ASPECTOS TOXICOLÓGICOS DO TRATAMENTO CRÔNICO DE … · Aos meus pais, pelo amor, carinho e apoio incondicionais. Obrigada por acreditarem nos meus sonhos e muitas vezes abrirem

KARINA TACIANA SANTOS SILVA

ASPECTOS TOXICOLÓGICOS DO TRATAMENTO CRÔNICO DE RATOS

WISTAR COM DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA:

INDUÇÃO DE CÂNCER E MARCADORES TUMORAIS

Ouro Preto – MG, fevereiro de 2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ASPECTOS TOXICOLÓGICOS DO TRATAMENTO CRÔNICO DE RATOS

WISTAR COM DIBENZOTIOFENO E DIBENZOTIOFENO SULFONA:

INDUÇÃO DE CÂNCER E MARCADORES TUMORAIS

AUTORA: Karina Taciana Santos Silva ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade COORIENTADOR: Prof. Dr. William de Castro Borges

Ouro Preto – MG, fevereiro de 2011

Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica

Silva, K.T.S. Catalogação

i

Catalogação: [email protected]

S586a Silva, Karina Taciana Santos. Aspectos toxicológicos do tratamento crônico de ratos Wistar com

dibenzotiofeno e dibenzotiofeno sulfona [manuscrito] : indução de câncer e marcadores tumorais / Karina Taciana Santos Silva. - 2011.

xx, 95f.: il. color; grafs.; tabs. Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.

1. Câncer - Teses. 2. Glicoproteínas - Teses. 3. Lectinas - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 615.77:616-006

mailto:[email protected]

Silva, K.T.S. Colaboradores

ii

COLABORADORES

Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima

Renata Alves de Oliveira e Castro

Aline Dias de Almeida

Vinícius Corrêa Rodrigues

Silva, K.T.S. Laboratório/Auxílio

iii

Este trabalho foi realizado no LABORATÓRIO DE ENZIMOLOGIA E PROTEÔMICA –

ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES) e Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

Silva, K.T.S. Dedicatória

iv

Dedico esta dissertação aos meus pais, minhas fontes de força, amor e apoio incondicionais.

Silva, K.T.S. Epígrafe

v

“Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida com paixão, perder com classe e vencer com ousadia, pois o triunfo pertence a quem se atreve.”

Charles Chaplin.

Silva, K.T.S. Agradecimentos

vi

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, pelo amor, carinho e apoio incondicionais. Obrigada por acreditarem

nos meus sonhos e muitas vezes abrirem mão dos seus para que essa conquista se tornasse

possível.

A minha irmã, pela amizade e companheirismo mesmo à distância.

Ao Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade, pela orientação, por todos os anos

de convívio, amizade, paciência e aprendizado. Obrigada por tornar a conclusão deste

trabalho possível.

Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela amizade, disponibilidade e

aprendizado. Obrigada pela Co-orientação e por compartilhar os problemas, alegrias e

enfrentar comigo as dificuldades encontradas.

Ao Técnico José Henrique Braga Fortes, muito obrigada por toda a ajuda “técnica”,

pela amizade, risadas e por compartilhar as alegrias, angústias e dúvidas surgidas

durante esses anos de convivência.

Ao Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima, pelo aprendizado e colaboração.

À Renata, pela colaboração e disponibilidade dedicadas a este trabalho.

Aos alunos de iniciação científica Aline, Vinícius e Pablo, que participaram

diretamente da realização deste trabalho, obrigada pela ajuda inestimável. Sem vocês, a

conclusão deste trabalho teria sido impossível.

Aos mestrandos (Micheline, Marina, Igor, Jonathan, Gustavo e Lorran) e demais

membros do LEP (Simone, Leandro, Rose, Rosália, Priscila) obrigada pelas festas,

risadas, conversas jogadas fora e pela ajuda, principalmente nos momentos finais do

desenvolvimento deste trabalho.

À Juliana, por dividir comigo os 7 anos de estudos em Ouro Preto, obrigada pela

amizade verdadeira, por sempre estar presente nos momentos mais difíceis e também pela

contribuição para a finalização desta dissertação.

À Sonaly, amiga querida que fiz durante esta jornada, obrigada pelo apoio,

desabafos e companheirismo.

Silva, K.T.S. Agradecimentos

vii

Aos laboratórios LIMP, LIP e LBBM por permitirem o uso de equipamentos e

dependências para realização de parte deste trabalho.

À secretária do NUPEB, Cida, pela paciência infinita, amizade e presteza,

determinantes na concretização desta etapa.

Aos professores do NUPEB que contribuíram de maneira construtiva para a

realização deste trabalho.

Enfim, agradeço a todos que de maneira direta ou indireta contribuíram para a

realização deste trabalho.

Silva, K.T.S. Índice

viii

ÍNDICE

Resumo......................................................................................................................................xi

Abstract..................................................................................................................................xiii

Lista de Abreviaturas.............................................................................................................xv

Lista de Figuras......................................................................................................................xvi

Lista de Tabelas......................................................................................................................xix

1. Introdução..............................................................................................................................2

1.1. Epidemiologia do Câncer.........................................................................................2 1.2. Neoplasias................................................................................................................3 1.3. Câncer Colorretal.....................................................................................................5 1.4. Glicoproteínas..........................................................................................................8 1.4.1. Relação de glicoproteínas com desenvolvimento de câncer..........................12 1.5. Lectinas e Ligantes de Carboidratos......................................................................15 1.5.1. Lectina de Canavalia ensiformis....................................................................17 1.5.2. Lectina de Artocarpus integrifolia.................................................................18 1.5.3. Lectina de Erythrina speciosa........................................................................19 1.5.4. Ácido m-Aminofenil Borônico......................................................................19 1.6. Carcinogênese Química..........................................................................................20 1.6.1. Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona.....................................................22

2. Justificativa..........................................................................................................................27

3. Objetivos..............................................................................................................................29

3.1. Objetivo Geral........................................................................................................29 3.2. Objetivos Específicos.............................................................................................29

4. Material e Métodos.............................................................................................................31

4.1. Indução de Câncer em ratos Wistar tratados com DMH, DBT e DBTO2..............31 4.1.1. Hemograma....................................................................................................32 4.1.2. Dosagens enzimáticas de ALT, AST e amilase.............................................32 4.1.3. Análise histológica.........................................................................................33 4.1.4. Extração de proteínas.....................................................................................33 4.1.5. Western blotting.............................................................................................34 4.2. Preparação de Suportes Cromatográficos para Análise de Glicoproteínas............35 4.2.1. Teste de quantificação de imobilização de proteínas.....................................44


ix

4.2.2. Verificação da eficácia de imobilização de proteínas....................................45 4.2.3. Verificação da ocorrência de ligações não específicas..................................45 4.3. Purificação de Lectinas..........................................................................................45 4.3.1. Purificação da lectina de Canavalia ensiformis.............................................46 4.3.2. Purificação da lectina de Artocarpus integrifolia..........................................46 4.3.3. Purificação da lectina de Erythrina speciosa.................................................46 4.3.4. Dosagens de proteínas....................................................................................47 4.3.5. Ensaio de hemaglutinação..............................................................................47 4.3.6. Teste de resistência das lectinas à presença de detergentes...........................48 4.4. Síntese de Colunas de Afinidade com Lectinas e Ácido Amino Borônico............48 4.5. Testes das Resinas com Clara de Ovo....................................................................49 4.6. Análise Estatística..................................................................................................49

5. Resultados e Discussão........................................................................................................51

5.1. Efeitos Biológicos de DMH, DBT e DBTO2 em ratos Wistar...............................51 5.1.1. Hemograma e dosagens séricas de AST, ALT e amilase...............................52 5.1.2. Avaliação das alterações de peso do fígado e do baço...................................57 5.1.3. Avaliações morfológicas macro e microscópicas..........................................57 5.1.4. Western blotting.............................................................................................63 5.2. Estudo do Glicoproteoma.......................................................................................63 5.2.1. Preparação de colunas de afinidade de elevada capacidade...........................64 5.2.2. Avaliação das colunas para glicoproteínas empregando a clara de ovo como amostra modelo.........................................................................................................................66 5.2.3. Ensaio de deteminação da capacidade hemaglutinante de lectinas e sua resitência à presença de detergentes..........................................................................................67

5.2.4. Extração de proteínas dos tecidos obtidos após a necropsia dos animais......69 5.2.5. Isolamento de glicoproteínas de membrana das amostras de animais controles

e testes tratados com DBT e DBTO2........................................................................................71

6. Conclusões............................................................................................................................74

7. Perspectivas.........................................................................................................................76

8. Referências Bibliográficas..................................................................................................78

9. Apêndice...............................................................................................................................92

9.1. Controle de Qualidade de Imobilização para as Resinas Obtidas pelo Protocolo FNHSCA...................................................................................................................................92 9.1.1. Avaliação da eficácia de imobilização de proteínas.......................................92


x

9.1.2. Verificação da ocorrência de interações não específicas...............................92 9.2. Purificação das Lectinas ConA, Jacalina e EspecL................................................93 9.2.1. Purificação de ConA......................................................................................93 9.2.2. Purificação de Jacalina...................................................................................93 9.2.3. Purificação de EspecL....................................................................................94

Silva, K.T.S. Resumo

xi

RESUMO

O alto conteúdo de compostos orgassulfurados nos derivados de petróleo compromete sua qualidade; assim, sua remoção ou conversão a substâncias menos tóxicas são importantes etapas durante o refinamento de óleo. Os limites de concentração para esses compostos estão

sob rígido controle em diversos países com o objetivo de minimizar seu impacto negativo sobre a saúde animal e o ambiente. Dentre eles, o dibenzotiofeno (DBT) é um hidrocarboneto policíclico aromático que contém um átomo de enxofre em substituição a um carbono em sua estrutura. Devido à importância dessas moléculas na oncogênese e a escassez de investigações toxicológicas relacionadas ao DBT, este trabalho se propôs a realizar uma avaliação dos efeitos tóxicos promovidos por um tratamento crônico de ratos Wistar com doses sub-letais (30 e 150 mg/kg) de DBT e seu derivado oxidado DBTO2 (dibenzotiofeno sulfona), ambos administrados durante 10 semanas. Em paralelo, seus efeitos tóxicos foram comparados com aqueles provocados pelo tratamento com o agente mutagênico clássico, 1,2-dimetilhidrazina (DMH), administrado a 30 mg/kg durante o mesmo período. Na 14º semana após a última dose, os animais foram sacrificados para uma avaliação inicial da contagem de células sanguíneas e das funções hepáticas e pancreáticas. Não foram observadas alterações nos parâmetros celulares ou indicações de lesões hepáticas e pancreáticas. Entretanto, lesões pré-neoplásicas no intestino delgado dos animais tratados com DBT e DBTO2 mostraram-se comparáveis em intensidade e morfologia com aquelas encontradas no cólon de animais

tratados com DMH. Análises histopatológicas revelaram a ocorrência de processos neoplásicos em estágio inicial de desenvolvimento. Em concordância com esse achado, os marcadores tumorais CD44 e CEA (antígeno carcinoembrionário), comumente associados ao câncer de intestino avançado, não foram detectados por Western blotting nos extratos proteicos dos animais tratados. Com o objetivo de isolar o glicoproteoma associado ao desenvolvimento deste tipo de câncer, diversos métodos de imobilização de proteína foram testados. O protocolo mais apropriado foi o FNHSCA (N-Hidroxysuccinylcaproyl-Fractogel), assim determinado por sua alta capacidade de imobilização e manutenção da atividade enzimática da tripsina bovina. Nosso próximo passo envolveu a imobilização do ligante não-específico de carboidratos, ácido amino borônico, e das lectinas ConA, Jacalina e EspecL, utilizando o protocolo selecionado, para o enriquecimento de glicoproteínas presentes em extratos totais de proteínas. Uma análise preliminar utilizando clara de ovo

Silva, K.T.S. Resumo

xii

como amostra, revelou padrões eletroforéticos distintos associados às diferentes colunas de afinidade produzidas. Enfim, uma análise comparativa das frações de proteína de animais controles e testes utilizando SDS-PAGE revelou uma discreta diferença no padrão de bandas eletroforéticas associadas aos tratamentos com DBT e DBTO2, e diferenças mais pronunciadas para o tratamento de animais com DMH. A identificação de tais proteínas por espectrometria de massas possui potencial para a identificação de novos marcadores moleculares para a detecção e prognóstico de alterações celulares e teciduais promovidas por esses agentes.

Silva, K.T.S. Abstract

xiii

ABSTRACT

The high content of organosulfur compounds in petroleum derivatives compromises their quality and, therefore, their removal or conversion to less toxic substances are important steps during oil refining. The concentration limits of such compounds in fuels are under strict control worldwide with the aim to minimize their negative impact upon animal health and the

environment. Among them, dibenzothiophene (DBT) is a polycyclic aromatic hydrocarbon containing a sulfur atom replacing a carbon in the main structure. Given the importance of such molecules during oncogenesis and the scarcity of toxicological investigations related to DBT, this work proposes an evaluation of the toxic effects promoted by a chronic treatment of Wistar rats with sub-lethal doses (30 and 150 mg/kg) of DBT and its oxidized derivative DBTO2 (dibenzothiophene sulfone), both administered during 10 weeks. In parallel, their toxicological effects were compared to those inflicted by treatment with the classic mutagenic compound, 1,2 dimethylhydrazine (DMH), given at 30 mg/kg for the same period. At the 14th week after the last dose, the animals were sacrificed for the initial evaluation of blood cell counts and assessment of hepatic and pancreatic functions. We have observed no alterations in either blood cell parameters or indication of liver and spleen injuries. However, pre-neoplastic lesions in the small intestine of DBT and DBTO2 treated animals were comparable in intensity and morphology to those found in the colon of DMH-treated animals. Hystophatological analyses revealed the occurrence of a neoplastic process at an early stage of development. In agreement with this finding two tumor markers CD44 and CEA

(carcinoembrionic antigen), commonly associated to advanced intestine cancer, were not detected by Western blotting using protein extracts from treated animals. Aiming to isolate the glycoproteome associated to the development of this type of cancer, diverse protein immobilization methods were evaluated. The most appropriate coupling protocol was the FNHSCA (N-Hidroxysuccinylcaproyl-Fractogel), as judged by the high binding capacity and maintenance of the enzymatic activity of bovine trypsin. Our next step involved immobilization of the non-specific carbohydrate ligant, aminoboronic acid, and the lectins ConA, Jacalin and EspecL, using the selected protocol, for enrichment of glycoproteins present in crude extracts. A preliminary analysis using the egg white revealed distinct eletrophoretic patterns associated to the different affinity columns produced. At last, a comparative analysis of the protein fractions from control and treated animals using SDS-PAGE revealed a discrete differential band patterning associated to DBT and DBTO2

Silva, K.T.S. Abstract

xiv

treatment, with the differences being more pronounced for DMH-treated animals. The identification of such proteins by mass spectrometry has the potential to reveal new molecular markers for detection and prognosis of the cell and tissue alterations promoted by these agents.

Silva, K.T.S. Lista de Abreviaturas

xv

LISTA DE ABREVIATURAS

AAT- Antígeno associado ao tumor ACF- Focos de criptas aberrantes AET- Antígenos específicos do tumor ALT- Alanino amino transferase

ANOVA- Análise de variância AST- Aspartato amino trasnferase BSD- Síndrome do saco azul C- Chitosan CA- Carbohydrate antigen CCA- N-Caproyl-Chitosan CCR- Câncer colorretal CD44- Cluster of differentiation 44 CEA- Carcinoembrionic antigen CEUA- Comissão de ética no uso de animais ConA- Concanavalina A CYP450s- Citocromos P450 DBT- Dibenzotiofeno DBTO2- Dibenzotiofeno sulfona DCC- Diciclohexilcarbodiimida DL50- Dose Letal 50% DL-BApNA- N-α-benzoil-DL-arginil-p-nitroanilida DMH- 1,2-Dimetilhidrazina ErbB- Família de proteínas EGFR

EspecL- Lectina de Erythrina speciosa FCA- Caproyl-Fractogel FD- Dextran-Fractogel FDCA- Dextrancaproylsuccinyl-Fractogel

FDCANHS-

Dextranamidosuccinylcaproylsuccinyl-Fractogel FNHS- N-Hidroxysuccinyl-Fractogel FNHSCA- N-Hidroxysuccinylcaproyl-Fractogel Fuc- Fucose Gal- Galactose

GalNAc- N-acetilgalactosamina GalNAcT- N-acetilgalactosamina transferase GlcNAc- N-acetilglicosamina

GPI- Glicosilfosfatidilinositol HE- Hematoxilina/Eosina

Her2/neu- subtipo ErbB-2 de proteínas

HPAs- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

HPASs- Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos sulfurados

HRP- Horseradish peroxidase

IARC- Agência internacional para pesquisa em câncer INCA- Instituto Nacional do Câncer kDa- kiloDalton

