ASSOCIAÇÃO ENTRE ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA E … › bitstream › 123456789...Esquistossomose crônica modifica a resposta imune e pode favorecer translocação, migração e sepse

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

ASSOCIAÇÃO ENTRE ESQUISTOSSOMOSE

MANSÔNICA E TRANSLOCAÇÃO BACTERIANA /

SEPSE: PERFIL DE CITOCINAS NA INFECÇÃO

CRÔNICA EM CAMUNDONGOS SUBMETIDOS À

ESPLENECTOMIA

Carlos Roberto Weber Sobrinho

RECIFE/PE

2012

Carlos Roberto Weber Sobrinho

ASSOCIAÇÃO ENTRE ESQUISTOSSOMOSE

MANSÔNICA E TRANSLOCAÇÃO BACTERIANA /

SEPSE: PERFIL DE CITOCINAS NA INFECÇÃO

CRÔNICA EM CAMUNDONGOS SUBMETIDOS À

ESPLENECTOMIA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Doutor em Medicina Tropical

Orientadora: Profª. Dra. Célia Maria Machado Barbosa de Castro. MD, PhD

Co-orientador: Profº. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho. MD,PhD

RECIFE/PE

2012

Catalogação na fonte Bibliotecária Maria das Graças Pessoa da Silva, CRB4-763

W373a Weber Sobrinho, Carlos Roberto. Associação entre esquistossomose mansônica e translocação

bacteriana / sepse: perfil de citocinas na infecção crônica em camundongos submetidos à esplenectomia / Carlos Roberto Weber sobrinho– Recife: O autor, 2012.

188 folhas: il.; tab. graf ; 30 cm. Orientador: Célia Maria Machado Barbosa de Castro. Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco, CCS,

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2012. Inclui bibliografia, e anexos. 1. Esquistossomose. 2. Esplenectomia. 3. Translocação

bacteriana. 4. Sepse. 5. Citocinas. I. Castro, Célia Maria Machado Barbosa (Orientador). II. Título.

616.96 CDD (23.ed.) UFPE (CCS2012-147)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

REITOR

Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Francisco de Souza Ramos

DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

Nicodemos Teles de Pontes Filho

COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM MEDICINA TROPICAL

Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM MEDICINA TROPICAL

Valdênia Maria Oliveira de Souza

CORPO DOCENTE

Ana Lúcia Coutinho Domingues

Célia Maria Machado Barbosa de Castro

Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto

Fábio André dos Santos Brayner

Heloísa Ramos Lacerda de Melo

Maria Amélia Vieira Maciel

Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque

Maria do Amparo Andrade

Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho

Marli Tenório Cordeiro

Ricardo Arraes de Alencar Ximenes

Valdênia Maria Oliveira de Souza

Vera Magalhães de Silveira

Vláudia Maria Assis Costa

COMISSÃO EXAMINADORA

Membros Titulares

Drª. Flávia Regina Gonçalves de Araújo

(Departamento de Patologia - UFPE)

Dr. Jacinto da Costa Silva Neto

(Departamento de Histologia - UFPE)

Dr. Luciano Montenegro


Drª. Maria Amparo Andrade

(Departamento de Fisioterapia - UFPE)

Drª. Vera Magalhães de Silveira

(Departamento de Medicina Tropical - UFPE)

Membros Suplentes

Drª. Janete Magali de Araújo

(Departamento de Antibióticos- UFPE)

Drª. Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho

(Departamento de Farmacologia - UFPE)

Tese: Associação entre esquistossomose mansônica e translocação bacteriana /

sepse: perfil de citocinas na infecção crônica em camundongos submetidos à

esplenectomia.

Doutorando: Carlos Roberto Weber Sobrinho

Data da defesa: 12/06/2012

BANCA EXAMINADORA:

Drª. Flávia Regina Gonçalves de Araújo


Dr. Jacinto da Costa Silva Neto

(Departamento de Histologia - UFPE)

Drª. Luciano Montenegro


Drª. Maria Amparo Andrade

(Departamento de Fisioterapia - UFPE)

Drª. Vera Magalhães de Silveira

(Departamento de Medicina Tropical - UFPE)

DEDICATÓRIA

Era apenas um garoto com 7 anos e ainda dependente da mãe, que lutadora, sobrevivia aos pés de uma velha máquina de costura. Situação não muito favorável, ela passava a noite aos cuidados atentos em produzir edredons para vendê-los na manhã seguinte. Tal menino, como toda criança, sentia a ausência de sua mãe... e passou a dormir ao lado da máquina de costura, sobre um retalho de pano, vendo uma pequena televisão. Muitas foram as noites como essa... Até que um dia, o seu avô, alguém de caráter admirável o aconselhou: “Estude, torne-se um Doutor e tire você e sua mãe dessa situação”! E assim começa um sonho de uma vida que se realiza com a elaboração desta tese.

A criança sou eu mesmo, e é a esta mulher que dedico minha tese, a lutadora, a minha mãe.

AGRADECIMENTOS

Mais uma etapa do conhecimento ou um grande passo para a

carreira científica. Para muitos, esta é a definição mais romântica do

doutoramento. Eu me permito ir mais além: é a realização de um sonho.

Parafraseando Raul Seixas ―Um sonho que se sonha só, é só um sonho que se

sonha só, mas sonho que se sonha junto é realidade‖. É para algumas dessas

muitas pessoas que sonharam comigo que apresento meus mais sinceros

agradecimentos:

Minha mãe Sonia Inês Weber, por todo amor, por toda dedicação,

por estar comigo sempre, por ser a minha base e minha força em todos os

momentos da minha vida.

Minha avó materna, Alaíde Inês dos Santos, por todos os

ensinamentos, por toda a torcida, preocupação e orações dedicadas a mim

desde o início da minha caminhada.

A minha prima e madrinha, Luzia Ribeiro, por toda a confiança e

carinho. Pelas horas de conversa e conselhos, e pela ajuda indispensável ao meu

crescimento como ser humano.

O meu especial agradecimento a minha orientadora a Profª. Drª Célia

Castro pela compreensão. É a ela que indiscutivelmente devo a defesa desta

tese.

A co-orientador Prof. Dr. Nicodemos Teles por toda a colaboração

A minha amiga e ex-chefe, Profª. Drª. Cleide Miranda, pelos

conselhos, apoio, confiança e credibilidade;

Ao meu grande amigo José Rebelo Neto, por toda torcida e ajuda nos

momento de estresse e angústia que todo doutorando precisa passar.

Aos meus amigos João Igor e Rozeli Weimman pelo acolhimento e

momentos de descontração durante o período crítico.

Ao meu amigo Ulrich Vasconcelos, por todo o carinho, colaboração e

torcida desde o início do doutorado até a conclusão dele.

A minha grande amiga e professora Drª. Magali de Araújo, pelo

apoio e ajuda sempre que solicitada.

Aos meus colegas Kedma Magalhães, Bruno Galvão e André Aires,

por toda colaboração na execução do projeto.

A Dra. Maria Helena, Chefe do Biotério do LIKA, pelo apoio, pela

colaboração nas cirurgias e pelo grande ser humano que é. Com ela aprendi

muito mais que procedimentos técnicos cirúrgicos, eu aprendi que gentileza

gera gentileza.

As estagiárias Sandy e Clarissa, que sem a preciosa ajuda delas, a

caminhada teria sido mais árdua, além de ter aprendido que tudo dá certo

quando se tem calma.

As amigas Fátima Regina, Liliane e Elizianne, por toda ajuda na

sempre que solicitada.

Ao estagiário João, pela ajuda sempre que possível.

E por último, e não menos importante, a Deus, causa primária de

tudo, a quem tentamos compreender e ser agradecidos pela dádiva da vida. A

todos aqueles que de maneira anônima estiveram ao meu lado com intuito de

ajudar.

A todos o meu muito obrigado!

EPÍGRAFE

―A ciência infundada gera ateus, a verdadeira ciência leva os homens a se curvarem diante da divindade‖.

Voltaire

RESUMO INTRODUÇÃO: Os helmintos são amplamente reconhecidos como organismos reguladores da resposta imune do seu hospedeiro. Um imunomodulador e potente indutor da resposta Th2 é o Trematódeo Schistosoma mansoni que no Brasil, é a espécie que apresenta as taxas mais alarmantes de infecção, principalmente no Nordeste do País. É de amplo conhecimento que a esquistossomose é um fator promotor de bacterioses, sendo descrita também a interação do S. mansoni com bactérias gram-positivas e bactérias anaeróbias. Alguns estudos estabelecem que mesmo com a realização da esplenectomia, os doentes não desenvolvem quadros sépticos graves nos primeiros dias de pós-operatório, assim como não há registro de tais complicações, de forma significativa, durante a história de sua afecção. Outros verificaram a ocorrência de infecção severa pós-esplenectomia (OPSI) caracterizando-as como sepse fulminante, meningite ou pneumonia, ocasionada, na maioria dos episódios, por S. pneumoniae, N. meningitidis e H. influenzae tipo B. Desta forma, não se sabe ao certo se a esquistossomose favorece a translocação microbiana e sepse ou se, em virtude de sua resposta imunológica característica, existe uma proteção do hospedeiro vertebrado contra esse processo e suas consequências. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar o desenvolvimento de sepse através de alterações dos níveis de citocinas do perfil Th1 e Th2, comparando camundongos esquistossomóticos na fase crônica e sem infecção, submetidos ou não a esplenectomia. MATERIAIS E MÉTODO: 24 camundongos Swiss webster fêmeas (Mus musculus) com 35 dias de nascidos foram infectados por suspensão com aproximadamente 50 cercarias e a mesma quantidade de indivíduos foi selecionada para o grupo controle. Noventa dias após a exposição cercariana, 08 camundongos esquistossomóticos e 08 controles foram submetidos à esplenectomia total convencional, assim como 08 outros camundongos de ambos os grupos foram submetidos a cirurgia controle (Sham). Foram realizadas avaliações de contagem de ovos pelo método kato-katz 45 e 97 dias após infecção cercariana. Foram eutanasiados após 100 dias de infecção. Para estudo da Translocação bacteriana (TB), foi coletado sangue periférico, fragmentos de linfonodos mesentéricos, baço e fígado. Para a investigação da microbiota, as fezes foram coletadas da região média do intestino delgado. Foi realizado ensaio multiplex com sangue coletado por punção cardíaca para dosar os níveis séricos de IL-1β, IL-2, IL-4, Il-5, IL-10, IL-12 INF-γ, TNF-α, GM-CSF. RESULTADOS: No grupo esplenectomizado, todas as unidades amostrais tiveram sepse. O micro-organismo de maior frequência nas fezes e com TB foi a E. coli. Micro-organismos no baço, fígado e sangue foram encontrados em todos os indivíduos infectados do grupo esplenectomizados e em 62,5% dos infectados do grupo controle, sendo estes apenas no baço. A média do número de ovos por g/fezes foi maior no 45º dia que no 97º dia da infecção (p=0,005) em todos os subgrupos. Entretanto, a diferença foi encontrada apenas no subgrupo de Esplenectomizados (p<0,05), sendo a diferença na ovoposição antes e depois da esplenectomia de aproximadamente 79%. Em relação aos níveis médio de IL-2 e IL-4, não houve diferença nas comparações inter e intra-grupos, ou seja, não há efeito do procedimento nem da infecção. Observa-se que os níveis médios de IL-5 se diferenciam entre os grupos infectados e na análise intra-grupo há um aumento da IL-5 sob a condição da infecção. Diferença significativa na IL-10 foi observada quando comparados os infectados entre os três grupos, onde a média do IL-10 foi maior no grupo sem procedimento e Sham. Na avaliação dos níveis de IL-12, não foram observadas diferenças quando

comparados os infectados entre grupos esplenectomizados, sham e sem procedimento. Na análise do TNF foi observada diferença quando comparados os infectados entre os grupos controle e Sham, onde a média

do TNFα entre os controles foi maior. Na análise do INF observa-se grande variabilidade nos grupos infectados submetidos a esplenectomia e estresse cirúrgico, o que explica a não diferença entre eles quando comparados ao controle. Diferença no nível sérico de GM-CSF foi observada entre os infectados e não infectados do grupo Sham onde o grupo infectado apresentou concentração média maior. CONCLUSÃO: Esquistossomose crônica modifica a resposta imune e pode favorecer translocação, migração e sepse em camundongos fêmeas. Além disso, a asplênia aumenta a suscetibilidade a TB e doenças de origem séptica, por altera mesmo de maneira sutil o perfil imunológico. A polarização do perfil de resposta CD4+ influencia tais fenômenos. PALAVRAS-CHAVE: esquistossomose, esplenectomia, translocação bacteriana, sepse, citocinas.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Helminths are known as host immune response regulators. The trematode Schistosoma mansoni comprises one of the most potent Th2 immunomodulator in Brazil, being responsible for the higher rates of infection, particularly in the Northeast region. In addition, schistosomiasis is well known a promoting bacterial diseases factor due to the parasite interaction with gram-positive and anaerobic bacteria. Interestingly, some studies have demonstrated that severe sepsis was not developed in the first days after total splenectomy, in the first days after surgery, as well as there are no significantly records of such complications in the following years. In contrast, occurrence of an Overwhelming Post-Splenectomy Infection (OPSI) was also reported. OPSI is characterized as a fulminant sepsis, meningitis or pneumonia, caused in most cases by S. pneumoniae, N. meningitidis and H. influenzae type B. Thus, it is uncertain whether schistosomiasis may contribute to the microbial translocation and sepsis or whether vertebrate host is protected against such process and its consequences due to immune response. Hence, the aim of this study was to analyze the development of sepsis by determining alterations in Th1 and Th2 levels between schitosomotic mice in the cronic phase and without infection or not subjected to splenectomy. MATERIALS AND METHODS: A 35 days old Swiss Webster female mice (Mus musculus) were infected with approximately 50 cercariae (n=24) and the same number of rodent were set in the control group. Ninety days after cercarial exposure, 08 schistosomotic and 08 control mice were underwent conventional splenectomy. In the other hand, 08 other mice of both groups were underwent Sham. Egg counting was evaluated by using Kato-Katz method at 45th and 97th days after cercarial infection. At the 100th day, all mice were anesthetized and euthanatized. Peripheral blood, fragments of mesenteric lymph nodes, spleen and liver were sampled for the bacterial translocation (BT) analysis. Fecal samples from the middle of the small intestine were collected for the microbial analysis. Multiplex assay was performed with blood drawn by cardiac puncture for the dose levels of serum IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, INF-γ, TNF-α, GM-CSF . RESULTS: All splenectomized group developed sepsis. E. coli was the most prevalent bacteria found in fecal analysis and BT. Enterobacteria were found in the spleen, liver and blood for all infected splenectomized mice as well as 62.5% in the spleen of infected mice in the control group. The number of eggs per gram of feces were greater at 45th day than at 97th day of infection (p = 0.005) in all subgroups. However, the difference was found only in the subset of splenectomy (p <0.05), and difference in oviposition before and after splenectomy was approximately 79%. IL-2 and IL-4 presented no difference in comparison between inter to intra-group, i.e. there was neither effect of the procedure nor infection. Levels of IL-5 differentiated between infected groups. Intra-group increased IL-5 during the infection. IL-10 showed a significant difference when infected mice was compared to the other three groups, presenting higher levels in the group without the procedure and Sham. Among all groups, no differences were observed in the IL-12 levels. TNFa levels were higher among controls. IFN-γ presented great variability in the infected groups underwent splenectomy and surgical stress, justifying the lack of difference between them when compared to control. Difference in serum GM-CSF was observed between infected and uninfected Sham group, revealing a higher average concentration. CONCLUSION: Chronic schistosomiasis modifies the immune response and may promote translocation, migration and sepsis in female mice. Furthermore, asplenia increases susceptibility to BT and sepsis, altering the immunological profile subtly. In addition, polarization of the CD4+ response profile acts in such phenomenon.

KEYWORDS: schistosomiasis, splenectomy, bacterial translocation, sepsis, citokines.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 2.1 – Distribuição do Schistosoma mansoni no Brasil 21 Figura 2.2 – Desenvolvimento da resposta imune na Esquistossomose masonica 29 Figura 2.3 – Cinética de Citocinas da Esquistossomose mansônica. 31 Figura 2.4 – Rotas de translocação bacteriana do trato gastrointestinal 38 Figura 2.5 – Complexidade da interação entre os receptores Toll-like (TLR) e patógenos

(leveduras e bactérias). Componentes distintos da parede são reconhecidos por diferentes TRL. Bactérias gram-negativas expressam exclusivamente lipopolissacarídeos, enquanto gram-positivas expressam ácido lipoteicóico. 42

Figura 2.6– Detalhes da anatomia de roedores, destacando a localização e morfologia do baço (os números indicam linfonodos). 48

Figura 2.7 – Sistema vascular do baço: distribuição de acordo com os vasos hilares. 51 Figura 2.8 – Estrutura da polpa branca de roedores: camundongo (A) e rato (B) 51 Figura 2.9 – Células hematopoéticas: polpa vermelha de camundongo - 20 semanas. 52 Figura 2.10 - Zona marginal e localização de suas espécies celulares. 54 Figura 2.11 – Eritrócitos contendo pits característicos, destacados pelas setas 59 Figura 2.12 – “A clínica do Dr. Agnew‖ (1889), fotogravura de Thomas Eakins (1844-

1916), retratando uma cirurgia esplênica em uma mulher, durante as quartas de final da rodada mundial de esplenectomia daquele ano. 66

Figura 5.1- A - Camundongo da linhagem Swiss webster. B – Local de permanência dos camundongos (Gaiola com cama de maravalha estéril, ração Labina® e bebedouro, alojada no Biotério do LIKA/UFPE). 76

Figura 5.2 – Distribuição de grupos de camundongos submetidos a estudos. 77 Figura 5.3- Dinâmica e distribuição dos grupos de camundongos fêmea submetidos ao

estudo. 79 Figura 5.4- Moluscos da espécie B. glabrata infectados, em meio aquático e expostos à

luz artificial. 81 Figura 5.5- Padronização da suspensão cercariana. 82 Figura 5.6-: A – Anestesia intramuscular. B – Imoblização e exposição à suspensão

cercariana por via percutânea, e luz artificial. 82 Figura 5.7- Método de Kato-Katz. A - Helm-test®. B - Recolhimento das fezes que

atravessam a malha. C - Lâminas preparadas. 83 Figura 5.8- Preparo pré-operatório. A – Anestesia intramuscular. B - Tricotomia. 84 Figura 5.9- Procedimento cirúrgico. A- Inspeção do Baço. B- Ligadura dos vasos. 84 Figura 5.10- Procedimento cirúrgico - mobilização e secção de ligamentos. 85 Figura 5.11- Procedimento cirúrgico. A-inspeção da cavidade abdominal. B- sutura. 85 Figura 5.12- Baço retirado na esplenectomia. 86 Figura 5.13- Estresse cirúrgico (SHAM). A – Tricotomia. B – Decúbito dorsal

semilateral. C- Laparotomia exploratória. 86 Figura 5.14: Kit de identificação de Enterobacterias. Da esquerda para direita,

respectivamente os meios: EPM (Meio Rugai modificado), Lisina, M.I.O. (Motilidade, Indol, Ornitina), Citrato de Simmons e Caldo Raminose. 88

Figura 5.15- Esquema do princípio de detecção do Bioplex. 90 Figura 5.16- Esquema da metodologia Bioplex. 91

LISTA DE QUADROS, TABELAS E GRÁFICOS

Quadro 2.1– Mediadores de dano endotelial na sepse. 44 Quadro 2.2 – Características estruturais e funcionais do baço em roedores. 49 Quadro 2.3 – Principais destaques na história e pesquisa do baço*. 57

Tabela 2.1 – Infecção Fulminante Pós-Esplenectomia (OPSI). 69

ARTIGO 1

Tabela 1. Comparação dos grupos segundo condição de infecção. 101 Tabela 2. Distribuição dos micro-organismos por sítio de infecção segundo os grupos

de comparação. 102

Gráfico 1 - Número médio de ovos eliminados por g/fezes em camundongos infectados por S. mansoni nos grupos Sem Perocedimento (SP), Eplenectomizados (E) e Sham (S). 100

Gráfico 2. IL-1 médio segundo os subgrupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção. 103

Gráfico 3. IL-2 média segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção. 104

Gráfico 4. INF médio segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção. 105




ARTIGO 2

Figura 1 – Distribuição de grupos experimentais. 127

Gráfico 1. TNF médio (pg/mL) segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção. Gráfico 2. IL-12 média (pg/mL) segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção. Gráfico 3. GM-CSF (pg/mL) médio segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Estresse cirúrgico (S), e sob a condição de infecção.

132

133

134

SUMÁRIO

1- Apresentação 18

2 - Revisão da Literatura 20

2.1 Esquistossomose mansônica 20

2.1.1 Aspectos epidemiológicos 20

2.1.2 Ciclo evolutivo 22

2.1.3 A doença 23

2.1.4 Modelos experimentais 25

2.1.5 Resposta imunológica na esquistossomose 27

2.2 Translocação bacteriana 36

2.2.1 Generalidades 36

2.2.2 Mecanismos e componentes da translocação bacteriana 37

2.2.3 Alteração da resposta imunológica 40

2.3 Sepse e resposta imunológica 41

2.4 O baço 48

2.4.1 Características gerais 48

2.4.2 Baço: etiologia e contexto histórico 54

2.4.3 Funções esplênicas 58

2.4.4 Imunidade inata do baço 62

2.4.5 Imunidade adquirida do baço 64

2.4 6 Cirurgia do baço e as consequências pós-cirúrgicas 65

3- Hipóteses e Modelo Teórico 73

4- Objetivos 74

5 - Animais, Materiais e Métodos 75

5.1 O desenho do estudo 75

5.2 Animais 76

5.3 Formação dos grupos de estudo 77

5.4 Categorizações das variáveis 80

5.4.1 Variáveis dependentes 80

5.4.2 Variáveis independentes 80

5.5 Obtenção das cercárias e infecção dos camundongos 81

5.6 Confirmações da infecção e perfil de ovoposição pós esplenectomia 83

5.7 Procedimento Cirúrgico (Esplenectomia Total) 83

5.8 Procedimento Cirúrgico (Estresse Cirúrgico - Sham) 86

5.9 Eutanásia e Verificação da translocação microbiana/ sepse 86

5.10 Avaliação da microbiota intestinal 89

5.11 Níveis Séricos de Interleucinas 89

5.11 Análise estatística 92

6 - Resultados 93

6.1 ARTIGO 1 93

Resumo 94

Introdução 94

Materiais e Métodos 95

Resultados 99

Discussão 108

Conclusões e perspectivas futuras 115

Agradecimentos 116

Referências 116

6.2 ARTIGO 2 124

Resumo 125

Introdução 125

Materiais e Métodos 126

Figura 1 – Distribuição de grupos experimentais. 127

Resultados 130

Discussão 134

Conclusões e perspectivas futuras 136

Agradecimentos 136

Referências 137

7 - Conclusão 140

8 – Perspectivas 142

Referências Bibliográficas 144

ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA 188

UFPE Programa de Pós-Graduação Em Medicina Tropical

Weber, C. R. 18

1- Apresentação

É de amplo conhecimento que a esquistossomose é um fator promotor de

bacterioses, fato amplamente documentado através de sua associação às infecções de

etiologia bacteriana gram-negativa. Contudo, foi descrita a interação do S. mansoni com

bactérias gram-positivas, bactérias anaeróbias e com fungos. Estudos experimentais

mostraram maior ocorrência de abscesso hepático estafilocócico em camundongos

portadores de esquistossomose quando comparados aos controles sem a doença. E

diferentemente das bactérias gram-negativas, as bactérias anaeróbicas translocam

apenas em situações em que o intestino se encontra estruturalmente danificado. Isto

leva a crer que a disfunção imune provocada pelo Schistosoma mansoni promove

primariamente translocação microbiana.

Em animais de laboratório são inúmeras as evidências de imunodepressão

provocadas pela esquistossomose. Sabe-se que ocorre baixa resposta imune celular na

fase crônica da doença. Alguns estudos demonstraram que há predomínio da resposta

de linfócitos T auxiliares 2 (Th2) na forma hepatoesplênica da esquistossomose. A

resposta Th2 predominante inibe, por sua vez, a resposta Th1, promovendo uma

modulação na resposta imune. Esta modulação das respostas imunes poderia facilitar a

translocação microbiana e predispor à sepse. Desta forma, a incapacidade de animais

infectados pelo S. mansoni de eliminar micro-organismo é tema que, desde muito cedo,

é alvo de estudo.

Outro fator importante é a ocorrência da diminuição do interferon gama (IFN-γ)

na esquistossomose crônica, o que sugere maior susceptibilidade às infecções

microbianas. Nas doenças fúngicas, o fator associado a sua evolução é a alteração dos

níveis séricos de lectina ligada a manose (MBL). Em contra partida, alguns trabalhos

demonstram que o aumento dos níveis de imunoglobulinas G e M (IgM e IgG) na

forma hepatoesplênica da esquistossomose pode ser, pelo menos parcialmente,

responsável pela maior resistência à sepse em portadores de esquistossomose. Alguns


Weber, C. R. 19

estudos estabelecem que mesmo com a realização da esplenectomia, os doentes não

desenvolvem quadros sépticos graves nos primeiros dias de pós-operatório, assim

como não há registro de tais complicações, de forma significativa, durante a história de

sua afecção. Na literatura, a única explicação para esse fato é que mesmo na ausência

do baço, as defesas imunológicas dos pacientes parecem ser preservadas.

Desta forma, não se sabe ao certo se a esquistossomose favorece a translocação

microbiana e sepse ou se, em virtude de sua resposta imunológica característica, existe

uma proteção do hospedeiro vertebrado contra esse processo e suas consequências.

Assim, frente a existência destas lacunas, torna-se clara a necessidade do

desenvolvimento de estudos que visem um maior esclarecimento destes mecanismos

imunológicos e a relação entre eles, a translocação microbiana e a esquistossomose

mansônica.


Weber, C. R. 20

2 - Revisão da Literatura

2.1 Esquistossomose mansônica

2.1.1 Aspectos epidemiológicos

A esquistossomose, em função de seu mecanismo de infecção, é uma doença

veiculada pela água, endêmica em aproximadamente 80 países, cuja prevalência

alta em diferentes regiões do mundo, faz dessa parasitose, uma das doenças de

maior importância. Os registros mais antigos da doença datam de mais de dois mil

anos no Egito. No entanto, a distribuição geográfica da esquistossomose mudou ao

longo da história, apesar do continente africano ainda permanecer como a região

do planeta com o maior número de pessoas infectadas nos dias atuais. Neste

contexto, um significativo número de pessoas infectadas ou sob risco de adquirir a

infecção pode ser identificado, apesar da implementação de programas de controle

em algumas regiões endêmicas ao redor do mundo (CHITSULO et al. 2000;

ENGELS et al. 2002; BINA; PRATA, 2003; GRYSSELS et al. 2006; MS-BRASIL, 2011).

Em razão das dimensões continentais do Brasil, diferentes aspectos

geográficos, climáticos, socioeconômicos caracterizam e destacam o país, como

uma das regiões com maior variedade de parasitoses, incluindo a esquistossomose

mansônica. Dentre os 26 estados e o Distrito Federal, 19 deles são afetados,

destacando a região nordeste e o estado de Minas Gerais (Figura 2.1). Isto

representa uma população cerca de seis milhões de pessoas infectadas, revelando

também, um grave problema de saúde pública no país (DOMINGUES; BARRETO,

2001; ALMEIDA, 2003; SCHNACK et al., 2003) (Figura 2.1).

De acordo com o Ministério da Saúde, a esquistossomose continua sendo

uma parasitose relevante no Brasil, embora a Política de Vigilância Epidemiológica

esteja em atividade a mais de uma década. Ressalta-se ainda que a mortalidade da

doença esteja relacionada particularmente às manifestações clínicas decorrentes da

fase crônica da doença (FERREIRA e SILVA, 2007; BRASIL, 2010).


Weber, C. R. 21

Figura 2.1 – Distribuição do Schistosoma mansoni no Brasil.

Fonte: MS Brasil, 2010.

Em Pernambuco, a esquistossomose é endêmica na região rural, acometendo

pessoas de baixa renda e apresentando-se comumente na forma crônica. O

principal hospedeiro intermediário de ocorrência no estado é o molusco

Biomphalaria straminea. Entretanto, em razão das migrações de trabalhadores rurais,

bem como o crescimento dos espaços urbanos, a doença migrou em direção ao

litoral, veiculada por um novo caramujo, Biomphalaria glabrata, e atingindo

populações de maior renda, assumindo nesse contexto, um caráter de infecção

aguda. Apenas no ano de 2011, mais de 300 casos foram registrados em todo o

estado de Pernambuco (COUTINHO et al., 1997; BARBOSA et al., 2001; BRASIL. S.

