VINIacuteCIUS CAROLINO DE SOUZA

ASSOCIACcedilAtildeO DA OSTEOPONTINA COM DENSIDADE MINERAL OacuteSSEA EM

INDIVIacuteDUOS MUITO IDOSOS

BRASIacuteLIA - DF 2012

UNIVERSIDADE DE BRASIacuteLIA

FACULDADE DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

VINIacuteCIUS CAROLINO DE SOUZA

ASSOCIACcedilAtildeO DA OSTEOPONTINA COM DENSIDADE MINERAL OacuteSSEA EM

INDIVIacuteDUOS MUITO IDOSOS

Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para a obtenccedilatildeo

do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de

Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias da Sauacutede da Universidade de

Brasiacutelia

Orientador Otaacutevio de Tolecircdo Noacutebrega

BRASIacuteLIA - DF

2012

VINIacuteCIUS CAROLINO DE SOUZA

ASSOCIACcedilAtildeO DA OSTEOPONTINA COM DENSIDADE MINERAL OacuteSSEA EM

INDIVIacuteDUOS MUITO IDOSOS

Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias

da Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia

Aprovado em 28 de Novembro de 2012

BANCA EXAMINADORA

Otaacutevio Tolecircdo Noacutebrega ndash (Presidente)

Universidade de Brasiacutelia

Herbert Gustavo Simotildees ndash (Membro)

Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia

Aparecido Pimentel Ferreira ndash (Membro)

UNICESPPROMOVE

Claudio Olavo de Almeida Coacuterdova ndash (Suplente)

Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia

Dedico este

trabalho aos meus Pais

minha Esposa e meu

Irmatildeo Pois sempre

estiveram do meu lado

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo primeiramente a Deus pela inspiraccedilatildeo e forccedila com que me

conduziu Pelo cuidado que Ele teve comigo todos esses tempos Pela sabedoria no

qual venho conquistando a cada dia que se passa pois sei que ela vem Dele

Aos meus Pais Maurilio e Faacutetima pelo apoio incondicional na minha vida

natildeo importando qual seja aacuterea da minha vida Onde sempre frisaram que a uacutenica

heranccedila que eu tenho e que ningueacutem pode me tirar satildeo os meus estudos Nunca me

esquecerei dessas palavras que me foi dita antes mesmo de concluir minha

graduaccedilatildeo Agradeccedilo por vocecircs sempre estarem ao meu lado natildeo importando qual

seja a situaccedilatildeo

Ao meu Irmatildeo Andreacute que com seu jeito uacutenico sempre me incentivou nas

minhas adversidades falando ldquoesse eacute meu irmatildeo Cabeccedilatildeordquo ldquoTamo juntordquo pra

sempre

A minha Esposa Lorena que sempre esteve ao meu lado seja qual for agrave

circunstacircncia Pelo apoio incentivo compreensatildeo e por sempre estar em prontidatildeo

a me ouvir Mesmo tendo que abrir matildeo de alguns finais de semana pois laacute estava

eu enfurnado no quarto de estudo escrevendo estudando ou preparando aula

Qualquer palavra que eu disser seraacute pouco pra expressar o que vocecirc eacute pra mim

Agradeccedilo a Deus por tecirc-la em minha vida

Ao meu orientador e amigo Profdeg Otaacutevio de Tolecircdo Noacutebrega no qual tenho

um carinho muito especial Sempre disposto a me ajudar em qualquer momento da

minha caminhada seja ela profissional ou pessoal pelos ensinamentos e conselhos

que sempre escutei com muita atenccedilatildeo e carinho Eacute um exemplo de Ser Humano

Orientadores como o senhor nos dias de hoje satildeo raros e eu posso dizer que tive o

privileacutegio de tecirc-lo como orientador

Aos meus amigos Wladimir Freitas Claudio Coacuterdova Alexandre Soares

Audrey Tonet Luis Guaglia e Andrei Sposito do Projeto Geros da Biocaacuterdios pois

me receberam de braccedilos abertos e confiaram no meu trabalho Eu estarei sempre

me esforccedilando para que possamos estar colhendo muitos frutos no meio cientiacutefico

Aos meus Amigos Profdeg Marcelo Sales Profdeg Rafael Sotero Profordf Verusca

Najara Profdeg Ricardo Asano Profdeg Jonato Prestes Profdeg Claudio Coacuterdova Profdeg

Daniel Boullosa Profordf Carmem Campbell e Profdeg Herbert Simotildees do programa de

poacutes-graduaccedilatildeo da Educaccedilatildeo fiacutesica - UCB pois cada um com seu jeito sempre

estiveram me incentivando e ajudando no meu crescimento como profissional e ser

humano Pela confianccedila em meu trabalho por acreditarem em mim

Aos meus Amigos de trabalho Diego Nakashoji Rodrigo Zolini Marcos Sodreacute

pelo apoio e momento de descontraccedilatildeo diante dificuldades que surgiram neste

trabalho Pelos bons momentos de risadas

A Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia que me possibilitou desenvolver este

trabalho em suas dependecircncias Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro

Em especial a todos os pacientes e familiares que se dispuseram a participar

deste trabalho para o crescimento da ciecircncia

Finalmente partindo da premissa de que ningueacutem faz nada sem ajuda

agradeccedilo a todas as pessoas que direta ou indiretamente concorreram para que o

presente trabalho se desenvolvesse e pudesse ser concluiacutedo

ldquoO homem saacutebio eacute forte e o homem de conhecimento consolida a forccedilardquo (Proveacuterbios 245)

ldquoOs saacutebios entesouram o conhecimento mas a boca do neacutescio eacute uma ruiacutena iminenterdquo (Proveacuterbios 1014)

ldquoO caminho para vida eacute de quem guarda o ensino mas o que abandona a repreensatildeo anda erradordquo

(Proveacuterbios 1017)

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

UNIVERSIDADE DE BRASIacuteLIA

FACULDADE DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

VINIacuteCIUS CAROLINO DE SOUZA

ASSOCIACcedilAtildeO DA OSTEOPONTINA COM DENSIDADE MINERAL OacuteSSEA EM

INDIVIacuteDUOS MUITO IDOSOS

Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para a obtenccedilatildeo

do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de

Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias da Sauacutede da Universidade de

Brasiacutelia

Orientador Otaacutevio de Tolecircdo Noacutebrega

BRASIacuteLIA - DF

2012

VINIacuteCIUS CAROLINO DE SOUZA

ASSOCIACcedilAtildeO DA OSTEOPONTINA COM DENSIDADE MINERAL OacuteSSEA EM

INDIVIacuteDUOS MUITO IDOSOS

Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias

da Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia

Aprovado em 28 de Novembro de 2012

BANCA EXAMINADORA

Otaacutevio Tolecircdo Noacutebrega ndash (Presidente)

Universidade de Brasiacutelia

Herbert Gustavo Simotildees ndash (Membro)

Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia

Aparecido Pimentel Ferreira ndash (Membro)

UNICESPPROMOVE

Claudio Olavo de Almeida Coacuterdova ndash (Suplente)

Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia

Dedico este

trabalho aos meus Pais

minha Esposa e meu

Irmatildeo Pois sempre

estiveram do meu lado

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo primeiramente a Deus pela inspiraccedilatildeo e forccedila com que me

conduziu Pelo cuidado que Ele teve comigo todos esses tempos Pela sabedoria no

qual venho conquistando a cada dia que se passa pois sei que ela vem Dele

Aos meus Pais Maurilio e Faacutetima pelo apoio incondicional na minha vida

natildeo importando qual seja aacuterea da minha vida Onde sempre frisaram que a uacutenica

heranccedila que eu tenho e que ningueacutem pode me tirar satildeo os meus estudos Nunca me

esquecerei dessas palavras que me foi dita antes mesmo de concluir minha

graduaccedilatildeo Agradeccedilo por vocecircs sempre estarem ao meu lado natildeo importando qual

seja a situaccedilatildeo

Ao meu Irmatildeo Andreacute que com seu jeito uacutenico sempre me incentivou nas

minhas adversidades falando ldquoesse eacute meu irmatildeo Cabeccedilatildeordquo ldquoTamo juntordquo pra

sempre

A minha Esposa Lorena que sempre esteve ao meu lado seja qual for agrave

circunstacircncia Pelo apoio incentivo compreensatildeo e por sempre estar em prontidatildeo

a me ouvir Mesmo tendo que abrir matildeo de alguns finais de semana pois laacute estava

eu enfurnado no quarto de estudo escrevendo estudando ou preparando aula

Qualquer palavra que eu disser seraacute pouco pra expressar o que vocecirc eacute pra mim

Agradeccedilo a Deus por tecirc-la em minha vida

Ao meu orientador e amigo Profdeg Otaacutevio de Tolecircdo Noacutebrega no qual tenho

um carinho muito especial Sempre disposto a me ajudar em qualquer momento da

minha caminhada seja ela profissional ou pessoal pelos ensinamentos e conselhos

que sempre escutei com muita atenccedilatildeo e carinho Eacute um exemplo de Ser Humano

Orientadores como o senhor nos dias de hoje satildeo raros e eu posso dizer que tive o

privileacutegio de tecirc-lo como orientador

Aos meus amigos Wladimir Freitas Claudio Coacuterdova Alexandre Soares

Audrey Tonet Luis Guaglia e Andrei Sposito do Projeto Geros da Biocaacuterdios pois

me receberam de braccedilos abertos e confiaram no meu trabalho Eu estarei sempre

me esforccedilando para que possamos estar colhendo muitos frutos no meio cientiacutefico

Aos meus Amigos Profdeg Marcelo Sales Profdeg Rafael Sotero Profordf Verusca

Najara Profdeg Ricardo Asano Profdeg Jonato Prestes Profdeg Claudio Coacuterdova Profdeg

Daniel Boullosa Profordf Carmem Campbell e Profdeg Herbert Simotildees do programa de

poacutes-graduaccedilatildeo da Educaccedilatildeo fiacutesica - UCB pois cada um com seu jeito sempre

estiveram me incentivando e ajudando no meu crescimento como profissional e ser

humano Pela confianccedila em meu trabalho por acreditarem em mim

Aos meus Amigos de trabalho Diego Nakashoji Rodrigo Zolini Marcos Sodreacute

pelo apoio e momento de descontraccedilatildeo diante dificuldades que surgiram neste

trabalho Pelos bons momentos de risadas

A Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia que me possibilitou desenvolver este

trabalho em suas dependecircncias Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro

Em especial a todos os pacientes e familiares que se dispuseram a participar

deste trabalho para o crescimento da ciecircncia

Finalmente partindo da premissa de que ningueacutem faz nada sem ajuda

agradeccedilo a todas as pessoas que direta ou indiretamente concorreram para que o

presente trabalho se desenvolvesse e pudesse ser concluiacutedo

ldquoO homem saacutebio eacute forte e o homem de conhecimento consolida a forccedilardquo (Proveacuterbios 245)

ldquoOs saacutebios entesouram o conhecimento mas a boca do neacutescio eacute uma ruiacutena iminenterdquo (Proveacuterbios 1014)

ldquoO caminho para vida eacute de quem guarda o ensino mas o que abandona a repreensatildeo anda erradordquo

(Proveacuterbios 1017)

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

VINIacuteCIUS CAROLINO DE SOUZA

ASSOCIACcedilAtildeO DA OSTEOPONTINA COM DENSIDADE MINERAL OacuteSSEA EM

INDIVIacuteDUOS MUITO IDOSOS

Dissertaccedilatildeo apresentada como requisito parcial para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de

Mestre em Ciecircncias da Sauacutede pelo Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias

da Sauacutede da Universidade de Brasiacutelia

Aprovado em 28 de Novembro de 2012

BANCA EXAMINADORA

Otaacutevio Tolecircdo Noacutebrega ndash (Presidente)

Universidade de Brasiacutelia

Herbert Gustavo Simotildees ndash (Membro)

Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia

Aparecido Pimentel Ferreira ndash (Membro)

UNICESPPROMOVE

Claudio Olavo de Almeida Coacuterdova ndash (Suplente)

Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia

Dedico este

trabalho aos meus Pais

minha Esposa e meu

Irmatildeo Pois sempre

estiveram do meu lado

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo primeiramente a Deus pela inspiraccedilatildeo e forccedila com que me

conduziu Pelo cuidado que Ele teve comigo todos esses tempos Pela sabedoria no

qual venho conquistando a cada dia que se passa pois sei que ela vem Dele

Aos meus Pais Maurilio e Faacutetima pelo apoio incondicional na minha vida

natildeo importando qual seja aacuterea da minha vida Onde sempre frisaram que a uacutenica

heranccedila que eu tenho e que ningueacutem pode me tirar satildeo os meus estudos Nunca me

esquecerei dessas palavras que me foi dita antes mesmo de concluir minha

graduaccedilatildeo Agradeccedilo por vocecircs sempre estarem ao meu lado natildeo importando qual

seja a situaccedilatildeo

Ao meu Irmatildeo Andreacute que com seu jeito uacutenico sempre me incentivou nas

minhas adversidades falando ldquoesse eacute meu irmatildeo Cabeccedilatildeordquo ldquoTamo juntordquo pra

sempre

A minha Esposa Lorena que sempre esteve ao meu lado seja qual for agrave

circunstacircncia Pelo apoio incentivo compreensatildeo e por sempre estar em prontidatildeo

a me ouvir Mesmo tendo que abrir matildeo de alguns finais de semana pois laacute estava

eu enfurnado no quarto de estudo escrevendo estudando ou preparando aula

Qualquer palavra que eu disser seraacute pouco pra expressar o que vocecirc eacute pra mim

Agradeccedilo a Deus por tecirc-la em minha vida

Ao meu orientador e amigo Profdeg Otaacutevio de Tolecircdo Noacutebrega no qual tenho

um carinho muito especial Sempre disposto a me ajudar em qualquer momento da

minha caminhada seja ela profissional ou pessoal pelos ensinamentos e conselhos

que sempre escutei com muita atenccedilatildeo e carinho Eacute um exemplo de Ser Humano

Orientadores como o senhor nos dias de hoje satildeo raros e eu posso dizer que tive o

privileacutegio de tecirc-lo como orientador

Aos meus amigos Wladimir Freitas Claudio Coacuterdova Alexandre Soares

Audrey Tonet Luis Guaglia e Andrei Sposito do Projeto Geros da Biocaacuterdios pois

me receberam de braccedilos abertos e confiaram no meu trabalho Eu estarei sempre

me esforccedilando para que possamos estar colhendo muitos frutos no meio cientiacutefico