MPT- Modificação pós traducional NHS- N-hidroxisuccinimida

O-GlcNAc- O-N-Acetilglicosamina

OPAS- Organização Pan-Americana de Saúde p/v- peso/volume

PAF- Polipose adenomatosa familiar

Silva, K.T.S. Lista de Abreviaturas

xvi

PIC- Coquetel de inibidores de protease

PMSF- Phenylmethanesulfonyl fluoride

ppm- Partes por milhão

PSA- Antígeno prostático específico

PVDF- Polyvinylidene fluoride

RER- Retículo endoplasmático rugoso

SDS- Duodecil sulfato de sódio

SLe- Sialyl Lewis

SNHS- N-hydroxyamidosuccinyl-Agarose

TIMP-1- Tissue inhibitor of metalloproteinases

UI- Unidades internacionais

UICC- Union for International Cancer Control v/v- volume/volume

VEGF- Vascular endothelial growth factor WHO- World Health Organization

Silva, K.T.S. Lista de Figuras

xvii

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Eventos celulares envolvidos no estabelecimento de metástases por células malignas......................................................................................................................................4 Figura 02: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal. Aassociação de iniciação e progressão da tumorogênese de uma mucosa normal em carcinoma e metástase com características morfológicas e histopatológicas .........................................................................6 Figura 03: Processamento de oligossacarídios N-ligados no RER (A) e Golgi (B)................. 9 Figura 04: (A) Diversificação dos três subtipos de N-glicanos gerados no complexo de Golgi: ricos em manose, híbridos, e complexos. (B) Representação simbólica de monossacarídios comuns.. ...................................................................................................................................10 Figura 05: (A) O-glicanos dos subtipos “Core 1” e “Core 2” formados por transferases GalT (Core 1) e GlcNAcT (Core2). (B) O-glicanos dos subtipos “Core 3” e “Core 4” cuja formação é controlada pelas enzimas GlcNAcT. .....................................................................................11 Figura 06: Alterações nos padrões de glicosilação durante a transformação maligna. (A) Células epiteliais normais. (B) Após a transformação maligna, alterações na maquinaria celular resultam no aparecimento de diferentes padrões de glicosilação..................................13 Figura 07: Eventos envolvidos na progressão tumoral onde existe a participação de glicanos.....................................................................................................................................14 Figura 08: Representação das estruturas terciária e quaternária da Concanavalina A (ConA). A) Estrutura monomérica. B) Estrutura tetramérica. ...............................................................17 Figura 09: Representação das estruturas monomérica e tetramérica da Jacalina. A) Estrutura monomérica ligada ao carboidrato manose. B) Estrutura tetramérica da Jacalina ligada ao antígeno-T. ..............................................................................................................................18 Figura 10: Representação da estrutura dimérica da lectina de Erythrina corallodendron que apresenta alto grau de homologia com a lectina de Erythrina speciosa. .................................19 Figura 11: Interação entre o Ácido fenil borônico e compostos que contenham cis-dióis em solução aquosa................................................................. ........................................................20 Figura 12: Carcinógenos exógenos como causadores de anomalias genéticas adquiridas......21 Figura 13: Estruturas químicas dos principais compostos contendo enxofre encontrados no petróleo.. ...................................................................................................................................23 Figura 14: “Via 4S”. O enxofre é removido na forma de sulfito, permanecendo intacta a estrutura carbonilada... .............................................................................................................25


xviii

Figura 15: Esquema representativo do tempo de tratamento e espera para o desenvolvimento de alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2.............................32 Figura 16: Etapas realizadas para obtenção de proteínas de membrana, lisossomais e citosólicas a partir dos tecidos obtidos de ratos Wistar tratados com DBT, DBTO2 e DMH...34 Figura 17: A) Representação da estrutura da Sepharose 4B; B) Representação da estrutura do Fractogel EMD Epoxy; C) Representação da estrutura do Quitosano......................................36 Figura 18: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas em Dextranhydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Fractogel (FDCANHS).................................38 Figura 19: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas descritas em N-Hidroxysuccinylcaproyl-Fractogel (FNHSCA)..............................................39 Figura 20: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas descritas em Caproyl-Fractogel (FCA). ..................................................................................39 Figura 21: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas descritas em N- Hidroxysuccinyl-Fractogel (FNHS)................................................................40 Figura 22: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas descritas em Chitosan (C).........................................................................................................42 Figura 23: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas descritas em N-Caproyl-Chitosan (CCA).................................................................................43 Figura 24: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas descritas em N- Hydroxyamidosuccinyl-Agarose (SNHS).......................................................43 Figura 25: Representação esquemática da estrutura obtida após a realização das etapas descritas em N- Hydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Agarose (SNHSCA)........................44 Figura 26: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos controles e testes ao longo de 24 semanas de tratamento/latência............................................51 Figura 27: Medida do volume globular (hematócrito) das hemácias provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência....................................................52 Figura 28: Contagens global e diferencial de leucócitos provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência......................................................................54 Figura 29: Dosagens enzimáticas séricas dos níves e AST, ALT e amilase provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência........................................56 Figura 30: Relações Peso Fígado/Peso Animal (A) e Peso Baço/Peso Animal (B) provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência............57


xix

Figura 31: A) Fotografia de parte do intestino grosso de animal pertencente ao grupo Teste DMH 30 mg/kg. B) Fotografia de parte do intestino delgado de animais pertencentes aos grupos Testes DBT 30 mg/kg e DBTO2 30 mg/kg respectivamente.......................................58 Figura 32: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado corados pela técnica de HE. a, c, e, g 110x. b, d, f 220x. h 440x...............................................................................62 Figura 33: Gráfico com os resultados obtidos para quantificação de proteína imobilizada (mg proteína/ g resina) para as três diferentes matrizes sólidas e protocolos utilizados.................65 Figura 34: SDS-PAGE 15% de amostras íntegras de clara de ovo (Am. Ínt. 120x 80x e 20x) e de amostras eluídas das colunas de lectinas e ácido amino borônico......................................67 Figura 35: SDS-PAGE 12% de extrato total de proteínas de membrana dos grupos controles e testes.......................................................................................................................................70 Figura 36: Figura 35: SDS-PAGE 12% de extrato total de proteínas citosólicas dos grupos controles e testes.......................................................................................................................71 Figura 37: SDS-PAGE 12% das amostras de extratos de proteínas de membrana dos grupos Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/kg e Teste DBTO2 30 mg/kg submetidas às colunas contendo lectinas e ácido amino borônico imobilizado............................................................72 Figura 38: Perfil de eluição em coluna G-75 obtido para a cromatografia de extrato de Canavalia ensiformis e purificação da lectina ConA................................................................93 Figura 39: Perfil de eluição em coluna Fractogel-Goma-guar obtido para a cromatografia de extrato de Artocarpus integrifolia e purificação da lectina Jacalina.........................................94 Figura 40: Perfil de eluição em coluna Galactosil-Sepharose obtido para a cromatografia de extrato de Erythrina speciosa e purificação da lectina EspecL................................................94 Figura 41: SDS-PAGE 15% das lectinas purificadas a partir de sementes de Canavalia ensiformis (ConA), Erythrina speciosa (EspecL) e Artocarpus integrifolia (Jacalina)...........95

Silva, K.T.S. Lista de Tabelas

xx

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Frequência das populações celulares (série branca) normalmente encontradas em ratos...........................................................................................................................................53 Tabela 02: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino delgado para os grupos Controle Óleo e Controle Salina...................................................................................59 Tabela 03: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino grosso para os grupos Controle Óleo e Controle Salina...................................................................................59 Tabela 04: Frequência das lesões observadas no intestino delgado para os grupos Controle Salina e Teste DMH 30 mg/kg.................................................................................................60 Tabela 05: Frequência das lesões observadas no intestino grosso para os grupos Controle Salina e Teste DMH 30 mg/kg.................................................................................................60 Tabela 06: Frequência das lesões observadas no intestino delgado para os grupos Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/kg, Teste DBTO2 30 mg/kg, Teste DBT 150 mg/kg e Teste DBTO2 150 mg/kg.................................................................................................................................60 Tabela 07: Frequência das lesões observadas no intestino grosso para os grupos Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/kg, Teste DBTO2 30 mg/kg, Teste DBT 150 mg/kg e Teste DBTO2 150 mg/kg.................................................................................................................................61 Tabela 08: Protocolos testados para obtenção de colunas de afinidade com alta capacidade e quantidade de proteína (tripsina) imobilizada ± desvio padrão................................................64 Tabela 09: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL na presença de TritonX-100 0,5 e 1% em 10 minutos de contato.....................................................................68 Tabela 10: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL presença de TritonX-100 0,5 e 1% em 30 minutos de contato.....................................................................68 Tabela 11: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL na presença de SDS 0,5 e 1% em 10 minutos de contato..................................................................................68 Tabela 12: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL na presença de SDS 0,5 e 1% em 30 minutos de contato..................................................................................68

1. Introdução

Silva, K.T.S. Introdução

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Epidemiologia do câncer

Apesar dos avanços tecnológicos, a incidência e a mortalidade por câncer têm aumentado nas últimas décadas. Em 2008, a Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC)/Organização Mundial de Saúde (WHO) estimou que ocorreriam 12,4 milhões de novos casos e 7,6 milhões de óbitos por câncer, doença esta que em 2030 será responsável por mais de 11 milhões de óbitos em todo o mundo (UICC, 2005; WHO, 2007, 2008).

Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) o câncer é uma importante causa de doença e morte no Brasil e desde 2003 as neoplasias malignas representam quase 17% dos óbitos de causa conhecida notificados no Sistema de Informações sobre Mortalidade. As estimativas para o ano de 2010 serão válidas também para o ano de 2011 e apontam para a ocorrência de 489.270 novos casos de câncer. Destes, aproximadamente 56 mil irão acometer o trato gastrointestinal (INCA, 2010).

A explicação para estes altos índices está na maior exposição dos indivíduos a fatores de risco cancerígenos. A redefinição dos padrões de vida, a partir da uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo desencadeados pelo processo global de industrialização refletem-se no perfil epidemiológico das populações (MONTESANO, 2001). O câncer constitui, assim, problema de saúde pública para o mundo desenvolvido e também para nações em desenvolvimento, nas quais a soma de casos novos diagnosticados a cada ano atinge 50% do total observado nos cinco continentes, como registrou em 2002 a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) (INCA, 2006).

Diante deste cenário, fica clara a necessidade da continuidade em investimentos no desenvolvimento de ações para o controle do câncer nos diferentes níveis de atuação, como na promoção da saúde, na detecção precoce, na assistência aos pacientes, e na formação de recursos humanos.


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1.2. Neoplasias

Neoplasia (gr. “neo” + “plasis” = neoformação) é o termo utilizado para caracterizar a proliferação local de clones celulares atípicos, sem causa aparente, de crescimento excessivo, progressivo, ilimitado, não coordenado, autônomo, irreversível, e com tendência a perda de diferenciação celular (ROBBINS & COTRAN, 2010). No entanto, a persistência do crescimento é resultado de alterações genéticas que permitem a proliferação excessiva e desregulada de forma autônoma; apesar de os tumores geralmente dependerem do organismo hospedeiro para nutrição e suprimento sanguíneo.

As anomalias genéticas encontradas no câncer afetam tipicamente três classes gerais de genes (CROCE, 2008). Os genes promotores, ou oncogenes (1), os genes supressores de tumor (2) e, os genes envolvidos no reparo do DNA (3). Quando algum desses sofre mutação, os controles genéticos pelos quais eles são responsáveis são perdidos e o processo carcinogênico pode ser iniciado (VOGELSTEIN and KINZLER, 2004; LEA et al, 2007; CROCE, 2008).

Desta forma, o câncer é uma doença complexa e multicausal que ocorre como consequência do acúmulo progressivo de mutações nos genes onde os produtos protéicos desempenham importantes papéis no controle da proliferação e diferenciação celular e na apoptose. Usualmente, diversos fatores promotores atuam anteriormente ao desenvolvimento neoplásico e com poucas exceções, uma mutação única não é suficiente para o estabelecimento da doença.

Os resultados das mutações gênicas podem apresentar diferenças nos níveis de alterações promovidas em novas células, as quais normalmente terão fenótipos anormais geralmente incompatíveis com as funções celulares normais. De acordo com o grau de agressividade e crescimento, os tumores podem ser separados em duas grandes categorias: (1) benignos, quando as características micro e macroscópicas demonstram que o tumor permanece localizado e, portanto, não dissemina para outros sítios; (2) malignos, referidos como câncer e com a capacidade de invadir tecidos contíguos, destruir as estruturas adjacentes e se disseminar para sítios distantes (metastatizar) (Rubin, 2006).

Todos os tumores, benignos ou malignos, apresentam dois componentes básicos: células neoplásicas clonais que constituem seu parênquima, e estroma reativo, constituído de tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e quantidade variável de macrófagos e linfócitos (Fig. 01).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Oncogene

http://pt.wikipedia.org/wiki/Gene_supressor_de_tumor

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Figura 01: Eventos celulares envolvidos no estabelecimento de metástases por células malignas.

Fonte: Robbins & Cotran, 2010. Sabe-se que os tumores malignos induzem resposta inflamatória celular crônica não

relacionada com necrose ou infecção do tumor, e o infiltrado é composto principalmente de células T e macrófagos. Assim, a defesa imunológica responde a antígenos tumorais presentes na superfície das células malignas expressos diferencialmente daqueles das células normais e, em alguns casos, pode ser responsável pelo retardo do crescimento tumoral e de sua progressão (ZBAR, 2004).

Esses antígenos podem ser específicos do tumor (AET) ou seja, os novos antígenos são expressos apenas pelas células cancerosas ou, podem representar proteínas expressas por algumas células normais, como as de embriões em desenvolvimento. Tais antígenos estão associados ao tumor (AAT) e não são tumor-específicos.

In vitro, células isoladas do sistema imune têm mostrado serem efetivas contra tumores através de mecanismos como lise osmótica ou apoptose e citotoxicidade celular. In vivo, contudo, os tumores parecem desenvolver mecanismos de escape ao sistema imune. As células neoplásicas podem evadir à imunovigilância por diversas vias, sendo a capacidade de


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interferência na função das células imunes o principal motivo de falha no controle da progressão tumoral (DUNN et al, 2004; BELLATI et al, 2009). Além disso, o papel do microambiente tumoral no reconhecimento e progressão do câncer tem sido cada vez mais estudado, e as interações entre as células imunes, as células tumorais e os componentes moleculares do tumor exercem influência significativa na progressão da doença (ROSENBERG, 2004).

1.3. Câncer Colorretal

O Câncer Colorretal (CCR) constitui atualmente uma neoplasia de ocorrência universal e de importância crescente como problema de saúde pública. Sua incidência varia de maneira importante entre os diferentes países, representando a terceira causa de câncer no mundo entre ambos os sexos e a segunda em países desenvolvidos (LOPEZ et al, 1993; JEMAL et al, 2005).

Fatores de risco hereditários e ambientais (dietéticos ou não) estão envolvidos no desenvolvimento do CCR. As alterações genéticas que levam a esta doença podem ser adquiridas, gerando o chamado câncer esporádico, responsável por 75 a 85% dos casos. Neles existe uma ação cumulativa de agentes carcinógenos ambientais e dietéticos sobre a mucosa, levando a modificações específicas no DNA das células do epitélio intestinal (CAMPOS, 2008). Em outras circunstâncias, o indivíduo já apresenta ao nascimento ou adquire precocemente mutações específicas que desencadeiam as formas hereditárias do CCR, representadas principalmente pela polipose adenomatosa familiar (PAF) e pelo câncer colorretal hereditário não associado à polipose (HOOPS and TRABER, 1997).

Quanto à influência da alimentação, é sabido que a dieta ocidental caracterizada pelo alto teor de gordura saturada, juntamente com a ingestão excessiva de proteína de origem animal e baixo teor de fibras, está associada à maior potencial carcinogênico. Também são considerados nocivos, os fatores relacionados ao estilo de vida como fumo, sedentarismo, obesidade, consumo excessivo de álcool e ingestão de aminas heterocíclicas e hidrocarbonetos aromáticos (MARQUES-VIDAL, 2006).

O trato intestinal é responsável pela digestão e absorção de alimentos sendo anatomicamente subdividido em intestino delgado e cólon. O epitélio de revestimento do intestino é composto por uma camada epitelial única que no intestino delgado, possui a forma


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de pequenos poços chamados de criptas e estão localizados entre o vilos. O colo possui estrutura similar ao intestino delgado, porém, com formas epiteliais diferentes apresentando-se mais planas (VRIES et al, 2010).

Os adenomas constituem os tipos de pólipos mais frequentemente encontrados no intestino delgado, possuindo predileção pelo duodeno distal embora possam ser encontrados em toda a sua extensão. Histologicamente, eles são similares aos adenomas encontrados na região colorretal tendendo a apresentar uma arquitetura de vilos mais pronunciada. Assim como para a região colorretal, o risco de progressão maligna de um adenoma é maior quanto maior for o pólipo (BROSENS et al, 2010).

A transformação de células epiteliais normais em adenomas e carcinomas segue, usualmente, um modelo de progressão de estágios histológicos e alterações genéticas e epigenéticas simultâneas (FEARON and VOGELSTEIN, 1990) (Fig. 02). Tais alterações fornecem às células neoplásicas vantagens sob sua expansão clonal e levam à perda da inibição por contato celular, evasão de mecanismos apoptóticos e de interrupção do ciclo celular, aquisição de características do tipo célula tronco, entre outros (CARDOSO et al, 2007).

Figura 02: Sequência adenoma-carcinoma em câncer colorretal. A iniciação e progressão da tumorogênese de uma mucosa normal em carcinoma e metástase é geralmente associada a características morfológicas e histopatológicas (como observado pela colonoscopia).

Fonte: Adaptado de CARDOSO et al, 2007.

A sequência adenoma-carcinoma-metástase é iniciada quando surgem pequenas lesões na arquitetura glandular do epitélio intestinal chamadas focos de criptas aberrantes (ACF). Os ACF são agregados de criptas anormais caracterizados por hiperproliferação, tamanho


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aumentado, zonas pericrípticas expandidas e fendas alongadas (ROSENBERG and LIU, 1995; PAPANIKOLAOU et al, 1998, 2000).

Algumas mutações estágio-específicas que ocorrem no modelo de progressão adenoma-carcinoma-metástase são conhecidas, e incluem alterações no gene supressor de tumor APC (Adenomatous polyposis coli) (Epitélio normal Adenoma), no proto-oncogene K-ras (presente em adenomas) e no gene supressor de tumor p53 (na transição Adenoma Carcinoma) (NAMBIAR et al, 2010). Além disso, outros genes estão significativamente alterados em diferentes classes de tumores e envolvidos na carcinogênese colorretal, no entanto, métodos de classificação e estadiamento do tumor e realização de prognósticos mais robustos e menos invasivos continuam sendo necessidades médicas ainda não atendidas (HOOPS and TRABER, 1997; NAMBIAR et al, 2010).

Os recentes progressos da proteômica têm contribuído para o entendimento da patofisiologia das neoplasias, propiciando novas perspectivas para diagnósticos e descoberta de novas drogas anti-câncer. A avaliação sistemática do proteoma, de forma a comparar a expressão proteica de duas células, tecidos ou organismos em diferentes condições fisiológicas possibilita a obtenção de informações para identificação, quantificação e caracterização de modificações pós-traducionais presentes em proteínas e que influenciam diretamente o funcionamento celular (WILKINS et al, 1995; CHO, 2007).

