos, queratinócitos

Quimiotaxia de fibroblastos e macrófagos, proliferação de fibroblastos

e síntese da MEC

Fator de Crescimento de Queratinócitos (KGF)

Fibroblastos da derme

Proliferação de queratinócitos

Interleucina 1α e β (IL1α e ILβ) Neutrófilos

Ativa a expressão do FC em macrófagos, queratinócitos e Fibroblastos

Tabela 1: Fatores de crescimento (FC) envolvidos no processo cicatricial de lesões cutâneas (Aukhil, 2000).


23

A indução das plaquetas pela trombina resulta na liberação, por degranulação de

uma variedade de fatores de crescimento e substâncias vasoativas, tais como: PDGF,

TGF- α e β, FGF, EGF e VEGF, tromboglobulina, fator plaquetário-4, serotonina,

bradicinina, prostagladinas, prostaciclinas, troboxanos e histamina. A degranulação das

plaquetas também inicia a cascata do complemento com a formação de C3a e C5a,

potentes anafilotoxinas que promovem a liberação da histamina pelos basófilos e

mastócitos. Além de glicoproteinas adesivas como a fibronectina e trombospondina, as

quais são importantes constituintes da matriz extracelular provisória (Strodtbeck, 2001;

Mandelbaum et al., 2003; Midwood et al., 2004).

Com a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea formam um coágulo de

células e fibrina que promovem a hemostasia, forma-se um selo temporário sobre o sítio

da injúria e prevenindo a eventual entrada de microrganismos, além de formar um

suporte para a migração celular a qual é na realidade uma matriz extracelular provisória

sobre a qual fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos ingressam na ferida. Esta

matriz é composta por proteínas adesivas como: fibrina, fibronectina, trombospondina,

vitronectina e fator de Willebrand, fornecendo resistência limitada à ferida (Stashak,

2004; Theoret, 2004).

Com o passar do tempo, essa matriz provisória é substituída por um tecido de

granulação rico em fibronectina que fornece um leito vascularizado para deposição de

colágeno (Midwood et al., 2004). Isto serve como processo inicial e amplificador para a

próxima fase da cicatrização (Ferreira et al., 2007).

2.2.2 Fase Inflamatória

A fase inflamatória é caracterizada pela resposta vascular e celular, cuja

intensidade depende da gravidade da injúria. O início da fase inflamatória e sua

intensidade estão correlacionados com a boa irrigação e perfusão sanguínea (Theoret,

2005). Seu início se dá pela liberação de vários mediadores a partir de células e

capilares danificados (plaquetas ativadas, citocinas e fatores de crescimento) que

possibilitam a passagem de células para o local da lesão. Os principais componentes

celulares de uma ferida são os leucócitos polimorfonucleares (PMN) e os macrófagos

(Strodtbeck, 2001).

Os neutrófilos fornecem proteção à ferida contra a contaminação por meio da

fagocitose de detritos celulares e bactérias (Midwood et al., 2004). Quando ativados,


24

secretam radicais livres de oxigênio (RLO) e enzimas lisossômicas como proteases,

colagenases e elastases que ajudam a combater uma possível infecção. Além de sua

função fagocitária, os neutrófilos possuem ação pró-inflamatória exercida através da

liberação de citocinas que ativam fibroblastos e queratinócitos. Caso a ferida não esteja

severamente infectada, em poucos dias o número de neutrófilos diminui devido à

fagocitose por macrófagos. Depois de um ou dois dias, monócitos teciduais infiltram-se

no local da lesão e se diferenciam em macrófagos finalizando a fase inflamatória

(Werner e Grose, 2003; Martin, 2005).

Uma vez no local da lesão os macrófagos realizam intenso processo de

debridamento. De maneira similar aos neutrófilos exercem atividade microbiana através

da fagocitose e da liberação de oxigênio, de óxido nítrico (NO) e de peróxido de

hidrogênio (Halper et al., 2003). Os fatores mitogênicos e citocinas sintetizadas e

liberadas pelos macrófagos são: PDGF, FGF, VEGF, TGF-α e β e o fator-1 de

crescimento insulina-like que são necessários para estimular a formação do tecido de

granulação e, podem influenciar as fases tardias da cicatrização, como:

neovascularização, granulação, fibroplasia e epitelização (Santos, 2000).

Quanto aos linfócitos, o seu papel na cicatrização ainda não está bem definido e

permanece controverso. Aproximadamente seis a sete dias após a injúria, o número de

linfócitos que aparece na ferida é desproporcionalmente menor que na circulação. Os

linfócitos secretam linfocinas importantes, incluindo: IL-2, MAF (Fator de Ativação de

Macrófagos) e fatores quimiotáticos, além de aumentar o estágio inicial da cicatrização

através da estimulação de macrófagos, células endoteliais e fibroblastos. Entretanto,

sugere-se que os linfócitos T podem regular a atividade fibroblástica exuberante a qual

poderia, caso esta regulação não existisse, ocorrer tardiamente na reparação cicatricial

(Mencia-Huerta, 1993).

A participação de eosinófilos no processo cicatricial está, aparentemente,

associada à produção da Proteína Básica Principal (MBP) a qual age na degradação do

tecido (Mencia-Huerta, 1993).

2.2.3 Fase Proliferativa

Na reparação do tecido conjuntivo ocorre a formação do tecido de granulação,

com proliferação endotelial e de fibroblastos (fibroplasia). Estes últimos são atraídos

por estímulos químicos em direção ao leito da ferida, produzindo matriz extracelular e


25

angiogênese. Estas células são as principais células envolvidas na cicatrização e surgem

por volta do segundo ou terceiro dia após o trauma. Esses eventos são necessários para

permitir e promover a reepitelização, no entanto paralelamente a esta fibroplasia, ocorre

intensa proliferação vascular (Desmoulière et al, 2005).

Macroscopicamente o tecido de granulação apresenta-se com aspecto granuloso

e avermelhado. Muitos fibroblastos adquirem alguns aspectos morfológicos e

bioquímicos de células musculares lisas, onde essas modificações darão origem aos

miofibroblastos (Desmoulière et al, 2005). Estes produzem MEC a qual fornecerá a

força mecânica para atividade contrátil, responsável pelo fechamento das feridas após as

lesões, processo conhecido como contração da ferida (Tomasek et al., 2002; Gabbiani

2003).

