Ataxias espinocerebelares –o que há de novo? · Inibição da formação de agregados 4. ... Ocupação do território ... açorianos ao sul do Brasil. Território brasileiro atual

Ataxias Ataxias espinocerebelaresespinocerebelares –– o o queque háhá de novo?de novo?

Laura Bannach JardimLaura Bannach JardimDepartamentoDepartamento de de MedicinaMedicina InternaInterna, UFRGS, UFRGS

ServiçoServiço de de GenéticaGenética MédicaMédica, Hospital de , Hospital de ClínicasClínicas de Porto de Porto AlegreAlegre

20092009

Doenças de poliglutaminas

Como as Como as polyQpolyQ causam doença?causam doença?

►► PerdaPerda de de funçãofunção induzinduzneurodegeneraçãoneurodegeneração


ArgumentosArgumentos contrárioscontrários

►►Modelos Modelos KnockoutKnockout para a para a Atxn1Atxn1, , Atxn2Atxn2 e e Atxn3Atxn3 foram gerados. foram gerados. Todos são viáveis e não Todos são viáveis e não demonstram problemas (Matilla demonstram problemas (Matilla etet al, 1998; al, 1998; KiehlKiehl etet al, 2006; al, 2006; Schmitt Schmitt etet al, 2007; al, 2007; Huynh et al, 2009))



ArgumentosArgumentos contrárioscontrários::

Mutações com perda de

função apresentam efeito

de dosagem gênica



►► Isso não parece acontecerIsso não parece acontecer

na DMJna DMJ

Início da doença aos 40





nem no nem no HuntingtonHuntington..


►► A proteína causal adquire A proteína causal adquire propriedades tóxicaspropriedades tóxicas


A poliQ em solução é tóxica para os neurônios (Nagai et al, 2007)

Mocked

SolublepolyQ inbeta--sheet


►►Atrapalham a função do núcleo das células Atrapalham a função do núcleo das células (transcrição)(transcrição)

►►Causam disfunção Causam disfunção mitocondrialmitocondrial

►►Induzem a morte celular programada Induzem a morte celular programada (apoptose)(apoptose)

►►Inibem o transporte Inibem o transporte axonalaxonal

Como as Como as polyQpolyQ causam doença? causam doença?



►►Atrapalham a função do núcleo das células Atrapalham a função do núcleo das células (transcrição)(transcrição)� ataxin-3 interacts with the major histoneacetyltransferases cAMP response-element binding protein (CREB)-binding protein, p300, and p300/CREB-binding protein-associated factor (Li et a, 2002).

Gene reporterexpression

in a bacterialmodel

Normal ataxin 3Expanded ataxin3

Ataxin3 without CAG



Huntingtin CBP DNA (nucleus) Merged

Normal huntingtin

expanded

Nucifora et al, 2001(Cell model)


►►Atrapalham a função do núcleo das células Atrapalham a função do núcleo das células (transcrição)(transcrição)Upregulated genes in CSM14.1 cell lines expressing expanded ataxin-3

Evert et al, 2001 and 2003

Directing ataxin-3 with 148 CAGs to the nucleus (nuclear localization signal, NLS) revealed a more pronounced phenotype with more inclusions and earlier death, than the same construct attached to a nuclear export signal (NES).

Mouse model

footprints

Bichelmeier et al, 2007


�� Causam disfunção Causam disfunção mitocondrialmitocondrial



�� Defeitos nas mitocôndrias foram vistos na Defeitos nas mitocôndrias foram vistos na HDHD

Clusters of imunostaining againstaggregated htt wereseen in mitochondriaof transgenic micewith expanded htt, and not in those withnormal htt.

Mithocondrial functionis reduced.

Panov et al, 2002




Deletions in mt DNA are increased in HD cortex (Horton et al, 1995)

Deletions in mt DNA are caused byoxidative stress.




Expanded Htt dysregulates the expression of variousmitochondrial proteins.

