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LYSIANNE PINTO
ATIVAÇÃO DO SISTEMA COMPLEMENTO HUMANO IN VITRO POR ANTÍGENOS DO
MOSQUITO Culex quinquefasciatus
Tese apresentada ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, visando à obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia)
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
Rio de Janeiro – RJ 2008
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2
FICHA CATALOGRÁFICA PINTO, Lysianne
Ativação do Sistema Complemento Humano in vitro por constituintes de extratos
do corpo do mosquito Culex quinquefasciatus. Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia
Prof. Paulo de Góes – UFRJ, 2008.
Tese: Doutor em Ciências Biológicas (Microbiologia)
1- Sistema Complemento Humano
2- Alérgenos de Mosquito
3- Culex quinquefasciatus
4- Urticária Papular
5- Imunocomplexos
I – Universidade Federal do Rio de Janeiro – Tese
II - Título
3
Trabalho Realizado nos Laboratórios de Imunoquímica II e Imunoquímica I do Departamento de Imunologia no Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes - UFRJ, sob orientação da Profa. Regina Ejzemberg e co-orientação da Profa. Maria Helena da Silva.
4
“Precisamos dar um sentido humano às nossas construções. E, quando o amor ao dinheiro, ao sucesso nos estiver deixando cegos, saibamos fazer pausas para olhar os lírios do campo e as aves do céu.”
Érico Veríssimo
5
AGRADECIMENTOS
Para a realização e conclusão de um trabalho, sempre precisamos contar com a
ajuda de outras pessoas. A todas elas deixo aqui o meu agradecimento sincero.
Em primeiro lugar agradeço a Deus que durante todo o tempo manteve acesa a
minha mente para a conclusão desta tese;
Aos meus pais Augusto e Valdecir, pessoas muito especiais em minha vida,
agradeço pelo amor, compreensão e apoio sempre presentes. Por terem sacrificado seus
sonhos em favor dos meus, não foram apenas pais, mas amigos e companheiros;
À Profa Regina Ejzemberg, minha orientadora que, durante o desenvolvimento
desta tese, não só contribuiu com seus conhecimentos, sugestões e críticas construtivas,
mas também com confiança, amizade, dedicação, competência e excelente orientação;
À Profa Maria Helena, modelo de professora, possuidora de profundo
conhecimento, obrigada pela dedicação, amizade e empenho indispensável no
desenvolvimento e finalização do trabalho;
Ao Sr. Ruppert Hahnstadt, representando a FDA Allergenic, por disponibilizar o
material de Culex quinquefasciatus utilizado neste trabalho;
Ao Prof. Pedro Paulo Elsas, pela ajuda com os experimentos de quimiotaxia e pela
atenção gentil sempre quando precisei;
À Profa Rosálie Coelho por sempre permitir a utilização dos aparelhos de seu
laboratório todas as vezes que eu precisei.
Aos colegas Jacilene Mesquita e Ricardo Alves, pela grande ajuda e
conhecimentos passados em alguns experimentos;
6
Ao meu querido amigo Rodrigo Fonseca de Souza, não tenho palavras para
agradecer sua constante presença em mais esta fase de minha vida. Obrigada por seus
conselhos, pela confiança e amizade em momentos alegres e outros nem tanto;
Aos meus amigos André Grigorevski, Erick Aniszewski e Ana Carolina Oliveira, a
quem eu agradeço pela amizade e bons momentos vividos desde a época da graduação.
Piadas, viagens, filmes do Zé e apelidos nunca serão esquecidos;
Aos amigos de laboratório Ana Regina Machado e Luiz Fernando Zmetek,
agradeço o convívio sempre amigo, na troca de idéias de trabalho, filmes, músicas e chás
milagrosos;
Aos amigos Madelayne Cortez, Sheila Alves e Thiago Pinheiro, que não estão
relacionados ao trabalho, mas fizeram parte do meu crescimento e por isso também fazem
parte da minha história;
Ao Sean Kenny, mesmo ainda me devendo uma aposta pela Copa de 02 e apesar da
existência de uma pequena poça (Atlântico) entre nós dois, obrigada pela atenção,
companheirismo e boas conversas que, de uma forma ou de outra, sempre aumentaram
meu conhecimento;
À Coordenação de Pós-Graduação do Instituto de Microbiologia da UFRJ, na
pessoa de sua atual Coordenadora, Profa. Thaís Souto-Padron;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
suporte financeiro;
E também aqueles, que me ajudaram a exercer minha paciência única, quase
divina. Se a vida fosse um mar de rosa, a rosa perderia a sua graça.
7
SIGLAS APC – Célula Apresentadora de Antígeno BSA – Soro Albumina Bovina CA – Anidrase Carbônica CD – Cluster de Diferenciação CH50 – Unidade de Complemento Capaz de Lisar 50% de Eritrócitos CR – Receptor de Complemento CRP – Proteína C-Reativa DAF – Fator de Aceleração do Decaimento DEAE – Dietil aminoetil DECOM – Departamento de Controle Ambiental DIVET – Divisão de Vetores DTH – Hipersensibilidade do Tipo Tardia EA – Eritrócitos Sensibilizados por Anticorpos EC – Eritrócitos de Carneiro ECT – Extrato de Corpo Total ECTx – Extrato de Cabeça e Tórax EGS – Extrato de Glândula Salivar EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético EGTA – Ácido Etilenoglicol Bis (Éter β-amino Etil Éter) N, N, N´, N´ Tetra Acético ELISA – Ensaio Imunoenzimático FEEMA - Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente fMLP - formil-metionina-leucina-fenilalanina HBSS – Solução Balanceada de Hanks HRF – Fator de Restrição Homóloga IC - Imunocomplexos Ig – Imunoglobulina IL – Interleucina kDa _ Kilodalton LPS – Lipopolissacarídio LTB4 – Leucotrieno B4 MAC – Complexo de Ataque à Membrana MASP – Serina Protease Associada à MBL MBL – Lectina de Ligação à Manose MHC – Complexo Principal de Histocompatibilidade PMN – Polimorfonucleares SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com tratamento pelo Dodecil Sulfato de Sódio. SHN – Soro Humano Normal SMF – Sistema Monocítico Fagocitário Th – Linfócito T auxiliar (do inglês helper) TNF – Fator de Necrose Tumoral VBS – Tampão Veronal Salina
8
ÍNDICE
Página Agradecimento V
Siglas VII
Índice de Figuras XI
Índice de Tabelas XII
Resumo XIII
Summary XIV
Introdução 15
1. O Sistema Complemento: Sua Ativação e Funções Biológicas 15
2. Participação do Complemento em Processos Inflamatórios 22
3. Reações de Hipersensibilidade e a Participação do Sistema
Complemento
25
4. Alérgenos e Ativação do Sistema Complemento 28
5. Reações a Antígenos de Mosquitos 32
Objetivos 38
Materiais e Métodos 39
1. Mosquitos 39
1.1 Extrato do Corpo Total do Mosquito (ECT) 39
1.2 Extrato de Cabeça e Tórax do Mosquito (ECTx) 39
1.3 Extrato de Glândula Salivar do Mosquito (EGS) 40
2. Soros Humanos 41
2.1 Os soros humanos normais 41
2.2 Como fonte de Complemento 41
2.3 Soros de pacientes 41
3. Pesquisa e Titulação dos Anticorpos anti-ECT nos Soros Humanos 42
3.1 Contraimunoeletroforese 42
3.2 Titulação dos soros por ELISA 42
4. Ativação do Sistema Complemento 43
4.1 Estudo da Ativação do Complemento Utilizando Hemácias de
Carneiro Sensibilizadas
44
9
4.2 Estudo da Ativação do Complemento Utilizando Hemácias de Coelho 47
5. Fracionamento do ECT do Mosquito C. quinquefasciatus por
Cromatografia de Troca Iônica
48
6. Detecção de Componentes e Fragmentos do Complemento 51
7. Ação Quimiotática de Fragmentos Resultantes da Ativação do
Complemento sobre Neutrófilos Humanos
53
7.1 Obtenção dos Granulócitos 53
7.2 Teste de Viabilidade Celular 54
7.3 Ensaio de Quimiotaxia de Neutrófilos 54
Resultados 56
1. Pesquisa e Titulação dos Anticorpos anti-ECT nos Soros Humanos 56
2. Ativação do Sistema Complemento 60
2.1 Ativação do sistema Complemento por ECT, ECTx e EGS do
Mosquito C. quinquefasciatus e Revelação com EA
60
2.2 Ativação do Sistema Complemento Com e Sem Quelantes (EDTA e
EGTA-Mg2+) e Revelação com EA
62
3. Fracionamento do ECT de Culex quinquefasciatus por Cromatografia de
Troca Iônica
65
3.1 Análise Eletroforética dos Extratos 69
3.2 Detecção de Constituintes Reconhecidos por Anticorpos nas Frações
Antigênicas
71
3.3 Ativação do sistema Complemento pelas frações cromatográficas do
ECT
75
4. Pesquisa de Componentes Presentes no Complemento Residual Após
Ativação por ECT, ECTx e Fração XI
80
5. Citometria de Fluxo 81
6. Ensaio de Quimiotaxia de Neutrófilos Humanos 94
Discussão 97
Conclusão 113
Anexos 114
10
Ficha de Anamnese do Paciente 114
Termo de Consentimento Para Participar do Estudo 115
Referências 116
11
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 – Identificação de complexos Ag-Ac por contraimunoeletroforese 56
Figura 2 - Detecção de anticorpos anti-ECT do mosquito C.
quinquefasciatus.
57
Figura 3 – Titulação de soros humanos frente aos antígenos do ECT do mosquito
C. quinquefasciatus pela técnica de ELISA indireta. 59
Figura 4 – Determinação do Complemento residual em misturas de soros
humanos normais após tratamento com extratos do mosquito C.
quinquefasciatus.
61
Figura 5 - Determinação do Complemento residual em misturas de soros
humanos normais sem ou com quelantes, após tratamento com extratos do
mosquito C. quinquefasciatus.
64
Figura 6 - Fracionamentodo ECT de C. quinquefasciatus por
cromatografia de troca iônica.
66
Figura 7 - Fracionamentodo ECT de C. quinquefasciatus por
cromatografia de troca iônica.
67
Figura 8 - Eletroforese em SDS-PAGE dos extratos ECT, ECTx e EGS do
mosquito C. quinquefasciatrus.
70
Figura 9 - Eletroforese em SDS-PAGE das Frações Cromatográficas (I a
XIV) do mosquito C. quinquefasciatrus.
72
Figura 10 - Análise das frações cromatogáficas por immunobloting 74 Figura 11 – Determinação do Complemento residual em mistura de soros
humanos normais após tratamento com ECT do mosquito C. quinquefasciatus e
suas frações cromatográficas, reveladas com EA.
76
Figura 12 – Determinação do Complemento residual em mistura de soros
humanos normais após tratamento com ECT do mosquito C. quinquefasciatus e
suas frações cromatográficas, reveladas com hemácias de coelho.
79
Figura 13 - Fixação dos fragmentos de componentes do Complemento sobre
zimosan tratado com os sobrenadantes da ativação da mistura de soros pelo
ECT.
83
Figura 14 - Fixação dos fragmentos e componentes do Complemento sobre
zimosan tratado com os sobrenadantes da ativação da mistura de soros pelo
ECTx.
87
12
Figura 15 - Fixação dos fragmentos e componentes do Complemento sobre
zimosan tratado com os sobrenadantes da ativação da mistura de soros pela
Fração XI.
90
Figura 16 – Detecção dos fragmentos de C3 e de MBL fixados sobre zimosan
tratado com os sobrenadantes da ativação da mistura de soros pelo ECT e ECTx
por citometria de fluxo.
93
Figura 17 – Atividade quimiotática de fragmentos de componentes do
Complemento após ativação da mistura de soros pelos extratos ECT e ECTx.
95
Figura 18 – Atividade quimiotática de fragmentos de componentes do
Complemento após ativação da mistura de soros pelas frações Fr I e Fr XI.
96
ÍNDICE DE TABELAS
Página
Tabela I - Concentração protéica do extrato de corpo total (ECT) e
frações cromatográficas (I a XIV) do mosquito C. quinquefasciatus
68
Tabela II – Quantidade protéica das frações cromatográficas (I a XIV), do
mosquito C. quinquefasciatus, utilizada na eletroforese em SDS-PAGE
72
Tabela III – Quantidade protéica de ECT e frações cromatográficas (I a
XIV) utilizada na ativação do sistema Complemento
77
Tabela IV – Quantidade protéica de ECT e frações cromatográficas (I a
XIV) utilizada na ativação do sistema Complemento utilizando-se
hemácias de coelho
79
13
RESUMO
O Complemento participa dos mecanismos de defesa inatos e adquiridos. As proteínas
desse sistema podem ligar-se diretamente a antígenos exógenos ou a complexos
imunológicos, facilitando sua eliminação e/ou gerando respostas inflamatórias. A saliva de
artrópodes hematófagos, como os mosquitos, pode induzir reações alérgicas como a
urticária papular, dermatose caracterizada pela formação de pápula e eritema em
indivíduos sensíveis às picadas. Reações cutâneas podem ocorrer ainda em indivíduos
considerados normais (prick test negativo) mas os mecanismos imunológicos não são bem
conhecidos. O Culex quinquefasciatus é um dos mosquitos mais encontrados no Brasil e
seu extrato de corpo total é utilizado para diagnóstico e imunoterapia hipossensibilizante
da urticária papular. Neste trabalho, extratos de corpo total (ECT), cabeça e tórax (ECTx)
e glândula salivar (EGS) desse mosquito mostraram ativação do sistema Complemento in
vitro pelas vias clássica e alternada bem como frações (I a XIV) obtidas do ECT por
cromatografia de troca iônica. A análise por immunoblotting e quimioluminescência
dessas frações mostrou antígenos reconhecidos por anticorpos das classes IgG e IgM
capazes de ativar o Complemento pela via clássica. O consumo do Complemento por
constituintes do mosquito foi evidenciado pela detecção de fragmentos de C3, C4 e C5 e
de properdina e MBL. Anafilatoxinas formadas durante a ativação do Complemento foram
demonstradas por quimiotaxia de neutrófilos em câmara de Boyden. Estes dados sugerem
que a ativação do sistema Complemento in vivo pode contribuir para o agravamento das
reações alérgicas de indivíduos sensíveis às picadas de mosquitos bem como explicar
reações inflamatórias locais em pessoas normais.
Palavras-chave: Sistema Complemento, mosquitos, Culex quinquefasciatus, urticária
papular, complexos imunológicos.
14
SUMMARY
The Complement plays role in innate and acquire defences. The proteins of such a
system are able to recognise exogenous antigens or immunecomplexes, enabling its
removal and producing inflammatory reactions. Saliva from heamatophagous arthropods,
such as mosquitoes, can induce allergic reactions as papular urticaria, a dematosis
characterised by papules and erythrema that happens in allergic individuals to mosquito
bites. Skin reactions can occur in non-allergic individuals (negative for prick test),
however, these mechanisms are not so completely understood. Culex quinquefasciatus is
the most commom mosquito in Brazil and its whole body extract is used for diagnosis and
immunetherapy for papular urticaria. In this work, the whole body (ECT), head and thorax
(ECTx) and salivary gland (EGS) extracts of this mosquito were able to activate the
complement system in vitro by both classical and alternative pathways, as well as, the
ECT fractions (I to XIV) obtained by ion-exchange chromatography. Immunoblotting and
chemiluminescence analysis of these fractions revealed antigens recognized by IgG and
IgM class of antibodies. These antibodies are able to activate the Complement by the
classical pathway. The Complement consumption by mosquito constituents was shown
detecting C3, C4 and C5 fragments and also by properdine and MBL. Anaphylatoxins
formation during the Complement activation was demonstrated through neuthrophils
chemotaxis in the Boyden chamber. Taken together, that data suggests that Complement
system activation in vivo can contribute to aggravate the allergic reactions in allergic
individuals to mosquito bites, as well as, explain local inflammatory reactions in normal
individuals.
Key words: Complement system, mosquitoes, Culex quinquefasciatus, papular urticaria,
immunecomplexes.
15
INTRODUÇÃO
1. O Sistema Complemento: Sua Ativação e Funções Biológicas
O Complemento é definido como um sistema funcional formado por um conjunto
de mais de 30 glicoproteínas, que podem estar tanto livres no fluido extracelular e no
plasma como associadas à superfície celular, desempenhando papel fundamental nos
processos de defesa do hospedeiro contra infecções. A maioria dos componentes do
sistema Complemento está presente no plasma e é sintetizada pelas células de Kupffer, no
fígado. As proteínas do sistema Complemento, que estão ligadas às membranas celulares,
são sintetizadas pelas próprias células que as expressam e têm papel regulador (Müller-
Eberhard, 1988).
O sistema Complemento é considerado um dos mecanismos efetores da imunidade
inata porque está presente e funcionante no organismo animal mesmo antes da exposição
ao patógeno. Uma vez em contacto com o microrganismo patogênico, o Complemento
funciona como uma via altamente efetiva para sua destruição e eliminação. Tem grande
importância nos processos inflamatórios em geral, incluindo aqueles que não decorrem de
infecção e participa da imunidade adaptativa ao contribuir para a eliminação de complexos
imunológicos e dos microrganismos presentes nos tecidos (Song, Sarrias & Lambris,
2000).
As proteínas do Complemento circulam no plasma na sua forma inativa. Quando
ativadas, iniciam-se reações enzimáticas, em cascata, que resultam na geração de vários
fragmentos protéicos. Alguns desses fragmentos devem se ligar rapidamente à superfície
dos microrganimos que funcionam como partícula ativadora. Caso isso não aconteça,
sofrem inativação. Outros fragmentos permanecem nos fluidos fisiológicos por períodos
mais longos, podendo difundir-se e atuar a distância, como os agentes quimiotáticos
(anafilatoxinas). A ativação do Complemento pode ocorrer por três vias conhecidas como
via clássica, das lectinas e alternativa, cujo final resulta na formação de um complexo
citolítico de ataque à membrana MAC (do inglês membrane attack complex) (Rambach,
Würzner & Speth, 2008)
De uma forma geral, a via clássica é ativada pela ligação do componente C1 a
anticorpos das classes M e G que formam imunocomplexos com os antígenos. Entretanto,
16
pode ser induzida também diretamente por certos microrganismos como os estreptococos
do grupo G tipo III (Butko, Nicholson-Weller & Wessels, 1999). No caso da
Pseudomonas aeruginosa, observa-se a interação direta de C1 com a endotoxina OEP
(original endotoxin protein) (Inada, 1980) e na Klebsiella pneumoniae, o C1 liga-se a duas
proteínas de membrana externa, pertencentes ao grupo das porinas (Alberti et al, 1993).
O componente C1 pertence à família das colectinas, caracterizadas por
apresentarem uma região colagenosa e outra com sítio de reconhecimento de carboidratos.
Este componente é formado por três proteínas: o C1q, a subunidade de reconhecimento,
que é ligada através do íon Ca2+ a duas moléculas de C1r e duas de C1s (Ghai et al, 2007).
A molécula de C1q é constituída de seis monômeros idênticos que apresentam
domínios globulares e regiões semelhantes ao colágeno. A ligação de pelo menos duas
dessas porções globulares aos anticorpos dos imunocomplexos, ou diretamente às
partículas ativadoras, causa uma modificação conformacional na molécula de C1q, que
resulta na autoclivagem do C1r. Assim, o C1r adquire a capacidade de ativar o
componente C1s, resultando em um complexo protéico com atividade de serina protease.
Esta enzima é capaz de atuar sobre os componentes C4 e C2, clivando-os em dois
fragmentos: o maior (denominado b) se liga à superfície da partícula ativadora; o menor
(chamado a) é liberado para a fase fluida (van de Wetering, van Golde & Batenburg,
2004). O componente C4 é constituído de três cadeias polipeptídicas (alfa, beta e gama)
ligadas entre si por pontes dissulfeto. Após a clivagem da molécula e formação dos
fragmentos C4b e C4a, um radical tio-éster é exposto na cadeia alfa do C4b, permitindo
sua ligação covalente a grupamentos hidroxila ou amina na superfície da partícula
ativadora. O C4a, uma anafilatoxina, permanece no fluido. A clivagem do C2, após ligar-
se ao C4b em presença de Mg2+, resulta na formação de dois fragmentos, C2b e C2a
(Schumaker, Závodszky & Poon, 1987).
Essas etapas de ativação levam à formação do complexo C4bC2b, denominado C3
convertase porque cliva o componente C3 em dois fragmentos: o C3b, uma opsonina que
facilita a fagocitose do agente patogênico, e o C3a, uma anafilatoxina.
Do mesmo modo que o C4b, o C3b pode ligar-se covalentemente nas proximidades
do complexo C1C4bC2b dando origem à C5 convertase. Este complexo enzimático irá
atuar sobre o componente C5, dando início à etapa final efetora, que resulta no complexo
citolítico MAC comum a todas as vias de ativação (Krishnan et al, 2005).
17
A ativação através da via das lectinas, como o nome indica, é iniciada por proteínas
que se ligam a carboidratos como a lectina ligadora de manose, MBL (mannan- binding
lectin). A MBL reconhece e liga-se a carboidratos com grupos hidroxila horizontais nas
posições 3’ e 4’ do anel de piranose de D-manose, N-acetil-D-glicosamina, D-glicose ou
L-fucose, presentes na superfície de microrganismos. Outra lectina recentemente
descoberta e denominada ficolina (L-ficolina/P35 e H-ficolina), ou antígeno de Hakata,
possui especificidade para N-acetilglicosamina. Estas lectinas, estruturalmente
semelhantes ao componente C1, podem complexar-se através de seu domínio semelhante
ao colágeno a três diferentes moléculas, denominadas, serina protease associada à MBL
(MBL associated serine protease): MASP-1, MASP-2 e a mais recentemente descoberta
MASP-3 (Gaboriaud et al, 2007). Essas enzimas têm funções semelhantes as das serinas
proteases C1r/C1s da via clássica.
Os complexos MBL-MASP ou ficolina-MASP circulam na corrente sangüínea na
forma inativa (pró-enzimas). Quando se ligam à superfície da partícula ativadora através
dos domínios de reconhecimento de carboidratos, ocorrem mudanças conformacionais nas
MASPs, seguidas de autoclivagem que as convertem em uma enzima com atividade
proteolítica. A MASP-1 possui atividade proteolítica sobre C3 e C2; a MASP-2 cliva C4 e
C2, enquanto a MASP-3 possui atividade inibitória sobre a MASP-2 (Weis, Taylor &
Drickamer, 1998 e Matsushita et al, 2002).
Inicialmente a MASP-2 cliva C4 e produz dois fragmentos peptídicos, C4a e C4b,
do mesmo modo que na via clássica. Para que a ativação do Complemento prossiga, o
fragmento C4b deve ligar-se próximo ao complexo lectina-MASP para que a MASP-2 (ou
a MASP-1) possa clivar o C2 em C2b e C2a. Após sua ligação ao C4b dependente do íon
magnésio, o C2b permanece ligado ao C4b formando um componente catalítico, a C3
convertase da via das lectinas (Sørensen, Thiel & Jensenius, 2005).