V. S., 2011).

Embora o diagnóstico e tratamento sejam relativamente simples, o controle

da esquistossomose demanda medidas de saneamento básico, bem como educação

da população, representada pelas mudanças de comportamento dos indivíduos

residentes de áreas endêmicas. O principal objetivo dessas medidas é a interrupção

do ciclo evolutivo do parasita, porém, encontra obstáculos importantes, tais como,

a população de caramujos, a não disponibilidade de uma vacina, o tempo

necessário para a população mudar seus hábitos e o custo das obras de saneamento

básico, entre outros (CARVALHO et al., 1998; KATZ, 1999; KATZ e PEIXOTO,

Prevalência (%)

>15 5-15 <5

Não endêmica


Weber, C. R. 22

2000; KATZ e ALMEIDA, 2003; COURA e AMARAL, 2004; FERREIRA e SILVA,

2007).

Neste cenário, estudos para o melhor entendimento da dinâmica da infecção

e das relações hospedeiro-parasita, bem como a compreensão da associação da

esquistossomose com outros processos infecciosos, podem contribuir no

implemento de estratégias, cujo objetivo seja buscar novos instrumentos de

controle da doença, bem como tratamento, permitindo assim, a redução da

morbidade e mortalidade causadas pelo helminto.

2.1.2 Ciclo evolutivo

O ciclo evolutivo do S. mansoni dura cerca de 80 dias e apresenta duas fases.

A primeira ocorre no hospedeiro intermediário, isto é, caramujos do gênero

Biomphalaria, e a segunda no hospedeiro definitivo, podendo ser o homem ou

outros vertebrados. Os vermes adultos localizam-se habitualmente no interior dos

vasos sanguíneos da parede do reto, ceco e intestino grosso desses hospedeiros

(REY, 2001; KATZ e ALMEIDA, 2003).

As fêmeas do S. mansoni põem cerca de 300 ovos por dia e parte desses ovos

podem atravessar a parede dos vasos, atingindo o lúmem, sendo eliminados pelas

fezes, as quais uma vez lançadas em água doce, pode fazer com que eles eclodam,

liberando a larva ciliada e planctônica, denominada por miracídio. O miracídio

penetra pelo epitélio do caramujo e após uma reorganização celular é formado o

esporocisto primário, evoluindo para secundário e culminando na formação das

cercarias. Após um período variando de 4 a 6 semanas, as cercárias deixam o

caramujo, tornando-se formas de vida livre na água até o contato com o hospedeiro

definitivo. A penetração do organismo ocorre de forma ativa através da pele ou

mucosa por ação enzimática e mecânica, e uma vez instalado, ocorrem

transformações morfológicas e de natureza bioquímica e antigênica, culminando na

forma de esquistossômolo. Os esquistossômolos penetram nos vasos sanguíneos e

linfáticos, podendo migrar para os pulmões, sendo distribuídos particularmente

para o fígado, atingindo a maturidade sexual no sistema portal entre 2 e 6 semanas,


Weber, C. R. 23

quando o hospedeiro definitivo produz fezes ricas de ovos do parasita (REY, 2001;

KATZ e ALMEIDA, 2003; PORDEUS et al., 2008).

2.1.3 A doença

A deposição dos ovos de S. mansoni no fígado e demais órgãos é implicada

na intensa resposta inflamatória do tipo granulomatoso da esquistossomose

enquanto os vermes adultos não são significativamente importantes no processo

mórbido. Muitos indivíduos infectados podem permanecer assintomáticos, porém

os sintomas clínicos da doença se relacionam com as fases do desenvolvimento do

parasito no organismo (LA FLAMME et al., 2004; BAPTISTA e ANDRADE, 2005;

PORDEUS et al., 2008).

De acordo com os achados clínicos, a esquistossomose é dividida em aguda e

crônica. A esquistossomose crônica distribuída principalmente em leve ou

hepatointestinal, geralmente assintomática e atingindo a maioria dos infectados

residentes de áreas endêmicas, e a segunda forma crônica, mais rara, é

caracterizada pela hepatoesplenomegalia e outros sinais de hipertensão porta (REY,

2001; PORDEUS et al., 2008; ANDRADE, 2008). Na fase aguda, podem ser

observados desde quadros assintomáticos até dermatite urticariforme, erupção

papular, eritema, edema e prurido, podendo persistir por até 5 dias após a infecção.

Recentemente tem sido observada a presença de tosse seca, dispnéia, e

manifestações de asma brônquica em pacientes com esquistossomose aguda,

características do quadro de pneumonite (SOUZA, NETO e ANDRADE, 2009). A

morte das cercárias também pode provocar dermatites, com intensidade de

duração pequena. Dente 4 a 8 semanas, os sinais cutâneos desaparecem, marcando

o final do período de incubação e o desenvolvimento dos esquistossômulos. Os

sintomas de febre, anorexia, dores abdominais e cefaleia podem surgir de 3 a 7

semanas. O paciente pode ainda apresentar diarreia, náuseas, vômitos, tosse seca,

embora com menor frequência (DOMINGUES e DOMINGUES, 1994;

LAMBERTUCCI, SILVA e VOIETA, 2005; PORDEUS et al., 2008).

O abdome distendido e doloroso, ou a hepatoesplenomegalia podem ser

detectados por meio de exame físico. No diagnóstico laboratorial é revelado


Weber, C. R. 24

eosinofilia significativa, porém a conclusão do diagnóstico de esquistossomose

aguda é baseada na associação com outros dados, sejam clínicos e/ou

epidemiológicos. A fase aguda pode durar de 30 a 60 dias e caso o indivíduo não

seja submetido a tratamento específico, dá início à fase crônica. Neste momento, os

sintomas podem regredir, sendo observadas as manifestações clínicas tipicamente

intestinais. Os principais sinais característicos dessa fase são indisposição,

vertigem, anorexia, empachamento pós-prandial e surtos diarréicos, alternados por

constipação intestinal (LAMBERTUCCI et al., 2000; KATZ e ALMEIDA, 2003;

BARBOSA et al., 2004).

A forma crônica leve da esquistossomose se caracteriza pela eliminação de

ovos viáveis nas fezes, acompanhadas ou não de queixas discretas e inespecíficas.

Na forma hepatointestinal os sintomas intestinais são os mais recorrentes, embora

mais acentuados. O indivíduo infectado pode também apresentar anemia leve,

eosinofilia e carência nutricional, decorrentes da perda se sangue nas fezes

causadas pela atuação do parasito. Os granulomas podem ser observados no fígado

e alguns outros órgãos, tais como o intestino. Em contrapartida, a carga parasitária

é geralmente baixa, permanecendo assim em função da resposta imunológica

(DOMINGUES e DOMINGUES, 1994; REY, 2001; ANDRADE et al., 2008).

A forma hepatoesplênica da esquistossomose ocorre quando do

comprometimento das funções e do aumento do volume do fígado e do baço. Esta

forma clínica caracteriza-se como estacionária e de sintomatologia de pequena

intensidade. Entretanto, alterações anatômicas, fisiopatológicas e clínicas,

resultantes das lesões teciduais provocadas pelos ovos são observadas (MELO e

COELHO, 2005).

As formas mais graves ocorrentes em alguns indivíduos são caracterizadas

pela fibrose hepática, hipertensão portal, circulação colateral, varizes esofagianas,

hemorragias digestivas, fibrose periportal e ascite. Adicionalmente, a produção de

imunoglobulinas é estimulada dada a grande quantidade de substâncias

antigênicas. Em certos casos, a fibrose hepática periportal não apresenta sinais de

hipertensão porta. Cabe salientar que a hipertensão porta, a esplenomegalia, as

varizes esofagianas e a circulação colateral ocorrem como consequência do


Weber, C. R. 25

bloqueio da circulação pré-sinusoidal, justificado como resultado da formação de

tecido fibroso cicatricial dos granulomas. Com a redução do fluxo na região

drenada pela veia porta, há promoção de congestão da veia esplênica do sistema

porta, estimulando a hiperplasia das células do sistema macrofágico-linfocitário,

com diferenciação plasmocitária (MAGALHÃES FILHO e COUTINHO, 1960;

DOMINGUES e DOMINGUES, 1994; REY, 2001; ANDRADE et al., 2008).

2.1.4 Modelos experimentais

O estudo experimental da esquistossomose mansônica tem se desenvolvido

utilizando estudos com vários modelos animais como camundongos geneticamente

diferentes – outbred (ELSHEIKHA, HUSSEIN e RAHBAR, 2008), geneticamente

idênticos – inbred (OSMAN et al., 1994), livres de micro-organismos – germfree

(BECKER, 1983), com genes específicos não expressos – Knock-out (TORBEN et al.,

2012) tratados com citocinas ou com anticorpos anticitocinas (LENZI et al., 2008).

Além destes mais utilizados, outros modelos podem ser utilizados como o de

roedores, primatas e outros mamíferos como coelho (Silvilagus floridanus), gambá

(Didelphis marsupialis), entre outros.

É importante perceber que cada modelo experimental tem suas

peculiaridades e podem ser transpostas para a em relação aos processos

patológicos humanos, havendo certos cuidados. Cheever e colaboradores (2002)

teceram alguns comentários sobre o tema, afirmando que:

Nos camundongos a intensidade da infecção esquistossomótica é

muito alta. Um único par de vermes adultos em camundongos pode

equivaler a mais de mil pares em um humano. No entanto, as mais

intensas infecções humanas relatadas raramente apresentavam mais

que cinco casais por quilograma de peso corporal;

A infecção em camundongo é fruto de uma única exposição,

enquanto a infecção em humanos é adquirida gradualmente no

transcorrer dos anos;

A maioria dos humanos expostos à infecção nasce de mães que estão

ou foram infectadas. Assim, a exposição intra-uterina a antígenos ou a


Weber, C. R. 26

anticorpos antiidiótipos pode modificar a resposta a infecções

subsequentes;

A cronicidade das infecções em humanos é de difícil reprodução na

maioria dos modelos animais, o cálculo de tempo é incerto.

No entanto, desde muito cedo, o camundongo embora apresente infecção

por Schistosoma mansoni mais grave do que as habitualmente observadas em seres

humanos, é considerado bom modelo experimental para esta helmintose

(WARREN, 1966; ABDUL-GHANI e HASSAN, 2010). O próprio Cheever e

coloboradores, em estudo de 2002, afirmam que a linhagem de camundongos

Swiss, mais do que qualquer outro animal de experimentação, apresenta respostas

fisiológicas e anatomopatológicas semelhantes aos humanos. Além disso, oferece

variabilidade genética (não isogênicos), o que pode facilitar extrapolação dos

resultados.

Quase todos os estudos experimentais de esquistossomose em

camundongos, principalmente os de base imunológica, são realizados com animais

do mesmo sexo, geralmente fêmeas. As razões para isso são pragmáticas. Arranjos

com população do mesmo sexo são utilizados para prevenir as complicações da

gestação no projeto experimental, e as fêmeas são mais comumente usadas porque,

na maioria das espécies, no estabelecimento de uma "ordem social" não ocorre

qualquer estresse ou luta (ELOI-SANTOS et al. 1992). Além disso, a fisiologia da

resposta imune é bastante complexa, sendo susceptível a uma variedade de fatores,

incluindo as ações hormonais. Hormônios sexuais são conhecidos por

desempenhar um papel importante na modulação da resposta imune (AHMED,

DAUPHINEE e TALAL, 1985; GROSSMAN, 1985) e a capacidade dos hormônios

em afetar a resposta imunológica dirigida contra os agentes patogênicos tem

recebido atenção (HUGHES e RANDOLPH, 2001; VERTHELYI, 2001). Em geral,

verifica-se que as fêmeas desenvolvem resposta imune celular e humoral mais

intensa, com fisiopatologia elevada (tal como tamanho do baço e do fígado) em

comparação a animais machos (ELOI-SANTOS et al. 1992). Tal

hiperresponsividade pode ser benéfico em alguns casos. Em estudos com S.

mansoni a mortalidade mais elevada das fêmeas em função da sua maior


Weber, C. R. 27

susceptibilidade para o desenvolvimento de vermes adultos resulta em carga

parasitaria mais elevada que em machos, quando expostos a mesma quantidade de

cercarias (ELOI-SANTOS et al. 1992). O mecanismo de diminuição na resposta

inflamatória em camundongos machos infectados tem como hipótese o efeito tóxico

da testosterona sobre a cadeia respiratória mitocondrial do parasita (NAKAZAWA

et al 1997; FANTAPPIE et al 1999.). No entanto, essas diferenças também podem

ser um reflexo do dimorfismo sexual imunológico do hospedeiro, uma vez que as

fêmeas são conhecidas por terem uma maior imunidade que os machos

(BLAZKOVEC e ORSINI, 1976; NELSON e STEINBERG, 1987; MARTIN, 2000;

BOISSIER et al. 2003).

Assim, estes fatores indicam que o cuidado deve ser tomado na realização de

comparações gerais baseado em achados de níveis específicos de infecções

esquistossomótica em hospedeiros exclusivamente machos ou fêmeas (ELOI-

SANTOS et al. 1992).

2.1.5 Resposta imunológica na esquistossomose

É indiscutível a importância de conhecer os eventos imunológicos das

parasitoses. Inúmeros estudos descrevem os principais mecanismos na

esquistossomose mansonica, destacando a resposta imune celular e humoral do

hospedeiro vertebrado, as quais estão intimamente relacionadas ao

desenvolvimento e manutenção da doença, bem como a resistência à infecção ou

reinfecção (SCHRAMM e HAAS, 2010; CHEEVER et al., 2000; PEARCE e

MACDONALD, 2002; PEARCE, 2005; ARAÚJO et al., 1996; MALAQUIAS et al.,

1997; MONTENEGRO et al., 1999)

Na esquistossomose, o sistema imune do hospedeiro não lida apenas com

um patógeno multicelular, mas é, além disso, confrontado com os vários diferentes

estágios de desenvolvimento do parasita: cercárias, esquistossômulos, vermes

adultos e de ovos (SCHRAMM e HAAS, 2010).

Nesta doença, a resposta imunológica celular é dividida, didaticamente, em

algumas etapas. A exposição do hospedeiro às cercárias e aos esquistossômulos

consiste na primeira delas. Abrange o período de três a cinco semanas após a


Weber, C. R. 28

infecção e corresponde a penetração das cercarias e migração de

esquistossmômulos pelos tecidos (CHEEVER et al., 2000). Nesta etapa, a resposta

imunológica predominante é a do tipo Th1, observando-se a presença de Células

Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) produzindo grandes quantidades do

fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e Interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) (DE JESUS

et al., 2002). À medida que essas formas imaturas se desenvolvem, transformam-se

em parasitas adultos, copulam e produzem ovos, cinco a seis semanas após a

infecção, ocorre uma alteração considerável na resposta imunológica. Na

esquistossomose, curiosamente, os vermes adultos vivem no homem de 7 a 10 anos

e quase não causam reação inflamatória no seu hospedeiro (PEARCE e

MACDONALD, 2002), entretanto, seus ovos desempenham um papel essencial na

formação da resposta imune (PEARCE e MACDONALD, 2002). Os antígenos

solúveis do ovo induzem uma reação granulomatosa, considerada,

tradicionalmente, como uma resposta imunológica de hipersensibilidade tardia

(MATHEW e BOROS, 1986). O perfil imunológico que era predominantemente Th1

é substituído pelo predomínio da resposta Th2, induzida principalmente por estes

antígenos. Ao passar a barreira endotelial no local de deposição, os ovos são

imediatamente atacados por células do sistema imunológico, resultando na

formação de granulomas do tipo Th2 que consistem principalmente de células T

CD4+, eosinófilos, macrófagos, linfócitos, alguns neutrófilos e células gigantes

multinucleadas (RASO e NEVES, 1965; WEINSTOCK, 1992; BOROS, 1989; PEARCE

e MACDONALD, 2002), que podem levar à remodelação do tecido patológico e

fibrose (PEARCE, 2005) (Figura 2.2).

Outro fator importante é que após a infecção aguda, as lesões hepáticas

(granulomas) apresentam uma tendência a diminuir de tamanho. Este fato pode ser

explicado tendo como base uma redução no precesso inflamatório periovular. Tal

evento é denominado de modulação (ANDRADE eWARREN, 1964). Assim, a então

predominante resposta Th2 é a responsável por essa modulação, que age sobre a

produção dos mediadores pró-inflamatórios e suas funções efetoras (FLORES-

VILLANUEVA et al., 1993; CHEEVER et al., 2000; PEARCE e MACDONALD,

2002). Estudos afirmam que a hipossensibilidade aos antígenos do ovo ocorre


Weber, C. R. 29

devido a esta modulação das células T (STADECKER e FLORES-VILLANUEVA,

1992; FALCÃO et al., 1998). O mecanismo que diminui a resposta inflamatória

granulomatosa ao redor dos ovos está relacionado principalmente à produção de

Interleucina 10 (IL-10). Neste caso, também é possível observar uma elevação na

produção de interleucinas 4 e 13, bem como na síntese de IgE (WEINSTOCK e

BLUM, 1987, ARAÚJO et al., 1996; MALAQUIAS et al., 1997; MONTENEGRO et

al., 1999; SCHRAMM e HAAS, 2010).

Figura 2.2 – Desenvolvimento da resposta imune na Esquistossomose mansônica.

Fonte: Adaptado de PEARCE e MACDONALD, 2002.

Quando a infecção se torna crônica, durante doze semanas, há uma comum

modulação negativa do sistema imunológico caracterizado pela diminuição da

resposta Th2, juntamente com uma redução no número dos granulomas das células

T CD4+ existentes e no tamanho daqueles formados a partir desse momento

(PEARCE e MACDONALD, 2002).

O fato da resposta Th2 se desenvolver com o início da produção de ovos

sugere que a fase de ovoposição é responsável pela mudança Th2, embora tal

polarização já tenha sido relatada na fase de penetração das larvas infectantes na

pele do hospedeiro (JENKINS et al. 2005) e ter sido induzida também na fase pré-

patente, isto é, quando não há ovoposição (OLIVEIRA FRAGA et al. 2010).

Intensidade

da resposta imune

Semanas pós-

infecção

3 6 Infecção Aguda

8 12

Infecção crônica


Weber, C. R. 30

2.1.5.1 Citocinas na esquistossomose aguda

Apesar dos diversos estudos de cunho imunológico disponível na literatura,

não estão bem estabelecidos os mediadores imunológicos da patogênese da forma

aguda, nem contra que antígenos essa resposta está dirigida (SILVA, SANTANA e

DE JESUS, 2008). Acredita-se que antígenos dos esquistossômulos sejam

importantes nesta fase, uma vez que os sintomas aparecem antes do tempo

necessário para o desenvolvimento do verme adulto e ovoposição (CHEEVER,

HOFFMANN e WYNN, 2000). A hipótese mais aceita é que a resposta Th1

induzida pelos antígenos dos esquistossômulos numa primo-infecção induziria

uma resposta inflamatória exuberante contra o antígeno liberado pelo ovo. Com o

tempo, a IL-10 produzida em resposta a liberação de carboidratos da parede do ovo

levaria a modulação da resposta imune e dos sintomas. (SILVA, SANTANA e DE

JESUS, 2008).

Os linfócitos Th1 produzem IL-2, IFN-γ e linfotoxina (LT). A principal

citocina efetora Th1 (INF-γ) tem duas funções principais. Ela ativa macrófagos e

estimula a produção de IgG, que se liga aos receptores Fc de alta afinidade e a

proteína do parasito. A resposta dominante do sistema Th1 se associa

frequentemente a inflamação e lesão teciadual devido ao recrutamento e ativação

de leucócitos inflamatórios por TNF e INF-γ (LAMBERTUCCI, SILVA e VOIETA,

2008).

Em modelos experimentais, lesões hepáticas com formação do granuloma

foram associadas a TNFα. Alguns estudos relacionam também ao aumento da IL-1

e IFN-γ (DUSTIN et al., 1986; RITTER e MCKERROW, 1996; CHEEVER,

HOFFMANN e WYNN, 2000). Podendo ser encontradas também, inicalmente, as

IL-2 e IL-4 (YAMASHITA e BOROS, 1992).

Na fase de máximo diâmetro na formação do granuloma, há o inicio do

predomínio das citocinas IL-4 e IL-5 (CHENSUE et al., 1993), citocinas mais

marcantes do perfil Th2. A IL-4 constitui a maior indutora da produção de IgE,

desencadeando respostas mediadas por mastócitos (LAMBERTUCCI, SILVA e

VOIETA, 2008), além de promover regulação na formação do granuloma


Weber, C. R. 31

(YAMASHITA e BOROS, 1992; SILVA, SANTANA e DE JESUS, 2008). Já a IL-5

promove estimulação do recrutamento de eosinófilos, bem como atua na

proliferação e diferenciação de células B (WEINSTOCK, 1992; SHER et al., 1990;

SHER et al., 1990; WEINSTOCK, 1992). A produção destas duas citocinas pelo

mesmo sistema biológico se traduz na concomitância frequente de IgE e eosinofilia,

características das alergias e infecções helmínticas (LAMBERTUCCI, SILVA e

VOIETA, 2008). É importante enfatizar que a resposta imunológica frente aos ovos

de S. mansoni resulta, portanto, na formação de granulomas hepáticos e intestinais

que podem desencadear um quadro de fibrose nesses tecidos.

Na fase aguda há uma expressão mista de citocinas Th1 e Th2 com

predominância de Th1 na infecção precoce. As produções superiores e inferiores de

IFN e IL-10, respectivamente, comparando a esquistossomose aguda e crônica,

pode parcialmente explicar a falta de modulação da resposta imune em pacientes

agudos (Figura 2.3). Além disso, há um aumento de eosinófilos e uma diminuição

dos linfócitos T na percentagem de células do sangue. A contribuição de cada

população de células para a produção de citocinas em seres humanos ainda não

está estabelecida (CALDASA et al. 2008). Apesar de todos esses dados, poucos

estudos mostraram uma associação entre a sintomatologia clínica na infecção

aguda e os marcadores imunológicos que expliquem sua patogênese (SILVA,

SANTANA e DE JESUS, 2008).

Figura 2.3 – Cinética de citocinas da esquistossomose mansônica.

Fonte: Caldasa et al. (2008).

Infecção Aguda

Infecção Crônica

Meses pós-infecção

Ovos/g


Weber, C. R. 32

2.1.5.2 Citocinas na esquistossomose crônica

A patogênese da esquistossomose crônica já é bastante conhecida. Sobre ela,

já está caracterizada suas diferenças em indivíduos residentes de áreas endêmicas

ou não. Sabe-se que a grande maioria de indivíduos em área endêmica da

esquistossomose desenvolve a parasitose na forma crônica intestinal. Alguns

estudos atribuem aos mecanismos de modulação da resposta imune o

desenvolvimento desta forma clínica. Alguns estudos descrevem a modulação da

resposta de células T utilizando anticorpos anti-idiotipos (LIMA et al., 1986;

PARRA et al., 1991), a participação de células T CD8+ (DOUGTHY et al. 1982) e a

regulação mediada pela tão discutida IL-10 (MALAQUIAS et al., 1997; ARAUJO et

al., 1996; MONTENEGRO et al., 1999, SILVA, SANTANA e DE JESUS, 2008).

A modulação da resposta imunológica durante a fase crônica promove uma

prevalêcencia da eosinofilia, produção de anticorpos e citocinas, como IL-5 e IL-10

(COLLEY, 1975; SALLUSTO et al., 1998; FORSSMANN et al., 1997; SALLUSTO et

al., 1997; UGUCCIONE et al., 1997; MCLAREN, 1980; MAIZELS e

YAZDANBAKHSH, 2003).

Cabe salientar que várias citocinas produzidas pelas células Th2 tem ações

anti-inflamatórias. A IL-4 e IL-13 antagonizam-se com a ativação da ação ativadora

de macrófagos do INFγ e IL-10 suprime a ativação de macrófagos. Dessa forma, o

resultado da ativação da resposta Th2 é a inibição da inflamação, fato que sugere a

hipótese de que o sistema agiria menos como efetor e mais como regulador das

respostas imunológicas (LAMBERTUCCI, SILVA e VOIETA, 2008).

Estudos sobre a esquistossomose em humanos observaram estes eventos,

verificando a imunossupressão específica em esquistossomóticos crônicos (KITA e

GLEICH, 1996; JOSE et al., 1994; PEARCE e MACDONALD, 2002; SALLUSTO et

al., 2000). Um estudo em particular observou uma baixa resposta linfoproliferativa

em mais da metade dos indivíduos na fase crônica sem, no entanto, produção de

IFN-γ em resposta aos antígenos do S. mansoni ―in vitro‖. Por outro lado, as PBMC

produziram IL-4, IL-5 e IL-10 em resposta ao antígeno de verme adulto,

demonstrando expansão dos linfócitos Th2 (ARAÚJO, 1997)


Weber, C. R. 33

Varios são os estudos da fase crônica da doença em modelos animais, a

maioria em murinos. Autores como Wynn et al. (1993), Grzych et al. (1991), Pearce

et al. (1991), Cheever et al. (2000) e De Jesus et al. (2002) verificaram a regulação dos

níveis de citocinas do tipo Th2 em camundongos infectados pelo S. mansoni,

demosntrando que a ovoposição é o principal estímulo para a indução de uma

potente resposta das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13.

Um importante mediador da modulação na fase cônica, é sem dúvida a IL-

10, que ao atuar sobre a resposta Th1 desviando-a para Th2, promove uma inibição

na produção de IFN-γ e IL-2 (citocinas importantes na proliferação de células T e

na ativação de macrófagos). A hipótese mais aceita para esse mecanismo é a

imunossupressão, principalmente pela não ativação celular. A IL-10 parece agir

sobre os receptores das células apresentadoras de antígenos, mais especificamente

monócitos e macrófagos, promovendo a inibição de moléculas essenciais ao

mecanismo de apresentação antigênico, como a expressão de moléculas do

complexo de histocompatibilidade principal do tipo II (MHC classe II) além das

moléculas co-estimulatórias, como por exemplo, B7-1 e B7-2. Tudo isso culminaria

na ausência ou diminuição da apresentação dos antígenos e, por conseguinte, falta

de ativação celular. Esta inibição na ativação de células, por sua vez, resultaria na

ausência na produção de IL-2 e IFN-γ (KING et al. 1996; (FLORES-VILLANUEVA

et al. 1994 FIORENTINO et al. 1989; MOORE et al. 1990; FIORENTINO et al. 1991) e

GM-CSF (GROUX et al. 1996). Cabe salientar que a IL-10 inibe o IFN-γ produzido

pelas células Natural Killers, fato que justifica a modulação da resposta imune com a

polarização Th2 (KOS e ENGLEMAN, 1996). Em humanos, esse mesmo mecanismo

foi observado, no entanto, culminando também na supressão da IL-12 por

macrófagos (FIORENTINO et al., 1991; WAAL-MALEFYT et al. 1991). Estudos

referenciam que a IL-12 promove a produção de níveis elevados de IL-10, o que

parece ser um mecanismo regulatório (CHEEVER, HOFFMANN, WYNN 2000;

PEARCE e MACDONALD, 2002).

Muitos são os estudos sobre a IL-10 e seu papel na patogênese, na

modulação da resposta imune e na gravidade das lesões e da forma clínica. Em

humanos, a elevação dos níveis de IL-10 está correlacionada com as formas menos


Weber, C. R. 34

graves de parasitoses, mais especificamente na esquistossomose, a forma

hepatoesplênica está associada a altos níveis de TNF-α e baixos níveis de IL-5. No

modelo animal, a ausência da IL-10 foi relacionada ao aumento da fibrose hepática

e esplenomegalia (KING et al., 1993; MAHANTY et al., 1995; ARAÚJO et al., 1996;

MALAQUIAS et al., 1997; BOSSHARDT et al., 1997; MWATHA et al. 1997).

2.1.5.3 Marcadores imunológicos - Gravidade e fase de infecção

É fácil observar, através de estudos in vitro, que a intensidade da infecção

esquistossomótica pode ser influenciada pelos níveis de citocinas, no entanto, é

preciso levar em consideração a endemicidade da doença. Foi comprovada que

pacientes de área endêmica, os níveis de IFN-γ produzidos por PBMC são

inversamente proporcionais a intensidade de infecção. Outro ponto relevante é que

a intensidade da infecção pelo S. mansoni é de primordial importância para a

produção de IL-10 e, consequentemente, para o tipo de resposta desenvolvida

(GRZYCH et al. 1991; SILVEIRA et al. 2004).

A principal citocina Th2 responsável pela fibrose é a IL-13. No modelo

murino, a ausência desta interleucina faz com que os animais não desenvolvam a

fibrose hepática grave que normalmente ocorre durante a infecção, o que leva a

sobrevivência prolongada (FALLON et al. 2000). O mecanismo pelo qual a IL-13 é

capaz de promover a fibrogênese foi elucidada em uma série de estudos

(MODOLELL et al. 1995; HESSE et al. 2000; LEE et al. 2001; HESSE et al. 2001) e

tiveram implicações além do entendimento da patogênese da esquistossomose

como a utilização de terapias de bloqueio da IL-13 em outras doenças fibróticas.

Vale ressaltar que os mediadores associados a respostas Th1, como o Interferon-γ

(IFN-γ), IL-12, TNF e NO (Óxido Nítrico) podem prevenir a fibrose mediada pela

IL-13 (HESSE et al. 2001). Alguns estudiosos desta ciotocina, entretanto, não

encontraram diferença significativa em seu nível sérico entre o grupo com e sem

presença de ovos do parasita nas fezes.