Nas feridas, quando ocorre perda total da derme, a epitelização se faz apenas das

suas margens, pois não há anexos cutâneos remanescentes. A atividade mitótica do

fibroblasto praticamente desaparece em torno do 15º dia, passando a secretar as

proteínas presentes no tecido de granulação, produzindo componentes da substância

fundamental e o colágeno. A substância fundamental é formada por água, eletrólitos e

glicosaminoglicanos, com aspecto semelhante a um gel estando distribuído entre fibras

do tecido conjuntivo (Carvalho, 2002).

A formação do epitélio é outro fenômeno que ocorre na fase de proliferação, na

qual a epitelização faz-se pelo aumento de tamanho, da divisão e da migração das

células da camada basal da epiderme por sobre a área de reparação do tecido conjuntivo

subjacente (Carvalho, 2002). Adicionalmente, ocorre a fibrose com intensa participação

dos fibrócitos. (Abe et al., 2001; Metz, 2002; Quan, 2004). Durante a cicatrização, os

fibrócitos podem ser recrutados do tecido adjacente não lesado revertendo-se para o

estado de fibroblasto e reativando sua capacidade de síntese (Mori et al., 2005).

2.2.4 Fase de Remodelação ou Maturação

Nesta fase ocorrem eventos importantes, como: deposição, agrupamento,

remodelação do colágeno e regressão endotelial, ocorre também a diminuição de todos

os elementos celulares, inclusive as células inflamatórias (Fig 6). A maturação da ferida

tem início durante a terceira semana e caracteriza-se por um aumento da resistência,

sem aumento na quantidade de colágeno. A remodelação do colágeno inicia-se na

formação do tecido de granulação e mantém-se por meses após a reepitelização. Nessa


26

fase ocorre uma tentativa de recuperação da estrutura tecidual normal e, alterações dos

elementos da matriz extracelular (Singer, et. al., 1999; Toscano, et. al., 2004).

Ocorre, concomitantemente, reorganização da matriz extracelular, que se

transforma de provisória em definitiva, cuja intensidade fenotípica, observada nas

cicatrizes, reflete a intensidade dos fenômenos que ocorreram, bem como o grau de

equilíbrio ou desequilíbrio entre eles. (Gabbiane, et. al., 2003). No entanto, se ocorrer o

desequilíbrio desta relação favorecerá o aparecimento de cicatrizes hipertróficas e

quelóides. Com a diminuição progressiva dos vasos neoformados, a cicatriz torna-se-á

menos espessa, passando de uma coloração rosada para esbranquiçada (Tazima et al,

2008).

Durante a fase inflamatória a liberação de fatores de crescimento por

fibroblastos, macrófagos e neutrófilos ativam os queratinocitos localizados nas margens

e no interior do leito da ferida. Os eventos dessa fase são regulados por três principais

agentes: fatores de crescimento, integrinas e metaloproteases (Santoro et. al., 2005).

Dentre os fatores de crescimento destacam-se o PDGF, que induz a proliferação de

fibroblastos com consequente produção da matriz extracelular durante a contração da

ferida e reorganização da matriz. O KGF7, que é considerado o principal regulador da

proliferação dos queratinócitos, assim como o TGF-β, principal responsável pelo

estímulo inicial da migração das células epiteliais (Santoro et. al., 2005).

A ativação de receptores de integrinas pelos queratinócitos permite a interação

com uma variedade de proteínas da matriz extracelular na margem e no leito da ferida.

Por outro lado, a expressão e ativação de metaloproteases promovem a degradação e

modificação das proteínas da matriz extracelular no sitio da ferida, facilitando a

migração celular. A própria atividade proteolítica dessas enzimas pode liberar fatores de

crescimento ligados a matriz extracelular, de forma a manter constante o estímulo a

proliferação e migração dos queratinocitos, acelerando o processo de reepitelização

(Santoro et. al., 2005). Esta fase de maturação perdura por toda a vida da ferida, embora

o aumento da força tênsil se estabilize, após um ano, em 70 a 80% da pele intacta

(Tazima et al, 2008).


2.3 Plantas Medicinais

As plantas medicinais representam a principal fonte de medicamentos utilizada

medicina tradicional em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que

utiliza o maior número de espécies diferentes. Em geral, o conhecimento popular é

adquirido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com

a natureza, observando-a de perto no seu dia

mantendo vivo e crescente esse patrimônio pela experimentação sistemática e constante

(Hamilton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido

estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma

Ata, em 1978, na qual foi constatado que, no âmbito sanitário, 80% da população

mundial utiliza essas plantas ou preparações delas

as mais diversas enfermidad

No Brasil, cerca de um quinto da população consome 63% dos medicamentos

disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural

especialmente nas plantas, a única fonte de recurso terapêutico.

privilegiado neste aspecto,

aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (

2007). Destas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no

Figura 6: Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais da cicatrização. Fonte: Biologia da ferida e cicatrização, 2008.



em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que


rido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com

a de perto no seu dia-a-dia, e explorando suas potencialidades,


lton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido

estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma


ntas ou preparações delas como única fonte de tratamento para

as mais diversas enfermidades (Silva, 2003).


disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural

especialmente nas plantas, a única fonte de recurso terapêutico. O Brasil é

privilegiado neste aspecto, pois abriga 55 mil espécies de plantas, compreendendo

aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (

tas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no

Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases sequenciais da cicatrização. Fonte: Biologia da ferida e cicatrização, 2008.


27


em suas práticas terapêuticas, sendo a medicina popular a que


rido e repassado por grupamentos culturais que ainda convivem intimamente com

dia, e explorando suas potencialidades,


lton, 2003). A valorização da utilização das plantas medicinais tem sido

estimulada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) desde a declaração de Alma-


única fonte de tratamento para


disponíveis e o restante da população encontra nos produtos de origem natural,

O Brasil é um país

abriga 55 mil espécies de plantas, compreendendo

aproximadamente um quarto de todas as espécies conhecidas no mundo (Di Stasi,

tas espécies, 10 mil podem ser medicinais, aromáticas e úteis, tendo no

Evolução do nº relativo de células sanguíneas e fibroblastos nas fases


28

mercado mundial de produtos farmacêuticos, cosméticos e agroquímicos, perspectivas

de altos ganhos na economia (Guarrera e Marignoli, 2005).