Nesse sentido, a proteômica tem sido utilizada também como nova ferramenta na busca por biomarcadores moleculares para o CCR. As alterações na expressão proteica envolvidas na transformação maligna podem ser monitoradas de maneira quantitativa e qualitativa e fornecem valiosas informações que podem ser utilizadas para a obtenção de diagnósticos e prognósticos mais efetivos. Além disso, representam um grande impacto na oncologia clínica, especialmente se o biomarcador pode ser detectado antes dos sintomas clínicos ou se permite um acompanhamento da resposta ao tratamento (CHO, 2007; AHLQUIST, 2010).

Muitos antígenos de superfície demonstram estar relacionados com a malignidade ou potencial metastático de alguns tipos de câncer. Entre eles, os antígenos modificados por carboidratos têm sido extensivamente estudados e relacionados ao comportamento biológico do carcinoma e prognóstico dos pacientes. Neste contexto, as proteínas associadas à membrana plasmática são de interesse particular considerando seu desempenho em funções cruciais em importantes processos celulares, tais como o reconhecimento celular e as vias de transdução de sinais (MATSUSHITA et al, 1997; ÁLVAREZ-CHAVER et al, 2007).


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Embora as alterações moleculares relacionadas ao CCR tenham sido extensivamente investigadas, poucos pesquisadores têm descrito as aplicações desses biomarcadores na detecção de estágios primários de diagnóstico e prevenção do câncer colorretal. Considerando que o CCR pode ser prevenido se o adenoma for diagnosticado e removido, torna-se necessária a identificação de marcadores capazes de diagnosticar de maneira tecido-específica e precoce as alterações iniciais que ocorrem durante o desenvolvimento desta doença (CHANG et al, 2005).

1.4. Glicoproteínas

A glicosilação é a ligação covalente de moléculas de carboidratos a proteínas, lipídios

ou outros compostos orgânicos, catalisados por glicosiltransferases, utilizando açúcares específicos como substratos. Os glicanos são encontrados em diversos tipos de biomoléculas classificadas em diferentes famílias de gliconjugados: glicoproteínas, glicoesfingolipídios, proteoglicanos e proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol (GPI). Existem mais de 20 tipos de MPT, e, dentre eles, a glicosilação é a mais comum. Por esta razão, o desenvolvimento de métodos proteômicos para o estudo desta modificação pós-traducional têm se tornado cada vez mais importante (DURHAM and REGNIER, 2006; REIS et al, 2010).

A variabilidade estrutural e complexidade de glicanos da superfície celular permitem que estas moléculas desempenhem de maneira sofisticada as funções de sinalização, reconhecimento e adesão celular estando, portanto, envolvidas em diversas funções a saber: desenvolvimento embrionário normal, reconhecimento célula-célula, sinalização celular, interação hospedeiro-patógeno durante processos de infecção, resposta imune, desenvolvimento de doenças, metástase, tráfego intracelular e localização, nível de degradação de moléculas e fluidez de membrana (DENNIS et al, 1999; BLOMME et al, 2009; GHAZARIAN et al, 2010).

As ligações glicosídicas dos oligossacarídeos com proteínas podem ser formadas por meio de dois mecanismos. O primeiro, N-glicosilação, envolve a ligação de N-acetilglicosamina (GlcNAc) à amina da cadeia lateral do aminoácido asparagina (Asn) geralmente na sequência Asn-X-Ser(Thr)-, onde X pode ser qualquer aminoácido com exceção da prolina (Pro). O segundo mecanismo denominado O-glicosilação, envolve a


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ligação de C-1 da N-acetilgalactosamina (GalNAc) à hidroxila da cadeia lateral dos aminoácidos serina (Ser) ou treonina (Thr) (TAYLOR and DRICKAMER, 2006).

A adição de carboidratos a proteínas para a formação de glicanos envolve o retículo endoplasmático rugoso (RER) e o complexo de Golgi de maneira co- e pós-traducional. Na síntese de N-glicanos, o mRNA codificante para a glicoproteína liga-se ao ribossomo no citoplasma e este adere à face citoplasmática do RER. A cadeia de proteína nascente é ligada a um oligossacarídio precursor e então internalizada no RER. O processamento inicial da cadeia de oligossacarídios é realizado ainda no RER e a proteína é transferida para o Complexo de Golgi onde ocorre a modificação final da cadeia de carboidratos envolvendo atividade de glicosidases e posterior adição de outros resíduos de sacarídios (Fig. 03) (VARKI et al, 1999).

Figura 03: Processamento de oligossacarídios N-ligados no RER (A) e Golgi (B). A maioria dos glicanos N processados inicia através de ação de uma α-manosidase do RER seguido de processamento por isozimas presentes no Complexo de Golgi.

Fonte: HELENIUS et al, 2001. Existem três subtipos de glicanos em vertebrados: (1) Ricos em Manose; (2) Híbridos

e (3) Complexos. As estruturas híbridas são definidas como aquelas com resíduos de manose substituídos (ligação GlcNAc) e não substituídos. Os glicanos complexos são aqueles onde os resíduos de manose α3 e α6 são substituídos por moléculas de GlcNAc (Fig. 04). Os glicanos complexos não apresentam uma estrutura padronizada e representam maioria dos glicanos extracelulares.


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As ligações N-glicosídicas em eucariotas podem desempenhar diversas funções, sendo a mais importante, a participação na montagem da conformação adequada de polipeptídios recém-sintetizados no RER, desempenhada principalmente por um sistema de proteínas chaperonas no chamado ciclo calnexina-calreticulina. Esse sistema permite que as células produzam e secretem proteínas complexas e também explica o motivo para a adição de N-glicanos ocorrer de maneira co-transducional no RER (antes que seja formada a estrutura terciária da proteína). Quando a glicosilação é inibida, o efeito mais comum observado é a geração de proteínas malformadas e agregadas que não alcançam o estado funcional, sendo posteriormente direcionadas para a degradação (HELENIUS and AEBI, 2001).

Figura 04: (A) Diversificação dos três subtipos de N-glicanos gerados no complexo de Golgi: ricos em manose, híbridos, e complexos. A maioria dos N-glicanos secretados e de superfície é do tipo complexo e gerado por duas rotas possíveis. (B) Representação simbólicade monossacarídios comuns.

Fonte: Adaptado de VARKI et al, 1999.

Em geral, o grau de glicosilação é ditado por uma regulação tecido específica dos genes das glicosiltransferases, pela disponibilidade de precursores glicosilados, pela atividade e nível de expressão da enzima oligossacariltransferase, pela competição entre as enzimas por aceptores intermediários durante a elongação do glicano e pelo número de sítios Asn-X-


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Thr/Ser presentes na sequência primária da proteína assim como por sua acessibilidade estrutural (DENNIS et al, 1999; GHAZARIAN et al, 2010). A síntese de O-glicanos é mais simples que a dos N-glicanos e não requer um precursor oligossacarídio. O evento inicial é a adição do monossacarídio GalNAc à resíduos de serina ou treonina catalisado por uma enzima GalNAc transferase (GalNAcT). Ao contrário da N-glicosilação, não existe sequência consenso para a adição de açúcares na formação do O-glicanos, embora existam alguns algorítmos preditivos presentes em bancos de dados. A maioria das cadeias de O-glicanos é longa contendo monossacarídios terminais variáveis, pequeno número de ramificações, e presença frequente de estruturas com duas antenas (VARKI et al, 1999).

Os O-glicanos também apresentam subtipos baseados na ligação diferencial de monossacarídios ao GalNAc não substituído. Podem ser formadas quatro tipos de estruturas, porém, a maioria dos O-glicanos contém a estrutura chamada de “Core1” formada pela adição de galactose em uma ligação β1-3 a GalNAc (Fig. 05).

Figura 05: (A) O-glicanos dos subtipos “Core 1” e “Core 2”. A formação destes subtipos é controlada pela atividade das transferases GalT (Core 1) e GlcNAcT (Core2). Biossínteses adicionais podem envolver lactosaminas fucosiladas e sializadas. (B) O-glicanos dos subtipos “Core 3” e “Core 4” cuja formação é controlada pelas enzimas GlcNAcT (Para descrição dos monossacarídios ver legenda na Figura 05).

Fonte: Adaptado de VARKI et al, 1999.


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A O-glicosilação de certas proteínas está relacionada com a resposta imune por ativação de células T, participação na sinalização de insulina, metabolismo de glicose e progressão do ciclo celular. Assim, O-GlcNAc desempenha papéis essenciais na transdução de sinal tanto através da associação dessa classe de glicoproteínas com outras proteínas, quanto afetando sua atividade diretamente. Em alguns exemplos recentes, O-GlcNAc está envolvida na modificação do fator de transcrição Sp1 que se torna hiperglicosilado em resposta a hiperglicemia ou elevação nos níveis de glicosamina prevenindo sua degradação proteassomal e inibindo sua interação hidrofóbica com fatores de transcrição associados permitindo assim, a ativação de importantes genes no diabetes (ROOS et al, 1997; WELLS et al, 2001).

1.4.1. Relação de Glicoproteínas com Desenvolvimento de Câncer

A glicosilação de proteínas e lipídios é uma das alterações moleculares que

acompanham a transformação maligna. Aproximadamente 80% das proteínas de superfície e secretadas são glicosiladas e a maquinaria enzimática responsável pela introdução desta MPT é alterada no desenvolvimento tumoral. As alterações induzidas comparadas ao estado normal incluem a hipo/hiper expressão de glicanos de ocorrência natural, e também modificações em suas estruturas tornando a população molecular e celular de glicanos candidatos potenciais para marcadores diagnósticos (DENNIS et al, 1999; THAYSEN-ANDERSEN et al, 2008).

As alterações relacionadas com tumores mais observadas incluem um aumento na ramificação de N-glicanos, elevação no grau de sialilação, síntese de ácidos polisiálicos, surgimento de antígenos de Lewis em glicoproteínas e glicolipídios e encurtamento das cadeias sacarídicas de O-glicanos particularmente em proteínas do tipo mucinas (Fig. 06). Em geral, essas alterações estão associadas a um mau prognóstico e capacidade agressiva e metastática do tumor. Normalmente, esses epítopos são expressos durante o desenvolvimento embrionário e fetal e estão ausentes em tecidos adultos (AARNOUDSE et al, 2006).

Tais alterações resultam em um aumento na exposição de resíduos terminais de galactose como os encontrados no antígeno T associado ao câncer (Galβ1-3GalNAc) e no trissacarídio de Lewisx (Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc). Um potencial papel dos ligantes de galactose na metástase é destacado pela correlação entre o aumento da expressão de galectinas (proteínas ligantes de galactose) e a capacidade de metástase de muitas células neoplásicas malignas. Acredita-se que as galectinas facilitem a ligação destas células circulantes às células


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do endotélio vascular através da sua ligação a ligantes carboidratos na superfície de células tumorais (POWLESLAND et al, 2009).

Figura 06: Alterações nos padrões de glicosilação durante a transformação maligna. (A) Células epiteliais normais. (B) Após a transformação maligna, alterações na maquinaria celular resultam no aparecimento de diferentes padrões de glicosilação.

Fonte: Adaptado de AARNOUDSE et al, 2006. Diferenças nos padrões de glicosilação de proteínas produzidas por células tumorais

refletem mudanças fundamentais nos níveis enzimáticos (ou atividades enzimáticas) das glicosiltransferases envolvidas na via de glicosilação. A atividade aumentada dessas enzimas específicas (que podem levar ao aumento da expressão de certos resíduos terminais como ácido siálico ou fucose) ou a diminuição da atividade da enzima manosidase (levando à diminuição da clivagem de estruturas ricas em manose, com o aumento correspondente de ramificações no núcleo), podem levar à superexpressão de glicosilação altamente ramificada observada no câncer (DALL’OLIO, et al, 2001).

Os glicanos podem regular diferentes aspectos da progressão tumoral, incluindo a proliferação, modulada por alterações em receptores para fatores de crescimento (ex. ERBB2-ERBB3); invasão, associada com a expressão de glicanos sialilados que promovem a dissociação de células tumorais (ex. superexpressão de STn); metástase, através da ligação de selectinas a antígenos tumorais de Lewis (SLeX ou SLeA); e angiogênese pela liberação


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tumoral de fatores pró-angiogênicos como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Fig. 07) (FUSTER and ESKO, 2005).

Figura 07: Eventos envolvidos na progressão tumoral onde existe a participação de glicanos. A) Oligomerização e receptores tirosina quinases (ERBB2-ERBB3) mediada por gangliosídios (GM1). B) Invasão tumoral por dissociação associada à superexpressão de glicanos sialilados. C) Disseminação de células tumorais através da corrente sanguínea facilitada pelas selectinas que promovem a ligação destas células a elementos sanguíneos. D) Angiogênese tumoral requerida para o crescimento patológico do câncer primário e suas metástases, promovida pela liberação de fatores de crescimento endotelial (VEGF) e ativada por proteglicano.

Fonte: FUSTER and ESKO, 2005. Mudanças nos padrões de glicosilação têm sido observadas nos cânceres de próstata,

colorretal, ovariano e de mama. Muitos marcadores clínicos conhecidos são glicoproteínas,


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por exemplo, antígeno 19-9 no câncer gastrointestinal, CD 340 (Her2/neu) no câncer de mama, CA 125 no câncer de ovário, antígeno prostático específico (PSA) no câncer de próstata e antígeno carcinoembrionário (CEA) nos cânceres colorretal, de bexiga, mama, pancreático e pulmonar (ZHAO et al, 2008).

O antígeno carcinoembrionário (CEA) é uma glicoproteína de membrana de alta massa molecular pertencente à superfamília das imunoglobulinas. Esta molécula desempenha papéis na adesão celular, imunidade e apoptose estando implicada na ocorrência de metástase. O CEA é o marcador utilizado atualmente na clínica para prognóstico molecular em câncer colorretal. A concentração sérica desta molécula acima de 5 ng/mL está associada com a recorrência da doença e metástase (DUFFY et al, 2003; KAHLENBERG et al, 2003).

Embora o CEA seja o biomarcador mais utilizado no CCR, sua detecção somente torna-se possível em pacientes cujo estágio de desenvolvimento do CCR é avançado, o impede que ele seja útil na detecção precoce deste tipo de câncer. Outros antígenos tumorais têm sido estudados como potenciais biomarcadores para o CCR. Entre eles destacam-se o CA19-9 (carbohydrate antigen19-9), CA 242, CA-195, CA 50, CA 74-2, CD44 (cluster differentiation 44) e o TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1). Entretanto, assim como o CEA, esses marcadores possuem baixa sensibilidade e especificidade não sendo adequados para propósitos de triagem ou diagnóstico precoce para o CCR (CHO et al, 1997; COPPOLA et al, 1998; LI et al, 2001; DUFFY et al, 2003; QIU et al, 2008).

Desta forma, é de grande interesse estudar e validar técnicas que sejam capazes de isolar e identificar glicoproteínas com padrões de glicosilação alterados que desempenhem papéis em eventos críticos na progressão tumoral e possuam utilidade como marcadores para a detecção precoce do câncer.

1.5. Lectinas e Ligantes de Carboidratos

As lectinas constituem uma classe estruturalmente diversa de proteínas, as quais

possuem a capacidade de se ligarem de maneira reversível a carboidratos com considerável especificidade. São constituídas de monômeros arranjados tridimensionalmente, formando dímeros, tetrâmeros, heterodímeros, etc. Podem ser monovalentes, com um sítio ligante glicídico por monômero, ou polivalentes com mais de um sítio ligante glicídico por monômero. Devido a essas propriedades ligantes, as lectinas possuem inúmeras atividades


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biológicas importantes, tais como a habilidade de aglutinar eritrócitos, linfócitos, fibroblastos, espermatozóides, fungos, bactérias e células vegetais. Em função dessa capacidade de aglutinação, tais proteínas são também referidas como aglutininas (SHARON, 1993; ELGAVISH, 1997; PEUMANS, 1995 a,b).

Tais propriedades tornam as lectinas moléculas úteis para a detecção, isolamento e caracterização parcial de glicoproteínas, e ainda possibilitam o estudo das mudanças dos padrões glicídicos que podem ocorrer no glicocálice nas superfícies celulares durante o desenvolvimento, diferenciação e transformação neoplásica. A partir da década de 80 e início dos anos 90 do século passado, o interesse pelas lectinas intensificou-se consideravelmente devido ao fato dessas proteínas estarem envolvidas na mediação do reconhecimento celular em muitos sistemas biológicos, tais como a adesão de bactérias, vírus e protozoários em células de hospedeiros (pré-requisito para a infecção); adesão de leucócitos em células do endotélio vascular, fatores decisivos durante o trânsito dessas células nos sistemas vivos e também para sua atuação na defesa contra os patógenos (SHARON, 1993; KENNEDY et al, 1994).

A especificidade glicídica é um dos critérios para se classificar as lectinas. Sendo assim, tais proteínas podem ser divididas em cinco grupos:

Grupo 1: D-manose ligantes; Grupo 2: D-galactose/ N-Acetil-D-Galactosamina ligantes; Grupo 3: N-Acetilglicosamina ligantes; Grupo 4: L-fucose ligantes; Grupo 5: Ácido N-Acetilneuramínico ligantes. Esta classificação é relevante no que concerne às funções biológicas das lectinas, pois

de todos os carboidratos presentes na natureza apenas os citados acima são constituintes típicos das superfícies de células eucariotas (LORIS et al, 1998).

Diversos estudos têm mostrado que os carboidratos da superfície celular são modificados durante a transformação maligna, diferenciação celular tumoral e metástase. Considerando que a maioria das lectinas reage especificamente com açúcares terminais de glicoproteínas ou glicolipídios presentes na superfície celular, elas podem ser utilizadas na caracterização destes glicoconjugados. Devido à suas especificidades de ligação, as lectinas têm sido utilizadas como alvos moleculares específicos com potencial aplicação na bioquímica, citoquímica e histologia para o estudo de diferenças sutis entre os


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glicoconjugados presentes na superfície celular de células normais e malignas não detectadas pelos anticorpos monoclonais disponíveis (MODY et al, 1995; MINKO, 2004; THOM et al, 2007).