Uma vez formado o complexo C4bC2b, as MASPs continuam enzimaticamente
ativas. Conseqüentemente, cada complexo lectina-MASP se torna rodeado por C3
convertases. Entretanto, qualquer molécula de C4b que venha a ligar-se à superfície do
patógeno, longe do complexo lectina-MASP inicial, pode ligar-se ainda ao C2, mas este
não é convertido à C3 convertase porque as MASPs não estão próximas o suficiente para
catalisarem a segunda etapa da reação (Wallis et al, 2007).
18
Da mesma forma que na via clássica, a ligação covalente do C3b nas proximidades
do complexo lectina-MASP, o complexo C4bC2b dá origem à C5 convertase que, por sua
vez, irá atuar sobre o componente C5, dando início à formação do MAC.
A ativação da via alternada se passa de forma lenta e espontânea e ocorre no
plasma e em outros fluidos orgânicos, na ausência de qualquer ativador. A cadeia alfa do
componente C3, que é constituído de duas cadeias polipeptídicas ligadas por pontes
dissulfeto, incorpora uma molécula de água que é capaz de hidrolisar uma ligação tio-éster
presente nessa cadeia. Disto resulta um C3 conformacionalmente alterado, o C3(H2O), e
essa molécula assim modificada é capaz de se comportar como C3b.
Na presença de íons Mg2+, o fator B se associa ao C3(H2O), propiciando a
clivagem de B pelo fator D (uma serina protease que circula no sangue na sua forma
ativa). Após a ação desta enzima, dois fragmentos são formados, Ba, que permanece na
fase fluida e Bb, que permanece ligado à molécula de C3(H2O) e contém o sítio catalítico.
Este novo complexo C3(H2O)Bb formado atua como a C3 convertase da via alternada,
atuando sobre outras moléculas de C3 e gerando novos fragmentos de C3a e C3b. Os
fragmentos C3b podem ligar-se à superfície dos patógenos ou às células do hospedeiro.
As moléculas de C3b que se ligam às partículas ativadoras podem associar-se ao
fator B (em presença de íons Mg2+), que é então clivado a Bb e Ba pelo fator D. O novo
complexo formado (C3bBb) também tem atividade de C3 convertase. Este complexo é
estabilizado pela proteína plasmática properdina. A ligação de novas moléculas de C3b
nas proximidades dessa C3 convertase dá origem à C5 convertase da via alternada. Nas
células do hospedeiro, a deposição desses componentes é modulada por várias proteínas
reguladoras presentes no fluido e na membrana das próprias células interferindo na sua
atividade (Pangburn & Müller-Eberhard, 1980).
As C5 convertases formadas pelas três vias de ativação do Complemento atuam
sobre as moléculas de C5, clivando-as em dois fragmentos, sendo o menor denominado
C5a, que é liberado na fase fluida, e o maior chamado de C5b que dá início à etapa efetora
de ataque à membrana, comum às três vias de ativação. O C5b, fracamente associado a
C3b, liga-se aos componentes C6, C7, C8 e C9, formando o complexo C5bC6C7C8C9.
No entanto, para formar um complexo altamente citolítico é necessário que várias
moléculas de C9 (C5b~C9n) se liguem a esse complexo formando, o MAC (complexo de
ataque à membrana) (Scibek, Plumb & Sodetz, 2002).
19
O MAC insere-se na membrana alvo, levando a alterações na estrutura e função da
célula: ocorre a perda de material citoplasmático de baixo peso molecular e a entrada de
líquido e sais, levando ao intumescimento celular. Como conseqüência, há o desequilíbrio
osmótico, ocasionando a lise da célula (Hansch, 1988 e Morgan, 1999).
No decorrer da ativação do Complemento são formados peptídios biologicamente
ativos, as anafilatoxinas C5a, C3a e C4a, oriundos da clivagem de C5, C3 e C4,
respectivamente. Esses fragmentos peptídicos têm efeitos pró-inflamatórios tais como a
quimiotaxia de leucócitos, desgranulação de mastócitos e/ou basófilos, além de induzirem
a contração da musculatura lisa e aumento da permeabilidade vascular. Outro fragmento
com atividade inflamatória, semelhante à das cininas, é o C2a resultante da clivagem de
C2 (Hugli, 1986).
A desgranulação dos mastócitos e/ou basófilos decorrente da ação das
anafilatoxinas resulta na liberação de mediadores pré-formados (histamina, triptase e
heparina) e neoformados (metabólitos derivados de lipídios, especialmente a
prostaglandina D2, leucotrienos e fator de ativação de plaquetas [PAF]), o que amplifica a
resposta inflamatória. Com a persistência do estímulo, ocorre a produção de citocinas
como IL-4, IL-5 IL-6, IL-13, e TNF-α que ativam outros tipos celulares como fagócitos
mononucleares, linfócitos T, eosinófilos, linfócitos B e células endoteliais a liberarem
outras citocinas importantes nos processos inflamatórios (Köhl, 2001).
Conseqüentemente, a ativação excessiva do sistema Complemento causa risco
considerável de dano tecidual por mediar direta e indiretamente reações inflamatórias
(Huston & Bressler, 1992).
Em condições fisiológicas, a ativação do Complemento é eficientemente
controlada por ações coordenadas de proteínas regulatórias tanto, solúveis como ligadas às
membranas celulares.
Quando em excesso, as anafilatoxinas são inativadas por uma enzima plasmática
(carboxipeptidase N) que cliva a arginina terminal nesses peptídios, impedindo sua ligação
às células responsáveis pelo processo inflamatório (Hugli et al, 1981).
Outros reguladores solúveis do Complemento tais como o C1 inibidor ou C1INH
(C1 inhibitor), a C4BP (C4 binding protein), os fatores H e I, a clusterina e a proteína S
(vitronectina), restringem a ação do Complemento em vários pontos da cascata de ativação
nos fluidos corporais.
Além disso, as membranas das células do hospedeiro são protegidas contra o
ataque do complemento homólogo por proteínas de superfície, tais como o receptor 1 de
20
complemento (CR1 ou CD35); a proteína cofator de membrana MCP (membrane cofator
protein) ou CD46; as proteínas do fator de aceleração do decaimento ou DAF (decay-
accelarating factor) também chamado de CD55; a proteína ligadora de C8 ou fator de
restrição homóloga HRF (homologous restriction factor); e a protectina ou CD59. Estas
proteínas estão ancoradas à superfície celular por âncoras de glicosilfosfatidilinositol
(GPI) (Meri, 2007).
Assim, as proteínas do Complemento funcionam mediando uma série de reações
biológicas, todas servindo diretamente para a defesa do organismo contra agentes
microbianos, especialmente contra os microrganismos extracelulares e, indiretamente,
contribuindo para a regulação de outros processos de defesa adaptativos (Taylor, Botto &
Walport, 1998).
Dessa forma, a ativação do sistema Complemento por qualquer uma das três vias
tem implicações importantes para o organismo animal:
Fagocitose - A opsonização dos microrganismos por fragmentos de componentes
do Complemento (C3b, C4b e iC3b), gerados durante a ativação do sistema,
facilita a fagocitose realizada por células que possuem receptores de complemento
(CR1, CR3 e CR4) presentes em sua superfície;
Reação inflamatória - Os fragmentos protéicos - C3a, C4a e C5a - oriundos da
clivagem de componentes do Complemento, ligam-se a receptores presentes em
mastócitos e basófilos, que desgranulam e liberam histamina;
Ativação de leucócitos - Os fragmentos peptídicos C3a e, principalmente C5a,
estão envolvidos na quimiotaxia e ativação dos leucócitos;
Lise de células-alvo - Ao final da cascata do Complemento a inserção de um
conjunto de proteínas C5bC6C7C8C9n (MAC), na bicamada lipídica das células-
alvo, leva à formação de um poro hidrofílico que provoca o influxo de água e
perda de íons da célula, gerando instabilidade osmótica e, conseqüentemente, lise.
O fenômeno de lise também pode ocorrer no caso de vírus envelopados;
Remoção de imunocomplexos - Componentes do Complemento participam da
solubilização e posterior eliminação dos complexos imunológicos mediante sua
ligação a receptores de Complemento (CR1) presentes na superfície dos eritrócitos,
macrófagos e neutrófilos.
21
2. Participação do Complemento em Processos Inflamatórios
Inflamação é a reação do organismo a lesões teciduais causadas não só por
microrganismos como também a traumatismos decorrentes de pancadas, esmagamentos,
cortes, queimaduras por agentes químicos ou físicos, etc. As reações inflamatórias
envolvem os vasos sangüíneos no sítio afetado e tem por finalidades a defesa, cicatrização
e reparo dos tecidos lesados (Giannoudis, 2003).
Durante a reação inflamatória são identificados dois tipos de eventos diferenciados,
mas que são relacionados: eventos vasculares e eventos celulares (Cochrane & Dixon,
1976 e Steed, 2003). Assim, leucócitos e moléculas plasmáticas extravasam para o local
de infecção ou dano tecidual e o sítio inflamado apresenta os sinais característicos de
rubor, edema, calor e dor. O processo inflamatório pode ou não evoluir para uma resposta
imunológica específica.
Os eventos vasculares ocorrem na microcirculação, e o rubor e o aumento de
temperatura (calor) se devem à maior quantidade de sangue fluindo através dos vasos
locais. Os vasos sangüíneos da microcirculação são revestidos por células endoteliais que
apresentam junções intercelulares muito firmes. Alguns mediadores liberados por
mastócitos e/ou basófilos causam a retração das células endoteliais, promovendo a
alteração da permeabilidade capilar (Miller & Burnett, 1990). Estes eventos permitem que
moléculas de maior peso molecular como as proteínas da cascata de coagulação e do
sistema Complemento atravessem o endotélio. A causa imediata de tais modificações é a
ação local dos mediadores químicos da reação inflamatória aguda. Estes mediadores
resultam da ativação de sistemas de enzimas plasmáticas, liberação de citocinas e produtos
de mastócitos, plaquetas e leucócitos (Wasserman, 1987). Além do extravasamento de
plasma haverá a migração e acúmulo de leucócitos no local da inflamação.
Cada tipo celular possui um padrão característico de migração. Quando ocorre
inflamação em um determinado local, inicia-se a quimiotaxia de leucócitos da circulação
sangüínea para o tecido inflamado. A migração das células inflamatórias é direcionada por
agentes quimiotáticos que são produtos de origem variada e cuja ação resulta em
marginação, pavimentação e diapedese dos leucócitos. Dentre estes agentes, podemos citar
fragmentos de componentes do Complemento; fatores derivados do sistema fibrinolítico e
das cininas; produtos de leucócitos e plaquetas e substâncias derivadas de determinadas
bactérias (Wasserman, 1987).
22
O extravasamento de líquido leva também ao aumento da drenagem linfática, o que
pode ser benéfico por permitir que o agente agressor seja retirado e levado até os
linfonodos, onde entra em contato com células do sistema imunológico adaptativo
inclusive com a participação das células dendríticas (Angeli & Randolph, 2006).
Há cerca de 30 anos atrás, a participação do sistema Complemento nas reações
inflamatórias, não relacionadas com infecção, não era considerada importante, pois eram
poucos os modelos experimentais in vivo que poderiam demonstrar seu papel no
desencadeamento e perpetuação de tais reações.
Gradualmente, tornou-se claro que a deficiência de alguns componentes do
Complemento estava freqüentemente associada ao agravamento de doenças reumáticas e
ao lupus eritematoso sistêmico (Alexander et al, 2007 ; Frank & Hester, 2008).
Mais recentemente foi aceito que tal sistema é importante não apenas para proteger
o organismo contra infecções microbianas, mas também contribui para a fisiopatologia de
um grande número de doenças não infecciosas como, por exemplo, esclerose múltipla,
artrite reumatóide e doença de Alzheimer (Skaper, 2007 e Okroj et al, 2007).
O conhecimento sobre o papel do Sistema Complemento em várias doenças
contribuiu para o desenvolvimento de estratégias de terapia anti-inflamatória, em que
determinados componentes do Complemento são inibidos especificamente, e também
levou ao desenvolvimento de métodos que permitem a melhor compreensão desse sistema
(Mollnes et al, 2007).
A anafilatoxina C5a promove a quimiotaxia, regulação positiva de moléculas de
adesão endoteliais e liberação de radicais de oxigênio de neutrófilos e macrófagos. C5a se
liga a, pelo menos, dois receptores transmembranares, C5aR (C5R1ou CD88) e C5L2
(gpr77), de menor afinidade, expresso numa grande variedade de células, mais
especificamente em células como macrófagos, neutrófilos e linfócitos T (Monk et al,
2007).
Camundongos deficientes de C5 e, conseqüentemente, incapazes de gerar C5a
durante a ativação do Complemento, não sofrem choque anafilático e também não
apresentam danos teciduais no intestino, quando injetados com TNF-α e a seguir com LPS
(Hsueh et al, 1990).
A inibição de certos componentes do Complemento pode ser utilizada como alvo
de terapia para se reduzir os efeitos adversos do processo inflamatório. Um exemplo dessa
estratégia é a administração de uma forma solúvel do receptor 1 de complemento (sCR1),
que bloqueia a ativação do C3, interrompendo, dessa forma, os estágios iniciais da
23
ativação do sistema. O emprego de anticorpos monoclonais anti-C5, que impedem a
quebra deste componente, inibe os estágios finais da ativação do complemento (Riou,
2001 e Kaplan, 2002). Por outro lado, a neutralização de C5a com anticorpos monoclonais
embora não interfira na formação do complexo de ataque à membrana e, portanto, na lise
de bactérias, contribui para o controle do processo inflamatório. Esta estratégia pode ser
empregada durante a septicemia causada por bactérias Gram-negativas, como a Neisseria,
em que a liberação de C5a contribui para o desenvolvimento do choque séptico. (Czermak
et al, 1999).
Entranto, estudos com diferentes animais têm mostrado resultados conflitantes no
tratamento do choque séptico utilizando-se anticorpo monoclonal anti-C5a. Em dois
modelos de choque séptico, utilizando-se primatas (Macaca fasciculares), foram
administrados anticorpos anti-C5a profilaticamente. Observou-se que a taxa de
mortalidade dos animais foi consideravelmente reduzida, havendo também melhoria das
condições hemodinâmicas (Stevens et al, 1986). Em contraste a estes resultados,
anticorpos monoclonais contra C5a ou desArgC5a não mostraram qualquer efeito na taxa
de mortalidade e na falência dos órgãos em um outro modelo de choque séptico desta vez
em porcos (Mohr et al, 1998).
Mostrou-se que a ativação do Complemento é prejudicial durante o
desenvolvimento do choque séptico em roedores, provavelmente, devido à formação
excessiva de C5a. Esse efeito prejudica a atividade de células como os neutrófilos que, sob
tais condições, têm o seu desempenho funcional (quimiotaxia, fagocitose e produção de
H2O2) profundamente prejudicado. Essas mudanças resultam na queda acentuada da
capacidade das células fagocíticas em destruir e eliminar o causador da inflamação.
Em camundongos, a produção excessiva de C5a também está associada com o
forte consumo de fatores do sistema de coagulação e fibrinolítico causando desequilíbrio
homeostático e alteração no sistema de coagulação. Todas essas conseqüências adversas
podem ser atenuadas com o bloqueio de C5a, C5aR ou IL-6. A síntese desta última
citocina parece ser importante na expressão de C5aR.
Em resumo, estes estudos sugerem que, em decorrência de sua ativação excessiva,
o Complemento perde a sua função de proteger o hospedeiro durante o choque séptico
(Riedemann et al, 2003).
24
3. Reações de Hipersensibilidade e a Participação do Sistema Complemento
A presença de um antígeno em um organismo pluricelular dotado de sistema imune
adaptativo é capaz de desencadear uma resposta imunológica, seja ela mediada por células
ou anticorpos. Quando a presença de um antígeno induz uma resposta imunológica que
causa danos teciduais, sem um evidente benefício para a sobrevivência do hospedeiro, diz-
se que estamos diante de uma reação de hipersensibilidade ou uma reação alérgica e o
antígeno em questão é um alérgeno (Venarske & de Shazo, 2003).
O termo “alergia” foi primeiramente utilizado por von Pirquet, para denominar
tanto as respostas imunológicas protetoras do hospedeiro quanto aquelas potencialmente
danosas (Gr. allos e ergon, atividade alterada). De forma semelhante, a palavra
“hipersensibilidade” foi descrita pela primeira vez como o status de um organismo
(mamífero) após exposição a um agente infeccioso. Com isso, o mamífero seria
hipersensível a este agente e, consequentemente, capaz de lidar efetivamente com ele
numa segunda exposição. Entretanto, estes dois termos adquiriram uma conotação de
respostas deletérias (Bendiner, 1981).
As reações alérgicas podem ser desencadeadas por agentes exógenos presentes na
poeira doméstica, no pólen, nos alimentos, drogas, agentes microbianos, picadas de
insetos, etc., e podem ser locais ou sistêmicas dependendo da via de contato e da dose do
alérgeno.
As reações de hipersensibilidade são observadas após a inoculação da chamada
dose desencadeante da reação alérgica e foram classificadas de acordo com diferentes
critérios. Assim, dependendo do tempo decorrido entre o contacto com o alérgeno e a
reação cutânea observada, elas foram classificadas em imediatas e tardias. Embora o
critério de tempo de aparecimento continue válido para a classificação das reações
alérgicas, a observação de que os estados de hipersensibilidade poderiam ser transferidos
pelo soro ou por células, de indivíduos sensíveis para indivíduos normais, possibilitou
classificá-las em humorais e celulares, respectivamente. Assim, enquanto as reações do
tipo imediato incluem as reações reproduzíveis por anticorpos das classes IgE, IgG ou IgM
presentes no soro e, conseqüentemente, podem ser transferidas de um indivíduo para o
outro por anti-soro, as reações do tipo tardio dependem de linfócitos e, portanto, não são
transmissíveis por anti-soro, mas somente por células (Averbeck et al, 2007).
Na década de 60, Gell & Coombs propuseram uma classificação das reações de
hipersensibilidade baseando-se em critérios imunohistopatológicos. Essas reações foram
25
classificadas em quatro tipos: Tipo I (anafilática), Tipo II (citotóxica), Tipo III (por
imunocomplexos) e Tipo IV (celular). O conhecimento dos mecanismos subjacentes a tais
processos mostrou que as reações classificadas em Tipos I, II e III envolviam anticorpos e
as reações mediadas por células T (DTH- delayed-type hypersensitivity) constituíam o
Tipo IV.
Embora os mecanismos envolvidos nessas reações estejam mais bem
compreendidos atualmente e sejam de fato muito relacionados, a classificação de Gell &
Coombs ainda auxilia na descrição de processos inflamatórios resultantes da exposição
prévia a certos antígenos.
Na reação de hipersensibilidade do Tipo I ou anafilática há o envolvimento do
anticorpo da classe IgE, que se liga ao mastócito e/ou basófilo pela porção Fc do anticorpo
ao seu receptor específico (FcεR1). O reconhecimento do antígeno pela região Fab do
anticorpo ligado, seguido pela agregação de receptores FrεR1, induzido pela interação das
IgE ligados aos diferentes epítopos de um mesmo antígeno, leva à desgranulação dessas
células e à liberação de mediadores primários (aminas vasoativas) e secundários
(derivados do ácido araquidônico). Esses mediadores causam diferentes efeitos,
dependendo do tecido afetado. Podem promover vasodilatação, extravasamento de
líquidos, multiplicação de células do sistema imunológico, síntese de mucina para
aumentar a viscosidade do muco e aumento dos movimentos peristálticos. Esses efeitos,
que contribuem para a eliminação de patógenos dos sistemas gastrointestinal e
respiratório, tornam-se deletérios quando produzidos em excesso (Fadal, 1993).
Na chamada reação citotóxica (Tipo II), há a participação de anticorpos das classes
IgG e IgM, que reconhecem antígenos presentes nas células ou a elas adsorvidos. Nesse
caso, pode haver a participação do sistema Complemento resultando na fagocitose ou lise
da célula. Podem então ocorrer danos celulares graves como nas anemias hemolíticas
causadas por medicamentos ou nas reações transfusionais. Anticorpos das classes IgM e
IgG e Complemento, também estão envolvidos nas reações por imunocomplexos (Tipo
III) que são formados na presença de antígenos solúveis. As reações de Arthüs e a doença
do soro são os exemplos clássicos desses processos inflamatórios. As reações mediadas
por imunocomplexos podem ser sistêmicas quando os complexos se formam na circulação
sangüínea e depositam-se, posteriormente, em diferentes órgãos; são localizadas, quando
os imunocomplexos são formados e depositados no sítio de inoculação do antígeno como
26
na reação de Arthüs ou ainda nos rins, nas articulações ou em pequenos vasos (Bonneau et
al, 1986).
Na resposta mediada por células (Tipo IV) identifica-se a participação das células
T antígeno-específicas. A reação cutânea à inoculação da tuberculina é o protótipo dessa
reação e envolve macrófagos, que secretam IL-12, e linfócitos Th1, que secretam IFN-γ.
Outra elemento importante nesta classe de reações são os linfócitos T citotóxicos (CD8+)
como a hipersensibilidade de contato em que ocorrem reações cutâneas a antígenos de
plantas ou metais (níquel) (Aberbeck et al, 2007).
A participação do Complemento em processos inflamatórios causados por
imunocomplexos, inclusive nas doenças autoimunes, se dá de duas formas. A primeira
inclui a clivagem de C3 em C3b, que depois pode ser clivado a iC3b pelo fator I (uma
serina esterase de fase fluida) na presença de cofatores. Esses fragmentos podem
opsonizar os imunocomplexos que são então reconhecidos pelas células fagocitárias via os
receptores CR1 e CR3 para C3b e iC3b, respectivamente. A segunda envolve a atuação
das anafilatoxinas que recrutam e ativam granulócitos polimorfonucleares, e macrófagos e
induzem mastócitos teciduais a liberar histamina e TNF-α, via receptores C5aR e C3aR.
Acreditou-se durante muito tempo, que o início do dano tecidual mediado por
imunocomplexos se dava, principalmente, pela ativação da via clássica do Complemento.
A formação desses complexos permitiria a ligação e ativação do Complemento levando à
liberação de peptídios quimiotáticos com subseqüente influxo de neutrófilos,
desgranulação de mastócitos e dano tecidual (Köhl & Gessner, 1999). Atualmente,
considera-se que esta reação envolva, de início, a ativação dos mastócitos teciduais
decorrente da ligação dos complexos imunes via receptores de IgG. (FcγRIII).
A reação de Arthus é provocada pela injeção subcutânea de um antígeno solúvel
em um animal previamente imunizado com o mesmo antígeno. Esta reação é mais lenta do
que a reação do tipo I e envolve o receptor FcγRIII, presente nos mastócitos, que é capaz
de reconhecer anticorpos da classe IgG.