Aos meus Amigos Profdeg Marcelo Sales Profdeg Rafael Sotero Profordf Verusca

Najara Profdeg Ricardo Asano Profdeg Jonato Prestes Profdeg Claudio Coacuterdova Profdeg

Daniel Boullosa Profordf Carmem Campbell e Profdeg Herbert Simotildees do programa de

poacutes-graduaccedilatildeo da Educaccedilatildeo fiacutesica - UCB pois cada um com seu jeito sempre

estiveram me incentivando e ajudando no meu crescimento como profissional e ser

humano Pela confianccedila em meu trabalho por acreditarem em mim

Aos meus Amigos de trabalho Diego Nakashoji Rodrigo Zolini Marcos Sodreacute

pelo apoio e momento de descontraccedilatildeo diante dificuldades que surgiram neste

trabalho Pelos bons momentos de risadas

A Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia que me possibilitou desenvolver este

trabalho em suas dependecircncias Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro

Em especial a todos os pacientes e familiares que se dispuseram a participar

deste trabalho para o crescimento da ciecircncia

Finalmente partindo da premissa de que ningueacutem faz nada sem ajuda

agradeccedilo a todas as pessoas que direta ou indiretamente concorreram para que o

presente trabalho se desenvolvesse e pudesse ser concluiacutedo

ldquoO homem saacutebio eacute forte e o homem de conhecimento consolida a forccedilardquo (Proveacuterbios 245)

ldquoOs saacutebios entesouram o conhecimento mas a boca do neacutescio eacute uma ruiacutena iminenterdquo (Proveacuterbios 1014)

ldquoO caminho para vida eacute de quem guarda o ensino mas o que abandona a repreensatildeo anda erradordquo

(Proveacuterbios 1017)

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

Dedico este

trabalho aos meus Pais

minha Esposa e meu

Irmatildeo Pois sempre

estiveram do meu lado

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo primeiramente a Deus pela inspiraccedilatildeo e forccedila com que me

conduziu Pelo cuidado que Ele teve comigo todos esses tempos Pela sabedoria no

qual venho conquistando a cada dia que se passa pois sei que ela vem Dele

Aos meus Pais Maurilio e Faacutetima pelo apoio incondicional na minha vida

natildeo importando qual seja aacuterea da minha vida Onde sempre frisaram que a uacutenica

heranccedila que eu tenho e que ningueacutem pode me tirar satildeo os meus estudos Nunca me

esquecerei dessas palavras que me foi dita antes mesmo de concluir minha

graduaccedilatildeo Agradeccedilo por vocecircs sempre estarem ao meu lado natildeo importando qual

seja a situaccedilatildeo

Ao meu Irmatildeo Andreacute que com seu jeito uacutenico sempre me incentivou nas

minhas adversidades falando ldquoesse eacute meu irmatildeo Cabeccedilatildeordquo ldquoTamo juntordquo pra

sempre

A minha Esposa Lorena que sempre esteve ao meu lado seja qual for agrave

circunstacircncia Pelo apoio incentivo compreensatildeo e por sempre estar em prontidatildeo

a me ouvir Mesmo tendo que abrir matildeo de alguns finais de semana pois laacute estava

eu enfurnado no quarto de estudo escrevendo estudando ou preparando aula

Qualquer palavra que eu disser seraacute pouco pra expressar o que vocecirc eacute pra mim

Agradeccedilo a Deus por tecirc-la em minha vida

Ao meu orientador e amigo Profdeg Otaacutevio de Tolecircdo Noacutebrega no qual tenho

um carinho muito especial Sempre disposto a me ajudar em qualquer momento da

minha caminhada seja ela profissional ou pessoal pelos ensinamentos e conselhos

que sempre escutei com muita atenccedilatildeo e carinho Eacute um exemplo de Ser Humano

Orientadores como o senhor nos dias de hoje satildeo raros e eu posso dizer que tive o

privileacutegio de tecirc-lo como orientador

Aos meus amigos Wladimir Freitas Claudio Coacuterdova Alexandre Soares

Audrey Tonet Luis Guaglia e Andrei Sposito do Projeto Geros da Biocaacuterdios pois

me receberam de braccedilos abertos e confiaram no meu trabalho Eu estarei sempre

me esforccedilando para que possamos estar colhendo muitos frutos no meio cientiacutefico

Aos meus Amigos Profdeg Marcelo Sales Profdeg Rafael Sotero Profordf Verusca

Najara Profdeg Ricardo Asano Profdeg Jonato Prestes Profdeg Claudio Coacuterdova Profdeg

Daniel Boullosa Profordf Carmem Campbell e Profdeg Herbert Simotildees do programa de

poacutes-graduaccedilatildeo da Educaccedilatildeo fiacutesica - UCB pois cada um com seu jeito sempre

estiveram me incentivando e ajudando no meu crescimento como profissional e ser

humano Pela confianccedila em meu trabalho por acreditarem em mim

Aos meus Amigos de trabalho Diego Nakashoji Rodrigo Zolini Marcos Sodreacute

pelo apoio e momento de descontraccedilatildeo diante dificuldades que surgiram neste

trabalho Pelos bons momentos de risadas

A Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia que me possibilitou desenvolver este

trabalho em suas dependecircncias Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro

Em especial a todos os pacientes e familiares que se dispuseram a participar

deste trabalho para o crescimento da ciecircncia

Finalmente partindo da premissa de que ningueacutem faz nada sem ajuda

agradeccedilo a todas as pessoas que direta ou indiretamente concorreram para que o

presente trabalho se desenvolvesse e pudesse ser concluiacutedo

ldquoO homem saacutebio eacute forte e o homem de conhecimento consolida a forccedilardquo (Proveacuterbios 245)

ldquoOs saacutebios entesouram o conhecimento mas a boca do neacutescio eacute uma ruiacutena iminenterdquo (Proveacuterbios 1014)

ldquoO caminho para vida eacute de quem guarda o ensino mas o que abandona a repreensatildeo anda erradordquo

(Proveacuterbios 1017)

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

AGRADECIMENTOS

Agradeccedilo primeiramente a Deus pela inspiraccedilatildeo e forccedila com que me

conduziu Pelo cuidado que Ele teve comigo todos esses tempos Pela sabedoria no

qual venho conquistando a cada dia que se passa pois sei que ela vem Dele

Aos meus Pais Maurilio e Faacutetima pelo apoio incondicional na minha vida

natildeo importando qual seja aacuterea da minha vida Onde sempre frisaram que a uacutenica

heranccedila que eu tenho e que ningueacutem pode me tirar satildeo os meus estudos Nunca me

esquecerei dessas palavras que me foi dita antes mesmo de concluir minha

graduaccedilatildeo Agradeccedilo por vocecircs sempre estarem ao meu lado natildeo importando qual

seja a situaccedilatildeo

Ao meu Irmatildeo Andreacute que com seu jeito uacutenico sempre me incentivou nas

minhas adversidades falando ldquoesse eacute meu irmatildeo Cabeccedilatildeordquo ldquoTamo juntordquo pra

sempre

A minha Esposa Lorena que sempre esteve ao meu lado seja qual for agrave

circunstacircncia Pelo apoio incentivo compreensatildeo e por sempre estar em prontidatildeo

a me ouvir Mesmo tendo que abrir matildeo de alguns finais de semana pois laacute estava

eu enfurnado no quarto de estudo escrevendo estudando ou preparando aula

Qualquer palavra que eu disser seraacute pouco pra expressar o que vocecirc eacute pra mim

Agradeccedilo a Deus por tecirc-la em minha vida

Ao meu orientador e amigo Profdeg Otaacutevio de Tolecircdo Noacutebrega no qual tenho

um carinho muito especial Sempre disposto a me ajudar em qualquer momento da

minha caminhada seja ela profissional ou pessoal pelos ensinamentos e conselhos

que sempre escutei com muita atenccedilatildeo e carinho Eacute um exemplo de Ser Humano

Orientadores como o senhor nos dias de hoje satildeo raros e eu posso dizer que tive o

privileacutegio de tecirc-lo como orientador

Aos meus amigos Wladimir Freitas Claudio Coacuterdova Alexandre Soares

Audrey Tonet Luis Guaglia e Andrei Sposito do Projeto Geros da Biocaacuterdios pois

me receberam de braccedilos abertos e confiaram no meu trabalho Eu estarei sempre

me esforccedilando para que possamos estar colhendo muitos frutos no meio cientiacutefico

Aos meus Amigos Profdeg Marcelo Sales Profdeg Rafael Sotero Profordf Verusca

Najara Profdeg Ricardo Asano Profdeg Jonato Prestes Profdeg Claudio Coacuterdova Profdeg

Daniel Boullosa Profordf Carmem Campbell e Profdeg Herbert Simotildees do programa de

poacutes-graduaccedilatildeo da Educaccedilatildeo fiacutesica - UCB pois cada um com seu jeito sempre

estiveram me incentivando e ajudando no meu crescimento como profissional e ser

humano Pela confianccedila em meu trabalho por acreditarem em mim

Aos meus Amigos de trabalho Diego Nakashoji Rodrigo Zolini Marcos Sodreacute

pelo apoio e momento de descontraccedilatildeo diante dificuldades que surgiram neste

trabalho Pelos bons momentos de risadas

A Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia que me possibilitou desenvolver este

trabalho em suas dependecircncias Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro

Em especial a todos os pacientes e familiares que se dispuseram a participar

deste trabalho para o crescimento da ciecircncia

Finalmente partindo da premissa de que ningueacutem faz nada sem ajuda

agradeccedilo a todas as pessoas que direta ou indiretamente concorreram para que o

presente trabalho se desenvolvesse e pudesse ser concluiacutedo

ldquoO homem saacutebio eacute forte e o homem de conhecimento consolida a forccedilardquo (Proveacuterbios 245)

ldquoOs saacutebios entesouram o conhecimento mas a boca do neacutescio eacute uma ruiacutena iminenterdquo (Proveacuterbios 1014)

ldquoO caminho para vida eacute de quem guarda o ensino mas o que abandona a repreensatildeo anda erradordquo

(Proveacuterbios 1017)

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

estiveram me incentivando e ajudando no meu crescimento como profissional e ser

humano Pela confianccedila em meu trabalho por acreditarem em mim

Aos meus Amigos de trabalho Diego Nakashoji Rodrigo Zolini Marcos Sodreacute

pelo apoio e momento de descontraccedilatildeo diante dificuldades que surgiram neste

trabalho Pelos bons momentos de risadas

A Universidade Catoacutelica de Brasiacutelia que me possibilitou desenvolver este

trabalho em suas dependecircncias Ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro

Em especial a todos os pacientes e familiares que se dispuseram a participar

deste trabalho para o crescimento da ciecircncia

Finalmente partindo da premissa de que ningueacutem faz nada sem ajuda

agradeccedilo a todas as pessoas que direta ou indiretamente concorreram para que o

presente trabalho se desenvolvesse e pudesse ser concluiacutedo

ldquoO homem saacutebio eacute forte e o homem de conhecimento consolida a forccedilardquo (Proveacuterbios 245)

ldquoOs saacutebios entesouram o conhecimento mas a boca do neacutescio eacute uma ruiacutena iminenterdquo (Proveacuterbios 1014)

ldquoO caminho para vida eacute de quem guarda o ensino mas o que abandona a repreensatildeo anda erradordquo

(Proveacuterbios 1017)

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

ldquoO homem saacutebio eacute forte e o homem de conhecimento consolida a forccedilardquo (Proveacuterbios 245)

ldquoOs saacutebios entesouram o conhecimento mas a boca do neacutescio eacute uma ruiacutena iminenterdquo (Proveacuterbios 1014)

ldquoO caminho para vida eacute de quem guarda o ensino mas o que abandona a repreensatildeo anda erradordquo

(Proveacuterbios 1017)

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

RESUMO

Introduccedilatildeo e objetivo Dado que a concentraccedilatildeo seacuterica de osteopontina (OPN)

constitui promessa de marcador para o diagnoacutestico precoce de doenccedilas oacutesseas

tecemos a hipoacutetese de que um polimorfismo em seu gene poderia explicar niacuteveis

seacutericos diferenciais do mediador e em sequencia os escores de densidade oacutessea

entre adultos muito idosos no Brasil Meacutetodos homens e mulheres (80 anos ou

mais) residentes no Distrito Federal brasileiro foram submetidos a avaliaccedilatildeo por

densitometria oacutessea de raio-X de dupla energia para determinaccedilatildeo da densidade

mineral oacutessea (DMO) das regiotildees do colo do fecircmur cabeccedila do fecircmur e lombosacral

(L1 a S5) Exame cliacutenico foi realizado para avaliar outras caracteriacutesticas fiacutesicas e

para excluir co-morbidades (cardiovasculares autoimunidade infecccedilotildees ou doenccedilas

neoplaacutesicas) As concentraccedilotildees seacutericas de OPN foram determinadas por ensaio

imunoenzimaacutetico enquanto o polimorfismo A7385G (rs1126772) foi determinada por

sequenciamento direto dos produtos de reaccedilatildeo em cadeia da polimerase

Resultados Entre os duzentos e dez sujeitos envolvidos natildeo foram observados

niacuteveis diferenciais de densidade mineral oacutessea entre os genoacutetipos mas um teor

circulatoacuterio aumentado de OPN foi encontrado entre os portadores do alelo A (P le

005) mesmo apoacutes os ajustes Os niacuteveis seacutericos de OPN foram negativamente

correlacionados com a densidade do colo do fecircmur (P = 0050 para a DMO P =

0032 para T-score) mas natildeo os niacuteveis de outras regiotildees investigadas As anaacutelises

com a amostra dicotomizada para idade e massa corporal revelou que esta

associaccedilatildeo foi perceptiacutevel apenas entre os sujeitos pertencentes agrave faixa etaacuteria mais

avanccedilada e aos com peso corporal dentro do intervalo inferior Conclusatildeo Nossos

achados apontam para niacuteveis circulantes elevados de osteopontina entre pacientes

com densidade mineral oacutessea diminuiacuteda consistente com uma modesta contribuiccedilatildeo

de uma variaccedilatildeo aleacutelica OPN para a expressatildeo do mediador Atestar relevacircncia

cliacutenica destes achados exige estudos futuros

Palavras-chave densidade oacutessea osteoporose remodelaccedilatildeo oacutessea polimorfismo

biomarcador envelhecimento

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

ABSTRACT

Introduction and objective Given that serum osteopontin (OPN) concentrations

may be a promising marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized

that a polymorphism in its gene might account to differential serum levels of the

mediator and thus to the bone density scores among very-old adults in Brazil

Methods Men and women (80 years or older) living in the Brazilian Federal District

underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for bone mineral

density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5)

regions Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to

exclude co-morbidities (cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic

diseases) Serum concentrations of OPN were determined with an enzyme-linked

immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism (rs1126772) was

determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Results

Among the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone

mineral density could be observed across genotypes but a greater content of

circulating OPN was found among carriers of the A allele (P le 005) even after

adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the femoral neck

density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass

revealed that this inverse relationship was noticeable only among those aged within

the highest and weighed within the lowest intervals Conclusion Our findings

indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with decreased bone

mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming

studies

Key-words bone density osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker

ageing

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D ndash Duas Dimensotildees

3D ndash Trecircs Dimensotildees

BMPs ndash Bone morphogenetic proteins (Proteiacutenas morfogeneacuteticas

oacutesseas)