1.5.1. Lectina de Canavalia ensiformis

A lectina Concanavalina A (ConA) é extraída da leguminosa Canavalia ensiformis,

sendo constituída de uma estrutura homotetramérica com cada monômero possuindo 237 resíduos de aminoácidos. Seus monômeros adotam uma conformação conservada nas famílias de lectinas de leguminosas e outras famílias de lectinas. A conformação consiste de três folhas-β com fitas antiparalelas (AGRAWAL and GOLDSTEIN, 1967).

Cada monômero possui um sítio de ligação ao substrato glicídico, sendo a lectina tetravalente. Além disso, a ConA possui ponto isoelétrico igual a 7,1 e assume a forma dimérica em pHs abaixo de 6. Seus substratos incluem a manose e a glicose, embora estudos termodinâmicos indiquem que a manose se liga mais fortemente à ConA quando comparada à glicose. O sítio de ligação é conservado e inclui a formação de ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e algumas interações mediadas pela molécula de água realizadas pelos resíduos Tyr-12, Pro-13, Asn-14, Thr-15, Asp-16, Leu-99, Asp-208 e Arg-228. A ligação de íons metálicos à estrutura também são de grande importância para a manutenção da conformação nativa (Fig. 08) (KAUSHIK et al, 2009).

Figura 08: Representação das estruturas terciária e quaternária da Concanavalina A (ConA). A) Estrutura monomérica. B) Estrutura tetramérica. As esferas claras representam as moléculas de carboidratos ligadas à lectina e as esferas escuras os íons cálcio e manganês necessários à manutenção da estrutura.

Fonte: KAUSHIK, 2009.


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1.5.2. Lectina de Artocarpus integrifolia

A lectina Jacalina é extraída da semente de Artocarpus integrifolia e tem sido utilizada

como ferramenta experimental por apresentar propriedades bioquímicas e imunológicas interessantes tais como a ligação a glicoproteínas IgA sérica e IgA secretora ligando-se especificamente à subclasse IgA-1 humana. Liga-se também à IgD e possui atividade imunomoduladora sobre a resposta de IgE (SELL and COSTA, 2000).

Esta lectina possui também a capacidade de ligação ao antígeno Thomsen-Friedenreich (Antígeno T – Galβ1-3GalNAc), que é um dissacarídio de origem não oncofetal com relação bem documentada com tumores humanos. Ele é geralmente expresso em mais de 85% dos carcinomas de cólon, mama, bexiga, cavidade bucal e próstata. Assim, proteínas que possuam especificidade de ligação com este antígeno, possuem valor diagnóstico potencial (JEYAPRAKASH et al, 2002; a).

A Jacalina assume a conformação tetramérica, com massa molecular de 66 kDa, constituída por cadeias α e β, podendo apresentar variações que geram isoformas, e especificidade para os açúcares galactose e manose (Fig. 09) (JEYAPRAKASH et al, 2005; b; NAKAMURA-TSURUTA et al, 2008).

Figura 09: Representação das estruturas monomérica e tetramérica da Jacalina. A) Estrutura monomérica ligada ao carboidrato manose. Os “loops” envolvidos na ligação ao açúcar estão numerados. B) Estrutura tetramérica da Jacalina ligada ao antígeno-T. Os loops envolvidos na ligação estão numerados na subunidade à esquerda.

Fonte: Adapatdo de JEYAPRAKASH, 2002 e 2005 (a,b).


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1.5.3. Lectina de Erythrina speciosa

A lectina EspecL é extraída das sementes da Erythrina speciosa e possui afinidade de

ligação com o açúcar GalNAc. Sua estrutura apresenta forma homodimérica onde cada subunidade é composta por três folhas-β com massa aproximada de 30 kDa para cada subunidade, e alto grau de conservação entre as demais espécies do gênero (Fig. 10). Como observado para outras lectinas, a presença dos íons cálcio e manganês são essenciais para a ligação com açúcares (KONOZY et al, 2003; KULKAMI et al, 2004) .

Figura 10: Representação da estrutura dimérica da lectina de Erythrina corallodendron que apresenta alto grau de homologia com a lectina de Erythrina speciosa. São mostrados também, os sítios de ligação para os íons cálcio e manganês e o sítio de ligação para o carboidrato.

Fonte: KULKAMI, 2004.

1.5.4. Ácido m-Aminofenil Borônico

O ligante de origem não proteica ácido m-aminofenil borônico tem sido utilizado em

cromatografia de afinidade para a separação de ácidos nucleicos e carboidratos. Sua especificidade permite o isolamento de diversos compostos que contém porções cis-diol incluindo catecóis, nucleosídios, nucleotídios, ácidos nucleicos, carboidratos, glicoproteínas e enzimas (Fig. 11). A interação básica que ocorre na cromatografia com boronato é a esterificação entre os ligantes boronato e as porções cis-diol. Para que ocorra tal interação, é necessário que os dois grupos diol estejam em átomos de carbono adjacentes e configuração coplanar, ou seja, 1,2-cis-diol. Algumas constantes de dissociação para os diésteres de ácido fenilborônico já são conhecidas, entre elas: adonitol 2,2x10-3 M; dulcitol 1,1x10-3 M; manitol


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3,3x10-3 M; NADH 5,9x10-3 M; frutose 1,2x10-4 M. Estas constantes de dissociação são relativamente altas quando comparadas às constantes 10-4 – 10-5 M observadas na maioria das interações de afinidade ligante/proteína (LIU, 2006).

Figura 11: Interação entre o Ácido fenil borônico e compostos que contenham cis-dióis em solução aquosa.

Fonte: LIU, 2006. As lectinas e ligantes de carboidratos constituem excelentes ferramentas para o

isolamento de microcomponentes presentes em amostras de tecidos cancerosos, os quais podem representar marcadores biológicos para esta doença. Desta forma, a utilização de colunas de afinidade que empreguem estas moléculas como ligantes e que possuam elevada capacidade e especificidade para identificação de glicoproteínas em amostras biológicas complexas submetidas a análise proteômica é de fundamental importância para a busca de novos marcadores. A diversidade de métodos de imobilização para a confecção de colunas de afinidade e a existência de novos materiais que poderiam aumentar o desempenho das análises tem encorajado vários pesquisadores no desenvolvimento de técnicas mais apropriadas para imobilização de lectinas e ligantes de carboidratos.

1.6. Carcinogênese Química

Os cânceres causados por agentes ambientais frequentemente ocorrem em tecidos como pulmão, trato gastrointestinal e pele, porque normalmente esses órgãos estão mais expostos ao ambiente (SHUBIK and SICÉ, 1956). Recentemente, o estudo da carcinogênese química tem sido mesclado com estudos de alterações celulares em células cancerígenas, possibilitando assim a busca por marcadores biológicos e vias metabólicas alteradas.


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A carcinogênese química causa alterações genéticas e epigenéticas em células susceptíveis que transmitem uma vantagem seletiva para o crescimento e sofrem uma expansão clonal, se tornando geneticamente instáveis e transformadas em células neoplásicas (Fig. 12). O primeiro estágio da carcinogênese, o de iniciação tumoral, envolve a exposição de células normais a carcinógenos físicos e químicos. Estes carcinógenos causam danos ao DNA e a outras macromoléculas fornecendo às células iniciadas responsividade alterada ao microambiente e vantagem proliferativa. No segundo estágio, a promoção tumoral resulta na proliferação excessiva das células iniciadas e aumenta a probabilidade de ocorrência de danos genéticos adicionais, incluindo mutações endógenas que acumulam na população em expansão. No estágio de progressão tumoral ou terceiro estágio ocorre a aquisição de múltiplas alterações genéticas e multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas (LOEB and HARRIS, 2008; IRIGARAY and BELPOMME, 2010).

Figura 12: Carcinógenos exógenos como causadores de anomalias genéticas adquiridas. Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006.

O campo de estudos sobre a carcinogênese química provavelmente teve início com as

associações epidemiológicas de ocorrência de tumores com a exposição à fumaça de tabaco realizadas por Hill e Pott no início do século 18. A partir daí, seguiram-se as observações de tumores no trato urinário de trabalhadores que mantinham contato com arilaminas nas fábricas européias no final do século 19. Além destes, trabalhos com animais experimentais envolvendo hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) derivados de óleos crus serviram desde então como importantes protótipos para o estudo de HPAs (GUENGERICH, 2001).

Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos representam uma importante classe de poluentes ambientais que têm recebido atenção especial pelo fato de alguns de seus componentes demonstrarem forte potencial mutagênico e carcinogênico, além de desempenharem papéis cruciais em três problemas ambientais importantes: poluição do ar, chuva ácida e mudança climática global. Esses compostos estão presentes nos combustíveis fósseis e são formados durante a combustão incompleta e pirólise de matéria orgânica. Os


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HPAs podem, por exemplo, ser gerados durante incêndios florestais e erupções vulcânicas além de serem constituintes naturais dos óleos crus, alguns tipos de alimentos e produtos petroquímicos. Além disso, podem ser formados pelo gás de cozinha e no tráfego, sendo também uma das diversas classes de carcinogênicos químicos presentes na fumaça de cigarro (HONER, 2001; MEIRE et al, 2007).

A ampla distribuição dos HPAs provenientes de fontes naturais e antropogênicas juntamente com processos de distribuição e transporte explica sua ocorrência ubíqua. Os seres humanos são expostos a HPAs ambientais, ocupacionais, medicinais e provenientes da dieta (JACOB, 1996; ANGERER et al, 1997; STRICKLAND and KANG, 1999; SCHOKET et al, 1999). A absorção através do trato pulmonar, gastrointestinal e da pele ocorre de maneira dependente do tipo de HPA, do tamanho das partículas onde estão adsorvidos, da composição do adsorvente, e da sua afinidade por gordura (KAWAMURA et al, 1988). Em roedores, a absorção no trato gastrointestinal ocorre rapidamente e picos destes compostos podem ser identificados no sangue 1-2 horas após a administração (LIPNIAK and BRANDS, 1993).

1.6.1. Dibenzotiofeno e Dibenzotiofeno Sulfona

O petróleo e o carvão são importantes combustíveis fósseis de composição complexa

da qual se distinguem quatro famílias de compostos: hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos, aromáticos e heteromoléculas contendo átomos de nitrogênio (N), enxofre (S) ou oxigênio (O) na estrutura. Os compostos sulfurados constituem a terceira população presente nesses combustíveis e, devido à sua difícil biodegradabilidade, são considerados compostos recalcitrantes, que podem servir como marcadores da poluição gerada por óleo, sendo o dibenzotiofeno (DBT) e seus derivados os maiores representantes desta classe (Fig. 13) (KROPP et al, 1997; ALVES and MESQUITA, 1999; PEREIRA et al, 2000; HEILLMANN et al, 2004).

O conteúdo elevado de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos sulfurados (HPASs) em produtos do petróleo compromete a qualidade dos mesmos e sua remoção ou conversão em estruturas menos tóxicas é uma importante etapa no processo de refino (ZHANG et al, 2005). Os limites de concentração desses compostos em combustíveis obedecem às legislações específicas de cada país com o objetivo de minimizar os efeitos negativos à saúde e ao ambiente. A gasolina e o diesel comercializados na comunidade Européia e nos EUA devem apresentar, respectivamente, os limites máximos de 30 e 50 ppm de HPASs. A


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Alemanha limitou o conteúdo de enxofre presente no diesel e na gasolina a 10 ppm em 2001 (BABICH and MOULIJN, 2003).

Figura 13: Estruturas químicas dos principais compostos contendo enxofre encontrados no petróleo.

Fonte: Adaptado de SPEIGHT, 2001. Visando uma redução da queima e consequente emissão de compostos sulfurados no

ambiente, diversos estudos buscam o desenvolvimento de tecnologias para a remediação do enxofre de combustíveis. A redução dessas substâncias por parte das refinarias revela a preocupação do setor em oferecer combustíveis menos tóxicos e menos poluentes. Neste contexto, o dibenzotiofeno é utilizado na verificação da eficiência de processos de dessulfurização em derivados do petróleo e, apesar disso, poucos relatos sobre sua ação tóxica em mamíferos têm sido apresentados (LEIGHTON, 1989; KOBAYASHI et al, 2000; MADEIRA et al, 2008; SCHERER et al, 2009).

Trabalhos da década de 80 foram realizados em animais experimentais empregando doses maciças de DBT e derivados por via oral e subcutânea na expectativa de demonstrar efeitos tóxicos. Tais trabalhos estabeleceram a dose letal (DL50) de 470 mg/kg e graves lesões no pâncreas e fígado, congestão pulmonar, edema, e hemorragia intestinal com doses de 335 mg/kg observadas nos ratos que sobreviveram a um tempo maior que 24 horas após a ingestão do DBT. Outros estudos onde foram administrados o DBT e outros análogos ativos de


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petróleo demonstraram, além dos efeitos citados acima, alterações nos linfonodos mesentéricos e necrose das células do timo (LEVINE et al, 1977; LEIGHTON, 1989).

A toxicidade individual dos HPAs de maneira geral está relacionada com a ativação metabólica e a formação de metabólitos carcinogênicos responsáveis pela alquilação do DNA e do estágio de iniciação através de mecanismos complexos associados à carcinogênese química (AAS et al, 2000; HONG et al, 2007). Os metabólitos ativos formados a partir de HPAs são produtos de reações catalisadas por enzimas do citocromo P450 (CYP450) em particular, pela isoenzima P4501A1 e, embora os níveis basais dessa isoforma sejam baixos em diversos tecidos, ocorre uma indução da sua expressão após a exposição a diversos tipos de HPAs (SOONTJENS et al, 1997; JONES et al, 2000).

Os xenobióticos são metabolizados por mecanismos que podem ser divididos em três fases distintas: (1) Na fase I ocorre a formação de produtos potencialmente carcinogênicos através da ação das enzimas monooxigenases que possuem a capacidade de bioativar/detoxificar um vasto número de xenobióticos através de reações que incluem a N- e O- dealquilação, hidroxilação alifática e aromática, N- e O- oxidação e a deaminação. (2) Na fase II, enzimas transferases conjugam os produtos resultantes através de glicuronidação, sulfatação, metilação, acetilação, conjugação à glutationa e aminoácidos formando produtos menos tóxicos que os HPAs originais ou seus derivados gerados na fase I. (3) Durante a fase III ocorre o transporte ativo desses conjugados através da membrana celular principalmente através do complexo chamado de Glicoproteína-P que é o principal responsável pela resistência à quimioterapia presente nos fenótipos de resistência múltipla a drogas (HASLER et al, 1999; OMIECINSKI et al, 2010).

Uma das vias de metabolização do DBT inicialmente descrita em espécies de Rhodococcus sp. IGTS8 é chamada de via sulfóxido-sulfona-sulfonato-sulfato ou “Via 4S”. Durante o metabolismo, o DBT sofre a ação de um sistema multienzimático com três diferentes atividades, que promovem um ataque oxidativo progressivo no grupo tiofênico. A primeira enzima da via é uma monooxigenase que oxida o DBT a 5,5’-dióxido de DBT (DBTO2) em dois passos; a segunda enzima apresenta atividade similar à uma uma monoxigenase e converte o 5,5’-dióxido de DBT a 2’- hidroxibifenil-2-sulfinato. Finalmente, a quebra da ligação C-S transforma o 2’-hidroxibifenil-2-sulfinato em dois produtos finais, 2-hidroxibifenil (HBP) e sulfito (Fig. 14) (GRAY, 1996).

Sabe-se que exposições ao DBT presente em ambientes aquáticos podem excercer efeitos em embriões de zebrafish, como por exemplo curvatura dorsal do tronco e cauda, redução do crescimento, e edemas severos do pericárdio e saco vitelínico. Deformidades


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similares comumente chamadas de síndrome do saco azul (BSD) e reduções no nível de incubação concentração-dependentes também foram observadas (WOZNY et al, 2010).

Figura 14: “Via 4S”. O enxofre é removido na forma de sulfito, permanecendo intacta a estrutura carbonilada.

Fonte: SILVA, 2007. Como a dieta é uma das principais fontes de exposição humana e animal a HPAs, as

células epiteliais intestinais constituem os alvos primários a entrarem em contato com os

contaminantes. O metabolismo de HPAs pelos citocromos P450 é bem caracterizado e, embora exista evidência considerável de que o fígado de mamíferos pode metabolizar tais substâncias, o metabolismo em tecidos extra-hepáticos como o intestino pode ser de grande importância (CAVRET and FEIDT, 2005).

O fato de agentes químicos promoverem alterações randômicas no genoma justifica o direcionamento de esforços para a quantificação dessas mudanças, diminuição da exposição a esses agentes e desenvolvimento de alternativas para a quimioprevenção.

2. Justificativa

Silva, K.T.S. Justificativa

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2. JUSTIFICATIVA

A importância dos Hidrocarbonetos Polícíclicos Aromáticos Sulfurados e a escassez de estudos toxicológicos relacionados às consequências da contaminação ambiental pelos agentes DBT e DBTO2, colocam essas substâncias como importantes objetos de investigação científica na área da toxicologia voltada para a carcinogênese. Devido à dificuldade de se conduzir experimentos que empregam tratamentos crônicos, poucos estudos foram realizados com estes compostos. Entretanto, no que se refere à exposição à substâncias químicas com baixa solubilidade em água, e presentes em pequenas proporções no ambiente, o estudo toxicológico de tratamentos crônicos com baixas doses é de extrema relevância para uma real avaliação toxicológica. Nesse sentido, esse trabalho tem como preocupação iniciar uma investigação voltada para possibilidade de indução crônica de câncer promovida por DBT e DBTO2.

3. Objetivos

Silva, K.T.S. Objetivos

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Realizar um estudo toxicológico em ratos Wistar submetidos a um regime crônico de administração de DBT e DBTO2 com ênfase no potencial carcinogênico desses HPA’s

sulfurados.

3.2. Objetivos específicos

A) Avaliar as possíveis alterações no perfil celular hematológico do sangue periférico;

B) Avaliar possíveis alterações na função hepática e pancreática empregando marcadores usuais de monitoramento desses órgãos;

C) Realizar estudos histopatológicos no baço, fígado e intestinos;

D) Desenvolver sistemas de cromatografia de afinidade para a busca de marcadores relacionados à toxicologia desses agentes, enfatizando-se a expressão de glicoproteínas relacionadas ao câncer.