Diante da carência financeira, a fitoterapia é uma alternativa viável para a

maioria da população. Se por um lado existe a necessidade de intensificação de estudos

potenciais em botânica, visando a descoberta ou comprovação de plantas usadas

popularmente, por outro é preciso reverter os conhecimentos adquiridos em benefícios

das pessoas e, obter um maior envolvimento da classe médica. Desta forma, diante da

importância da fitoterapia e da escassez de pesquisas em Medicina Veterinária, torna-se

necessário estudar e aprofundar os efeitos terapêuticos das plantas inseridas no contexto

agro-ecológico e social da população (Joshi e Joshi, 2000).

A fitoterapia tem sido aplicada há séculos empiricamente, mas atualmente vem

recebendo maior atenção dos campos acadêmicos e em estudos científicos. Diversas

enfermidades são tratadas ou aliviadas pela utilização de plantas, dentre elas destacam-

se as doenças de pele, incluindo-se as feridas. Sendo assim, é de suma importância que

novos trabalhos na área sejam desenvolvidos, a fim de aperfeiçoarem os recursos e

tecnologias existentes no tratamento de feridas, como também para torná-los mais

baratos e acessíveis, principalmente para a classe econômica menos favorecida (Dos

Santos, 2009).

Assim, apesar da predominância de substâncias sintéticas no arsenal

terapêutico, nos últimos anos tem-se verificado a retomada e valorização de práticas

terapêuticas consideradas por muitos profissionais de saúde como populares ou não-

científicas, inclusive a lenta reincorporação das ervas medicinais como alternativa ou

complemento terapêutico. Sendo vários os fitoterápicos testados e usados no processo

de cicatrização de feridas cutâneas que se mostraram promissores (Dos Santos, 2009).

Muitas plantas contendo óleos fixos são relatadas por suas propriedades

cicatrizantes relacionadas a ácidos graxos insaturados como, ômega-3, ômega-6 e

ômega-9 presentes em sua constituição (Oliveira et al., 2010; da Silva Quirino et al.,

2009). Habeeb et. al, 2007 demonstraram, por exemplo que os óleos fixos de Aloe vera

(babosa) apresentam atividade cicatrizante, sendo atribuída as seus polissacarídeos. Este

óleo também favorece a formação do colágeno fornecendo força e integridade a derme.

A fração glicoprotéica é o maior componente do Aloe vera que está envolvida com a

cicatrização por promover a proliferação celular, a migração e o crescimento dos

fibroblastos da derme (Eshghi et al., 2010). O óleo de Helianthus annus (girassol)

também tem se mostrado uma alta atividade cicatrizante. Esta planta é rica em ácido


29

linoléico (ômega- 6) o qual é um ácido graxo essencial e precursor do ácido aracdônico,

atuando indiretamente, nas prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos e leucotrienos

os quais são importantes mediadores inflamatórios e essenciais no processo de

cicatrização das feridas (Eurides, 2006). Além do H. Annus,pode-se citar a Rosa aff.

Rubiginosa (rosa mosqueta) com grandes quantidades de ácido linoléico e seus

derivados (Eggers et. al., 2000), possuindo atividade cicatrizante substancial.

(Szentmihályi et al., 2002).

Assim, a importância da utilização de plantas no tratamento é evidenciada por

estes estudos e pela necessidade de se buscar alternativas para a cicatrização de lesões

na pele, já que os curativos disponíveis, sintéticos ou biossintéticos, utilizados são

bastante onerosos (Di Stasi, 2007).

2.3.2 Ouratea sp.

A família Ochnaceae pertence à ordem Theales e compreende cerca de 28

gêneros e 400 espécies de ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais de todo

o mundo. No Brasil, são conhecidos aproximadamente 9 gêneros com um total de 105

espécies (Jolly, 1988). São plantas essencialmente arbóreas ou arbustivas e, recebem

denominações específicas dependendo da região: angelim (Ouratea vaccinoides),

coração de bugre (Ouratea parviflora) e caju bravo (Ouratea floribunda e Ouratea

salicifolia), sendo estas últimas empregadas em ornamentação urbana. No Nordeste, as

espécies desse gênero são conhecidas popularmente por batiputá (Fig.7) (Barroso,

1986).

As espécies de Ochnaceae mais competentes em biossintetizar flavonóides e

biflavonóides, é representada pelo gênero Ouratea, sendo a frequência e a diversidade

estrutural dos biflavonóides nas espécies desse gênero utilizadas como marcadores

taxonômicos (Tih et al., 1992).

As espécies de Ouratea, são utilizadas pela população como tônicas e

adstringentes (O. castanaefolia, O. parviflora), como anti-inflamatório e em doenças da

pele (O. parviflora) e no tratamento de doenças gástricas (O. spectabilis) (Corrêa, 1975;

Paulo et al., 1986; Felício et al., 2004). Estudos tem demonstrado que extratos e frações

obtidas de plantas pertencentes a estes gênero possuem ação vaso-dilatadora e anti-

hipertensiva (Cortes et al., 2002), antitumoral (Sampaio et al., 1975; Oliveira et al.,

2002; Carvalho et al., 2002; Grynberg et al., 2002). O óleo extraído do extrato hexânico


30

dos frutos de O. parviflora apresentou atividades antibacteriana e antifúngica (Marcol et

al., 1988).

Além dos flavonóides e biflavonóides, esse gênero são bioprodutores de outras

classes de metabólitos como: triterpenos, diterpenos, depsídeos, ésteres graxos e

triglicerídeos, aos quais se atribuem suas importantes propriedades biológicas. Entre

essas classes de substâncias, os biflavonóides recebem destaque, devido à frequência e

abundância com que são encontrados nesse gênero, e cuja diversidade estrutural é

devida, principalmente, aos diferentes padrões de ligações entre seus monômeros

(Velandia et al., 2002; Felicio et al., 2004).

Fig. 7: Ouratea sp. Fonte: http://www.ulf-mehlig.de/jpg/dunes/duouratea-1-0.html


31

3 JUSTIFICATIVA

O uso de plantas medicinais como agentes terapêuticos tem despertado interesse

junto aos pesquisadores devido os seus mais diferentes efeitos, dentre eles o de promover a

cicatrização de feridas, ocasionadas por doenças de pele ou traumas. Entretanto, o uso

potencial dessas plantas como fontes de substâncias cicatrizantes em Medicina

Veterinária ainda é insignificante.