Sylvestre e colaboradores, em 1996, trabalhando com camundongos deficientes de
FcRγ-/-, demonstraram que estes animais exibiam redução acentuada da reação de Arthus
cutânea porque eram incapazes de sinalizar através de receptores FcγRI e FcγRIII, embora
apresentassem o sistema Complemento funcional. Trabalhos adicionais mostraram que as
reações de Arthus são atenuadas em camundongos deficientes de mastócitos, e que esta
resposta inflamatória pode ser reconstituída com este tipo celular proveniente de animais
controles. Entretanto, isso não ocorre caso sejam utilizados mastócitos de camundongos
27
FcRγ-/-. Os autores concluíram que mastócitos expressando FcγRIII são os principais
responsáveis por iniciar uma resposta inflamatória dependente de IgG (Sylvestre &
Ravetch, 1996).
Outros dados tornaram controvertida a participação do Complemento na reação de
Arthüs. O fato da exclusão genética de C3 e C4 não impedir a referida reação sugeriu a
hipótese de que o Complemento não exerceria nenhum papel importante no processo, ou
participaria apenas de forma secundária nessa reação. Entretanto, não foi considerado o
fato de que a deficiência em C3 não impedia as propriedades inflamatórias realizadas por
outros produtos do complemento.
Baumann e colaboradores (2001) mostraram ser necessária a clivagem de C5 e a
formação de C5a, independentes de C3b, para que se desenvolva uma reação de Arthus em
camundongos C3-/-. A clivagem de C5 pode ocorrer através da ação de trombina, elastase
de neutrófilo e serina protease de macrófagos (Huber-Lang et al, 2006).
Por outro lado, a inibição farmacológica ou inativação gênica de C5aR impediu a
inflamação mediada por imunocomplexos. Os estudos comparativos de Complemento e
FcγR nas mesmas condições experimentais mostraram o papel co-dominante de FcγR e
Complemento, sendo os receptores FcγRIII e C5aR as moléculas mais relevantes para a
ocorrência deste processo. Estes resultados sugerem um modelo de reação de Arthus em
que as respostas mediadas por FcγR estão interligadas com a ativação de C5aR (Baumann
et al, 2000 e Skokowa et al, 2005).
4. Alérgenos e Ativação do Sistema Complemento
Algumas substâncias, com propriedades alergênicas para indivíduos sensíveis, são
capazes de ativar o Complemento do soro proveniente de indivíduos normais. Portanto, é
possível que essas substâncias possam desencadear processos inflamatórios independentes
de reações de hipersensibilidade propriamente ditas, através da ativação inespecífica do
Complemento (Hidvégi, 1995).
Há várias décadas foi mostrado que extratos de alérgenos (proteínas do trigo, pelo
de animais, poeira doméstica, pólen de plantas, corpo de mosquito, etc.), capazes de
desencadear reações cutâneas em indivíduos sensíveis, podem ativar o sistema
Complemento in vitro (Berrens & de la Cuadra López, 1997). Entretanto, pouco se
28
conhece sobre os mecanismos de ativação do Complemento por essas substâncias
alergênicas.
A ativação inicial do sistema complemento ocorre principalmente pela via clássica,
embora a participação da via alternada também ocorra. É possível a ligação do C1 ao
alérgeno na ausência de anticorpo. A ligação deste componente à proteína A de
estafilococos ou em agregados de imunoglobulinas (IgG), na ausência de antígenos, in
vitro é bem conhecida (van der Zee, van Swieten & Aalberse, 1988).
Há ainda a possibilidade da ativação da via clássica ser iniciada por anticorpos
naturais. Trabalhos realizados com extratos de poeira doméstica demonstraram que a
ativação da via clássica pelo alérgeno é mediada por anticorpos naturais, da classe IgM,
que reagem com antígenos polissacarídicos presentes no extrato (van der Zee, van Swieten
& Aalberse, 1988).
Além disso, é possível a concomitância dos processos de reação de
hipersensibilidade mediada por anticorpos específicos e ativação direta do sistema
Complemento por alérgenos (Hidvégi, 1995).
Tradicionalmente, a ativação do Complemento não era considerada importante na
patogênese das reações de hipersensibilidade do tipo I, visto que IgE não é fixadora de
complemento (Cavelti, 1950). Entretanto, alérgenos responsáveis por reações de
hipersensibilidade mediadas por IgE, como por exemplo os antígenos da ambrósia (RWA
- ragweed allergen), podem ativar o complemento independentemente da presença de
anticorpos específicos. Isto resulta na liberação de anafilatoxinas que, como se sabe,
atuam na desgranulação de mastócitos e, portanto, podem amplificar as reações da
hipersensibilidade mediadas por IgE (Wilson et al, 1980).
Mais recentemente, Hidvégi e colaboradores (1995), verificaram que o alérgeno
RWA ativa o Complemento pela via alternada da seguinte forma: três amostras de soro de
indivíduos não alérgicos, três amostras de soro de pacientes deficientes de C2 e uma
amostra de soro depletado de C2 foram incubadas com 100 AU/ml de extrato total de
Ambrósia (RWA). Nas amostras de soro normal de indivíduos não alérgicos, o RWA
induziu a formação de C3 convertase associada à properdina (C3bBbP) e,
conseqüentemente, a presença significativa de C3a, quando comparados ao controle
negativo feito com tampão veronal-salina. Ao contrário, não foi observada formação de
grande quantidade de C3bBbP e/ou C3a nos soros dos pacientes deficientes de C2.
Resultado semelhante foi encontrado com o soro depletado de C2. Portanto, supôs-se
29
necessário o envolvimento de C2 na ativação do Complemento. Posteriormente verificou-
se que o C1 pode ligar-se diretamente a esses alérgenos, mesmo na ausência de
imunoglobulinas, o que explicaria a amplificação da via alternada por componentes da via
clássica (Berrens, Van Rijswijk-Verbeek, & Guikers, 1976 e Berrens, de la Cuadra &
Gallego, 1997).
O extrato de folhas de tabaco (TGP) contém uma glicoproteína rica em polifenol,
que pode ativar a via clássica do sistema Complemento após interagir com em um sítio
localizado entre a porção colágena e a globular do C1q. Uma proteína isolada da fumaça
de cigarro (S-TGP) que também ativa a via clássica tem um sítio de ligação ao C1q
semelhante ao TGP. Entretanto, a ligação da proteína do S-TGP ao C1 não leva à
clivagem do C3, a menos que a porção polifenólica da molécula esteja associada ao ácido
clorogênico ou à rutina. Esses resultados mostram um mecanismo adicional de ativação do
Complemento por produtos do cigarro. In vivo, esses processos podem resultar na
formação de produtos biologicamente ativos e dar início a uma resposta inflamatória
localizada (Koethe, Nelson & Becker, 1995).
Em 2003, Varga e colaboradores, estudaram duas preparações alergênicas: uma de
ácaros poeira caseira (HD – house dust mites) e outra da planta Parietaria judaica (PA). A
incubação desses extratos com soro humano foi capaz de ativar o sistema Complemento,
conforme verificado pela presença de fragmentos resultantes da clivagem de C4. Esses
fragmentos foram detectados tanto no soro de pessoas alérgicas a esses extratos quanto no
de pessoas não alérgicas. Os autores demonstraram a interação dos extratos HD e PA com
C1q e ativação do componente C1. Utilizando componentes purificados do Complemento,
foi verificado que constituintes desses extratos eram capazes de se ligar à porção globular
do C1q e também à MBL. Entretanto, extrato de HD induziu a formação de fragmentos de
C4 a partir de soro normal ou soro depletado de MBL em quantidades equivalentes. Em
contraste, o PA não induziu à formação de fragmentos do C4 a partir de soro depletado de
MBL. Esta atividade foi restaurada quando o soro foi reconstituido com MBL purificada.
Verificou-se ainda a diminuição nesses resultados quando foi usado soro de
indivíduos com hipogamaglobulinemia. Estes resultados in vitro indicam que embora os
extratos alergênicos possam se ligar a C1q e MBL, há necessidade de IgG para ativação
eficiente do sistema complemento. Dependendo do alérgeno, esta ativação pode ser
inciada pelo C1, pela MBL ou por ambos. Pode se excluir a participação de anticorpos
específicos para diferentes epítopos do alérgeno durante a ativação do Complemento, pois
30
extratos alergênicos podem ativar o sistema no soro de indivíduos não alérgicos (Varga, et
al, 2003).
Assim, a ativação do complemento pode ser explicada pela formação de
imunocomplexos entre epítopos polissacarídicos ubíquos nos diversos alérgenos que
reagem cruzadamente com anticorpos naturais presentes no soro de vários indivíduos (van
der Zee, van Swieten & Aalberse, 1988).
Dada a complexidade desses extratos conclui-se que vários mecanismos,
independentes de anticorpos efetores de reações de hipersensibilidade, podem desencadear
a ativação do complemento e intensificar os processos inflamatórios. Além disso,
trabalhos recentes sugerem que o complemento desempenha papel regulador importante
nas reações de pacientes sensibilizados com diferentes alérgenos (Drouin et al, 2001).
Karp e colaboradores, em 2000, compararam dois grupos de camundongos que
exibiam respostas respectivamente baixas e altas contra metacolina, um derivado sintético
do neurotransmissor acetilcolina. Este composto é utilizado como agente
broncoprovocador para a avaliação de reatividade brônquica, no diagnóstico de asma.
Utilizando-se técnicas de biologia molecular, demonstrou-se que o gene que codifica C5
confere baixa resposta brônquica ao alérgeno. A resposta da linhagem geneticamente
deficiente de C5 foi significativamente maior que dos animais normais. Os autores
concluiram que C5a possui a capacidade de estimular a liberação de IL-12 de monócitos e
macrófagos e, consequentemente, induzem resposta do tipo TH1. Quando C5 está ausente
e, conseqüentemente, nenhum C5a pode ser gerado, o balanço da resposta imunológica
muda para o do tipo TH2, que é característico da produção de anticorpos envolvidos nas
alergias.
Vários estudos sugerem que as anafilatoxinas regulam o desenvolvimento e a
magnitude das respostas imunológicas adaptativas. Há ainda evidências indicando que a
sinalização realizada pelo C5aR na região de contato entre células dendríticas e linfócitos
T é importante para proteger o organismo, impedindo o desenvolvimento de resposta
imunológica adaptativa do tipo TH2 (Peng et al, 2005).
Em contraste com o observado com relação ao C5a, C3a e seu receptor (C3aR) são
necessários para uma resposta efetiva do tipo TH2, após o estímulo imunológico com o
alérgeno. Camundongos C57BL/6 deficientes de C3aR apresentaram produção reduzida
de citocinas do tipo TH2 (IL-4, IL-5 e IL-13), acarrentando diminuição da inflamação
31
eosinofílica, produção de IgE e muco em um modelo de alergia pulmonar causada por
Aspergilus (Drouin et al, 2002).
5. Reações a Antígenos de Mosquitos
Um conjunto importante de alérgenos para o homem e para os animais é
proveniente de artrópodes. As picadas de insetos hematófagos e ferroadas de himenópteros
são sabidamente causadoras de reações alérgicas tanto localizadas quanto sistêmicas.
Exemplos importantes dessas reações a picadas de artrópodes hematófagos (mosquitos,
moscas, pulgas, carrapatos e ácaros predadores) é a urticária papular ou prurigo-estrófulo,
que é uma das dermatoses mais comuns na infância (Dortas Jr. & Abe, 2006). As reações
alérgicas às ferroadas de abelhas podem resultar até em choque anafilático (Steen,
Carbonaro & Schwartz, 2004)
Clinicamente, a urticária papular se caracteriza pela presença de pápulas
eritematosas, algumas vezes encimadas por vesículas, outras vezes escoriadas ou
recobertas por pequenas crostas. O prurido é um sintoma proeminente e a coçadura pode
levar à infecção secundária, normalmente restrita à pele. As lesões podem regredir
totalmente com o tempo e, eventualmente, deixar cicatrizes permanentes (Degos, Civatte
& Belaich, 1980).
A urticária papular resulta da sensibilização dos indivíduos a constituintes oriundos
desses artrópodes. As reações podem ser imediatas, do tipo urticariforme, e ocorre em
poucos minutos após a picada. É transientemente pruriginosa e chega a sua intensidade
máxima entre 15 e 30 minutos, podendo perdurar por até 60 minutos. Já a reação tardia é
semelhante à reação tuberculínica, podendo perdurar por vários dias, acompanhadas por
prurido intermitente. Segundo observações de Goldman, Rockwell e Richfield em 1952,
em alguns casos assume características de uma reação de Arthus, podendo levar à necrose.
A urticária papular pode ser causada por mosquitos, que são insetos dípteros (um
par de asas), mundialmente distribuidos, pertencentes à família Culicidae, daí serem
também chamados Culicídeos (lat. Culex = mosquito). Reconhece-se atualmente a
existência de aproximadamente 3.600 espécies de culicídeos, em cerca de 40 gêneros
(Crosskey, 1988).
32
Foi demonstrado, em 1922, por Gordon, que os mosquitos atacam o homem
indiscriminadamente, ao contrário da crença de que algumas pessoas seriam mais
predispostas às picadas que as outras.
Numerosas espécies de mosquitos incluem-se no grupo de insetos de importância
epidemiológica, porque é por ocasião das picadas hematofágicas que as fêmeas atuam
como vetores de microrganismos patogênicos, que podem causar várias enfermidades no
homem e em outros animais. O hematofagismo é precedido da inoculação de saliva e
substâncias anticoagulantes que desencadeiam reações alérgicas leves ou intensas,
dependendo do estado de susceptibilidade do indivíduo picado (Steen, Carbonaro &
Schwartz, 2004).
Especial atenção tem sido dada aos estudos das glândulas salivares e saliva dos
mosquitos, visando-se compreender a capacidade de vetoração das glândulas, os processos
metabólicos de síntese dos constituintes da saliva e suas atividades biológicas.
Várias substâncias têm sido descritas como constituintes da saliva dos mosquitos,
tais como alfa-glicosidade, alfa-amilase, fator bacteriolítico, esterase, apirase,
vasodilatador, proteína D7, anti-TNF, anticoagulante, aglutinina e histamina. Alguns
constituintes da saliva, independente de suas atividades bioquímicas, podem comportar-se
como antígeno (Malafronte et al, 2003 e Ribeiro, 2000).
Reações cutâneas à picada de mosquito consistem de uma pápula e enrijecimento
tardio da região ao redor da picada. O tempo decorrido entre a picada do inseto e o
desencadeamento da reação cutânea é compatível com a hipersensibilidade mediada por
IgE (imediata). A fase tardia da alergia cutânea mediada por IgE é caracterizada pelo
aparecimento de eritema e endurecimento, com o pico da reação ocorrendo entre 4 e 8
horas, podendo ser transferida de um indivíduo sensível para um não sensível através do
soro (Solley et al, 1976). Estudos realizados por Peng & Simons (1997) confirmaram,
através de testes cutâneos e imunoblotting, que a IgE está envolvida no desenvolvimento
de reações cutâneas imediatas em pessoas alérgicas à picada de mosquito.
A quantidade sérica de IgE específica, contra constituintes das três espécies mais
comuns de mosquito (Aedes vexans, A. aegypti, e Culex quinquefaciatus), é
significativamente maior em pessoas que apresentam teste cutâneo positivo à picada de
mosquito do que naquelas com resultado negativo. IgE específica contra antígenos de
mosquito foi primeiramente identificada pelo teste Prausnitz-Küstner (Peng & Simons,
1997 e Scott et al, 1984).
33
A reação tardia parece ser consistente com a hipersensibilidade mediada por
linfócitos, que se desenvolve algumas horas após o indivíduo entrar em contato com os
antígenos do mosquito (pico da reação ocorre entre 24 e 48 horas). A reação cutânea tardia
não é observada quando a tentativa de transferência de hipersensibilidade é realizada com
soro. Estudos in vitro mostraram que o tempo de aparecimento das pápulas tardias está
correlacionado com o tempo da proliferação linfocitária em resposta aos antígenos do
mosquito (Peng, Yang & Simons, 1996).
Estudos histológicos mais detalhados mostram que os infiltrados celulares na
urticária papular típica podem ser de quatro tipos: linfocitário, eosinofílico, neutrofílico ou
misto (Jordaan & Schineider, 1997). Infiltrado perivascular localizado, contendo
linfócitos, histiócitos, eosinófilos e mastócitos são evidenciados na superfície da derme
(Ackerman, 1978).
Em 1984, Heng, Kloss e Haberfelde, além de estudarem histopatologicamente as
lesões de urticária papular, analisaram o envolvimento de complexos imunes e
Complemento nas lesões, sugerindo a ocorrência de vasculite no local da picada. Foram
demonstrados, por imunofluorescência, anticorpos da classe IgM e componentes do
Complemento (C1q e C3) no endotélio dos vasos superficiais da derme no local da reação
à picada de insetos hematófagos. Apesar dos sintomas e alterações histopatológicas
estarem bem descritos, os mecanismos subjacentes não são completamente conhecidos.
A complexidade dos mecanismos envolvidos nas reações alérgicas às picadas de
mosquitos pode resultar da grande variedade de constituintes veiculados por esses insetos.
Em extratos de glândula salivar foram identificadas mais de 25 bandas de proteínas,
correspondentes às bandas obtidas com saliva pura (Jariyapan et al, 2007).
Os níveis de anticorpos específicos contra antígenos de mosquitos vão decrescendo
com a idade, desde a infância até a adolescência, existindo correlação inversa significativa
entre a idade e os níveis de IgE e IgG específicos, o que sugere que a dessensibilização
ocorre naturalmente com o passar do tempo. A dessensibilização natural contra picada de
mosquito em adultos foi observada durante um longo período de exposições às picadas
(Peng et al, 2004a).
Estudos mostraram que um grande número de picadas, de forma regular e contínua
(100 picadas a cada 2 semanas durante 48 semanas), normalmente, leva à
dessensibilização do indivíduo, que é definida pela perda completa das reações imediata e
tardia. Entretanto a dessensibilização natural pode levar anos para ocorrer, ou até mesmo
34
nunca acontecer, porque indivíduos alérgicos à picada de mosquito, normalmente, tentam
se proteger da exposição aos mosquitos (Peng et al, 2004b).
A imunoterapia hipossensibilizante para a urticária papular tem sido tentada
utilizando-se extratos de corpo total dos mosquitos dos gêneros Culex e Aedes. Os extratos
são, em geral, administrados por via intradérmica ou subcutânea e sublingual (Targer et
al., 1969; Lelong, Brás & Castelani, 1986; Benaim-Pinto & Fassrainer, 1990; Pires et al,
1991; McCormack et al. 1995; Engler, 2001). No Brasil, o tratamento de pacientes com
urticária papular é feito com extrato de corpo total de Culex quinquefasciatus (Say, 1823).
O C. quinquefasciatus, normalmente referido como “pernilongo comum”, é o
culicídeo mais comumente encontrado no ambiente humano, tendo se adaptado com
facilidade ao incremento da urbanização e da industrialização promovidos pelo homem.
Coloniza em pequenos recipientes, valas, charcos e margens de rios e lagos tomados pela
vegetação, gerando intensa proliferação e altas densidades de mosquitos adultos (Lopes et
al, 1993).
Essa espécie é muito importante porque é vetora de agentes patogênicos como a
Wuchereria bancrofti (causadora da filariose humana), a Brugia malayi (o principal
nematodo responsável pela elefantíase no sudeste asiático), a Dirofilaria immitis (cujos
vermes adultos têm como hospedeiro preferencial o cão, mas, eventualmente, podem
parasitar o homem, localizando-se no coração e pulmões), e o poxvirus aviário (Guimarães
et al, 2000).
O extrato de corpo total do C. quinquefasciatus utilizado na dessensibilização de
pacientes alérgicos a picadas de mosquitos é preparado pela FDA Allergenic, Rio de
Janeiro, RJ, e comercializado como Vacina antiestrófulo®.
Alguns trabalhos relatando a utilização dessa vacina têm sido publicados. Riscalla
(1984) obteve bons resultados utilizando essa preparação por via sublingual. Pires et al
(1991), demonstraram ausência de lesões cutâneas em 87% dos pacientes tratados com a
vacina sublingual, em comparação com apenas 12% dos pacientes do grupo tratado com
placebo; Hahnstadt & Pires, em 1993, relataram resultados semelhantes. Estudo realizado
no México por Giraldi et al (2002), utilizando também esse extrato, mostrou que os
pacientes apresentaram diminuição no número de lesões, mas não foi observada variação
significativa nos níveis de IgE entre os grupos teste e placebo.
Extratos comerciais de corpo total de mosquito são misturas muito complexas;
contêm várias proteínas que não estão presentes na saliva do inseto, e que não são muito
úteis nos testes de diagnóstico e nos exames in vitro com soro de indivíduos com histórico
35
de reações alérgicas à picada de mosquito (Peng & Simons, 1996). Por outro lado, as
glândulas salivares e a saliva do mosquito, embora menos complexas quimicamente, são
tecnicamente difíceis de serem extraídas e consomem muito tempo para serem obtidas.
Estudos recentes mostraram que a positividade de um teste ELISA para culicídeos,
em que foi utilizado extrato de glândula salivar, foi de 44% e o teste UniCap (Pharmacia
Diagnostics AB – Suécia), que utiliza extrato de corpo total destes mosquitos, foi de 25%,
enquanto que os testes de negatividade foram de 0% e 3%, respectivamente. Ou seja,
testes, para a identificação de pacientes com urticária papular, que utilizam extrato de
glândula salivar conferem resultados mais precisos e confiáveis que aqueles que usam os
antígenos do extrato de corpo total. Entretanto, o extrato de glândula salivar empregado no
teste o encarece, tornando-se um empecilho para ampliar o seu uso no diagnóstico. Com
isso, a falta de um teste amplamente difundido, sensível, seguro e específico para a
determinação de sensibilidade à picada de mosquito ainda é um grande obstáculo para
aprimorar o diagnóstico de pessoas alérgicas e para investigar os mecanismos
imunológicos envolvidos (Beckett et al, 2004).
Com o objetivo de padronizar as preparações utilizadas em testes sorológicos e na
dessensibilização dos pacientes com urticária papular, Hahnstadt (1997) analisou o extrato
de corpo total do mosquito C. quinquefasciatus por cromatografia de troca iônica e
demonstrou a presença pelo menos onze frações com atividade antigênica e uma fração
com atividade alergênica. A antigenicidade das frações foi demonstrada por precipitação
em gel e testes imunoenzimáticos frente a soros de indivíduos considerados sensíveis e
não sensíveis. Uma das frações deu resultado positivo quando injetada intradermicamente
em paciente adulto alérgico a picadas de mosquitos. Portanto, nesse trabalho o autor
demonstrou a presença de vários constituintes no extrato de corpo total dessa espécie de
mosquito que são reconhecidos por anticorpos presentes no soro tanto de pacientes com
urticaria papular quanto no soro de indivíduos não sensíveis.