4. Material e Métodos

Silva, K.T.S. Material e Métodos

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4. MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto catalogado sob o protocolo nº: 2010/14. Para a realização do mesmo, o número de animais utilizados assim como o tratamento aplicado restringiu-se ao estabelecido pelos objetivos delineados.

4.1. Indução de câncer em ratos Wistar tratados com DMH, DBT e DBTO2

Ratos da linhagem Wistar, machos, com aproximadamente 60 dias de idade, foram obtidos no Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro Preto, sendo mantidos à temperatura ambiente com ração e água ad libitum e ciclo claro/escuro de 12 horas.

Os animais foram divididos em sete grupos, a saber:

Grupo I: Controle Salina (n=5); Grupo II: Controle Óleo (n=4); Grupo III: Teste DMH 30 mg/kg (n=15); Grupo IV: Teste DBT 30 mg/kg (n=14);

Grupo V: Teste DBTO2 30 mg/kg (n=10); Grupo VI: Teste DBT 150 mg/kg (n=9);

Grupo VII: Teste DBTO2 150 mg/kg (n=9). Nos grupos I e II foram administradas, respectivamente, injeções

intraperitoniais semanais de salina e óleo vegetal durante 10 semanas, os grupos III, IV e V receberam injeções de soluções de DMH (Sigma-Aldrich) em salina, DBT e DBTO2 (Sigma-Aldrich) em óleo vegetal na dose de 30 mg/kg no mesmo regime de tempo dos grupos anteriores. Injeções de DBT e DBTO2 na dosagem de 150 mg/kg de animal foram administradas nos animais pertencentes aos grupos VI e VII, também semanalmente, durante 70 dias. Todos os grupos passaram por um período de latência de 98 dias (14 semanas) após a última injeção (Fig. 15) para o desenvolvimento das alterações patológicas, como esperado


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para a substância de referência DMH (NEWELL and HEDDLE, 2004). Após esse período, realizou-se a necrópsia dos animais para coleta do sangue, baço, fígado, e intestinos grosso e delgado.

Figura 15: Esquema representativo do tempo de tratamento e espera para o desenvolvimento de alterações patológicas nos animais tratados com DMH, DBT e DBTO2.

4.1.1. Hemograma

Coletou-se aproximadamente 3 mL de sangue por animal, através de punção cardíaca direta com seringa, sendo a amostra depositada em tubos plásticos contendo heparina sódica para a concentração final de 450 UI/mL de sangue. Dividiu-se o material em duas partes, uma para análise hematológica e outra para as dosagens bioquímicas. Os parâmetros hematológicos aferidos foram: hematócrito, leucometria global, leucometria específica (contagem de linfócitos, neutrófilos segmentados, neutrófilos bastonetes, monócitos, eosinófilos) obtidos através de contagem e observação ao microscópio óptico. Tomaram-se como referência normal, os valores aferidos para os grupos controles.

Para a contagem global de leucócitos, o sangue foi diluído em líquido de Turk (ácido acético 2%, violeta genciana 0,1%) na proporção de 1:10 e analisado em câmara de Neubauer espelhada. Para a contagem diferencial e avaliação morfológica destas células, confeccionaram-se esfregaços em lâminas de vidro e utilizou-se o kit Instant Prov (Labor & Labor Bioclin) para coloração.

4.1.2. Dosagens enzimáticas para ALT, AST e amilase

Para as dosagens bioquímicas no plasma sanguíneo das enzimas amilase e das

transaminases ALT (alanino aminotransferase) e AST (aspartato aminotransferase), 1 mL de sangue por animal foi centrifugado a 6.000 x g por 3 minutos para obtenção do plasma


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utilizado nos testes. Utilizaram-se os kits de dosagem para Transaminases e Amilase (Doles, Brasil) que empregam técnicas colorimétricas para a medida da atividade enzimática. Após a execução dos ensaios, as soluções finais foram submetidas à leitura em espectrofotômetro (Shimadzu, UV – 1601) nos comprimentos de onda 505 nm para transaminases e 660 nm para amilase. Assim como para o hemograma, tomaram-se como valores normais de referência os valores obtidos nos ensaios dos grupos controle.

4.1.3. Análise histológica

Os segmentos de tecidos biopsiados foram fixados em formol tamponado e

posteriormente processados e incluídos em parafina. Para a análise histológica, secções de 4 μm foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) e examinadas ao microscópio. Avaliaram-se qualitativamente os seguintes parâmetros: presença/ausência de atipias celulares nas camadas mucosa e média, inflamação na mucosa, presença de necrose, atipias estruturais e hiperplasia de nódulos linfóides. As imagens foram digitalizadas utilizando-se o microscópio Leica DM5000B com câmera acoplada, através do programa Leica Application Suite (version 2.4.0 R1, Leica Microsystems). As análises estatísticas foram realizadas aplicando-se os testes de Qui-quadrado e exato de Fisher através do software Graph Pad Prism versão 5.0.

4.1.4. Extração de proteínas

Para extração de proteínas dos tecidos obtidos após a necrópsia dos animais foram

utilizados 100 mg de tecido/mL de tampão de extração (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Glicerol 10%) adicionados de 20 μL de tampão PIC (coquetel de inibidores de proteases, Sigma-Aldrich). Homogeneizou-se a mistura em tubo Poter por 15 minutos em banho de gelo, seguido por três ciclos de sonicação a 25 W, de 15 segundos cada com intervalos de 45 segundos entre cada ciclo (Sonifier 250 Branson). A suspensão resultante foi centrifugada a 4º C e 10.000 x g por 1 hora em centrífuga Sorvall 5C.

Após a centrifugação, separou-se o sobrenadante (S1) contendo a fração solúvel para novo ciclo de centrifugação, desta vez, a 46.000 x g e 4º C por 2 horas. O precipitado (P1) resultante da primeira centrifugação foi ressuspendido em Tris-HCl 25 mM contendo TritonX-100 0,5%, SDS 0,1% pH 7,5 e sonicado como descrito anteriormente. Centrifugou-se a mistura resultante a 10.000 x g por 1 hora a 4º C. O sobrenadante (S2) continha as proteínas de membrana celular de interesse neste estudo, sendo o pellet (P2) descartado.


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O sobrenadante obtido após a centrifugação de S1 (S3), foi estocado em freezer a -20º C, e o precipitado (P3) também descartado (Fig. 16).

Figura 16: Etapas realizadas para obtenção de proteínas de membrana, lisossomais e citosólicas a partir dos tecidos obtidos de ratos Wistar tratados com DBT, DBTO2 e DMH.

4.1.5. Western blotting

Realizou-se a técnica de Western blotting para a detecção da expressão diferenciada das proteínas CD44 e CEA, ambas consideradas marcadores moleculares para o câncer. Foi preparado um extrato total de proteínas de membrana dos intestinos grosso e delgado dos animais pertencentes aos grupos I a VII de controles e testes conforme descrito no item 4.1.4. Submeteu-se as amostras de proteínas obtidas à eletroforeses em gel de poliacrilamida 12% e realizou-se a transferência para membranas de PVDF (Invitrogen) a 200 mA em tampão Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, etanol 20% e SDS 10% sob refrigeração por duas horas. Em seguida, as membranas foram bloqueadas overnight com tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Tween-20 0,3% e leite em pó desnatado 5%, sendo posteriormente lavadas por três vezes com Tris-HCl 10 mM pH 7,5. Os anticorpos monoclonais Purified anti-rat CD44 (BD


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Biosciences Pharmingen) (1:4000) para a detecção de CD44 e Purified anti-human CEA (Sigma-Aldrich, USA) (1:4000) foram incubados no tampão de immunoblotting (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, Tween-20 0,013%, leite em pó desnatado 5%) à temperatura ambiente por 3 horas e posteriormente submetidos a detecção com o anticorpo secundário IgG anti-mouse conjugado com HRP (1:4000) à temperatura ambiente por 2 horas. Após as lavagens com tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,5, detectaram-se os sinais com o reagente Lumigen PS (GE Healthcare, UK) .

4.2. Preparação de suportes cromatográficos para análise de glicoproteínas

Três matrizes sólidas com diferentes características estruturais foram testadas com o

objetivo de obter o melhor protocolo de imobilização para proteínas. Empregou-se como proteína modelo a enzima tripsina, para avaliar a capacidade das colunas pela medida da atividade amidásica sobre o cloridrato de N-α-benzoil-DL-arginil-p-nitroanilida (DL-BApNA).

As matrizes escolhidas foram a Sepharose 4B (GE); Fractogel EMD Epoxy (MERCK) e Quitosano (Comercial) (Fig. 17) sendo testadas diversas combinações de protocolos descritos na literatura para imobilização de proteínas. A seguir, uma descrição de cada protocolo testado:


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Figura 17: A) Representação da estrutura da Sepharose 4B; B) Representação da estrutura do Fractogel EMD Epoxy; C) Representação da estrutura do Quitosano.

Dextranhydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Fractogel (FDCANHS): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: expansão com Dextrano, aminação, succinilação, ativação com N-hidróxisuccinimida (NHS) e Diciclohexilcarbodiimida (DCC), imobilização do braço extensor

ácido ε-amino capróico, nova ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Fractogel EMD Epoxy e Dextrano de Leuconostoc mesenteroides (Sigma-Aldrich) na proporção 1:1 foram suspensos em 16 volumes de NaOH 0,4 M e mantidos sob agitação leve por duas horas a 40º C e posteriormente overnight à temperatura ambiente, para expansão da superfície do Fractogel. Após a etapa de expansão, lavou-se a resina resultante em funil de vidro sinterizado com água destilada e suspendeu-se a mesma em 4 volumes de NaOH 0,4 M contendo 5% de epicloridrina para ativação (MATSUMOTO et al, 1979). Manteve-se a suspensão em banho-maria a 40º C por duas horas sob agitação leve e novamente procedeu-se lavagem com excesso de água destilada.

Para aminação utilizaram-se 1,5 volumes de solução de hidróxido de amônio P.A., onde foi suspensa a resina lavada. Manteve-se a suspensão por 1,5 horas em banho-maria a


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40º C sob agitação. Decorrido o tempo de espera, lavou-se novamente a resina aminada com água destilada em excesso e NaCl 0,1 M.

Suspendeu-se a resina aminada em 1,5 volumes de NaCl 0,1 M sendo posteriormente adicionados 0,08 g de anidrido succínico por g de resina para que ocorresse a succinilação da mesma. Manteve-se o pH da suspensão em 6 através da adição gradual de NaOH 20%, e, após a estabilização do pH respeitou-se um tempo de espera de cinco horas à temperatura ambiente. Realizou-se uma nova lavagem com NaOH 0,1 M e a resina foi novamente suspensa nesta mesma solução.

O Fractogel succinilado foi então lavado com 3 volumes de dioxano para tornar a resina anidra e suspenso em dioxano onde adicionou-se NHS e DCC na concentração de 0,1 M cada para ativação. Esta suspensão foi mantida por 70 minutos sob agitação leve à temperatura ambiente, sendo então lavada com 8 volumes de dioxano seguidos de 4 volumes de metanol e 3 volumes de dioxano.

Após a ativação, realizou-se uma lavagem rápida com um volume de água destilada sendo a resina rapidamente transferida para um béquer com 3 volumes de solução NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9%, pH 7,5 contendo ácido ε-amino capróico na proporção de 2,6 g de ácido para 100 mL de solução. Manteve-se a suspensão por uma hora a temperatura ambiente para inserção do braço extensor. Repetiu-se então a etapa de ativação com NHS e DCC como descrita anteriormente.

A uma solução de NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9% pH 7,5 adicionou-se a proteína tripsina na proporção de 10 mg de proteína/mL para a qual transferiu-se a resina. Após uma hora à temperatura ambiente e 12 horas sob refrigeração, ocorreu a imobilização da proteína. A etapa final consistiu no bloqueio dos grupos carboxílicos livres com solução de etanolamina 0,1 M, pH 9 por uma hora a temperatura ambiente. Após este procedimento procedeu-se nova lavagem com água destilada. Manteve-se o produto a 4º C até o momento do uso.

A Figura 18 mostra um esquema representativo da estrutura proposta com a realização deste protocolo:


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Figura 18: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo Dextranhydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Fractogel (FDCANHS). Vermelho: estrutura correspondente à matriz Fractogel EMD Epoxy; Verde: estrutura correspondente ao Dextrano; Azul: estruturas obtidas após a succinilação e ativação com NHS e DCC; Roxo: estruturas correspondentes ao ácido ε-amino capróico.

N-Hidroxysuccinylcaproyl-Fractogel (FNHSCA):

Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: aminação, succinilação, ativação com N-hidróxisuccinimida e Diciclohexilcarbodiimida, imobilização do braço extensor ácido ε-amino capróico, nova ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Neste protocolo aminou-se diretamente um (1) volume de Fractogel EMD epoxy utilizando-se hidróxido de amônio PA nas condições de aminação já descritas, seguindo a partir deste ponto, executaram-se as mesmas etapas indicadas no protocolo anterior (FDCANHS).



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Figura 19: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo N-Hidroxysuccinylcaproyl-Fractogel (FNHSCA). Vermelho: estrutura correspondente à matriz Fractogel EMD Epoxy; Azul: estruturas obtidas após a succinilação e ativação com NHS e DCC; Roxo: estruturas correspondentes ao ácido ε-amino capróico.

Caproyl-Fractogel (FCA): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: imobilização do braço extensor ácido ε-amino capróico, ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Na confecção desta resina acoplou-se diretamente o Fractogel ao ácido ε-amino capróico na proporção de 2,6 g de ácido/100 mL de solução de NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9% pH 10. Em seguida, procedeu-se à etapa de ativação com NHS e DCC já descrita e, posteriormente, realizou-se imobilização da tripsina conforme descrito para FDCANHS.


Figura 20: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo Caproyl-Fractogel (FCA). Vermelho: estrutura correspondente à matriz Fractogel EMD Epoxy; Roxo: estruturas correspondentes ao ácido ε-amino capróico.


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N-Hidroxysuccinyl-Fractogel (FNHS): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: aminação, succinilação, ativação com N-hidróxisuccinimida (NHS) e Diciclohexilcarbodiimida (DCC), imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

O Fractogel é diretamente aminado conforme descrito anteriormente e em seguida succinilado e ativado com NHS e DCC. Neste protocolo não há adição de ácido ε-amino capróico e a imobilização da tripsina é realizada após a primeira ativação com NHS.


Figura 21: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo N- Hidroxysuccinyl-Fractogel (FNHS). Vermelho: estrutura correspondente à matriz Fractogel EMD Epoxy; Azul: estruturas obtidas após a succinilação e ativação com NHS e DCC.

Dextrancaproylsuccinyl-Fractogel (1:5) (FDCA): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: expansão com Dextrano, aminação, succinilação, ativação com N-hidróxisuccinimida e Diciclohexilcarbodiimida, imobilização de braço extensor com ácido ε-amino capróico, nova ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres.

Este protocolo segue essencialmente todas as etapas descritas em FDCANHS com diferença na proporção Fractogel: Dextrano utilizada, que neste, é de 1:5 e não de 1:1.


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Dextran-Fractogel (FD): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: expansão com Dextrano oxidado, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Na tentativa de se obter um suporte com o máximo de expansão, o Dextrano foi oxidado conforme descrito por Battersby em 1996, através de reação com periodato de sódio 1,8 M e purificado através de cromatografia em coluna de G-15.

Após a oxidação, um (1) volume de Fractogel foi suspenso em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 7,8 onde foi acrescentado o produto de oxidação do dextrano na proporção de 1:1. A mistura foi mantida por 24 horas no escuro com agitação leve à temperatura ambiente. Após este tempo, a resina foi lavada com NaHCO3 0,01 M, NaCl 0,9%, pH 7,5 e suspensa nessa mesma solução para imobilização da tripsina.

Chitosan (C): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: formação de beads de quitosano, crosslink entre as cadeias com glutaraldeído, ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Na preparação das beads de quitosano solubilizaram-se 4 g de quitosano em pó em 96 mL de ácido acético 5%, sendo a mistura posteriormente vertida em 1 (um) L de NaOH 1 M conforme descrito por Rodrigues em 2008. Manteve-se a mistura sob agitação por 24 horas à temperatura ambiente, sendo o precipitado resultante lavado com excesso de água destilada.

Realizou-se então um crosslink das beads obtidas em tampão fosfato 0,1 M pH 7 contendo glutaraldeído 5% v/v, sendo a proporção utilizada de 1:10 (Vbeads/Vtotal). Manteve-se a suspensão sob agitação por uma hora à temperatura ambiente e lavou-se o produto obtido com excesso de água destilada.

Na etapa final imobilizou-se a tripsina conforme descrito anteriormente no item Dextranhydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Fractogel (FDCANHS).



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Figura 22: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo Chitosan (C). Laranja: estruturas correspondentes ao polímero quitosano; Azul: estrutura gerada pelo crosslink promovido pelo glutaraldeído.

N-Caproyl-Chitosan (CCA): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: formação de beads de quitosano, crosslink entre as cadeias com glutaraldeído, ativação com NHS e DCC, imobilização do braço extensor ácido ε-amino capróico, nova ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Na preparação deste suporte prepararam-se as beads conforme descrito no item anterior, sendo porteriormente as suas cadeias ligadas entre si após a suspensão em tampão fosfato e glutaraldeído como em C. Os grupos hidroxila disponíveis foram então ativados com NHS e DCC, sendo posteriormente imobilizado o ácido ε-amino capróico, seguido de nova ativação com NHS e DCC para imobilização de tripsina como nos demais protocolos.



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Figura 23: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo N-Caproyl-Chitosan (CCA). Laranja: estruturas correspondentes ao polímero quitosano; Azul: estrutura gerada pelo crosslink promovido pelo glutaraldeído; Verde: estrutura obtida após adição de ácido ε-amino capróico.

N- Hydroxyamidosuccinyl-Agarose (SNHS): Para a obtenção da estrutura proposta, realizaram-se as seguintes etapas de

ativação/imobilização: ativação com epicloridrina, aminação, succinilação, ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres. As etapas citadas encontram-se descritas a seguir.

Para a ativação da Sepharose 4B, suspendeu-se um volume da resina lavada e seca em 4 volumes de NaOH 0,4 M contendo 5% de epicloridrina para ativação (MATSUMOTO et al, 1979). Manteve-se a suspensão em banho-maria a 40 ºC por duas horas sob agitação leve e posteriormente lavou-se a resina com excesso de água destilada.