Ceacutelulas NK ndash Ceacutelulas Natural Killer

CMO ndash Conteuacutedo Mineral Oacutesseo

CTX ndash C-telopeptiacutedeo do Colaacutegeno Tipo I

DCNT ndash Doenccedilas Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel

DEXA ndash dual energy X-ray absorptiometry (densitometria oacutessea com

raio-X de dupla energia)

DMO ndash Densidade Mineral Oacutessea

FTIR ndash Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de

Raman e Fourier

GLA ndash Aacutecido gama-carboxiglutacircmico

HR-MRI ndash Ressonacircncia Magneacutetica em Imagem de Alta Resoluccedilatildeo

HR-pQCT ndash Tomografia Computadorizada Quantitativa de Alta

Resoluccedilatildeo Perifeacuterica

IMC ndash Iacutendice de Massa Corporal

OMS ndash Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede

OPN ndash Osteopontina

NTX ndash N-telopeacuteptidos do colaacutegeno tipo I

P1NP ndash N-proacute-peacuteptideos de Colaacutegeno do Tipo 1

qBSEI ndash imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa

RGD ndash Arg-Gly-Asp (arginandashglicinandashaspartato)

SAXS ndash Teacutecnica de Dispersatildeo de Raios-X em Pequeno Acircngulo

TEM ndash Microscopia Eletrocircnica de Transmissatildeo

TGF-β ndash Transforming growth factor beta (fator de transformaccedilatildeo de

crescimento Beta)

μCT ndash Tomografia Computadorizada em Resoluccedilatildeo Micromeacutetrica

de Radiaccedilatildeo Sincrotron

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

SUMAacuteRIO

1 ndash INTRODUCcedilAtildeO 11

2 ndash REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 13

21 ndash Envelhecimento Populacional 13

22 ndash Osso (tecido oacutesseo) 15

221 ndash Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea 15

222 ndash Qualidade Oacutessea 18

2221 ndash Remodelaccedilatildeo Renovaccedilatildeo Oacutessea 19

2222 ndash Microarquitetura Oacutessea 21

2223 ndash Mineralizaccedilatildeo e Matriz Oacutessea 22

2224 ndash Avaliaccedilatildeo dos Microdanos Microlesotildees 24

23 ndash Densidade Mineral Oacutessea 25

231 ndash Densitometria Oacutessea (DEXA) 27

24 ndash Osteopontina 29

241 ndash Funccedilatildeo 29

242 ndash Estrutura 31

3 ndash JUSTIFICATIVA 32

4 ndash OBJETIVOS 33

5 ndash MANUSCRITO 34

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR 53

7 ndash CONCLUSAtildeO 55

8 ndash REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 56

ANEXO A ndash APROVACcedilAO EM COMITEcirc DE EacuteTICA 72

ANEXO B ndash TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO73

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

12

1 INTRODUCcedilAtildeO

A transiccedilatildeo demograacutefica encontra-se em diferentes fases ao redor do mundo

Em conjunto com a transiccedilatildeo epidemioloacutegica resulta no principal fenocircmeno

demograacutefico do seacuteculo 20 e que se estende ao longo deste seacuteculo conhecido como

envelhecimento populacional Este fenocircmeno tem levado a uma reorganizaccedilatildeo do

sistema de Sauacutede pois essa populaccedilatildeo exige cuidados que satildeo um desafio devido

agraves doenccedilas crocircnicas que apresentam aleacutem do fato de que incorporam disfunccedilotildees

nos uacuteltimos anos de suas vidas No grupo etaacuterio composto por pessoas acima de 65

anos observou-se um crescimento de 35 em 1970 para 55 em 2000 Em 2050

este grupo etaacuterio deveraacute responder por 19 da populaccedilatildeo brasileira Estes fatos

levaratildeo a uma draacutestica mudanccedila de padratildeo na piracircmide populacional brasileira (1)

Entretanto eacute interessante observar o envelhecimento dentro da proacutepria populaccedilatildeo

idosa pois vemos que enquanto 17 dos idosos de ambos os sexos tinham 80

anos ou mais de idade em 2050 corresponderatildeo provavelmente a

aproximadamente 28 do segmento Na populaccedilatildeo feminina o percentual das mais

idosas passaraacute de 18 para cerca de 308 e assim presenciaremos o

ldquoenvelhecimentordquo e ldquofeminilizaccedilatildeordquo da populaccedilatildeo muito-idosa (2) No ano de 2000

para cada cem mulheres idosas havia 81 homens idosos em 2050 haveraacute

provavelmente cerca de 76 idosos para cem idosas No grupo acima de 80 anos

estima-se que em 2050 teremos duas idosas para cada idoso (3)

Na populaccedilatildeo idosa a prevalecircncia de distuacuterbios oacutesseos eacute elevada O principal

distuacuterbio oacutesseo consiste na osteoporose Ela eacute conhecida como uma doenccedila

silenciosa por ser assintomaacutetica pois o surgimento das primeiras manifestaccedilotildees

cliacutenicas ocorre quando jaacute atinge perda da ordem de 30 a 40 de massa oacutessea

(456) A osteoporose eacute uma doenccedila de importacircncia crescente tendo-se em vista o

aumento da expectativa de vida populacional que no Brasil eacute de aproximadamente

72 anos para as mulheres (8) Estima-se que uma em cada duas mulheres assim

como em um a cada cinco homens acima de 65 anos de idade apresentaratildeo pelo

menos uma fratura relacionada agrave osteoporose em algum momento da vida (9) A

osteoporose atualmente afeta mais de 75 milhotildees de pessoas na Europa Japatildeo e

os Estados Unidos com um risco estimado de fraturas ao redor 15 (10) Dados

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

13

norte-americanos mostram que as fraturas devido agrave osteoporose satildeo mais graves

letais em 12 a 20 dos casos e acarretam despesas meacutedicas ao redor de dez

bilhotildees de doacutelares (11) Sabe-se que a incidecircncia de osteoporose entre mulheres

chilenas acima de 50 anos de idade eacute de 22 (12) No Brasil haacute escassez de dados

referentes agrave populaccedilatildeo acometida pela osteoporose (9) Estima-se que

aproximadamente 10 milhotildees de brasileiros sofram com osteoporose no paiacutes (13)

sendo que 24 milhotildees sofrem fraturas anualmente e destes cerca de 200 mil

morreratildeo em decorrecircncia direta de suas fraturas (14) Calcula-se que a osteoporose

afete cerca de 35 das mulheres acima de 45 anos de idade em nosso paiacutes (15)

O DEXA eacute considerado como o meacutetodo ldquopadratildeo-ourordquo em estudos de

validaccedilatildeo de meacutetodos e equaccedilotildees para a avaliaccedilatildeo da composiccedilatildeo corporal Por ser

uma das teacutecnicas densitomeacutetricas mais usadas no mundo para determinaccedilatildeo da

densidade oacutessea isto faz com que tenha um destaque na aplicabilidade cliacutenica Pois

haacute falta de marcadores bioquiacutemicos de apoio ao diagnoacutestico especialmente em

indiviacuteduos muito idosos (1617)

Este trabalho pretende investigar a possibilidade de associaccedilatildeo dos genoacutetipos

e niacuteveis de OPN com distuacuterbios oacutesseos em indiviacuteduos muito idosos com vistas a

estudar sua aplicabilidade como marcador molecular para integridade oacutessea nesse

grupo etaacuterio

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

14

2 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA

21 Envelhecimento Populacional

O envelhecimento eacute um fenocircmeno complexo que ultimamente tem despertado

grande interesse cientiacutefico O proacuteprio envelhecimento populacional vem sendo

apresentado como um dos maiores desafios da sauacutede puacuteblica contemporacircnea O

processo de transiccedilatildeo demograacutefica caracterizada pela diminuiccedilatildeo das taxas de

mortalidade e de fecundidade tem proporcionado o aumento da populaccedilatildeo idosa

mundial Nos paiacuteses desenvolvidos a transiccedilatildeo demograacutefica ocorreu

gradativamente facilitando a adaptaccedilatildeo agraves condiccedilotildees necessaacuterias para assistir aos

idosos (17) O Brasil vem acompanhando essa tendecircncia mundial uma vez que

entre as deacutecadas de 40 e 70 houve grande aumento da expectativa de vida da

populaccedilatildeo devido sobretudo agraves accedilotildees de sauacutede puacuteblica vacinaccedilatildeo saneamento

baacutesico e aos avanccedilos meacutedico-tecnoloacutegicos (1819) Esse processo intensificou-se a

partir da deacutecada de 60 e a expectativa de vida ao nascer atingiu 686 anos em 2000

(17) A partir dos anos 80 o envelhecimento tornou-se um fenocircmeno que atinge

grande parte do mundo incluindo tanto paiacuteses desenvolvidos como aqueles em

desenvolvimento (20) O processo de envelhecimento no Brasil estaacute associado em

geral com as melhorias das condiccedilotildees meacutedico-sanitaacuterias enquanto nos paiacuteses

desenvolvidos o processo estaacute associado tanto com a evoluccedilatildeo meacutedico-sanitaacuteria

como com a melhoria das condiccedilotildees de educaccedilatildeo saneamento baacutesico infra-

estrutura condiccedilotildees soacutecio-econocircmicas dentre outros fatores (1721)

Em nosso paiacutes estima-se que em 2025 a populaccedilatildeo brasileira seraacute cinco

vezes maior que a de 1950 ao passo que o nuacutemero de pessoas com idade superior

a 60 anos teraacute aumentado cerca de quinze vezes Essas alteraccedilotildees colocaratildeo o

Brasil na condiccedilatildeo de portador da sexta maior populaccedilatildeo de idosos do mundo em

termos absolutos (22)

Algumas projeccedilotildees pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) estimam que

entre 1990 e 2025 a populaccedilatildeo idosa aumentaraacute de sete a oito vezes em paiacuteses

como Colocircmbia Malaacutesia Quecircnia Tailacircndia e Gana As mesmas projeccedilotildees indicam

que em 2025 o Brasil apresentaraacute um nuacutemero estimado de 27 milhotildees de pessoas

acima de 60 anos de idade (23) Em paralelo agraves modificaccedilotildees observadas na

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

15

piracircmide populacional as doenccedilas proacuteprias do envelhecimento ganham maior

expressatildeo no acircmbito social Em geral a populaccedilatildeo de idosos apresenta uma alta

prevalecircncia de doenccedilas crocircnicas onde cerca de 90 deste contingente manifesta a

menos uma DCNT (Doenccedila Crocircnica Natildeo Transmissiacutevel) (24) O grupo das DCNTs

compreende majoritariamente as doenccedilas cardiovasculares diabetes cacircncer e

doenccedilas respiratoacuterias crocircnicas entre outras (25)

Claramente um dos resultados dessa dinacircmica consiste em uma demanda

crescente por serviccedilos de sauacutede O idoso consome mais internaccedilotildees hospitalares

assim como uma ocupaccedilatildeo de leito por mais tempo quando comparado a outras

faixas etaacuterias No geral as doenccedilas dos idosos satildeo crocircnicas e muacuteltiplas perdurando

por vaacuterios anos e exigindo acompanhamento constante cuidados permanentes

assim como medicaccedilatildeo contiacutenua e exames perioacutedicos (26)

Recentemente os distuacuterbios oacutesseos com ecircnfase para a osteoporose tecircm

sido reconhecidos como um dos maiores problemas de sauacutede puacuteblica do mundo

devido principalmente agraves altas taxas de morbi-mortalidade relacionadas com

fraturas particularmente entre mulheres idosas e em regiotildees anatocircmicas

especiacuteficas como quadril veacutertebras e antebraccedilo (27282930) A osteoporose eacute uma

doenccedila esqueleacutetica sistecircmica caracterizada por diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e

deteriorizaccedilatildeo microarquitetural do tecido oacutesseo com consequente aumento da

fragilidade oacutessea e susceptibilidade agrave fratura (27313233) No entanto a perda de

massa oacutessea consiste em uma consequecircncia do processo de envelhecimento que

por si soacute natildeo explica a diversidade de etiologias para as fraturas observadas na

praacutetica cliacutenica (34) Alteraccedilotildees da microarquitetura dos ossos que natildeo afetam sua

densidade aparente parecem contribuir para a fragilidade encontrada no segmento

geriaacutetrico da populaccedilatildeo Entretanto no indiviacuteduo com osteoporose a perda de

massa oacutessea torna-se tatildeo aparente que passa a constituir a principal variaacutevel de

preocupaccedilatildeo por parte da equipe cliacutenica (2835)

Sendo assim torna-se indispensaacutevel o desenvolvimento de pesquisas que

possam contribuir para o entendimento das alteraccedilotildees fisioloacutegicas decorrentes do

processo de envelhecimento bem como das patologias associadas a este processo

para que assim se possam criar mecanismos de intervenccedilatildeo terapecircutica que

auxiliem na melhoria da qualidade de vida do idoso

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404

16

22 Osso

221 Estrutura e Composiccedilatildeo Oacutessea

O osso eacute um tecido bem organizado baixo peso e que fornece estrutura de

suporte Sua composiccedilatildeo varia dependendo da sua localizaccedilatildeo da idade do

histoacuterico de alimentaccedilatildeo aleacutem de outros aspectos do estilo de vida do indiviacuteduo bem

como pela existecircncia de doenccedilas (36) Categorizamos o osso em quatro

componentes microestruturais ceacutelulas matriz orgacircnica matriz inorgacircnica e fatores

soluacuteveis Em termos de composiccedilatildeo o tecido oacutesseo eacute um tipo especializado de

tecido conjuntivo formado por ceacutelulas e material extracelular calcificado a matriz

oacutessea e que portanto possui parte inorgacircnica e outra parte orgacircnica A resistecircncia

oacutessea depende desta deposiccedilatildeo assim como da arquitetura mineral (3842) A matriz

oacutessea eacute uma substancia do tecido oacutesseo constituiacutedo de componentes orgacircnicos