Calixto em 2005, analisando 5 diferentes partidas de extrato de corpo total do C.
quinquefasciatus, obtidas em diferentes épocas do ano, mostrou a reprodutibilidade do
processo de análise quanto ao perfil cromatográfico e antigenicidade das frações obtidas.
Análises preliminares dessas frações por immunoblotting mostraram a presença de vários
antígenos reconhecidos por anticorpos das classes IgM e IgG presentes no soro de
indivíduos normais.
Neste ponto, cabe ressaltar que são considerados normais ou não, pelos alergistas,
os indivíduos que não apresentam reação cutânea quanto testados pelo prick test usando
36
extratos provenientes dos insetos. No caso dos mosquitos, no entanto, várias pessoas que
apresentam prick test negativo, referem reações cutâneas às picadas de mosquitos.
Essas reações são tão características que já em 1946, Mellanby, observando as
reações de voluntários submetidos às picadas de Aedes aegypti, sugeriu haver uma
seqüência de estágios na sensibilização dos seres humanos. As picadas iniciais não
causariam nenhuma reação cutânea imediata, mas dentro de 20 a 24 horas haveria uma
reação cutânea considerada tardia. Picadas subseqüentes causavam reações cutâneas
imediatas que desapareciam dentro de duas horas e reações mais tardias semelhantes
àquelas observadas no início da sensibilização do indivíduo. Após repetidas exposições
aos mosquitos, as reações imediatas persistiriam a as reações mais tardias iriam
desaparecendo progressivamente. Observando pessoas picadas naturalmente, durante
longo tempo, e que não apresentavam mais reações cutâneas, o autor considerou ser este o
último estágio na sua classificação.
Posteriormente, McKiel & West (1961) confirmaram as observações sobre os
estágios das reações às picadas de mosquito e modificaram o quadro proposto por
Mellanby, acrescentando a etapa inicial onde os indivíduos não eram reativos.
Deve-se observar que, neste caso, os termos imediato e tardio não estavam sendo
usados no contexto dos termos empregados nas classificações das reações de
hipersensibilidade posteriores descritas do ponto de vista imunológico, como o de Gell &
Coombs.
Como já assinalado, trabalhos posteriores mostraram que tanto anticorpos
específicos quanto linfócitos sensibilizados por constituintes salivares estão envolvidos
nas reações cutâneas às picadas de mosquitos. Entretanto, a observação desses processos
de sensibilização e dessensibilização (ou não) dos indivíduos mostram que eles são
fenômenos complexos envolvendo eventualmente ativação de outros sistemas orgânicos
além do imunológico.
Assim, tendo em vista a complexidade das reações cutâneas individuais frente a
constituintes de mosquitos, reações essas que podem envolver respostas de fundo
imunológico humoral e celular ou não, induzidas por esses vários contituintes, o presente
trabalho tem por objetivo estudar a ativação do sistema complemento humano por
componentes do extrato de corpo total de mosquito.
37
OBJETIVOS
Tendo em vista a possível participação do sistema Complemento nas reações às
picadas de mosquitos e a comprovada complexidade química dos extratos de corpo total
utilizados em testes diagnósticos e hipossensibilização de indivíduos sensíveis, o presente
trabalho tem por objetivos:
1 Verificar a presença de anticorpos precipitantes no soro de indivíduos sensíveis e
não sensíveis à picada de mosquito, frente ao extrato de corpo total (ECT) do
mosquito Culex quinquefasciatus;
2 Estudar as vias de ativação in vitro do sistema Complemento humano frente aos
extratos de corpo total, cabeça e tórax e glândula salivar do mosquito Culex
quinquefasciatus;
3 Estudar as vias de ativação in vitro do sistema Complemento humano frente às
frações antigênicas obtidas a partir do ECT;
4 Analisar a atividade quimiotática de fragmentos resultantes da ativação do
Complemento pelos diferentes extratos e frações antigênicas do mosquito.
38
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Mosquitos
Foram utilizados os mosquitos da espécie C. quinquefasciatus (Say, 1823 ). Os
insetos foram fornecidos pelo Departamento de Controle Ambiental (DECOM), Divisão
de Vetores – Serviço de Bioensaios e Teste (DIVET) da Fundação de Engenharia do Meio
Ambiente (FEEMA). Os mosquitos adultos foram coletados na cidade do Rio de Janeiro,
principalmente, nos bairros da Barra da Tijuca e Jacarepaguá.
Formas imaturas (ovos, larvas e pupas) foram utilizadas para a criação dos
mosquitos em laboratório. Para assegurar que as espécies de mosquito representem as
populações que atacam o homem, foi feita a coleta de mosquitos no campo, com a
finalidade de introduzir o patrimônio genético das populações selvagens nas criações de
laboratório.
A espécie Culex quinquefasciatus foi identificada por especialistas em culicídeos
do DECOM/DIVET da FEEMA (Forattini, 1965).
1.1 Extrato do Corpo Total do Mosquito (ECT)
Os extratos de corpo total do mosquito Culex quinquefasciatus (4 partidas) foram
gentilmente cedidos pela FDA Allergenic (Rio de Janeiro, RJ).
Esses extratos são preparados a partir de mosquitos das gerações F1 a F3. Os
mosquitos adultos (2 a 3 dias) são mortos por congelamento (1 hora a -20ºC) e cerca de 1g
é homogeneizado com 10 ml de solução extratora de Evans (Lima et al.1969). A mistura é
macerada, sob agitação, a 4ºC durante 20h. Em seguida, o macerado é centrifugado a
25.000 x g durante 30 min. a 0ºC (Sorvall Superspeed RC2-B, rotor SS-34). O
sobrenadante é esterilizado por filtração através de membrana Millipore de poro 0,22µm.
1.2 Extrato de Cabeça e Tórax do Mosquito (ECTx)
Os extratos de cabeça e tórax foram preparados a partir de 400 mosquitos adultos
(fêmeas) com 1 semana de idade fornecidos pela FEEMA. Os mosquitos, mantidos sem
alimentação por 2 dias, foram mortos por congelamento (1h a -20°C). Antenas, probócida,
pernas, asas e os segmentos abdominais foram removidos, deixando-se apenas cabeça e
tórax (CTx). Esse material foi suspenso na solução extratora de Evans na proporção de 16
CTx para 100 µl de solução obtendo-se 2,5 ml de suspensão. Após maceração a 4°C por
20 h, a preparação foi centrifugada a 25.000 xg durante 30 min. a 0°C. O extrato resultante
39
foi estocado a 4°C até o momento de sua utilização. A representação gráfica abaixo mostra
as partes do mosquito utilizadas para o preparo do extrato.
Esquema 1 - Representação do corpo do mosquito sem as asas e patas. A região em destaque foi
utilizada no preparo do extrato de cabeça e tórax (ECTx). A = bomba salivar, B = glândulas
salivares, C = bomba faringeana, D = esôfago, E = divertículos dorsais, F = pró-ventrículo, G =
divertículo ventral, H = estômago, I = tubo de Malpighi, J = íleo e cólon, K = ovário, L =
espermatecas, M = placa pós-genital, N = abertura anal e O = cerca (Forattini, 1996).
1.3 Extrato de Glândula Salivar do Mosquito (EGS)
Mosquitos (72 fêmeas) de mesma procedência que os anteriores, com 4 dias de
idade e mantidos mais 2 dias sem alimentação, foram mortos por congelamento a -20C e
suas glândulas salivares dissecadas sob microscópio monócular Zeiss (aumento de 10 X) e
transferidas para solução de NaCl a 0,85% (16 pares de glândulas/100 µl de solução) e
mantidas no gelo. As glândulas foram rompidas por homogeneização e, em seguida,
centrifugadas a 3.500 x g por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi utilizado nos
experimentos de ativação do sistema Complemento.
O teor protéico dos extratos foi determinado de acordo com o método de Bradford
(1976) em placa de poliestireno de acordo com a técnica de micro-ensaio (1-20 µg de
proteína/ml) da Bio-Rad Laboratories GmBH (München, Alemanha) e usando
soroalbumina bovina (Sigma Chemical Co., Saint Louis, EUA) como padrão.
Região do mosquito utilizada para o preparo do ECTx
40
2. Soros Humanos
Sangue retirado de doadores voluntários normais, com prévio consentimento, foi
deixado coagular por 30 minutos à temperatura ambiente e em seguida os soros foram
centrifugados a 3500 x g a 4°C em centrífuga clínica (Internacional Clinical Centrifuge,
Arthur Thomas, EUA).
2.1. Soros humanos normais (SN) utilizados para identificação de constituintes
antigênicos, nas amostras de extratos de mosquitos, foram obtidos conforme referido
acima e conservados a - 20°C até o momento do uso.
2.2. Mistura de soros como fonte de Complemento (M), foram feitos com pelos
menos 8 alíquotas de diferentes soros humanos eram misturadas e absorvidas com papa de
hemácias de carneiro (cerca de 1 x 109 céls/ml), durante meia hora e sob agitação a 4°C.
Após centrifugação a frio por 5 min. a 1.400 x g, o sobrenadante era separado e o processo
de absorção repetido mais 3 vezes para a remoção de possíveis anticorpos capazes de
reconhecer eritrócitos de carneiro. Os soros absorvidos eram aliquotados e conservados a -
80ºC até o momento do uso.
2.3. Soros de pacientes (SP) com urticária papular foram gentilmente cedidos pelo
Dr. Mario Cezar Pires, do Serviço de Dermatologia “Dr. José Alexandre Sittart” do
Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo “Francisco Morato de Oliveira”, São
Paulo, SP.
A triagem dos paciencites, com diagnóstico de urticária papular por picadas de
mosquitos, foi efetuada por anamnese, exame clínico direto e testes cutâneos por puntura
de leitura imediata, conforme comunicação pessoal do Dr. Mario Cezar Pires. Ficha de
anamnese dos pacientes e o termo de consentimento para participar do estudo encontram-
se em anexo.
41
3. Pesquisa e Titulação dos Anticorpos anti-ECT nos Soros Humanos
A presença e conteúdo de anticorpos específicos nos soros para antígenos do ECT
foram verificados pelas técnicas de Contraimunoeletroforese e ELISA indireta.
3.1 Contraimunoeletroforese - A pesquisa de anticorpos precipitantes em soro foi
realizada por contraimunoeletroforese de acordo com Kurata & Tan (1976) com ligeiras
modificações como descrito a seguir: Amostra (20 µl) de uma mistura de soros utilizada
como fonte de Complemento (M1) foi aplicada em um orifício (3 mm de diâmetro) de
uma lâmina de microscópio (2,5 x 7,0cm) coberta com 4,0 ml de ágar a 1% em tampão
veronal sódico 0,02 M, pH 8,6. Após 10 min. de eletroforese (corrente contínua de 5V/cm)
a corrida foi interrompida e 20 µl do ECT (concentrado 4,5x) foram aplicados em um
segundo orifício no lado negativo do campo eletroforético e a 1,2 cm de distância da
mistura de soros. Como controle negativo, amostras da mistura e solução extratora de
Evans foram aplicadas em paralelo. Após mais 20 min. de corrida, a lâmina foi
exaustivamente lavada com solução salina e posteriormente com água destilada. Depois de
seca, a lâmina foi corada com vermelho de Pounceau S a 0,5% em ácido acético a 1 %. A
representação gráfica abaixo exemplifica a aplicação das amostras para a realização da
contraimunoeletroforese.
Esquema 2 – representação gráfica da contraimunoeletroforese entre mistura de soros humanos
normais (M1) e ECT do mosquito Culex quinquefasciatus.
3.2 Titulação dos soros por ELISA - A titulação dos soros foi realizada por
ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto de acordo com Voller & Bidwell (1986).
Amostras de ECT (concentrada 4,5x) foram diluídas a 1/5 em PBS (tampão fosfato de
sódio 0,01M, pH 7,2 contendo NaCl a 0,85%) e 100µl foram aplicados aos poços de placa
1,2 cm
+ - M1
M1
ECT
Evans
42
de poliestireno com 96 cavidades de fundo plano (Corning Laboratory Sciences Co.NY,
EUA) para sensibilização. Para controle do ensaio, algumas orifícios receberam apenas
PBS (100µl/ml). Após incubação por 2 h a 37°C, a placa foi mantida a 4°C por 18 horas e,
depois, lavada (2x) com PBS e incubada com o mesmo tampão contendo 5% de leite
desnatado (Molico – Nestlé), 200µl/poço, por 60 min. a 37°C para bloqueio.
Posteriormente, adicionaram-se alíquotas de100µl dos soros humanos diluídos em série na
razão de 2, de 1/40 a 1/640, em PBS/leite 5%. Após incubação por 60 min. a 37°C, a
placa foi lavada 3x com PBS, e incubada novamente nas mesmas condições com 100
µl/poço de conjugado de IgG de cabra anti-gamaglobulina humana marcada com
peroxidase (Sigma Chemical Co., Saint Louis, EUA) diluído a 1/20.000 em PBS/leite 5%.
Após lavagem (4x) com PBS, adicionou-se o substrato [100 µl da solução de 4,0 mg de
ortofenilenodiamina (OPD) + 4µl H2O2 a 30% (Sigma Chemical Co. St Louis, EUA) em
10 ml de tampão citrato-fosfato de sódio 0,1 M, pH 5,0]. Após 20 min. à temperatura
ambiente e ao abrigo da luz, reação foi interrompida pela adição de H2SO4 3N (50
µl/poço). A leitura da absorbância foi realizada em leitor de ELISA (Spectra Vision –
SLT, Austria) a 492 nm.
4. Ativação do Sistema Complemento
Os estudos da ativação do sistema complemento foram realizados de acordo com
Lima & Silva (1970) utilizando-se o sistema EA (Eritrócito de carneiro-Anticorpo de
coelho anti-eritrócito) como indicador da ação lítica do Complemento.
Para o estudo das diferentes vias de ativação foram usados dois métodos: o que
emprega hemácias de carneiro sensibilizadas com anticorpo de coelho anti-eritrócito
(hemolisina) e o que emprega hemácias de coelho não sensibilizadas. A técnica que
emprega hemácias de carneiro permite o estudo das três vias de ativação do Complemento
(Lima & Silva 1970). A técnica empregando hemácias de coelho possibilita o estudo
apenas da via alternada de ativação (Joiner, Hawiger & Gelfand, 1983).
43
4.1 Estudo da Ativação do Complemento Utilizando Hemácias de Carneiro
Sensibilizadas
A determinação da capacidade de ativação do Complemento pelas amostras de
ECT, ECTx e EGS foi realizada utilizando-se diferentes quantidades de amostras para um
mesmo volume de soro (utilizado como fonte do Complemento - M).
Para tanto, as amostras (6 a 120µl) de extratos foram incubadas a 37°C com 1,0 ml
de soro diluído a 1/10 em tampão veronal/salina (VBS) contendo gelatina 0,1% e íons
Ca2+ e Mg2+ durante 60 min.
Para quantificação da ativação do Complemento, as misturas de reação foram
centrifugadas (a fim de remover possíveis sedimentos) e o teor de Complemento residual
foi determinado nos sobrenadantes pela técnica de Mayer (1961). Resumidamente, após
diluição do soro a 1/5, alíquotas de 0,1 a 0,8ml foram levadas ao volume final de 2,0 ml
com o mesmo tampão de reação. A essas amostras adicionou-se o sistema revelador EA
(0,25ml) e incubou-se em banho-maria a 37°C durante 60 min. A leitura do conteúdo de
hemoglobina liberada pela ação do Complemento sobre o EA é avaliada pela absorbância
a 540nm. A porcentagem de lise é obtida comparando-se os valores de absorbância das
amostras com o de uma equivalente de EA em água destilada (100% de lise). Esses dados
possibilitam a determinação das unidades de CH50 /ml (Complemento hemolítico a 50%)
usando a equação de von Krogh (Lima & Silva,1970).
Como controle positivo foi utilizada uma amostra de 1mg/ml de zimosan (capaz de
consumir todo o Complemento). Zimosan consiste da parede celular da levedura
Saccharomyces cerevisiae, rica em carboidratos, consistindo de dois polissacarídos de α-
D-manana e β-D-glicano (Sigma Chemical, Co. St. Louis, MO. EUA). Este ativador que é
capaz de ativar, principalmente a via alternada e também a das lectinas, foi preparado de
acordo com Lima e Silva (1970): após suspensão em solução salina (NaCl 0,85%), foi
aquecido em banho-maria a 100ºC, por 30 min. Em seguida, foi centrifugado e lavado
duas vezes com solução salina.
Como controle negativo de ativação do Complemento foram utilizadas amostras de
soro sem as partículas ativadoras.
O sistema revelador ou sistema hemolítico (EA) é preparado da seguinte forma:
sangue de carneiro, coletado em solução de Alsever (1950), é centrifugado a 1.400 xg,
durante 10 minutos em centrífuga clínica (Internacional Clinical Centrifuge). A papa de
hemácias é lavada inicialmente com tampão veronal sódico/salina (VBS) adicionado de
44
EDTA 10mM e gelatina a 0,1% e mais 2 vezes com VBS contendo íons Ca2+, Mg2+ e
gelatina 0,1%. A suspensão dos eritrócitos é preparada no mesmo tampão, de modo a
conter 1 x 109 céls/ml. Ao volume dessa suspensão é adicionado volume igual de
hemolisina, previamente titulada (Lima & Silva, 1970). A mistura é incubada a 37ºC
durante 20 min., sob agitação e depois centrifugada durante 5 min. O sedimento é lavado
duas vezes com VBS contendo íons Ca2+ e Mg2+ e gelatina. A suspensão final de EA
utilizada nas dosagens de complemento residual contém 5 x 108 céls/ml.
O estudo das diferentes vias de ativação do Complemento foi efetuado usando-se
quelantes dos íons Ca2+ e/ou Mg2+ e o sistema hemolítico (EA) de acordo com Kabat &
Mayer (1961). Em resumo, amostras (60µl) de ECT, ECTx, EGS foram misturadas com
1,0 ml de soro humano, diluído a 1/10 em VBS/gelatina 0,1% contendo íons Ca2+ e
Mg2+, conforme referido acima. A duas outras misturas de reação acrescentaram-se 100µl
de soluções contendo quelantes: EDTA 0,1M (ácido etileno diamino tetra acético) ou
EGTA 0,1 M (ácido etilenoglicol bis (éter β-amino etil éter) N, N, N´, N´ tetra acético)
contendo MgCl2 0,1M. Essas misturas foram incubadas em banho-maria a 37°C durante
60 min., com agitação nos primeiros 10 min. Após incubação, as amostras foram
centrifugadas (1.400 x g) sob refrigeração (4°C) durante 5 minutos. O EDTA é um
quelante de íons divalentes, como o Ca2+ e o Mg2+, que são importantes para a manutenção
da estrutura e, consequentemente, da atividade de alguns componentes do Complemento.
A remoção destes íons do soro impede a ativação de todas as vias do complemento. O
EGTA age de forma semelhante ao EDTA, entretanto, este remove, preferencialmente, os
íons Ca2+, impedindo desta forma a manutenção da estrutura do complexo C1 e da MBL-
MASPs. A adição deste quelante juntamente com MgCl2 ao soro, leva ao bloqueio das
vias clássica e das lectinas e permite a ativação da via alternada.
Para verificação da ativação do Complemento, foram utilizados os sobrenadantes
das reações diluídos em tampão VBS contendo Ca2+ e Mg2+, conforme referido acima. No
caso das reações contendo quelantes, os sobrenadantes foram primeiro recalcificados com
solução de CaCl2 0,2 M, para que a estrutura e atividade dos componentes do
Complemento fossem recuparadas.
Abaixo está representado o esquema de ativação do sistema Complemento.
45
Primeira etapa:
Segunda Etapa
46
Esquema 3 – Representação do ensaio de ativação do sistema Complemento. A etapa 1 representa
a ativação do Complemento pelas amostras testadas e os respectivos controles (Zimosan e soro
sem ativadores). A etapa 2 representa o procedimento para a quantificação do Complemento
residual, proveniente da etapa 1. Nos testes utilizando-se quelantes (EDTA e EGTA), 100µl de
CaCl2 são adicionados ao Complemento residual a 1/50 no início da etapa 2.
4.2 Estudo da Ativação do Complemento Utilizando Hemácias de Coelho
Amostras (25µl) das frações antigênicas obtidas após fracionamento do ECT por
cromatografia de troca iônica (ver ítem 5 abaixo) foram misturadas com alíquotas de 50µl
de soro humano (previamente absorvido com hemácias de carneiro) diluído a 1/10 em
tampão VBS/gelatina 0,1% e contendo EGTA-Mg2+ 10mM. Após a adição de 50µl de uma
suspensão de hemácias de coelho a 1 x 108 céls/ml, as misturas foram incubadas em
banho-maria a 37°C durante 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 500 µl de
salina gelada. Após centrifugação (1.400 x g) a 4°C durante 5 min., os sobrenadantes
(100µl) foram transferidos para uma placa de poliestireno de 96 cavidades de fundo plano
e o teor de hemoglobina liberada foi determinado em colorímetro (SLT – Spectra –
Áustria) no comprimento de onda de 405 nm.
A suspensão de hemácias de coelho utilizada nestes ensaios foi preparada como
segue: sangue de coelho, coletado em solução de Alsever, foi centrifugado e as hemácias
lavadas 3x com VBS contendo EDTA 10mM. A etapa de lavagem das hemácias com
EDTA é importante para a remoção de possíveis componentes do Complemento,
provenientes do coelho, adsorvidos na superfície das células. O sedimento das hemácias
47
foi novamente lavado com VBS contendo EGTA-Mg2+ 10mM e preparada uma suspensão
contendo 1 x 108 céls/ml.
5. Fracionamento do ECT do Mosquito C. quinquefasciatus por Cromatografia de
Troca Iônica
Quatro diferentes partidas de ECT foram submetidas à cromatografia de troca
iônica em coluna de DEAE-Celulose de acordo com Hahnstadt (1997) com ligeiras
modificações, descritas a seguir:
Amostras de ECT (35ml) foram concentradas por ultrafiltração em concentrador da
Amicon com membrana YM 10 (Amicon Inc., Beverly, MA, EUA), sob pressão de N2; o
concentrado (5,0 ml) foi misturado com 5,0ml do tampão de equilíbrio da coluna
cromatográfica (tampão fosfato de sódio 0,0175M, pH 7,1, condutividade 1,28 x 1K
µmho/cm e contendo azida sódica a 0,02%). A amostra assim diluída foi concentrada
novamente a 5,0ml e a operação foi repetida até que a absorbância (a 280nm) e a
condutividade do filtrado fossem iguais às do tampão de equilíbrio. O concentrado final
foi diluído a 1/2 com o tampão de equilíbrio e amostra de 9,0 ml foi aplicada à coluna (1,8
x 8,0cm) de DEAE celulose (DEAE 52, Whatman Ltd, Inglaterra) previamente equilibrada
com o tampão fosfato.