Além é claro, da gravidade da infecção, esses marcadores imunológicos têm

sido associados com a susceptibilidade e a resistência às infecções no homem.


Weber, C. R. 35

Alguns estudos longitudinais foram realizados a fim de verificar tais associações.

Utilizaram, com maior frequência, a população escolar e sugeriram o envolvimento

da IL-10 como fator de risco para a reinfecção. Uma explicação palpável para esse

evento pode ser a diminuição mais vigorosa na resposta Th1 pela IL-10. Assim,

quanto menor a intensidade da resposta Th1 maior o risco de reinfecção pelas

cercárias. No entanto, os mecanismos que levam a IL-10 a promover uma falha na

imunidade em infecções subsequentes ainda não estão totalmente esclarecidos.

Outro estudo observou, ainda, que a citocina IL-5 apresentava-se mais elevada nos

indivíduos resistentes, possuindo um comportamento sérico inverso em relação aos

níveis de IFN-γ (VAN DEN BIGGEALAAR et al. 2002; MORVEN et al.1993).

Foi comprovado que as citocinas exercem um papel crucial na resposta

humoral, influenciando na produção de algumas classes e subclasses de anticorpos.

Um exemplo perfeito disso é o antagonismo da IL-4 e IFN-γ. Enquanto a IL-4

estimula a produção de IgG1 e inibie IgG2a pelos linfócitos B, o IFN-γ exerce

exatamente o contrário (SNAPPER e PAUL, 1987; STEVENS et al.1988;

FINKLEMAN et al.1990). A IL-12, IL-4 e IL-13 também pode influenciar a

imunidade humoral, uma vez que estimula e/ou modula a produção de IgE,

essencial na defesa contra infecções hilmínticas. O mecanismo não está claramente

elucidado, no entanto a modulação exercida pela IL-12 parece estimular a produção

de outras citocinas como IFN-γ e a IL-8 que poderiam suprimir secreção de IgE

(KING et al.1995). As citocinas do perfil Th2 IL-4 e IL-13 estimulam a produção de

IgG4, que por sua vez, parece também receber influencia de IL-10 e IFN-γ

produzidos por células TCD4 ainda sem diferenciação fenotípica Th1 ou Th2

(AKDIS et al. 1997; GASCAN et al. 1991).

Se por um lado, uma grande quantidade de estudos demonstraram a

importância da resposta imune celular e homoral, na esquistossomose, através do

perfil de citocinas produzidos pelas subpopulações de linfócitos TCD4+, por outro,

as variações que poderiam causar susceptibilidade e/ou resistência não foram bem

esclarecidas. Sabe-se que cada fase da infecção apresenta um perfil característico de

citocinas, e que a gravidade das lesões pode estar vinculada a variações nesses


Weber, C. R. 36

perfis. Fica claro então, que as citocinas exercem um importante papel regulador

em resposta a infecção pelo S. mansoni.

2.2 Translocação bacteriana

2.2.1 Generalidades

O trato gastrointestinal (TGI) é atualmente reconhecido como um sistema

cuja função não está apenas relacionada à digestão e excreção, mas também como

um órgão que atua como uma barreira contra micro-organismos e antígenos,

localizados em seu lumem. Tal função de barreira ocorre de modo tão eficiente que

apesar da densidade bacteriana no intestino, por exemplo, poder alcançar a ordens

de magnitude de até 1012 UFC/g de fezes, o sangue portal e linfonodos

mesentéricos se apresentam estéreis. Entretanto, o fato da flora endógena do TGI,

sob determinadas condições, poder representar uma fonte de sepse, gera

preocupação e tem sido foco de diferentes estudos ao longo das últimas décadas

(MacFIE, 2004).

Neste contexto, a translocação bacteriana (TB) pode ser definida como a

passagem de bactérias viáveis da flora gastrointestinal para áreas extraintestinais,

normalmente estéreis, tais como baço, fígado, rins, linfonodos e sangue. No

entanto, o termo foi expandido, podendo também ser aplicado à passagem de

micro-organismos não viáveis, partículas inertes e outras macromoléculas, por

exemplo, endotoxinas, pela barreira intestinal (BERG, 1992; ÇELIK et al., 2005).

A microbiota gastrointestinal saudável é essencial para a manutenção do

equilíbrio imunológico do hospedeiro. Esse fenômeno de ocorrência natural,

denominado por translocação fisiológica, garante certos benefícios com relação à

imunidade adquirida no organismo hospedeiro. Entretanto, a disseminação

extraentérica é impedida de ocorrer em função da barreira formada por células

mucosas. A segunda linha de defesa corresponde às propriedades mecânicas do

epitélio da mucosa intestinal, incluindo peristase (GABE, 2001; SALZEDAS-NETTO

et al., 2006; SINGH et al., 2011).

A definição de translocação bacteriana foi primeiramente discutida a partir

de um estudo com ratos, por Berg e Garlington (1979), embora a hipótese sobre o


Weber, C. R. 37

evento tenha sido formulada em 1891, quando foi demonstrado in vivo que

bactérias viáveis podiam passar através da parede intacta intestinal. No entanto, tal

hipótese só foi confirmada após a II Guerra Mundial. O critério aceito para

considerar a translocação é atribuído à presença de 100 ou mais bactérias entéricas,

por grama de tecido infectado. Estudos experimentais demonstraram diversos

fatores implicados no processo de translocação bacteriana, incluindo o estresse,

trauma cirúrgico, icterícia, cirrose, exposição à radiação, variações na motilidade

intestinal, uso de antibióticos e imunossupressores, entre outros (GUARNIER et al.,

1997; MacFIE, 2000; MacFIE, 2004; ÇELIC et al., 2005).

Em contrapartida, os critérios que definem a translocação bacteriana evocam

discordâncias no mundo científico. Em sua resenha, Steinberg (2003) discutiu os

principais achados considerados como reais evidências da translocação bacteriana,

a saber: 1- enterobactérias ou endotoxinas encontradas nos linfonodos mesentéricos

ou veia porta; 2- DNA ou proteínas bacterianas encontradas nos linfonodos

mesentéricos, veia porta ou no sistema circulatório; 3- presença de enterobactérias

em tecidos que deveriam estar estéreis; 4- desenvolvimento de sepse; 5- aumento

dos níveis de citocinas circulantes e mediadores inflamatórios; e 6 – aumento da

permeabilidade intestinal às macromoléculas.

2.2.2 Mecanismos e componentes da translocação bacteriana

Apesar de a literatura referenciar diferentes fatores preponentes para

translocação bacteriana, é consenso entre os autores que sua ocorrência pode ser

associada a três principais mecanismos: o aumento da flora intestinal, o estado

imunológico e o aumento da permeabilidade da mucosa intestinal. Neste contexto,

qualquer alteração de um ou todos esses componentes, pode favorecer a passagem

de bactérias ou endotoxinas para locais extraintestinais (Figura 2.4), acarretando

serias complicações (NAABER et al., 1998; GABE, 2001).

O aumento da microbiota intestinal compreende o principal mecanismo da

translocação bacteriana. O TGI contém uma grande variedade de bactérias aeróbias


Weber, C. R. 38

e anaeróbias, as quais impedem a colonização de micro-organismos patogênicos

exógenos, empregando diversos mecanismos, como por exemplo, o de barreira de

colonização, isto é, quando ocorre a formação de microambientes, nos quais o

oxigênio é consumido, criando um meio propício para o desenvolvimento de

anaeróbios estritos. Diferentes fatores estão envolvidos com a redução da função da

barreira de colonização, dentre eles, o uso de antibióticos orais, choque,

desnutrição, administração de nutrição enteral e parenteral, obstrução da vesícula e

mais recentemente depressão . Diversos micro-organismos podem ser translocados

pela membrana intestinal, entretanto sob razões de velocidade distintas.

Enterobactérias, tais como E. coli, K. pneumoniae e P. mirabilis translocam de forma

rápida, S. epidermidis de forma intermediária, enquanto geralmente os anaeróbios,

por exemplo, Bacteroides, Clostridium e Fusobacterium, em uma taxa muito lenta

(BERG, 1992; MacFIE, 2000; MacFIE, 2004).

Figura 2.4 – Rotas de translocação bacteriana do trato gastrointestinal

Fonte: Berg (1995).


Weber, C. R. 39

De acordo com Wiest e Rath (2003), diferentes componentes microbianos

estão envolvidos no processo de translocação. Alguns desses parâmetros

aumentam a razão do fenômeno e podem ser divididos, anatômico e

funcionalmente, isto é, nos fatores intrínsecos que influenciam no número e grau de

virulência das bactérias que translocam facilmente; nos fatores que interferem na

aderência, provocando danos epiteliais e favorecendo a penetração, por estresse

oxidativo, acidose ou depleção de ATP; e finalmente nos fatores relacionados à

resposta imune local e sistêmica do hospedeiro contra a translocação.

O estado imunológico consiste no segundo mais importante fator, implicado

com a translocação bacteriana. Em circunstâncias normais, as células translocadas

são fagocitadas antes de atingirem os linfonodos mesentéricos e/ou vasos

sanguíneos. No entanto, quando a resposta imunológica está comprometida por

alguma razão, como nos casos de asplenia, atimia, uso de imunodepressores e na

leucemia, o evento se manifesta de forma mais agressiva, podendo evoluir à sepse.

Entretanto, cabe ressaltar que mesmo relacionada à morbidade nesta condição

clínica, a translocação bacteriana não é considerada um elemento iniciador (BERG,

1992; MacFIE, 2004).

Estudos com roedores revelaram que a imunossupressão associada ao

aumento do crescimento microbiano, possui ação sinérgica na translocação

bacteriana. Além disso, a ausência do timo e do baço potencializam o evento,

revelando o papel das células T como mediadores da inibição da translocação.

Normalmente, as imunoglobulinas do soro agem como opsoninas, aumentando a

capacidade fagocítica dos macrófagos e leucócitos polimorfonucleados. Além disso,

IgA específicos presentes na superfície das mucosas intestinais podem participar da

reação de defesa contra a translocação, por impedirem a aderência de certos micro-

organismos, uma vez que precisam manter contato com a superfície da luz

intestinal para iniciar o processo de penetração. Tal mecanismo se mostrou muito

eficiente contra, por exemplo, V. cholerae e S. typhimurium (BERG, 1992; WIEST e

RATH, 2003; EVERETT et al., 2004).

Finalmente, como mencionado anteriormente, a mucosa intestinal intacta

configura uma barreira física contra a colonização de enterobactérias em áreas


Weber, C. R. 40

extraintestinais. Entretanto, estudos com animais experimentais revelaram que

certas substâncias podem promover esfoliação química da mucosa, tais como, ácido

ricínoleico e zimosan, estabelecendo meios para a ocorrência de translocação

bacteriana. Outras condições também podem favorecer esse processo, dentre elas,

choque hemorrágico e presença de endotoxinas, estimulando particularmente

macrófagos na liberação de mediadores que agem em reações de desordenação do

sistema homeostático (BERG, 1992; MacFIE, 2004).

Adicionalmente, a importância da camada mucosa como uma barreira

mecânica defensiva contra toxinas entéricas foi bastante discutida na literatura. No

entanto, certas enterobactérias, por exemplo, E. coli, em maior proporção que

bactérias não patogênicas, aproveitam-se da viscosidade e da elasticidade da

mucina, principal constituinte do muco, como matriz para adesão, tornando as

adesinas importantes fatores de virulência nesses micro-organismos (GUARNER et

al., 1997; KATAYAMA et al., 1997).

2.2.3 Alteração da resposta imunológica

Estudos têm demonstrando que a Translocação bacteriana (TB) é um

processo fisiológico e essencial na regulação da imunidade sistêmica e intestinal.

Esta conclusão foi obtida levando em consideração que a TB ocorre normalmente

em animais e humanos saudáveis, ainda que em pequena proporção (WIEST and

RATH, 2003; MACFIE, 2004b; SALZEDAS-NETO, 2006). A bactéria translocada

pode ser fagocitada antes de alcançar o linfonodo mesentérico ou vasos linfáticos,

assim, falhas nesse mecanismo de defesa poderia viabilizar a entrada e

sobrevivência da bactéria em sítios extra-intestinais distantes. Levando em

consideração esse mecanismo, é possível afirmar que a translocação bacteriana e

suas complicações ocorrem pela incapacidade do hospedeiro controlar o número

de bactérias presentes (MACFIE, 2004; SALZEDAS-NETO, 2006). Desse modo, o

processo é favorecido principalmente pelas citocinas antiinflamatórias, como IL-10

e TGF (ACHESON e LUCCIOLI, 2004). E atualmente, já é bastante evidenciado que

o intestino age como órgão liberador de citocinas (MOORE, 1999).


Weber, C. R. 41

É importante salientar a importância destes mediadores na resposta a

translocação. Ainda que a TB não seja detectável, o intestino modula uma resposta

sistêmica, não somente local, e as manifestações clínicas da sepse, por exemplo,

podem ser consequência da liberação dos mediadores inflamatórios e não somente

devido a lesão tissular bacteriana ou de seus produtos (MOORE, 1999).

2.3 Sepse e resposta imunológica

A sepse consiste em uma condição clínica extremamente séria, associada à

presença e persistência de micro-organismos patogênicos (bactérias e/ou fungos),

bem como suas toxinas no sangue. O percentual de mortalidade pode variar de 30 a

50%. Os sistemas de resposta imune inata e adquirida contribuem para a

patogênese da sepse, por conseguinte, uma resposta fisiopatológica complexa do

organismo pode envolver diferentes desordens, tais como, bacteriemia, síndrome

de resposta inflamatória sistêmica, choque séptico e falência múltipla dos órgãos. A

imunopatogênese da sepse é caracterizada por uma inflamação fulminante e

supressão da imunidade adaptativa. Embora ocorra ativação do sistema de

imunidade inato por micro-organismos e seus produtos, muitos aspectos da sepse

ainda precisam ser elucidados (WEIGHARDT e HOLZMANN, 2008).

Micro-organismos e hospedeiros coexistem em um frágil equilíbrio. Neste

contexto, o sistema imune rapidamente detecta organismos patogênicos invasores,

fagocitando-os e se necessário, evocando mecanismos da imunidade adaptativa,

minimizando a resposta sistêmica e a inflamação local. Para reconhecer organismos

invasores, diferentes células participam da resposta imune, por exemplo,

macrófagos, monócitos, granulócitos e células dendríticas, dotados de receptores

que reconhecem padrões não presentes no hospedeiro (ZWEIGUER; SCHUMANN

e WEBER, 2006).

Os receptores toll-like (TLR) representam o papel central na resposta aguda,

sendo capazes de reconhecer grande número de moléculas associadas à padrões do

patógeno (PAMP), bem como suas toxinas, denominadas por alarminas (DAMP),

como mostrado na Figura 2.5. Em resposta, ocorre a proliferação de inúmeras


Weber, C. R. 42

células, tais como polimorfonucleares, macrófagos, células dendríticas e células

epiteliais, somadas ao recrutamento de leucócitos através das citocinas. Dentre os

diferentes tipos de receptor toll-like, o receptor TLR4 é considerado como principal.

Esta estrutura é responsável pelo reconhecimento de lipopolissacarídeos contidos

nas membranas de bactérias gram-negativas, organismos comumente associados à

sepse (GOSEMANN et al., 2010).

Figura 2.5 – Complexidade da interação entre os receptores Toll-like (TLR) e patógenos (leveduras e bactérias). Componentes distintos da parede são reconhecidos por diferentes TRL. Bactérias gram-negativas expressam

exclusivamente lipopolissacarídeos, enquanto gram-positivas expressam ácido lipoteicóico.

Fonte: Van der Poll e Opal (2008)

A ativação dos TLR é crucial para a indução da resposta imune inata, uma

vez que estes receptores induzem resposta inflamatória por mecanismos mediados

por sinais promovidos pelo fator 88 de diferenciação da linhagem mieloide

(MyD88) e Toll/IL-1 indutor de interferon. Alguns estudos comprovaram que o

interferon não é essencial apenas na imunidade antiviral, mas também está

relacionado nas defesas contra Leshimania major, Listeria monocytogenes e

Streptococcus pneumoniae. Além disso, investigações utilizando animais

experimentais evidenciaram que a sinalização dos TLR através das vias MyD88 e


Weber, C. R. 43

Toll/IL-1 é importante para a indução da resposta hiper-inflamatória e do dano

celular durante a sepse (WEIGHARDT e HOLZMANN, 2008).

Segundo Davis et al. (2010), a resposta individual à infecção pode ser

influenciada por variações genéticas dentro do sistema imune. A interleucina 1β

(IL-1β) é a citocina pró-inflamatória secretada na fase inicial da resposta frente a

bactérias e protagoniza o papel mais importante na patogênese da sepse. Por outro

lado, os receptores do tipo Toll-like, localizados no retículo endoplasmático ou nas

vesículas citoplasmáticas, servem como sensores de diversas moléculas estranhas

ao organismo hospedeiro, tais como ácidos nucléicos e principalmente

lipopolissacarídeos.

As proteínas ligantes de lipopolissacarídeos (LBP) configuram a primeira

linha de defesa e ativação direta induzida por micro-organismos. Tais moléculas

são sintetizadas nos hepatócitos e liberadas como glicoproteínas com cerca de 58-

60-kDa. Outras fontes de LBP são as células presentes nos pulmões, intestinos,

artérias, coração e rins. A síntese de LBP é estimulada tanto por agentes infecciosos,

como por não infecciosos e a proteína tende a se ligar à parte anfipática do lipídio

A da parede celular do micro-organismo, facilitando o processo de monomerização

e subsequente apresentação aos sítios ligantes ativadores da imunidade celular e

humoral como CD14 e TLR4. A IL-1 regula a promoção do gene de síntese de LBP,

que pode ser também promovida pelo sinergismo da IL-1 com a IL-6 ou com o

Fator de Necrose Tumoral alfa (TNFα) (ZWEIGNER; SCHUMANN e WEBER,

2006).

O entendimento da resposta clínica a mediadores inflamatórios requer em

parte, o entendimento da terminologia usual para distinguir o espectro de

respostas clínicas. A síndrome da resposta inflamatória sistêmica, por exemplo,

descreve as manifestações da sepse, independentemente de sua etiologia

(HERDEGAN e BONE, 1992). Entretanto, a resposta inata pode ocorrer com a

interação das vias neural, endócrina, bioquímica e celular, restaurando a

hemostasia através da eliminação do patógeno, reparação do dano tecidual e

regulando a inflamação. A resposta inata funciona independentemente da resposta

imune adaptativa (STAVITSKY (2010).


Weber, C. R. 44

O avanço científico ao longo das últimas três décadas permitiu que o

conceito da mortalidade da sepse, como um resultado de uma resposta hiper-

inflamatória descontrolada, fosse modificado. Sabe-se que ao serem reconhecidos,

os PAMP desencadeiam uma série de eventos que culminam na resposta

inflamatória. Entretanto, a sepse é mais atribuída às alarminas, isto é, proteínas ou

enzimas extracelulares e outros mediadores microbianos que contribuem para o

dano tecidual, tais como lipopolissacarídeos da membrana, referidos como

endotoxinas. As toxinas são classificadas em três tipos: as do tipo 1, provocam

dano sem a necessidade de penetração na célula do hospedeiro, como ocorre nas

infecções por S. aureus e S. pyogenes. As do tipo 2, promovem dano celular,

permitindo o acesso do patógeno e disparam a resposta inflamatória, por exemplo

as hemolisinas e fosfolipases. Finalmente as toxinas do tipo 3, são exotoxinas

dotadas de componentes enzimáticos ativos binários, do tipo A/B, como a toxina

do V. cholerae (VAN DER POLL e OPAL, 2008).

Segundo Herdengen e Bone (1992), a exposição à endotoxinas induz direta e

indiretamente a ativação de diversos mecanismos do sistema imunológico,

envolvendo liberação de diferentes citocinas, betaendorfinas, fator ativador de

plaquetas, protaglandinas e leucotrienos, bem como ativação do sistema

complemento, da cascata de coagulação e de células de defesa, sumarizadas na

Tabela 2.1. As endotoxinas de bactérias gram-negativas foram mais estudadas e

discutidas na literatura, uma vez que são reconhecidas como os principais

mediadores exógenos da sepse.

Quadro 2.1– Mediadores de dano endotelial na sepse.

Mediador Efeitos principais relacionados

Fator de necrose tumoral alfa (TNFα)

Aumenta permeabilidade vascular; Inibe trombomodulina; Inibe atividade da lipoproteína lípase; Diminui incorporação da glicose; Estimula liberação da colagenase; Reduz potencial transmembrana da musculatura esquelética e cardíaca; Induz moléculas de histocompatibilidade do tipo I; Atua diretamente no hipotálamo, produzindo febre.

Interleucina 1 (IL-1) Estimula liberação de TNFα, IL-6, IL-8, PAF, LT, TXA2, prostaglandinas; Ativa linfócitos T; Auxilia a proliferação de células B; Promove citotoxicidade às células beta produtoras de insulina; Promove adesão das células endoteliais, polimorfonucleares, granulócitos, monócitos e linfócitos; Promove ativação e acúmulo de


Weber, C. R. 45

polimorfonucleares; Aumenta atividade pró-coagulante do endotélio; Promove liberação endotelial do inibidor da ativação do plasminogênio; Atua sinergicamente ao TNFα; Diminui atividade da lipoproteína lípase; Libera colegenase das células sinoviais; Promove liberação de acetilcolinesterase; Atua no hipotálamo, produzindo febre.

Interleucina 2 (IL-2) Promove liberação de TNFα e INFγ; Diminui pressão arterial.

Interleucina 4 (IL-4) Aumenta adesão de linfócitos às células endoteliais; Induz expressão de antígenos nos macrófagos; Diminui expressão de IL-8 dos mastócitos; Inibe a expressão de adesão de moléculas por TNFα, IL-1 e INFγ.

Interleucina 6 (IL-6) Ativa linfócitos T e B; Promove ativação e acúmulo de polimorfonucleares; Níveis aumentados apresentam correlação com mortalidade aumentada

Interleucina 8 (IL-8) É quimiotáxico de neutrófilos e linfócitos; Inibe adesão endotelial do leucócito.

Fator de Ativação de Plaquetas (PAF)

Estimula liberação de tnfα, LT e TXA2; Promove ativação de leucócitos e formação de radicais livres; Promove agregação plaquetária; Altera permeabilidade capilar; Estimula o influxo/efluxo de cálcio; Exerce efeito inotrópico negativo.

Leucotrienos (LT) LTB4

É quimiotáxico de neutrófilos; Aumenta permeabilidade capilar.

LTC4 e LTD4 Estimula liberação de PGI4

LTE4 Aumenta permeabilidade vascular; Diminui fluxo coronariano e contractilidade cardíaca; Aumenta resistência vascular pulmonar; Diminui fluxo sanguíneo mensentérico; Promove vasoconstrição.

Tromboxano A2

(TXA2) Promove liberação de EDRF; Promove agregação plaquetária e acúmulo de neutrófilos; Aumento da permeabilidade capilar; Promove vasoconstrição.

Protaglandinas PGE2

Inibe produção de IL-1; Baixas concentrações estimulam liberação de TNFα; Inibe mitose de células T e B; Promove vasodilatação; Promove catabolismo muscular; Age sinergicamente com PGI2, aumentando efeitos da serotonina e bradicinina na permeabilidade capilar; Atua no hipotálamo, produzindo febre.

PGI2 Inibe agregação plaquetária; Promove vasodilatação; Promove efeitos benéficos na perfusão tecidual no início da sepse.

INF-γ Aumenta a liberação de tnfα, IL-1 e IL-6; Atua com tnfα, potencializando efeito citotóxico; Estimula linfócitos B; Aumenta adesão endotelial dos linfócitos B; Aumenta liberação e acúmulo de polimorfonucleares; Induz moléculas de histocompatibilidade classe I e II; Atua no hipotálamo, produzindo febre.

Fator estimulante de monócitos e granulócitos

(GM-CSF)

Estimula fagocitose; Promove maturidade e aumenta a atividade de macrófagos.

Fator relaxador Relaxa musculatura lisa; Inibe agregação plaquetária.


Weber, C. R. 46

endotélio-derivado (EDRF)

Endotelina 1 (ET-1) Promove vasoconstrição; Aumenta resistência glomerular; Promove liberação de EDRF e PGI2.

Sistema complemento

C3a

Promove desgranulação e liberação de mediadores vasodilatadores; Libera TXA2 e PGI2; Promove contração da musculatura lisa e secreção de muco.

C5a Promove desgranulação e liberação de mediadores vasodilatadores Libera TXA2 e PGI2; Promove liberação de TNFα; Aumenta ativação, migração, aderência e agregação de polimorfonucleares; Produz hipotensão.

Polimorfonucleares Promovem liberação direta ou indireta da maioria dos mediadores descritos anteriormente; Liberam radicais livres durante degranulação; Formam microêmbolos durante a agregação.

Molécula de adesão endotelial de

leucócitos (ELAM-1)

Atuam como ligantes de receptores nas células inflamatórias; Atraem linfócitos.

Moléculas de adesão intracelular

de leucócitos (ICAM-1)

Atraem linfócitos B e neutrófilos para o endotélio vascular; Mediam ligação de linfócitos B e neutrófilos no endotélio vascular.

Plaquetas Promovem liberação de EDRF e PGI2; Induz vasoconstrição e estimula neutrófilos.

Fatores de coagulação Bradicinina

Promove liberação de EDRF e PGI2.

Trombina Estimula liberação de PAF; Promove liberação de EDRF, ET-1e PGI2;

Media ativação de IL-8.

β-endorfina Causa hipotensão e hipoinsulismo. Fonte: Herdegen e Bone (1992)

O fator de necrose tumoral alfa (TNFα), um hormônio polipeptídico de 17-

kDa, é o primeiro e mais estudado mediador não específico na cascata inflamatória,

em resposta ao choque séptico, induzido por agentes como lipopolissacarídeos.

Estudos com animais experimentais comprovaram que a injeção de endotoxinas

promoveu a rápida liberação pelos macrófagos, em poucos minutos e com picos em

duas horas. Além dos macrófagos, o TNFα também é sintetizado pelos linfócitos,

natural killers, astrócitos, células microgliais do cérebro, células de Kupffer do

fígado, ligando-se preferencialmente a receptores localizados nos rins, pulmões e

fígado de mamíferos (HERDEGEN e BONE, 1992).


Weber, C. R. 47

A IL-1 é associada aos estados febris, apresentando bastante semelhança com

o TNFα. São produzidos por células como natural killers, linfócitos T e B,

queratinócitos, astrócitos, células microgliais, epiteliais, mesenquimais e tecidos

vasculares. No entanto, são monócitos e macrófagos as fontes primárias na sepse. O

endotélio vascular parece ser o primeiro alvo submetido às modificações induzidas

pela IL-1 na sepse, embora outros órgãos também sofram influência (HERDEGEN e

BONE, 1992).

Em ratos, os linfócitos e subpopulações deles, CD4+, CD8+ e CD56+, assim

como natural killers, mostram forte influência no curso da sepse. A diminuição da

razão CD4/CD8, por exemplo, está associada à diminuição da incidência de

falência múltipla dos órgãos, enquanto a mortalidade aumenta com o incremento

dos níveis de natural killers (GOSEMANN et al., 2010).

Bogaert et al. (2010) verificaram em camundongos a importância do sistema

complemento na sepse. O sistema complemento responde por eventos ligados à

opsonização, ao recrutamento de leucócitos e na ativação da lise de bactérias,

envolvendo interações entre a imunidade inata e adquirida, complementando os

achados de Van der Poll e Opal (2008) que revelaram o papel de C3a, C4a e

principalmente, C5a na inibição da apoptose de neutrófilos e timócitos, concluindo

que a apoptose desregulada é responsável pela maior parte da mortalidade

relacionada à sepse.

As cápsulas em certas bactérias são consideradas importantes fatores de

virulência implicados nas infecções fulminantes, principalmente em organismos

asplênicos. Recentemente, Lammers et al. (2011) demonstraram um mecanismo de

resposta imune inata e adaptativa contra linhagens de S. pneumoniae não

encapsuladas. Os autores observaram que nestes casos, outros importantes fatores

de virulência foram identificados e os micro-organismos foram depurados, mesmo

em camundongos esplenectomizados.

Rogero et al. (2004) observaram uma elevada correlação entre a concentração

da glutamina na musculatura esquelética e no plasma com a sobrevivência à sepse.

A diminuição desta concentração ocorre em função do aumento da taxa de

degradação proteica.


Weber, C. R. 48

Van der Poll e Opal (2008) observaram que o sistema nervoso colinérgico e

em particular o nervo vago limita a resposta inflamatória. A acetilcolina suprime a

produção de citocinas pró-inflamatórias por uma ação específica nos receptores

colinérgicos α7, nos macrófagos de camundongos. Uma disfunção neste processo

rende efeitos importantes relacionados à toxicidade de lipopolissacarídeos e eleva

significativamente o índice de mortalidade.