Para aminação, succinilação, ativação, imobilização de tripsina e bloqueio utilizaram-se os tempos e condições descritas nos protocolos anteriores.


Figura 24: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo N- Hydroxyamidosuccinyl-Agarose (SNHS). Azul: estrutura obtida após a epoxilação, aminação, succinilação e ativação com NHS e DCC da Sepharose 4B.


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N-Hydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Agarose (SNHSCA): Neste protocolo a Sepharose foi primeiramente epoxilada para posterior aminação,

succinilação, ativação, adição de ácido ε-amino capróico, nova ativação com NHS e DCC, imobilização de tripsina e bloqueio dos grupos carboxílicos livres.


Figura 25: Representação esquemática da estrutura proposta para a obtenção da coluna de afinidade de acordo com o protocolo N- Hydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Agarose (SNHSCA). Azul: estrutura obtida após a epoxilação, aminação, succinilação e ativação com NHS e DCC da Sepharose 4B; Verde: estrutura obtida após a imobilização do ácido ε-amino capróico.

4.2.1. Teste de quantificação de imobilização de proteínas

Para avaliar a quantidade de proteína imobilizada em cada protocolo testado, realizou-se um ensaio de atividade peptidásica para a tripsina de acordo com Erlanger et al, 1961. O substrato utilizado foi o DL-BApNA (Sigma-Aldrich), preparado com o solvente DMSO (dimetilsulfóxido) para uma concentração final de 9 x 10-2 M. Esta solução foi mantida a -20 ºC como solução estoque e diluída no momento do uso com Tris-HCl 0,1 M contendo CaCl2 20 mM pH 8,1 para a concentração de 9 x 10-4 M.

Utilizaram-se aproximadamente 10 mg de resina por protocolo avaliado e entre 1 e 1,5 mg de tripsina (Sigma-Aldrich) pura como controle no volume de 10 mL de solução contendo o substrato. As reações foram interrompidas com ácido acético 60% v/v, para posterior medida da absorvância a 410 nm. Para a realização dos cálculos e determinação da quantidade de proteína imobilizada por mg de resina, o tempo necessário para a formação do produto colorido foi cronometrado.

Utilizaram-se as seguintes equações para calcular a quantidade de tripsina imobilizada/g resina:

1) ABS410 nm/8800(absortividade molar da p-nitroanilina) = [ ] molar do produto formado


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2) [ ] molar do produto formado / Tempo da reação(minutos) = Molaridade/minuto 3) Molaridade/minuto x Volume(litros) = Moles do produto na unidade de tempo 4) Massa tripsina controle x Moles de produto na unidade de tempo(teste) / Moles de

produto na unidade de tempo(controle) = Massa de tripsina imobilizada na massa de resina

4.2.2. Verificação da eficácia de imobilização de proteínas Para verificar a ocorrência de imobilização de proteína por interações iônicas, colunas

de aproximadamente 2 mL preparadas com as resinas obtidas conforme os protocolos de imobilização descritos acima, foram submetidas a eluições com soluções de NaCl 1 M e 2 M sendo colhidas 10 frações de 0,5 ml para cada solução.

Submeteram-se as frações obtidas ao ensaio de atividade enzimático para tripsina bovina como descrito no item 4.2.1.

4.2.3. Verificação da ocorrência de ligações não específicas

Para verificar se proteínas provenientes das amostras a serem submetidas à

cromatografia poderiam se ligar às resinas por interações não específicas, aplicou-se nas colunas uma solução de albumina bovina na concentração de 1 mg/ml e realizou-se uma lavagem com o tampão de baixa força iônica, NaCl 0,15 M. Posteriormente, foram realizadas eluições com soluções de NaCl nas concentrações 1 M e 5 M, sendo coletadas 10 frações de 1 ml para cada solução. Avaliou-se o conteúdo protéico das frações em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 230 e 280 nm.

4.3. Purificação de lectinas

As sementes de Canavalia ensiformis, Artocarpus integrifolia e Erythrina speciosa utilizadas para purificação das lectinas ConA, Jacalina e EspecL respectivamente, foram obtidas no comércio agropecuário.


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4.3.1. Purificação da lectina de Canavalia ensiformis

Suspenderam-se duzentos gramas de farinha de Canavalia ensiformis em 1 L de NaCl

0,15 M mantidos a 4 ºC por 12 horas sob agitação. Filtrou-se a suspensão com o auxílio de gaze e centrifugou-se o filtrado a 6.500 g por 30 minutos sob refrigeração, sendo o precipitado ressuspendido em água destilada.

Dialisou-se o extrato obtido por 48 horas primeiro contra água destilada e posteriormente contra solução de NaCl 1 M. Submeteu-se a mistura resultante à cromatografia em coluna de G-75 e eluição com Glicose 0,2 M em NaCl 1 M sendo coletadas frações de 45 ml e selecionadas aquelas com maior absorvância a 280 nm.

4.3.2. Purificação de lectina de Artocarpus integrifolia

A partir de sementes congeladas do fruto, obteve-se um pó triturado suspendido na proporção de 1:10 p/v em tampão fosfato 0,1 M pH 7,4 e mantido sob agitação constante por quatro horas a 4 ºC. Centrifugou-se a suspensão a 6.500 x g por 30 minutos sendo o sobrenadante dialisado contra o mesmo tampão por três dias a 4 ºC com trocas de tampão a cada oito horas.

Submeteu-se o dialisado à cromatografia em coluna de afinidade de Goma Guar epoxilada e aminada como descrito no item 4.2 (FDCANHS) e imobilizada em Fractogel. A lectina retida foi removida por meio de solução de galactose 0,2 M, sendo coletadas 20 frações de 2 ml submetidas a leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda 280 nm para seleção das frações ricas em proteína.

4.3.3. Purificação de lectina de Erytrhina speciosa

Suspenderam-se vinte gramas de pó de sementes de Erythrina speciosa em 300 mL de NaCl 0,15 M contendo PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) mantidos overnight sob refrigeração. Após a extração, filtrou-se a suspensão com gaze, sendo o filtrado centrifugado a 7.000 x g por 30 minutos sob refrigeração. Dialisou-se o sobrenadante obtido contra NaCl 0,15 M por 24 horas e procedeu-se à retirada do excesso de gordura da mistura empregando-se butanol. Novamente realizou-se uma centrifugação, sendo o extrato obtido aplicado em coluna de Galactosil-sepharose. Realizou-se a eluição com solução de galactose 0,2 M e as


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frações contendo a lectina purificada foram selecionadas após a leitura no espectrofotômetro no comprimento de onda de 280 nm.

4.3.4. Dosagem de proteínas

As dosagens das lectinas purificadas foram determinadas através de método

colorimétrico utilizando o reagente Folin-Ciocauteau (LOWRY et al, 1951). Utilizou-se a soroalbumina bovina (BSA) como padrão de proteína referência em soluções de 20 a 100 μg/mL para obtenção da reta padrão.

Protocolo de preparo dos reagentes necessários para a dosagem: Reagente A: 0,5 g de CuSO4.5H2O e 1,0 g de citrato de sódio dissolvidos em 100 mL

de água destilada. Reagente B: 20,0 g de Na2CO3 e 4,0 g de NaOH dissolvidos em 1,0 L de água

destilada. Reagente C: a cada 50,0 mL de Reagente B, adicionar 1,0 mL de Reagente A. Reagente D: a cada 10,0 mL de reagente Fenol Folin-Ciocauteau adicionar a mesma

quantidade de água destilada. O método foi modificado proporcionalmente para melhor adequação aos

equipamentos disponíveis no laboratório. Assim, para 250 μL de solução contendo até 40 μg de proteína foram adicionados 1,25 mL de Reagente C; transcorrido um intervalo de 5-10 minutos foram então adicionados 125 μL de Reagente D. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, mediu-se a absorvância da mistura reacional a 660 nm. Com o valor da absorvância, foi determinada a concentração de proteína através da equação da reta padrão obtida com as soluções de BSA.

4.3.5. Ensaio de hemaglutinação para lectinas

Para verificação da atividade hemaglutinante das proteínas obtidas, realizou-se o ensaio de hemaglutinação com sangue humano total coletado em presença de citrato de sódio 3,8% p/v e submetido à centrifugação por 5 minutos a 4.000 x g. Descartou-se o plasma e lavaram-se as hemácias com solução de NaCl 0,15 M por três ciclos seguidos de centrifugações a 4.000 x g. Preparou-se uma suspensão de hemácias na proporção de 2,5% v/v de concentrado de hemácias em volume suficiente de solução de NaCl 0,15 M + MnCl2 0,005 M e CaCl2 0,005 M.


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Diluíram-se as amostras de lectinas (100 μL) em série com NaCl 0,15 M + MnCl2 0,005 M e CaCl2 0,005 M em placas de microtitulação de 96 x 12 poços com fundo em U ou V, para possibilitar a visualização do sedimento das hemácias que não se aglutinaram. Os 100 μL da amostra foram adicionados no primeiro poço da série; os demais poços foram preenchidos com 50 μL, cada, da solução salina anteriormente descrita. Para a diluição seriada, foram tomados 50 μL da amostra no primeiro poço diluídos sucessivamente nos demais para a razão de 1:2. Após a diluição das amostras, 50 μL de suspensão de hemácias a 2,5% v/v foram adicionados em todos os poços da placa de microtitulação. Decorridos 60 minutos de repouso à temperatura ambiente, a atividade hemaglutinante foi determinada pela recíproca da maior diluição que preserva hemaglutinação visível. Essa medida representa as unidades de atividade hemaglutinante (UAH).

4.3.6. Teste de resistência de lectinas à presença de detergentes

Para verificar se as lectinas imobilizadas nas colunas resistiriam à presença de detergente utilizado na extração de glicoproteínas de membranas celulares realizou-se um ensaio de hemaglutinação na presença dos detergentes TritonX-100 e SDS para avaliar a diminuição ou manutenção da atividade das mesmas.

Os ensaios de hemaglutinação após o contato das lectinas ConA, Jacalina e ESpecL com detergentes foram realizados conforme a descrição do item 4.3.5. Sendo as amostras de lectinas previamente mantidas em contato com o TritonX-100 e o SDS nas concentrações 0,5% e 1% por 10 e 30 minutos separadamente para cada detergente.

4.4. Síntese de colunas de afinidade com lectinas e amino borônico

Utilizou-se o protocolo da resina que apresentou o melhor resultado no teste de

eficiência de acoplamento para imobilização das lectinas de ConA, Jacalina e EspecL e também do Ácido Amino Borônico para posterior tentativa de isolamento de marcadores tumorais glicoconjugados. Para a imobilização das lectinas utilizaram-se soluções na concentração de 10 mg/mL provendo um excesso de proteína frente aos grupos ativados da resina.


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4.5. Teste das resinas com clara de ovo:

Para realização de teste das resinas imobilizadas com lectinas e ácido amino borônico,

escolheu-se a clara de ovo por ser um modelo rico em glicoproteínas, de baixo custo e fácil obtenção. Para aplicação da amostra em colunas de 2 mL, diluiu-se a clara de ovo na proporção 1:15 em solução de NaCl 0,15 M contendo 5 mM de MnCl2 e CaCl2. Após a aplicação das amostras, lavaram-se todas as colunas com NaCl 0,15 M. Para a eluição, utilizou-se solução de galactose 0,8 M paras as colunas contendo EspecL e Jacalina imobilizadas, solução de glicose 0,8 M para a coluna contendo ConA imobilizada e solução de manitol 0,1 M em acetato de amônio pH 8,8 para a coluna com ácido amino borônico imobilizado. Para todas as colunas coletaram-se cinco frações de 1 mL cada. As frações obtidas foram submetidas à diálise contra tampão acetato de amônio 0,01 M pH 7,4 durante 24 horas com trocas de tampão a cada oito horas para remoção do excesso de açúcar presente na etapa de eluição. As soluções dialisadas foram então liofilizadas e submetidas à eletroforese para visualização das bandas referentes às glicoproteínas presentes na clara de ovo.

4.6. Análise Estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada com o software Graph Pad Prism (Versão 5.0). Utilizou-se ANOVA para testar as diferenças entre os tratamentos, seguido de pós-teste de Tukey para determinação das diferenças significativas entre os grupos expostos e os grupos controle no que diz respeito às medições enzimáticas, hemograma e relações entre os pesos dos animais. Para análise das diferenças entre os parâmetros histológicos observados utilizaram-se os testes exato de Fisher e Qui-quadrado. Adotou-se o nível de significância p < 0,05 para todas as análises.

5. Resultados e Discussão

Silva, K.T.S. Resultados e Discussão

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Considerando a importância toxicológica do DBT e DBTO2, e devido à escassez de

estudos nesse sentido, foram realizados experimentos empregando-se doses subletais destas substâncias, administradas de forma crônica pela via intraperitoneal, com o intuito de observar efeitos tardios decorrentes da exposição prolongada a esses compostos. Assim sendo, utilizou-se a dose de 30 mg/kg para o DBT, seu derivado DBTO2 e para a substância de

referência na indução do câncer DMH. Em outros experimentos com o objetivo de exacerbar os efeitos tóxicos esperados, empregou-se a dose de 150 mg/kg de DBT e DBTO2. Os animais foram tratados semanalmente por longo período (10 semanas) e mantidos em latência por 14 semanas adicionais com a expectativa de observar, sobretudo, possíveis atividades cancerígenas desses compostos.

5.1. Efeitos biológicos do tratamento com DMH, DBT e DBTO2 em ratos Wistar

Ao longo do tratamento, os animais foram observados quanto à aparência física e medida do peso corporal. A Figura 26 apresenta o acompanhamento do peso de todos os grupos ao longo de 24 semanas (tratamento/latência). Como pode ser observado, não houve variação estatística significativa de peso entre os diversos grupos, indicando que a inoculação dessas substâncias, no regime proposto, não interferiu no crescimento normal dos animais. Além disso, não foi observada a presença de alterações macroscópicas perceptíveis na superfície corporal externa.

1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 240

100

200

300

400

500

Controle Salina

Controle Óleo

Teste DMH 30 mg/KgTeste DBT 30 mg/Kg

Teste DBT 150 mg/KgTeste DBTO230 mg/Kg

Teste DBTO2 150 mg/Kg

Semanas

Peso

Anim

al (g

)

Figura 26: Gráfico de acompanhamento de peso dos animais pertencentes aos grupos controles e testes ao longo de 24 semanas de tratamento/latência.


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5.1.1. Hemograma e dosagens séricas de ALT, AST e amilase

Após a necrópsia e coleta do sangue realizou-se o hemograma para avaliação de possíveis alterações das células sanguíneas. O hematócrito foi o primeiro parâmetro avaliado, e, como pode ser observado na Figura 27, não houve variação estatística significativa entre os grupos controles e testes indicando que o volume globular não é afetado pelos tratamentos realizados mesmo em doses mais elevadas.

Figura 27: Medida do volume globular (hematócrito) das hemácias provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência.

Além do volume globular normal verificado, a observação dos esfregaços de sangue total não evidenciou alterações morfológicas, presença de inclusões, presença de hemácias nucleadas ou empilhamento dos glóbulos vermelhos indicando eritropoese normal e ausência de processos inflamatórios. Tais achados demonstraram que os tratamentos não interferiram na produção ou sobrevida na circulação das hemácias no sangue periférico. A Figura 28 apresenta os resultados obtidos após a contagem global e diferencial de leucócitos do sangue periférico. No que diz respeito aos resultados apresentados na Figura 28-A não houve variação na contagem global de leucócitos diante da análise estatística aplicada. Além disso, quando avaliados os resultados individuais das contagens diferenciais de leucócitos não foi possível detectar diferenças que possam indicar importância diagnóstica.

Foram encontradas diferenças significativas na análise estatística para a contagem diferencial de linfócitos e segmentados, porém, os níveis celulares apresentados pelo grupo


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DBT 150 mg/kg onde foram observadas tais diferenças encontraram-se dentro da faixa normal de variação (Tab. 01) para estas populações celulares em ratos.

Tabela 01: Frequência das populações celulares (série branca) normalmente encontradas em ratos.

Animal Linfócitos

(%)

Segmentados

(%)

Monócitos

(%)

Bastões

(%)

Eosinófilos

(%)

Rato 53-83 12-46 1-7 - 3-5


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Figura 28: Contagens global e diferencial de leucócitos provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência.


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Além do hemograma, foram determinados os níveis séricos das enzimas amilase, AST e ALT. As concentrações séricas das enzimas AST e ALT são comumente utilizadas como marcadores de lesões hepáticas. Em conjunto, as duas enzimas (AST e ALT) são consideradas os mais importantes parâmetros para detecção de injúrias ao fígado embora ALT seja mais específica que AST (ANDERSON et al, 2000).

Níveis muito altos de AST (maiores que 10 vezes o nível normal) são relacionados à hepatite aguda provocada por infecções virais e exposição a drogas ou outras substâncias tóxicas ao fígado. Na hepatite crônica, os níveis de AST encontram-se mais baixos, mantendo-se aproximadamente quatro vezes maiores que o nível normal ou variando entre níveis normais e levemente aumentados. Além das características individuais, a relação entre as duas enzimas possui valor diagnóstico embora ambas possam variar na mesma proporção em doenças hepáticas. Sheth e cols. (1998), em concordância com Imperiale e cols. (2000) observaram que a relação AST/ALT maior que 1 indica a ocorrência de lesão hepática (cirrose) no caso de hepatite crônica (hepatite C) viral em humanos.

Os resultados expostos na Figura 29 demonstraram que os níveis séricos individuais das enzimas ALT e AST (Fig. 29-A,B) dos grupos controle salina e controle óleo não apresentaram diferenças significativas. Com relação aos testes DBT 30 mg/kg, DBT 150 mg/kg, DBTO2 30 mg/kg os níveis de ALT e AST encontraram-se diminuídos estatísticamente em aproximadamente 30%, quando comparados com o grupo controle óleo. A relação AST/ALT apresentou-se maior que 1 para todos os grupos avaliados de forma indiscriminada entre os grupos controles e testes (Fig. 29-C). Tal fato indica que o tratamento dos animais não promoveu lesões hepáticas que puderam ser detectadas por esses marcadores. O exame histopatológico do fígado demonstrou que a ausência de lesões foi coerente com os resultados apresentados acima.