As frações foram eluídas inicialmente com o tampão de equilíbrio e a seguir com
aproximadamente 50 ml de tampões fosfato de sódio de molaridade crescente e pH
decrescente, contendo azida sódica a 0,02%: tampão fosfato de sódio 0,02M, pH 7,17 (c=
2,8 x 1K µmho/cm); tampão fosfato de sódio 0,05M, pH 6,97 (c= 4,9 x 1K µmho/cm);
tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 6,91 (c= 9,5 x 1K µmho/cm); tampão fosfato de sódio
0,1M/NaCl 0,5M, pH 6,90 (c= 2,9 x 10K µmho/cm); tampão fosfato de sódio 0,1M/NaCl
1,0M, pH 6,40 (c= 4,3 x 10K µmho/cm). A coluna foi lavada com NaOH 0,5M e em
seguida com água destilada. A eluição das frações foi acompanhada pela medida da
absorbância dos eluatos (1,5ml/tubo/5min) no comprimento de onda de 280 nm
(espectrofotômetro Beckman Instruments, Inc., Ca. EUA).
A pesquisa de antígenos nos eluatos foi realizada pela técnica de ELISA indireta.
Para tanto, alíquotas dos eluatos da coluna de troca iônica foram diluídas a 1:5 com PBS e
aplicadas (100µl) nos poços de placas de poliestireno para sensibilização; as etapas
posteriores foram realizadas conforme descrito acima (item 3.3). Após sensibilização,
lavagem e bloqueio, as placas foram incubadas por 60 min. a 37°C com 100µl de soro de
48
indivíduo normal e/ou sensível, diluído a 1/80 em PBS/leite 5%. Após lavagem, as placas
foram incubadas por 60 min. a 37°C com 100 µl de IgG de cabra anti-gamaglobulina
humana (1:20.000) ou com IgG de cabra anti-cadeia µ humana (1:20.000) marcados com
peroxidase (Sigma Chemical Co., St Louis, EUA) e diluídos em PBS/leite 5%. Após
lavagem, a revelação e leitura das placas foram realizadas conforme referido acima.
As frações antigênicas foram definidas de acordo com a leitura da absorbância dos
eluatos, em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 280nm (absorbância de
triptofano e tirosina) e quanto à reatividade dos constituintes com anticorpos presentes no
soro de indivíduo normal e de paciente com urticária papular. Os eluatos foram agrupados
de acordo com esses resultados e concentrados por ultrafiltração (membrana YM 10) ao
volume de 1,0ml, originando 14 frações antigênicas (Frações I a XIV). Portanto, o
conteúdo dos constituintes presentes nas frações ficou 35 x concentrado em relação à
amostra original de ECT aplicado à coluna. O teor protéico das frações foi determinado
pelo método de Bradford (1976) conforme referido acima.
A pureza das frações cromatográficas foi verificada por eletroforese em gel de
poliacriamida, sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) segundo Laemmli (1970):
alíquotas das frações (20µl) foram misturadas com 5µl de tampão de amostra 5x
concentrado e fervidas a 100oC por 5 min.. Após centrifugação aplicaram-se 20µl da
amostra/poço (gel de separação a 12% e 1mm de espessura). A corrida eletroforética foi
conduzida sob diferença de potencial constante de 200V, à temperatura ambiente, durante
45 minutos. A coloração das proteínas foi feita com azul de Coomassie e/ou com prata de
acordo com Bollag et al. (1996).
A mistura padrão de pesos moleculares utilizada era composta de IgG humana
(150 kDa), Organon Teknika-Capell, PA, EUA, e soroalbumina bovina (66kDa),
ovoalbumina (45kDa), anidrase carbônica (29kDa) e lisozima (14,3 kDa) da Sigma
Chemical Co. St Louis, EUA.
A composição antigênica das frações foi verificada por immunoblotting de acordo
com Bollag et al (1996).
A transferência das proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida
para membrana de nitrocelulose (Millipore, EUA, poro de 0,22µm) foi efetuada no
aparelho de Mini Trans-Blot da Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA. EUA).
As transferências foram realizadas por 1 hora a 100 V. Após secagem da membrana, à
49
temperatura ambiente, a parte da fita contendo os padrões foi cortada e corada com Amido
Black 0,1% em isopropanol, ácido acético, H 2O (25:10:75, v/v).
O restante da membrana, após bloqueio com BSA a 3% em PBS por 2h a 37°C, foi
incubado 1 h à temperatura ambiente com soro humano normal diluído a 1/80 em PBS
contendo 0,05% de Tween 20 e 5% de leite desnatado, sob agitação. Após este período, o
soro foi retirado e as membranas foram lavadas 3x por 10 min. com PBS/ Tween 20 a
0,05%, sob agitação. Posteriormente, as membranas foram incubadas por 1h à temperatura
ambiente, com conjugado específico para IgG humana, marcado com peroxidase (Sigma
Chemical Co. St Louis, EUA) e diluido a (1/20000) em PBS/Leite a 5%. Após incubação,
a membrana foi novamente lavada 3x durante 10min com PBS /Tween 20 a 0,05%. Os
complexos antígeno-anticorpo-conjugado foram visualizados por quimioluminescência
utilizando o sistema de detecção do Kit ECL+Plus de acordo com as instruções do
fabricante (Amershan Biosciences UK Ltd., Buckinghmshire, Inglaterra).
A visualização das bandas imuno-reativas é feita misturando-se na proporção de
1:1 os dois reagentes de revelação do Kit, e aplicando-se 2 ml deste sobre a membrana.
Após 5 mins, o excesso do reagente é removido e, em câmara escura, uma película
autofotográfica (Kodak X-Omat) de matriz azul é colocada sobre a membrana para a
sensibilização desta pelas bandas reativas. Após sensibilização, a imagem latente é
imediatamente revelada conforme recomendação do fabricante do filme.
Uma segunda membrana, após bloqueio, foi incubada com soro humano
previamente absorvido com proteina A ligada à Sepharose (Sigma Chemical Co. St Louis,
EUA) e na diluição de 1/10. Após este período, o soro foi retirado, a membrana lavada e
incubada por 1h à temperatura ambiente com conjugado de IgG de coelho anti- cadeia ε
humana, marcada com peroxidase (Sigma Chemical Co. St Louis, EUA) e diluído a a
(1/1000) em PBS/Leite a 5%. Após incubação, a membrana foi lavada e revelada por
quimioluminescência conforme referido acima.
A mesma membrana, após lavagens exaustivas com PBS/Tween 20 0,05%, foi
incubada com o conjugado de IgG de cabra específico para a cadeia µ humana, marcada
com peroxidase e diluído a 1/20.000. Após incubação e lavagem a membrana foi
novamente revelada por quimioluminescência.
50
6. Detecção de Componentes e Fragmentos do Complemento
A detecção indireta de componentes e fragmentos do Complemento foi utilizada
como método para a investigação da atividade do ECT, ECTx e Fr XI sobre o
Complemento. Este método foi empregado para se confirmar os resultados obtidos nos
ensaios de ativação do sistema Complemento.
Os fragmentos resultantes dos ensaios de ativação do Complemento foram
detectados utilizando-se amostras obtidas no item 5.1 acima.
Para tanto, alíquotas dos sobrenadantes resultantes da ativação do Complemento
pelos extratos e frações, contendo ainda (ou não) Complemento residual, foram misturadas
com nova amostra de zimosan (1mg/ml) e incubadas novamente a 37°C durante 60 min.
Após as incubações, as amostras foram centrifugadas e as partículas de zimosan
foram lavadas 4x e ressuspensas em 1 ml de PBS para posterior detecção dos componentes
residuais fixados.
Alíquotas (100µl) de cada suspensão de zimosan diluídas a 1/10 foram transferidas
para placas de poliestireno de 96 cavidades de fundo plano, incubadas a 37ºC durante 2 h e
em seguida, mantidas por 18 h a 4ºC. Posteriormente, a placa foi lavada e bloqueda com
300µl de leite desnatado a 5% em PBS e incubada novamente a 37ºC durante 60 min.
Após o bloqueio, adicionaram-se aos poços anticorpos específicos para os diferentes
componentes do Complemento a serem pesquisados.
Assim, às amostras de zimosan adsorvidas às placas adicionaram-se anticorpos de
cabra anti-C3 (Calbiochem-Novabiochem Co., CA, EUA) ou anti-properdina (Miles
Laboratories, Inc. EUA) e anticorpos de coelho anti-C4 (Dako-immunoglobulins.
Dinamrca), anti-C5 (Calbiochem-Novabiochem Co., CA, EUA) diluídos em tampão PBS
adicionado em 5% de leite desnatado. Após incubação com os conjugados específicos para
IgG de cabra ou de coelho, marcados com peroxidase, as placas foram lavadas e reveladas
conforme referido anteriormente (item 3.2)
O mesmo procedimento foi realizado com as amostras dos sobrenadantes
provenientes dos ensaios com quelantes, bem como dos controles dos testes de ativação
(item 4.1)
O esquema abaixo representa os ensaios e controles desse ensaio que utiliza
zimosan como suporte para a pesquisa de componentes residuais do complemento
presentes no soro tratado com ECT, ECTx ou frações antigênicas. As estrelas indicam
as amostras de zimosan utilizadas para a realização do ensaio imunoenzimático indireto.
51
Além dos ensaios enzimáticos, amostras das suspensões de zimosan referidas
acima foram utilizadas para pesquisa de componentes do Complemento (C3 e MBL) por
citometria de fluxo.
Às amostras (50µl) das suspensões de zimosan adicionamos anticorpo de coelho
anti-C3c (1/50), marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Dako-
immunoglobulins, Dinamrca). Após incubação a 37ºC durante 60 min. as amostras foram
lavadas 3x com PBS e ressuspensas em 400µl deste tampão.
Para a pesquisa de MBL, as amostras foram incubadas com soro de cabra anti-
MBL humano (1/50) a 37ºC durante 60 min. Após incubação, as amostras foram lavadas e
incubadas novamente nas mesmas condições com anticorpo de coelho anti-IgG de cabra
52
marcado com FITC (Sigma Chemical Co.St Louis, EUA). A seguir, as amostras foram
lavadas 3x com PBS e ressuspensas em 400µl desse tampão.
As suspensões de zimosan marcadas foram aplicadas ao citômetro de fluxo
(FACSCalibur – Becton Dickinson, EUA) e lidas no canal FL-1.
Como controle de autofluorescência foram utilizadas amostras de zimosan sem
marcação com anticorpo fluorescente.
7. Ação Quimiotática de Fragmentos Resultantes da Ativação do Complemento por
Antígenos de Mosquitos
A pesquisa de componentes quimotáticos resultantes da ativação do Complemento
humano, por extratos de mosquito (ECT e ECTx) ou pelas frações I e XI, foi realizada
por testes de migração de neutrófilos em câmara de Boyden (1962).
7.1 Obtenção dos Granulócitos
Polimorfonucleares (PMN) neutrófilos foram purificados de sangue humano pelo
método original de Böyum (1968), modificado por Borregaard et al. (1983). Em resumo,
foram colhidos 40 ml de sangue de doador saudável com seringa estéril descartável
contendo heparina, livre de conservantes, na concentração de 20 U/ml. O sangue foi
misturado a 10 ml de solução de dextrana a 3% (peso molecular de 500.000, Sigma
Chemical Co. St Louis, EUA) em salina estéril, homogeneizado e distribuído em tubos
cônicos de plástico de 15 ml. Após 20 min à temperatura ambiente, o concentrado
leucocitário, foi aspirado e centrifugado a 250 x g por 10 min a 5oC em centrífuga (Sanyo,
modelo Mistral 3000i). As células sedimentadas foram imediatamente ressuspensas em
NaCl 0,9% estéril, para o mesmo volume inicial. A seguir, a suspensão foi transferida
cuidadosamente para um tubo cônico contendo 3,0 ml de Ficoll (Sigma Chemical Co. St
Louis, EUA). Após centrifugação (400 x g) a 20oC durante 45 min, a camada líquida
superior e o anel intermediário, rico em células mononucleares, foram aspirados e
descartados, deixando-se apenas o sedimento rico em granulócitos e hemácias. A remoção
das hemácias foi feita através de lise hipotônica, utilizando-se 20 ml de solução de NaCl
0,2% gelada e estéril, durante 30 segundos e sob agitação. Após este período,
adicionaram-se mais 20 ml de solução de NaCl 1,6%, também gelada e estéril,
restaurando-se com isso a isotonicidade da suspensão.
53
O material foi centrifugado (250 x g) a 5oC por 6 min, descartando-se em seguida
o sobrenadante e repetindo-se as etapas de lise e lavagem até a completa remoção das
hemácias, conforme verificado pelo desaparecimento da cor vermelha do sedimento
celular. A viabilidade das células foi maior que 98%, de acordo com o ensaio de exclusão
ao corante Azul de Tripan.
As células foram ressuspensas em 3 ml de solução salina balanceada de Hank´s
(HBSS), sem Ca2+ e Mg2+, e a concentração celular foi ajustada para 2,0 x 106 células/ml
após contagem em câmara de Neubauer (Arthur H. Thomas Co. PA, EUA).
7.2 Teste de Viabilidade Celular
Células viáveis são impermeáveis ao corante azul de Tripan e, conseqüentemente,
a sua penetração na célula indica a perda da integridade da membrana. Assim, uma
alíquota da suspensão de granulócitos foi misturada (v/v) com solução de azul de Tripan
0,2% em PBS e, após 5 min, as células foram contadas novamente. A porcentagem de
viabilidade celular foi calculada pelo número de células viáveis (não coradas) dividido
pelo número total de células (coradas e não coradas) multiplicado por 100.
7.3 Ensaio de Quimiotaxia de Neutrófilos
Para o ensaio de quimiotaxia de neutrófilos foram utilizadas câmaras de Boyden
(1962) com poço de 4 mm de diâmetro e 6mm de profundidade na parte inferior da
câmara, onde são aplicadas as misturas de reação. No presente ensaio, foram aplicados 90
µl de soro humano diluído (1/5) em VBS contendo Ca2+ e Mg2+ e 10 µl de amostras de
ECT, ECTx, Fr I ou Fr XI . Após colocação da membrana de quimiotaxia (13mm de
diâmetro e poros de 5µm da Nuclepore Corp., Pleasanton, CA, EUA), a parte superior da
câmara foi colocada e atarrachada. No poço da parte superior da câmara foram aplicados
100µl da suspensão de neutrófilos (2 x 106 células/ml). As câmaras foram incubadas a
37oC e após 60 min a suspensão de células remanescentes na parte superior da câmara foi
retirada; a peça superior foi desencaixada e a membrana removida. Uma alíquota (10µl) da
suspensão do poço inferior foi diluída a 1:4 em solução de Turk (Lima et al., 1969) e
utilizada para a contagem em câmara de Neubauer das células que migraram por
quimiotaxia.
Como controles negativos de quimiotaxia foram utilizados:
54
a) 90 µl de soro humano inativado (56° C durante 30 min) e diluído a 1/5 em VBS
contendo Ca2+ e Mg2+ e 10 µl de amostras de ECT, ECTx, Fr I ou Fr XI;
b) 90 µl de VBS contendo Ca2+ e Mg2+ mais 10 µl de ECT, ECTx, Fr I ou Fr XI;
c) 100µl de VBS contendo Ca2+ e Mg2+.
Como controles positivos de quimiotaxia foram utilizados:
a) 100 µl de LTB4 (leucotrieno B) 10-8 M (Sigma Chemical Co. St Louis, EUA)
diluído em PBS;
b) 100µl de FMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine) 10-9 M (Sigma
Chemical Co. St Louis, EUA) diluído em PBS.
55
RESULTADOS
1. Pesquisa e Titulação dos Anticorpos anti-ECT nos Soros Humanos
A Fig. 1 mostra o resultado da pesquisa de anticorpos anti-constituintes antigênicos
presentes no ECT pela técnica de contraimunoeletroforese. Conforme pode ser
observado, há formação de uma linha de precipitação entre os pontos de aplicação da
mistura de soros normais (Materiais e Métodos item 2.2) e o ECT (A). Este resultado indica
a presença de anticorpos presentes em soros de indivíduos normais, capazes de reconhecer
constituintes antigênicos no ECT de C. quinquefasciatus. Nenhuma linha de precipitação
foi observada entre os pontos de aplicação da mistura de soros e a da solução extratora de
Evans (B) mostrando a especificidade da reação Ag-Ac.
Figura 1 – Identificação de complexos Ag-Ac por contraimunoeletroforese
(A) reação entre mistura de soros humanos normais (M1) e ECT do mosquito C. quinquefasciatus.
(B) controle negativo (ausência de linha de precipitação entre a mistura de soros e a solução
extratora de Evans). Gel de ágar a 1% em tampão veronal pH 8,6 (5 V/cm).
A
B + -
M1 →
M1 → ←Evans
← ECT
56
Na Fig. 2 estão representados os resultados obtidos na titulação de soro humano
normal (SN1), de paciente com urticária papular (SP12) e de mistura de soros utilizados
como fonte de Complemento pela técnica de ELISA indireta, frente ao ECT. Conforme
pode ser verificado na figura, os três soros testados, principalmente a mistura de soros,
apresentaram altos títulos (> 1/640) de anticorpos capazes de reconhecer constituintes
antigênicos presentes no ECT. Estes resultados mostram que o soro de indivíduo não
reativo ao prick test possui anticorpo anti-ECT assim como o soro de indivíduo com
urticária papular. Além disso, a mistura de soros, utilizada como fonte de Complemento,
absorvida com hemácias de carneiro, ainda apresenta anticorpos capazes de reconhecer
constituintes do ECT, ou seja, a absorção do soro não influencia, ou pouco influencia, nos
anticorpos capazes de formar imunocomplexos com o ECT. De acordo com os resultados
obtidos nesta figura, foi empregada a diluição de 1/80 dos soros para a realização dos
demais testes de detecção de anticorpos anti-ECT.
Detecção de IgG Humana
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1 / 40 1 / 80 1 / 160 1 / 320 1 / 640
Diluição do Soro
Abs
orbâ
ncia
SN1 x PBS
SP x PBS
SN1 x ECT
SP x ECT
M1 x ECT
M1 x PBS
Figura 2 - Detecção de anticorpos anti-ECT do mosquito C. quinquefasciatus.
As linhas representam a reação da mistura de soros humanos (M1) e dos soros de indivíduos
normal (SN1) e paciente com urticária papular (SP12) com antígeno adsorvido (ECT) ou não
(PBS) à placa de microtitulação. Revelação dos anticorpos com conjugado (1/20.000) de IgG de
cabra anti-gamaglobulinas humanas, marcada com peroxidase.
57
Na Fig. 3A está representada a média dos resultados das amostras de soros de
indivíduos normais e de pacientes com urticária papular (diluídos a 1/80) capazes de
reconhecer antígenos no ECT. Este resultado nos mostra que anticorpos anti-ECT são
encontrados no soro de diferentes indivíduos sensíveis (SP - média dos valores obtidos
para soros de três pacientes com urticária papular: SP12, SP9 e SP6) ou não (SN – média
de 5 diferentes soros de indivíduos normais) à picada de mosquitos e em diferentes
misturas de soros (média dos valores de 4 diferentes amostras, M1 a M4), indicando que
estes anticorpos circulantes são encontrados, possivelmente, em todos os indivíduos. Vê-
se ainda que os valores encontrados nas misturas de soro são comparáveis as médias dos
soros de um único indivíduo (SN).
A Fig. 3B representa os níveis de anticorpos em soros de um único indivíduo
coletados em diferentes meses e anos (Mar/02, Jan/03, Nov/03, Mai/04, Ago/04 e Jun/05).
Podemos observar que os níveis de anticorpos anti-ECT não variam muito com as épocas
de coleta do sangue, mostrando que a produção destes anticorpos é sempre constante.
Diferentes estações do ano possuem maior ou menor infestação de mosquito, com isso,
dependendo do período em que o soro foi coletado, os indivíduos estariam mais ou menos
sujeitos às picadas deste inseto, o que poderia se refletir nos níveis de anticorpos anti-
mosquito produzidos. Entretanto, conforme podemos observar, os níveis de anticorpos
pesquisados permaneceram sempre constantes. Além disso, os níveis de anticorpos de um
indivíduo durante um determinado período são comparáveis com as médias de diferentes
soros de indivíduos normais.
58
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Mistura SN SPDiluição dos Soros 1/80
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
ECTPBS
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
SN (03/02) SN (01/03) SN (11/03) SN (05/04) SN (08/04) SN (06/05)
Abs
orbâ
ncia
(492
nm)
ECTPBS
Figura 3 – Titulação de soros humanos frente aos antígenos do ECT do mosquito
C. quinquefasciatus pela técnica de ELISA indireta. A) As colunas com barras de erro representam as médias dos valores de absorbância obtidos no
teste de ELISA indireto com misturas de soros normais (M1 a M4), amostras de soros de um único
indivíduo (SN1), coletadas em diferentes meses e anos (Mar/02, Mai/04 e Ago/04 e Jun/05), e
soros de pacientes com urticária papular (SP), frente ao ECT adsorvido à placa de microtitulação
ou não (PBS). Diluição dos soros 1/80;
B) As colunas com barras de erro representam o nível de anticorpos em soros de um único
indivíduo normal coletados em diferentes meses e anos, capazes de reconhecer antígenos
do C. quinquefasciatus (ECT) adsorvidos à microplaca ou não (PBS). Revelação dos
anticorpos com conjugado (1/20.000) de IgG de cabra anti-gamaglobulinas humanas, marcada com
peroxidase.
A
B
59
2. Ativação do Sistema Complemento
2.1 Ativação do sistema Complemento por ECT, ECTx e EGS do Mosquito C.
quinquefasciatus e Revelação com EA
A Fig. 4 mostra a atividade residual do Complemento em misturas de soros
humanos normais após tratamento com diferentes concentrações de extratos (ECT, ECTx
e EGS) do mosquito C. quinquefasciatus.
Na Fig. 4A verificamos que o ECT foi capaz de consumir o Complemento do soro
humano e que este efeito é proporcional à concentração de material utilizado, ou seja, na
maior concentração de ECT (50,0 µg) restaram apenas 20% do Complemento inicial.
Na Fig. 4B, verifica-se que o ECTx apresenta resultados semelhantes àqueles
obtidos com quantidades equivalentes de ECT (2,5 a 50,0 µg de ECTx).
Esses valores, que representam a média de 4 a 5 determinações com diferentes
misturas de soros (M1 a M5), permitiram definir a quantidade ótima de material a ser
utilizada nos estudos das vias de ativação. O valor escolhido (25 µg) é suficiente para
consumir aproximadamente 60% do Complemento inicial visto que, após tratamento da
mistura de soros com 25 µg ECT ou de ECTx, restou em torno de 40% de atividade lítica
inicial.
Na Fig. 4C, relativa à ação do extrato das glândulas salivares (EGS), observa-se
que este material também é capaz de consumir o Complemento. Comparando-se esses
resultados com os obtidos para o ECT e ECTx, verificamos que 1µg de EGS tem atividade
aproximadamente igual a de 5µg dos outros dois extratos.