2.4 O baço

2.4.1 Características gerais

O baço murino, mostrado na Figura 2.6, caracteriza-se como um órgão mole,

alongado, com aspecto esponjoso, de coloração púrpura a preto azulado, localizado

no quadrante superior do abdômen, adjacente à curvatura maior do estômago, na

região do hipocôndrio esquerdo, diretamente abaixo do diafragma. Ao ser

seccionado, o baço apresenta uma forma parcialmente triangular. As dimensões e

peso do órgão, bem como a razão entre as massas esplênica e corporal, variam de

acordo com a idade. Camundongos apresentam baços maiores que ratos, os quais

possuem uma razão entre as massas esplênica e corporal de 0,2% (CESTA, 2006).

Figura 2.6– Detalhes da anatomia de roedores, destacando a localização e morfologia do baço (os números indicam linfonodos).

Fontes: Van den Broeck; Derore e Simoens (2006); Cesta (2006); Linden; Ward e Cherian (2012)


Weber, C. R. 49

Os roedores, particularmente os camundongos, são bastante empregados em

diferentes experimentos científicos, e as razões para que sejam considerados

animais preferenciais, decorrem da grande variedade e da possibilidade de

produção de diferentes linhagens, aliados à elevada taxa de reprodução (VAN DER

BROECK; DEDORE e SIMOENS, 2006). Entretanto, baseado na premissa de que os

resultados obtidos em animais podem ser extrapolados para humanos, ressalta-se a

necessidade de reconhecer e considerar particularidades entre as espécies, no

tocante das características biológicas relevantes, tais como, diferenças estruturais e

funções do sistema imunológico (HALEY, 2003). No Quadro 2.2, estão

apresentadas algumas destas diferenças.

Quadro 2.2 – Características estruturais e funcionais do baço em roedores.

Características Camundongo Rato

Embriogênese 12º,5 dia de gestação 15º dia de gestação

Primeiras células hematopoéticas

15º,5 dia de gestação 17º dia de gestação

Perfil histológico Uniforme Uniforme

Contração e expansão da musculatura lisa

Pouca Pouca

Ramificações da artéria esplênica

ND Até 8

Sinos venosos Não Sim

Hematopoese extramedular

Ativa durante toda a vida

Menos prevalente*

Polpa branca Grande e com menos distinção entre folículos, zona marginal e estruturas relacionadas

Menor* e bem delineada. A zona marginal corresponde a 28% do tamanho total

Sino marginal Menos delimitado Mais perceptível*

Potencial em sofrer mutações

Alto Baixo*

Células B 1/4 na zona marginal 1/3 na zona marginal

Imunoglobulinas IgG1, IgG2a, IgG2b IgG1, IgG2a, IgG2b, IgGc, IgG3, IgG4

Células Natural Killer Pico de atividade entre 4ª e 10ª semana de vida

ND

Fontes: Haley (2003) e Cesta (2006) * comparado ao camundongo ND- Não disponível na literatura consultada


Weber, C. R. 50

Do ponto de vista evolutivo, o baço primeiramente ocorreu nos répteis,

atingindo maior complexidade nos mamíferos. Durante a embiogênese, o órgão se

desenvolve como um espessamento do mesoderma e as primeiras células que

colonizam o baço são linhagens progenitoras eritroide e mieloide, contribuindo

com a função hematopoética lienal. Enfatiza-se que a hematopoese extramedular é

característica de roedores, ocorrendo durante toda a vida, particularmente em

camundongos. A seguir, células indutoras de tecido linfoide, fenotipicamente

identificadas como CD4+, CD3‾ e CD45+ se apresentam, porém ainda no órgão

imunologicamente imaturo. Estas mesmas células também podem induzir o sinal,

cujo resultado é o desenvolvimento dos linfonodos. No entanto, a formação dos

linfonodos é dependente de interações moleculares distintas daquelas envolvidas

na formação do baço (PEITZMAN et al., 2001; MEBIUS, 2003; MEBIUS e KRAAL,

2005).

Histologicamente, o baço é revestido por duas camadas: a primeira, serosa,

formando a cápsula externa em praticamente toda a víscera, e uma segunda

camada, de tecido conectivo de natureza fibroelástica, que se prolonga, para o

interior do órgão e ao redor dos vasos, formando a trabécula. A cápsula e a

trabécula juntas formam um suporte tridimensional que confere certa rigidez ao

baço (HALEY, 2003; CESTA, 2006).

O baço é formado por dois lobos, superior e inferior, entretanto, um terceiro

lobo, denominado acessório, pode se apresentar. As zonas de vascularização se

dividem em três: periférica, contendo penicílios de arteríolas e vênulas;

intermediária, formada por vasos segmentares e subsegmentares e finalmente a

zona do hilo, contendo vasos lobares e segmentares. A artéria e veia esplênica são

notáveis pelo grande calibre, em proporção ao volume total do órgão (Figura 2.7).

Essencialmente, o baço está organizado em um complexo sistema vascular arterial,

semelhante a uma árvore, no qual, as arteríolas terminam em um sistema sinosoide

venoso. Em roedores, algumas dessas arteríolas se comunicam no sino marginal,

isto é, a região entre a polpa branca e a adjacência da zona marginal, onde outros

vasos se comunicam para formar o sistema venoso da polpa vermelha (LIU et al.,

1996; McCLUSKY et al., 1999; PEITZMAN et al., 2001; MEBIUS e KRAAL, 2005).


Weber, C. R. 51

Figura 2.7 – Sistema vascular do baço: distribuição de acordo com os vasos hilares.

Fonte: Campos Christo (2005)

O interior do baço é constituído pela região da polpa, composta por

compartimentos funcional e morfologicamente distintos. Esta região consiste um

fino retículo de fibras contínuo, gerando uma massa mole, distribuída sob duas

fases: a polpa vermelha, compreendendo, em média, 70-75% da massa total, e

constituída por uma trama de fibroblastos, colágeno, macrófagos e linfócitos. Os

25-30% restantes representam a polpa branca, isto é, diversos compartimentos

linfoides, ricos em células B e T (Figura 2.8). Finalmente, a região intermediária

entre a polpa vermelha e a polpa branca é conhecida por zona marginal

(McCLUSKY et al., 1999; MARIEB, 2003; CESTA, 2006).

Figura 2.8 – Estrutura da polpa branca de roedores: camundongo (A) e rato (B)

Fonte: Cesta (2006)


Weber, C. R. 52

É importante salientar que os camundongos apresentam a polpa branca

proporcionalmente maior que os ratos. A área de transição entre a polpa vermelha

e a polpa branca é denominada por zona marginal, região na qual ocorre o trânsito

de células hematopoéticas em ambas as direções (McCLUSKY et al., 1999; MARIEB,

2003; CESTA, 2006).

As características particulares de cada um dos compartimentos esplênicos

estão intimamente relacionadas à função esplênica, discutida na seção 2.4.3.

Polpa vermelha

A região da polpa vermelha dos roedores é composta por uma rede

tridimensional de cordas e sinos venosos. As cordas são compostas por fibras

reticulares, células reticulares e macrófagos associados. As células reticulares são

consideradas miofibroblastos e podem participar da contração esplênica. Nos

espaços entre as cordas ocorrem diversas células sanguíneas, incluindo eritrócitos,

granulócitos e células mononucleadas circulantes (Figura 2.9). A hematopoese

também é comum. Além disso, nota-se um número significativo de linfócitos,

células plasmáticas e plasmoblastos que migram dos folículos e da bainha linfótica

periarterial (PALS), após diferenciação. Os macrófagos nesta região são ativamente

fagocíticos e alguns pigmentos podem estar presentes, tais como, hemossiderina e

ferritina. Nos ratos negros, a melanina também é observada (SAITO et al., 1988)

Figura 2.9 – Células hematopoéticas: polpa vermelha de camundongo - 20 semanas.

Fonte: Cesta (2006)


Weber, C. R. 53

Polpa branca

A região da polpa branca está subdividida em folículos e bainha linfótica

periarterial, composta por linfócitos, macrófagos, células dendríticas, células

plasmáticas, arteríolas e capilares, organizados numa trama reticular similar à

observada na polpa vermelha. Como as arteríolas centrais penetram na polpa

vermelha, tais estruturas são circundadas pela bainha linfótica, composta por

linfócitos e camadas concêntricas de fibras e células reticulares. A bainha linfótica

está dividida em interna e externa. A primeira compreende uma região dependente

de células T, CD4+ em maior número que CD8+, além de células dendríticas e

células B em trânsito. A bainha linfótica externa é composta de linfócito B e T, de

menor tamanho, assim como macrófagos e células plasmáticas, sob estimulação

antigênica. Os folículos ocorrem na região de bifurcação da arteríola central. Estas

estruturas são primariamente compostas por células B e poucas células dendríticas

e CD4+, e tipicamente não contém CD8+. Adicionalmente, os folículos contêm

centros germinativos, estimulados por antígenos, os quais formam macrófagos e

células B apoptóticas (CESTA, 2006).

Zona marginal

A zona marginal é uma importante área de trânsito contínuo e eficiente de

células hematopoéticas, do sangue para a região da polpa branca, em um processo

ativo que envolve sinalização através de receptores acoplados à proteína G. Por

constituir uma área de transição, a zona marginal abriga uma grande quantidade

de células, cujas propriedades podem ser únicas, bem como serem dependentes

umas das outras, de acordo com sua localização, como apresentado na Figura 2.10

(MEBIUS e KRAAL, 2005).

Particularmente, duas espécies de macrófagos específicos são encontradas

nesta região: macrófagos da zona marginal, maiores em tamanho, e distribuídos ao

longo da região mais externa, caracterizados por expressarem proteínas de

reconhecimento típicas, DC-SIGN e MARCO (receptor com estrutura colágena de

macrófagos). O segundo tipo compreende os macrófagos metalofílicos da zona


Weber, C. R. 54

marginal, localizados próximos à polpa branca e caracterizados pela expressão de

sialoadesinas do tipo SIGLEC1 (MARTIN e KEARNEY, 2002).

Figura 2.10 - Zona marginal e localização de suas espécies celulares.

Fonte: Mebius e Kraal (2005)

2.4.2 Baço: etiologia e contexto histórico

Para os gregos, o nome do baço, splén, é um termo derivado dos vocábulos

splanchonon e spaw, cujos significados, são respectivamente, viscoso e remover, uma

vez que os antigos acreditavam que tal ―órgão viscoso removia as impurezas do

sangue‖. Splén tornou-se, por exemplo, a raiz para spleen (inglês) e esplênico

(português). Os latinos empregavam para denominar o órgão, o termo lien,

derivado do grego. Entretanto, as duas palavras encontram origem no sânscrito.

Atualmente, o conhecimento das funções do baço está consolidado, e serão

discutidas mais adiante. Entretanto, por um longo período na história, o órgão

esteve cercado por grande mistério e envolvido em diversos mitos e fábulas. Na


Weber, C. R. 55

Babilônia, por exemplo, o Talmud discute a anatomia, a função e as patologias

esplênicas, considerando o baço (tehol) um dos dez órgãos comandantes da alma.

Não há menção do órgão na Bíblia, entretanto, o Midrash hebreu cita a

esplenectomia em duas situações: o conhecimento sobre a sobrevivência de uma

ave, cujo baço perfurado tenha sido extirpado e o ataque de Adonijah contra o

trono de Salomão após a morte de Davi. Neste assalto, 50 homens sem o baço

foram utilizados, baseado no fato da potencialização da força após a remoção do

órgão (ROSNER, 1995; McCLUSKY et al., 1999; MORGENSTERN, 2006; ROSNER,

1995; PEITZMAN et al., 2001).

A palavra melancolia tem origem histórica relacionada ao baço (Melanós

preto e Kholi, bile, isto é, bile negra). Acreditava-se que o órgão era responsável

pela remoção desta doença no corpo. Tal pensamento era extremamente

consolidado entre os povos antigos, que permitiu aos gregos, a elaboração da teoria

dos quatro humores: fleumático, sanguíneo, colérico e melancólico, este último

relacionado à bile negra (REZENDE, 2004; O’SULLIVAN, 2009). A medicina

humoral representava uma doutrina cercada de muito empirismo, resultante da

combinação entre filosofia, astrologia e medicina. A teoria associava características

da personalidade, qualidades, órgãos-alvo, estações do ano e as fases da vida do

homem, aos quatro elementos.

Acreditava-se que os humores eram produzidos na segunda digestão,

processada no fígado. De acordo com a teoria, cabia à bile negra, receber o sangue

mais pobre de nutrientes e por isso, deveria ser escassa no organismo, contudo,

muito concentrada no baço, cuja principal função era depurar a melancolia do

organismo. Outras atribuições funcionais lienais eram relacionadas à formação de

ossos e dentes, bem como o estímulo do apetite, a formação de coágulos e a

solidificação das fezes (WILLS, 1999; MCCLUSKY et al. 1999). Os principais

momentos históricos e da pesquisa sobre o baço estão sumarizados no Quadro 2.3.

Apesar de todo o contexto filosófico exposto, concernente à importância e

função esplênicas, implicadas na saúde, temperamento e constituição física de um

indivíduo, o baço, ironicamente reconhecido como um dos dez principais órgãos,


Weber, C. R. 56

cujo sorriso abrigava, foi considerado sem valor e dispensável, sendo negligenciado

por mais de 2000 anos (PLEITZMAN et al., 2001).

A estrutura física do baço fez com que Hipócrates (c. 460-377 AC) tenha sido

o primeiro investigador a sugerir que o órgão poderia prevenir doenças, dada sua

propriedade de absorver fluidos indesejáveis no organismo. Posteriormente, Platão

(c. 428-348 AC) descreveu a relação do baço com o fígado, aumentando a crença de

que o primeiro não tinha muita importância. Erasístrato (355-230 AC) foi o

primeiro a defender a tese de que o baço não era essencial, inspirando Aristóteles

(384-322 AC) a argumentar o possível papel esplênico na digestão. Por outro lado,

Galeno (131-200), baseado em exaustivos estudos da arquitetura lienal, acreditava

no mistério que envolvia o órgão, atribuindo-lhe a função de remoção da

melancolia (McCLUSKY et al., 1999; McCLUSKY et al., 1999).

Uma abordagem técnico-científica e menos filosófica, visando esclarecer as

funções reais do baço, obteve maior destaque a partir do século XIX. No entanto, a

história da cirurgia esplênica, realizada desde antes da era cristã, contribuiu de

forma significativa para este esclarecimento. Seu reconhecimento definitivo

completará 60 anos em 2012, na celebração do clássico artigo de King e Schumacker

de agosto de 1952 (PLEITZMAN et al., 2001).


Weber, C. R. 57

Quadro 2.3 – Principais destaques na história e pesquisa do baço*. Ano Investigador Observações, descobertas ou relatos

Id.Antiga Hipócrates Sugeriu que o baço poderia prevenir doenças, por absorver fluidos indesejáveis do organismo.

Id.Antiga Platão Descreveu o órgão como secundário e relacionado ao fígado.

Id.Antiga Erasístrato Postulou o baço como órgão não essencial.

Id.Antiga Aristóteles Especulou as possíveis funções digestivas do baço.

Id.Antiga Galeno Descreveu o baço como um órgão cuja função é a remoção da melancolia.

Século I Plínio Recomendou a excisão do baço com ferro em brasa como modo de melhorar o desempenho de corredores profissionais.

1543 Versalius Descreveu em detalhes a arquitetura do baço, contestando a teoria galênica.

1549 Zaccarelli Realizou a primeira esplenectomia no ocidente.

1665 Malpighi Classificou o baço como um órgão com propriedades secretórias glandulares.

1680 Zambeccari Primeiro relato sobre a sobrevivência de animais submetidos à esplenectomia total.

1696 Ruysch Observou similaridades do baço com as glândulas tireoide, adrenal e linfática.

1700 Blackmore Modernizaram a teoria galênica, incluindo hipocondria e histeria como doenças relacionadas ao baço.

1708 Leeuwenhoeck Descreveu características microscópicas de amostras de baço.

1847 Von Kölliker Descobriu a função hematopoética do baço.

1854 Gray Publicou a monografia The structure and use of the spleen, laureada com o prêmio Astley Cooper

1864 Wells Primeira esplenectomia realizada com abertura do abdomem.

1866 Bryant Realizou a primeira esplenectomia em paciente portador de leucemia.

1892 Johnson Realizou a primeira esplenectomia com sucesso em paciente portador de ruptura por trauma mecânico.

1913 Aschoff Desenvolveu o conceito do baço como órgão de defesa imunológica contra infecções microbianas.

1916 Kaznelson Realizou a primeira esplenectomia em um paciente portador de púrpura.

1919 Morris Provaram, em ratos, a importância do baço na resistência às infecções.

1923 Volkmann Sugeriu a viabilidade da esplenectomia parcial em humanos.

1939 Buchbinder Relataram o fenômeno de esplenose em um paciente com baço lesionado por trauma.

1952 King Artigo histórico, no qual, os autores discutiram a evolução da septicemia fulminante subsequente à esplenectomia em crianças.

1969 Diamond Descreveu e nomeou a septicemia clássica em indivíduos esplenectomizados (OPSI).

1975 Shafir et al. A partir do relato de caso dos autores, os procedimentos que conservam o baço são adotados definitivamente em diferentes hospitais no mundo.

1991 Delaitre Modernizaram o conceito de cirurgias esplênicas, introduzindo a laparoscopia. * dados reunidos de diversas fontes.


Weber, C. R. 58

2.4.3 Funções esplênicas

Grande parte do conhecimento a respeito das funções baço foi baseada em

estudos realizados com roedores. O baço compreende a combinação dos sistemas

de imunidade inata e adaptativa, em um único compartimento, caracterizando-o

como o maior órgão linfoide (MEBIUS e KRAAL, 2005). De acordo com as

características particulares das três regiões funcionais, isto é, polpa vermelha, polpa

branca e zona marginal, o baço apresenta as seguintes funções:

Filtração sanguínea

A estrutura e organização especializadas da polpa vermelha atribuem à esta

região a propriedade de filtração. Ao chegar ao baço, o sangue atravessa o tecido

esplênico, sendo comprimido nos pequenos poros entre as células endoteliais, para

ganhar acesso à circulação venosa. Os elementos circulantes são expostos a uma

densa rede de células fagocitárias, sendo filtrados e/ou removidos. Neste cenário

são detidos xenobióticos e células defeituosas ou envelhecidas (WEISS, 1991;

CESTA, 2006; TARANTINO et al., 2011).

Regulação da função eritrocitária

A arquitetura da polpa vermelha também permite o estabelecimento de um

cenário propício para a mediação da função eritrocitária. Aproximadamente cerca

de 90% do fluxo esplênico é recebido nesta região, e os eritrócitos retidos são

tratados por dois mecanismos denominados por culling e pitting. O mecanismo de

culling compreende fagocitose dos eritrócitos danificados e senescentes, enquanto

que o pitting envolve a remoção de inclusões eritrocitárias (Figura 2.13), mantendo

a atividade do eritrócito. Dentre as inclusões removidas, os corpúsculos de Howell-

Joly, corpúsculos de Heinz e corpúsculos de Pappernheimer ganham destaque.

Adicionalmente, os esferócitos, eritrócitos falciformes, eritrócitos e plaquetas


Weber, C. R. 59

complexados à IgG, bem como certos parasitas eritrocitários, como o Plasmodium,

também podem ser eliminados pelo processo de pitting (PEITZMAN et al., 2001).

Figura 2.11 – Eritrócitos contendo pits característicos, destacados pelas setas

Fonte: Di sabatino; Carsetti e Corazza (2011)

Metabolismo do ferro

A eritrofagocitose é importante no processo de reciclagem de ferro. Os

eritrócitos são hidrolisados pelos macrófagos, cujos receptores específicos CD163,

participam da liberação do grupo heme após a degradação proteolítica da

hemoglobina, posteriormente catabolisada em biliverdina, CO2 e Fe2+. O íon ferroso

pode ser estocado como ferritina nos macrófagos e sua liberação é regulada pela

necessidade da medula óssea, por um mecanismo ainda não elucidado (MEBIUS e

KRAAL, 2005).

Estoque

Além de virtualmente funcionar como um tecido de estoque de ferro, a

polpa vermelha dos camundongos atua como reservatório de eritrócitos e por cerca

de 30% das plaquetas, as quais são liberadas na circulação sob estímulos

apropriados, por exemplo, após o aumento dos níveis de epinefrina. As plaquetas

são os maiores carreadores de serotonina no sangue, um neurotransmissor

envolvido na modulação de células T e proliferação de células Natural Killer

(LESURTEL et al., 2006; DE PORTO et al., 2010;(MEBIUS e KRAAL, 2005; SWIRSKI

et al., 2009).


Weber, C. R. 60

Hematopoese extramedular

A estrutura da região linfoide do baço está organizada em compartimentos

contendo células T e B, circundados por vasos, semelhante à estrutura de um

linfonodo. Neste contexto, o baço pode ser considerado um órgão hematopoético,

uma vez que é capaz de produzir linfócitos (CHADBURN, 2000; DE PORTO et al.,

2010).

Em roedores, o baço é um órgão hematopoético particularmente nos fetos e

neonatos, entretanto a hematopoese esplênica é mais prevalente nos camundongos

do que em ratos. Nos fetos desses animais, as primeiras células hematopoéticas

surgem antes do 20º dia de gestação. Os primeiros linfócitos são células T, que se

acumulam na região da bainha linfótica periarterial a partir do segundo dia de

vida. O número de linfócitos detectados na polpa branca diminui com a idade. Por

conseguinte, a hematopoese extramedular tende a reduzir nos animais adultos,

porém pode ser incrementada quando há aumento da demanda dessas células, em

casos de anemia, inflamação, redução da hematopoese medular ou neoplasias

(CESTA, 2006)

Resposta imunológica

A compreensão da atividade imunológica em roedores avançou

significativamente ao longo dos últimos 50 anos e sabe-se hoje que o baço pode

conter aproximadamente um quarto de todos os linfócitos, podendo iniciar a

resposta imune contra diferentes antígenos veiculados pelo sangue. Todas as três

regiões esplênicas estão envolvidas no processo, e respondem de forma específica

aos estímulos gerados. Além dos antígenos, as células dendríticas e os linfócitos

penetram no baço através da artéria esplênica aferente e posteriormente atravessam

a zona marginal, contendo macrófagos específicos, bem como células B, antes de

alcançarem a polpa branca, rica em células T, na bainha linfótica periarteriolar

(PALS) e de células B, nos folículos (NG e CHALASANI, 2010).

A trama característica da arquitetura da polpa vermelha permite a retenção e

identificação, por exemplo, de determinados patógenos, em particular, bactérias

encapsuladas. O processo subsequente de opsonização está envolvido com a


Weber, C. R. 61

síntese de pelo menos três importantes proteínas, tuftisina, properdina e opsonina.

A primeira delas, um tetrapeptídeo ligado a leucócitos polimorfonucleares,

participa dos eventos que envolvem fagocitose, enquanto que as duas últimas

proteínas integram alternativas na via de ativação do sistema complemento

(PEITZMAN et al., 2001).

Outra importante função atribuída à polpa vermelha diz respeito à produção

de anticorpos. Após a diferenciação de antígenos específicos nos folículos da polpa

branca, plasmoblastos migram para a polpa vermelha, garantindo uma produção

extra de anticorpos com acesso rápido à corrente sanguínea. Os plasmoblastos são

atraídos para a polpa vermelha por um possível mecanismo de expressão de

receptores de quimiocinas CXCR4, o qual se liga à quimiocina CXCL12, presente na

polpa vermelha, coincidindo com a redução da expressão dos receptores de

quimiocina CXCR5 e CCR7 nos folículos e na região contendo células T na polpa

branca. Além disso, os plasmoblastos requerem células dendríticas para

sobreviverem na polpa vermelha e tais células são garantidas pelo suprimento na

região das células T da polpa branca e nos canais que se estendem para a polpa

vermelha (GARCÍA DE VINUESA et al., 1999).

A polpa branca se caracteriza como uma região linfoide, composta por

células T e folículos contendo células B. A organização e manutenção da polpa

branca são controladas por quimiocinas específicas que atraem estes dois tipos de

células aos seus respectivos domínios. A zona de células T, também conhecida

PALS, interage com células dendríticas e células B em trânsito, enquanto a

expressão de células B ativas ocorre nos folículos. A quimiocina CXCL13 é

necessária para a migração de células B para o folículo, enquanto que CCL19 e

CCL21 estão envolvidas na atração de células T e células dendríticas. Ressalta-se

que a expressão dessas quimiocinas é controlada pela linfotoxina-α1β2 (LT-α1β2) e

pelo fator de necrose tumoral (NGO et al., 1999).

Na zona marginal ocorre o trânsito de diferentes tipos celulares e

mediadores envolvidos na resposta imunológica e particularmente, dois tipos

específicos de macrófagos, da zona marginal e metalofílicos. Às células B da zona

marginal está atribuído o papel de organizadoras da integridade da região. As


Weber, C. R. 62

células B que expressam LT-α1β2 proporcionam a indução da expressão de

diferentes quimiocinas, as quais favorecem a atração e/ou retenção de espécies

celulares nas regiões distintas da zona marginal. Apesar de nenhuma quimiocina

ter sido identificada como importante neste mecanismo para os macrófagos

metalofílicos, sabe-se que o receptor MARCO dos macrófagos da zona marginal são

essenciais à retenção das células B da zona marginal, revelando a influencia de cada

célula sobre as outras (KARLSSON et al., 2003; DI SABATINO; CARSETTI;

CORAZZA, 2011).

2.4.4 Imunidade inata do baço

O sistema de imunidade inata representa importante papel na resposta

imune contra patógenos invasores, determinando o curso da ativação imunológica,

por apresentar antígenos do sistema de imunidade adquirida e ativar linfócitos T e

B. O papel do baço na proteção contra estes patógenos foi demonstrado por

diversos estudos, nos quais animais experimentais esplenectomizados foram

empregados e por assim, tornaram-se impedidos de mediar respostas adequadas a

determinados produtos bacterianos (MEBIUS e KRAAL, 2005; SCHMITT;

VILWOCK e KURZAI, 2009).

Para o aprisionamento eficiente de patógenos e antígenos, as células

residentes na zona marginal expressam receptores específicos, alguns deles, únicos

para a região (DC-SIGN, MARCO). Tais receptores reconhecem polissacarídeos

como já mencionados, presente na superfície de bactérias, por exemplo,

lipoarabinomanana no M. tuberculosis, e resultam na absorção e remoção da

bactéria. Além disso, os receptores do tipo SIGN são importantes na eliminação de

importantes micro-organismos, como a bactéria S. pneumoniae, por também

reconhecerem polissacarídeos em sua membrana. A literatura reporta o

envolvimento desse receptor na remoção de diferentes vírus. Por outro lado, o

receptor MARCO pode reconhecer diversos agentes patogênicos, tais como E. coli e

S. aureus, além de muitas vezes atuar em associação ao SIGN (VAN DER LAAN et

al., 1997; KOPPEL et al., 2004; KOPPEL et al., 2005; GATTO et al., 2007; MOSEMAN

et al., 2012).


Weber, C. R. 63

Os macrófagos metalofílicos expressam o receptor SIGLEC1, que pode ligar-

se às moléculas contendo o ácido siálico, assim como, resíduos deste composto, na

superfície de certas bactérias, por exemplo, S. aureus (GJERTSSON; NITSCHKE e

TARKOWSKI, 2004), C. jejuni e N. meningitides (DE BAERE et al., 2011). Os

receptores SIGLEC também foram identificados na superfície de monócitos e

células dendríticas, contudo acredita-se que a sua presença esteja relacionada nas

interações com os macrófagos metalofílicos da zona marginal. Tais interações

ocorrem por meio de um mecanismo que envolve a concentração dos patógenos

nesta área, culminando em fagocitose, como já demonstrado contra N. meningitides

(JONES; VIRJI e CROCKER, 2003; SCHIMITT; VILLWOCK e KURZAI, 2009).

Os macrófagos metalofílicos produzem mais citocinas que os macrófagos da

zona marginal. Isto se deve pela ausência da expressão do complexo principal de

histocompatibilidade da classe II. Por outro lado, acredita-se que a ativação das

células B da zona marginal pode ocorrer pela exposição de produtos de degradação

durante o processo de opsonização. Estas células são especializadas na detecção de

patógenos veiculados pelo sangue, respondendo rapidamente com a diferenciação

para células plasmáticas produtoras de IgM ou células apresentadoras de antígeno

(LOPES-CARVALHO e KEARNEY, 2004).

As células B da zona marginal também expressam níveis elevados de IgM,

CD1d, CD9, CD21 e CD22, e baixos níveis de IgD, CD23 e B220. Em contrapartida,

as células B foliculares expressam níveis elevados de IgD e mais baixos de IgM,

CD21 e CD22 e nenhum nível detectável de CD1d ou CD9. Após a ativação,

algumas células especializadas migram, ativando células T virgens e CD4+. A

estimulação promovida pelos lipopolissacarídeos das células B da zona marginal

regula os receptores S1P1 e S1P3, permitindo responder à CXCL13 e migrarem para

os folículos (MEBIUS e KRAAL, 2005).