A concentração sérica de amilase foi avaliada com o objetivo de investigar a função pancreática. Níveis alterados desta enzima também estão relacionados à doença da vesícula biliar e alguns distúrbios gastrointestinais. A amilase é produzida principalmente nas glândulas salivares e no pâncreas. Na pancreatite aguda, os níveis de amilase podem alcançar valores de quatro a seis vezes o limite superior de referência, elevando-se em 2 a 12 horas e retornando aos níveis normais após 3 a 4 dias. A magnitude da elevação da amilase não se correlaciona com a gravidade da lesão pancreática. As pancreatites crônicas, assim como o carcinoma pancreático, cursam com níveis normais ou pouco elevados de amilase (TIETZ, 1998).


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A Figura 29-D mostra os resultados obtidos para dosagem sérica da amilase. Nela se pode observar a ausência de alterações nos níveis enzimáticos entre os grupos controles e testes indicando que não houve a ocorrência de pancreatite aguda. Porém, como os níveis normais desta enzima podem ser encontrados em diversas outras doenças não se pode concluir que não há alteração da função pancreática, sendo necessário que este dado seja complementado com outros estudos clínicos para os animais em questão.

Figura 29: Dosagens enzimáticas séricas dos níves de AST, ALT e amilase provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência. Escolheu-se medir a atividade das enzimas AST, ALT e amilase por representarem os principais meios de detecção sérica de alterações das funções hepática e pancreática respectivamente. Como esses órgãos estão diretamente relacionados ao metabolismo, as alterações nasfunções normais dos mesmos representam informações importantes a respeito da atividade toxicológica dessas substâncias.


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5.1.2. Avaliação das alterações de peso do fígado e do baço

Os animais foram necropsiados com o objetivo de observar lesões produzidas pelo tratamento realizado e para coleta de órgãos. O fígado e baço foram pesados para comparação entre grupos. Nesse sentido, não observou-se diferenças estatísticas significativas nas relações Peso do Órgão/Peso de Animal entre controles e testes dos diversos grupos como pode ser observado na Figura 30. Tais achados corroboram com os dados exibidos anteriormente que demonstraram ausência de alteração da função e morfologia hepática e no perfil celular sanguíneo.

Figura 30: Relações Peso Fígado/Peso Animal (A) e Peso Baço/Peso Animal (B) provenientes dos grupos controles e testes ao final do período de tratamento/latência.

5.1.3. Avaliações morfológicas macro e microscópicas

Após avaliação macroscópica do pulmão, fígado, baço e estômago observou-se que

esses órgãos pertencentes a todos os grupos estudados apresentaram aspecto e coloração compatíveis com a normalidade. Nos intestinos, o quadro de aparente normalidade foi observado nos animais dos grupos Controle Salina e Controle Óleo. No grupo Teste DMH 30 mg/kg observou-se a presença de projeções papiliformes na mucosa para a luz do intestino grosso, de aspecto avermelhado e consistência rígida, sugerindo a formação de pólipos. Este aspecto não foi observado no intestino delgado destes animais (Fig. 31-A, Tab. 04 e 05). Em contraste, para os animais pertencentes aos grupos Teste DBT 30 mg/kg; DBTO2 30 mg/kg; DBT 150 mg/kg e DBTO2 150 mg/kg não foram visualizadas projeções no intestino grosso sendo estas, observadas ao longo do intestino delgado (Fig. 31-B, Tab. 06 e 07).


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Figura 31: A) Fotografia de parte do intestino grosso de animal pertencente ao grupo III (Teste DMH 30 mg/kg) onde podem ser observadas as formações de pólipos. B) Fotografia de parte do intestino delgado de animais pertencentes aos grupos IV (acima) e V (abaixo) (Testes DBT 30 mg/kg e DBTO2 30 mg/kg respectivamente) onde podem ser observados pólipos. Os retângulos em vermelho indicam a localização dos pólipos.

Para a avaliação microscópica das lesões realizou-se a análise histológica dos

intestinos, obervando a ocorrência de alterações celulares, estruturais e inflamatórias oriundas dos grupos controles e testes avaliados.

Com o objetivo de eliminar qualquer possibilidade de os efeitos observados nos grupos tratados com DBT e DBTO2 serem decorrentes da administração crônica de óleo vegetal pela via intraperitonial, introduziu-se um grupo experimental controle de animais tratados com salina para efeito de comparação com animais tratados com óleo. Nestes grupos, o quadro geral foi compatível com a normalidade histológica. Nesses intestinos, foi possível a plena observação das túnicas intestinais bem como de todas as estruturas histológicas do

órgão. No intestino delgado de poucos animais de ambos os grupos controle observou-se aumento de células inflamatórias que quando presentes se apresentavam de maneira difusa e de intensidade leve. Além disso, no grupo óleo foram observadas reações hiperplásicas dos nódulos linfoides do intestino delgado em apenas 25% dos animais (Tab. 02). Ao contrário, no intestino grosso dos animais pertencentes ao grupo controle salina foi observado certo grau de inflamação (40%) (Tab. 03). Porém, considerando o tratamento invasivo ao qual esses animais foram submetidos, e a diferença estatística encontrada quando analisados esses dados contra os dados de animais tratados com DMH, DBT e DBTO2 pode-se dizer que para os animais dos grupos controle o quadro geral observado representa a normalidade histológica.


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Tabela 02: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino delgado para os grupos Controle Óleo e Controle Salina.

Lesões Observadas Controle Óleo

% (n)

Controle Salina

% (n) P

Atipias Celulares na Mucosa 25 (1/4) 20 (1/5) 0,4985

Atipias Celulares na Média 0 (0/4) 0 (0/5) -

Inflamação na Mucosa 0 (0/4) 20 (1/5) < 0,0001

Necrose 0 (0/4) 0 (0/5) -

Atipias Estruturais 25 (1/4) 20 (1/5) 0,4985

Hiperplasia de Nódulos Linfóides 25 (1/4) 0 (0/5) < 0,0001

Tabela 03: Comparação de frequência das lesões observadas no intestino grosso para os grupos Controle Óleo e

Controle Salina.

Lesões Observadas Controle Óleo

% (n)

Controle Salina

% (n) P

Atipias Celulares na Mucosa 0 (0/4) 0 (0/5) -

Atipias Celulares na Média 0 (0/4) 0 (0/5) -


Necrose 0 (0/4) 20 (1/5) < 0,0001

Atipias Estruturais 25 (1/4) 0 (0/5) < 0,0001

Hiperplasia de Nódulos Linfóides 25 (1/4) 20 (1/5) 0,4985

A comparação entre os grupos Controle Salina e Teste DMH 30 mg/kg nos intestinos delgado e grosso (Tab. 04 e 05) revelou aumento significativo para todas as alterações avaliadas. As atipias observadas foram principalmente alterações na morfologia das mucosas, presença de glândulas irregulares e de células com morfologia irregular de difícil identificação. As áreas de necrose observadas eram, em geral, focais atingindo principalmente as túnicas mucosas e médias. As hiperplasias das regiões nodulares eram caracterizadas pelo aumento concêntrico de linfócitos e macrófagos e apresentavam correlação com as projeções papiliformes observadas macroscopicamente (Fig. 31).


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Tabela 04: Frequência das lesões observadas no intestino delgado para os grupos Controle Salina e Teste DMH 30 mg/kg.

Lesões Observadas Controle Salina

% (n)

Teste DMH 30 mg/kg

% (n) P

Atipias Celulares na Mucosa 20 (1/5) 71 (10/14) < 0,0001

Atipias Celulares na Média 0 (0/5) 43 (6/14) < 0,0001


Necrose 0 (0/5) 64 (9/14) < 0,0001


Hiperplasia de Nódulos Linfóides 0 (0/5) 43 (6/14) < 0,0001

Tabela 05: Frequência das lesões observadas no intestino grosso para os grupos Controle Salina e Teste DMH 30 mg/kg.

Lesões Observadas Controle Salina

% (n)

Teste DMH 30 mg/kg

% (n) P

Atipias Celulares na Mucosa 0 (0/5) 60 (9/15) < 0,0001

Atipias Celulares na Média 0 (0/5) 13 (2/15) 0,0002


Necrose 20 (1/5) 73 (11/15) < 0,0001


Hiperplasia de Nódulos Linfóides 20 (0/5) 40 (6/15) 0,0032

A mesma comparação realizada anteriormente foi aplicada aos grupos Controle Óleo e

Teste DBT 30 mg/kg; DBTO2 30 mg/kg; DBT 150 mg/kg e DBTO2 150 mg/kg (Tab. 06 e 07) revelando também, aumento significativo para todas as alterações avaliadas.

Tabela 06: Frequência das lesões observadas no intestino delgado para os grupos Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/kg, Teste DBTO2 30 mg/kg, Teste DBT 150 mg/kg e Teste DBTO2 150 mg/kg

Lesões

Observadas

Controle

Óléo

% (n)

Teste DBT

30 mg/kg

% (n)

Teste DBTO2 30

mg/kg

% (n)

Teste DBT

150 mg/kg

% (n)

Teste DBTO2

150 mg/kg

% (n)

P

Atipias Celulares na Mucosa 25 (1/4) 50 (7/14) 55 (5/9) 67 (6/9) 67 (6/9) < 0,0001*

Atipias Celulares na Média 0 (0/4) 36 (5/14) 44 (4/9) 33 (3/9) 33 (3/9) < 0,0001**

Inflamação na Mucosa 0 (0/4) 79 (11/14) 67 (6/9) 89 (8/9) 89 (8/9) < 0,0001***

Necrose 0 (0/4) 64 (9/14) 67 (6/9) 22 (2/9) 89 (8/9) < 0,0001

Atipias Estruturais 25 (1/4) 29 (4/14) 67 (6/9) 67 (6/9) 67 (6/9) < 0,0001¨ Hiperplasia de Nódulos Linfóides 25 (1/4) 79 (11/14) 55 (5/9) 67 (6/9) 89 (8/9) < 0,0001¨¨

* sem diferença estatística entre teste DBT 30mg/kg e DBT e DBTO2 150 mg/kg ** sem diferença estatística entre os grupos testes *** sem diferença estatística entre teste DBT 30 mg/kg e testes DBT e DBTO2 150 mg/kg ¨ sem diferença estatística entre teste DBTO2 30 mg/kg e testes DBT e DBTO2 150 mg/kg ¨¨ sem diferença estatística entre teste DBTO2 30 mg/kg e teste DBT 150 mg/kg


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Tabela 07: Frequência das lesões observadas no intestino grosso para os grupos Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/kg, Teste DBTO2 30 mg/kg, Teste DBT 150 mg/kg e Teste DBTO2 150 mg/kg

Lesões

Observadas

Controle

Óleo

% (n)

Teste DBT

30 mg/kg

% (n)

Teste DBTO2 30

mg/kg

% (n)

Teste DBT

150 mg/kg

% (n)

Teste DBTO2

150 mg/kg

% (n)

P

Atipias Celulares na Mucosa 0 (0/4) 29 (4/14) 55 (5/9) 22 (2/9) 33 (3/9) < 0,0001*

Atipias Celulares na Média 0 (0/4) 7 (1/14) 33 (3/9) 0 (0/9) 0 (0/9) < 0,0001**

Inflamação na Mucosa 0 (0/4) 43 (6/14) 55 (5/9) 67 (6/9) 67 (6/9) < 0,0001***

Necrose 0 (0/4) 36 (5/14) 55 (5/9) 44 (4/9) 67 (6/9) < 0,0001¨

Atipias Estruturais 25 (1/4) 36 (5/14) 55 (5/9) 11 (1/9) 78 (7/9) < 0,0001 Hiperplasia de Nódulos Linfóides 25 (1/4) 50 (7/14) 55 (5/9) 44 (4/9) 67 (6/9) < 0,0001***

* sem diferença estatística entre teste DBT 30 mg/kg e testes DBT e DBTO2 150 mg/kg ** sem diferença estatística entre teste DBT 150 mg/kg e DBTO2 150 mg/kg *** sem diferença estatística entre os grupos testes¨ ¨ sem diferença estatística entre teste DBT 30 mg/kg e teste DBT 150 mg/kg e teste DBT 30 mg/kg e teste DBTO2 150 mg/kg

A presença de inflamação e necrose aumentadas nos grupos testes indicaram o potencial irritativo e lesivo das drogas utilizadas. Para as maiores concentrações das drogas foi observada piora no quadro patológico, com maior índice de necrose e aumento da intensidade inflamatória, sendo esses resultados consistentes com a expectativa dose/resposta, e corroborando com as evidências anteriores de indução de neoplasias. Por outro lado, as observações de crescimento celular aumentado e alterações nas estruturas teciduais demonstraram um estágio inicial de displasia característico de lesões pré-neoplásicas (Fig. 32). Diante da constatação de indução de lesões de natureza neoplásica nos animais tratados com DBT e DBTO2 em intensidade semelhante àquelas provocadas pela administração crônica de mesma dose de DMH, fica clara a importância desses resultados para contribuir para a avaliação toxicológica dessas substâncias de irrefutável relevância ambiental.

Figura 32: Fotomicrografias de cortes histológicos de intestino delgado corados pela técnica de HE. a, c, e, g 110x. b, d, f 220x. h 440x. a, b, c) Detalhes da túnica mucosa apresentando aspecto histológico normal. d) Notar aumento de células inflamatórias na região glandular (setas). e) Observar hiperplasia linfoide na região mucosa (estrela). f) Observar células displásicas (seta) determinando a formação de estruturas irregulares e de difícil identificação e processo inflamatório associado (estrela). g) Observar área de necrose (estrela) associada à atrofia mucosa. h) Observar glândulas com células atípicas e grande polimorfismo nuclear e celular (seta).


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5.1.4. Western blotting Embora os resultados das análises histopatológicas demonstrem claramente o desenvolvimento de lesões com características neoplásicas, os marcadores moleculares CD44 e CEA não puderam ser detectados pela técnica de Western blotting nos extratos de proteínas de membrana provenientes dos pólipos coletados. Embora, seja inequívoca a utilidade desses marcadores na detecção do câncer gastrointestinal, algumas condições específicas podem ter dificultado tal identificação: o estágio de desenvolvimento tumoral, a especificidade do anticorpo CEA utilizado, que nesse caso, foi um reagente recomendado para detecção em humanos, e a utilização de anticorpos recomendados para análises imunohistoquímicas. Considerando a limitação na disponibilidade comercial destes tipos específicos de anticorpos para detecção adequada desses antígenos em ratos, a tentativa foi válida do ponto de vista do planejamento experimental deste trabalho. Por outro lado, o fracasso da detecção de um marcador molecular para esses experimentos, demonstra que há necessidade de encontrar marcadores que venham detectar de maneira precoce e específica este tipo de câncer. Sendo assim, estudos proteômicos de extratos provenientes dessas lesões, forneceriam subsídios importantes para uma melhor compreensão dos efeitos toxicológicos das substâncias testadas.

5.2. Estudo do glicoprootema A diversidade estrutural dos oligossacarídeos encontrados nas glicoproteínas é

resultado da sua biossíntese não dirigida por moldes, e que envolve a ação coordenada de uma maquinaria enzimática sem capacidade de revisão. Além disso, a diversidade estrutural depende também de fatores variáveis, como os níveis de substrato e a disponibilidade enzimática de glicosidases e glicosiltransferases, que podem alterar-se durante o crescimento celular, diferenciação e desenvolvimento (GEYER and GEYER, 2006). Consequentemente, a análise da expressão de glicoproteínas de células malignas pode gerar informações importantes relacionadas à evolução tumoral. A alta complexidade da maioria dos proteomas promovida pelo elevado número de proteínas, suas diferenças de concentração, propriedades físico-químicas e possíveis modificações pós-traducionais, dificulta a detecção de todo o proteoma. Assim, técnicas de pré-fracionamento como imunodepleção de proteínas de alta abundância, fracionamento


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subcelular e métodos que empregam cromatografia de afinidade por uma classe particular de proteínas são necessários para o isolamento de componentes menos abundantes (FREIJE and BISCHOFF, 2006).

5.2.1. Preparação de colunas de afinidade de elevada capacidade

O interesse maior deste trabalho se constituiu na busca de glicoproteínas que possam servir como marcadores tumorais, por meio da captação das mesmas em colunas de afinidade de lectinas. Apesar da notável especificidade das lectinas, essas apresentam limitação quanto à afinidade pelos seus ligantes. Dessa forma, foi necessário desenvolver um suporte cromatográfico de elevada capacidade de ligação com o objetivo de promover a captura máxima dos componentes glicoproteicos dos extratos protéicos. Assim sendo, foram empregadas várias estratégias de expansão de superfície e ligação de braços extensores de diferentes naturezas químicas.

Utilizou-se a tripsina como proteína modelo para determinação da capacidade real de ligação preservando-se a atividade enzimática da mesma.

A Tabela 08 e a Figura 33 resumem as condições testadas permitindo a observação da capacidade de imobilização da tripsina. Esses resultados mostraram que a quantidade de proteína imobilizada (mg)/g resina variou quando foram avaliadas as diferentes matrizes utilizadas, e também quando foram avaliados diferentes protocolos de imobilização para uma mesma matriz. Tabela 08: Protocolos testados para obtenção de colunas de afinidade com alta capacidade e quantidade de proteína (tripsina) imobilizada ± desvio padrão.

Protocolo Sigla mg tripsina/g resina

± σ

Dextranhydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Fractogel FDCANHS 5,95 ± 0,95 N-Hidroxysuccinylcaproyl-Fractogel FNHSCA 10,47 ±0,94 Caproyl-Fractogel FCA 2,67 ± 0,56 N-Hidroxysuccinyl-Fractogel FNHS 5,94 ± 0,54 Dextrancaproylsuccinyl-Fractogel (1:5) FDCA 6,25 ± 1,00 Dextran-Fractogel FD 4,60 ± 0,60 Chitosan C 3,16 ± 0,71 N-Caproyl-Chitosan CCA 3,64 ± 0,97 N- Hydroxyamidosuccinyl-Agarose SNHS 2,24 ± 0,36 N-Hydroxyamidosuccinylcaproylsuccinyl-Agarose SNHSCA 7,00 ± 0,26

*n=4.