O número e a variedade de preparações tópicas obtidas a partir de plantas

medicinais para a cicatrização de feridas é relativamente significante, sendo, na sua

maioria, eficientes estimulando a cicatrização. Em contrapartida, mais estudos são

necessários, mediante a vastidão de plantas existentes, para que haja a comprovação

científica do efeito cicatrizante de fitoterápicos, evitando assim o uso indevido de

determinados produtos que são prejudiciais à cicatrização, por serem irritativos ou

estimularem a formação de um tecido de granulação exuberante (White, 1995).

Apesar de diversas atividades terapêuticas comprovadas, o efeito cicatrizante do

óleo de batiputá (Ouratea sp.) sobre feridas cutâneas permanece desconhecido. Por outro

lado, apesar de já ser utilizado pela população como cicatrizantes, essa atividade

terapêutica ainda necessita de comprovação científica. Desta forma, são necessárias

pesquisas que evidenciem, cientificamente, a ação dos constituintes presentes no óleo de

batiputá (Ouratea sp.) como cicatrizantes além de não causarem efeitos colaterais.

Portanto, a comprovação do potencial cicatrizante dessa planta utilizada em feridas

cutâneas em modelos experimentais irá validar seu uso, bem como contribuir para a

produção de um fitoterápico de baixo custo para uso humano e/ou veterinário.


32

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

O óleo fixo de Ouratea sp., conhecida como batiputá, possui atividade

cicatrizante em lesões cutâneas induzidas expermentalmente.


33

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo Geral:

Avaliar o potencial do óleo fixo de Ouratea sp. (batiputá) na cicatrização de

feridas cutâneas experimentais in vivo.

5.2 Objetivos específicos:

• Determinar a composição química do óleo fixo de Ouratea sp.;

• Avaliar os aspectos macroscópicos das lesões cutâneas em camundongos (Mus

musculus);

• Avaliar a retração da área da lesão nas feridas em cicatrização;

• Avaliar os aspectos histológicos no processo cicatricial;

• Avaliar morfometricamente a quantidade de colágeno durante o processo de

cicatrização das feridas.


34

6 MATERIAL E MÉTODOS

6.1 Óleo Vegetal

Pesquisas realizadas com a população a respeito de tratamentos para feridas na

pele foi relatado o uso do óleo de Ouratea sp. como um dos produtos naturais mais

utilizados na região. Com base nesta pesquisa foi feita a aquisição comercial do óleo de

Ouratea sp., no Mercado São Sebastião, situado na cidade de Fortaleza, no Estado do

Ceará. O óleo foi acondicionado em frascos de vidro com as seguintes características

qualitativas: coloração amarela translúcida com consistência e odor sui generis. Os

fracos foram armazenados a 25°C, envolvidos em papel laminado a fim de proteger

contra a luminosidade excessiva.

Utilizou-se como referência para o estudo o óleo de Helianthus annus (girassol),

por já possuir sua atividade cicatrizante conhecida (Wendt, 2005). Este óleo foi obtido

comercialmente através de farmácia de manipulação.

6.1.1 Análise Fitoquímica

A análise química dos constituintes do óleo de Ouratea sp. foi realizada por

cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa, realizada no Parque de

Desenvolvimento Tecnológico (PADETEC), em Fortaleza, Ceará. Utilizando

espectrômetro Shimadzu modelo GCMS-QP 5050 sob as seguintes condições: coluna

capilar de sílica fundida W Scientific DB-5MS (50 m x 0,25 mm); gás de arraste: He (1

mL/min); temperatura do injetor: 250°C; temperatura do detector: 200 °C; temperatura

da coluna: 35-180°C a 4°C/min e depois 250°C/15 min; espectro de massa: por impacto

eletrônico a 70 eV. A identificação dos constituintes foi feita por busca em biblioteca de

espectros de massa, tempos de retenção e comparação visual dos espectros de massa

obtidos com os publicados na literatura (Alencar et al., 1984; Adams, 1989).

6.2 Animais

Camundongos Swiss machos, com 8-10 semanas de idade, pesando 32,0 ±

2,0g foram adquiridos e mantidos no Biotério de Criação e Biotério Experimental do


Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães

Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram alojados individualmente em

caixas de polietileno, permanecendo em macroambiente controlado (fotoperíodo de 12h

claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento

de água e ração. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas

preconizadas pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

SBCAL e os protocolos experimentais

Uso de Animais – CEUA da

6.2.1 Procedimento cirúrgico

Os animais foram divididos em três grupos experimentais (n=15/grupo),

anestesiados por via intramuscular (IM) com cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e

cloridrato de cetamina 10% (115 mg/Kg), segu

al. (2001). Após o procedimento anestésico, cada animal foi submetido à tricotomia da

região dorsal e posterior antissepsia utilizando iodopovidona 1%. Com auxílio de um

molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A

ferida cutânea foi produzida pela incisão da pele através de lâmina de bisturi número 15

e a tela subcutânea divulsionada com tesoura íris de pontas tipo fina/fina e pinça de

dissecção, até sua ressecção

6.2.2 Tratamento da lesão

Fig. 8: Procedimento cmetálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida realizada.


Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - CPqAM/FIOCRUZ, localizado



claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento


Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

experimentais foram aprovados pelos Comitês de Ética para o

da Universidade Estadual do Ceará (SPU – 09172748

6.2.1 Procedimento cirúrgico



to de cetamina 10% (115 mg/Kg), seguindo a metodologia proposta por



lico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A



o, até sua ressecção, expondo a fáscia muscular (Fig 8 A-C).

6.2.2 Tratamento da lesão

Procedimento cirúrgico para realização da lesão. A –metálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida


35

CPqAM/FIOCRUZ, localizado no campus da



claro/escuro, temperatura 23 ± 2°C e umidade 55 ± 10%) com fornecimento ad libitum


Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório –

pelos Comitês de Ética para o

09172748-0).



indo a metodologia proposta por Hall et



lico vazado (Ø= 1,0 cm), a pele foi demarcada com caneta dermográfica. A



– molde metálico vazado (Ø= 1,0 cm); B e C: divulsionamento da pele; D: Ferida


Fig. 9: A- Bancada para Microtomiado processo histológico.

Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e,

lesão foi tratada diariamente até o 12º dia de

soluções testes. Os grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental

empregado: G I – animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II

animais tratados com o óleo de

óleo de Ouratea sp.(batiputá).