A ativação induz a migração para a polpa branca, de células dendríticas

presentes temporariamente na zona marginal. O processo é importante para a

iniciação das respostas imunes adaptativas, levando a uma regulação da expressão

de CCR7 pelas células dendríticas, as quais impedem a migração das células


Weber, C. R. 64

apresentadoras de antígeno para a polpa branca, e consequentemente, aumentando

a proteção do hospedeiro (MEBIUS e KRAAL, 2005).

2.4.5 Imunidade adquirida do baço

A entrada de células apresentadoras de antígeno na polpa branca, e

particularmente na zona de células T, representa um dos principais momentos da

resposta adaptativa, dado que a arquitetura da região se assemelha à observada

nos linfonodos. Na resposta inicial contra as bactérias, as células dendríticas do

sangue são responsáveis pelas captura e transporte para o baço. Na entrada do

órgão, estas células mediam a diferenciação e sobrevivência de células B,

produtoras de anticorpos. A passagem para a polpa branca necessariamente obriga

o contato do material transportado com a zona marginal, estrategicamente

localizada na região intermédia das polpas vermelha e branca, resultando na

ativação de diferentes estruturas (LOKMIC et al., 2008).

A expressão da quimiocina CXCR5 regula a ativação das células T, após a

penetração das células apresentadoras de antígeno na polpa branca, favorecendo a

migração dessas células para a borda dos folículos contendo células B. Do mesmo

modo, nas células B, a ligação do antígeno ao seu receptor pode induzir a regulação

e expressão de CCR7, favorecendo a migração para a borda do folículo. Por

conseguinte, o contato entre células T ativadas com as células B pode promover a

migração para a polpa vermelha ou para a zona marginal, bem como garantir a sua

permanência nos centros germinativos do baço (MEBIUS e KRAAL, 2005).

A polpa branca apresenta um sistema de rede tubular, conhecido por

sistema condutor, no qual pequenas moléculas tais como, quimiocinas e peptídeos,

podem ser transportadas diretamente do sangue. Este sistema de transporte

caracteriza-se pela expressão da glicoproteína 38 e VCAM1. Os fibroblastos

reticulares que rodeiam o sistema condutor possivelmente também produzem

quimiocinas, as quais são subsequentemente transportadas nos canais. De fato, a

resposta dos fibroblastos reticulares à sinalização através de receptores de TNF e

LT-β, permite o estabelecimento de um mecanismo de indução da expressão das

quimiocinas hemostáticas CCL19, CCL21 e CXCL13, garantindo que antígenos de


Weber, C. R. 65

baixa massa molecular possam entrar na polpa branca através do canal, sendo

conduzidas por células dendríticas das proximidades, num processo de captação

sem a necessidade de sinal de ativação (LOKMIC et al., 2008).

A saída dos linfócitos da polpa branca também é regulada e altamente

funcional. As células T CD8+ efetoras mediam a própria saída, pela expressão de

CCR7, entretanto os mecanismos moleculares precisos pelos quais os linfócitos

deixam a polpa branca não foram totalmente elucidados. A hipótese mais aceita,

admite que os linfócitos retornam à corrente sanguínea, partindo da polpa branca a

partir da zona marginal (AOSHI et al., 2008; MITCHEL, 1973).

2.4 6 Cirurgia do baço e as consequências pós-cirúrgicas

Por um longo período da história o baço foi negligenciado, sendo

considerado um órgão silencioso e dispensável, e por esta razão, extirpável. A

história e a evolução da cirurgia esplênica refletem a interação entre a cirurgia, a

anatomia e a fisiologia, particularmente na Grécia e em Roma. No passado, a

cirurgia tinha por objetivo remover tendências suicidas, melancolia, hipocondria e

o riso descontrolado. Curiosamente, a excisão do baço também era indicada como

um método para aumento do desempenho de atletas, tendo como consequências a

disúria e o apetite voraz, considerados não prejudiciais à saúde (McNEE, 1931)

A literatura clínica entre os séculos XVII e XIX relatou diversos casos de

sucessos e erros nas esplenectomias. O primeiro relato de sucesso, de autenticidade

comprovada é atribuído ao médico italiano Adriano Zaccarelli, no ano de 1549.

Entretanto, alguns autores conferem o pioneirismo a Leonardo Fiovarante, oito

anos antes (McCLUSKY et al., 1999; PETROIANU, 2003).

Seja Zaccarelli o detentor do mérito do sucesso, seja Fiovarante, o período da

cirúrgia coincide com diversas experimentações semelhantes, em animais, por

exemplo, cães e ratos, realizados por diversos outros pesquisadores. Um dos

maiores expoentes, também italiano, Marcelo Malpighi (1628-1694), por meio da

microscopia, descreveu as propriedades secretórias do baço, corroborando com a

função aceita para o órgão, isto é, um depurador de sais e elementos telúricos no


Weber, C. R. 66

sangue, os quais eram volatilizados e posteriormente excretados

(MORGENSTERN, 1975; McCLUSKY et al., 1999; BYNUM, 2002).

A crença de que o baço não era essencial à vida permaneceu até o século

XIX. Em 1854, Henry Gray (1827-1861) produziu a mais completa monografia sobre

o órgão até então, relacionando-o à determinadas condições, cuja tentativa de

eliminá-las culminaram na realização de esplenectomias pioneiras, na tentativa de

cura da leucemia (1866) e púrpura (1916) (MORGENSTERN, 1975).

As esplenectomias no século XIX (Figura 2.14) eram indicadas para casos de

cistos, abcessos, lacerações e trauma. Contudo, com uma abordagem cada vez

menos filosófica, aliado ao pequeno número de sobreviventes nas intervenções,

pela primeira vez na história o procedimento não foi considerado preferencial

(McCLUSKY et al., 1999).

Figura 2.12 – ―A clínica do Dr. Agnew‖ (1889), fotogravura de Thomas Eakins (1844-1916), retratando uma cirurgia esplênica em uma mulher, durante as quartas

de final da rodada mundial de esplenectomia daquele ano.

Fonte: Philadelphia Museum of Art (2012)

O entrave da questão residia no fato da deficiência de uma opção segura,

pois a mortalidade persistia elevada, com ou sem a cirurgia. Em 1864, Sir Thomas

Spencer Wells (1818-1897) propôs uma terapia baseada na administração de

brometo de potássio e quinina, porém foi obrigado a recorrer à esplenectomia em


Weber, C. R. 67

sua paciente, cuja vida perdurou por mais cinco dias, resultado superior às poucas

horas reportadas pela literatura da época. Baseado nisso, Wells estabeleceu dois

princípios para conduzir a esplenectomia, a saber: 1- a escolha pelo procedimento

deve ser governada exclusivamente pelo risco de morte do paciente e 2- somente

deve ser indicada nas condições, cujo prejuízo das funções do baço estejam

evidentes (McCLUSKY et al., 1999).

No início do século XX o histologista suíço, Rudolf Albert von Kölliker

(1817-1905) propôs que o baço participava da hematopoese, dando início a uma

linha de investigação, cujo objetivo foi tentar preservar ao máximo o órgão e assim,

outras modalidades de esplenectomia puderam ser testadas, por exemplo,

aspirados de cistos (1901), sutura (1902), tamponação (1908), drenagem de abcessos

(1911) e esplenectomia parcial (1962). Tais métodos evoluíram e aumentaram a

perspectiva de sobrevivência, entretanto, estas metodologias, bem como seus

defensores permaneceram ignorados praticamente até meados dos anos 1970. Em

contrapartida, a esplenectomia parcial era empregada apenas nos poucos casos,

cuja preservação do baço era cercada de intenso debate (MORGENSTERN, 1975;

McCLUSKY et al., 1999; UPADHYAYA, 2003).

A esplenectomia total como prática clínica de rotina era justificada pela

elevada mortalidade dos pacientes na ocorrência de procedimentos não-cirúrgicos

do baço após um trauma. A preservação do órgão não era reconhecida como segura

e se baseava nos seguintes princípios: 1- o baço não tinha função e por isso, não é

essencial à vida; 2- o índice de mortalidade de pacientes sem intervenção cirúrgica

em casos de trauma era de 90 a 100%; 3- a não remoção do baço implicava no risco

iminente de ruptura; e 4- por tratar-se de uma víscera vascular friável, possíveis

lacerações não poderiam ser suturadas. Contudo, diversos pesquisadores

continuaram sua busca na tentativa de desmistificar o real papel do baço no

organismo (UPADHYAYA, 2003).

Finalmente em 1919, Morris e Bullock conseguiram provar, em um

experimento bem sucedido, o aumento da mortalidade de ratos esplenectomizados,

infectados por Y. pestis. Todavia, o grande divisor de águas ocorreu em 1952, com a

clássica publicação de King e Schumacker, enfatizando mortes de crianças por


Weber, C. R. 68

septicemia fulminante após esplenectomias totais (KING e SCHUMACKER, 1952).

O trabalho de tão revolucionário, sensibilizou a comunidade científica para o fato,

possibilitando o crescimento da corrente de pensamento, em defesa das cirurgias

conservadoras do baço (UPADHAYAYA e SIMPSON, 1968). Cinco anos mais

tarde, Singer revelou que o índice de sepse fulminante, era 200 vezes maior na

população infantil como um todo, inspirando o relato de Shafir et al. (1975), em

defesa da prática da intervenção com preservação do órgão. A partir deste

momento, o número de adeptos desta rotina aumentou, consolidando-se por

definitivo antes mesmo do final dos anos 1980 (UPADHAYAYA, 2003).

Atualmente, a cirurgia esplênica é indicada para diferentes condições, tais

como esplenomegalia, algumas doenças autoimunes, câncer e traumas. Ressalta-se

que a frequência de esplenectomia por razões hematológicas, imunológicas ou

oncológicas (54%) é significativamente maior que nos casos de trauma (16%). A

decisão pela preservação do baço requer julgamento de acordo com a estabilidade

hemodinâmica, idade e condições, cuja ameaça à vida é iminente (HANSEN e

SINGER, 2001; PACHTER et al., 1998).

As modalidades das cirurgias esplênicas são: 1- Esplenectomia total

(ressecção); 2- Esplenectomia parcial (preservação de 25 a 50% do tecido esplênico

original); 3 - Esplenorrafia (sutura); 4- Esplenopexia (fixação); 5- autoimplante

esplênico (transplante ectópico de tecido esplênico) e 6- Esplenectomia

laparoscópica eletiva (menos agressiva e introduzida em 1991) (MORGENSTERN,

1975; LLENDE et al., 1986; DI SABATINO; CARSETTI e CORAZZA, 2011;

PETROIANU, 2003).

A asplenia e a hipoesplenia são os estados resultantes da cirurgia esplênica,

predispondo o organismo ao risco de infecções severas ou o agravamento de

determinadas processos patológicos e/ou condições mórbidas como discutido de

forma contínua pela literatura (WILLIAM e CORAZZA, 2007; DE PORTO et al.,

2010; DI SABATINO; CARSETTI e CORAZZA, 2011; TARANTINO et al., 2011,

entre outros).

Apesar das células esplênicas conferirem uma imunidade inferior, quando

comparadas à proteção promovida pelos linfonodos cervicais e mesentéricos, a


Weber, C. R. 69

esplenectomia frequentemente trás consequências imunológicas importantes, uma

vez que ocorre comprometimento da imunidade inata, assim como da indução e da

expressão da imunidade adquirida, contra um grande número de bactérias

encapsuladas, bem como protozoários. Em contrapartida, estudos com animais

experimentais revelaram que a esplenectomia parcial ocasiona uma depressão

transitória da imunidade humoral, permitindo uma resposta fagocítica adequada

(DI SABATINO; CARSETTI e CORAZZA, 2011; YONG; GLANVILLE e DOBSON,

1983).

A partir de 1952, a excisão completa do baço começou a ser vista como não

isenta de impunidade imunológica e um número crescente de produções científicas

relatou casos graves de infecções bacterianas pós-esplenectomias. Em 1969, L. K.

Diamond ao observar e descrever a instalação dessas septicemias abruptas,

resultando em óbito em poucas horas, criou o termo OPSI, sigla inglesa para

Overwhelming Post-Splenectomy Infection, isto é, Infecção fulminante pós-

esplenectomia, no clássico artigo da literatura médica, intitulado ―Splenectomy in

childhood and the hazard of overwhelming infection‖ (DIAMOND, 1969).

A OPSI, sumarizada na Tabela 2.1, caracteriza-se por sepse fulminante,

meningite ou pneumonia, ocasionadas, na maioria dos episódios, por bactérias

encapsuladas, tais como, S. pneumoniae, N. meningitidis e H. influenzae tipo B, em

organismos asplênicos e/ou hipoesplênicos (HANSEN e SINGER, 2001;

PEITZMAN et al., 2001; DI SABATINO; CARSETTI e CORAZZA, 2011).

Tabela 2.1 – Infecção Fulminante Pós-Esplenectomia (OPSI).

Fator Descrição

Grupo de risco Esplenectomizados (total e parcialmente) e asplênicos funcionais. Sintomas Febre, evoluindo à sepse fulminante, coagulação intravascular

disseminada e falência de órgãos, em questão de horas.

Incidência 2-5 por 1000.

Risco de desenvolver OPSI de 5%. Mortalidade 50-70%.

68-80% nas primeiras 24-48h, respectivamente. Micro-organismos S. pneumoniae (70%), H. influenzae, N. miningitidis, E. coli e P.

aeruginosa, C. canimorsus, Enterococcus sp, Bacteroides sp, Bartonella sp. Fontes: Hansen e Singer (2001); de Porto et al. (2010) e Di Sabatino; Carsetti e Corazza (2011)


Weber, C. R. 70

A OPSI se instala em função da incapacidade do sistema imunológico

promover a opsonização de bactérias encapsuladas. Em animais experimentais,

outras complicações relacionadas às funções esplênicas, subsequentes à cirurgia

foram observadas e reportadas pela literatura, tais como: 1- impossibilidade de

depuração de partículas defeituosas do sangue; 2- diminuição da atividade

fagocitária de macrófagos alveolares contra pneumococos; 3- diminuição na

resposta antígeno-anticopo específico; 4- aumento dos títulos de IgM e diminuição

de IgA e IgG; 5- inibição da função das células T; 6- redução da síntese de tuftisina;

7- opsonização de bactérias insuficiente; 8- redução dos níveis de properdina; 9-

deficiência primária de anticorpos contra sepse; 10- desenvolvimento de diversas

parasitoses e 11- perturbação da regulação à resposta imune tumoral (LLENDE et

al., 1986; BRIGDEN e PATTULLO, 1999; PEITZMAN et al., 2001).

Utilizando animais experimentais esplenectomizados como modelo, outras

condições, não relacionadas diretamente às funções mais discutidas do baço, foram

objeto de estudo por diversos autores, revelando a participação do órgão em vários

processos. Ren et al. (2012) investigaram o papel da esplenectomia em ratos, após a

excisão hepática, observando que a ausência do baço contribuiu para o aumento da

função hepática após a regeneração do fígado, pelo estímulo da síntese de DNA e

de células de proliferação antígeno celular, porém nas condições experimentais, o

mecanismo de como o processo ocorreu não foi elucidado. Recentemente, Rezende

et al. (2011) identificaram o aumento de lesões ateroscleróticas em ratos

esplenectomizados, submetidos à dieta rica em gordura. Comparados a um grupo

controle, sob mesma dieta, os autores observaram que apesar dos níveis de

colesterol total e LDL séricos, bem como dos títulos de IgG, tenham sido similares,

as lesões na raiz aórtica foram significativamente maiores no grupo

esplenectomizado. Embora a aterosclerose configure processo inflamatório

autoimune, o papel do baço no desenvolvimento da doença permanece incerto.

Sendo assim, os autores discutiram e sugeriram o papel protetor do baço sobre a

formação de ateromas. Wyszomirska et al. (2006) observaram uma diminuição dos

níveis de dois marcadores séricos de fibrose, colágeno tipo IV e TIMP-1, por até 60


Weber, C. R. 71

dias após a esplenectomia, em uma população esquistossomótica , sugerindo que o

baço pode contribuir com a produção da matriz extracelular, contribuindo com o

processo de fibrose hepática na esquistossomose mansônica.

Na literatura são descritas duas principais condutas, no intuito de reduzir ou

prevenir a instalação da OPSI após a esplenectomia em animais: imunização e

antibioticoterapia. A imunização compreende principalmente o emprego da vacina

polivalente contra pneumococos, cujo resultado é a produção de anticorpos

opsonizantes por meios de um mecanismo de células T independente (EL-ALFY e

EL-SAYED, 2004; KAPLINSKY e SPIRER, 2006). De acordo com Peitzman et al.

(2001), outras vacinas e regimes de administração, contra H. influenzae tipo B,

meningococos, vírus influenza e Hemophillus também podem ser conduzidos.

A antiobioticoterapia, mesmo não sendo considerada totalmente eficaz, é

recomendada como um meio profilático. O regime comumente empregado utiliza

penicilinas e derivados, tais como, benzilpenicilina e amoxilina. Trimetazol,

eritromicina, e os esquemas amoxilina + clavulanato, cefuroxima e trimetroprima +

sulfametoxazol são opções no intuito de evitar possíveis mecanismos de resistência

e multirresistência (PEITZMAN et al., 2001; DI SABATINO; CARSETTI e

CORAZZA, 2011).

Por razões já expostas, o interesse na esplenectomia parcial como uma

alternativa de conservação do baço, tem aumentado ao longo dos anos e diversos

estudos são realizados com o objetivo de verificar os benefícios da preservação do

órgão. Tracy et al (2011), por exemplo, ao investigarem a população de células B,

em camundongos C57BL/6J submetidos a diferentes modalidades de intervenções

esplênicas, verificaram que a esplenectomia parcial foi o único modelo capaz de

preservar as células B por um período de 30 dias após a cirurgia. Os autores

discutiram seus resultados na importância do procedimento para a preservação da

resposta imune do baço.

Segundo a literatura, o autrotransplante esplênico consiste como outra

possível alternativa de preservação das funções imunológicas lienais. O

procedimento consiste na fixação de tecido esplênico vital e funcional, medindo de

poucos milímetros a alguns centímetros em diâmetro, no omento, peritônio e


Weber, C. R. 72

mesentério. Como resultados, podem ocorrer a redução da produção de opsonina e

tuftisina, bem como a melhora da resposta após vacinação meningocócica.

Entretanto, o autotransplante esplênico não garante proteção contra OPSI e as

possíveis causas podem ter relação com a adição de pequenas porções, como

também provocadas pela vascularização insuficiente no tecido, a qual reduz o

contato entre as partículas de antígeno com os fagócitos esplênicos (PATEL et al.,

1981; LEEMANS et al., 1999; PEITZMAN et al., 2001; CADILI e DE GARA, 2008; DI

SABATINO; CARSETTI e CORAZZA, 2011).

Sabe-se que, dentre as consequências imunológicas associadas à

esplenectomia total, o comprometimento da capacidade de síntese de tuftisina

pode ocorrer. A tuftisina consiste em uma endocarboxipeptidase produzida

primariamente pelo baço, cuja função dentre outras, é ligar-se aos receptores na

membrana dos macrófagos e leucócitos polimorfonucleados, estimulando a

migração e as atividades fagocitária e antitumoral. Entretanto, a literatura reporta a

possibilidade da resposta imune eficaz, promovida pela manutenção da síntese

dessa proteína, em níveis normais, após o autotransplante esplênico, podendo

favorecer, por exemplo, na conservação da imunidade após administração da

vacina antipneumocócica (BRANDT et al., 2001), na recuperação e manutenção do

índice de aderência, produção de superóxido e de TNFa em monócitos (BRANDT

et al., 2005), bem como na viabilidade de fagócitos durante a eliminação de altas

concentrações de E. coli, entre outros (MARQUES et al., 2002).

O autotransplante é um procedimento de opinião controversa, porém

mostrou-se eficaz ao ser empregado em animais experimentais. Fernandes et al.

(2010), por exemplo, avaliaram a resposta imune à infecção por S. pneumoniae, em

ratos submetidos ao autotransplante esplênico. Após cinco dias da cirurgia, títulos

de anticorpos, densidade bacteriana e os níveis de IL-17 e neutrófilos foram

determinados e os resultados revelaram que a população autotransplantada

apresentou mesmo comportamento que no grupo controle, sugestivo de que o

autotransplante esplênico restaura a capacidade de ratos esplenectomizados em

combater infecções por bactérias encapsuladas.


Weber, C. R. 73

3- Hipóteses e Modelo Teórico

Camundongos esquistossomóticos são mais susceptíveis a translocação

microbiana/ sepse que camundongos não infectados;

A translocação bacteriana em camundongos esquistossomóticos ocorre de

forma semelhante antes e após a esplenectomia. Entretanto, a sepse é mais

frequente após a esplenectomia;

Em camundongos esquistossomóticos submetidos à esplenectomia ocorre

aumento do imunocomprometimento da resposta imunológica;

Quanto maior o nível da IL-10 nas células esplênicas e, maior níveis séricos de

IL-4, IL-5 e IL-12 dos camundongos na fase crônica da infecção, mais comum é

a translocação microbiana;

Quanto menor o nível sérico de IFN-γ, nos camundongos, na fase crônica da

infecção, mais comum é a translocação microbiana;

Alteração da resposta Imunológica, em

camundongos a esplenectomia.

TRANSLOCAÇÃO MICROBIANA

Esquistossomose experimental crônica

Infecções bacterianas


Weber, C. R. 74

4- Objetivos

4.1 Geral

Analisar o comportamento das citocinas do perfil Th1 e Th2, comparando

camundongos esquistossomóticos fêmeas na fase crônica e sem infecção,

submetidos ou não a esplenectomia em relação à translocação e ao desfecho de

sepse.

4.2 Específicos

4.2.1 Verificar desfecho de sepse nos grupos de camundongos estudados,

analisando a bactéria de maior prevalência.

4.2.2 Comparar os camundongos infectados pelo S. mansoni submetidos a

esplenectomia e não esplenectomizados em relação a

sepse/translocação quanto ao:

Níveis de citocinas do tipo Th1: IL-1β, TNF-α, IFN-γ e IL-12.

Níveis de citocinas do tipo Th2: IL-2, IL-4, Il-5 e IL-10.

4.2.3 Comparar os camundongos não infectados pelo S. mansoni

submetidos a esplenectomia e não esplenectomizados em relação a

sepse/translocação quanto ao:



4.2.4 Verificar a interferência do procedimento cirúrgico na translocação/

sepse, comparando os camundongos infectados e não infectados

submetidos a cirurgua controle (Sham) quanto aos:




Weber, C. R. 75

5 - Animais, Materiais e Métodos

5.1 O desenho do estudo

O presente trabalho originou-se de um estudo experimental intervencionista,

no qual o modelo de hospedeiro vertebrado para esquistossomose mansônica na

fase crônica utilizado foi o camundongo. O grupo experimental foi criado sendo

composto por camundongos (fêmeas) infectados anteriormente pela penetração

ativa das cercárias com intuito de ser comparado a um grupo privado da infecção

das cercarias do S. mansoni. Além disso, trata-se de um estudo fatorial, onde duas

intervenções experimentais são avaliadas separadamente e em combinação, e

submetidos à comparação com o controle. No presente estudo, a diferença dos

mecanismos imunológicos referente à susceptibilidade da translocação bacteriana e

sepse em camundongos com esquistossomose e camundongos não infectados,

ambos submetidos ou não a esplenectomia. Além disso, foi criando um grupo

submetido ao estresse cirúrgico pela cirurgia controle (grupo Sham), sem, contudo,

sofrer a retirada do baço.

Os animais para o estudo não são considerados randomizados, pois foram

criados sob as mesmas condições ambientais e nutricionais. Desta forma, as

diferenças existentes entre os grupos foram atribuídas às intervenções avaliadas.

Na investigação estritamente experimental, pode-se operar com uma definição

bastante limitada das causas como nexos obrigatórios e unívocos entre fatores

(Esquistossomose mansônica na fase crônica e suas alterações no hospedeiro) e

efeitos (resposta imune, translocação microbiana e sepse). A experimentação em

condições laboratoriais, com alto grau de controle, pode estabelecer, com certa

margem de segurança, as alterações imunológicas, assim como o caráter etiológico

da esquistossomose mansônica para a produção da translocação microbiana e suas

variações (ROUQUAYROL e ALMEIDA FILHO, 2003; LIMA, 2011).


Weber, C. R. 76

O modelo de estudo experimental é o único capaz de um controle eficaz das

confusões provocadas pelas variáveis de confundimento desconhecidas. O estudo

foi desenvolvido na linhagem de camundongos Swiss (Mus musculus) que

apresenta variabilidade genética (não isogênicos). Dos animais de experimentação,

este é o que fornece respostas mais próximas aos humanos em relação à

esquistossomose, e sendo tal fato o que facilita extrapolar os resultados,

salvaguardem as devidas proporções e tomando os devidos cuidados (LIMA,

2011).

5.2 Animais

O estudo foi iniciado apenas após aprovação pelo Comitê de Ética em

Experimentação Animal do Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de

Pernambuco (n° de protocolo: 23076.02635553/2011-75). No presente trabalho

foram utilizados como modelo experimental camundongos fêmeas (ELOI-SANTOS

et al. 1992; BOISSIER et al. 2003) da linhagem Swiss webster recém-desmamados (21

dias) fornecidos pelo biotério do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães

(CPqAM/FIOCRUZ) e mantidos no Laboratório de Imunopatologia Keizo Azami

(LIKA) (Figura 5.1).

Figura 5.1- A - Camundongo da linhagem Swiss webster. B – Local de permanência

dos camundongos (Gaiola com cama de maravalha estéril, ração Labina® e bebedouro, alojada no Biotério do LIKA/UFPE).

Fonte: Lima, 2011

A B


Weber, C. R. 77

Os animais foram mantidos em uma mesma sala e em condições ambientais

similares, alojados em gaiolas especiais, camas de maravalha (autoclavada), ração

especial para camundongos (Labina®/Purina – São Paulo-SP) e água estéril ad

libitum.

5.3 Formação dos grupos de estudo

Foram utilizados 48 camundongos fêmeas da linhagem Swiss webster com

21 dias de nascidos. Destes, 24 foram infectados por via percutânea com cercárias.

Após a 12ª semana da exposição à cercária, os camundongos infectados

juntamente com os camundongos não infectados constiuiram dois grandes

grupos: GRUPO 1 (Camundongos Infectados - CI): 24 animais esquistossomóticos

na fase crônica da doença (08 animais que sofrerão o estresse cirúrgico, sem

retirada do baço; 08 serão esplenectomizados e 08 que não sofrerão quaisquer

intervenções cirúrgicas); GRUPO 2 (Camundongos Não Infectados - CNI): 24

animais não-infectados (com os mesmos subgrupos do grupo CI)(Figura 5.2).

Figura 5.2 – Distribuição de grupos de camundongos submetidos a estudos.

Noventa dias após a exposição cercariana, 08 camundongos de cada grupo

(CI e CNI) foram submetidos à esplenectomia total, e o mesmo número de animais

de cada grupo foram submetidos apenas ao estresse cirúrgico (Grupo Sham). Os

animais foram mantidos vivos após os procedimentos cirúrgicos e apenas após 8 a

Sham (n=08)

Esplenectomizados (n=08)

Controles (n=08)

Controle (n=08)

Esplenectomizados (n=08)

Sham (n=08)

Camundongos esquistossomóticos Grupo 1: CI - (n=24)

Camundongos não infectados GRUPO 2 : CNI - (n=24)


Weber, C. R. 78

10 dias, completando-se de 98 a 100 dias de infecção, foram eutanasiados para

estudo (Figura 5.3). No momento da eutanásia foi coletado por punção caudal, o

sangue periférico para cultura microbiológica e por punção cardíaca o sangue

destinado ao estudo sorológico. Para estudo da microbiota intestinal as fezes

também foram coletadas.


Weber, C. R. 79

Figura 5.3- Dinâmica e distribuição dos grupos de camundongos fêmea submetidos ao estudo.

132° Dia 125° Dia

Controle (n=08)

14 d

ias

CI (n=24)

CN

I

Infecção percutânea

com cercarias do S.

mansoni.

35° Dia

Realização do Kato-Katz

80° Dia

Camundongos

fêmea (n=48)

Obtenção dos camundongos

fêmea

21° Dia

Esplenectomia (n=08)

Sham (n=08)

Procedimento cirúrgico

( Esplenectomia e Estresse cirúrgico)

45 d

ias

45 d

ias

Idade dos Camundongos

Controle (n=08)

Esplenectomia (n=08)

Sham (n=08)

7 d

ias

CI (n=24)

CN

I

Realização do

Kato-Katz

CI (n=24)

CN

I

3 d

ias C

I (

n=

24)

CN

I (n

= 2

4)

135° Dia

Eutanásia

90 dias de infecção 45 dias de Infec. Infecção 97 dias de Infec. 100 dias Infec.