(35) e inorgacircnicos (65) e eacute encontrado em lacunas onde estatildeo situados os

osteoacutecitos A parte inorgacircnica do osso eacute constituiacuteda principalmente por uma matriz

mineral de caacutelcio e fosfato mas podem tambeacutem ser encontrados iacuteons de potaacutessio

magneacutesio citrato soacutedio e bicarbonato O caacutelcio e o fosfato formam os cristais que

em estudo de difraccedilatildeo de raios-X mostram ter uma estrutura de hidroxiapatita Jaacute a

parte orgacircnica da matriz eacute constituiacuteda por grande quantidade de fibras colaacutegenas de

tipo I (90) e uma pequena quantidade de glicoproteiacutenas e proteoglicanas Dentre

as proteiacutenas natildeo colagenosas estatildeo a osteocalcina osteopontina e a osteonectina

(42) A dureza e a resistecircncia do osso deve-se a associaccedilatildeo das fibras colaacutegenas

tipo I com hidroxiapatita Os ossos funcionam como depoacutesito de caacutelcio fosfato e

outros iacuteons armazenando-os ou liberando-os de maneira controlada por uma

intrincada rede neuro-hormonal para manter constante a concentraccedilatildeo desses

importantes iacuteons nos liacutequidos corporais (42)

Os ossos do esqueleto satildeo em regra constituiacutedos por camada cortical

externa densa que envolve estrutura interna esponjosa com maior aacuterea tambeacutem

denominada osso trabecular (38) Por isso o tecido oacutesseo pode ser entendido em

dois componentes macroestruturais integrados em hierarquias distintas o osso

cortical e o osso esponjoso (37)

17

O osso cortical forma 80 do esqueleto distingue-se pela dureza maior

densidade aleacutem de formar a parte externa de vaacuterios ossos aleacutem do corpo dos ossos

longos Suas unidades constituintes satildeo os oacutesteons e as regiotildees oacutesseas intersticiais

ou sistema haversiano Os oacutesteons possuem formato ciliacutendrico e satildeo compostos de

lamelas ou camadas concecircntricas paralelamente dispostas ao longo do eixo do

osso Os sistemas haversianos estatildeo localizados no centro dos oacutesteons e

acomodam vasos sanguiacuteneos para facilitar o suprimento de nutrientes para ceacutelulas

oacutesseas (osteoacutecitos) O osso cortical possui uma porosidade considerada baixa de 5

a 30 de sua aacuterea sendo riacutegido e suportando um valor razoaacutevel de tensatildeo antes de

fraturar quando submetido agrave pressatildeo (394041)

Jaacute o osso esponjoso compotildee 20 do volume do esqueleto humano

possuindo uma estrutura altamente porosa encontrada nos corpos vertebrais e na

parte final dos ossos longos Formado por numerosas e pequenas trabeacuteculas

interconectadas que tendem a se orientar ao longo da direccedilatildeo da tensatildeo principal

em adaptaccedilatildeo agraves pressotildees ambientais O osso esponjoso possui uma porosidade

considerada alta de 30 a 90 de sua aacuterea sendo capaz de suportar alongamentos

e deformaccedilotildees antes de se fraturar quando submetido agrave tensatildeo De 75 a 95 do

volume do osso esponjoso eacute constituiacutedo por poros interconectados e preenchido

com medula oacutessea (3940)

As principais ceacutelulas que compotildeem o tecido oacutesseo satildeo os osteoacutecitos os

osteoblastos e os osteoclastos Os osteoblastos satildeo as ceacutelulas responsaacuteveis pela

formaccedilatildeo da matriz que seraacute posteriormente mineralizada Entre as substacircncias que

produz podemos citar a fosfatase alcalina osteocalcina (proteiacutena GLA ndash aacutecido

gama-carboxiglutacircmico) grandes quantidades de colaacutegeno do tipo I e uma

variedade de outras proteiacutenas da matriz (4243)

Os osteoacutecitos estatildeo localizados em cavidades ou lacunas no interior da matriz

oacutessea (42) Os osteoclastos satildeo as ceacutelulas precursoras dos osteoacutecitos o

componente celular mais abundante no tecido oacutesseo (44) Podem apresentar-se

como ceacutelulas sinciciais gigantes intensamente ramificadas que estatildeo presentes

principalmente nas partes mais altas das lacunas de reabsorccedilatildeo dos ossos

trabeculares (43) Eles secretam iacuteons de hidrogecircnio colagenases e hidrolases para

dentro da matriz oacutessea digerindo a matriz oacutessea e dissolvendo os cristais de sais de

caacutelcio A atividade desta ceacutelula eacute comandada pela calcitonina e paratormocircnio Aleacutem

18

da reabsorccedilatildeo do tecido oacutesseo haacute uma participaccedilatildeo nos processos de remodelagem

dos ossos (45)

As unidades de remodelamento satildeo independentes e individuais compondo-

se cada qual de osteoblastos e osteoclastos para formaccedilatildeo e reabsorccedilatildeo

respectivamente (43) Mudanccedila contiacutenua acontece em todo osso ao longo de vida

Estas mudanccedilas acontecem em ciclos e satildeo atribuiacuteveis agrave atividade de grupos de

osteoclastos e osteoblastos

A tendecircncia natural do organismo eacute de sofrer uma reduccedilatildeo gradativa da

densidade mineral oacutessea (DMO) que eacute a quantificaccedilatildeo da massa oacutessea expressa

em gcm2 (47) O pico de massa oacutessea eacute atingido por volta dos 35 anos de idade em

homens e mulheres Apoacutes essa idade as mulheres perdem aproximadamente 1

de massa oacutessea por ano e podem perder ateacute 6 por ano durante os primeiros 5

anos apoacutes a menopausa Os homens apenas comeccedilam a perder cerca de 03 da

massa oacutessea por ano por volta dos 50 anos (4348)

Vale lembrar que nos indiviacuteduos apoacutes os 35 anos de idade principalmente no

sexo feminino a formaccedilatildeo oacutessea natildeo consegue repor de forma completa a massa

oacutessea perdida durante a atividade osteoclaacutestica (35) Haacute reduccedilatildeo da massa

esqueleacutetica e os ossos tornam-se progressivamente porosos Esta reduccedilatildeo de

massa oacutessea ao longo do tempo eacute conhecida como perda oacutessea involutiva (49)

19

222 Qualidade Oacutessea

A qualidade oacutessea eacute determinada por sua composiccedilatildeo e estrutura em um

processo contiacutenuo de renovaccedilatildeo por meio do qual o osso velho ou danificado eacute

substituiacutedo por um osso mecanicamente saudaacutevel e a homeostase do caacutelcio eacute

mantida As propriedades estruturais oacutesseas incluem sua geometria (tamanho e

formato dos cristais) microarquitetura (configuraccedilatildeo trabecular e porosidade

cortical) grau de mineralizaccedilatildeo e composiccedilatildeo natildeo mineral da matriz como tambeacutem

histoacuterico de microdanos e seus reparos (505152) Estes componentes satildeo

largamente interdependentes de modo que uma anomalia primaacuteria em um

frequentemente conduz a alteraccedilotildees nas demais dimensotildees (5152)

O recente interesse na qualidade oacutessea surgiu a partir de observaccedilotildees de que

a medida tradicional de resistecircncia oacutessea na praacutetica cliacutenica ou seja a densitometria

oacutessea nem sempre eacute confiaacutevel para prever o risco de fratura (53) A avaliaccedilatildeo in

vivo da qualidade do osso eacute limitada pela escassez de marcadores e de meacutetodos

para estimar remodelaccedilatildeo oacutessea assim como evoluccedilatildeo de alguns aspectos da

geometria e arquitetura oacutessea (5152)

No entanto utilizando-se bioacutepsia oacutessea ou amostras de autoacutepsia um nuacutemero

de abordagens foram desenvolvidas o que tecircm aumentado a compreensatildeo sobre

como a qualidade do osso contribui para a resistecircncia oacutessea em doenccedilas tratadas e

natildeo tratadas (52)

20

2221 RemodelaccedilatildeoRenovaccedilatildeo Oacutessea

A remodelaccedilatildeo oacutessea contribui para a qualidade oacutessea O equiliacutebrio entre a

reabsorccedilatildeo oacutessea e sua formaccedilatildeo consiste no componente chave na preservaccedilatildeo da

qualidade oacutessea e da reparaccedilatildeo de danos na microarquitetura pois manteacutem a DMO

e reduz o risco de fratura (52)

Na reabsorccedilatildeo oacutessea acelerada haacute perda irreversiacutevel de algumas trabeacuteculas

e desta perda resulta um osso mais fraco e um risco aumentado de fratura Como

natildeo eacute possiacutevel avaliar rotineiramente a conectividade das trabeacuteculas em pacientes

com ou sem suspeita cliacutenica de distuacuterbio oacutesseo a remodelaccedilatildeo oacutessea eacute mais

comumente avaliada na praacutetica cliacutenica atraveacutes de marcadores bioquiacutemicos de

remodelaccedilatildeo oacutessea (52)

Como marcadores bioquiacutemicos de reabsorccedilatildeo destacam-se medidas seacutericas

de osteocalcina de fosfatase alcalina oacutessea e de N-proacute-peacuteptiacutedeo do colaacutegeno do

tipo 1 (P1NP) Jaacute os niacuteveis seacutericos dos telo-(C- e N-)peptiacutedeos de colaacutegeno do tipo 1

(CTX NTX) de desoxipiridinolina e da fosfatase do tipo 5b resistente ao tartarto (51)

podem ser considerados marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea Produto de osteoblastos

niacuteveis elevados do CTX geralmente significam remodelaccedilatildeo oacutessea acelerada (52)

Certamente que marcadores baseados em avaliaccedilotildees seacutericas refletem a

remodelaccedilatildeo oacutessea total ou seja em niacutevel global das estruturas oacutesseas do corpo

assim fornecendo uma avaliaccedilatildeo predominantemente representativa da conjuntura

de ossos corticais do organismo por constituir 80-90 do esqueleto humano

Ademais ressalta-se que estas afericcedilotildees vecircm demonstrando consideraacutevel

variabilidade tanto intra- quanto inter-indiviacuteduos o que pode ser atribuiacutedo agrave dieta agraves

variaccedilotildees eacutetnicas assim como agrave interaccedilatildeo com fatores ambientais e de estilo de vida

(51) No entanto a mediccedilatildeo de marcadores de renovaccedilatildeo oacutessea em conjunto com a

afericcedilatildeo da DMO tem sido proposta como o iacutendice substituto mais eficaz para prever

o risco de fratura em comparaccedilatildeo com escores de DMO considerados isoladamente

(54)

Outra teacutecnica utilizada para avaliar remodelaccedilatildeo oacutessea consiste na

histomorfometria oacutessea tendo como marcador a tetraciclina antes da realizaccedilatildeo da

biopsia (5255) A histomorfometria consiste na anaacutelise quantitativa dos paracircmetros

de reabsorccedilatildeo do osso formaccedilatildeo de estrutura e em secccedilotildees histoloacutegicas sendo

21

largamente considerado o padratildeo ouro para a avaliaccedilatildeo da remodelaccedilatildeo oacutessea

Uma vez que eacute o uacutenico meacutetodo disponiacutevel para anaacutelise direta in situ de ceacutelulas do

osso e da sua atividade Esta teacutecnica pode avaliar microarquitetura oacutessea 2D (duas

dimensotildees) permitindo mediccedilotildees tais como a espessura e a conectividade das

trabeacuteculas Aleacutem disso a anaacutelise computadorizada de amostras da bioacutepsia pode

avaliar as caracteriacutesticas da cavidade de reabsorccedilatildeo em termos quantitativos como

meacutedia e maacutexima da profundidade corroiacutedo e aacuterea de erosatildeo No entanto o volume

de osso em bioacutepsias de crista iliacuteaca pode natildeo refletir mudanccedilas em outros locais do

esqueleto Como a natureza deste procedimento eacute invasivo isto pode colocar como

uma desvantagem para o seu uso generalizado (56)

22

2222 Microarquitetura oacutessea

Alteraccedilotildees na microarquitetura oacutessea contribuem de modo importante para a

resistecircncia oacutessea contribuiccedilatildeo que pode nem sempre ser capturada por meio de

mediccedilotildees da densidade mineral oacutessea Tanto a arquitetura cortical quanto a

esponjosa satildeo importantes a esse respeito No osso esponjoso o tamanho e forma

das trabeacuteculas e sua conectividade e orientaccedilatildeo (anisotropia) contribuem para a

resistecircncia oacutessea enquanto no osso cortical sua largura e porosidade satildeo os

principais determinantes Embora algumas destas caracteriacutesticas arquitetocircnicas

pudessem ser avaliadas em secccedilotildees histoloacutegicas de amostras de biopsia do osso

utilizando abordagens em 2D (57) meacutetodos mais sofisticados tecircm sido

desenvolvidos para permitir visualizaccedilatildeo e quantificaccedilatildeo em 3 dimensotildees (3D)

Estes meacutetodos incluem ressonacircncia magneacutetica em imagem de alta resoluccedilatildeo (HR-

MRI) tomografia computadorizada quantitativa de alta resoluccedilatildeo perifeacuterica (HR-

pQCT) tomografia computadorizada em resoluccedilatildeo micromeacutetrica de radiaccedilatildeo

siacutencrotron (μCT) (58) Estes satildeo presentemente ferramentas de pesquisa que in

vivo podem ser aplicadas ao esqueleto perifeacuterico embora avanccedilos tecnoloacutegicos

possam eventualmente estender sua utilizaccedilatildeo para elementos do esqueleto

central (51)

Mudanccedilas na microarquitetura oacutessea em doenccedila tratada e natildeo tratada resulta

de alteraccedilotildees inerentes agrave taxa e velocidade da remodelaccedilatildeo oacutessea Elevada taxa de

remodelaccedilatildeo assim como atividade aumentada dos osteoclastos predispotildeem a dano

sobre a matriz trabecular perda de conectividade entre elementos afinamento e

aumento da porosidade cortical Jaacute baixos niacuteveis de remodelaccedilatildeo e de reduccedilatildeo da

formaccedilatildeo oacutessea estatildeo associados a relativa preservaccedilatildeo da microarquitetura oacutessea

poreacutem a um desgaste trabecular mais intenso (51)