60
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Zimosan Tampão 2,5µg 5,0µg 12,5µg 25µg 50µg%
de
Com
plem
ento
resi
dual
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Zimosan Tampão 2,5µg 5,0µg 12,5µg 25µg 50µg
% d
e C
ompl
emen
to re
sidu
al
0
10
20
30
40
50
60
7080
90
100
Zimosan Controle 0,25µg 0,5µg 1,0µg
% d
e C
ompl
emen
to re
sidu
al
Figura 4 – Determinação do Complemento residual em misturas de soros humanos normais
após tratamento com extratos do mosquito C. quinquefasciatus.
As colunas com barras de erro representam a % de Complemento residual em diferentes amostras
de soros (M1 a M5) frente aos extratos ECT, ECTx e EGS e controles dos testes (zimosan e
tampão):
A) 2,5 a 50 µg de proteína do ECT (média de 5 deteminações/concentração)
B) 2,5 a 50 µg de proteína no ECTx (média de 4 deteminações/concentração)
C) 0,5 a 1,0 µg de proteína no EGS (média de 3 deteminações/concentração)
A
B
C
61
2.2 Ativação do Sistema Complemento Com e Sem Quelantes (EDTA e
EGTA-Mg2+) e Revelação com EA
Na Fig. 5 são apresentados os resultados de ativação do Complemento pelos
extratos ECT, ECTx e EGS do mosquito na presença de quelantes, com o objetivo de
verificar as possíveis vias de ativação envolvidas.
Na Fig. 5A, verificamos que restaram 40% da atividade inicial do Complemento
após incubação com o ECT (25µg), o que indica que este consumiu cerca de 60% do
Complemento da mistura de soros, na ausência de quelantes (conforme foi observado
anteriormente na Fig. 4A). Quanto aos controles, o zimosan consumiu todo o
Complemento (0% de complemento residual); com tampão, sem partículas ativadoras, não
houve consumo de Complemento restando praticamente 100% de atividade lítica.
O tratamento do soro com EGTA-Mg2+ permite a ativação apenas da via
alternativa do Complemento. Quando o soro tratado desta forma é incubado com ECT,
observamos que o Complemento residual é de 80% (Fig. 5A). Este resultado indica que o
extrato não é um bom ativador da via alternada do Complemento. Comparando com o
resultado obtido para o soro sem quelantes (Tampão), observamos que a atividade do ECT
sobre o Complemento humano parece depender da ativação da via clássica. Conforme
esperado, não observamos Complemento residual nos soros incubados com zimosan, pois
este pode consumir o Complemento pela via alternada. Praticamente não há perda de
Complemento no soro sem partícula ativadora.
O tratamento do soro com EDTA resulta no bloqueio das três vias de ativação do
Complemento, pois essa substância quela os íons Ca2+ e Mg2+ presentes no soro.
Na Fig. 5A vemos que quando o soro é tratado com este quelante, o Complemento
residual é praticamente 100% do inicial, tanto na presença do ECT quando do zimosan ou
controle sem partícula ativadora. Este resultado mostra ainda que o ECT não tem
quaisquer atividades que afetem a integridade dos componentes do Complemento.
A Fig. 5B mostra que o ECTx (25µg) é capaz de ativar o sistema complemento
humano restando apenas 28% do inicial (Tampão, sem quelantes). No soro tratado com
EGTA-Mg2+ (via alternada de ativação não bloqueada) restaram 68% do Complemento
após a incubação com ECTx. Houve, portanto, consumo de 32% do Complemento.
Comparando-se com a Fig. 5A, o ECT consome menos Complemento que o ECTx,
utilizando-se quantidades iguais de extrato; esses resultados indicam ainda que o ECTx
62
está ativando também a via alternada. Conforme o esperado, em presença de EDTA, não
houve ativação do Complemento.
Na Fig. 5C estão representados os resultados da ativação do Complemento pelo
EGS (1µg). Na ausência de quelantes (Tampão), restam 80% do Complemento original,
portanto, há apenas 20% de consumo. Em presença de EGTA-Mg2+ restaram
aproximadamente 90% da atividade do Complemento, o que indica consumo do
Complemento pela via alternada. Portanto, o maior consumo do Complemento na mistura
de soros não tratada por quelantes (20%), pode ser devido à atividade de outras vias como
clássica e das lectinas em conjunto com a alternada (ativada no soro tratado com EGTA-
Mg2+). Conforme observado com os outros extratos, os resultados com EDTA indicam
que os valores obtidos são em função da ativação do Complemento, e que o EGS também
não afeta a integridade dos componentes do Complemento. Apesar do aparente baixo
consumo de Complemento observado com o EGS, devemos considerar estes resultados
consideráveis, pois a quantidade empregada deste material foi 25 vezes menor que o
empregado para os outros extratos.
63
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
% d
e C
ompl
emen
to re
sidu
al
ZimosanECT
Controle
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
% d
e C
ompl
emen
to re
sidu
al
ZimosanECTx
Controle
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
% d
e C
ompl
emen
to re
sidu
al
ZimosanEGS
Controle
Figura 5 - Determinação do Complemento residual em misturas de soros humanos normais
sem ou com quelantes, após tratamento com extratos do mosquito C. quinquefasciatus.
As colunas com barras de erro representam a porcentagem de Complemento residual (média de 3
determinações) em misturas de soros sem (Tampão) ou com quelantes (EGTAMg2+ ou EDTA),
após tratamentos com A) 25µg ECT; B) 25µg ECTx; C) 1µg EGS; controles dos testes
zimosan (1mg) e tampão.
A
B
C
64
3. Fracionamento do ECT de Culex quinquefasciatus por Cromatografia de Troca
Iônica
Na Fig. 6 está representado o fracionamento de uma partida de ECT do mosquito
Culex quinquefasciatus por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose.
O fracionamento resultou na coleta de 231 amostras contendo aproximadamente
1,5ml/tubo, perfazendo o volume total de 342,44ml. Os resultados das análises
espectrofotométrica e imunoenzimática dos eluatos mostraram a presença de pelo menos
sete picos de concentração de proteína (absorbância a 280 nm) e diversos constituintes
antigênicos, reconhecidos por gamaglobulinas de indivíduo normal (SN1) e de paciente
(SP) (absorbância a 492 nm). Neste caso, os soros de indivíduo normal e de paciente
apresentaram perfis de reconhecimento antigênico parcialmente semelhantes. Estes picos
de reconhecimento não estão associados com os picos de maior conteúdo protéico. A
reunião dos eluatos de acordo com esses perfis cromatográficos resultou na obtenção de
14 frações (Fr I a XIV).
A Fig. 7 representa o fracionamento de uma segunda partida de ECT. A presença
dos antígenos nos eluatos foi detectada através da pesquisa de gamaglobulinas (anticorpos
totais) e também do anticorpo da classe IgM presentes em soro humano normal (SN1).
Como pode ser observado, o perfil cromatográfico deste fracionamento é semelhante ao
do anterior (Fig. 6). A semelhança do perfil cromatográfico demonstra a constância dos
antígenos de mosquito em diferentes lotes do extrato utilizado, mostrando a
reprodutibilidade do método de fracionamento empregado.
65
0
0,2
0,4
0,6
0,81
1,2
1,4
1,6
1,82
2,2 1,
2816
,48
31,5
46,3
261
,15
75,8
490
,83
105,
8312
0,85
135,
7215
0,78
165,
9618
0,86
195,
6521
0,44
225,
0523
9,54
254,
6527
0,06
284,
8929
9,63
312,
9932
9,12
Vol
ume
Absorbância
D.O
SN1
SP
66
0
0,2
0,4
0,6
0,81
1,2
1,4
1,6
1,82
2,2 1,
4115
,94
30,5
245
,21
59,8
774
,62
89,3
110
3,98
118,
7113
3,43
148,
1916
3,08
177,
919
2,81
207,
8922
2,79
237,
3425
2,8
268,
1528
2,56
297,
3831
2,3
326,
32
Vol
ume
Absorbância
D.O
Ig to
tal
IgM
67
Os conteúdos protéicos do ECT e das 14 frações antigênicas foram determinados
pela técnica de Bradford (1976). Na Tab. I encontra-se o teor protéico da amostra de ECT
aplicada à coluna cromatográfica de DEAE-celulose e das frações cromatográficas (I a
XIV) obtida após o fracionamento deste extrato. Além disso, está representada a
porcentagem de proteína que cada fração possui em relação ao ECT. Após o processo de
fracionamento, a dosagem do conteúdo protéico de cada fração mostra que foi recuperado
cerca de 93% (3849,3 µg) do material inicialmente aplicado (4123,0 µg) à coluna de
cromatografia. As perdas estão relacionadas ao processo de concentração dos eluatos para
a formação das diversas frações antigênicas, que foi realizado em célula de ultrafiltração
com membrana de 10 kDa de porosidade.
Tabela I - Concentração protéica do extrato de corpo total (ECT) e frações
cromatográficas (I a XIV) do mosquito C. quinquefasciatus
Amostras (tubos) Teor Protéicoa (µg) % em relação ao ECT
ECT
4123,0
100b I (1-29) 214,3 5,19
II (30-46) 145,1 3,51 III (46-68) 448,7 10,88 IV (69-96) 317,5 7,70
V (97-117) 819,3 19,87 VI (118-130) 505,0 12,24 VII (131-142) 217,7 5,28 VIII (143-163) 243,3 5,90 IX (164-173) 174,1 4,22 X (174-185) 248,9 6,03 XI (186-191) 441,9 10,71 XII (192-202) 33,4 0,81 XIII (203-217) 23,4 0,57 XIV (218-231) 16,7
0,40
3849,3c 93,31c a) Dosagem protéica pelo método de Bradford, padrão de BSA
b) Amostra de ECT aplicada à coluna cromatográfica; c) Σ dos valores de cada fração.
68
3.1 Análise Eletroforética dos Extratos
Para a realização da eletroforese em gel de poliacrilamida foram utilizados 20µl de
cada amostra, o que representa a aplicação de 6,59µg de ECT, 7,23µg de ECTx e 0,3µg de
EGS. A análise eletroforética das amostras de ECT, ECTx e EGS em gel de poliacrilamida
a 12% é mostrada na Fig. 8A. Após a eletroforese, o gel foi corado com azul de
Coomassie para a visualização das bandas. No ECT podemos visualizar pelos menos 4
bandas de peso molecular aproximado de 79, 46, 31 kDa e uma entre 24 e 19 kDa. No
ECTx podemos observar também pelo menos 4 bandas. Entre esses dois extratos, apenas a
banda de 79kDa parece se repetir. Em relação ao EGS, apenas uma banda foi visualizada
pela coloração empregada. Essa mesma banda com peso molecular próximo a região de 31
kDa também parece estar presente no ECTx.
Após a corrida eletroforética dos extratos, o gel também foi submetido à
impregnação pela prata. Conforme podemos observar, o emprego desta técnica revelou
uma maior complexidade de constituintes nos extratos (Fig. 8B), O ECT apresenta várias
bandas distribuídas pela região de massa molecular de 119 até 19 kDa, mesmo quando
este está diluído a 1/16 em relação à concentração protéica aplicada no gel para a
realização da coloração pelo corante Coomassie blue. O mesmo pode ser observado para o
ECTx, que também apresentou várias bandas protéicas ao se utilizar a coloração pela
prata, sendo duas delas visualmente mais intensas, que se apresentam na região de 119
kDa e outra próximo a região de 79 kDa. No caso do EGS, assim como os outros extratos,
este apresentou várias bandas, entretanto, 3 delas são mais marcantes: uma na região entre
79 e 46 kDa e outras duas (uma refratária à prata) próximas à região de 31 kDa.
69
Figura 8 - Eletroforese em SDS-PAGE dos extratos ECT, ECTx e EGS do mosquito
C. quinquefasciatus.
Amostras (20µl) aplicadas/poço: 6,59µg de ECT; 7,23µg de ECTx e 0,3µg de EGS para a
revelação pelo Coomassie Blue (A) e 0,41µg de ECT; 3,6µg de ECTx e 0,3µg de EGS
para a revelação pela prata (B).
119 kDa
79 kDa
46 kDa
31 kDa
24 kDa
19 kDa
ECT ECTx EGS
119 kDa
79 kDa
46 kDa
31 kDa
24 kDa
19 kDa
ECT ECTx EGS
A
B
70
3.2 Detecção de Constituintes Reconhecidos por Anticorpos nas Frações Antigênicas
A eletroforese em gel de poliacrilamida das frações cromatográficas (I a XIV) do
C. quinquefasciatus, também foi revelada pela coloração da prata. Conforme podemos
observar na Fig. 9, as frações antigênicas também possuem complexidade de constituintes.
Além disso, a coloração da prata revelou que o fracionamento do extrato de corpo total em
coluna de troca iônica foi capaz de produzir 14 frações cromatográficas diferentes, visto
que cada uma delas apresenta conteúdos distintos.
A tabela II mostra a quantidade protéica, determinada pelo método de Bradford, de
cada fração cromotagráfica que foi utilizada para a realização da corrida eletroforética,
revelada pela coloração de prata, apresentada na Fig. 9. Estas mesmas quantidades de cada
fração também foram utilizadas para se detectar anticorpos anti-mosquito no soro de
indivíduos normais. A detecção destes anticorpos foi realizada pela técnica de
quimioluminescência.
71
Figura 9 - Eletroforese em SDS-PAGE das Frações Cromatográficas (I a XIV) do
mosquito C. quinquefasciatus.
Amostras (25µl) aplicadas/poço e reveladas pela coloração da prata.
Tabela II – Quantidade protéica das frações cromatográficas (I a XIV), do mosquito
C. quinquefasciatus, utilizada na eletroforese em SDS-PAGE*
Amostras Qnt. de Ptn.** (µg) Amostras Qnt. de Ptn.** (µg)
Fr I 4,28 Fr VIII 4,86
Fr II 2,90 Fr IX 3,48
Fr III 8,97 Fr X 4,97
Fr IV 6,35 Fr XI 8,83
Fr V 16,38 Fr XII 0,67
Fr VI 10,10 Fr XIII 0,47
Fr VII 4,35 Fr XIV 0,34
* A concentração de proteína utilizada para a realização da eletroforese das frações cromatográficas também
foi utilizada para análise destas por immunobloting;
* * Quantidade de proteína das amostras utilizadas nos ensaios de ativação do sistema Complemento.
119 kDa
79 kDa
46 kDa
31 kDa
24 kDa
19 kDa
VIII VII Fc I II III IV VV
VI V
IX X XI XII XIII XIV
50 kDa
72
Após ensaio eletroforético das 14 frações antigênicas, o material presente no gel de
poliacrilamida foi transferido para membrana de nitrocelulose e incubado com soro de
indivíduo não sensível à picada de mosquito. A revelação de possíveis anticorpos da classe
IgG capazes de reconhecer os constituintes das frações foi feita utilizando-se anticorpo de
cabra anti-IgG humana marcada com peroxidase e evidenciados pela técnica de
quimioluminescência. Na Fig. 10A podemos observar que as frações antigênicas I, II, III,
IV, V, VI, IX, X e XI foram reconhecidas por anticorpos da classe IgG. Esse
reconhecimento resultou em várias bandas de massa molecular variando de 14,3 a 45 kDa.
Além dessas bandas, a fração X apresentou uma banda reconhecida por IgG de
aproximadamente 150 kDa, enquanto que a fração XI apresentou uma banda na região de
66 kDa de massa molecular. As frações VII, VIII, XII, XIII e XIV não apresentaram
bandas antigênicas reconhecidas por IgG.
A pesquisa por anticorpos da classe IgM do soro de indivíduo normal capazes de
reconhecer constituintes presentes nas frações antigênicas resultou num perfil de
reconhecimento diferente do observado na Fig. 9A. Conforme podemos observar na Fig.
10B as frações II, III apresentaram 4 bandas de 29 a 45 kDa de massa molecular
reconhecidas por IgM. As frações IV e V apresentaram apenas 2 bandas também na região
de 29 a 45 kDa de massa molecular. A fração VI apresentou somente uma banda
reconhecida por esta classe de anticorpo na região de 45 kDa. A pesquisa por anticorpos
IgM capazes de reconhecer constituintes na fração X revelou apenas uma banda na região
de 29 kDa e a fração XI revelou diversas bandas antigênicas que se extendem da região de
66 a 29kDa. As demais frações não revelaram bandas reconhecidas por IgM.
Por essa metodologia não foi observada nenhuma banda reconhecida por
anticorpos da classe IgE de soro de indivíduo não sensível.
73
Figura 10 - Análise das frações cromatográficas por immunobloting A) Conjugado de IgG de cabra anti-IgG humana específico (1/20.000);
Revelação por quimioluminescência. Concentração das amostras aplicadas
16 a 0,34 µg/poço;
B) Conjugado de IgG de cabra anti-IgM humana específico (1/30.000);
Revelação por quimioluminescência. Concentração das amostras aplicadas
16 a 0,34 µg/poço.
VII Fc I II III IV V VI VIII IX X XI XII XIII XIV
50 kDa
VII Fc I II III IV VV
VI V
VIII IX X XI XII XIII XIV
50 kDa
B
119 kDa
79 kDa
46 kDa
31 kDa
24 kDa
19 kDa
119 kDa
79 kDa
46 kDa
31 kDa
24 kDa
19 kDa
A
74
3.3 Ativação do Sistema Complemento pelas Frações Cromatográficas do
ECT
O fracionamento do ECT foi realizado com o objetivo de verificar a contribuição
de diferentes constituintes do extrato total na ativação das vias do Complemento. Os
eluatos correspondentes às frações I a XIV foram concentrados a um volume constante
para que a concentração dos constituintes em cada fração fosse proporcional àquela em
que estavam no extrato total. Dessa forma, o teor protéico de cada fração (Tabela I) usada
nos testes de ativação do complemento é variável, mas permanece proporcional à sua
representação no extrato total (ECT). Além disso, essas frações foram concentradas a um
volume 10x menor que o do extrato original aplicado à coluna e, portanto, estão 35x mais
concentradas em relação ao seu conteúdo no ECT.
Na Fig. 11 são mostrados os resultados da ativação do Complemento de uma
mistura de soros normais (M1) incubadas com o extrato total (ECT) e com frações (I a
XIV).
Para a realização desses experimentos, foram utilizadas amostras de 60µl de cada
fração, concentradas 35x em relação à amostra de ECT. O conteúdo protéico de cada uma
não foi igualado, para que se respeitassem as proporções de cada uma em relação ao
extrato bruto. Podemos observar que todas as frações (I a XIV) são capazes de ativar o
sistema complemento. Considerando a porcentagem de Complemento residual, vemos que
as frações I (11,3%), III (20,2%), IV (18,6%) e X (24,9%) foram as que apresentaram
maior porcentagem de consumo de Complemento: 88,7%, 79,8%, 81,4% e 75,1%,
respectivamente.
Conforme referido anteriormente, essas frações foram definidas a partir dos
resultados dos testes de ELISA frente a soros de indivíduo normal e de paciente com
urticária papular. A análise dessas frações por immunoblotting revelou a presença de
antígenos reconhecidos por anticorpos das classes IgM e IgG. Portanto, a ativação do
Complemento por essas frações pode ter o envolvimento da via clássica, já que esta via
poderia ser ativada por imunocomplexos formados entre antígenos do mosquito e
anticorpos das classes IgG e IgM.
Na Tabela III estão representadas as concentrações das amostras utilizadas no
teste de ativação do Complemento. Podemos observar que uma maior ou menor ativação
do Complemento não necessariamente depende da concentração protéica de cada fração.
As frações que apresentam maior teor de proteína (V e VI) não foram capazes de consumir
75
mais o Complemento, mesmo estas sendo reconhecidas por anticorpos das classes IgG e
IgM conforme observado na Fig. 9A. Por outro lado, as frações XII, XIII e XIV, que
apesar de apresentarem o menor teor protéico dentre as frações e também não serem
reconhecidas por anticorpos através da técnica de immunoblotting, ainda assim foram
capazes de consumir aproximadamente de 40 a 30% do Complemento.
Juntos, estes resultados nos mostram que além da possível participação da via
clássica no consumo do Complemento pelas frações, outras vias (alternativa e das lectinas)
também podem estar sendo ativadas.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Zimos
an
Tampã
oECT I II III IV V VI
VII VIII IX X XI XIIXIII XIV
% d
e C
ompl
emen
to re
sidu
al
Figura 11 – Determinação do Complemento residual em mistura de soros humanos normais
após tratamento com ECT do mosquito C. quinquefasciatus e suas frações cromatográficas,
reveladas com EA.
As colunas, apresentando barra de erro, representam a porcentagem de Complemento residual na
mistura de soros normais (M1) frente ao ECT (25 µg) e suas frações obtidas por cromatografia de
troca iônica (I a XIV); média de 3 deteminações/amostra; controles dos testes zimosan (1mg) e
tampão.
76
Tabela III – Quantidade protéica de ECT e frações cromatográficas (I a XIV)
utilizada na ativação do sistema Complemento
Amostras Qnt. de Ptn.* (µg) Amostras Qnt. de Ptn.* (µg)
ECT 25,0 Fr VIII 14,59
Fr I 12,8 Fr IX 10,4
Fr II 8,7 Fr X 14,9
Fr III 26,9 Fr XI 26,5
Fr IV 19,0 Fr XII 2,0
Fr V 49,1 Fr XIII 1,4
Fr VI 30,3 Fr XIV 1,0
Fr VII 13,0
* Quantidade de proteína das amostras utilizadas nos ensaios de ativação do sistema Complemento.
77
Para testar a via alternada de ativação do complemento, foram realizados os testes
com hemácias de coelho. As hemácias de coelho são utilizadas nos estudos de ativação da
via alternada do complemento porque elas são capazes de ativar esta via por possuírem
pouca quantidade de ácido siálico em sua membrana, quando comparadas com as
hemácias de outras espécies. Na Fig. 12 verificamos a alta porcentagem de Complemento
residual após tratamento da mistura de soros com a maioria das frações. Portanto, nem
todas as frações são capazes de consumir o complemento através da via alternada.
Pela porcentagem de Complemento residual vemos que as frações V (31,9%), VI
(58,8%) e XI(11,2%), apesar de serem reconhecidas por anticorpos presentes no soro de
indivíduo normal (Fig. 10A) são as que apresentam maiores consumo de Complemento
pela via alternada, ou seja, são capazes de consumir o Complemento por outra via
independente do reconhecimento de anticorpos. Comparando-se as figuras 10A e 10B
podemos perceber que estas frações possuem constituintes que não são reconhecidos por
anticorpos. Tais constituintes poderiam participar do consumo do Complemento ativando
a via alternada. Além disso, dependendo da subclasse de imunoglobulina que esteja
reconhecendo os constituintes destas frações, os imunocomplexos assim formados não
seriam bons ativadores da via clássica do Complemento, fazendo-o pela via alternativa.