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FDCANHS

FNHSCAFCA

FNHSFDCA FD C

CCASNHS

SNHSCA0

5

10

15

Protocolos Testados

mg

trips

ina/g

resin

a

Figura 33: Gráfico com os resultados obtidos para quantificação de proteína imobilizada (mg proteína/ g resina) para as três diferentes matrizes sólidas e protocolos utilizados.

O protocolo FNHSCA que utiliza Fractogel como matriz sólida, succinilação, ativação

com NHS e DCC e extensão do braço ligante com ácido ε-amino capróico apresentou o melhor resultado de imobilização (10,47 ±0,94) dentre os demais protocolos testados. Esta condição demonstra a melhor compatibilidade entre os grupos químicos utilizados para expansão e também indica que o acoplamento ocorre de maneira a manter a enzima ativa.

O protocolo SNHSCA, que utiliza como suporte a Sepharose 4B, apresenta capacidade de imobilização de aproximadamente 7 mg proteína/g resina apesar de utilizar os mesmos ativadores e extensores que FNHSCA. A redução na capacidade pode ser decorrente da menor disponibilidade das hidroxilas ativáveis presentes na Sepharose 4B.

Não se observou diferença estatística na comparação entre as capacidades das resinas obtidas pelos protocolos CCA, FDCANHS, FNHS e FDCA, embora todos eles tenham apresentado resultados significativamente inferiores à FNHSCA e SNHSCA. Apesar do protocolo CCA ter gerado menor capacidade de imobilização, deve-se lembrar que o Quitosano apresenta custo muito inferior às demais matrizes utilizadas, tornando esse suporte um material alternativo oportuno para o preparo de colunas de afinidade.

Observou-se também que as resinas FDCANHS e FDCA não apresentaram diferença significativa na quantidade de proteína imobilizada apesar dos protocolos utilizarem concentrações diferentes de dextrano para expansão, o que indica que a quantidade de 1:1 em peso de Fractogel para peso de Dextrano provavelmente é suficiente para saturação dos


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grupos epóxi disponíveis da resina. O protocolo FD, que utiliza como braço espaçador o Dextrano oxidado com periodato de sódio, e do qual se esperava a maior capacidade de expansão para imobilização de proteína, também não apresenta resultados significativamente diferentes de FDCANHS e FDCA. Tal fato, mostra que pode ocorrer algum tipo de reação lateral entre as cadeias de dextrano que prejudica a capacidade de ligação ou, que por ser um grupo volumoso, ocorre um impedimento estérico para a ligação dos grupos ativadores e também para a proteína.

5.2.2. Avaliação das colunas para glicoproteínas empregando a clara de ovo como

amostra modelo

Colunas de afinidade com elevado desempenho são fundamentais para o isolamento de microcomponentes na análise proteômica. Considerando que as colunas sintetizadas atingiram uma capacidade satisfatória empregando-se a tripsina como modelo, foram preparadas resinas contendo lectinas (ConA, Jacalina e EspecL) e ácido amino borônico. A clara de ovo, por conter grande variedade de glicoproteínas, constituindo um modelo rico em micro e macro constituintes, foi empregada para simular uma amostra complexa de proteínas. Como pode ser observado na Figura 34, diversas proteínas foram retidas nas colunas, fornecendo um amplo espectro de espécies protéicas oriundas de macro e microcomponentes. Além disso, notou-se um enriquecimento de bandas de glicoproteínas com pesos moleculares próximos a 30 kDa em relação a amostra integral em concentração apropriada para se comparar os perfis eletroforéticos.


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Figura 34: SDS-PAGE 15% de amostras íntegras de clara de ovo (Am. Ínt. 120x 80x e 20x) e de amostras eluídas das colunas de lectinas e ácido amino borônico. Nos retângulos vermelhos observam-se as glicoproteínas enriquecidas após a eluição das colunas sintetizadas e a comparação da mesma região do gel para amostras íntegras em diferentes diluições. PMM: Padrão de Massa Molecular.

A partir desse experimento com a amostra modelo, foi possível verificar que as colunas produzidas a partir do protocolo FNHSCA (item 4.2) foram capazes de detectar microcomponentes em amostras complexas como a clara de ovo. Dessa forma, foi possível avaliar a eficiência desse tipo de imobilização em colunas produzidas com as lectinas, para utilizá-las na busca de novos marcadores glicoproteicos que possam estar eventualmente presentes em amostras de pólipos induzidos com DMH, DBT e DBTO2.

5.2.3. Ensaio de determinação da capacidade hemaglutinante de lectinas e sua

resistência à presença de detergentes

A atividade hemaglutinante das lectinas purificadas (ConA, Jacalina e EspecL) foi determinada na presença dos detergentes TritonX-100 e SDS nas concentrações de 0,5 e 1 % durante 10 e 30 minutos de incubação, com o objetivo de avaliar a resistência das mesmas à desnaturação. Considerando que os protocolos de preparo de extratos de tecidos biológicos utilizados empregam tais detergentes para extração das glicoproteínas de membranas, o controle de resistência à desnaturação pela presença dos mesmos é fundamental para garantir a integridade das lectinas, e portanto, da manutenção da capacidade ligante das colunas de afinidade. Os resultados obtidos encontram-se expostos nas tabelas a seguir (08 a 11).


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Tabela 09: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL na presença de TritonX-100 0,5 e 1% em 10 minutos de contato.

Lectina

UAH Sem a

Presença de

Detergente

UAH na Presença de

TritonX-100 0,5%

UAH na Presença de

TritonX-100 1%

Jacalina 2048 2048 2048 EspecL 64 64 32 ConA 256 128 128

Tabela 10: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL presença de TritonX-100 0,5 e 1% em 30 minutos de contato.

Lectina

UAH Sem a

Presença de

Detergente

UAH na Presença de

TritonX-100 0,5%

UAH na Presença de

TritonX-100 1%


Tabela 11: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL na presença de SDS 0,5 e 1% em 10 minutos de contato.

Lectina

UAH Sem a

Presença de

Detergente

UAH na Presença de SDS

0,5%

UAH na Presença de

SDS 1%


Tabela 12: Avaliação da resistência das lectinas ConA, Jacalina e EspecL na presença de SDS 0,5 e 1% em 30 minutos de contato.

Lectina

UAH Sem a

Presença de

Detergente

UAH na Presença de SDS

0,5%

UAH na Presença de

SDS 1%

Jacalina 2048 2048 2048 EspecL 64 32 16 ConA 256 64 32 Pode-se observar que a lectina Jacalina mantém sua capacidade hemaglutinante na

presença de Triton-X100 e SDS nas condições testadas não apresentando diminuição do título. Porém, as lectinas EspecL e ConA apresentaram redução significativa da atividade na presença destes detergentes, não sendo portanto aconselhável o uso de amostras que contenham Triton- X100 ou SDS em colunas que contenham tais lectinas imobilizadas. Portanto, os extratos de proteínas obtidos deverão ser exaustivamente dialisados para remoção dos detergentes especialmente quando forem utilizados nas colunas de lectinas ConA e EspecL.


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5.2.4. Extração de proteínas dos tecidos obtidos após a necropsia dos animais

Como uma das mais importantes modificações pós-traducionais, a glicosilação modula

propriedades físicas, químicas e biológicas das proteínas. As estruturas de glicanos podem ser importantes determinantes em diferentes processos incluindo interações proteína-proteína, tráfego e conformação proteica, reconhecimento imune, adesão, migração celular e sinalização intercelular. Nesse sentido, glicanos aberrantes desempenham papéis críticos na biologia do câncer mediando a adesão, motilidade e invasão da célula tumoral tornando-se potenciais fontes de informação para a elucidação dos mecanismos da doença, possibilitando melhoria no diagnóstico e tratamento (ZENG et al, 2010).

Nesse contexto, foram realizadas extrações de proteínas de membranas e citosólicas do material de estudo para se obter os enriquecidos de glicoproteínas provenientes das colunas de afinidade produzidas ou mesmo para a avaliação da expressão de possíveis marcadores do proteoma total.

Os perfis eletroforéticos do extrato total de proteínas de membrana dos diversos grupos de estudo estão apresentados na Figura 35. De acordo com as setas indicativas da figura pode-se observar que várias diferenças na expressão de proteínas foram constatadas comparando-se os grupos controle e teste para cada tratamento.

Para os extratos de cólon dos experimentos com DMH (controle e teste) utilizamos a banda indicada pela seta BR como referência de concentração de proteínas aplicadas nas canaletas do gel de poliacrilamida. Embora seja observada maior concentração protéica nas amostras testes (linhas 3 e 4) observa-se indicado pela seta 2 que esse componente dos controles (linhas 1 e 2) apresenta-se em maior concentração que nas amostras dos testes. Por outro lado, o componente evidenciado pela seta 1 tem sua expressão aumentada pelo tratamento com DMH. Alterações na expressão também podem ser notadas para outros componentes indicados pelas setas 3 a 8.

Nos experimentos de DBT e DBTO2 observam-se alterações mais discretas (indicados pelas setas verdes) em relação aos experimentos com DMH: a seta BR indica a proteína tomada como referência de concentração, as demais setas indicam discretas diferenças entre controle e testes mais evidenciadas nos experimentos com 150 mg/kg de DBT, o componente indicado pela seta 4 sofre uma clara redução de concentração nos experimentos com DBTO2 150 mg/kg.


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Novos experimentos visando enriquecer os componentes das regiões apontadas serão imprescindíveis para o isolamento de quantidades satisfatórias desse material para permitir a sua identificação por espectrometria de massas.

Figura 35: SDS-PAGE 12% de extrato total de proteínas de membrana dos grupos controles e testes. Os extratos foram aplicados no gel em duplicata biológica para efeito de comparação das alterações observadas. Linhas 1 a 4: Controle e teste DMH, com material extraído do intestino grosso. Linhas 5 a 14: Controle e testes DBT e DBTO2 30 e 150 mg/kg com material extraído do intestino delgado. PMM: Padrão de Massa Molecular.

Como pode ser observado na Figura 36, correspondente ao extrato citosólico dos mesmos grupos e indivíduos discutidos anteriormente, ocorreram menores diferenças em relação ao observado nos extratos protéicos de membrana. Da mesma forma, utilizamos a seta BR para indicar a banda referência para concentração protéica das amostras aplicadas e as demais apontando diferenças de expressão para os tratamentos com DMH, DBT e DBTO2.


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Figura 36: SDS-PAGE 12% de extrato total de proteínas citosólicas dos grupos controles e testes. Os extratos foram aplicados no gel em duplicata biológica para efeito de comparação das alterações observadas. Linhas 1 a 4: Controle e teste DMH, com material extraído do intestino grosso. Linhas 5 a 14: Controle e testes DBT e DBTO2 30 e 150 mg/kg com material extraído do intestino delgado. PMM: Padrão de Massa Molecular. 5.2.5. Isolamento de glicoproteínas de membrana das amostras de animais

controles e testes tratados com DBT e DBTO2

Na tentativa de se isolar marcadores tumorais glicoproteicos provenientes das amostras de animais controle e testes tratados com DBT e DBTO2, submeteram-se amostras de proteínas de membrana às colunas de lectinas e ácido amino borônico (Fig. 37). Como pode ser observado na figura, são encontradas discretas diferenças de bandas para as diferentes colunas utilizadas (indicadas pelas setas). Além disso, as amostras foram separadas sendo aplicadas nas colunas em série respeitando-se a ordem: ConA, Erythrina, Jacalina e Ácido Amino Borônico. As diferenças encontradas para as glicoproteínas isoladas podem representar marcadores moleculares potenciais para a detecção precoce do câncer induzido por esses agentes.


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Figura 37: SDS-PAGE 12% das amostras de extratos de proteínas de membrana dos grupos Controle Óleo, Teste DBT 30 mg/kg e Teste DBTO2 30 mg/kg submetidas às colunas contendo ConA imobilizada (linhas 1 a 3), EspecL (linhas 4 a 6), Jacalina (linhas 7 a 9) e Ácido amino borônico (linhas 10 a 12). As amostras das linhas 1 a 9 estão coradas com Coomassie e as das linhas 10 a 12 estão coradas com prata.

6. Conclusões

Silva, K.T.S. Conclusões

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6. CONCLUSÕES

O tratamento crônico semanal de ratos Wistar por 10 semanas e latência de adicionais 14 semanas com a dose de 30 mg/kg e 150 mg/kg de DBT e DBTO2 e 30 mg/kg de DMH permitiu as seguintes avaliações toxicológicas:

- Os perfis de células sanguíneas e de enzimas utilizadas na avaliação da função

hepática não foram alterados, corroborando com a análise histológica e observação de esfregaços sanguíneos.

- Os níveis de amilase permaneceram estáveis em todos experimentos, indicando que não houve alterações agudas da função pancreática.

- As lesões identificadas pelas análises histopatológicas dos intestinos grosso e delgado indicaram a ocorrência de um processo neoplásico em fase inicial de desenvolvimento tanto para os animais tratados com DBT e DBTO2 quanto para os animais tratados com DMH;

- A indução de lesões neoplásicas por DBT e DBTO2, na mesma intensidade e mesma dose que o DMH situa esses agentes como indutores de câncer de grande expressão toxicológica;

- A análise comparativa dos perfis eletroforéticos (SDS-PAGE) dos extratos protéicos de membranas dos grupos controles e testes revelou diferenças na expressão de algumas proteínas, gerando a perspectiva de identificação de novos marcadores protéicos para as alterações celulares decorrentes da exposição a esses agentes.

7. Perspectivas

Silva, K.T.S. Perspectivas

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7. PERSPECTIVAS

Considerando a limitação no diagnóstico precoce de lesões tumorais decorrentes de indução química com os agentes estudados, e a importância ambiental dos mesmos, torna-se atraente a busca por novos marcadores proteicos e o desenvolvimento de métodos diagnósticos para a detecção dos mesmos. Sendo assim, pretende-se melhorar as condições cromatográficas utilizadas para a separação de glicoproteínas através de alterações nos tampões de amostra e eluição utilizados, tamanho e características das colunas.

8. Referências Bibliográficas

Silva, K.T.S. Referências Bibliográficas

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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9. Apêndice

Silva, K.T.S. Apêndice

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9. APÊNDICE

9.1. Controles de qualidade de imobilização para as resinas obtidas pelo

protocolo FNHSCA

9.1.1. Avaliação da eficácia de imobilização de proteínas

Colunas de aproximadamente 2 mL que utilizaram o protocolo descrito em FDCANHS para imobilização de tripsina foram submetidas à eluição com soluções de NaCl 1 M e 2 M. As frações coletadas na eluição para cada uma das soluções foram submetidas a ensaio de atividade para tripsina bovina como descrito em 4.2.1. Não foi observada atividade enzimática em nenhuma das frações coletadas, indicando que a imobilização de tripsina neste protocolo ocorre de maneira integralmente covalente.

9.1.2. Verificação da ocorrência de interações não específicas

Para a verificação da ocorrência de interações não específicas da resina FDCANHS com proteínas provenientes de amostras, submeteu-se uma solução de albumina bovina na concentração de 1 mg/mL à cromatografia nas mesmas colunas utilizadas no item 5.2.2. Após a aplicação da amostra e lavagem com tampão de baixa força iônica (NaCl 0,15 M) realizaram-se eluições com soluções de NaCl nas concentrações 1 M e 5 M sendo coletadas 10 frações de 1 mL cada. As frações coletadas foram submetidas à leitura em espectrofotômetro nos comprimentos de onda 230 e 280 nm e não foi detectado conteúdo proteico em nenhuma destas frações, o que indica que não há interação inespecífica da resina utilizada com amostras de albumina.


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9.2. Purificação das lectinas ConA, Jacalina e EspecL

9.2.1. Purificação de ConA

Sementes de Canavalia ensiformis foram utilizadas para a purificação da lectina ConA

conforme descrito no item 4.3.1. Utilizaram-se 200 g de pó de semente triturada como material de partida. Após a cromatografia do extrato obtido em coluna G-75, utilizando-se solução de glicose 0,2 M em NaCl 1 M para eluição, obteve-se o perfil cromatográfico apresentado na Figura 38.

Figura 38: Perfil de eluição em coluna G-75 obtido para a cromatografia de extrato de Canavalia ensiformis e purificação da lectina ConA.

9.2.2. Purificação de Jacalina

Sementes de Artocarpus integrifolia foram utilizadas para a purificação da lectina Jacalina conforme descrito no item 4.3.2. Utilizaram-se 30 g de pó de semente triturada como material de partida. Após a cromatografia do extrato obtido em coluna Fractogel-Goma-guar, utilizando-se solução de galactose 0,2 M para eluição, obteve-se o perfil cromatográfico apresentado na Figura 39.


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Figura 39: Perfil de eluição em coluna Fractogel-Goma-guar obtido para a cromatografia de extrato de Artocarpus integrifolia e purificação da lectina Jacalina.

9.2.3. Purificação de EspecL

Sementes de Erythrina speciosa foram utilizadas para a purificação da lectina EspecL conforme descrito no item 4.3.3. Utilizaram-se 20 g de pó de semente triturada como material de partida. Após a cromatografia do extrato obtido em coluna Galactosil-Sepharose utilizando-se solução de galactose 0,2 M para eluição, obteve-se o perfil cromatográfico apresentado na Figura 40.

Figura 40: Perfil de eluição em coluna Galactosil-Sepharose obtido para a cromatografia de extrato de Erythrina speciosa e purificação da lectina EspecL. Como pode ser avaliado através dos perfis de eluição (Fig. 37, 38, 39) e do perfil eletroforético para as lectinas purificadas (Fig. 41), obtiveram-se preparações homogêneas em


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quantidades satisfatórias de proteínas para a imobilização das mesmas através do protocolo FNHSCA descrito no item 4.2.

Figura 41: SDS-PAGE 15% das lectinas purificadas a partir de sementes de Canavalia ensiformis (ConA), Erythrina speciosa (EspecL) e Artocarpus integrifolia (Jacalina).

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ASPECTOS TOXICOLÓGICOS DO TRATAMENTO CRÔNICO DE … · Aos meus pais, pelo amor, carinho e apoio incondicionais. Obrigada por acreditarem nos meus sonhos e muitas vezes abrirem