6.2.3 Análises Histológicas

As amostras do tecido lesionado formam coletadas nos dias 2, 7 e 12. Nestes

tempos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente de cada grupo experimental e

submetidos à eutanásia em câmar

4% (v/v) preparado em PBS 0,01M, pH 7,2 e submetidas ao processamento histológico

de rotina, incluídas em parafina (Fig. 9 A

microtomia com seções de 5 µm na

Em seguida as lâminas das amostras foram coradas pela

(H/E) e pelo Picrosirius. Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente

sob o microscópio de luz em magnificação de 40

aspectos histológicos (Tabela

(+++) (AKKOL et al., 2009). Todos os cortes histológicos foram avaliados de forma

cega pelo mesmo investigador.


Bancada para Microtomia. B e C- Visão em detalhes do processo histológico. D – Processo de coloração das lâminas.

Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e,

lesão foi tratada diariamente até o 12º dia de pós-operatório (p.o.) com

s grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental

animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II

animais tratados com o óleo de H. annus (girassol) e G III – animais tratados com

(batiputá).

6.2.3 Análises Histológicas



submetidos à eutanásia em câmara de CO2. Após isto, foram fixadas em formaldeído a


de rotina, incluídas em parafina (Fig. 9 A-D). O material foi então submetido

microtomia com seções de 5 µm na área logo abaixo da epiderme e formação de crostas.

Em seguida as lâminas das amostras foram coradas pela Hematoxilina

Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente

sob o microscópio de luz em magnificação de 40x e 100x e classificados quanto aos

aspectos histológicos (Tabela 3) em: ausente (-), discreto (+), moderado (++) e intenso


cega pelo mesmo investigador.


36

Visão em detalhes

Após a indução das lesões, os animais ficaram alojados individualmente e, cada

com 100 µL das

s grupos foram divididos de acordo com o tratamento experimental

animais tratados com solução de cloreto de sódio a 0,9%; G II –

animais tratados com o



. Após isto, foram fixadas em formaldeído a


D). O material foi então submetido à

abaixo da epiderme e formação de crostas.

Hematoxilina-Eosina

Os tecidos corados pela H/E foram avaliados qualitativamente

0x e classificados quanto aos

), discreto (+), moderado (++) e intenso



6.2.4 Quantificação do colágeno para análise m

A avaliação morfológica para a quantificação de colágeno foi realizada com as

lâminas das amostras coradas através do Picrosirius. Utilizando um microscópio sob

objetiva de 5x e um software

expressa em percentual (Fig. 10

6.2.5 Análise Macroscópica

Para a análise macroscópica,

foram submetidos ao procedimento cirúrgico

Diariamente, foi realizada a avaliação macroscópica de cada lesão, observando aspectos

como: edema, hiperemia, exsudato, tecido de granulação

6.2.6 Contração da área da lesão

A mensuração da área da lesão foi realizada c

digital (Fig 11). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al.

(1988): A= π.R.r, onde “A” representa a área (cm²); “R”

representa o raio menor.

Fig. 10: A- Equipamento utilizado para realização da morfometria. Visão do software


tificação do colágeno para análise morfométrica



software específico Qwuin (LEICA®), a quantidade de colágeno foi

expressa em percentual (Fig. 10 A-C).

6.2.5 Análise Macroscópica

Para a análise macroscópica, foram utilizados 3 grupos de 10 animais

foram submetidos ao procedimento cirúrgico como descritos a


como: edema, hiperemia, exsudato, tecido de granulação e reepitelização.

6.2.6 Contração da área da lesão

A mensuração da área da lesão foi realizada com o auxílio de um paquímetro

). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al.

.R.r, onde “A” representa a área (cm²); “R” representa o raio maior; “r”

Equipamento utilizado para realização da morfometria. Bsoftware utilizado.

Fig. 11: Paquímetro digital.


37



), a quantidade de colágeno foi

grupos de 10 animais, os quais

como descritos anteriormente.


e reepitelização.

om o auxílio de um paquímetro

). A redução da área foi calculada pela equação formulada por Prata et al.

o raio maior; “r”

B e C-


38

6.3 Análise Estatística

Foi realizada uma análise descritiva dos resultados obtidos. Para testar a suposição

de homogeneidade das variáveis envolvidas no estudo foi aplicado o teste de Bartlett.

Quando observado o pressuposto de homogeneidade entre as variáveis foi aplicado

ANOVA e como post hoc o teste de Tukey, e quando o pressuposto não foi observado,

utilizou-se a ANOVA para variâncias com diferenças, sendo o teste Pair wise t-test

como post hoc. E nos casos em que as observações ocorreram ao longo do tempo de

forma dependente, o teste foi aplicado levando em consideração o pareamento dos

dados. Todas as conclusões foram tomadas ao nível de significância de 5%. Os

softwares utilizados foram o Excel 2000 e o R v2.10.0.


39

7 RESULTADOS

7.1 Análise química do óleo fixo

Os resultados da avaliação química do óleo fixo de Ouratea sp. estão

representados na tabela 2. A cromatografia gasosa acoplada em espectrômetro de massa

detectou a presença de ácidos graxos insaturados no óleo fixo de Ouratea sp. (Fig.12).

O ácido linoléico (40,88%), ácido oléico (28,29%) e o ácido palmítico (20,65%) foram

os componentes majoritários encontrados neste óleo. Além destes ácidos, foram

isolados outros constituintes em menores concentrações, tais como os ácidos esteárico,

linoléico-iso e ecosanóicos.

Figura 12: Cromatografia de Íons Totais (TIC) do óleo de Ouratea sp.

Tabela 2: Composição química qualitativa e quantitativa do óleo fixo de Ouratea sp., com respectivos tempos de retenção correspondente a cada substância.

Tempo ret. %Total Constituintes

18.280 20.65 Ácido Palmítico

20.448 40.88 Ácido Linoléico

20.521 28.29 Ácido Oléico

20.573 1.84 Ácido Elaiclico

20.814 5.67 Ácido Esteárico

20.874 2.25 Ácido Linoléico-iso

23.142 0.42 Ácido Eicosanóico

Tempo de Retenção (min.)

Intensidade


40

7.2 Avaliação Macroscópica

A avaliação macroscópica de cada lesão foi realizada até o 12º dia de p.o., os

seguintes aspectos foram observados: presença de edema, hiperemia, exsudato, tecido

de granulação e reepitelização (Tabela 3).