Após a incubação do soro com a fração VIII observamos que este apresenta cerca
de 68,0% de Complemento residual. Este resultado mostra que esta fração também é capaz
de ativar este sistema pela via alternada.
Na Tabela IV estão representadas as quantidades de proteína de cada amostra
utilizada nos ensaios de ativação da via alternada do Complemento.
78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Zimos
anTam
pão
ECT I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII XIV
% d
e Co
mpl
emen
to r
esid
ual
Figura 12 – Determinação do Complemento residual em mistura de soros humanos normais
após tratamento com ECT do mosquito C. quinquefasciatus e suas frações cromatográficas,
reveladas com hemácias de coelho.
As colunas, apresentando barra de erro, representam a porcentagem de Complemento residual na
mistura de soros normais (M1) frente ao ECT (25 µg) e suas frações obtidas por cromatografia de
troca iônica (I a XIV); média de 3 deteminações/amostra; controles dos testes: zimosan (1mg) e
tampão.
Tabela IV – Quantidade protéica de ECT e frações cromatográficas (I a XIV)
utilizada na ativação do sistema Complemento utilizando-se hemácias de coelho
Amostras Qnt. de Ptn.* (µg) Amostras Qnt. de Ptn.* (µg)
ECT 10,3 Fr VIII 6,0
Fr I 5,3 Fr IX 4,3
Fr II 3,6 Fr X 6,2
Fr III 11,2 Fr XI 11,0
Fr IV 7,9 Fr XII 0,8
Fr V 20,4 Fr XIII 0,6
Fr VI 12,6 Fr XIV 0,4
Fr VII 5,4
* Quantidade de proteína das amostras utilizadas nos ensaios de ativação do sistema Complemento.
79
4. Pesquisa de Componentes Presentes no Complemento Residual Após Ativação por
ECT, ECTx e Fração XI
Conforme foi visto na Fig. 1, o ECT do mosquito Culex quinquefasciatus é
reconhecido por anticorpos presentes no soro de pessoas não sensíveis à picada do
mosquito. Esses anticorpos ao reconhecerem estruturas presentes no extrato formaram
uma linha de precipitação visível, demonstrando a formação de complexos antígeno-
anticorpo. Vimos também na Fig. 5 que o ECT é capaz de ativar o sistema complemento
humano, principalmente, através da via clássica. Essa via pode ser iniciada na presença de
complexos imunológicos formados no soro. A pesquisa de componentes presentes no
Complemento residual, após o soro ter sido incubado com este extrato, foi realizada para
se confirmar os resultados obtidos nos ensaios de ativação do sistema Complemento,
confirmando que o ECT é verdadeiramente um ativador do Complemento e que este não
exerce apenas uma atividade pontual sobre determinada proteína da cascata deste sistema.
Na Fig. 13 são expressos os resultados referentes à pesquisa de componentes do
Complemento nos sobrenadantes do tratamento da mistura de soros por ECT conforme
verificado pela ligação dos componentes residuais a amostras de zimosan. Os
componentes do Complemento ou seus fragmentos ligados à partícula ativadora (zimosan)
foram detectados pela técnica de ELISA indireta.
Na Fig. 13A (Tampão) vemos o conteúdo total de C3 da mistura de soros utilizada
nos testes de ativação do Complemento (controle do soro): absorbância de 0,85.
Observamos ainda o controle do zimosan tratado apenas com solução salina: absorbância
de 0,04. O resultado referente à pesquisa do componente C3 presente no sobrenadante do
da mistura de soros, após tratamento com ECT (Sobr. ECT), mostra que nem todo o C3 foi
consumido pelo ECT: ainda é possível detectar fragmentos do componente C3 residual
zimosan utilizado como suporte (absorbância de 0,35). O conteúdo de C3 no sobrenadante
do controle do teste de ativação (Sobr do controle), mostra que este sobrenadante contém
praticamente todo o C3 da mistura de soros utilizada (absorbância 0,65). A diferença
observada em relação ao controle da mistura (Controle do soro) era esperada visto que a
amostra da mistura de soros sofreu uma incubação prévia de 1h a 37oC. Vários
componentes do Complemento são termolábeis e o como o controle do soro passou apenas
por uma incubação, este possui quantidade maior de proteínas do Complemento do que os
soros que foram incubados por 2 vezes.
80
Conforme o esperado, restou pouco do componente C3 (absorbância de 0,09) no
sobrenadante do controle positivo desse teste (Sobr zimosan). O zimosan é capaz de
consumir praticamente todo o Complemento, consequentemente, os componentes
residuais estão muito baixo, desta forma, muito pouco C3 é encontrado na superfície do
suporte (Sobr. Zimosan), após este ser incubado com o soro pré-incubado com zimosan.
Ainda na Fig. 13A podemos observar a ação dos quelantes: na presença de EGTA-
Mg2+ há queda no conteúdo de C3 detectado sobre o zimosan em praticamente todos os
testes. Estes resultados eram esperados visto que este quelante possibilita a ativação
apenas da via alternada. Consequentemente, uma menor quantidade de C3 é detectada na
superfície dos suportes, pois apenas uma via é capaz de ser ativada.
Além disso, a disponibilidade de componentes de Complemento sempre sofre uma
pequena redução devido ao tratamento do soro com o quelante. Por esse motivo, as
quantidades de C3 detectadas na superfície dos suportes incubados com o Complemento
residual do soro em Tampão e do soro tratado com EGTA-Mg++ não devem ser
comparados.
Na presença de EDTA não houve ativação do Complemento, pois este quelante
bloqueia todas as vias de ativação e, portanto, não se detecta fragmentos de C3 em
nenhum dos ensaios (controles ou sobrenadantes).
Na Fig. 13B estão os resultados da pesquisa de C4 residual nos sobrenadantes do
tratamento da mistura de soros com o ECT. Na Fig. 13B (Tampão) vemos o conteúdo total
de C4 na mistura de soros utilizada nos testes de ativação do Complemento (controle do
soro): absorbância de 0,88 e o controle do zimosan tratado apenas com solução salina:
absorbância de 0,04. Observando o resultado referente à pesquisa do componente C4
presente no sobrenadante da mistura de soros após tratamento com ECT (Sobr ECT)
vemos que nem todo C4 foi consumido pelo ECT: ainda é possível detectar fragmentos do
componente C4 residual na amostra de zimosan utilizada como suporte.
Ainda na Fig. 13B observamos que não há grande deposição de fragmentos de C4
sobre o zimosan nos ensaios com EGTA-Mg2+ conforme o esperado, pois esse quelante
bloqueia a via clássica. Na presença do EDTA não houve ativação do Complemento e não
há detecção de fragmentos de C4 em nenhum dos ensaios (controles ou sobrenadantes).
Na Fig. 13C vemos os resultados obtidos da pesquisa de C5 residual nos
sobrenadantes da mistura de soros mais ECT.
A detecção de C5 residual indica que a ativação do complemento pelo ECT iniciou
a formação do complexo de ataque à membrana. Na Fig. 13C (Tampão) vemos que restou
81
apenas parte do C5 no sobrenadante do ensaio da mistura de soros ativada pelo ECT (Sobr
ECT) através de sua deposição ao zimosan (absorbância de 0,28) se compararmos este
valor com o obtido para o sobrenadante do controle (absorbância 0,49). Este consumo foi
reduzido na presença de EGTA-Mg2+ porque não há ativação de uma das vias do sistema.
Da mesma forma que nos testes anteriores, na presença de EDTA não há ativação do
sistema e, portanto, não foram detectados fragmentos do C5 na superfície do zimosan
usado como suporte.
82
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
Soro
Salina
Sob. ECT
Sob. Controle
Sob. Zimosan
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
Soro
Salina
Sob. ECT
Sob. Controle
Sob. Zimosan
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
Soro
Salina
Sob. ECT
Sob. Controle
Sob. Zimosan
Figura 13 - Fixação dos fragmentos de componentes do Complemento sobre zimosan tratado
com os sobrenadantes da ativação da mistura de soros pelo ECT.
As barras indicam a absorbância obtida no teste de ELISA indireto empregado na detecção dos
fragmentos ligados ao zimosan (média de três determinações):
A) anticorpo primário anti-C3 humano (1/4.000);
B) anticorpo primário anti-C4 humano (1/800);
C) anticorpo primário anti-C5 humano (1/800).
A
B
C
83
Os resultados da pesquisa de componentes residuais do Complemento após
tratamento da mistura de soros com ECTx são mostrados na Fig. 14.
Na Fig. 14A Tampão estão expressos os resultados referentes à pesquisa de C3: a
mistura de soros (Controle do soro) utilizada nos testes mostrou absorbância aproximada
de 0,80 enquanto no controle do zimosan, tratado apenas com salina, a absorbância é baixa
(0,04), demonstrando que não há presença de fragmentos de C3 ligados à superfície da
partícula ativadora conforme o esperado. O sobrenadante do ensaio de ativação do
Complemento pelo ECTx (Sobr. ECTx) apresenta C3 (absorbância de 0,71), entretanto,
quando comparado com o sobrenadante do controle (absorbância de 0,86) vê-se que a
concentração de C3 está mais baixa. Isso significa que durante a incubação da mistura de
soros com o ECTx, este foi capaz de consumir o C3 durante a ativação. Quando
comparamos o controle (Sob. Controle) tratado com EGTA-Mg2+, também podemos
observar redução na quantidade de C3 na superfície do zimosan (suporte) quando o soro é
incubado com o ECTx e tratado com este mesmo quelante. Este resultado também
demonstra que o ECTx também é capaz de consumir este componente pela via alternada.
O soro tratado com EDTA não apresenta fragmentos de C3 ligados na superfície do
zimosan.
Na Fig. 14B, estão expressos os resultados dos ensaios para a pesquisa de C4
através da fixação do C4 residual ao zimosan suporte, após o soro ser incubado com
ECTx. No tampão, o controle da mistura dos soros (controle do soro) representa todo o C4
disponível no soro (absorbância de 0,96), enquanto que no zimosan tratado apenas com
salina não são encontrados fragmentos de C4 ligados à sua superfície (absorbância de 0,04
– controle negativo). O C4 residual, presente no sobrenadante da mistura de soros
incubada com o ECTx, apresenta-se numa quantidade menor (0,40) quando comparamos
com o controle do teste (Sob. Controle com absorbância de 0,94). No controle do zimosan
vemos uma pequena quantidade de C4 ligada (absorbância de 0,110).
Ainda na Fig. 14B observamos que não há grande deposição de fragmentos de C4
sobre os suportes nos ensaios com EGTA-Mg2+ conforme o esperado, pois esse quelante
bloqueia a via clássica. Entretanto, a pequena quantidade de C4 observada sobre o
zimosan pode ser devido à ativação da via das lectinas, já que o zimosan possui superfície
rica em manose e também o fato de uma pequena quantidades do complexo MBL-MASPs
permanecer estável mesmo na presença do quelante. Isso ocorre desde que o complexo
esteja em tampão com pH próximo a neutralidade, conforme utilizado em nossos testes. O
consumo de C4 mesmo no tratado com EGTA-Mg++, sugere uma possível participação
84
também da via das lectinas durante a ativação do Complemento por este extrato. Ainda
que em quantidades reduzidas, quando comparamos o soro incubado com ECTx e tratado
com EGTA-Mg2+ , podemos perceber que este está reduzido em relação ao controle do
teste (Sob. Controle).
Na presença do EDTA não houve ativação do Complemento e não há detecção de
fragmentos de C4 em nenhum dos ensaios (controles ou sobrenadantes). Esses resultados
são semelhantes aos obtidos com o ECT (Fig.12).
Na Fig. 14C vemos os resultados obtidos sobre a pesquisa de C5 residual nos
sobrenadantes da mistura de soros mais ECTx. Na presença de tampão, sem quelantes,
vemos que houve pouco consumo deste componente pelo extrato testado: a absorbância do
sobrenadante da mistura de soros tratada com o ECTx (Sobr. ECTx) foi de 0,70 enquanto
a do sobrenadante do controle foi de 0,73. Na presença de EGTA-Mg2+ vê-se que restou
menos C5 no sobrenadante da mistura de soros tratado com o extrato (absorbância de
0,30) do que o sobrenadante do controle (absorbância de 0,40) indicando o consumo,
embora reduzido, deste componente pela via alternada.
Na Fig. 14D estão os resultados da pesquisa de properdina nos sobrenadantes do
tratamento da mistura de soros com o ECTx. Na Fig. 14D “Tampão” vemos o conteúdo
total de properdina na mistura de soros utilizada nos testes de ativação do Complemento
(controle do soro): absorbância de 0,390, e o controle do zimosan tratado apenas com
solução salina: absorbância de 0,03. Observando o resultado referente à pesquisa da
properdina presente no sobrenadante da mistura de soros após tratamento com ECTx (Sobr
ECTx - absorbância de 0,22) e o sobrenadante do controle (Sobr controle – absorbância de
0,33) vemos que houve consumo deste componente, participante da via alternada, pelo
ECTx. Este resultado mostra que o consumo de properdina pelo extrato confirma o fato do
ECTx ser um ativador do sistema Complemento e que a via alternada está participando.
Como esperado, no sobrenadante do controle positivo (Sobr zimosan) não restou nada de
properdina (absorbância 0,04).
Em presença de EGTA-Mg2, os resultados obtidos são semelhantes aos
encontrados no soro sem tratamento (sem quelantes) e, portanto, o ECTx também é capaz
de consumir a properdina durante a ativação do Complemento o que confirma a atuação da
via alternada. Em presença do EDTA os resultados são semelhantes àqueles obtidos nos
demais ensaios.
Em conjunto, o consumo de C3, C4, C5 e properdina durante a ativação do sistema
Complemento pelo ECTx mostra que este extrato é capaz de realizar uma verdadeira
85
ativação do Complemento, visto que, após tratamento do soro com ECTx, vários
componentes pesquisados estão em quantidades reduzidas. Além de não ser uma atuação
pontual sobre determinada proteína da cascata do Complemento, também podemos
observar que todas as vias (clássica, alternada e provavelmente a das lectinas) parecem
estar atuando o extrato.
86
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abso
rbân
cia
(492
nm
)
Soro
Salina
Sob. ECTx
Sob. Controle
Sob. Zimosan
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
Soro
Salina
Sob. ECTx
Sob. Controle
Sob. Zimosan
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
Soro
Salina
Sob. ECTx
Sob. Controle
Sob. Zimosan
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTAA
bsor
bânc
ia (4
92 n
m)
Soro
Salina
Sob. ECTx
Sob. Controle
Sob. Zimosan
Figura 14 - Fixação dos fragmentos e componentes do Complemento sobre zimosan tratado
com os sobrenadantes da ativação da mistura de soros pelo ECTx.
As colunas, com barras de erro, indicam a absorbância obtida no teste de ELISA indireto
empregado na detecção dos fragmentos e componentes ligados ao zimosan (média de três
determinações):
A) anticorpo primário anti-C3 humano (1/4000);
B) anticorpo primário anti-C4 humano (1/800);
C) anticorpo primário anti-C5 humano (1/800);
D) anticorpo primário anti-properdina humana (1/500);
A B
C D
87
A pesquisa por componentes residuais do Complemento também foi realizada no
sobrenadante da mistura de soros utilizada nos ensaios de ativação do Complemento pela
Fração XI. Dentre as 14 frações, esta foi a que apresentou maior consumo de
Complemento pela via alternada.
A Fig. 15A apresenta os resultados obtidos na detecção de fragmentos de C3
ligados à superfície do zimosan suporte. No tampão, a quantidade de C3 residual presente
no sobrenadante da mistura de soros incubada com a Fração XI (Sobr. Fr XI) está reduzida
(absorbância de 0,58) se comparada ao sobrenadante do controle do soro (absorbância de
0,89), o que indica que houve consumo de C3 pela Fração XI. Quando o soro é tratado
com EGTA-Mg2+ também observamos que esta fração é capaz de consumir o C3 do soro,
pois, restou pouco C3 no sobrenadante deste teste. A absorbância do ensaio da detecção de
fragmentos de C3 sobre o zimosan suporte é de 0,31 enquanto a do sobrenadante do
controle (Sobr. controle) é de 0,49. Esses resultados indicam que tanto a via clássica
quanto a alternada estão sendo ativadas pela fração XI, pois podemos observar consumo
de C3 no soro em que todas as vias de ativação estão liberadas (tampão), como também no
soro em que, basicamente, somente a via alternada está livre (tratamento com EGTA-
Mg++), quando em presença de ECTx.
Na Fig. 15B são mostrados os resultados da pesquisa de C4 presente nos
sobrenadantes da ativação do Complemento pela Fração XI. Em tampão, podemos
observar que o nível de C4 residual no sobrenadante da mistura de soros, após incubação
com esta fração (Sobr. Fr XI), está muito reduzido (absorbância de 0,25), tendo como
parâmetro o resultado encontrado no sobrenadante do controle (absorbância de 0,83). Em
relação às amostras dos ensaios com soros tratados com EGTA-Mg2+, não houve ativação
e fixação de fragmentos de C4 ao zimosan suporte quando comparamos este resultado
(absorbância aproximada de 0,10) com o resultado do controle positivo do teste (Sob.
Controle – absorbância de 0,10). Também não se detectou o fragmento deste componente
na superfície do zimosan (suporte) quando utilizamos os sobrenadantes dos soros quelados
com EDTA. Estes resultados indicam que a Fração XI é capaz de consumir o C4 quando
apenas a mistura de soro não é tratada com quelantes (Tampão), ou seja, este componente,
possivelmente, está sendo consumido pela via clássica.
A Fig. 15C mostra que a Fração XI também é capaz de reduzir a disponibilidade
do componente C5 tanto nos soros tratados com EGTA-Mg2+ como no soro não tratado
com quelantes (Tampão). Estes resultados indicam que o C5 é consumido quando em
presença da Fração XI tanto pela via clássica quanto pela via alternada.
88
Os resultados da pesquisa de properdina (Fig. 15D) indicam que a fração XI
também pode consumir a properdina do soro. Entretanto, só foi observado consumo deste
componente quando a mistura de soros não sofre tratamento com quelantes. De forma
surpreendente, não foi observado consumo deste componente pela fração quando os soros
são tratados com EGTA-Mg2+.
Esses resultados dizem que a Fração XI é capaz de consumir o sistema
Complemento tanto pela via clássica (consumo de C4 do soro) quanto pela alternada
(consumo de C3 do soro tratado com EGTA-Mg++) e que esta ativação é capaz de, pelo
menos, iniciar a via efetora do Complemento (MAC), devido ao consumo de C5 no soro.
Como o C4 foi consumido pelo ECTx apenas quando o soro possuía todas as vias livres, é
provável que a via das lectinas não esteja atuando sobre ele.
89
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abso
rbân
cia
(492
nm
)
SoroSalinaSob. Fr XISob. ControleSob. Zimosan
0
0,1
0,20,3
0,4
0,5
0,6
0,70,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
SoroSalinaSob. Fr XI
Sob. ControleSob. Zimosan
0
0,1
0,20,3
0,4
0,5
0,6
0,70,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Abs
orbâ
ncia
(492
nm
)
SoroSalinaSob. Fr XISob. Controle
Sob. Zimosan
0
0,1
0,20,3
0,4
0,5
0,6
0,70,8
0,9
1
Tampão EGTA-Mg++ EDTAA
bsor
bânc
ia (4
92 n
m)
SoroSalinaSob. Fr XISob. Controle
Sob. Zimosan
Figura 15 - Fixação dos fragmentos e componentes do Complemento sobre zimosan tratado
com os sobrenadantes da ativação da mistura de soros pela Fração XI.
As colunas com barras de erro indicam a absorbância obtida no teste de ELISA indireto
empregado na detecção dos fragmentos e componentes ligados ao zimosan (média de três
determinações):
A) anticorpo primário anti-C3 humano (1/4000);
B) anticorpo primário anti-C4 humano (1/800);
C) anticorpo primário anti-C5 humano (1/800);
D) anticorpo primário anti-properdina humana (1/500);
A B
C D
90
5. Citometria de Fluxo
Na Fig. 16 são expressos os resultados referentes à pesquisa de componentes do
Complemento (C3 e MBL) nos sobrenadantes do tratamento da mistura de soros por ECT
e ECTx, usando zimosan como suporte. A MBL e o C3c (fragmento resultante da
clivagem do C3) ligados ao zimosan foram detectados pela técnica de citometria de fluxo
e os resultados estão expressos em média de fluorescência (MF).
Na Fig. 16A são mostrados os resultados da pesquisa de C3c ligado à superfície do
suporte. No tampão, o zimosan tratado com a mistura de soros (controle do soro) apresenta
o maior nível de C3c ligado à sua superfície. O zimosan tratado com salina não apresenta
fluorescência conforme o esperado pela ausência do Complemento. As partículas
incubadas com os sobrenadantes da mistura de soros, resultantes da ativação do
Complemento pelo ECT (Sobr. ECT) e ECTx (Sobr. ECTx) apresentam níveis
aproximados de C3c: MF de 800 e 700, respectivamente. A comparação desses valores
com aquele (MF 1150) obtido para o sobrenadante do controle (soro sem ativadores)
mostra que o componente C3 foi consumido no processo de ativação pelos extratos. O
sobrenadante do controle positivo (zimosan mais mistura de soros) não continha mais
componente C3 visto que não foi detectado C3c no zimosan suporte (Sobr zimosan –
controle negativo). Resultados similares foram obtidos para os ensaios com misturas de
soros tratadas com EGTA-Mg2+, porém de menor intensidade devido à interferência deste
quelante sobre a ativação da via alternada. Apesar deste quelante permitir a ativação da via
alternada, nem todo o C3 é capaz de ser consumido no soro tratado desta forma. O
tratamento do soro com este quelante disponibiliza uma quantidade um pouco menor de
C3 para ser ativado do que no soro que não sofreu tratamento algum com quelante.
Fragmentos de C3 não foram praticamente detectados nos ensaios usando EDTA como
quelante.
Na Fig. 16B são mostrados os resultados da pesquisa de MBL ligada à superfície
do suporte. O consumo deste componente foi realizado para sabermos se a atuação da via
das lectinas ocorre quando o soro é incubado com o ECT e, principalmente, o ECTx. O
resultado da Fig. 14B, nos deu indícios de que este último também é capaz de consumir o
Complemento pela via das lectinas. No tampão, o zimosan tratado com a mistura de soros
(controle do soro) apresenta o maior nível de MBL ligada a sua superfície. O zimosan
tratado com salina não apresenta fluorescência, conforme o esperado. O suporte incubado
com o sobrenadante da mistura de soros resultante da ativação do Complemento pelo ECT
91
(Sobr. ECT) apresenta média de fluorescência 315. Comparando-se este valor com o
obtido para o sobrenadante do controle (MF 340) observamos que a MBL pouco é
consumida durante o processo de ativação por este extrato. Entretanto, em relação ao
ECTx, observamos que este extrato é capaz de consumir a MBL durante o processo de
ativação, pois o suporte tratado com a mistura de soros incubada com o ECTx apresentou
MF de 145. O sobrenadante do controle positivo (Sobr zimosan) não apresenta ligação de
MBL (MF 60), pois ela foi consumida na primeira etapa do ensaio. Em presença de
quelantes não há muita detecção de MBL porque ambos quelam Ca2+ essencial para
manutenção da estrutura dessa lectina. Esses resultados mostram que a via das lectinas
praticamente não é ativada na presença de ECT, entretanto, quando o soro é incubado com
ECTx, este componente é reduzido do soro, indicando que foi consumido durante a
ativação do Complemento por este extrato.