Dysrupted transcription thencauses mithocondrial dysfunction, and secondary oxidative stress

(Cui et a,. 2006)


►►Induzem a morte celular Induzem a morte celular programada (apoptose)programada (apoptose)



Pro-apoptotic caspasesare activated in HD:

Caudate tissue from HD patients and controlswere subjected to immunoblot analysiswith a mAb tocaspase-8.(Sánchez et al, 1999)



►►InibiçãoInibição dada caspasecaspase--1 1 alentecealentece a a doençadoença no no modelomodelo animalanimal

Rotarod: white: HD mice; black: HD + ↓caspase miceHD +↓caspase

Mice

HD Mice

Ona et al, 1999



►►InibiçãoInibição dada caspasecaspase--1 1 alentecealentece a a doençadoença no no modelomodelo animalanimal

Ubiquitin+ inclusionsin the hippocampus in HD mice (a), but not in HD/↓caspase mice (b).Peroxidaseimmunohistochemistryfor NII in HD mice (c), but not in HD/↓caspase mice (d).

Ona et al, 1999



►► A A ataxinaataxina 3 expandida reduz o 3 expandida reduz o HSP27HSP27 (um inibidor (um inibidor da morte celular)da morte celular)

Neuroblastomacells

Neuroblastoma cells+ expanded ATX3

HSP 27

Wen et al, 2003



►► A A ataxinaataxina 3 expandida reduz o 3 expandida reduz o HSP27HSP27 (um inibidor (um inibidor da morte celular)da morte celular)

Immunostaining for HSP27:

Neuroblastoma cells

Neuroblastoma cells transfectedwith expanded ATXN3

Wen et al, 2003


►►Inibição do transporte Inibição do transporte axonalaxonal



►►PolyQPolyQ inibe o transporte para cima e para inibe o transporte para cima e para baixo dos axôniosbaixo dos axônios

dyneinkinesin




Synapticmarker CSP in larval segmental nerves:

Expression of htt20Qresulted in anormal phenotype.

Expression of htt93Q caused organelleaccumulationswith CSP (arrows).

Gunawardena et al, 2003




Tunel staining:

cell death in Htt93Q

was enhanced if the gene dosage of kinesin heavy chain(KHC) was 50% reduced

Gunawardena et al, 2003



►► PolyQPolyQ AR (SBMA) inibe a AR (SBMA) inibe a kinesinkinesin--1 e o transporte 1 e o transporte anterógradoanterógrado (para baixo)(para baixo)

Immunocytochemistryof polyQ-AR cells

Tubulin expanded AR

Arrowhead in ‘Untreated’ (‘UT’): a cellnotexpressingAR, which hasbecomeelongated and haselaboratedneurites.

The othersremained flat.

Morfini et al, 2006



►► PolyQPolyQ AR (SBMA) inibe a AR (SBMA) inibe a kinesinkinesin--1 e o transporte 1 e o transporte anterógradoanterógrado (para baixo)(para baixo)

Immunocytochemistryof polyQ-AR cells

Tubulin expanded AR

Arrowhead in ‘Untreated’ (‘UT’): a cellnotexpressingAR, which hasbecomeelongated and haselaboratedneurites. The othersremained flat.

Treatment of polyQ-AR cellswith an indirect kinesin-1 activator allowed more cells toelaborate neurites.