Weber, C. R. 80

5.4 Categorizações das variáveis

5.4.1 Variáveis dependentes

Nome Definição conceitual Definição operacional Categorização

Sepse

Resposta inflamatória à infecção, manifestada por

duas ou mais das seguintes condições: aumento da

temperatura, aumento da frequência cardíaca,

respiratória e leucopenia.

Presença de bactérias nos Linfonodos mesentéricos, no baço,

no fígado e sangue periférico concomitante ao aumento da IL-1β.

Sim Não

Susceptibilidade dos camundongos à infecção pelo S.

mansoni.

Capacidade dos camundongos serem

infectados pelo S. mansoni.

Presença de ovos de S. mansoni eliminados nas fezes através de

exame parasitológico e visualização do verme adulto durante perfusão

do sistema porta-hepático.

Infectados Não infectados

Esplenectomia Retirada do Baço

Incisão subcostal esquerda com auxílio de tesoura cirúrgica para retirada do baço após 90 dias da

exposição cercariana.

Esplenectomizados Não

Esplenectomizaos

5.4.2 Variáveis independentes

Nome Definição conceitual Definição operacional Categorização

IL-1β IL-1 está envolvida na resposta inflamatória, sendo identificado

como pirogénios endógenos. Média±DP

IL-2 Age sobre os linfócitos B e funciona

como fator de crescimento autócrino.

Níveis séricos de interleucinas observados

nos camundongos

Média±DP

IL-4 Fator de crescimento das células B e Th2, promove síntese de IgE e IgG,

inibe Th1 Média±DP

IL-5 Fator de crescimento e diferenciação de eosinófilos e células B e estimula

secreção de IgE. Média±DP

IL-10 Interleucina da resposta Th2

observada na fase crônica da infecção pela esquistossomose

Média±DP

IL-12 Interleucina ativadora de NK e Th1 Média±DP

TNF-α Interleucina envolvida na resposta

inflamatória que induz febre e choque séptico

Média±DP

IFN-γ Interleucina da resposta Th1

importante para proliferação de células T e a ativação de macrófagos

Média±DP

GM-CSF Fator de crescimento de Macrófado e

Granulócitos Média±DP

TM Passagem de micro-organismos via trato gastrointestinal para órgãos

e/ou sistema circulatório.

Presença de bactérias em homogeneizados de

órgãos.

Sim Não


Weber, C. R. 81

5.5 Obtenção das cercárias e infecção dos camundongos

Foi utilizada a cepa SLM (São Lourenço da Mata) de S. mansoni mantida

no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) através da passagem

sucessiva da cepa em caramujos da espécie Biomphalaria glabrata, fornecida pelo

Moluscário da Disciplina de Parasitologia, do Departamento de Medicina

Tropical - UFPE.

Fezes de camundongos infectados foram individualmente coletadas,

após 45 e 60 dias da infecção, para a realização da técnica quantitativa de Kato-

Katz (KATZ, CHAVES e PELLEGRINO, 1972). Após este procedimento, o

sedimento foi exposto à iluminação e a temperatura de aproximadamente 28°C,

até eclosão dos ovos de S. mansoni e visualização dos miracídios em lupa.

Os miracídios foram postos em contado individualmente com cada

caramujo, permanecendo exposto à luz e ao calor por aproximadamente duas

horas (Figura 5.4). Após infecção, os moluscos foram mantidos em aquários

com água desclorada e livres de exposição luminosa (STANDEN, 1952).

Figura 5.4- Moluscos da espécie B. glabrata infectados, em meio aquático e

expostos à luz artificial.

Fonte: Lima, 2011.

Após 30 dias de infecção, os moluscos da espécie B. glabrata em meio

aquático e sob exposição à luz artificial, têm a capacidade de eliminar cercárias


Weber, C. R. 82

através de seus tecidos moles. Após a obtenção de uma suspensão cercariana

padronizada, os camundongos serão infectados por via percutânea em uma

fração desta suspensão (Figura 5.5). Este procedimento está de acordo com a

Técnica de infecção percutânea (COUTINHO et al. 2007).

Figura 5.5- Padronização da suspensão cercariana.

Fonte: Lima, 2011.

Após a obtenção e padronização da suspensão cercariana, cada

camundongo, imobilizado pós-administração de anestesia intramuscular -

Solução cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e cloridrato de cetamina 10%

(115 mg/Kg) - foi infectado por via percutânea em uma fração desta

suspensão, que continha, em média, 50 cercárias (FIGURA 5.6 A e B). Os

camundongos parasitados foram colocados em gaiolas separadas daqueles não

parasitados.

Figura 5.6- A – Anestesia intramuscular. B – Imoblização e exposição à suspensão cercariana por via percutânea, e luz artificial.

Fonte: Lima, 2011

A B


Weber, C. R. 83

A fase crônica da infecção esquistossomótica é considerada estabelecida

a partir da 12ª semana (aproximadamente 3 meses) após a exposição

cercariana (FALLON, 2000; PEARCE e MCDONALD, 2002). Por essa razão, foi

realizado procedimento intervencionista (esplenectomia) nos camundongos

após 3 meses da infecção e somente após 100 dias da infecção (fase crônica),

todos os camundongos foram eutanasiados para estudo.

5.6 Confirmações da infecção e perfil de ovoposição pós esplenectomia

Após 45 dias da infecção nos camundongos, as fezes foram coletadas

individualmente e examinadas pela técnica de KATO-KATZ (Figura 5.7) -

simplificação do método de Kato, introduzida por Katz, Chaves e Pellegrino

(1972). A primeira análise objetivou confirmar a infecção percutânea dos

camundongos. No 97° dia de infecção, o mesmo procedimento foi repetido,

desta vez, o objetivo foi verificar o padrão de ovoposição pós-esplenectomia e

comparar com a primeira amostra.

Figura 5.7- Método de Kato-Katz. A - Helm-test®. B - Recolhimento das fezes que atravessam a malha. C - Lâminas preparadas.

Fonte: Lima, 2011

5.7 Procedimento Cirúrgico (Esplenectomia Total)

Noventa dias da infecção cercariana, 1/3 dos camundongos (sendo

metade deles esquistossomóticos e a outra metade do grupo controle) foram

submetidos à laparotomia mediana, com esplenectomia total convencional.

Para isso foi realizada cirurgia aberta. Após anestesia geral por via

A B C


Weber, C. R. 84

intraperitoneal com solução de Cloridrato de cetamina - 2-(2-clorofenil)-2-

(metilamino)-ciclohexanona 10% (115 mg/Kg) e Cloridrato de xilazina - 2-(2,6-

xilino)-5,6-dihidro-4H-1,3-tiazina 2% (10 mg/Kg), foi realizada a tricotomia da

área da incisão e cada camundongo foi colocado em decúbito dorsal

semilateral direito. Seguiu-se anti-sepsia com polivinilpirrolidona-iodo e foi

utilizada incisão subcostal esquerda (Figura 5.8).

Figura 5.8- Preparo pré-operatório. A – Anestesia intramuscular. B - Tricotomia.

Posteriormente ao acesso da cavidade abdominal, realizou-se a inspeção

à procura de baço acessório e palpação para detectar aderência deste órgão, o

que poderiam causar lacerações e sangramentos. Procedeu-se, então, com

dissecção do ligamento gastroesplênico e ligadura dos vasos gástricos curtos

(Figura 5.9).

Figura 5.9- Procedimento cirúrgico. A- Inspeção do Baço. B- Ligadura dos

vasos.

B A

A B


Weber, C. R. 85

Localizou-se a artéria esplênica, com posterior reparo e ligadura com fio

monofilamentar de náilon 6.0, fazendo-se leve compressão do pequeno baço

(autotransfusão), que possibilitou o retorno de parte do sangue à circulação

sistêmica. O baço foi mobilizado medialmente, fazendo-se secção dos

ligamentos. Realizou-se a dissecção da veia esplênica, seguida de reparo e

ligadura. Finalizou-se a cirurgia com a dissecção do pedículo vascular e

exérese do órgão (Figura 5.10).

Figura 5.10- Procedimento cirúrgico - mobilização e secção de ligamentos.

Em seguida, foi realizada nova inspeção da cavidade e síntese da

parede abdominal. Foi realizada laparorrafia com fio monofilamentar de

náilon 4.0 (Figura 5.11). O procedimento foi realizado seguindo o protocolo de

Siqueira et al. (2010).

Figura 5.11- Procedimento cirúrgico. A-inspeção da cavidade abdominal. B-

sutura.

.

O baço foi retirado de maneira asséptica e mantido por alguns minutos

sob-refrigeração até a pesagem e analise microbiológica (Figura 5.12).

B A


Weber, C. R. 86

Figura 5.12- Baço retirado na esplenectomia.

5.8 Procedimento Cirúrgico (Estresse Cirúrgico - Sham)

Assim como o grupo de camundongos esplenectomizados, noventa dias

da infecção cercariana, 1/3 dos camundongos (sendo metade deles

esquistossomóticos e a outra metade do grupo controle) foram submetidos à

laparotomia exploradora para que sofressem o mesmo nível de estresse, no

entanto, sem exérese do baço, isto é, sem a esplenectomia total convencional.

As condições cirúrgicas foram as mesmas utilizadas para o grupo

esplenectomizado, com anestesia e tricotomia da área de incisão. Cada

camundongo foi colocado em decúbito dorsal semilateral direito e utilizada

incisão subcostal esquerda para a exposição do baço. Posteriormente, houve a

manipulação do órgão e sua reintrodução a cavidade abdominal do animal

(Figura 5.13). A laparorrafia foi realizada também de maneira semelhante ao

grupo esplenectomizado. O procedimento foi realizado de modo semelhante

ao protocolo de Biondo-Simões et al. (2000).

Figura 5.13- Estresse cirúrgico (SHAM). A – Tricotomia. B – Decúbito dorsal semilateral. C- Laparotomia exploratória.

5.9 Eutanásia e Verificação da translocação microbiana/ sepse

A B C


Weber, C. R. 87

Uma semana pós-esplenectomia, todos os camundongos foram

submetidos à overdose anestésica para coleta de amostras biológicas. O tempo

de sete dias pós-esplenectomia foi estabelecido para eutanásia devido à

debilidade dos camundongos, principalmente os esquistossomóticos

(ALBERTI et al., 2007).

Antes da coleta foi realizada rigorosa assepsia da cauda e de todo o

corpo do animal, com Iodopovidona 1% para evitar contaminação das

amostras e/ou tubo com a microbiota do camundongo. Além disso, para

laparotomia, foram utilizadas pinças e tesouras esterilizadas individualmente.

O estudo da translocação bacteriana está de acordo com o realizado por Torres

et al. (1999), Çelik et al. (2005) e Gencay et al. (2008). Primeiramente foi

retirado sangue periférico (1,5mL) por punção caudal e, posteriormente,

realizada a punção cardíaca para a dosagem de citocinas séricas. Para

aspiração do sangue na punção cardíaca utilizou-se agulha 13 x 4,5 acoplada a

seringa descartável de 1 mL. Somente após, as coletas de sangue, foi realizada

incisão mediana xifo-pubiana com auxílio de tesoura cirúrgica.

Foram coletados, respectivamente, fragmentos do baço (grupos não

esplenectomizados), fragmentos do fígado, linfonodos mesentéricos na região

média do intestino delgado, e as fezes da porção distal do intestino delgado.

Todo material coletado foi submetido ao cultivo para verificação do

crescimento de micro-organismos. Fragmentos do baço, fígado e linfonodos

mesentéricos foram macerados e homogeneizados separadamente em placas

de Petri estéreis. As amostras foram acrescidas de BHI (Caldo cérebro coração

– BHI, BioMérieux, Marcy I'Etoile, França - 1:5), incubados em estufa

bacteriológica a 37°C/24 horas e semeadas em placas de Petri contendo meios

de cultivo (Agar Columbia + 5% sangue carneiro, Levine PolyviteX,

BioMérieux, Marcy I'Etoile, França). A observação das placas foi realizada

após 24-72 horas de incubação.

Observado o crescimento bacteriano, as colônias foram isoladas e cada

colônia foi submetida a coloração de Gram. Foi observada o tipo de hemólise

do grupo de bactérias Gram-positivas, que por conseguinte, foram submetidas


Weber, C. R. 88

ao teste da catalase (determinação do gênero), coagulase, sensibilidade a

novobiocina, obtoquina e bile-esculina, teste de salinidade, testes de

assimilação de carboidratos (determinação da espécie). As bactérias Gram

negativas foram submetidas ao teste de oxidase, e de fermentação. Em

sequência, foram identificadas por testes bioquímicos convencionais

(Newprov® - Pinhais, Paraná, Brasil) (Figura 5.14). Os testes bioquímicos

utilizam 5 meios diferentes para as seguintes provas bioquímicas:

1. Desaminação do L-Triptofano (LTD) ou Triptofano-Desaminase

(TRI);

2. Produção de gás sulfídrico (H2S);

3. Fermentação da Glicose;

4. Descarboxilação da L-Lisina (LIS);

5. Produção de Indol (IND);

6. Descarboxilação da Ornitina (ORN);

7. Motilidade (MOT);

8. Utilização do citrato como única fonte de carbono;

9. Fermentação da Rhamnose.

Figura 5.14: Kit de identificação de Enterobacterias. Da esquerda para direita, respectivamente os meios: EPM (Meio Rugai modificado) (PESSOA e SILVA,

1974), Lisina, M.I.O. (Motilidade, Indol, Ornitina), Citrato de Simmons e Caldo Raminose.

A interpretação provas bioquímicas do kit de identificação, aliado a

prova de lactose observada no meio de isolamento foi realizada através do

manual fornecido pelo fabricante.


Weber, C. R. 89

5.10 Avaliação da microbiota intestinal

Nos animais eutanasiados e submetidos à necropsia, foram colhidas as

fezes da porção média do intestino delgado, de maneira asséptica, em tubos de

ensaio estéreis. As amostras coletadas foram imediatamente transportadas para

o Laboratório de Microbiologia do LIKA/UFPE, onde foram submetidas às

análises microbiológicas.

Para a análise microbiológica qualitativa foi utilizado o mesmo método

proposto por BISSO (2008). As amostras fecais foram armazenadas inicialmente

em solução salina estéril (NaCl 0,9%) qsp 10% (p/v). Após a homogeneização

mecânica foi semeado o volume de 0,01mL nos meios de cultura (Agar

Columbia + 5% sangue carneiro, Ágar bile-esculina Levine PolyviteX,

BioMérieux, Marcy I'Etoile, França) para pesquisa de micro-organismos

mesófilos aeróbios, enterococos e coliforme respectivamente e incubado 35±2°C,

durante 48 horas. As UFC serão contadas em cada meio seletivo, e os

enterococos e coliformes serão identificados também por suas características

coloniais e testes bioquímicos utilizando a mesma metodologia empregada na

identificação das bactérias nos fragmentos de órgãos.

5.11 Níveis Séricos de Interleucinas

As citocinas IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e GM-CSF

presentes no sangue dos camundongos foram dosadas por método de

dosagem de múltiplos analitos (Multiplex), utilizando kit comercial da BIO-

RAD (Hercules,CA). O ensaio foi realizado em duplicada, utilizando placa de

96 poços de fundo chato.

As amostras de sangue coletadas por punção cardíaca foram

armazenadas em Eppendorfs, centrifugadas a 3000 rpm por 10 min a 4°C.

Foram armazenadas por período inferior a dois meses sob temperatuda de -

80°C até a coleta de todas as amostras e realização da dosagem das citocinas. O

principio do ensaio é similar ao do ELISA sanduíche (Figura 5.15).


Weber, C. R. 90

Figura 5.15- Esquema do princípio de detecção do Bioplex.

Trata-se de um imunoensaio que utiliza bead (microesferas) magnéticas.

Os anticorpos de captura são dirigidos contra o biomarcador (citocinas)

desejado e estão covalentemente acoplado às microesferas magnéticas. Depois

de uma série de lavagens para remover a proteína não ligada, o anticorpo de

detecção biotinilado é adicionado para criar um complexo sanduíche

(BJURSTEN e HOERNQUIST, 2005). O complexo de detecção final é formado

com a adição do conjugado estreptavidina-ficoeritrina. Ficoeritrina serve como

um indicador fluorescente. A metodologia está explicitada na Figura 5.16.

Microesfera magnética

(Bead) Anticorpo de

captura

Citocina

anticorpo de detecção biotinilado

Estreptavidina

Marcador fluorescente Ficoritrina


Weber, C. R. 91

Figura 5.16- Esquema da metodologia Bioplex.

A leitura foi realizada por um sistema de leitura a laser (Bio-Rad Bio

Plex 200) onde a amostra passou por uma câmera de fluxo e os lasers

identificaram o analito. O laser verde detectou e quantificou os analitos

considerados, enquanto o laser vermelho classificou cada analito

simultaneamente (ANTONELLI, 2007).


Weber, C. R. 92

5.11 Análise estatística

Os resultados das variáveis quantitativas foram expressos por média e

desvio padrão e os resultados das variáveis qualitativas, por frequências

absolutas e relativas. A analise estatística consistiu numa aplicação do Teste t

de student para amostras independentes na comparação intra-grupos e o teste

ANOVA com comparações dois a dois utilizando o Teste de Bonferroni como

pós-teste na comparação entre gupos. O software utilizado foi o STATA versão

12 e a significância estatística para análise das hipóteses foi de 5%, ou seja, p

<0,05.


Weber, C. R. 93

6 - Resultados

6.1 ARTIGO 1

Parasitology Research

Avaliação dos níveis de IL-1β, INF-γ, IL-2, IL-4, IL-5 e IL-

10 em modelo murino de infecção pelo Schistossoma

mansoni associado a translocação bacteriana/sepse pós-

esplenectomia terapêutica.

Carlos Roberto Weber Sobrinho - Pós-Graduação em Medicina Tropical. Universidade

Federal de Pernambuco. Rua Rodrigues Ferreira, nº 45, Cidade Universitária, CEP: 50810-020, Recife, PE, Brasil. Responsável pelo projeto de pesquisa, execução da investigação, análise dos dados, escrita e formatação do artigo.

Maria Helena Madruga Lima Ribeiro - Biotério do Laboratório de Imunologia Keizo

Asami, LIKA/UFPE. Cidade Universitária, CEP: 50670-901, Recife, PE, Brasil.

Sandy Beatriz Gomes da Silva - Setor de Microbiologia do Laboratório de Imunologia

Keizo Asami, LIKA/UFPE. Cidade Universitária, CEP: 50670-901, Recife, PE, Brasil.

Clarissa Ataíde de Araújo - Setor de Microbiologia do Laboratório de Imunologia Keizo

Asami, LIKA/UFPE. Cidade Universitária, CEP: 50670-901, Recife, PE, Brasil.

Mônica Camelo Pessoa de Azevedo Albuquerque - Pós-graduação em Medicina

Tropical, Departamento de Parasitologia, Universidade Federal de Pernambuco. Cidade Universitária, CEP: 50670-901, Recife, PE, Brasil.

Célia Maria Machado Barbosa de Castro - Pós-graduação em Medicina Tropical e

Nutrição. Setor de Microbiologia do Laboratório de Imunologia Keizo Asami, LIKA/UFPE. Cidade Universitária, CEP: 50670-901, Recife, PE, Brasil.

Autor de correspondência:

Carlos Roberto Weber Sobrinho - Rua Rodrigues Ferreira, nº 45, Cidade Universitária, CEP: 50810-020, Recife, PE, Brasil. [email protected]

Este trabalho foi financiado pela UFPE and C. R. Weber recebeu recursos do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).


Weber, C. R. 94

Resumo

São inúmeras as evidências de imunodepressão provocadas pela

esquistossomose. Estudos demonstraram predomínio da resposta Th2 na forma

hepatoesplênica, modulação que poderia facilitar a translocação microbiana e

predispor à sepse, agravado ainda pela retirada do baço, órgão essencial na

defesa contra infecções bacterianas. Objetivando verificar o perfil sérico de

citocinas (IL-1β, INF-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10) nestas condições, foram

comparados os grupos controle, asplênicos e Sham (GI: infectados e GNI: não

infectados) compostos de camundongos fêmeas. Cada grupo com n=08 animais.

Foram realizados isolamentos de micro-organismos nas fezes, baço figado e

linfonodos mesentéricos bem como a contagem de ovos após 45 e 97 dias de

infecção cercariana. A ovoposição foi menor após 97 dias de infecção. O micro-

organismo mais comumente isolado em camundongos com TB e sepse

presumida pela elevado nivel de IL-1β foi a E. coli. Não houve efeito

significativo da esplenectomia ou da infecção sobre IL-2, IL4, INF-γ. A IL-5 foi

maior no GI sob procedimentos cirúrgicos. A IL-10 foi maior no GI. De um

modo geral, parece existir uma discreta modicação na produção de citocinas

influenciada pelo trauma cirúrgico.

Introdução

Os helmintos são conhecidos como reguladores da resposta imune do seu

hospedeiro (Maizels et al, 2004; Elliottet al, 2007). Sabe-se que a imunidade

eficaz frente a eles depende de uma forte resposta imunológica do tipo Th2

(Anthony et al. 2007; Allen et al. 2011). No Brasil, um potente indutor Th2 é o S.

mansoni, que apresenta taxas alarmantes de infecção, principalmente no

Nordeste (Frederich et al. 2007). A infecção está associada a fibrose periportal,

hepatoesplenomegalia e ascite e, apesar das medidas terapêuticas e de

prevenção, afeta cerca de 200 milhões de pessoas no mundo (Hortez et al. 2008;

Pearce et al. 2004; Schramm et al. 2010). Recentemente, demonstrou-se que a

resposta Th2 é controlada por células T regulatórias ovo específicas, que

diminui a reação fibrótica (Taylor et al. 2006; Wilson et al. 2007). Estudos


Weber, C. R. 95

comprovam que o mecanismo imunossupressor provocado pela infecção pelo S.

mansoni é estendido a antígenos não esquistossomóticos, como das bactérias

(Ator et al, 1994;. Sabin et al 1996). Estudos em modelo murino demostraram

que a diminuição da secreção de citocinas Th1 (IFN-γ e IL-2) concomitante ao

aumento do perfil Th2 (IL-4 e IL-5) causado pela presença de antígenos dos

ovos, promove imunodepressão na fase crônica da doença, o que poderia

facilitar graves infecções bacterianas incluindo a sepse(Araújo et al, 1977; Ferraz

et al., 1993; Elias et al., 2005). Associado a isso, a hiperplasia de células de defesa

causada pela longa duração da resposta imune contra antígenos do parasita,

bem como a congestão induzida pela fibrose periportal promove a

esplenomegalia, caracterizada pela pancitopenia (Ferraz et al. 2001; Kelner et al.

1992; Pereira et al. 1993). A esplenectomia em si não é o tratamento de escolha

para o pancitopenia hiperesplênica, mas na maioria das vezes, é realizada como

profilaxia às hemorragias digestivas. Alguns estudos verificaram a ocorrência

de infecção severa pós-esplenectomia (OPSI) caracterizando-as como sepse

fulminante, que se instala em função da incapacidade de opsonização de

bactérias encapsuladas, redução da síntese de tuftsina e properdina, por

deficiência primária de anticorpos, assim como perturbação da regulação imune

(Hansen et al. 2001; Peitzman et al. 2001; Di Sabatino et al. 2011; Peitzman et al.

2001; Brandt et al. 2001 ). Apesar do avanço das pesquisas, os desafios

permanecem na compreensão de como os helmintos toleram a resposta imune

gerada contra eles, bem como o modo de utilização desse conhecimento para

desenvolver novas formas de combater essas infecções e o agravamento delas.

Assim, o objetivo do presente estudo é verificar o perfil sérico de citocinas (IL-

1β, INF-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10) no desenvolvimento de sepse em

camundongos esquistossomóticos na fase crônica submetidos a esplenectomia.

Materiais e Métodos

Animais, infecção pelo S. mansoni e grupos de estudo


Weber, C. R. 96

Todos os camundongos (fêmeas da linhagem Swiss Webster - Mus

musculus) submetidos ao experiemento foram desmamados aos 21 dias de

nascidos e imediatamente separados em dois grupos. O primeiro grupo (GI,

n=24) foi infectado por via percutânea após 35 dias de nascidos com 50 cercárias

de S. mansoni, cepa São Lourenço da Mata. No 45° dia após a exposição às

cercarias, a infecção foi confirmada pelo método Kato-Katz (Katz et al. 1972) e

ao 97º dia da infecção, o mesmo método foi novamente realizado. O segundo

grupo (GNI, n=24) não foi exposto as cercárias e permaneceu sem infecção até o

final do experimento.

Ambos os grupos (GI e GNI) foram divididos em três subgrupos,

sendo cada um destes subgrupos submetidos a intervenções diferentes: E-

Esplenectomia total (n=8); S – Sham : Cirúrgia Controle (n=8); SP– Sem

procedimento (n=8).

O tempo de experimentação estabelecido no estudo foi de 14

semanas da infecção, uma vez que a fase crônica da doença esquistossomótica

murina é referenciada na literatura por iniciar a partir da 12ª semana do contato

com as cercárias (Fallon, 2000; Pearce et al. 2002). O protocolo de estudos foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal

de Pernambuco (n° .

Esplenectomia e Sham

Após 125 dias de nascidos, 16 camundongos fêmea (GI – n=8; GNI –

n=8) foram submetidos à laparotomia mediana, com esplenectomia total

convencional. Para isso foi realizada cirurgia aberta. Os camundongos foram

anestesiados com solução cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e cloridrato de

cetamina 10% (115 mg/Kg). Após anestesia geral, foi realizada a tricotomia da

área da incisão e cada camundongo foi colocado em decúbito dorsal semilateral

direito. Seguiu-se antissepsia com polivinilpirrolidona-iodo e foi utilizada

incisão subcostal esquerda.

Posteriormente ao acesso da cavidade abdominal, realizou-se a

inspeção à procura de baço e palpação para detectar aderência deste órgão.


Weber, C. R. 97

Procedeu-se, então, com dissecção do ligamento gastroesplênico e ligadura dos

vasos gástricos curtos. Localizou-se a artéria esplênica, com posterior reparo e

ligadura, fazendo-se leve compressão do pequeno baço (autotransfusão), que

possibilitou o retorno de parte do sangue à circulação sistêmica. O baço foi

mobilizado medialmente, fazendo-se secção dos ligamentos. Os animais que

foram a óbito durante a cirurgia foram excluídos do experimento e novos

camundongos incluídos. Realizou-se a dissecção da veia esplênica, seguida de

reparo e ligadura. Finalizou-se a cirurgia com dissecção do pedículo vascular e

exérese do órgão, seguida de nova inspeção da cavidade e síntese da parede

abdominal.

Em igual período de tempo ao grupo submetidos a esplenectomia,

16 camundongos fêmeas (GI – n=8; GNI – n=8) foram submetidos à

laparotomia exploradora para que sofressem o mesmo nível de estresse. As

condições e manobras cirúrgicas foram as mesmas utilizadas para o grupo

esplenectomizado, com anestesia e tricotomia da área de incisão. Cada

camundongo foi colocado em decúbito dorsal semilateral direito e utilizada

incisão subcostal esquerda para a exposição do baço. Posteriormente, houve a

manipulação do órgão e sua reintrodução a cavidade abdominal do animal

(Figura 5.11). A laparorrafia foi realizada também de maneira semelhante ao

grupo esplenectomizado. O procedimento foi realizado de modo semelhante

ao protocolo de Biondo-Simões et al. (2000).

Eutanásia e verificação da translocação microbiana/sepse

Sete dias após esplenectomia, todos os camundongos, inclusive os não

esplenectomizados, foram submetidos a eutanásia por overdose de anestésico.

A coleta do sangue periférico (0,5mL) foi realizada por punção caudal após

rigorosa assepsia da cauda e de todo o corpo do animal com iodopovidona

para evitar contaminação das amostras e/ou tubo com a microbiota residente e

transitória externa do camundongo.

Posteriormente, foi realizada tricotomia da região, seguindo-se da

antissepsia e incisão mediana xifo pubiana com auxílio de tesoura cirúrgica.


Weber, C. R. 98

Coletou-se na seguinte ordem, fragmentos do fígado, linfonodos mesentéricos

na região média do intestino delgado, fragmentos da porção distal do intestino

e material fecal desta região.

Todo material coletado foi submetido ao cultivo para verificação de

crescimento de micro-organismos. Fragmentos do fígado e linfonodos

mesentéricos foram macerados e homogeneizados separadamente em placas

de Petri estéreis. As amostras foram adicionadas a meio liquido de

enriquecimento na proporção de 1:5 (Caldo cérebro coração – BHI,

BioMérieux, Marcy I'Etoile, França) e incubados em estufa bacteriológica a

37°C/48horas.

Posteriormente, semeadas em placas de Petri contendo meios de cultivo

(Agar Columbia + 5% sangue carneiro, Levine PolyviteX, BioMérieux, Marcy

I'Etoile, França). A observação das placas foi realizada após 24-72 horas de

incubação. Após crescimento, as espécies bacterianas foram identificadas por

testes bioquímicos convencionais (MEWPROV® - Pinhais, Paraná, Brasil).