No 1º dia de p.o, foi observado exsudato sero-saguinolento, hiperemia e edema

nas feridas em todos grupos (Tab. 3 e Fig.13). As lesões presentes nos três grupos

apresentaram sinais flogísticos como: edema, hiperemia e exsudato nos primeiros dias

(0-4 dias de p.o) ( Tabela 3).

Os animais dos grupos I e II apresentaram edema, hiperemia e exudato nos 3

primeiros dias de p.o. Do dia 4 ao dia 7 a hiperemia persistiu, mas houve uma

diminuição no exudato e ausência de edema. O aparecimento de uma crosta de aspecto

granular, espessa foi observado neste período. Não houve desprendimento da crosta

neste grupo durante todo período de observação. Também não foram observados neste

grupo sinais de reepitelização (Figs 13A-C).

Os animais do grupo II (Figs.D-F) e com o óleo de Ouratea sp. (Figs 14 G-H)

apresentaram evolução semelhante ao grupo I nos períodos iniciais de tratamento (0-3

dias). Nos grupos II e III foram observados o aparecimento de uma crosta mais

precocemente do que no grupo controle (grupo I) para este mesmo período de

observação. Nos dias subseqüentes até o dia 7 o grupo II apresentou uma evolução

superior aos demais grupos, com diminuição do exudato, formação de crosta espessa,

sem hiperemia. Já no grupo III foi observado ainda a presença de exudato, embora em

menor quantidade quando comparado com os dias anteriores, uma crosta com aspecto

regular e menos espessa do que nos grupos I e II. Nos períodos de 8-12 dias de p.o. os

dois grupos tratados com os óleos apresentaram desprendimento da crosta, sendo que no

grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. o desprendimento ocorreu mais precocemente

do que no grupo tratado com o óleo de H. annus. Também foi possível observar uma

maior reepitelização no grupo III quando comparado aos demais, sendo esta

característica observada entre os dias 9-10 enquanto para o grupo II apenas a partir do

dia 11. Houve também no grupo III um desprendimento mais rápido da crosta do que os

grupos I e II. Apenas nos grupos do II e III foi observada a presença de re-epitielização

(Figs 13 F-I).


41

Para verificarmos a hipótese do óleo de Ouratea sp. ter sido contaminado, o que

poderia dificultar o processo cicatricial, foi realizado teste microbiológico deste. Nossos

resultados mostraram a ausência de crescimento de microrganismos, confirmando a sua

qualidade.

Ed = edema, Hip = hiperemia, Exs = exsudato, Cr = crosta, Re = re-epitelização, De = desprendimento

da crosta

7.3 Análises Histopatológicas

Para análise histopatológica as lâminas das amostras das lesões foram coradas e

analisadas segundo critérios previamente descritos na metodologia (Tabela 4). A

avaliação histopatológica dos animais do grupo I demonstrou a evolução normal do

processo reparativo. No 2º dia de p.o., o grupo I apresentou infiltrado de células

inflamatórias, principalmente linfócitos. No grupo II, há uma predominância de

Grupos Dias 0 - 4 5 - 7 8 -12 GI

GII

GIII

Ed / Exs / Hip

Ed / Exs / Hip

Ed / Exs / Hip

Hip / Cr

Cr

Exs / Cr

Cr

Re

Re / De

Tabela 3. Avaliação macroscópica durante os dias de tratamento.

NaCl 0,9%

H. annus

Ouratea sp.

Dia 2 Dia 7 Dia 12

Figura 13: Aspectos Macroscópicos das lesões durante tratadas com óleo fixo de Ouratea sp.

por 12 dias consecutivos. Observe a presença da crosta menos espessa no grupo controle (A)

no dia 2 quando comparada com os óleos de girassol (D) e do Batiputá (G) para este mesmo período. Também é possível observar o desprendimento da crosta e a presença de re-


42

neutrófilos sobre linfócitos, enquanto no grupo III apenas neutrófilos são observados no

dia 2 de p.o.

No 7° dia já foi possível observar nos animais dos grupos controles tecido de

granulação com padrão fibrovascular, colagenização com epitélio desorganizado nas

bordas das lesões. Estas fibras se mostraram mais organizadas no 12º dia p.o. quando

também se pode observar a presença do processo de re-epitelização. Também foi

importante observar que grupos controles não apresentavam folículo piloso durante todo

o tempo de observação. A presença de fibroblastos entre os grupos foi bastante

diversificada. Foi possível observar a presença destas células no grupo controle e nos

grupos tratados com os óleos. No entanto, elas são mais abundantes nos grupos III e II

no último dia de observação, não sendo observadas nestes grupos no 7° dia e sendo

moderados no dia 2º de p.o.

O grupo tratado com óleo de H. annus apresentou um infiltrado inflamatório

considerável no 2° dia, quando comparado ao grupo tratado com óleo de Ouratea sp.

No 12º dia p.o. o grupo tratado com NaCl a 0,9% apresentou fibras colágenas

organizadas e, os camundongos tratados com o óleo de H. annus e o óleo de Ouratea sp.

apresentaram características histopatológicas semelhantes: re-epitelização, presença de

fibroplasia e fibras colágenas (Figura 14 A-I).

Escores: ausente (-), discreto (+), moderado (++) ou intenso (+++).

PARÂMETROS HISTOLÓGICOS

GRUPO I GRUPO II GRUPO III

DIA 02

DIA 07

DIA 12

DIA 02

DIA 07

DIA 12

DIA 02

DIA 07

DIA 12

Células Inflamatórias:

Linfócitos Neutrófilos Monócitos Eosinófilos

+++ - - + - - - - - + +++ - +++ - - +++ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Edema Congestão de vasos Hemácias Tecido de granulação Angiogênese Fibroblasto Fibras colágenas Epitélio desorganizado Epitélio em organização Reepitelização Queratina Glândula sebácea Folículo piloso

- - - + + + + ++ - - - - -

- - - ++ - - + ++

- - - + - - ++ +++ - + - - - - - - + + - - - - - +++ + + - - - - - +++ ++ ++ ++ - +++ ++ - +++ - + +++ - +++ +++ - - ++ ++ - + + - - - - - +++ - - +++ - - - ++ +++ - ++ +++ - - - - ++ - - - - - - - - - - - - - - - +++ - - +++ - -

Tabela 4: Aspecto qualitativo da avaliação histológica do potencial de cicatrização do óleo fixo de Ouratea sp.