23

2223 Mineralizaccedilatildeo e matriz oacutessea

Relativamente pouco se sabe sobre como matriz oacutessea e composiccedilatildeo mineral

efetivamente contribuem para a resistecircncia oacutessea Mudanccedilas na ligaccedilatildeo cruzada

entre moleacuteculas de colaacutegeno do tipo 1 (59) assim como modificaccedilotildees poacutes-

traducionais como hidroxilaccedilatildeo em lisina glicosilaccedilatildeo e β-isomerizaccedilatildeo dos resiacuteduos

de aspartato em telopeptiacutedeos carboxiterminais podem ter implicaccedilotildees biomecacircnicas

podendo provocar alteraccedilotildees no tamanho e estrutura mineral do osso (6061) Uma

vez que a estrutura de colaacutegeno e a mineralizaccedilatildeo estatildeo tatildeo estreitamente

associadas eacute provaacutevel que quando ocorrem alteraccedilotildees em um ambos satildeo afetados

(62)

Novas abordagens para estudar matriz oacutessea e composiccedilatildeo incluem

espectroscopia de infravermelho com transformada de Raman e Fourier (FTIR)

microscopia eletrocircnica de transmissatildeo (TEM) e a teacutecnica de dispersatildeo de raios-X

em pequeno acircngulo (SAXS) Estas teacutecnicas podem ser aplicadas apenas ex vivo

para as amostras de osso No entanto ensaios para afericcedilatildeo da beta-isomerizaccedilatildeo

de CTX foram recentemente desenvolvidas e esta abordagem em conjunto com o

desenvolvimento de outras medidas bioquiacutemicas de mudanccedilas na composiccedilatildeo do

colageacutenio no soro ou na urina podem representar uma aacuterea importante para a

pesquisa no futuro (51) O grau de mineralizaccedilatildeo e a sua distribuiccedilatildeo ao longo do

osso pode ser medida ex vivo atraveacutes de vaacuterios meacutetodos incluindo microradiografia

imagem de eleacutetrons retroespalhados quantitativa (qBSEI) teacutecnica de dispersatildeo de

raios-X em pequeno acircngulo (SAXS) e teacutecnicas espectroscoacutepicas O grau de

mineralizaccedilatildeo eacute capturado por meio de mediccedilotildees da DMO mas a sua contribuiccedilatildeo

em relaccedilatildeo a outros fatores que influenciam a DMO natildeo pode ser diretamente

deduzida (5152)

Com o aumento da mineralizaccedilatildeo o tecido torna-se mais fraacutegil e requer

menor impacto para fraturar Portanto eacute possiacutevel para um osso que eacute

hipermineralizado seja mais fraacutegil do que um osso com um menor grau de

mineralizaccedilatildeo (51) Este efeito pode explicar parcialmente atraveacutes dos resultados de

Riggs e colaboradores (63) que demonstraram que apesar de um aumento

dramaacutetico na DMO com o tratamento por fluoreto houve aumento significativo no

nuacutemero de pacientes com fraturas natildeo vertebrais no grupo tratado em comparaccedilatildeo

24

com o grupo placebo Inversamente quando a reabsorccedilatildeo oacutessea comeccedila antes da

conclusatildeo de mineralizaccedilatildeo um deacuteficit acumulado na mineralizaccedilatildeo surge levando

a uma resistecircncia oacutessea diminuiacuteda e forccedila (5263)

25

2224 Avaliaccedilatildeo dos microdanos microlesotildees

Microlesotildees no osso consiste de microfissuras e microfraturas A relaccedilatildeo

entre estes se algum eacute desconhecido e apesar de ambas as formas de microdanos

aumentarem com a idade seus efeitos sobre a resistecircncia oacutessea natildeo satildeo claras

(64) Avaliaccedilatildeo de microlesotildees atualmente pode ser feita somente por meio de

teacutecnicas histoloacutegicas (51)

A matriz oacutessea sofre reiteradas cargas ciacuteclicas e o dano resultante da fadiga

na matriz oacutessea eacute expresso atraveacutes de microfissuras ou microlesotildees Microdanos

satildeo geralmente definidos como fissuras lineares detectaacuteveis por microscopia de luz

Embora o meacutetodo ideal para quantificar microdanos no osso esteja em debate

vaacuterios estudos tecircm demonstrado que a acumulaccedilatildeo de danos enfraquece o

osso Aleacutem disso parece que os microdanos desencadeia remodelaccedilatildeo

presumivelmente para reparar o tecido danificado (65) Por outro lado a acumulaccedilatildeo

de danos microscoacutepicos pode resultar de um aumento da mineralizaccedilatildeo secundaacuteria

agrave supressatildeo de remodelaccedilatildeo tornando o osso mais fraacutegil (52)

Haacute um debate em curso sobre o niacutevel ideal de renovaccedilatildeo oacutessea para evitar a

deterioraccedilatildeo arquitetocircnica preservando a capacidade de osso para manter a

homeostase do caacutelcio responder a cargas mecacircnicas alteradas e para reparar

microlesotildees Apesar de a acumulaccedilatildeo de microdanos ter sido proposta como fator

que pode contribuir para o aumento da fragilidade do esqueleto uma relaccedilatildeo entre

microdanos com fraturas relacionadas com a idade ainda precisa ser estabelecida

(66)

Teacutecnicas para detectar microfissuras requerem tecnologias caras e

treinamento A maioria dos dados foi obtida em modelos animais bem como a

aplicabilidade de alguns resultados experimentais para os seres humanos ainda natildeo

estaacute clara Estudando microdanos em humanos especificamente para determinar o

impacto das drogas oacutesseas depende de bioacutepsias oacutesseas da crista iliacuteaca a qual

pode natildeo ser apropriada devido agrave baixa densidade de fissuras numeacuterico neste local

em comparaccedilatildeo com os outros Teacutecnicas natildeo invasivas devem ser desenvolvidas

para melhorar a avaliaccedilatildeo de danos microscoacutepicos in vivo (67)

26

23 Densidade mineral oacutessea

Os agravos relacionados agrave massa oacutessea dos indiviacuteduos incluindo as doenccedilas

crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis constituem prioridade para a sauacutede

puacuteblica em paiacuteses desenvolvidos e naqueles em desenvolvimento tanto nas regiotildees

metropolitanas quanto nos municiacutepios de pequeno porte Atinge todos os gecircneros e

idades apesar de apresentar importacircncia crescente conforme a progressatildeo da

idade figurando como achado frequente entre idosos Em 2000 a Organizaccedilatildeo

Mundial da Sauacutede (OMS) propocircs uma estrateacutegia mundial para prevenccedilatildeo e controle

das doenccedilas crocircnico-degenerativas natildeo transmissiacuteveis dentre elas os distuacuterbios de

massa oacutessea Essa estrateacutegia concentrou-se sobre fatores de risco tradicionais

como tabagismo dietas aterogecircnicas inatividade fiacutesica mas de maneira integrada

considerando a interaccedilatildeo existente entre eles (68)

A densidade mineral oacutessea (DMO ou BMD do inglecircs bone mineral density) eacute

um termo meacutedico que se refere agrave quantidade de mateacuteria mineral por centiacutemetro

quadrado de ossos permitindo uma caracterizaccedilatildeo quantitativa da massa oacutessea

(697071) Sendo uma medida pontual estaacutetica natildeo avalia as alteraccedilotildees dinacircmicas

que determinado tecido oacutesseo sofre em curto periacuteodo de tempo (72) A partir desta

teacutecnica foram estabelecidos padrotildees de normalidade que podem ser distintos para

diferentes grupos populacionais Estudos mostram que indiviacuteduos de ancestralidade

africana sub-saariana apresentam maior DMO quando comparados agraves populaccedilotildees

caucasianas os quais por sua vez apresentam maior DMO que indiviacuteduos de

ancestralidade asiaacutetica (697071) Para aleacutem da etnia muitos outros fatores

influenciam a massa oacutessea exibida pelos indiviacuteduos com destaque para os aspectos

natildeo modificaacuteveis como sexo e hereditariedade e modificaacuteveis como peso corporal

dieta atividade fiacutesica e status hormonal (7374757677)

O advento das teacutecnicas de quantificaccedilatildeo da massa oacutessea tornou possiacutevel

identificar a monitoraccedilatildeo da massa oacutessea de pacientes e com isso estratificar o

risco de desenvolvimento de fraturas e suas complicaccedilotildees O meacutetodo mais utilizado

consiste na densitometria oacutessea com raio-X de dupla energia (dual energy X-ray

absorptiometry - DEXA) que permite a avaliaccedilatildeo direta da massa oacutessea de regiotildees

especiacuteficas a exemplo da coluna lombar regiatildeo proximal do fecircmur e terccedilo distal do

radio regiotildees mais acometidas por distuacuterbios como osteoporose (78)

27

A osteoporose eacute uma doenccedila esqueleacutetica sisteacutemica progressiva caracterizada

por baixa massa oacutessea e deterioraccedilatildeo da microarquitetura do tecido oacutesseo com um

consequente aumento da fragilidade oacutessea e susceptibilidade agraves fraturas (7980)

Fraturas ocorrem como resultado de uma lesatildeo suficiente para provocar rompimento

do osso normal e constitui entidade cliacutenica cujo risco pode ser estratificado em

funccedilatildeo da massa oacutessea alcanccedilada ateacute a maturidade e por eventos no decurso da

vida a exemplo do iniacutecio do periacuteodo poacutes-menopausa e influenciado por outros

fatores de risco Os fatores geneacuteticos exercem uma influecircncia significativa no pico de

massa oacutessea e presumivelmente a perda oacutessea relacionada agrave idade (818283) A

diminuiccedilatildeo da massa oacutessea e uma microarquitetura alterada satildeo causadas por uma

perturbaccedilatildeo em que a remodelaccedilatildeo de reabsorccedilatildeo oacutessea excede a formaccedilatildeo oacutessea

(84)

Anteriormente havia ecircnfase no conteuacutedo mineral e massa oacutessea (aferidos por

DEXA) para estratificaccedilatildeo do risco de fraturas conforme o escore atingido pelo

sujeito em anaacutelise A despeito de a abordagem centrada nos achados por DEXA

ainda ser prevalente na praacutetica cliacutenica a compreensatildeo moderna de osteoporose

atribui maior importacircncia agrave qualidade oacutessea e agrave arquitetura do osso entre outras

propriedades intriacutensecas do osso representadas pelo teor de colaacutegeno e

mineralizaccedilatildeo aleacutem de sua micro e macro arquitetura representadas pela

porosidade do osso cortical e da espessura e da conectividade das trabeacuteculas

(8586) Outros fatores mecacircnicos podem tambeacutem desempenhar um papel na

tendecircncia de um osso longo de fratura (87) No entanto a DMO aferida por DEXA

prossegue ateacute o momento como ferramenta mais acessiacutevel na cliacutenica para se

estimar a resistecircncia oacutessea (88)

28

231 Densitometria oacutessea (DEXA)

A densitometria oacutessea (DEXA) em si consiste em um meacutetodo natildeo invasivo

para se avaliar a massa oacutessea que se baseia na propriedade fiacutesica do osso de

absorver foacutetons Permite analisar os pacientes e detectar sujeitos com alto risco de

doenccedila metaboacutelica oacutessea de estimar a gravidade cliacutenica da perda de matriz mineral

oacutessea e assim verificar o risco de fraturas e de acompanhar a evoluccedilatildeo dos

tratamentos (89)

O meacutetodo DEXA utiliza radiaccedilatildeo ionizante onde uma fonte de radionucliacutedeos

ou um tubo de raios-X satildeo usados para gerar um feixe de radiaccedilatildeo que eacute absorvido

parcialmente pelo tecido oacutesseo O meacutetodo baseia-se na atenuaccedilatildeo ou absorccedilatildeo da

energia emitida por uma fonte de raio-X pelo tecido oacutesseo na regiatildeo estudada Satildeo

utilizados dois feixes de raios-X e o feixe de menor energia penetra nos tecidos

moles enquanto que o feixe de maior energia penetra tanto no tecido oacutesseo quanto

nos tecidos moles circundantes Um detector mede os raios que atravessam a

regiatildeo estudada e um programa computacional segmenta a aacuterea para quantificar e

subtrair os valores obtidos com os dois feixes de energia Um sistema detector avalia

a quantidade de radiaccedilatildeo absorvida e os dados coletados satildeo computadorizados e

comparados a padrotildees internacionais (ou grupo especiacuteficos) obtidos de uma

populaccedilatildeo com densidade mineral oacutessea (DMO) normal (90) O conteuacutedo mineral

oacutesseo (CMO) eacute a quantidade de todos os minerais presentes na extensatildeo do osso

avaliada Por convenccedilatildeo usa-se o grama (g) como unidade para o CMO aferido pelo

DEXA (91)

A densidade de um material eacute medida pela relaccedilatildeo entre sua massa e seu

volume e sua unidade de medida eacute o grama por centiacutemetro cuacutebico (gcm3) No

entanto a DMO mensurada pelo DEXA consiste na relaccedilatildeo entre a quantidade de

todos os minerais oacutesseos (hidroxiapatita) presente em uma aacuterea projetada ou seja

constitui avaliaccedilatildeo bidimensional de uma variaacutevel tridimensional empregando grama

por centiacutemetro quadrado (gcm2) como unidade de medida (919293)

Segundo a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) o diagnoacutestico de

osteoporose eacute a mesurada por meio da medida de pico da DMO de um individuo

comparando-o com o valor meacutedio de um conjunto de indiviacuteduos jovens do mesmo

sexo Sendo assim obteacutem-se o T-score que constitui a representaccedilatildeo do numero

29

de desvios-padratildeo em que se posiciona a DMO do indiviacuteduo na curva de distribuiccedilatildeo

dos valores do grupo controle jovem (9495) O sujeito com seu T-score entre -1 e -

25 desvios-padratildeo eacute considerado osteopecircnico enquanto um valor de T-score

inferior a -25 corresponde a osteoporose Apesar de natildeo constituir fator preditivo

absoluto para eventos de fratura oacutessea consensos da literatura meacutedico-cientiacutefica

datildeo conta de que reduccedilatildeo de massa oacutessea aferidas por este meacutetodo correlacionam-

se diretamente com o risco de fratura sendo que para cada diminuiccedilatildeo da DMO em

1 desvio-padratildeo duplica-se o risco de fratura (95)