Avaliação da microbiota intestinal

Nos animais eutanasiados e submetidos à necropsia, foram colhidas as

fezes da porção média do intestino delgado, de maneira asséptica, em tubos de

ensaio estéreis. As amostras fecais foram armazenadas inicialmente em

solução salina estéril (NaCl 0,9%) qsp 10% (p/v). Após a homogeneização

mecânica foi semeado o volume de 0,01mL nos meios de cultura (Agar

Columbia + 5% sangue carneiro, Ágar bile-esculina Levine PolyviteX,

BioMérieux, Marcy I'Etoile, França) para pesquisa de micro-organismos

mesófilos aeróbios, enterococos e coliforme respectivamente e incubado

35±2°C, durante 48 horas. As UFC foram contadas em cada meio seletivo, e os

enterococos e coliformes foram identificados também por suas características

coloniais e testes bioquímicos utilizando a mesma metodologia empregada na

identificação das bactérias presentes nos fragmentos de órgãos.


Weber, C. R. 99

Níveis Séricos de Interleucinas

As citocinas IL-1β, IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-5 presentes no sangue dos

camundongos foram dosadas por método de dosagem de múltiplos analitos

(Multiplex), utilizando kit comercial da BIO-RAD (Hercules,CA). O ensaio foi

realizado em duplicada, utilizando placa de 96 poços. As amostras de sangue

coletadas por punção cardíaca (1,5mL), utilizando-se agulha 13 x 4,5 acoplada

à seringa descartável de 1 mL e foram armazenadas em Eppendorfs,

centrifugadas a 3000 rpm por 10 min a 4°C. Foram armazenadas por período

inferior a dois meses sob temperatuda de -80°C até a coleta de todas as

amostras.

A leitura foi realizada por um sistema de leitura a laser onde a amostra

passou por uma câmera de fluxo e os lasers identificaram o analito. O laser

verde detectou e quantificou os analitos considerados, enquanto o laser

vermelho classificou cada analito simultaneamente.

Apresentação e análise dos dados

Os resultados das variáveis quantitativas foram expressos por mediana,

média e desvio padrão e os resultados das variáveis qualitativas, por

frequências absolutas e relativas. A analise estatística consistiu numa aplicação

do Teste t de student para amostras independentes na comparação intra-

grupos e o teste ANOVA com comparações dois a dois utilizando o Teste de

Bonferroni como pós-teste na comparação entre gupos. O software utilizado

foi o STATA versão 12 e a significância estatística para análise das hipóteses foi

de 5%.

Resultados

A média do número de ovos por g/fezes foi maior no 45º dia que no 97º

dia da infecção (p=0,005) em todos os subgrupos. Entretanto, houve diferença

apenas no subgrupo de Esplenectomizados (E) (p<0,05), sendo a diferença na


Weber, C. R. 100

172 178164

154

99

141

0

50

100

150

200

250

SP E S

nd

e o

vo

s/ g

de f

eze

s

45° dia da infecção

97° dia da infecção•

ovoposição antes e depois da esplenectomia de aproximadamente 79%

(Gráfico 1).

Gráfico 1 - Número médio de ovos eliminados por g/fezes em camundongos

infectados por S. mansoni nos grupos Sem Procedimento (SP), Esplenectomizados (E) e Sham (S).

•Grupo com diferença: p<0,05


Weber, C. R. 101

Segundo a Tabela 1, entre os grupos infectados não houve diferença estatística significativa entre as medianas do número de

ovos coletados. No grupo esplenectomizado, todas as unidades amostrais tiveram sepse. A presença de micro-organismos nos

linfonodos foi detectada entre os roedores infectados de cada um dos grupos investigados. Micro-organismos no baço, fígado e

sangue foram encontrados em todos os indivíduos infectados, aumentando nos animais submetidos à esplenectomia do grupo

esplenectomizado, e em 62,5% dos animais infectados do grupo controle, sendo estes apenas no baço.

Tabela 1. Comparação dos grupos segundo condição de infecção.

Variáveis Sem procedimento Esplenectomizados Sham

GI GNI GI GNI GI GNI

N° de ovos* 156 (149,5; 156) - 169 (149,5; 195) - 162,5 (156; 175,5) -

Sepse - - 08 (100%) - - -

Presença de Micro-organismo

Fezes 08 (100%) 08 (100%) 08 (100%) 08 (100%) 08 (100%) 08 (100%)

Linfonodos 08 (100%) - 08 (100%) - 08 (100%) -

Baço 05 (62,5%) - 08 (100%) - - -

Fígado - - 08 (100%) - - -

Sangue - - 08 (100%) - - -

GI : Grupo infectado; GMI: Grupo não infectado; * p-valor = 0,922.


Weber, C. R. 102

A distribuição dos micro-organismos por grupos estão dispostos na Tabela 2,

tendo diferentes distribuições quanto ao sítio de infecção.

Tabela 2. Distribuição dos micro-organismos por sítio de infecção segundo os

grupos de comparação.

GI: Grupo Infectado; GNI: Grupo Não Infectado.

Na avaliação dos níveis de IL-1 , diferenças foram observadas (p < 0,05)

quando comparados os infectados entre subgrupos de comparação, onde o nível

médio de IL-1 foi maior no subgrupo esplenectomizados (43,9) quando

Micro-organismos Sem procedimento Esplenectomizados Sham

GI GNI GI GNI GI GNI

Citrobacter diversus Fezes (1/8) - - - - -

Citrobacter amalonaticus - - - Fezes (1/8) - Fezes (1/8)

Enterobacter agglomerans

Fezes (6/8)

Linfonodos (4/8)

Baço (2/8)

Fezes (3/8)

Fezes (2/8)

Linfonodos (1/8)

Fígado (1/8)

Sangue (1/8)

Fezes (1/8) - Fezes (2/8)

Enterobacter aerogenes - -

Fezes (1/8) Linfonodos (1/8)

Fígado (1/8)

Sangue (1/8)

Fezes (3/8) Fezes (6/8)

Linfonodos (5/8) Fezes (2/8)

Enterobacter gergoviae Fezes (1/8) - - - - -

Escherichia coli

Fezes (6/8)

Linfonodos (7/8)

Baço (5/8)

Fezes (5/8)

Fezes (7/8)

Linfonodos (7/8)

Fígado (7/8)

Sangue (6/8)



Hafnia alvei - - Fezes (1/8) Fezes (4/8) Fezes (1/8)


Klebsiella pneumoniae - Fezes (2/8) - Fezes (4/8) - -

Proteus mirabilis Fezes (2/8)

Linfonodos (2/8) Fezes (8/8) Fezes (2/8) - - -

Proteus rettgeri Fezes (3/8) - - Fezes (1/8) - -

Serratia liquefaciens Fezes (3/8) - - - - Fezes (1/8)

Serratia rubidae - - - - - Fezes (2/8)

Shigella boydii - -

Fezes (2/8)

Linfonodos (1/8)

Fígado (1/8)

Sangue (1/8)

- - -

Enterococcus faecalis Fezes (8/8) Fezes (8/8)

Fezes (7/8)

Linfonodos (3/8)

Fígado (3/8)



Enterococcus sp. - - - Fezes (5/8) - Fezes (2/8)

Staphylococcus coag. neg.

Fezes (3/8) - Fezes (2/8) Fezes (2/8) Fezes (2/8) Fezes (4/8)

Streptococcus viridans Fezes (2/8) - Fezes (5/8) Fezes (2/8) Fezes (1/8) Fezes (1/8)


Weber, C. R. 103

comparados ao subgrupo controle e com Sham. Não houve diferença quando

comparados os subgrupos controle e Sham. Comparando a média da IL-1 entre os

não infectados, não houve diferença (p = 0,264). Na comparação entre infectados e

não infectados intra-grupos, tanto no grupo esplenectomizado como no grupo sob

estresse cirúrgico a diferença foi que no grupo infectado houve maiores níveis

médios de IL-1 . Assim, em relação ao nível de IL-1 observa-se que há um efeito

do procedimento e da infecção (Gráfico 2).

Gráfico 2. IL-1 médio segundo os subgrupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p < 0,001) - SP x E (p < 0,001); E x S (p < 0,001) ** Grupo Não infectados: E x S (p = 0,264) ***Infectados versus não infectados: E (p< 0,001); S (p < 0,001) **** O SP não infectado não tinha observações

1,92 1,54

8,14

43,9

8,1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-1β

Sem procedimento Esplenectomizados Sham

GI GI GI GNI GNI GNI

SP E S


Weber, C. R. 104

Em relação aos níveis médio de IL-2, não houve diferença nas comparações

entre e intra-grupos, ou seja, não há efeito do procedimento nem da infecção

(Gráfico 3).

Gráfico 3. IL-2 média segundo os grupos sem procedimento (SP),

esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p = 0,449) ** Grupo Não infectados: E x S (p = 0,288) ** Infectados versus não infectados: E (p = 0,137); G3 (p = 0,215) **** O SP não infectado não tinha observações

26,626,627,6

27,1

29,3

0

5

10

15

20

25

30

35

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-2



E S SP


Weber, C. R. 105

Na análise do INF- observa-se grande variabilidade nos grupos infectados

submetidos a esplenectomia e estresse cirúrgico, o que explica não haver diferença

entre os grupos quando comparados ao controle, onde os níveis médios foram

maiores nestes grupos. Na comparação intra-grupos, não houve diferença em

nenhum dos grupos (Gráfico 4).

Gráfico 4. INF médio segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p = 0,789) ** Grupo Não infectados: ANOVA (p = 0,162) ** Infectados versus não infectados: SP (p = 0,888); E (p = 0,245); S (p = 0,229)


2,01,6

3,3

5,55,2

3,1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IN

Fγ


E S SP


Weber, C. R. 106

Em relação aos níveis médio de IL-4, não houve diferença nas comparações

entre e intra-grupos, ou seja, não houve efeito significativo do procedimento ou da

infecção (Gráfico 5).

Gráfico 5. IL-4 média segundo os grupos sem procedimento (SP),

esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p = 0,938) ** Grupo Não infectados: ANOVA (p = 0,721) ** Infectados versus não infectados: SP (p = 0,339); E (p = 0,435); S (p = 0,145)


13,1

15,015,314,613,5 14,0

0

5

10

15

20

25

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-4


E S SP


Weber, C. R. 107

Segundo os níveis de IL-5, houve diferença (p < 0,05) quando

comparados os infectados entre os diferentes subgrupos onde o nível médio de IL-5

foi maior no grupo sem procedimento, diferenciando-o dos grupos

esplenectomizados e Sham. Não houve diferença quando comparados os grupos

esplenectomizados e Sham entre si (p = 0,973). Comparando a média da IL-5 entre

os não infectados não houve diferença (p = 0,288). Na comparação entre infectados

e não infectados intra-grupos, houve diferença em todas os grupos. Observa-se que

os níveis médios de IL-5 se diferenciam entre os grupos entre os infectados e na

análise intra-grupo há um aumento da IL-5 sob a condição da infecção (Gráfico 6).

Gráfico 6. IL-5 média segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p < 0,001) – SP x E (p = 0,003); SP x S (p < 0,001); E x S (p = 0,973) ** Grupo Não infectados: ANOVA (p = 0,288) ** Infectados versus não infectados: SP (p < 0,001); E (p = 0,022); S (p < 0,001)

Diferença na produção de IL-10 não foi observada quando comparados

os infectados entre os três grupos. Não houve diferença quando comparadas as

médias entre os não infectados (p = 0,287). Na comparação entre infectados e não


10,410,8

16,7

12,811,8

10,7

0

5

10

15

20

25

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-5


E S SP


Weber, C. R. 108

infectados intra-grupos, houve diferença nos grupos sem procedimento e

esplenectomizado, com maior nível de IL-10 no grupo infectado (Gráfico 7).

Gráfico 7. IL-10 média segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p = 0,071) – SP x E (p = 1,000); SP x S (p < 1,000); E x S (p = 0,060) ** Grupo Não infectados: ANOVA (p = 0,287) ** Infectados versus não infectados: SP (p = 0,022); E (p = 0,001); S (p = 0,086)

Discussão

A maior morbidade da esquistossomose em camundongos está relacionada

com a reação do hospedeiro aos ovos postos pelos parasitas que residem nas

vênulas mesentéricas. A ovoposição inicia após 4 a 5 semanas de infecção, e

muitos ovos são transportados para o fígado, onde iniciam reação granulomatosa

(Cheever et al. 1994). Estes granulomas são mediados por uma complexa interação

de células e citocinas. O estudo mostrou que a liberação de ovos no estágio agudo

(45° dia após a exposição cercariana) foi maior comparado ao estágio crônico. É

sabido que o padrão de ovoposição pode variar de acordo com a fecundidade do


1,8 2,0

3,5

4,2

1,4

4,2

0

2

4

6

8

10

12

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-10

1,8 2,0

3,5

4,2

1,4

4,2

0

2

4

6

8

10

12

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-10

1,8 2,0

3,5

4,2

1,4

4,2

0

2

4

6

8

10

12

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-10

1,8 2,0

3,5

4,2

1,4

4,2

0

2

4

6

8

10

12

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-10

1,8 2,0

3,5

4,2

1,4

4,2

0

2

4

6

8

10

12

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-10


E S SP


Weber, C. R. 109

verme, idade do parasita e do hospedeiro (El Ridi et al. 1997), no entanto, na

investigação atual, houve uma homogeneidade de condições experimentais e

tempo de infecção, o que diminuem os viéses de confundimento. Desde muito

cedo, as provas da diminuição na ovoposição é atribuida a uma resposta imune

ativada precocemente pelo hospedeiro infectado (Damian, 1984; Bosshardt et al.

1986), sendo de amplo conhecimento que o SEA (Soluble Egg Antigens – Antígeno

Solúvel do Ovo), na infecção por S. mansoni, é necessário para induzir uma

resposta Th2 (Khalife et al. 2000; Meevissen et al. 2011). A redução no padrão de

ovoposição pós-explenectomia pode ser sugerida pela diminuição da IL-5.

Cheever et al. (1999) obveservaram, em seu estudo, que a mesma redução estava

associada a diminuição também da interleucina-4 (IL-4) e INF-γ. Contradizendo o

experimento de Cheever et al. (1999), nos camundongos pós-explenectomizados,

nao houve tal aumento do INF-γ e não houve alteração da IL-4, com diminuição

na contagem de ovos por gramas de fezes. Poucos são os estudos que relacionam a

diminuição no padrão de eliminação de ovos pelo hospedeiro e o perfil de

resposta imune, no entanto, sabe-se que INF-γ suprime a resposta Th2 (Schramm

et al. 2010), o que poderia ser o evento causal neste desfecho de ovoposição.

O desenvolvimento de infecções fulminantes, subsequentes à esplenectomia,

constitui outro ponto de grande impacto por ser um dos maiores riscos de óbito.

Translocação bacteriana (TB) foi originalmente definido por Berg et al (1973),

posteriormente descrito por Balzan (2007) como a passagem de bactérias viáveis,

endotoxina e/ou antígenos a partir do lúmen intestinal para a circulação,

causando inflamação sistêmica e lesões de órgãos distantes. Embora a TB possa

ocorrer em indivíduos saudáveis, a sua incidência em individuos

imunocomprometidos ou submetidos a procedimentos cirurgicos é alto, podendo

ser associada a graves complicações sépticas (MacFie et al. 2006, O’Boyle et al.

1998). A TB foi estudada como causa de sepse em individuos susceptíveis, sendo

evidenciada a partir de estudos clínicos e experimentais (Blackwell et a. 1996,

Strauss et al. 2003, Mattos et al. 2003). A TB pode ocorrer em uma variedade de

condições patológicas como asplenia, imunossupressão e helmintíases (Romond et

al. 2008, Alverdy et al. 2000, Stockbruegger et al. 1985, Nieuwenhuijs et al. 1998,


Weber, C. R. 110

Aranow et al.1996, Spaeth et al. 1994, Slocum et al. 1992). Estas condições

envolvem intensa resposta inflamatória ou hipotensão, hipercrescimento

bacteriano no intestino delgado, dano a barreira mucosa intestinal (Wells et al.

1995). No presente estudo, houve uma grande relação entre a TB e camundongos

esquistossomóticos esplenectomizados. Para Dietch et al. (1990) e Wiest et al.

(2003) o aumento da população de bactérias intraluminais é um importante e

provável mecanismo da translocação bacteriana. Esse aumento poderia ser

favorecido pelo desenvolvimento da resposta Th2 especifica contra o S. mansoni.

Além disso, a ausência do baço é refletida não apenas no seu papel como órgão

filtrante, mas também na atividade fagocítica de macrófagos, principais células

envolvidas na defesa contra bactérias (Shih-Ching et al., 2004, Feleder et al., 2006).

Estudos na última década caracterizam o baço como órgão vital na proteção do

hospedeiro contra micro-organismos invasores (Shih-Ching et al., 2004, Feleder et

al., 2006), sendo reafirmado pelo presente estudo, que revela taxa de 100% de

sepse em camundongos asplênicos (Tabela 1). Neste contexto, a sepse caracteriza-

se como uma séria condição associada à presença e persistência de um ou mais

micro-organismos patogênicos, particularmente bactérias gram-negativas

encapsuladas (Weighardt et al., 2008).

No presente estudo, comparado ao grupo controle, observou-se que a

ausência do baço promoveu o favorecimento da infecção sistêmica por bactérias

entéricas. Foi isolado um total de 17 patógenos, sendo estes de 13 espécies da

família Enterobacteriaceae, 2 enterococos e 2 linhagens do gênero Staphylococcus.

Observou-se que em todos os animais infectados (sem procedimento, sham e

esplenectomizados), pelo menos seis patógenos foram detectados e que a

combinação com a esplenectomia favoreceu a infecção por pelo menos cinco

patógenos diferentes na maioria dos indivíduos, destacando-se a prevalência de

infecção por E. coli. A mesma prevalência de infecção foi relatada por diversos

autores (Katouli et al. 2009, MacFie et al. 2006, Finfer et al. 2004, MacFie et al.

1999). Um fato importante é que o trato intestinal dos roedores é colonizado por

uma microbiota bastante estruturada. É característica destes animais a resistência

a diferentes bactérias gram-negativas. No entanto, o elevado número de


Weber, C. R. 111

camundongos colonizados e infectados por E. coli, em todos os grupos, e

particularmente, nos animais esplenectomizados, pode ser justificado por ser a

mais populosa dentre as bactérias da diversidade intestinal em murinos (Bleich et

al. 2012).

Algumas das bactérias isoladas foram descritas por Wells (1990) e

recentemente citadas como pertencentes ao grupo de bactérias intestinais capazes

de translocar (Fouts et al. 2012). Alguns trabalhos relatam que esta capacidade é

maior em linhagens bacterianas específicas que apresentam mais fatores de

colonização, como a cápsula (Pultz et al. 2005). No entanto, há casos de bactérias

não encapsuladas participarem significativamente de infecções fulminantes, uma

vez que outros fatores de virulência poderiam estar envolvidos (proteases,

hemolisinas e principalmente adesinas) (Rogers et al., 2009, Lammers et al., 2011).

Outras espécies com menores frequências em estudos similares foram Enterobacter

agglomenas e Enterococcus faecalis. A primeira é pertencente ao gênero identificado

em diversas investigações promissoras sobre o assunto (Townsend et al. 2007,

Stoll et al. 2004), no entanto, sobre a espécie isolada, nenhum estudo foi

encontrado na literatura que a reportasse. Já a segunda espécie foi descrita por

alguns autores - Wells et al. (1991), Shankar et al. (2001), Pultz et al. (2005) - e

embora gram-positiva, a capacidade de translocar foi a ela atribuída. Nenhuma

explicação sobre os fatores que facilitariam a colonização intestinal e disseminação

extraentérica de E. faecalis foi dada, apenas sugerido o local preferido de

penetração nos tecidos intestinais, especialmente pela E. coli, P. mirabilis e E.

faecalis.

Enquanto a maioria dos micro-organismos foi detectada nas fezes de todos

os indivíduos por razões óbvias, alguns membros não foram identificados,

possivelmente porque a composição e a diversidade da população de

enterobactérias nos mamíferos variam consideravelmente de indivíduo para

indivíduo (Schierck et al., 2007). Vale ressaltar que a atual investigação isolou da

microbiota intestinal, sem indício de translocação, as espécies Citrobacter diversus,

Citrobacter amalonaticus, Enterobacter gergoviae, Hafnia alvei, Klebsiella pneumoniae,

Proteus rettgeri, Serratia liquefaciens, Serratia rubidae, Staphylococcus coagulase


Weber, C. R. 112

negativa, Streptococcus viridans, as quais foram reportadas em poucos estudos

sobre translocação (Skinn et al. 2007, Silva et al. 2009, Wells et al. 1991). Nishioka

et al. (1992) comprovou associação entre bacteremia pelo gênero Serratia e

esquistossomose mansônica sem, no entanto, cogitar a possibilidade de

translocação.

Se por um lado, existe um grande percentual de translocação e sepse no grupo

infectado submetidos a esplenectomia, por outro, a translocação bacteriana pode

ocorrer sem o desenvolvimento necessário da sepse. A TB pode ser causada pela

resposta imune, e a mecanismos espoliativos do parasita (Katouli et al. 2009,

MacFie et al. 2006). Estudos mostram que a TB pode ocorrer de modo independente

de alterações no trato gastrointestinal, sendo chamada de translocação fisiológica.

Acredita-se que a translocação bacteriana fisiológica é necessária, uma vez que é

considerada um dos mecanismos moduladores do sistema imunológico entérico

(Wiest et al. 2003). No entanto, é importante observar que a translocação fisiologica

não é observada no estudo. O elevado percentual de micro-organismos nos

linfonodos e no baço dos animais infectados, do grupo sem procedimento, é um

claro exemplo da modulação da resposta imune pelo parasita. No grupo sem

infecção pelo S. mansoni não é observada presença de bactérias entéricas nos

órgãos, contradizendo os valores obtidos por Seehfer et al. (2004).

É bem esclarecido que a diminuição da resposta imune inata pós-

esplenectomia está correlacionada à sepse, particularmente provocada por

bactérias encapsuladas (King et al. 1952; Claret et al. 1975, Koren et al. 1984,

Schumacher 1970, Petroianu et al. 2003, Zweiguer et al. 2006, Rogers et al. 2009,

Lammers et al. 2011). É estabelecido na literatura que a esplenectomia total é

acompanhada de uma maior frequência de infecções durante toda a vida do

asplenico (King et al. 1952; Claret et al. 1975, Koren et al. 1984, Schumacher 1970,

Petroianu et al. 2003) .

Alguns estudos estabelecem modificações no perfil de resposta imune de

indivíduos esquistossomóticos asplênicos através da verificação dos níveis de IgM

e IgG (King et al. 1952; Claret et al. 1975, Koren et al. 1984, Schumacher 1970,

Petroianu et al. 2003). Essa situação se deve, com certeza, à imunodepressão


Weber, C. R. 113

verificada nos estados asplênicos (Chaimoff et al. 1978, Guerra et al. 1991,

Schumacher 1970, Petroianu et al. 2003) e agravada pela imunomodulação da

esquissomosose na fase hepatoesplênica ( Pearce et al. 2004).

A TB e sepse foram confirmados pela presença de bactérias em sítios

extraentéricos concomitante à elevação dos níveis séricos de IL-1β. O aumento de

IL-1β foi observado no grupo esplênico infectado. Segundo Blackwell et al. (1996),

quatro citocinas estão fortemente associadas com a sepse: TNF, IL-1, IL-6 e IL-8.

Considerados mediadores precoces, o TNFα e a IL-1β, e quando perfundidos

promove um estado semelhante à sepse, enquanto bloqueadores específicos de

ambos revogam algumas das manifestações na sepse experimental (Dinarello

1991, Smith et al. 1990, Emerson et al. 1992, Hinshaw et al. 1992, Redl et al. 1993).

A IL-1β tem sido reportada como importante mediador inflamatório em múltiplas

doenças (Auron 2010, García-González et al. 2009) e é a forma predominante da

família de IL-1 produzido por monócitos estimulados por endotoxina, sendo

detectada no plasma de animais sépticos (Blackwell et al. 1996). Fischer et al.

(1992) relataram que a diminuição dos níveis desta citocina (mas não TNFα)

melhorou a sobrevivência de animais infectados por E. coli. É necessário enfatizar

que estudos em humanos (Casey et al. 1993, Goldie et al. 1995) relatam que

somente 37% dos indivíduos com sepse apresentaram concentrações plasmáticas

inicialmente detectáveis de IL-1β o que discorda do nosso estudo. No entanto, a

média da concentração IL-1β nesses estudos é significativamente maior nos

pacientes com sepse comparados aos pacientes criticamente doentes sem sepse,

ainda que a concentração inicial de IL-1 no plasma não preveja mortalidade.

Alguns estudos anteriores demonstraram uma associação entre a produção

de citocinaTh2 e a intensidade da infecção pelo S. mansoni (Zwingerber et al. 1991,

Williams et al. 1994, Araújo et al. 1994, Viana et al. 1994). Estes estudos revelaram

que a intensidade da infecção está correlacionada com aumento dos níveis séricos

de IL-4 contradizendo o presente trabalho. Em outro estudo, o desenvolvimento

da doença hepatoesplênica foi associada com respostas Th1 (Mwatha et al. 1998).

O nosso estudo não mostrou diferença significativa da IL-2 (citocina o perfil

Th1) entre asplênicos infectados com sepse e os demais grupos contradizendo o


Weber, C. R. 114

trabalho de Reynalds et al. (1995), a qual relata que a alta concentração sérica de

IL-2 promove translocação de E. coli e S. aureus do intestino. Esta contradição pode

estar relacionada a modulação da resposta imune pela infecção com S. mansoni,

que estando na fase crônica justificaria a baixa variação da IL-2 (Montenegro et al.

1999). Vale salientar que estudos mais recentes associam a IL-2 a uma redução na

carga parasitária (Watanabe et al. 2004, El Ridi et al. 2006).

Alguns estudos mostram que a resposta imune no período pré-patente da

infecção pelo S. mansoni é tipicamente Th1, com grande produção de INF-γ e baixa

produção de IL-4, IL-5 e IL-10. Dados na literatura evidenciaram que tanto as

celulas Th1 (secretoras de INFγ e IL-2) como células do tipo Th2 (secretoras de IL-

4, IL5 e IL-10) tornam-se sensibilizadas e contribuem para a formação do

granuloma. No entanto, na fase crônica da infecção a variação de IL-2 é baixa uma

vez que a resposta do tipo Th1 é reduzida, permanecendo as funções associadas

apenas a Th2 (Montenegro et al. 1999, Jesus et al. 2002). É importante salientar que

é prevista a diminuição da síntese de IFN-γ nos camundongos submetidos ao

procedimento cirúrgico como parte integrante da resposta inflamatória prevista

após trauma cirúrgico ou sepse, no entanto, nao se confirma no estudo. As

consequências deste mecanismo sobre a liberação de citocinas pró e anti-

inflamatórias não estão totalmente elucidadas, no entanto, a diminuição na síntese

de IFN-γ pode impedir uma estimulação excessiva do sistema imunológico não-

específico, através de níveis elevados de TNF-α (FRANKE et al., 2006). Embora

alguns estudos como o de Teixeira-Carvalho (2004) mostraram uma produção

significativa de INF-γ, muitos estudos sugerem que a produção do INF-γ parece

não ser o controle principal da proliferação de Linfócitos T em indivíduos

esquistossomóticos na fase crônica hepatoesplênica como comprovado (Viana et

al. 1994, Araújo et al. 1996).

Entre as citocinas envolvidas na regulação da resposta à esquistossomose, IL-

10 é, sem dúvida, uma molécula chave (King et al. 1996, Malaquias et al. 1997,

Montenegro et al. 1999, Fallon et al. 2000, Reiman et al. 2006). A IL-10

aparentemente contribui para a diminuição de IFN-γ observado principalmente

em indivíduos com mais de 100 ovos/g de fezes (Silveira et al. 2004). Alguns


Weber, C. R. 115

estudos sugerem uma correlação inversa entre estas duas citocinas, indícios

possivelmente visualizados em nosso estudo. No presente estudo foram

detectadas diferenças nas concentrações de IL-10 apenas em esquistossomóticos e

não infectados, confirmando o estudo de Brandt et al (2010).

Se por um lado os resultados apresentados pelo presente estudo corroboram

com alguns relatos da literatura, por outro, foram de encontro a alguns estudos

recentes. Apesar disso, cabe salientar que diferenças entre os níveis de citocinas,

foco das contradições entre a maioria dos estudos, podem sofrer influência de

diversos fatores como tempo de infecção, tipo de anestésico utilizado (Garcia et al.

2002) e metodologia empregada. E ainda tais contradições possam ocorrer, o

estudo traduz a importância de mais estudos sobre o tema.