43

7.4 Contração da Área da Lesão

A evolução macroscópica do processo cicatricial foi acompanhada pela

mensuração das lesões ao longo dos 12 dias p.o. (Fig. 15). A partir do 6º dia p.o. o

grupo tratado com NaCl a 0,9% iniciou uma contração significativa da área da lesão, o

grupo tratado com o óleo de H. annus teve uma contração significativa da área da lesão

a partir do 7º dia p.o. e o grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. reduziu

significativamente a área da lesão a partir do 4º dia p.o.

NaCl 0,9%

H. annus

Ouratea sp.

Dia 2 Dia 7 Dia 12

Figura 14: Avaliação microscópica (H&E) dos tecidos tratados à base de óleos vegetais em diferentes dias sobre a cicatrização cutânea: Grupo I: NaCl 0,9% (A=D2, B=D7; C=D12) –; Grupo II: H. annus (D=D2; E=D7; F=D12); Grupo III: Ouratea sp.(G=D2; H=D7; I=D12). Legenda: c= crosta; q= queratina; ep= epitélio; vs= vaso sanguíneo; tg= tecido de granulação; ci= células inflamatórias; fb= fibroblastos.


44

7.5 Análise Morfometria

A análise morfométrica da quantidade de colágeno demonstrou que em todos os

grupos houve uma tendência ao aumento da deposição de colágeno sendo que a partir

do 2º dia um aumento mais pronunciado foi observado no grupo tratado com solução de

NaCl 0,9%, quando comparados aos demais grupos analisados. No decorrer dos dias de

tratamento, o grupo controle apresentou uma redução gradativa quanto ao conteúdo de

colágeno depositado. Todavia, os grupos tratados com os óleos H. annus e Ouratea sp.

comportaram-se de forma oposta ao grupo controle, pois com o decorrer dos dias de

tratamento o percentual de colágeno apresentou-se em maiores quantidades (Fig. 16).

Figura 15: Tratamento com o óleo fixo de Ouratea sp. sobre a área da lesão

Fig. 16: Porcentagem da deposição de colágeno durante o tratamento.

Percentual de C

olágeno (%)


45

8 DISCUSSÃO

A cicatrização é um processo complexo e dinâmico de restabelecimento das

estruturas celulares e, consequentemente, das camadas do tecido epitelial. Este processo

é realizado a fim de estabelecer uma reepitelização mais próxima do seu estado normal

(Kumar et al., 2006). Algumas plantas são medicinais utilizadas de maneira empírica

como o óleo Ouratea sp., popularmente conhecido por batiputá, que é utilizado como

agente para diversas afecções da pele, inclusive, como cicatrizante para feridas

cutâneas.

Devido a sua disponibilidade no Nordeste Brasileiro e, mais especificamente, no

interior do Estado do Ceará, as espécies de Ouratea sp., são bastante utilizadas pela

população como tônicas e adstringentes (O. castanaefolia, O. parviflora), como anti-

inflamatório e em doenças da pele (O. parviflora) e no tratamento de doenças gástricas

(O. spectabilis) (Corrêa, 1975; Paulo et al., 1986; Felício et al., 2004).

No presente trabalho nós analisamos o potencial cicatrizante do óleo do Batiputá

e utilizamos o óleo de H. annus, o girassol, como tratamento de referência. Este óleo já

é bastante utilizado em feridas abertas promovendo um menor desconforto doloroso ao

indivíduo (Eurides et. al., 2006). Quando observadas as respostas cicatriciais das feridas

cutâneas, nos tratamentos utilizados, estas podem ser atribuídas ao fato de tanto o óleo

de girassol quanto o de Batiputá apresentarem como componentes mais abundantes os

ácidos linoléico (ômega 6) e oléico (ômega 9). Segundo De Nardi et al. (2004), estes

ácidos tem importante função no processo inflamatório, na proliferação e modulação do

crescimento celular. Desta forma, os efeitos superiores destes óleos tanto na qualidade

quanto no tempo da reepitelização da lesão pode ser atribuído a ação conjunta destes

ácidos. No entanto, não se pode descartar a hipótese de outros constituintes encontrados

em menor quantidade possa estar agindo sinergicamente potencializando sua ação

cicatrizante. O ácido linoléico em alta concentração no óleo de girassol foi aplicado em

lesões escamosas e dermatose por Van Dorp, 1974 e Prottey et al., 1975 onde

observaram a reversão e a cura dessas lesões. Hartop Prottey, 1976 também mostrou

que, quando aplicado via cutânea, ambos os ácidos (linoléico e iso-linoleico), restaurada

a permeabilidade da epiderme na pele de ratos. De acordo com Glasgow e Eling, 1990,

o ácido linoléico é essencial para a regulação de eventos bioquímicos que precedem a

mitogênese fibroblástica uma vez que estimula alguns fatores de crescimento celular e ,

segundo Moch D. et al., 1990 por ser um poderoso mediador pró-inflamatório (ácido


46

linoléico) provoca a migração de granulócitos e macrófagos, bem como mudanças

importantes no tecido da granulação.

A avaliação histopatológica mostrou um maior acúmulo de células inflamatórias

no grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. Sabe-se que a fase inflamatória é uma etapa

das mais importantes no processo de cicatrização. É nesta fase que células como

neutrófilos, responsáveis pela fagocitose de restos celulares e agentes estranhos,

proliferam no sítio da lesão, ativados pela permeabilidade vascular e pela ação de

substâncias quimiotáticas, como fatores do crescimento, citocinas, fatores plaquetários

entre outros. Esses dados corroboram com os dados encontrados por Ribeiro et al.,

2009, que observaram a presença de infiltrado inflamatório severo, predominantemente

neutrofílico. E segundo Gurmel et al. 1998, as feridas dos animais tratados com

curcumina demonstraram reepitelização, neovascularização, aumento da migração de

várias células, incluindo fibroblastos, miofibroblastos e macrófagos no leito da ferida, e

um maior teor de colágeno. Macrófagos também estão presentes nos sítios da lesão

auxiliando os neutrófilos na fagocitose secretando sinalizadores de fibroblastos os quais

são os responsáveis pela síntese do colágeno (Guidugli-Neto, 1992). Assim, embora

nossos resultados sejam aparentemente paradoxais com relação ao aumento da atividade

inflamatória no óleo do Batiputá em relação ao grupo controle, esta atividade

aumentada pode contribuir para uma maior resposta destas células e por conseguinte,

aumentar a eficiência do processo cicatricial. Por outro lado, a hipótese que uma

eventual contaminação dos óleos com micro-organismos pudesse estar afetando e

exacerbando a resposta inflamatória local também deveria ser considerada. Desta forma

realizamos teste bacteriológico destes óleos. Os resultados negativos quanto a presença

de microrganismos nos óleos analisados refutaram esta hipótese.