30

24 Osteopontina

241 Funccedilatildeo (OPN)

A osteopontina (OPN) consiste em uma fosfoproteiacutena O-glicosilada

sintetizada por uma variedade de tecidos e ceacutelulas e secretada para os fluidos

corporais Foi inicialmente identificada como uma proteiacutena de matriz oacutessea e

posteriormente identificada como fator humoral produzido por ceacutelulas T ativadas e

linhagens de ceacutelulas transformadas (969798) Conjuntamente com a osteocalcina

OPN eacute referida na literatura como marcador claacutessico para diferenciaccedilatildeo de

osteoblastos e podem ser encontrados diversos estudos que utilizam estes

marcadores entre outros como meio para confirmar a ocorrecircncia do processo de

osteogecircnese (99100)

Eacute sugerido que siacutetios da osteopontina interagem com a osteocalcina e esta

por fim expotildee domiacutenios da osteopontina que suportam a nucleaccedilatildeo e crescimento

de hidroxiapatita (101) A biossiacutentese de osteopontina parece estimulada pelo

calcitriol conhecido precursor exoacutegeno da vitamina D (102103) Dentre os

receptores conhecidos para OPN destacam-se certas integrinas (104105106) e

variantes de CD44 (107108109) Eacute considerada como uma proteiacutena de matriz por

conter motivo RGD (Arg-Gly-Asp) que eacute o local de ligaccedilatildeo de integrinas portanto

com propriedade adesiva para diferentes tipos celulares da matriz oacutessea Estes

receptores medeiam agrave adesatildeo celular migraccedilatildeo e sobrevivecircncia em uma variedade

de tipos de ceacutelulas (110)

O potencial da OPN de interagir com receptores de superfiacutecie celular

expressos de forma ubiacutequa a torna um mediador atuante em muitos processos

fisioloacutegicos e inclusive patoloacutegicos incluindo cicatrizaccedilatildeo de feridas remodelaccedilatildeo

oacutessea tumorigecircnese inflamaccedilatildeo isquemia e respostas imunitaacuterias O niacutevel de

expressatildeo do receptor desta proteiacutena aumenta em resposta a vitamina D e a niacuteveis

elevados de fosfato Beck e colaboradores por exemplo sugerem que a expressatildeo

da osteopontina eacute regulada fortemente em resposta aos niacuteveis elevados de fosfato

extracelular e vaacuterios outros fatores como aacutecido ascoacuterbico TGF-β (Transforming

growth factor beta) aacutecido retinoacuteico endotelinas BMPs (Bone morphogenetic

31

proteins - Proteiacutenas morfogeneacuteticas oacutesseas) e vitamina D estimulam a expressatildeo

dos transcritos primaacuterios de OPN (111)

No sistema imunitaacuterio OPN eacute expressa por muitos tipos diferentes de ceacutelulas

incluindo macroacutefagos neutroacutefilos ceacutelulas dendriacuteticas ceacutelulas NK (Natural killer) e

linfoacutecitos T e B sendo super-expressa em resposta agrave lesatildeo e inflamaccedilatildeo em todos

os oacutergatildeos examinados a exemplo do tecido cardiacuteaco rins pulmatildeo osso ceacuterebro

trato gastrointestinal articulaccedilotildees fiacutegado tecido adiposo (112) e na maioria dos

tumores (109) OPN tem sido identificada como um biomarcador para vaacuterios tipos de

cacircncer e de doenccedilas inflamatoacuterias (113114) A expressatildeo excessiva ou desregulada

de OPN tem sido relacionada com a patogeacutenese de diferentes doenccedilas auto-imunes

tais como esclerose muacuteltipla (115) luacutepus eritematoso sisteacutemico (116) artrite

reumatoide (117) aterosclerose (118) e de outras doenccedilas inflamatoacuterias incluindo

doenccedilas cardiovasculares (119) doenccedila pulmonar obstrutiva croacutenica (120) doenccedila

inflamatoacuteria intestinal (121) a doenccedila de fiacutegado (122) e asma (123) Provas

consideraacuteveis estabeleceram que OPN eacute tambeacutem uma citocina soluacutevel mediador

capaz de estimular vias de transduccedilatildeo de sinal em muitos tipos de ceacutelulas

diferentes Recentemente a OPN tem surgido como um mediador chave de tensatildeo

por exemplo modulando a resposta dos oacutergatildeos do sistema imunoloacutegico (baccedilo timo)

a algumas formas de stress (110)

32

241 Estrutura

Os motivos funcionais da moleacutecula de OPN podem fornecer pistas para

grandes funccedilotildees bioloacutegicas da OPN Ela eacute uma proteiacutena altamente carregada

negativamente que natildeo tem estrutura secundaacuteria extensa (97110) Ele eacute codificada

por um uacutenico gene localizado no cromossomo 4 em seres humanos pertence ao

grupo de proteiacutenas da famiacutelia das integrinas proteiacutenas N-glicosiladas de ligaccedilatildeo

(124125126) sendo descrita inicialmente por Senger et al em 1979 por anaacutelise de

proteiacutenas secretadas por ceacutelulas epiteliais transformadas (127) O seu promotor eacute

sensiacutevel a um nuacutemero de fatores de transcriccedilatildeo diferentes (106128) O comprimento

completo da OPN eacute composto de cerca de 300 aminoaacutecidos (297 em ratos 314 em

humanos) mas que tambeacutem pode apresentar produtos de clivagem ou de splicing

diferencial que sejam biologicamente funcionais (113129130131) Embora

expressa como uma proteiacutena nativa de aproximadamente 33 kDa extensas

modificaccedilotildees poacutes-traducionais aumentam sua massa molecular aparente para cerca

de 44 kDa (97113) havendo isoformas com migraccedilatildeo eletroforeacutetica na faixa de 50-

75 kDa (97) Ambos os motivos de sequecircncias altamente conservadas e

modificaccedilotildees poacutes-traducionais contribuir para diferentes atividades funcionais de

OPN (132133) Esta amplitude de isoformas em que OPN pode ser encontrada

pode justificar em parte a plecirciade de atividades bioloacutegicas relatadas para a proteiacutena

No entanto relatos de inativaccedilatildeo funcional da proteiacutena OPN em modelos animais

descreve atraso da cicatrizaccedilatildeo de feridas (134) e reduccedilatildeo da infiltraccedilatildeo por

macroacutefagos assim como proteccedilatildeo contra a perda do conteuacutedo mineral em ossos de

roedoras oofrectomizadas (137)

33

3 ndash JUSTIFICATIVA

Haacute embasamento teoacuterico que subsidie uma associaccedilatildeo entre massa oacutessea e

genoacutetipos assim como niacuteveis seacutericos da osteopontina em seres humanos Com base

nesse pressuposto niacuteveis de OPN podem ser um marcador promissor para o

diagnoacutestico precoce de desordens oacutesseas

34

4 ndash OBJETIVOS

O objetivo desse trabalho consistiu em investigar a associaccedilatildeo de niacuteveis e de

genoacutetipos de osteopontina (OPN) com a densidade mineral oacutessea (DMO)

encontrada em indiviacuteduos brasileiros muito idosos

35

5 ndash MANUSCRITO

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Artigo submetido ao perioacutedico Journal of Bone and Mineral Metabolism

36

Comprovante de Recebimento pelo perioacutedico

Journal of Bone and Mineral Metabolism

37

Osteopontin in bone mineral density of very-old Brazilians

Viniacutecius C Souza12 Wladimir M Freitas13 Luiz A Quaglia4 Simone N Santos1

Claacuteudio Coacuterdova2 Andrei C Sposito14 and Otaacutevio T Noacutebrega1

1 University of Brasilia (UnB) Brasiacutelia DF Brazil

2 Catholic University of Brasiacutelia (UCB-DF) Brasilia DF Brazil

3 Instituto de Cardiologia Biocardios Brasiacutelia DF Brazil

4 State University of Campinas (UNICAMP) Campinas SP Brazil

Short title ldquoosteopontin and bone density in the very-oldrdquo

Sources of funding Research supported by the CNPq with grant 4718722011-3 and with a

fellowship for productivity in research to AC Sposito VC Sousa received a student fellowship from

CAPES Brazil

Corresponding author and address for correspondence

Otaacutevio T Noacutebrega

Address Campus Universitaacuterio Darcy Ribeiro

Asa Norte Brasiacutelia ndash DF 70910-900 Brazil

Phone (+55 61) 3107 1916

E-mail nobregapqcnpqbr otavionobregaunbbr

38

Abstract

Recent evidences suggest that changes in plasma levels of osteopontin (OPN) may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders We hypothesized that a frequent OPN gene

polymorphism may be useful for identifying very-old individuals with alterations in plasma OPN levels

and consequently at risk to abnormal bone density scores Men and women (80 years or older) living

in the Brazilian Federal District underwent assessments with dual energy X-ray absorptiometry for

bone mineral density (BMD) of the femoral neck femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions

Clinical inspection was performed to assess other physical traits and to exclude co-morbidities

(cardiovascular autoimmunity infections or neoplastic diseases) Serum concentrations of OPN were

determined with an enzyme-linked immunosorbent assay whereas the A7385G polymorphism

(rs1126772) was determined by direct sequencing of a polymerase chain reaction product Among

the two hundred and ten subjects enrolled no differential scores for bone mineral density could be

observed across genotypes but a greater content of circulating OPN was found among carriers of the

A allele (P le 005) even after adjustments Serum OPN levels were negatively correlated with the

femoral neck density (P = 0050 for BMD P = 0032 for T-scores) but not with scores of the other

regions investigated Analyses with the sample dichotomized to age and body mass revealed that this

inverse relationship was noticeable only among those aged within the highest and weighed within

the lowest intervals Our findings indicate elevated circulating osteopontin levels in patients with

decreased bone mineral density consistent with a modest contribution of an OPN allelic variation to

its expression Attesting clinical relevance of our findings demands forthcoming studies

Key-words osteoporosis bone remodeling polymorphism biomarker ageing

39

Introduction

Osteoporosis is a systemic skeletal disorder and is characterized by progressive bone

deterioration that is devoid of apparent clinical symptoms and often only brought to attention after a

fracture Loss of bone mineral density (BMD) among the very-old population is significantly increased

not only due to settled menoandropausal hormonal-related changes but also due to increased loss

of functional independency along with other age-related diseases which causes long-term unloading

on the skeletal system [12] But fracture risk should not be interpreted as an outcome that derives

from trauma events and demineralization levels alone since bone toughness turns out to depend on

the mineralization quality and on the content of organic constituents of the bone matrix

Biomarkers are sought worldwide to predict occurrence of loss of bone quality Consistent

with the notion that variations in components of the matrix play a major role in bone integrity

osteopontin (OPN) has been associated with the regulation of bone strength in many animal studies

[3-5] OPN is an acidic phosphoprotein secreted by immune cells osteoblasts and osteoclasts found

to be important for bone remodeling and maintenance of bone strength [67] Noncollagenous

proteins as OPN comprise a relatively small percentage of the bonersquos volume or weight but may

contribute to the matrix quality in a number of ways basically due to its binding properties to

calcium ions [8] calcium oxalate crystal [9] and hydroxyapatite crystal [10] either guiding mineral

deposition and influencing crystal shape and size OPN deficient mice for instance have bones that

are irregularly hypermineralized and more fragile than those from wild-type counterparts

Despite all above the association of OPN genotypes and serum concentrations with

osteoporosis in humans is still unclear Based on the assumption that OPN levels may be a promising

marker for early diagnosis of bone disorders we hypothesized that a polymorphism in its gene might

account to differential serum levels of the mediator and thus to the bone density statuses in the

Healthy Ageing Cohort of very-old adults of the Brazilian Federal District Brazil Because factors such

40

as age body composition and common co-morbidities affect circulating levels of OPN our report

poses a contribution by taking these variables into account

Material and Methods

Subjects

Brasiacutelia (national capital) is located in the Midwest of Brazil The present cross-sectional

analyses were performed using data obtained from apparently healthy outpatients aged 80 years or

older and living in the urban Federal District These subjects are participants in the ongoing Brazilian

Study on Healthy Aging a prospective study designed to identify markers for primary prevention of

cardiovascular events in our settings and that recruits outpatients who have never manifested

myocardial infarction stroke or peripheral arterial disease [11] For this report a subset that has

never manifested bone fractures or recurrent falls was enrolled Additional selection criteria were

the absence of autoimmune disease (including rheumatic disorders) chronic or recurrent infections

prior or current neoplastic disease or use of steroidal or nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the

past 30 days Current use of BMD-related drugs was investigated for each patient The present

report presents analyses of admission data of subjects who fulfilled inclusion criteria

At baseline individuals underwent a detailed clinical examination including assessment of

anthropometric data After 12 h of overnight fasting the study participants underwent blood

drawing for biochemical analysis and freezing at -80 ordmC of serum and whole blood samples To

determine body mass index [BMI weight (kg)height (msup2)] patients were weighed wearing light

clothing and their height was measured without shoes to the nearest millimeter Waist

circumference (WC cm) was measured midway between the iliac crest and the lower costal margin

41

Type-2 diabetes was characterized by fasting blood glucose 126 mgdl or use of insulin or oral anti-

diabetic drugs Hypertensive cases were defined following to the V Brazilian Guidelines of

Hypertension [12]

This study was approved by the institutional ethics committee and conducted attending the

Helsinki Declaration Participation was voluntary and written informed consent was obtained from

each participant

Dual Energy X-Ray Absorptiometry Measurements

Participants underwent bone mineral density (BMD) assessments of the femoral neck

femoral head and lumbarsacral (L1 to S5) regions with dual energy X-ray absorptiometry (DXA (Lunar

Prodigy Advance GE Healthcare USA) according to standard protocol to measure BMD (gcm2) The

difference between an individualrsquos BMD and the mean BMD for a reference population was

expressed in standard deviation term (T-score)

OPN analysis

Serum OPN concentration was determined using the enzyme-link immunosorbent assay

(ELISA) method with the Human Osteopontin Quantikinereg Immunoassay Kits (RampD Systems USA)

according to manufacturer instructions This kit measures total concentration of OPN

(phosphorylated and nonphosphorylated forms) Samples were analyzed in duplicate and the

experimental threshold of detection was set at 001 ngml

The A7385G polymorphic site in the human OPN gene (also known as +1083AG or

rs1126772) was selected based on evidence that variations in its 3rsquo UTR have more influence on the

genersquos expression and on the sOPN levels of healthy individuals than variation in its exons or

42

promoter region [1314] Genotypes were determined by direct sequencing of a polymerase chain

reaction (PCR) product A 506-bp region was amplified using a pair of specific primers 5-