Morfini et al, 2006











“Gene on”, 18w

“gene on”, 34w

“gene off”, 34w

Arrest of gene expression after the diseaseonset, in conditional Huntington mouse models, reverses the behavioral and neuropathological abnormalities

Yamamoto et al, 2000Mouse model


O processo da doença das O processo da doença das polyQpolyQ é potencialmente reversível é potencialmente reversível em estágios mais iniciaisem estágios mais iniciais

“Gene on”, 18w

“gene on”, 34w

“gene off”, 34w

Terapias em potencialTerapias em potencial

Terapias em potencial Terapias em potencial

►►Inibição da formação de agregadosInibição da formação de agregados

►►Ativação dos mecanismos de defesa celularAtivação dos mecanismos de defesa celular

►►Correção dos defeitos nucleares (na Correção dos defeitos nucleares (na transcrição)transcrição)

►►NeuroproteçãoNeuroproteção


►► Inibição da formação de agregadosInibição da formação de agregados

SCA3 patients with higher methylation degrees of ATXN3 (red dots) have a later disease onset(Emmel et al, in preparation)


►► Inibição da formação de agregadosInibição da formação de agregados1.1. BenzothiazolesBenzothiazoles as as potentialpotential polyQpolyQ aggregationaggregation

inhibitorsinhibitors in HD in HD diseasediseaseInhibition of HD aggregation in cells

control


►► Inibição da formação de agregadosInibição da formação de agregados

2.2. TrehaloseTrehalose alleviatesalleviates polyQpolyQ pathologypathology in a HD mouse in a HD mouse modelmodel. .

Suppressed polyQ accumulation, improvedmotor dysfunction and extended life span.Tanaka et al, 2004


�� Inibição da formação de Inibição da formação de agregados agregados

3.3. RNA interferênciaRNA interferência

Silenciar o RNA mutante mas não o Silenciar o RNA mutante mas não o normal.normal.

Nenhuma estratégia Nenhuma estratégia siRNAsiRNA pode ainda pode ainda distinguir os dois. distinguir os dois.

ResultadosResultados de Almeida et al de Almeida et al emem um um camundongocamundongo DMJ DMJ sãosão aguardadosaguardados. .


Inibição da formação de agregados Inibição da formação de agregados

4.4. ReduzindoReduzindo a a expressãoexpressão dada polyQpolyQ

PhasePhase 2 2 trialtrial of of leuprorelinleuprorelin in in patientspatients withwith spinalspinal and and bulbar muscular bulbar muscular atrophyatrophy ((BannoBanno etet al, 2009):al, 2009):


►► Ativação dos mecanismos de defesa Ativação dos mecanismos de defesa celularcelular

1.1. SuperSuper--expressão das expressão das heatheat

shockshock proteinsproteins

HighHigh levelslevels of of HSP70HSP70 affordedafforded protectionprotection

againstagainst neurodegenerationneurodegeneration in a in a SCA1SCA1

mouse mouse modelmodel ((CummingsCummings etet al, 2001)al, 2001)


►► Ativação dos mecanismos de defesa Ativação dos mecanismos de defesa celularcelular2.2. Indução de autofagia.Indução de autofagia.

The mammalian autophagy–lysosomalpathway

Modification of mutant Modification of mutant htthtt bybyacetylationacetylation promotes its promotes its targeting into targeting into autophagosomesautophagosomesand facilitates specific and facilitates specific degradation.degradation.

Jeong et al, 2009Cultured neurons, mouse HD brain.

Acetylated Non-acetylated Htt htt


►►Correção dos defeitos nucleares (na Correção dos defeitos nucleares (na transcrição)transcrição)


►► Correção dos defeitos nucleares (na Correção dos defeitos nucleares (na transcrição)transcrição)

1.1. HDAC HDAC inhibitorsinhibitors

ButyrateButyrate

-- ameliorated phenotypic ameliorated phenotypic

expression in a SBMA expression in a SBMA

mouse modelmouse model

((MinamiyamaMinamiyama et al, 2004)et al, 2004)


►►NeuroproteçãoNeuroproteção


►► NeuroproteçãoNeuroproteção

1.1. AntioxidantsAntioxidants

CoenzymeCoenzyme Q10Q10

A phase III randomized trial on efficacy and safety in A phase III randomized trial on efficacy and safety in HD is underway (HD is underway (MassachussetsMassachussets General Hospital, General Hospital, NCT00608881NCT00608881); 608 individuals, ending in 2014.); 608 individuals, ending in 2014.