Conclusões e perspectivas

No presente estudo observa-se diminuiu ovoposição após a esplenectomia,

podendo ser causado pela diminuição da IL-5. Todos os camundongos

esplenectomizados apresentaram sepse, apresentado como agente microbiano

pelo menos cinco patógenos diferentes na maioria dos indivíduos destacando a

prevalência de infecção por E. coli. Faz-se necessário destacar que a IL-1β, mesmo

em camundongos asplenicos, está aumentada, o que pode assegurar o quadro

septico. O INF-γ, IL-2 e IL-4 não sofreram influência da esplenectomia,

possivelmente atribuida a perda de células produtoras. O estresse cirúrgico gerou

diminuição da IL-5 nos infectados. A IL-10 sofreu diminuição dos níveis séricos

em camundongos esplenectomizados. Esse estudo vem a ser somado a outros

anteriores sobre a resposta imune a esquistossomose a fim de ampliar o tema.

O conhecido sobre o perfil de resposta imune na esquistossomose mansônica

foi adquirido, em sua grande parte, por estudos realizados em animais roedores,

com extrapolação, em alguns casos, para infecções humanas. Essas descobertas

foram bastante importantes para o entendimento da patogênese e podem sugerir

novos caminhos para pesquisas futuras. Observar as alterações imunológicas

relacionadas às co-infecções, bem como aquelas oriundas de possíveis

procedimentos cirúrgicos podem facilitar o tratamento criando alternativas que


Weber, C. R. 116

promovam melhoria no prognóstico. Tais estudos combinados com pesquisas

moleculares de interações do parasita-hospedeiro trarão informações essenciais

para o desenvolvimento de medidas profiláticas e terapêuticas mais eficientes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Dra. Janete Magali de Araújo, chefe do

Laboratório de Genética de Micro-organismos do Dept. de Antibióticos - UFPE .

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7867356


Weber, C. R. 124

6.2 ARTIGO 2

Revista do Instituto Brasileiro de Medicina Tropical de

São Paulo.

Avaliação dos níveis de IL-1β, TNF-α, IL-12 e GM-CSF

na translocação bacteriana/sepse pós-esplenectomia

terapêutica em camundongos infectados pelo Schistosoma

mansoni.

Carlos Roberto Weber Sobrinho - Pós-Graduação em Medicina Tropical. Universidade Federal de Pernambuco. Rua Rodrigues Ferreira, nº 45, Cidade Universitária, CEP: 50810-020, Recife, PE, Brasil. Responsável pelo projeto de pesquisa, execução da investigação, análise dos dados, escrita e formatação do artigo.

Maria Helena Madruga Lima Ribeiro - Biotério do Laboratório de Imunologia Keizo Asami, LIKA/UFPE. Cidade Universitária, CEP: 50670-901, Recife, PE, Brasil.

André de Lima Aires – Laboratório de Parasitologia da UFPE. Pós-Graduação em Medicina Tropical. Universidade Federal de Pernambuco.

Célia Maria Machado Barbosa de Castro - Pós-graduação em Medicina Tropical e Nutrição. Setor de Microbiologia do Laboratório de Imunologia Keizo Asami, LIKA/UFPE. Cidade Universitária, CEP: 50670-901, Recife, PE, Brasil.

Autor de correspondência:

Carlos Roberto Weber Sobrinho - Rua Rodrigues Ferreira, nº 45, Cidade Universitária, CEP: 50810-020, Recife, PE, Brasil. [email protected]

Este trabalho foi financiado pela UFPE e C. R. Weber recebeu recursos do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).


Weber, C. R. 125

Resumo

A resposta Th2 foi amplamente discutida como predominante na forma

hepatoesplênica da esquistossomose. Sabe-se que a modulação da respota imune

com o perfil Th2 poderia facilitar a translocação microbiana e predispor à sepse.

Esse quadro poderia ser agravado com retirada do baço, órgão essencial na defesa

contra infecções bacterianas. O objetivo do presente estudo é verificar o perfil sérico

das citocinas IL-1β, TNF-α, IL-12 e GM-CSF nestas condições, comparando os

grupos infectados (n=24) e nao infectados (n=24) sob três aspectos (controle,

asplênicos e Sham) compostos de camundongos Swiss webster fêmeas. Foram

realizados isolamentos de micro-organismos nas fezes, e verificada a sua presença

no baço, fígado e linfonodos mesentéricos bem como a contagem de ovos após 45 e

97 dias de infecção cercariana. A ovoposição foi maior após 97 dias de infecção. O

micro-organismo mais comumente isolado em camundongos com TB e sepse

presumida pelo elevado nível de IL-1β foi E. coli. Na análise do TNF- , foi

observada diferença quando comparados os infectados entre os grupos controle e

Sham, onde a média de TNF-α entre os controles foi maior. Na avaliação dos níveis

de IL-12 não foram observadas diferenças quando comparados os infectados. O

grupo infectado apresentou níveis médios maiores de GM-CSF. Ainda que de

maneira discreta, parece existir alterações na produção de citocinas influenciada

pelo trauma cirúrgico.

Introdução

O processo patológico associado à esquistossomose decorre principalmente

da reação fibrótica dirigida contra os ovos. Uma característica imunobiológica da

esquistossomose é a redução gradual e espontânea na inflamação granulomatosa

periovular1. Esse fenômeno, denominado imunomodulação, tem sido o objeto de

numerosos estudos que relatam a participação de células e citocinas2,3,4. Estudos em

modelo murino demostraram que a diminuição da secreção de citocinas Th1 (IFN-γ

e IL-2) pelas células hepáticas, concomitante ao aumento da secreção de citocinas

do perfil Th2 (IL-4 e IL-5) causado pela presença de antígenos dos ovos, promove

imunodepressão na fase crônica da doença, o que poderia facilitar translocação,


Weber, C. R. 126

infecções bacterianas graves permitindo a sepse Reconhece-se hoje que a

resistência a micro-organismos intracelulares, incluindo bactérias encontra-se

ligada a indução da resposta Th1, em particular as citocinas ativadoras de

macrófagos, INF-γ5-9. É de amplo conhecimento que a esquistossomose, em

indivíduos residentes em áreas endêmicas, pode levar a uma forma mais grave

denominada hepatoesplênica. A esplenectomia nesses pacientes é uma opção

terapêutica eficaz, indicada em casos de hipertensão portal grave com sagrameto

digestivo10. No entanto, a intervenção cirúrgica pode resultar em pancitopenia e

agravamento da imunodepressão11-13. O baço desempenha um papel importante

nas funções imunes do hospedeiro. Estudos demonstraram que sua remoção

resulta em menor secreção de imunoglobulinas, bem como diminuíção na

capacidade de depuração de partículas no sangue e de endotoxina, além da

redução na atividade fagocítica de celulas mononucleares e alterações na função e

no número de células T14-19. Por isso, a infecção pós-esplenectomia (OPSI) tornou-se

uma complicação bem reconhecida na população asplênica pediátrica e adulta20-24.

Em animais de experimentação foi verificada alterações na resposta imune frente a

bactérias, principalmente Escherichia coli25,26, por prejudicar a atividade bactericida

dos macrófagos a produção TNF-α17, 18. No entanto, ainda existem poucos estudos

que relatam a variação na alteração do perfil de citocinas levando em consideração

a modulação da esquistossomose, a imunodepressão causada pela esplenectomia e

desenvolvimento da translocação/sepse. O presente estudo objetivou verificar o

perfil de quatro citocinas (IL-1β, TNF-α, IL-12 e GM-CSF) e nesse contexto a

ocorrência de sepse.

Materiais e Métodos

Animais, infecção pelo S. mansoni e grupos de estudo

Foram utilizados camundongos fêmea (Swiss Webster - Mus musculus)

desmamados aos 21 dias de nascidos. Foram separados em dois grupos. O primeiro

grupo (GI, n=24) foi infectado por via percutânea (50 cercárias de S. mansoni - cepa

São Lourenço da Mata) 14 após o desmame (Figura 1).


Weber, C. R. 127

Grupo Infectado pelo S. mansoni

n=24

Esplenectomizado

n=08

Sham

n=08

Sem procedimento

n=08

Grunpo não infectado

n=24

Esplenectomizado

n=08

Sham

n=08

Sem procedimento

n=08

Figura 1 – Distribuição de grupos experimentais.

A infecção foi confirmada pelo método Kato-Katz (Katz et al. 1972) 45 dias

após a exposição cercariana. O segundo grupo (GNI, n=24) não foi exposto as

cercárias e permaneceu sem infecção até o final do experimento.

Os dois grupos (GI e GNI) foram divididos em três subgrupos: E-

Eplenectomia total (n=8); S – Sham; Cirúrgia Controle (n=8); SP– Sem

procedimento (n=8).

Devido a fase crônica de a esquistossomose murina ser referenciada na

literatura por iniciar a partir da 12ª semana do contato com as cercárias, o tempo de

experimentação estabelecido no estudo foi de 14 semanas após infecção (Fallon,

2000; Pearce et al. 2002). O protocolo de estudos foi aprovado pelo Comitê de Ética

em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Pernambuco.

Esplenectomia e Sham

Os procedimentos foram realizados em 16 indivíduos com 125 dias de

nascidos (GI – n=8; GNI – n=8) foram submetidos à laparotomia mediana, com

esplenectomia total convencional através de cirurgia aberta. Os camundongos

foram anestesiados com solução cloridrato de xilazina 2% (10 mg/Kg) e cloridrato

de cetamina 10% (115 mg/Kg). Após anestesia geral, foi realizada a tricotomia da

área da incisão e cada camundongo foi colocado em decúbito dorsal semilateral


Weber, C. R. 128

direito. Seguiu-se antissepsia com polivinilpirrolidona-iodo, sendo utilizada incisão

subcostal esquerda.

Foi realizada a inpeção da cavidade abdominal à procura de baço e palpação

para detectar sua aderência. Logo após, foi realizada a dissecção do ligamento

gastroesplênico e ligadura dos vasos gástricos curtos. Localizou-se a artéria

esplênica, com posterior reparo e ligadura, realizando compressão leve do orgão

(autotransfusão), possibilitando o retorno sanguíneo à circulação sistêmica. O baço

foi mobilizado medialmente, fazendo-se secção dos ligamentos. Realizou-se a

dissecção da veia esplênica, seguida de reparo e ligadura. Finalizou-se a cirurgia

com dissecção do pedículo vascular e exérese do órgão, seguida de nova inspeção

da cavidade e síntese da parede abdominal. Vale ressaltar o experimento não sofre

interferência da perda por óbitos, uma vez que os indivíduos nesta condição foram

substituídos.

Em igual período de tempo ao grupo esplenectomizado, 16 camundongos

fêmeas (GI – n=8; GNI – n=8) foram submetidos à laparotomia exploradora com

intuito de sofrerem o mesmo nível de estresse. As condições e manobras cirúrgicas

foram as mesmas utilizadas para ambos os grupos. Cada camundongo foi colocado

em decúbito dorsal semilateral direito e utilizada incisão subcostal esquerda para a

exposição do baço. Posteriormente, houve a manipulação do órgão e sua

reintrodução a cavidade abdominal do animal (Figura 5.11). A laparorrafia foi

realizada também de maneira semelhante ao grupo esplenectomizado. O

procedimento foi realizado de modo semelhante ao protocolo de Biondo-Simões et

al. (2000).

Eutanásia e verificação da translocação microbiana/sepse

Em um período de aproximadamente sete dias após esplenectomia, todos os

subgrupos de camundongos foram submetidos a eutanásia por overdose de

anestésico. A coleta do sangue periférico (0,5mL) foi realizada por punção caudal

após rigorosa assepsia da cauda e de todo o corpo do animal com iodopovidona

para evitar contaminação das amostras e/ou tubo com a microbiota residente e

transitória externa do camundongo.


Weber, C. R. 129

Foi realizada tricotomia da região ventral, antissepsia e posterior incisão

mediana xifo pubiana com auxílio de tesoura cirúrgica. Foram coletados

fragmentos do fígado, linfonodos mesentéricos na região média do intestino

delgado, fragmentos da porção distal do intestino e material fecal desta região,

seguindo esta ordem.

Fragmentos do fígado e linfonodos mesentéricos foram macerados e

homogeneizados separadamente em placas de Petri estéreis e adicionadas a meio

liquido de enriquecimento na proporção de 1:5 (Caldo cérebro coração – BHI,

BioMérieux, Marcy I'Etoile, França), posteriormente incubados em estufa

bacteriológica a 37°C/48horas.

Veridicada a turvação, alíquotas do meio foram semeadas em placas de Petri

contendo meios de cultivo (Agar Columbia + 5% sangue carneiro, Levine

PolyviteX, BioMérieux, Marcy I'Etoile, França). Após 24-72 horas de incubação as

placas fram observação, verificando crescimento, as espécies bacterianas foram

submetidas a coloração de gram e identificadas por testes bioquímicos

convencionais (MEWPROV® - Pinhais, Paraná, Brasil).

Avaliação da microbiota intestinal

Nos animais eutanasiados e necropsiados, foram coletadas fezes da porção

média do intestino delgado, de maneira asséptica. As amostras fecais foram

adicionadas à solução salina estéril (NaCl 0,9%) qsp 10% (p/v). Após a

homogeneização mecânica foi semeado o volume de 0,01mL nos meios de cultura

(Agar Columbia + 5% sangue carneiro, Ágar bile-esculina Levine PolyviteX,

BioMérieux, Marcy I'Etoile, França) para pesquisa de micro-organismos mesófilos

aeróbios, enterococos e coliforme respectivamente e incubado 35±2°C, durante 48

horas. Os enterococos e coliformes foram identificados também por suas

características coloniais e testes bioquímicos utilizando a mesma metodologia

empregada na identificação das bactérias presentes nos fragmentos de órgãos.


Weber, C. R. 130

Níveis Séricos de Interleucinas

As citocinas IL-1β, TNF-α, IL-12 e GM-CSF presentes no sangue dos

camundongos foram dosadas por método de dosagem de múltiplos analitos

(Multiplex), utilizando kit comercial da BIO-RAD (Hercules,CA). O ensaio foi

realizado em duplicada, utilizando placa de 96 poços. As amostras de sangue

coletadas por punção cardíaca (1,5mL), utilizando-se agulha 13 x 4,5 acoplada à

seringa descartável de 1 mL e foram armazenadas em Eppendorffs, centrifugadas a

3000 rpm por 10 min a 4°C. Foram armazenadas por período inferior a dois meses

sob temperatuda de -80°C até a coleta de todas as amostras.

A leitura foi realizada por um sistema de leitura a laser onde a amostra

passou por uma câmera de fluxo e os lasers identificaram o analito. O laser verde

detectou e quantificou os analitos considerados, enquanto o laser vermelho

classificou cada analito simultaneamente.

Apresentação e análise dos dados

Os resultados das variáveis quantitativas foram expressos por mediana,

média e desvio padrão e os resultados das variáveis qualitativas, por frequências

absolutas e relativas. A analise estatística consistiu numa aplicação do Teste t de

student para amostras independentes na comparação intra-grupos e o teste

ANOVA com comparações dois a dois utilizando o Teste de Bonferroni como pós-

teste na comparação entre gupos. O software utilizado foi o STATA versão 12 e a

significância estatística para análise das hipóteses foi de 5%.

Resultados

Todos os indivíduos pertencentes so grupo esplenectomizadoapresentaram

sepse. A presença de micro-organismos nos linfonodos foi detectada entre os

roedores infectados de cada um dos grupos investigados. Micro-organismos no

baço, fígado e sangue foram encontrados em todos os indivíduos infectados,

aumentando nos animais submetidos à esplenectomia do grupo

esplenectomizado, e em 62,5% dos animais infectados do grupo controle, sendo

estes apenas no baço.


Weber, C. R. 131

O micro-organismo de maior prevalência na translocação foi a bactéria gram-

negativa Escherichia coli, com aproximadamente 75%, sendo encontrada em todos

os compartimentos investigados, seguinda da Enterobacter aglomerans e Shigella

boydii. Ambas com prevalência de aproximadamente 12% entre os camundongos

que apresentaram translocação bacteriana (TB).

Na avaliação dos níveis de IL-1 , diferenças (p < 0,05) foram observadas

quando comparados os infectados entre subgrupos de comparação:

Esplenectomizado (E), Sham (S) e sem procedimento cirúrgico (SP). O nível médio

de IL-1 foi maior no subgrupo esplenectomizados (43,9) quando comparados ao

subgrupo controle e com Sham. Não houve diferença quando comparados os

subgrupos controle e Sham. Comparando a média do IL-1 entre os não infectados,

não houve diferença, com p apresentado de 0,264. Na comparação entre infectados

e não infectados intra-grupos, tanto no grupo esplenectomizado como no grupo

sob estresse cirúrgico a diferença foi que no grupo infectado houve maiores níveis

médios de IL-1 . Assim, em relação ao nível de IL-1 observa-se que tanto a

esplenectomia quanto a infecção exercem influência sobre ela.

Na análise do TNF a diferença foi observada quando comparados os

infectados entre os grupos controle e Sham. O grupo infectado sem procedimento

cirúrgico apresentou maior média de TNF . Não houve diferença quando

comparadas as médias entre os não infectados (p = 0,527). Na comparação entre

infectados e não infectados intra-grupos, houve diferença apenas no grupo

controle. O maior nível de TNF foi observado no grupo infectado sem

procedimento (Gráfico 1).


Weber, C. R. 132

Gráfico 1. TNF médio (pg/mL) segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p = 0,019) – SP x E (p = 0,166); SP x S (p = 0,019); E x S (p = 0,976) ** Grupo Não infectados: ANOVA (p = 0,527) ** Infectados versus não infectados: SP (p = 0,042); E (p = 0,269); S (p = 0,326)

Na avaliação dos níveis de IL-12, quando comparados os infectados entre os

tres subgrupos (SP, E e S) é possível observar uma grande variabilidade de

valores, justificando assim, não haver diferença entre os eles. Comparando os não

infectados, também não houve diferença (p = 0,311). Na comparação entre

infectados e não infectados intra-grupos, não houve diferença em nenhum dos

grupos (Gráfico 2).

Sem procedimento Esplenectomizados Estresse cirúrgico

10,610,2

10,9

12,4

10,2

11,0

0

2

4

6

8

10

12

14

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

TN

Fα


E S SP


Weber, C. R. 133

Gráfico 2. IL-12 média (pg/mL) segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Sham (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p = 0,052) – SP x E (p = 0,064); SP x S (p = 1,000); E x S (p = 0,199) ** Grupo Não infectados: ANOVA (p = 0,311) ** Infectados versus não infectados: SP (p = 0,197); E (p = 0,745); S (p = 0,767)

Na análise de GM-CSF há uma homogeneidade intra e entre grupos, com

pequenas variabilidades, havendo diferenças entre os não infectados, na

comparação entre os grupos controle e Sham. Diferença entre os níveis séricos de

GM-CSF foi observada entre os infectados e não infectados do grupo sob estresse

cirúrgico (Sham) onde o grupo infectado apresentou níveis médios maiores de

GM-CSF (Gráfico 3).


33,3

21,3

39,9

19,4

35,3

25,1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

IL

-12


E S SP


Weber, C. R. 134

Gráfico 3. GM-CSF (pg/mL) médio segundo os grupos sem procedimento (SP), esplenectomizado (E) e Estresse cirúrgico (S), e sob a condição de infecção.

* Grupo infectados: ANOVA (p = 0,071) – SP x E (p = 1,000); SP x S (p = 0,134); E x S (p = 0,143) ** Grupo Não infectados: ANOVA (p = 0,014) – SP x E (p = 0,153); SP x S (p = 0,013); E x S (p = 0,367) ** Infectados versus não infectados: SP (p = 0,958); E (p = 0,187); S (p = 0,004)

Discussão

O ovo é o agente patogênico primário na esquistossomose crônica

experimental. É a partir da ovoposição que é desenvolvida uma reação

granulomatosa27,28,29. O presente estudo demonstrou uma tendência reducional, ao

longo do tempo, no padrão de ovoposição, ainda que a diferença tenha sido

encontrada apenas na população murina esplenectomizada. Muitos relatos sobre a

redução da fecundidade do S. mansoni na infecções crônica experimental sugerem

o perfil de resposta imune do hospedeiro como causa30,31,32. Em modelos

experimentais, lesões hepáticas com formação do granuloma foram associadas a

TNFα. Alguns estudos relacionam também ao aumento da IL-1 e IFN-γ 33,34,35. No

presente estudo a IL-1β foi observada de maneira proeminente em camundongos


5,15,25,3 5,3

5,6

5,3

0

1

2

3

4

5

6

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Infectados Não

infectados

Mé

dia

do

GM

-CS

F


E S SP


Weber, C. R. 135

esplenectomizados infectados. Este achado parece estar relacionado não apenas a

parasitose, mas a translocação e sepse. Considerada mediador precoce da sepse

juntamente com o TNFα, a IL-1β tem sido reportada em modelos experimentais

em múltiplas doenças inflamatórias36,37. Esta hipótese é corroborada também por

Fischer e colaboradores38 que relataram a diminuição dos níveis desta citocina

(mas não TNFα) na melhoria na sobrevida de animais infectados por E. coli. Além

disso, o presente estudo verificou no grupo com aumento dos níveis séricos desta

citocina a prevalência também da E.coli e uma maior debilidade dos camundongos

esplenectomizados, isto é, concordante em mais um aspecto com o estudo de

Ficher38. O TNFα, apesar de também ser um mediador da resposta inflamatória

envolvido na formação do granuloma esquistossomótico, bem como na maior

gravidade da sepse, não apresentou comportamento semelhante ao da IL-1β. O

estudo de Kang e colaboradores39 indica que a capacidade de produção de TNFα,

em duas semanas após esplenectomia pelos macrófagos alveolares, células de

kupffer e macrófagos peritoneais foi aumentada, enquanto a produção por PBMC

e macrófagos dos linfonodos foi suprimida sob as mesmas condições. Os

diferentes estímulos causados pelo procedimento cirúrgico às células produtoras

de TNFα poderiam justificar o comportamento encontrado pelo presente trabalho.

Na IL-12, apesar da incapacidade de afirmar que existe diferença, através dos

dados obtidos, podemos sugerir a redução dos níveis séricos desta citocina no

grupo esplenectomizado. Se por um lado, existe indício de aumento na produção

da IL-12 pelo grupo infectado sem procedimento, por outro lado o grupo

esplenectomizado apresenta uma tendência a reduzir os níveis séricos. Sabe-se

que antígenos do S. mansoni são capazes de ativar células dendríticas levando a

um aumento na expressão de CD40 e CD86 e na produção de IL-12 e TNF-α40. A

tendência a diminuição da IL-12 em camundongos esplenectomizados poderia

estar relacionada a aumento da IL-10. Cabe salientar que a IL-10 inibe o IFN-γ

produzido pelas células Natural Killers, fato que justifica a modulação da resposta

imune com a polarização Th2 na esquistossomose crônica41. Esse mesmo

mecanismo foi observado culminando também na supressão da IL-1236,37. Estudos

referenciam que a IL-12 promove a produção de níveis elevados de IL-10, o que


Weber, C. R. 136

parece ser um mecanismo regulatório33,42. No nosso estudo, o fator estimulador de

granulócitos e macrófagos/monócitos (GM-CSF) apresentou níveis séricos entre

os grupos bastante homogêneos. Sabe-se que a IL-1β e o TNFα estimulam a

produção do GM-CSF, importante em doenças inflamatórias mediadas por

eosinófilos43. No entanto, no trabalho aqui apresentado não é percebido a

influencia de ambas na indução da produção do GM-CSF. No entanto, é preciso

observar possíveis interferências de outras citocinas, bem como do tipo de

anestésico utilizado nos experimentos44.

Conclusões e perspectivas

No presente estudo é possível demonstrar que o TNFα e IL-12 sofreram

influencia do processo cirúrgico, no entanto não sofreram influências da infecção

parasitária. O GM-CSF parece haver associação com o TNFα, sem entretanto

sofrer influência direta da esplenectomia. O GM-CSF não varia de acordo com a

IL-12, como demonstrado por alguns autores.

Esses dados vêm contribuir com conhecimento do perfil de citocinas na

infecção esquistossomótica. Estudos adicinais utilizando a biologia molecular para

verificar o perfil de citocinas, bem como as interações do parasita-hospedeiro pode

fornecer informações essenciais ao desenvolvimento de medidas profiláticas e

terapêuticas mais eficientes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Dra. Janete Magali de Araújo, Do

Laboratório de Genética de Micro-organismos do Dept. de Antibióticos - UFPE .

Este trabalho foi realizado em conformidade com as leis brasileiras.


Weber, C. R. 137

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Weber, C. R. 140

7 - Conclusão

É possível concluir através do presente trabalho que:

Existe uma maior prevalência de translocação bacteriana/ sepse em

camundongos infectados pelo S. mansoni submetidos a esplenectomia;

No grupo infectado que não sofreu interveção cirúrgica, 62,5% dos individos

apresentavam translocação para o baço, no entanto sem indícios de sepse;

Foram isoladas da microbiota fecal: Enterobacter agglomerans, Enterobacter

gergoviae, Proteus mirabilis, Proteus rettgeri, Enterococcus faecalis, Enterococcus

sp., Escherichia coli, Staphylococcus , Serratia liquefaciens, Citrobacter diversus,

Streptococcus viridans, Klebsiella pneumoniae, Shigella boydii, Citrobacter

amalonaticus, Serratia rubidiae, Hafnia alvei, Enterobacter aerogenes;

A bactéria mais prevalente na translocação foi Escherichia coli, seguida da

Enterococcus faecalis, Enterobacter agglomerans, Shigella boydii Enterobacter

aerogenes;

Foi observado que a translocação apresentou, em parte, características

polimicrobianas com bactérias gram-negativas e gram-positivas na mesma

amostra biológica;

A ovoposição diminui consideravelmente após esplenectomia;

A diminuição na ovoposição pode estar envolvida na diminuição da IL-5,

provavelmente devido à diminuição na quantidade de células produtoras

desta citocina com a esplenectomia;

Todos os camundongos esplenectomizados apresentaram sepse, com a

mesma espécie bacteriana das fezes, no linfonofos mesentéricos, baço, fígado

e sangue periférico;


Weber, C. R. 141

A IL-1β está aumentada em camundongos esplenectomizados. Esta citocina

está possivelmente intimamente relacionada à sepse, mesmo com a

diminuição da população de células linfoides com a retirada do baço;

O INF-γ, IL-2 e IL-4 não sofreram influência da esplenectomia ou do

processo cirúrgico ou da infecção;

O estresse cirúrgico gera diminuição da IL-5 nos infectados;

A IL-10 foi diferente apenas no grupo sem procedimento, comparando

infectados e não infectados;

O TNFα e a IL-12 sofreram influencia da esplenectomia;

O GM-CSF não sofreu influencia direta da infecção ou da esplenectomia, no

entanto parece estar relacionado com o TNFα e não com a IL-12, como

referencia a literatura.


Weber, C. R. 142

8 – Perspectivas

É indiscutível a necessidade de mais estudos sobre o comportamento

imunológico do hospedeiro em casos de coinfecções helmíntica e bacteriana.

Inúmeros são os estudos que investigaram a eficiência e as modificações na

resposta imune da esplenectomia, no entanto, não foram encontrados estudos de

cunho imunológico observando as variáveis e o papel das intervenções aqui

realizadas sobre o perfil das citocinas. Todos os resultados apresentados ressaltam

os motivos para a contínua investigação da imunidade que permeia o melhor

entendimento acerca dos mecanismos de modulação das respostas frente a

parasitas. Além disso, entender que os organismos estão expostos a vários

estímulos antigênicos concomitantes e que podem ser fatores promotores ou

agravantes de tais doenças é de extrema importância para entender variações na

sua evolução clínica.

As infecções secundárias na fase crônica da esquistossomose, e pós-

esplenectomia foram discutidas utilizando uma abordagem imunológica. Se por

um lado foram utilizados métodos clássicos na identificação de bactérias, por outro

a metodologia do presente trabalho contemplou métodos imunoenzimáticos

modernos mais sensíveis que o ELISA. Ainda assim, os dados apresentados na tese

destacam discretas alterações no perfil de citocinas e apenas sugerem possíveis

mudanças sob influência da esplenectomia. No entanto, um evento interessante por

superar todas as expectativas foi a discrepante diferença na IL-1β na população

esquistossomótica asplenica em relação aos demais grupos.

Possíveis estudos adiante poderiam investigar nas mesmas intervenções,

desta vez em camundongos knockout, a dinâmica das citocinas mais influenciadas

no processo cirúrgico em esquistossomóticos com evolução para sepse por

translocação. Além disso, outro fator diferencial poderia ser a realização de


Weber, C. R. 143

observações por um período maior que o do estudo (sete dias). Inúmeros estudos

imunológicos poderiam ser realizados visando investigar mediadores químicos das

respostas imunes envolvidos na translocação/sepse e suas demais causas como

depressão, desnutrição e esquistossomose. Alguns órgãos foram coletados dos

experimentos originais e conservados para posterior investigação de estresse

oxidativo, na tentativa de observar o efeito do procedimento cirúrgico sobre os

demais órgãos.

Assim, ainda que obtendo resultados com otimismo aquém do esperado, o

presente estudo caracterizou-se como inédito, como anteriormente mencionado,

tendo como principal contribuição a ampliação da base científica para novos

estudos e elaboração de novas teorias a respeito do tema.


Weber, C. R. 144

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ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

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