TGCATCTTCTGAGGTCAATTAAA -3 (sense) and 5- CTGGACAACCGTGGGAAAAC -3 (antisense) which

flank the polymorphism The reaction tubes contained 100 ng DNA 10 mM Tris-HCl pH 92 75 mM

KCl 35 mM MgCl2 02 mM dNTP 20 pmol of each primer 05 microg of purified chicken albumin and 1

unit of Taq DNA polymerase (Phoneutriareg Brazil) in a final volume of 25 microL After 1 min of hot start at

80ordmC and an initial denaturation for 2 min at 94ordmC the amplifications were carried out for 36 cycles

of 30 s at 94ordmC 30 s at 62ordmC and 40 s at 72ordmC followed by a final 5-min extension at 72ordmC Each PCR

product was directly sequenced on an ABI PRISM 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems Foster

City CA USA) using alternately the sense and antisense primers Each sequence obtained was

examined using the Staden software package (MRC Cambridge UK) and confirmed by visual

inspection

Statistical analysis

Violation of the Hardy-Weinberg equilibrium was tested using Fisherrsquos exact test The

Kolmogorov-Smirnov test was used to verify normal distribution of continuous data Because of the

intercorrelated nature between dependent variables multivariate analysis of variance (MANOVA)

was used to compare means of anthropometricclinicalserum variables (age BMI WC blood

pressure bone density and serum OPN) across genotypic groups Otherwise the Student t-test was

applied For the non-parametric purpose of evaluating gender distribution as well as cases of

hypertension type-2 diabetes and bone-active drug use between genotypes the chi-square test was

employed

Association of sOPN concentrations with the absolute (BMD) and relative (T-scores) levels of

bone mineral density were evaluated by Pearsonrsquos correlation coefficient A similar association was

assessed with other continuous anthropometricclinical variables to obtain regression coefficient for

43

sOPN and potential confounding factors among all subjects Whenever an interaction was noticed

partial correlation analyses were run to test adjustments Then all subjects were segregated

according to the median value of the confounding variable in the sample and the correlation

between OPN and BMD variables was reassessed on the lower and on the higher intervals Finally

linear multivariate regression analysis stepwise method was performed to assess to which extent

genotypes explain sOPN concentrations and how this latter may explain BMD variability All analyses

were performed with the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) for Windows (version

100) A P value le 005 (two-tailed) was considered significant

Results

After applying the exclusion criteria 210 very-old subjects were eligible for analysis The

prevalence of the A and G alleles of the rs1126772 polymorphism was 788 and 212 respectively

Genotype frequencies did not deviate from the Hardy-Weinberg equilibrium (P = 014) The clinical

and laboratory characteristics of the subjects analyzed are summarized in Table 1 In a co-dominant

model no significant differences in mean age anthropometric and blood pressure levels or in the

distribution of gender and of hypertensive and diabetic cases were observed between carriers of the

three genotypes Most notably no differential scores for bone mineral density in the lumbosacral

and femoral regions could be observed across genotypes regardless of the 160 fold greater content

of sOPN (P = 0050) found assuming a dominant model of analysis (A carriers versus G homozigotes)

or the 127 fold increase in sOPN (P = 0021) found using the contrasting recessive model (A

homozigotes versus G carriers)

To assess homogeneity across gender clinical (age SBP DBP hypertension type 2

diabetes use of BMD-related drugs) anthropometric (BMI WC) and laboratory (sOPN) data

44

considered at admission were explored and found to be identical (not shown) As expected mineral

density scores were significantly reduced for women compared to the male counterparts at all

osseous sites investigated (P le 0001) But our results tend not to be biased due to admitting both

gender in the sample since the malefemale ratio did not vary across OPN (sup2 = 2704 P = 0440)

BMI (sup2 = 1816 P = 0661) or age (sup2 = 3847 P = 0279) quartiles Also during clinical assessments

117 (56) of the very-old subjects were found to be users of anti-reabsortive drugs Nonetheless we

do not believe that our finding reflect pharmaceutically-influenced results since the chi-square test

failed to reveal quantitative variances in the distribution of users and non-users of these drugs across

the three genotypes (P gt 005) Moreover because of the possible association of OPN expression

with the hyperglycaemic or hypertensive states or with variables such as age sex and adiposity

differences between genotypes were investigated adjusting to these confounding factors In brief

the contribution of the A allele to more pronounced sOPN concentrations resisted all adjustments

whilst no other difference in quantitative traits became significant after correction (not shown)

Serum osteopontin concentrations were negatively correlated with the femoral neck mineral

density expressed as gcm2 and T-score (Table 2) but not with BMD of the other regions

investigated suggesting that sOPN acts as biomarker for bone disorder at this site Moreover our

results show that sOPN concentrations have significant positive correlation with age and negative

correlation with body mass in the group Adjustments for age and BMI resulted in non-significant

association of sOPN levels with either the absolute (r = -0076 P = 0275) or the relative (r = -0087 P

= 0213) femoral neck density along with the other densities assessed Using statistical models

(described in Methods) in which age and BMI were used to dichotomize subjects according to their

corresponding median value in the sample (lt or ge 84 years for the former and lt or ge 26 kgm2 for

the latter variable) we uncovered an important interaction in the relationship between sOPN and

the femoral neck density a context-sensitive relationship between enhanced osteopontin

concentrations and reduced BMD that is noticeable only among those aged within the highest and

weighed within the lowest intervals (Table 3) In multivariate regression analysis sOPN

45

concentrations were significant predictors for T-scores of the femoral neck only (P = 0032) although

the variance was small (R = 0148)

Discussion

The bone microarchitecture is a dynamic structure constantly changing in response to

morphogenetic metabolic mechanical inflammatory and endocrine demands With age enhanced

matrix remodeling reduces its overall strength and predisposes to fractures which are important

predictors of morbidity and mortality among very-old individuals As sophisticated as current working

models are relatively little is known regarding the effect of common allelic variationslevels of key

bone constituents in determining the structure and resistance of the bone In part this void may

result from the complex interplay between these mediators and the individualsrsquo clinical milieu For

instance OPN was shown as a glucose-inducible mediator upregulated in the context of metabolic

syndrome (diabetes and hypertension) via the bipartite upstream stimulatory factoractivator

proteinndash1 element pathway [1516] Also the intercorrelated nature of OPN concentration with age

and body mass as observed herein and elsewhere [17] are the most common confounding factors in

human models and previous reports that ignored the clinical environment of the sample (especially

classic cardiovascular risk factors [1819]) should be interpreted with caution Therefore the

potential of sOPN to predict fracture remains open to debate Our work tends to pose a contribution

by ruling out symptomatic individuals for cardiovascular disorders minimizing the influence of major

vascularmetabolic unbalances in our analyses

In our investigation we start showing that an association between the common A7385G

polymorphism of the human OPN gene and circulating concentrations of its product was detectable

among the very-old adults investigated Stepwise multivariate regression showed that the OPN

polymorphism was the first most predictive variable in the model which along with age and body

46

mass accounted for 25 of the variance in the markerrsquos humoral content Nonetheless no direct

genotype-phenotype association was established between the polymorphism itself and actual bone

density scores probably due to sOPN concentrations being a poor predictor of the bone

mineralization status among the very-old subjects investigated coupled with the limited non-

probabilistic character of the sample For similar reasons sOPN levels were associated to bone

mineral density only in a site-restricted manner basically attaining to the femoral neck

Our findings are in accordance with previous reports indicating elevated circulating

osteopontin levels in ageing patients with decreased bone mineral density [1720] In line analysis in

old age resembling ovariectomized mice indicate greater porosity and trabecular bone loss in the

epiphyseal portion of the long bones of OPN-bearing wild-type animals compared to OPN-deficient

littermates [21] Because OPN-deficient mice do not show any structural alterations in their bones at

birth or growth period OPN does not appear to be required for normal development [22] On the

other hand our data and the results revised above suggest that the effect of OPN presence seems to

become apparent in circumstances of accelerated bone turnover But given the cross-sectional

design of our study and the comprehension that abnormal hyperminerelizaton is a phenotype that

may as well derive from OPN deficiency assuming whether higher or lower levels of the cytokine

predispose to fractures is beyond the scope of our report The complexity of this scenario may be

illustrated by our understanding that organisms may adapt to ageing using OPN overexpression to

compensate for low osteoblastic activity by assuming a more efficient pattern of matrix construction

in an attempt to produce better quality bones even with relatively lower BMD Accordingly it does

not surprise that the significant associations only resisted adjustment among the frailest subjects (ge

84 years or BMI lt 26) where BMD scores are naturally lower and more of this adapting mechanism

would be required Nonetheless despite BMD is the most common diagnostic used to assess fracture

risk it is important to have in mind that less than half of nonvertebral fractures can be explained by

BMD alone (13) Therefore direct assessments of bone toughness in animal models along with

clinical follow-ups aiming at fracture incidence in humans across carriers of distinct basal

47

concentrations of the mediator or genotypic architecture would help elucidating causal relationships

between OPN and bone disorders

Despite the standardization of subjects in terms of age body composition and cardiovascular

statuses the present study has limitations mostly related to confounding factors inherent to the

Brazilian scenario but not investigated herein such as the remarkable interethnic variation owing to

genetic mix [23] the escalating prevalence of metabolic disorders among the aged [2425] levels of

functional independency and the diversity of food consumption habits throughout the country

In conclusion we found an association between of the common A7385G transition in the

OPN gene with serum levels of the mediator in very-old humans consistent with increased systemic

OPN expression by the A allele Also OPN levels were inversely correlated and in a clinical-sensitive

matter with absolute and relative BMD scores of the femoral neck but not with other bone regions

investigated This indicates that in the aged human model expression of the OPN mediator explains

at least in part the complex phenotype of bone structure and resistance However attesting clinical

relevance of the findings presented herein and abroad still depends on forthcoming studies

Acknowledgments None

Conflict of interest None

Author contributions

VC Sousa genotyped all subjects conducted the immunoassay analyzed and interpreted data used

in the study

LA Quaglia SN Santos executed the radiological component of the study

WM Freitas supervised and executed the medical component of the study

48

C Coacuterdova advised on the analysis and interpretation of results

AC Sposito OT Noacutebrega designed and coordinated the study analyzed and interpreted the results

VC Souza WM Freitas AC Sposito and OT Noacutebrega participated in the preparation of the original

manuscript as well as of its revised version

REFERENCES

1 Ahlborg HG Johnell O Turner CH Rannevik G Karlsson MK (2003) Bone loss and bone size after menopause N Engl J Med 349327-334

2 Karlsson MK Gerdhem P Ahlborg HG (2005) The prevention of osteoporotic fractures J Bone Joint Surg Br 871320-1327

3 Thurner PJ Chen CG Ionova-Martin S Sun L Harman A Porter A Ager JW 3rd Ritchie RO Alliston T (2010) Osteopontin deficiency increases bone fragility but preserves bone mass Bone 461564-1573

4 McCann RM Colleary G Geddis C Clarke SA Jordan GR Dickson GR Marsh D (2008) Effect of osteoporosis on bone mineral density and fracture repair in a rat femoral fracture model J Orthop Res 26384-393

5 Malaval L Wade-Gueye NM Boudiffa M Fei J Zirngibl R Chen F Laroche N Roux JP Burt-Pichat B Duboeuf F Boivin G Jurdic P Lafage-Proust MH Amedee J Vico L Rossant J Aubin JE (2008) Bone sialoprotein plays a functional role in bone formation and osteoclastogenesis J Exp Med 2051145-1153

6 Rittling SR Denhardt DT (1999) Osteopontin function in pathology Lessons from osteopontin-deficient mice Exp Nephrol 7103-113

7 Scatena M Liaw L Giachelli CM (2007) Osteopontin A multifunctional molecule regulating chronic inflammation and vascular disease Arterioscler Thromb Vasc Biol 272302-2309

8 Chen Y Bal BS Gorski JP (1992) Calcium and collagen binding properties of osteopontin bone sialoprotein and bone acidic glycoprotein-75 from bone J Biol Chem 26724871-24878

9 Hoyer JR Otvos L Jr Urge L (1995) Osteopontin in urinary stone formation Ann N Y Acad Sci 760257-265

10 MacNeil RL Berry J DErrico J Strayhorn C Piotrowski B Somerman MJ (1995) Role of two mineral-associated adhesion molecules osteopontin and bone sialoprotein during cementogenesis Connect Tissue Res 331-7

49

11 Freitas WM Quaglia LA Santos SN Soares AA Japiassu AV Boaventura V Dos Santos Barros E Cordova C Nobrega OT Sposito AC (2011) Association of systemic inflammatory activity with coronary and carotid atherosclerosis in the very elderly Atherosclerosis 216212-216

12 [V Brazilian Guidelines in Arterial Hypertension] (2007) Arq Bras Cardiol 89e24-79

13 DAlfonso S Barizzone N Giordano M Chiocchetti A Magnani C Castelli L Indelicato M Giacopelli F Marchini M Scorza R Danieli MG Cappelli M Migliaresi S Bigliardo B Sabbadini MG Baldissera E Galeazzi M Sebastiani GD Minisola G Ravazzolo R Dianzani U Momigliano-Richiardi P (2005) Two single-nucleotide polymorphisms in the 5 and 3 ends of the osteopontin gene contribute to susceptibility to systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum 52539-547

14 Han S Guthridge JM Harley IT Sestak AL Kim-Howard X Kaufman KM Namjou B Deshmukh H Bruner G Espinoza LR Gilkeson GS Harley JB James JA Nath SK (2008) Osteopontin and systemic lupus erythematosus association A probable gene-gender interaction PLoS One 3e0001757

15 Shao JS Sierra OL Cohen R Mecham RP Kovacs A Wang J Distelhorst K Behrmann A Halstead LR Towler DA Vascular calcification and aortic fibrosis (2011) A bifunctional role for osteopontin in diabetic arteriosclerosis Arterioscler Thromb Vasc Biol 311821-1833

16 Bidder M Shao JS Charlton-Kachigian N Loewy AP Semenkovich CF Towler DA (2002) Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities J Biol Chem 27744485-44496

17 Chang IC Chiang TI Yeh KT Lee H Cheng YW (2010) Increased serum osteopontin is a risk factor for osteoporosis in menopausal women Osteoporos Int 211401-1409

18 Golledge J Muller J Shephard N Clancy P Smallwood L Moran C Dear AE Palmer LJ Norman PE (2007) Association between osteopontin and human abdominal aortic aneurysm Arterioscler Thromb Vasc Biol 27655-660

19 Aryan M Kepez A Atalar E Hazirolan T Haznedaroglu I Akata D Ozer N Aksoyek S Ovunc K Ozmen F (2009) Association of plasma osteopontin levels with coronary calcification evaluated by tomographic coronary calcium scoring J Bone Miner Metab 27591-597