►► NeuroproteçãoNeuroproteção2.2. CaspaseCaspase inhibitorsinhibitors

MinocyclineMinocycline

MinocyclineMinocycline and and doxycyclinedoxycycline are not beneficial in a are not beneficial in a model of Huntington's disease. model of Huntington's disease. Smith et al, 2003Smith et al, 2003


►► NeuroproteçãoNeuroproteção3.3. ExcitotoxityExcitotoxity blockersblockers

AmantadineAmantadine, , memantinememantine, , riluzoleriluzole

RiluzoleRiluzole in in Huntington'sHuntington's diseasedisease: a 3: a 3--yearyear, , randomizedrandomizedcontrolledcontrolled studystudy in 537 in 537 patientspatients showedshowed no no efficacyefficacy((LandwehrmeyerLandwehrmeyer etet al, 2007)al, 2007)


►► OutrasOutras1.1. TransplantesTransplantes celularescelulares

Neural stem cellsNeural stem cells

(mice lineage) transplanted (mice lineage) transplanted

to the left lateral ventricleto the left lateral ventricle

combined with combined with trehalosetrehalose

ingestion alleviates ingestion alleviates

pathology in pathology in

a HD Mouse.a HD Mouse.

O O queque fazemosfazemos no HCPA no HCPA nosnos últimosúltimosanosanos

►►Para saber Para saber porpor queque a a doençadoença de Machado de Machado Joseph é Joseph é tãotão freqüentefreqüente..


►►Para saber Para saber porpor queque a a doençadoença de Machado de Machado Joseph é Joseph é tãotão freqüentefreqüente..

Distribuição geográfica e prevalências mínimas municipais da DMJ no RS

Análise da prevalência da Doença de Análise da prevalência da Doença de MachadoMachado--JosephJoseph ((SCA3SCA3))no Estado do Rio Grande do Sul no Estado do Rio Grande do Sul -- Brasil.Brasil.

Camargo, G, Rodrigues C, Godoy B, Fagundes NJ, Saraiva-Pereira ML, Jardim LB, Schüler- Faccini L

Tratado de Madri, em

1750

Ocupação do território

das Missões Jesuíticas

Migração de casais

açorianos ao sul do

Brasil.

Território brasileiro

atual

e

segundo Tordesilhas

Território brasileiro, segundo o tratado de Madri


►►Para Para ajudarajudar osos ensaiosensaios clínicosclínicos::

�� FizemosFizemos umauma escalaescala clínicaclínica

NESSCA

Absent 0

Contraction fasciculation in the face 1

8.

Fasciculations

Diffuse, or in other parts of the body 2

Absent 0

One altered proof: Reduction in (a) or (b) o r (c):

two to four mistakes, on average of both feet

1

Two altered p roofs 2

9. Sensory

loss

(a) Vibratory sense in the

first toes; normal: >11 sec.

(b) Discriminat ion between

tactile and algesic stimuli

using a needle; 10 trials per

foot.

(c) Discrimination between

cold (10oC) and warm (40-

60oC) water; 10 trials per

foot

Total loss of vibratory sense in toes; or 5 or more

mistakes in one of discriminating proofs; or three

altered proofs

3

Absent 0

Mild, triggered by voluntary movements 1

Moderate, impairing, in some degree, voluntary

movements

2

10. Dystonia

Almost constant, impairing severely voluntary

movements

3

Absent 0

Moderate: does not prevent total, passive

mobilization

1

11. Rigidity

Important: prevent total, passive mobilization 2

Absent 0

Slow movements, with reduction in amplitude 1

12.

Bradykinesia

- Pat ient is asked to perform

10 cycles of repetit ive

opposition (extension and

flexion) of the second finger

against the thumb Movements can hardly be done 2

Absent 0 13. Eyelid

retraction

Present 1

Absent 0 14.