Durante todo o estudo, a mensuração da área ferida foi realizada, sendo

observada a redução da lesão em todos os grupos. Embora não tenha havido diferenças

significativas entre os grupos com relação a este parâmetro no decorrer do período total

de observação, nossos dados mostraram que a retração da lesão se dá de maneira mais

precoce no grupo do Batiputá. Um importante fator de morbidade de uma ferida é o

tempo que esta leva para completar o processo de cicatrização. Assim a possibilidade de

que uma ferida pode infeccionar é tanto maior quanto maior for a área comprometida

(Branon, 2002; Clark, 2003). Desta forma, o Batiputá apresentaria uma vantagem em

relação aos demais, uma vez que o tratamento com este óleo favorece a contratura

significativa da lesão em um espaço mais curto de tempo diminuindo as chances de uma


47

eventual contaminação. Segundo Madison e Gronwal, 1992 o processo de contração das

feridas ocorre em três fases: uma fase inicial, na qual as bordas da ferida apresentam

retração centrífuga e a área da lesão aumenta; a seguir, um período de contração rápida

em direção ao centro da lesão, e finalmente, quando a ferida está praticamente

cicatrizada, o processo torna-se mais lento, deixando a curva de cicatrização na forma

de platô. O aumento da área das lesões registrado logo após o traumatismo se deve,

segundo Barber, 1990 à associação da perda da tensão ao edema da pele. Segundo

Kumar et al., 2006, os animais tratados com a casca da uva em pó da Cabernet

Sauvignon, exibiram aumentos significantes nas a taxa de contração da ferida, a taxa de

epitelização. Corroborando com os resultados de Baie e Sheikh, 2000 que trataram ratos

com o óleo de peixe, e até ao final de doze dias obtiveram 80% de contração da ferida.

O tecido de granulação formado na penúltima parte da fase proliferativa é

composto principalmente de fibroblastos, colágeno (tipo III), células inflamatórias,

fibronectina e novos pequenos vasos sanguíneos. Colágeno, o principal componente

estrutural de granulação tecidos, fortalece e apóia matriz extracelular tecidos, e

eventualmente substitui a fibronectina temporária matriz. Este é considerado o principal

componente que fortalece e suporta o tecido extracelular, pois é composto de

aminoácidos dentre eles a hidroxiprolina, e tem sido usado como um marcador

bioquímico tecidual (Kumar et al., 2006). Tomariz et. al., 2002 demonstraram que a

deposição de colágeno recém-sintetizado no local da ferida, amplia a concentração deste

por unidade de área e, portanto, aumenta a resistência à tração do tecido, interferindo

positivamente na contração da área lesionada. Para verificarmos os efeitos dos

tratamentos com os óleos sobre a deposição de colágeno, foi realizada a análise

morfométrica através da quantificação desta proteína. Nossos resultados demonstraram

um aumento significativo da quantidade de colágeno em todos os grupos testados, sendo

que no decorrer do tratamento, o grupo tratado com o óleo de Ouratea sp. foi o que

apresentou aumento significativo na quantidade da proteína (p=0,04) em relação ao

grupo controle, no 12º dia. Estes dados corroboram tanto as nossas análises histológicas

quanto macroscópicas. Consistentemente, nossos achados revelam que apenas o grupo

tratado com os óleos de batiputá e do girassol apresentaram uma repitelização eficiente

e sugerem que o bom resultado de repitelização alcançado pelos óleos se deva a uma

deposição eficiente do colágeno nestes grupos em relação ao controle. Segundo

Schumacher et al., 1992 e D’utra Vaz 1995 características clínicas semelhantes foram

observadas para lesões cutâneas em equinos avaliadas nos primeiros dias após a


48

indução, que foram associadas ao pico da fase inicial do processo inflamatório. De

acordo com Marques et. al., 2004 Ao sétimo dia após a excisão, as feridas tratadas com

ácidos graxos essenciais, apresentaram-se evoluídas macroscopicamente que as feridas

do grupo controle devido a um grande desenvolvimento do tecido de granulação,

contração na borda exterior das fronteiras e da ausência de secreção. Por outro Por outro

lado, as feridas controle apresentaram extensas áreas de hiperemia, crosta e edema.

Nossos dados sugerem o óleo fixo de Batiputá como alternativa terapêutica no

tratamento de feridas. No entanto, maiores estudos ainda se fazem necessário para uma

melhor compreensão do papel deste óleo sobre a fisiologia da cicatrização de lesões da

pele.


49

9 CONCLUSÕES

O óleo fixo de Ouratea sp. apresentou os ácidos linoléico (40,88%), oléico

(28,29%) e palmítico (20,65%) como componentes majoritários;

O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu re-epitelização a partir do oitavo

dia e retração da área da lesão mais evidente a partir do quarto dia;

O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu migração neutrofílica, proliferação

de fibroblastos e aumento de fibras colágenas;

O tratamento com o óleo de Ouratea sp. induziu maior percentual de colágeno.

Portanto, concluiu-se que óleo fxo de Ouratea sp. auxilia e acelera o processo de

cicatrização, mostrando potencial terapêutico sobre as lesões cutâneas, comprovando,

desta forma, o seu uso popular como agente cicatrizante.


50

10 PERSPECTIVAS

Como as lesões de pele, particularmente as feridas, possuem grande importância

clínica em função da alta frequência com que ocorrem entre os animais domésticos, este

estudo aponta perspectivas para a utilização do óleo de Ouratea sp. em ferimentos

cutâneos.

Além do mais, novos protocolos com o intuito de verificar a concentração ideal

do óleo fixo de Batiputá para sua utilização em ferimentos cutâneos devem ser

avaliados em animais de diferentes espécies.


51

11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA

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