20 Chiang TI Chang IC Lee HS Lee H Huang CH Cheng YW (2011) Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment Osteoporos Int 22577-585

21 Yoshitake H Rittling SR Denhardt DT Noda M (1999) Osteopontin-deficient mice are resistant to ovariectomy-induced bone resorption Proc Natl Acad Sci USA 968156-8160

22 Rittling SR Matsumoto HN McKee MD Nanci A An XR Novick KE Kowalski AJ Noda M Denhardt DT (1998) Mice lacking osteopontin show normal development and bone structure but display altered osteoclast formation in vitro J Bone Miner Res 131101-1111 23 Pimenta JR Zuccherato LW Debes AA Maselli L Soares RP Moura-Neto RS Rocha J Bydlowski SP Pena SD (2006) Color and genomic ancestry in brazilians A study with forensic microsatellites Hum Here 62190-195

24 Nobrega OT Faleiros VP Telles JL (2009) Gerontology in the developing Brazil Achievements and challenges in public policies Geriatr Gerontol Int 9135-139

50

25 Karnikowski M Cordova C Oliveira RJ Karnikowski MG Nobrega OT (2007) Non-alcoholic

fatty liver disease and metabolic syndrome in brazilian middle-aged and older adults Sao Paulo Med

J 125333-337

51

Table 1 Characteristics of the 210 very-old subjects according to genotypes of the rs1126772

polymorphism of the osteopontin gene

AA

(n = 134)

AG

(n = 63)

GG

(n = 13)

P (AA vs

AG vs

GG)

Age (years-old) 846 44 842 35 844 52 0799

Male () 828 698 923 0054sect

BMI (kgm2) 262 44 268 52 255 40 0541

Waist circumference (cm) 942 112 950 135 901 119 0402

Systolic blood pressure (mm Hg) 1441 192 1471 228 1474 213 0580

Diastolic blood pressure (mm Hg) 760 106 735 104 735 109 0285

Hypertension () 791 730 769 0637sect

Type-2 diabetes () 231 238 147 0421sect

Use of BMD-related drugs () 582 540 385 0371sect

Lumbosacral BMD (gcm2) 082 013 084 016 079 013 0328

Lumbosacral T-score -212 114 -191 136 -228 119 0427

Femural Head BMD (gcm2) 079 014 082 014 078 012 0300

Femural Head T-score -136 100 -115 096 -141 095 0330

Femural Neck BMD (gcm2) 064 011 066 009 061 012 0301

Femural Neck T-score -195 094 -183 070 -212 114 0292

Serum osteopontin (ngml) 106 077 088 044 062 033 0031

Data are means SD or percentage within genotype P values for comparison of differences between

genotypes in a co-dominant model using MANOVA or the Chi-squaresect test BMI = body mass index

BMD = bone mineral density

52

Table 2 Correlation analysis between levels of serum osteopontin and clinicalanthropometric

findings among the 210 very-old subjects investigated

sOPN

BMD T-scores

LS FH FN LS FH FN

sOPN -- -015 828 -097 160 -134 050 -010 876 -107 121 -147 032

Age 182 008 -033 639 -024 003 -250 000 -030 656 -218 001 -256 000

BMI -139 045 129 062 294 000 148 032 139 043 333 000 166 016

WC -118 089 118 087 249 000 135 051 112 104 274 000 136 049

SBP 050 467 004 954 033 635 028 689 010 891 039 576 022 752

DBP -028 684 077 268 066 343 033 638 065 351 041 558 009 898

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed in correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index WC = waist circumference SBP = systolic blood pressure DBP =

diastolic blood pressure BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural Head FN =

Femural Neck sOPN = serum osteopontin

53

Table 3 Correlation analysis between serum levels of serum osteopontin and bone mineral density

findings among the very-old subjects grouped according to age and BMI

The Pearsonrsquos correlation test was used Data are expressed as correlation index and significance

level (r P) BMI = body mass index BMD = bone mineral density LS ndash lumbarsacral FH = Femural

Head FN = Femural Neck

OPN BMD T-scores

Group n (ngml) LS FH FN LS FH FN

Age lt 84 105 90 plusmn 06 -101 303 -025 804 -095 337 -071 469 009 926 -096 332

Age ge 84 105 106 plusmn 07 073 459 -115 241 -133 176 050 616 -165 093 -208 038

BMI lt

26 106 107 plusmn 07 -014 884 -094 338 -191 050 -008 936 -090 358 -213 028

BMI ge

26 104 89 plusmn 06 027 788 -033 737 -029 772 033 741 -049 622 -035 728

54

6 ndash DISCUSSAtildeO COMPLEMETAR

A microarquitetura do osso eacute uma estrutura dinacircmica em constante mudanccedila em resposta a

mecanismos de adaptaccedilatildeo geneacutetica e a demandas metaboacutelicas mecacircnicas inflamatoacuterias e

endoacutecrinas Com a progressatildeo da idade um remodelamento mais acentuado da matriz oacutessea reduz

sua resistecircncia global e predispotildee a fraturas que satildeo importantes preditores de morbidade e

mortalidade de individuos muito-idosos Por mais sofisticados que sejam os atuais modelos de

trabalho relativamente pouco eacute conhecido sobre o efeito das principais variantes aleacutelicas conhecidas

e dos niacuteveis dos constituintes oacutesseos mais fundamentais na determinaccedilatildeo da estrutura e resistecircncia

do osso Em parte esta lacuna pode resultar da interaccedilatildeo complexa entre estes mediadores e as

condiccedilotildees cliacutenicas de base dos indiviacuteduos assistidos clinicamente Por exemplo OPN foi

originalmente descrita como mediador seacuterico induziacutevel por glicose super-expressa em um contexto

de siacutendrome metaboacutelica (diabetes e hipertensatildeo) (136137) Aleacutem disso a interrelaccedilatildeo existente

entre concentraccedilotildees seacutericas de OPN e aspectos como idade e massa corporal como observado neste

e em outros estudos (138) satildeo os fatores de confusatildeo mais comuns em modelos humanos e relatos

anteriores ignoraram o ambiente cliacutenico da amostra (especialmente claacutessicos fatores de risco

cardiovascular) que devem ser interpretados com cautela (139)

Portanto o potencial de OPN para predizer fratura permanece aberto ao debate Nosso

trabalho tende a representar uma contribuiccedilatildeo para a literatura especializada sobre o assunto por

experimentalmente excluir indiviacuteduos sintomaacuteticos para doenccedilas cardiovasculares minimizando a

influecircncia de grandes desequiliacutebrios vascularesmetaboacutelicos em nossas anaacutelises Eacute importante

ressaltar que este estudo foi conduzido entre pacientes ambulatoriais muito idosos recrutados por

nunca terem manifestado infarto do miocaacuterdio ou acidente vascular cerebral ou periferica (140)

Sabendo que diversos relatos associam OPN com risco para eventos cardiovasculares uma

interferecircncia sobre os nossos resultados proveniente de um risco cardiovascular natildeo controlado

pocircde ser minimizada Ademais nosso estudo foi conduzido com um subconjunto que jamais

manifestou fraturas oacutesseas ou quedas recorrentes Criterios de seleccedilatildeo adicionais foram ausecircncia de

doenccedilas auto-imune (incluindo doenccedilas reumaacuteticas) infecccedilotildees crocircnicas ou recorrentes doenccedila

neoplaacutesica preacutevia ou atual ou uso de esteroacuteides ou natildeo esteroacuteides anti-inflamatoacuterios nos uacuteltimos 30

dias aleacutem do uso atual de medicamentos relacionados com a DMO Ao se realizar semelhante

estudo entre indiviacuteduos com bom estado geral de sauacutede e mobilidade preservada controla-se

experimentalmente para co-morbidades natildeo controladas em estudos revisados ateacute aqui

Em nossa investigaccedilatildeo comeccedilamos por demostrar uma associaccedilatildeo entre o conhecido

polimorfismo A7385G do gene humano para OPN e as concentraccedilotildees circulantes de seu produto

detectado nos indiviacuteduos muito idosos invetigados Regressatildeo multivariada do tipo stepwise mostrou

55

que o polimorfismo de OPN foi a mais importante variaacutevel preditiva do modelo a qual

conjuntamente com a idade e a massa corporal foram responsaacuteveis por 25 da variaccedilatildeo do

conteuacutedo humoral do marcador No entanto nenhuma associaccedilatildeo genoacutetipo-fenoacutetipo direta foi

estabelecida entre o polimorfismo em si e os escores de densidade dos ossos investigados

provavelmente devido ao fato de a concentraccedilatildeo de OPN ser um preditor pobre do estado de

mineralizaccedilatildeo oacutessea entre os sujeitos muito de idade investigados em conjunto com a natureza natildeo-

probabiliacutestica da amostra e numericamente limitada em sujeitos Por razotildees semelhantes os niacuteveis

de OPN foram associados a densidade mineral oacutessea apenas de forma siacutetio-especiacutefica basicamente

restrita ao colo do feacutemur

Nossos achados estatildeo de acordo com relatos anteriores que indicam niacuteveis elevados de

osteopontina circulantes em pacientes com diminuiccedilatildeo da densidade mineral oacutessea (138141) Dado

o desenho transversal do nosso estudo e a compreensatildeo de que uma hipermineralizaccedilatildeo anormal

pode derivar de deficiecircncia de OPN assumir que niacuteveis aumentados ou reduzidos da citocina

predispocircem a fraturas estaacute aleacutem do escopo do nosso trabalho A complexidade deste cenaacuterio pode

ser ilustrada pela nossa compreensatildeo de que os organismos podem adaptar-se ao envelhecimento

usando a superexpressatildeo de OPN por exemplo para compensar uma atividade osteoblaacutestica

diminuiacuteda assumindo um padratildeo mais eficaz da construccedilatildeo da matriz na tentativa de produzir ossos

de melhor qualidade mesmo em um contexto de DMO relativamente mais baixa Assim natildeo

surpreende que as associaccedilotildees significativas resistiram a ajustes estatiacutestics apenas entre os sujeitos

mais fraacutegeis (ge 84 anos ou IMC lt 26 kgm2) onde niacuteveis de DMO satildeo naturalmente mais baixos e um

mecanismo adaptativo mais intenso seria necessaacuterio No entanto apesar da DMO ser a ferramenta

diagnoacutestica mais comum utilizado para avaliar risco de fratura eacute importante ter em mente que

menos da metade das fraturas natildeo vertebrais podem ser explicada considerada apenas a DMO

isoladamente (142) Portanto as avaliaccedilotildees diretas da resistecircncia oacutessea em modelos animais

juntamente com acompanhamento cliacutenico visando aferir incidecircncia de fraturas em seres humanos

agregados conforme portadores de distintas concentraccedilotildees basais do mediador ou diferentes

arquiteturas genotiacutepicas ajudariam a elucidar as relaccedilotildees causais entre distuacuterbios do OPN e a

qualidade do osso

Apesar da normalizaccedilatildeo dos sujeitos em termos de idade composiccedilatildeo corporal e status

cardiovasculares o presente estudo tem limitaccedilotildees na sua maioria relacionados a fatores de

confusatildeo inerentes ao cenaacuterio brasileiro mas natildeo foram investigados aqui tais como a notaacutevel

miscigenaccedilatildeo geneacutetica do contingente brasileiro (143) a prevalecircncia crescente de doenccedilas

metaboacutelicas entre os idosos (144145) e a diversidade de haacutebitos de consumo de alimentos em todo

o paiacutes

56

7 ndash CONCLUSAtildeO

A anaacutelise dos dados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- Foi encontrado uma associaccedilatildeo entre a transiccedilatildeo A7385G comum no gene OPN com niacuteveis seacutericos

do mediador em individuos muito idosos em consonacircncia com uma expressatildeo sistecircmica aumentada

de OPN pelo alelo A

- Aleacutem disso os niacuteveis de OPN foram negativamente correlacionadas e de um modo sensiacutevel ao

contexto cliacutenico dos pacientes com valores de DMO do colo do fecircmur tanto em termos absolutos

quanto relativos mas natildeo com outras regiotildees oacutesseas investigadas

- No modelo humano a expressatildeo do mediador OPN explica ao menos em parte o fenoacutetipo complexo

da estrutura e resistecircncia oacutesseas No entanto atestar relevacircncia cliacutenica dos achados apresentados

aqui ainda depende de estudos futuros

- O estudo forneceu a primeira evidecircncia geneacutetica para associaccedilatildeo entre polimofismo comum do

gene da OPN sua quantificaccedilatildeo em termos de niveis sericos e sua relaccedilatildeo com a densidade mineral

oacutessea

57

8 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

01 Nasri F The aging population in Brazil Einstein (Satildeo Paulo) 6(supl1)S4-S6

2008

02 Carvalho JAM Garcia RA O Envelhecimento da populaccedilatildeo Brasileira um

enfoque demograacutefico Cad Sauacutede Publica 2003 19725-33

03 Chaimowicz F A sauacutede dos idosos brasileiros agraves veacutesperas do seacuteculo XXI

problemas projeccedilotildees e alternativas Rev Sauacutede Publica 1997 31(2)184-200

04 Nieman DC Exerciacutecio e sauacutede Como se prevenir de doenccedilas usando o exerciacutecio

como seu medicamento 1ordfed Satildeo Paulo Manole 1999 105-18

05 Danowski JS Osteoporose conceito classificaccedilatildeo e cliacutenica ARS CVRANDI

Cliacutenica Meacutedica 1996 29 21 apud Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V 2001

06 Yuaso DR Sguizzatto GT Fisioterapia em pacientes idosos In Netto MP

Gerontologia ndash A velhice e o envelhecimento em visatildeo globalizada Satildeo Paulo

Atheneu 2002 P324-47

07 Datasus Banco de dados [on line] 2003 Disponiacutevel em http

wwwdatasusgovbr

08 Rennoacute ACM Driusso P Ferreira V Atividade fiacutesica e osteoporose uma revisatildeo

bibliograacutefica Fisioter Mov 2001 13(2) 49-54

09 Chan KM Anderson M Lau EMC Exercise interventions defusing the worldrsquos

osteoporosis time bomb Bull W Health Organ 2003 81(11)

10 Meinatildeo IM Pippa MGB Romanelli PRS Zerbini CAF Doenccedilas

Osteometaboacutelicas In Moreira C Carvalho MAP Noccedilotildees praacuteticas de reumatologia

Belo Horizonte Health 1998 2379-404