Blepharospasm

Present 1

Absent 0 15. Distal

amyotrophies

- Inspection of the interossei,

tenar and hypotenar muscles Present 1

Normal 0

Urgency 1

16. Sphincter

function

Incontinence 2

Absent 0 17. Cramps

Present 1

Absent 0 18. Vertigo

Present 1

Total score

NESSCA

Item Proofs Severity Score

Absent 0

Minimal: only while walking on toes, heels, or in

tandem

1

Moderate: gait autonomy preserved 2

Inability to walk without help 3

1. Gait ataxia - Walking spontaneously, ten

steps, parallel to a wall, and

including a half-turn

- Walking on toes, on heels,

and in tandem

Wheelchair bound or bedridden 4

Absent 0

Minimal: one single altered p roof 1

Moderate: two altered proofs 2

2. Limb

ataxia

(bilateral)

- Finger-to-nose test

- Test for dysdiadochokinesia

(fast alternating pronation

and supination of hands,

elbows fixed to his/her sides)

- Rebound test of Gordon-

Holmes

Important: three altered proofs

Proofs: (a) dysmetria, (b) fast alternating hand

movements, and (c) upper limb rebound. Positive

findings can be uni or bilateral.

3

Absent 0

On extreme gaze; o r circular, after saccades 1

3. Nistagmus

Permanent 2

Absent 0

Supranuclear: media l longitudinal fasciculus

syndrome; or limitation in upward gaze or

convergence

1

4. Progressive

external

ophthalmoplegia

Nuclear ophthalmoplegia, with strabismus 2

Absent 0

Few brisk reflexes 1

General hyperreflexia; or clonus; or Babinski sign 2

Three findings: (a) genera l hyperreflexia, (b)

spasticity, (c) clonus, (d) Bab inski sign; (e) paresis

3

5. Pyramidal

findings

- Limb reflexes, including

patellar and ankle clonus test

- Plantar reflex

- Muscle tone examination

- Motor strength proofs:

extended arms and

Mingazzin i test, both for 60

seconds

Four or five of the above mentioned signs 4

Absent 0

Mild : Impaired speech, but easy to understand 1

Moderate: speech understandable, but with

difficulty

2

Severe: speech hardly understandable 3

6. Dysarthria

Anarthria 4

Absent 0

Mild 1

7. Dysfagia

Important: occuring every day 2




�� DescrevemosDescrevemos a a velocidadevelocidade de de progressãoprogressão dadadoençadoença

A ten years followA ten years follow--up of up of neurological manifestations neurological manifestations in patients with Machadoin patients with Machado--Joseph Disease (MJD)Joseph Disease (MJD)

Laura Bannach JardimLaura Bannach Jardim 1, 3, 51, 3, 5, , LisianeLisiane Hauser Hauser 22, Christian C. Kieling , Christian C. Kieling 66, , Jonas Saute Jonas Saute 3, 3, 77 , Carlos Rieder , Carlos Rieder 77, Thais Monte , Thais Monte 77, , SuziSuzi Camey Camey 2, 42, 4, ,

Alvaro VigoAlvaro Vigo2, 42, 4 , Vanessa , Vanessa BielefeldBielefeld LeottiLeotti 22

DepartmentsDepartments of of 11 InternalInternal MedicineMedicine and and 22 StatisticsStatistics, , PostPost--graduationgraduationProgramsPrograms of of 33 Medical Medical SciencesSciences and and 44 EpidemiologyEpidemiology, Universidade , Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Federal do Rio Grande do Sul, BrazilBrazil..55 Medical Medical GeneticsGenetics, , 66 PsychiatryPsychiatry and and 77 NeurologyNeurology ServicesServices, Hospital , Hospital

de Clínicas de Porto Alegre, de Clínicas de Porto Alegre, BrazilBrazil..

resultsresults

►► Individual progression of NESSCA, according to Individual progression of NESSCA, according to disease durationdisease duration

Ouliers: 6 cases followed up from 20 to 29

years of disease duration. Age at baseline:

57 ±15 years-old.

resultsresults

►► CAG expanded repeat and NESSCA Growth Curve CAG expanded repeat and NESSCA Growth Curve

Idinic 34 Idinic 42Percentile 25:

72 repeats

Percentile 50:

74 repeats

Percentile 75:

76 repeats

Percentile 100:

82 repeats

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Time

Nessca

An increase of one CAG

repeat was related to an

increase of 0.15 units in

the slope of NESSCA

mean Growth Curve (p =

0.0002, Proc MIXED, SAS)

ijiiijE time)cagexp1476,07701,9()cagexp3621,07248,32(]nessca[ˆ +−+−=

82 repeats

76

74

72









�� EstudamosEstudamos um um biomarcadorbiomarcador (IGF(IGF--1)1)


►►ProjetosProjetos emem andamentoandamento::

�� RedeRede neurogenéticaneurogenética

RedeRede NeurogenéticaNeurogenéticahttp://www.redeneurogenetica.ufrgs.brhttp://www.redeneurogenetica.ufrgs.br

Laura B. JardimLaura B. Jardim

Departamento de Medicina Interna, Universidade Federal do Rio GrDepartamento de Medicina Interna, Universidade Federal do Rio Grande do ande do Sul, Brasil, eSul, Brasil, e

Serviço de Genética Médica e Laboratório de Medicina Serviço de Genética Médica e Laboratório de Medicina GenômicaGenômica, Hospital de , Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil.Clínicas de Porto Alegre, Brasil.


►►ProjetosProjetos emem andamentoandamento::

�� RedeRede neurogenéticaneurogenética

�� OrigensOrigens geográficasgeográficas no RSno RS

�� Testes Testes preditivospreditivos

�� NeuroimagemNeuroimagem

►►ProjetosProjetos emem análiseanálise::

�� EnsaiosEnsaios clínicosclínicos ((sobresobre medicamentosmedicamentos))

�� ModeloModelo animal (a ser animal (a ser importadoimportado))

Algusn pesquisadores que participaram do V Workshop onMachado Joseph Disease, São Miguel, Açores, 2009.

PsiquiatriaPsiquiatriaCláudioCláudio OsórioOsório, MD, , MD, MScMSc

FisiatriaFisiatriaMaria Maria EmíliaEmília BortolozzoBortolozzo

FonoaudiologiaFonoaudiologiaSimone Finard de Nisa e CastroSimone Finard de Nisa e Castro

TerapiaTerapia OcupacionalOcupacionalRenataRenata Cristina SilvaCristina Silva

GeneticistasGeneticistasLavínia Lavínia SchullerSchuller--FacciniFaccini

Gabriela Gabriela CamargoCamargo

CoordenaçãoCoordenaçãoLaura Bannach Jardim, MD, PhD Laura Bannach Jardim, MD, PhD

EquipeEquipe locallocal

BiologiaBiologia molecularmolecularMaria Maria LuizaLuiza PereiraPereira, PhD, PhDSandra Leistner, PhDSandra Leistner, PhDVanessa EmmelVanessa EmmelHugo BockHugo Bock

NeurologistasNeurologistasThais Monte, MD, Thais Monte, MD, MsCMsCCarlos Rieder, MD, PhDCarlos Rieder, MD, PhDRaphael Raphael CastilhosCastilhos, MD, MD

MédicosMédicos residentesresidentesJonas Saute, MDJonas Saute, MDGersonGerson CarvalhoCarvalho, MD, MD

PsicologiaPsicologiaRita Prieb, Rita Prieb, MsCMsCCaroline S.M. Caroline S.M. RodriguesRodrigues

Documents

Ataxias espinocerebelares –o que há de novo? · Inibição da formação de agregados 4. ... Ocupação do território ... açorianos ao sul do Brasil. Território brasileiro atual