92
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Méd
ia d
e Fl
uore
scên
cia
(FL-
1)
Controle do Soro
Salina
Sobr. ECTSobr. ECTx
Sobr. Controle
Sobr. Zimosan
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Tampão EGTA-Mg++ EDTA
Méd
ia d
e Fl
uore
scên
cia
(FL-
1)
Controle do Soro
Salina
Sobr. ECT
Sobr. ECTx
Sobr. Controle
Sobr. Zimosan
Figura 16 – Detecção dos fragmentos de C3 e de MBL fixados sobre zimosan tratado com os
sobrenadantes da ativação da mistura de soros pelo ECT e ECTx por citometria de fluxo.
As colunas com barras de erro indicam a média de fluorescência (FL-1) emitida por C3c e MBL
fixados sobre zimosan relativa e reconhecidos por anticorpos marcados com fluoresceina (média
de três determinações):
A) anticorpo anti-C3c humano conjugado com FITC (1/50);
B) anticorpo primário anti-MBL humana (1/50).
B
A
93
6. Ensaio de Quimiotaxia de Neutrófilos Humanos
A ativação do sistema Complemento leva à liberação de fragmentos que
promovem a quimiotaxia de neutrófilos. Esta atividade biológica pode ser verificada pela
mobilidade das células através de membrana porosa na câmara de Boyden. As Fig. 17 e 18
mostram os resultados de quimiotaxia (FQ) obtidos após incubação da mistura de soros
normais com extratos e frações antigênicas do mosquito e seus controles: na Fig. 17A
vemos que o ECT (SHN-ECT) é capaz de induzir a liberação de fragmentos quimiotáticos
do soro (FQ~10) quando comparado com a indução deste efeito pelos controles LTB4
(FQ~11,5) e FMLP (FQ~13). A incubação do extrato antigênico com o soro inativado pelo
calor (SHN+ECT) não apresenta esta atividade (FQ~1,5) bem como os demais controles:
mistura de soros inativado pelo calor (SHN-VBS) ou não (SHN-VBS), amostras de ECT
sem soro (VBS-ECT) ou apenas o tampão de diluição do soro (VBS). A Fig. 16B mostra
resultados semelhantes para o extrato ECTx. Os resultados obtidos com as frações Fr I e
Fr XI são apresentados nas Fig. 18A e B, respectivamente. Esses resultados também são
semelhantes àqueles obtidos para os extratos brutos.
Analisando os resultados dos controles, vê-se ainda que nenhum componente
presente no ECT, ECTx, FrI ou FrXI é capaz de por si só induzir a quimiotaxia das células
para a região inferior da câmara de Boyden. Ou seja, a quimiotaxia é observada apenas em
presença de Complemento ativo incubado com as amostras testadas, provavelmente,
devido à formação de anafilatoxinas liberadas para a fase fluida, oriundas da ativação do
Complemento.
94
0
2
4
6
8
10
12
14
VBS LTB4 FMLP SHN+ECT VBS+ECT SHN+VBS SHNΔ+ECT SHNΔ+VBS
Fato
r de
Qui
mio
taxi
a
0
2
4
6
8
10
12
14
VBS LTB4 FMLP SHN+ECTx VBS+ECTx SHN+VBS SHNΔ+ECTx SHNΔ+VBS
Fato
r de
Qui
mio
taxi
a
Figura 17 – Atividade quimiotática de fragmentos de componentes do Complemento
após ativação da mistura de soros pelos extratos ECT e ECTx.
Ensaio realizado em câmara de Boyden com membrana de porosidade de 13mm, por 60
minutos a 37ºC. Controles positivos: LTB4 e FMLP; controles negativos: mistura de soros
inativada pelo calor (SHN) e tampão de diluição das amostras (VBS). As barras indicam
o fator quimiotático (média de três determinações) induzido por:
A) Extrato ECT com ou sem a presença de Complemento;
B) Extrato ECTx com ou sem a presença de Complemento.
A
B
95
0
2
4
6
8
10
12
14
VBS LTB4 FMLP SHN+FrI VBS+FrI SHN+VBS SHNΔ+FrI SHNΔ+VBS
Fato
r de
Qui
mio
taxi
a
0
2
4
6
8
10
12
14
VBS LTB4 FMLP SHN+FrXI VBS+FRXI SHN+VBS SHNΔ+FRXI SHNΔ+VBS
Fato
r de
Qui
mio
taxi
a
Figura 18 – Atividade quimiotática de fragmentos de componentes do Complemento
após ativação da mistura de soros pelas frações Fr I e Fr XI.
Ensaio realizado em câmara de Boyden com membrana de porosidade de 13mm, por 60
minutos a 37ºC. Controles positivos: LTB4 e FMLP; controles negativos: mistura de soros
inativada pelo calor (SHN) e tampão de diluição das amostras (VBS). As barras indicam
o fator quimiotático (média de três determinações) induzido por:
A) Fração Fr I com ou sem a presença de Complemento;
B) Fração Fr XI com ou sem a presença de Complemento.
B
A
96
DISCUSSÃO
As picadas de mosquitos causam reações bastante complexas e, conforme
observado por Mellanby em 1946, há uma seqüência de estágios durante o processo de
sensibilização dos seres humanos. Inicialmente, o indivíduo não apresenta reação cutânea
às picadas. Posteriormente, quando picado, o indivíduo apresenta reação cutânea
considerada tardia (após 20 a 24 horas). Depois, o quadro torna-se mais complexo: picadas
subseqüentes causam reações cutâneas imediatas que desaparecem dentro de duas horas e
reações mais tardias semelhantes àquelas observadas no início da sensibilização do
indivíduo. Após repetidas exposições, as reações imediatas persistem, a as reações mais
tardias desaparecem progressivamente. Com o tempo, algumas pessoas não apresentam
mais reações cutâneas, tornando-se naturalmente dessensibilizados (tolerantes). Porém
outras mantêm certo nível de sensibilidade cutânea (McCormack et al, 1995). Sintomas
sistêmicos às picadas de mosquitos parecem ser muito raros, diferentemente do que
ocorre, por exemplo, após ferroadas de himenópteros (Clayton et al., 1983). Que
mecanismos imunológicos estão envolvidos em cada um desses estágios ainda não está
claro.
Durante a infância, as crianças picadas por mosquitos e outros artrópodes podem
desenvolver a dermatose denominada urticária papular (prurigo estrófulo), caracterizada
por pápulas urticariformes, pruriginosas, crônicas ou recorrentes (Dortas Jr. & Abe, 2006).
A coçadura causa lesões que podem levar a infecções secundárias. Essas reações decorrem
da sensibilização do indivíduo por proteínas encontradas na saliva dos artrópodes e, na
maioria dos casos, desaparecem com a idade (Stibich & Schwartz, 2001).
O teste cutâneo por puntura de leitura imediata (técnica de Pepys, 1975) é utilizado
no diagnóstico das alergias (prick test). Após aplicação do alérgeno na face anterior do
braço, as leituras das reações inflamatórias são feitas em até 20 min. Esse teste é utilizado
no diagnóstico de alergias mediadas por IgE (tipo I), visto que há fixação via receptor
FcεRI desses anticorpos em mastócitos, onde tem vida média de 10 dias. No plasma a
duração dos anticorpos da classe IgE é de apenas 2,5 dias (Hellman, 2007). Esse teste,
usando o extrato de corpo total do mosquito como agente desencadeante da reação
alérgica, permite distinguir os pacientes com urticária papular causada por mosquitos, dos
indivíduos normais. Do ponto de vista clínico, os pacientes que desenvolvem respostas
97
positivas ao teste cutâneo são considerados sensíveis. As pessoas que não apresentam
reação ao extrato são consideradas normais. Entretanto, algumas pessoas deste grupo
normal, embora sejam negativas ao teste cutâneo, apresentam reações cutâneas quando
picadas pelo inseto (Rockwell & Johnson, 1952, Shaffer, Jacobson & Pori, 1952 e Peng &
Simons, 2007).
Em 1993, Smith e colaboradores demonstraram que a picada de mosquito
Anopheles causava uma reação imediata devido à presença de anticorpos circulantes.
Esses anticorpos teriam sido previamente produzidos pelos indivíduos contra as
substâncias inoculadas pelo mosquito por ocasião da sucção do sangue, demonstrando
assim que a reação cutânea à secreção salivar do inseto era de natureza imunológica.
Substâncias com os mesmos efeitos são encontradas não só nas glândulas salivares mas
também em outros órgãos dos mosquitos, mesmo que em pequenas concentrações.
Estudos de Peng e colaboradores (2004) mostraram que anticorpos da classe IgE e
IgG específicos contra os constituintes salivares do inseto, assim como a sensibilização de
linfócitos, estão envolvidos nessas reações alérgicas, tanto imediatas quanto tardias. Os
índices de IgE, IgG e proliferação linfocitária estão aumentados nesses casos.
Estudos recentes demonstram que a picada do mosquito Anopheles ativa
mastócitos cutâneos, levando à resposta inflamatória local. In vivo, foi visto que durante a
picada do mosquito alguns constituintes da saliva são capazes de ativar os mastócitos,
mesmo na ausência de anticorpos IgE ou IgG específicos contra os constituintes salivares.
Experiências in vitro mostraram que a saliva de A. stephensis inicia diretamente a
liberação de mediadores de mastócitos humanos e de camundongos residentes do tecido
conjuntivo, mas não dos mastócitos de mucosa. Portanto, as reações aos constituintes
salivares dos insetos podem ser resultado tanto da ativação das respostas imunológicas
específicas quanto inespecíficas (Demeure et al, 2005).
Heng, Kloss e Haberfelde em 1984 demonstraram a presença de depósitos de
imunoglobulinas e fragmentos de Complemento na pele de três pessoas que apresentavam
urticária papular, sugerindo que essas lesões eram devidas à vasculite cutânea. Estes
depósitos eram encontrados a partir de biópsias do local da picada nas primeiras 24 horas
após o início do desenvolvimento da pápula. A presença de C1q, C3b e IgM nas paredes
98
dos vasos superficiais da derme sugeriram que imunocomplexos estariam envolvidos na
patogênese das lesões, como resultado da ativação do Complemento pela via clássica.
Porém, em 1997, Jordaan & Schneider, realizaram estudo histopatológico em 30
pacientes apresentando urticária papular à picada de mosquito. Em todos os casos foi
detectada a presença de linfócitos T e macrófagos enquanto que linfócitos B e células
dendríticas estavam ausentes. Os testes de imunofluorescência para a detecção de
depósitos de IgA, IgG, IgM, C3b e fibrina nas biópsias foram negativos em todos os casos.
Mais tarde, em 2004, García e colaboradores estudando a urticária papular causada
pela picada de pulga, mostraram a predominância de eosinófilos e linfócitos T CD4+ nas
lesões após exames histopatológicos das pápulas em 45 pacientes. Quanto à presença de
anticorpos séricos, os testes de immunoblotting não mostraram diferenças significativas
nas respostas em IgG entre pacientes e indivíduos controles (não sensíveis). Além disso,
demonstraram que os níveis de IgE diminuíam à medida que as lesões regrediam. Eles
sugeriram que as manifestações clínicas da urticária papular são mediadas por respostas
imunológicas complexas, envolvendo mais de um mecanismo, com maior evidência para a
respostas envolvendo IgE (tipo I) e células (tipo IV).
Peng e colaboradores, em 2004, realizaram um estudo com 14 indivíduos que
apresentavam reações sistêmicas à picada de mosquito. Esses pacientes apresentavam
altos títulos de IgE para as 5 espécies mais prevalentes de mosquitos: Aedes vexans, A.
aegypti, A. albopicus, Anopheles sinensis e Culex quinquefasciatus. Considerando a
reatividade dos anticorpos da classe IgE frente aos antígenos de glândula salivar,
verificou-se que o menor título era para os antígenos do C. quinquefasciatus. Quanto aos
níveis de IgG, verificou-se que os títulos mais elevados de anticorpos eram encontrados
também para os antígenos do C. quinquefasciatus. Os autores concluíram que tanto
anticorpos IgE quanto IgG participam das reações sistêmicas desencadeadas pela picada
do C. quinquefasciatus.
Esses dados da literatura mostram a complexidade das reações que os indivíduos
apresentam frente aos constituintes originados das diferentes espécies de mosquitos. Essas
reações podem resultar da diversidade de substâncias com as quais entram em contato ao
serem picados pelos insetos.
99
Os mecanismos subjacentes podem envolver a ação direta desses constituintes ou
serem mediadas por processos imunológicos. A possível ativação do sistema
Complemento, tanto pelas vias diretas quanto mediadas por anticorpos podem ser
responsáveis por alguns dos fenômenos cutâneos observados tanto em indivíduos sensíveis
(prick test positivo) quanto não sensíveis (prick test negativo). Conforme foi observado
em nossos estudos, foi visto que tanto soro de pacientes (indivíduos sensíveis) quanto de
pessoas normais, apresentam anticorpos capazes de reconhecer constituintes do mosquito
Culex quinquefasciatus. A possível formação in vivo de complexos antígeno-anticorpo
entre antígenos do mosquito e esses anticorpos, com a conseqüente ativação do sistema
Complemento, pode ser a responsável por algumas das reações causadas pelas picadas de
mosquitos. Pessoas que não apresentam anticorpos da classe IgE capazes de reconhecer
constituintes do mosquito, não são dadas como reativas ao prick test, mas como visto
podem possuir anticorpos das classes IgG e/ou IgM reativas aos constituintes do mosquito.
Nossos dados estão de acordo com os achados por Ailus e colaboradores (1985),
que também detectaram a presença de anticorpos circulantes por imunodifusão radial
dupla contra antígenos presentes em extrato de corpo total de Aedes communis. Estes
anticorpos não estavam presentes nos soros de indivíduos sem exposição prévia aos
alérgenos de mosquito e de neonatos.
O presente trabalho teve por objetivo estudar a ativação do Complemento in vitro
por complexos imunológicos formados entre constituintes provenientes do mosquito e
anticorpos presentes no soro de pessoas consideradas não sensíveis pelo prick test.
Considerando que no Brasil extratos de corpo total do mosquito C.
quinquefasciatus tem sido utilizados nos testes cutâneos e na hipossensibilização de
indivíduos alérgicos às picadas de mosquitos, usamos esse material para os testes in vitro
de ativação do Complemento (Pires et al, 1991)
Em nosso trabalho, constatamos, por contraimunoeletroforese frente ao ECT de C.
quinquefasciatus (Fig.1), a presença de anticorpos nas misturas de soros humanos colhidos
aleatoriamente para serem utilizados como fonte de Complemento. A curva de titulação
das gamaglobulinas dessa mistura frente ao ECT é comparável àquela encontrada com os
soros de um paciente com urticária papular e de um indivíduo não sensível (Fig.2). Esses
resultados mostram a presença comum desses anticorpos. (não reativas ao teste cutâneo
100
utilizando-se ECT de C. quinquefasciatus). Se comparados os teores de anticorpos
presentes em misturas de soros utilizadas para ativação do Complemento com aqueles dos
soros de pacientes com urticária papular (Fig.3) constatamos nos dois casos níveis altos de
gamaglobulinas contra antígenos do C. quinquefasciatus. Tais resultados são esperados,
pois esta espécie é um dos mosquitos mais comuns em todo o Brasil, com prevalência
variando de 5% a 8% dentre os Culicídeos (Barbosa, et al, 1993, Labarthe et al, 1998 e
Silva-Filha, et al, 2001), e, portanto, a exposição a esses insetos é altamente provável.
Além disso, o estímulo à produção desses anticorpos é constante conforme observado
pelos teores de gamaglobulinas específicas produzidas por um único indivíduo durante um
período de, aproximadamente, dois anos. Tais resultados mostram a presença desses
anticorpos circulantes em decorrência das freqüentes picadas sofridas pelas pessoas desde
a infância, durante todo o ano, no Brasil. Esses dados estão de acordo com o observado
por Hahnstadt em 1997.
O soro utilizado como fonte de Complemento é absorvido com hemácias de
carneiro para que possíveis anticorpos de reação cruzada que podem reconhecer estas
hemácias sejam removidos, e não atrapalhem os ensaios de ativação do sistema
Complemento. Essa absorção não é capaz de reduzir os títulos de anticorpos anti-mosquito
do soro utilizado como fonte de Complemento, não invalidando o soro para ser utilizado
nesses ensaios.
Conforme referimos anteriormente, algumas pessoas consideradas normais também
apresentam reações inflamatórias ao serem picadas por mosquitos. As respostas das
pessoas sensibilizadas parecem depender de anticorpos da classe IgE, enquanto as reações
apresentadas por indivíduos considerados “normais” podem resultar de outros mecanismos
como a ativação de mastócitos e basófilos por imunoglobulinas da classe IgG (Peng &
Simons, 2007), a ativação do sistema Complemento por complexos imunes resultantes da
interação entre antígenos do inseto e anticorpos das classes IgG e IgM, ou diretamente por
constituintes do mosquito.
Para estudar a possível participação do Complemento nessas reações, testamos a
capacidade de extratos do C. quinquefasciatus em ativar as diferentes vias desse sistema in
vitro.
O ECT é capaz de ativar o sistema Complemento do soro de indivíduos normais, e
o efeito é dose dependente (Fig.4A). Os extratos de cabeça e tórax (Fig.4B) e de glândula
salivar (Fig.4C) também atuam sobre o sistema in vitro. O uso dos quelantes de Ca2+ e
101
Mg2+ permitiu estudar as diferentes vias de ativação constatando-se que o ECT ativa o
Complemento, principalmente, pela via clássica, provavelmente devido à formação de
complexos imunológicos entre constituintes desse extrato e anticorpos presentes nos soros
(Fig. 5A). O ECTx também ativa o Complemento pela via clássica mas a via alternada
parece ter também papel importante no consumo do Complemento (Fig. 5B). No caso do
EGS, apesar da baixa concentração de extrato empregada (1 µg), também observamos
consumo de Complemento. Pelos resultados pode-se supor que se fossem empregadas
quantidades equivalentes às dos extratos brutos de corpo total e de cabeça e tórax (25 µg)
o consumo total do Complemento seria mais elevado (Fig. 5C). O fato desses extratos
também ativarem a via alternativa, mostra que as reações à picada de mosquito podem
ocorrer em qualquer indivíduo, de forma indiscriminada, no que diz respeito aos efeitos,
aparentemente, não benéficas ao hospedeiro, da ativação do sistema Complemento.
O tratamento da mistura de soros com o quelante EDTA demonstra que os
constituintes desses extratos não têm qualquer atividade inibitória ou enzimática sobre as
proteínas do sistema Complemento visto que não há perda de atividade hemolítica dos
soros tratados com este quelante, durante a primeira etapa do experimento e recalcificados
para a realização da segunda etapa do experimento, em que o Complemento residual é
incubado com hemácias de carneiro sensibilizadas com anticorpos. A possível atividade
quelante dos próprios extratos foi ensaiada utilizando-se amostras previamente tratadas
com os íons Ca2+ e Mg2+ obtendo-se resultados negativos (dados não mostrados).
Conforme discutido anteriormente, o ECTx e o EGS são capazes de ativar o
sistema Complemento pela via clássica e também pela via alternada. Entretanto, para o
ECT, a via alternada não mostrou grande participação durante a ativação do
Complemento, apesar dos constituintes presentes no ECTx e EGS também estarem
contidos no ECT. Uma possível explicação seria a presença de constituintes do mosquito,
não localizados na cabeça e nem no tórax, que poderiam modular negativamente a
ativação do Complemento pela via alternada. Sabe-se que a meia vida da C3 convertase da
via alternada é muito pequena, menor que a C3 convertase da via clássica. O decaimento
da C3 convertase da via alternada pode ser ainda mais acelerada caso moléculas
carregadas negativamente facilitem a ligação do Fator H.
Como o ECT é obtido a partir do corpo total do mosquito, este possui maior
quantidade de integumento (exoesqueleto), que é constituído, dentre outras substância, por
quitina (cadeia de n-acetil-glucosamina) que é um polímero de alto peso molecular, capaz
de agregar moléculas negativas. Tal agregação de moléculas negativas, por exemplo,
102
poderia facilitar o deslocamento do Fator B do C3b, possibilitando a ligação do Fator H e,
com isso, impossibilitar a continuidade da ativação do Complemento pela via alternada
(Pangburn & Müller-Eberhard, 1986)
Há estudos que mostram que constituintes salivares de insetos podem inibir a
atividade do Complemento. Cavalcanti, Pereira & Gontijo (2003), mostraram que o
extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis foi capaz de inibir tanto a via clássica
quanto a via alternada, enquanto que a saliva de L. migonei atua somente sobre a
alternada. Através da técnica de ultracentrifugação, os autores mostraram que na saliva de
L. longipalpis há um componente termo-estável responsável pela atividade inibitória sobre
a via clássica. Esse componente tem entre 10 a 30 kDa de massa molecular e é capaz de
inibir cerca de 80% da atividade do Complemento. Em nosso trabalho, o ECT aquecido a
56°C por 30 min. não perdeu sua atividade, mostrando que não contém qualquer
componente lábil que interfira na ativação do Complemento (Clements, 1992).
Apesar dos três extratos atuarem sobre o Complemento, a complexidade das
amostras dificulta avaliar a contribuição efetiva de cada constituinte sobre as possíveis
vias de ativação do sistema. Extratos alergênicos de composição também complexa como
poeira doméstica, insetos e epitélio de animais, produzidos para o diagnóstico e tratamento
de alergias, são capazes de ativar o sistema Complemento humano in vitro. Os
mecanismos de consumo do Complemento por estes extratos ainda não estão
completamente esclarecidos, podendo envolver todas as vias de ativação (Varga et al.,
2003).
Em trabalhos com extratos alergênicos de pólen de diferentes plantas, Berrens, de
la Cuadra & Gallego (1997) demonstraram que esses extratos ativam o Complemento.
Entretanto, a ativação não está relacionada com sua atividade alergênica in vivo visto que
esses extratos ativam o Complemento dos soros de indivíduos não alérgicos (ausência de
IgG ou IgE específicos). Além disso, o Complemento é ativado in vitro, mesmo na
ausência de imunocomplexos. A ausência de anticorpos específicos e/ou naturais capazes
de reconhecer componentes presentes no extrato mostra que a ativação do Complemento
pode se dar pela ligação de componentes do extrato com algum fator encontrado no soro
(como lectinas). Resultados semelhantes são encontrados com extratos de Urtica dioica
que é capaz de consumir Complemento do soro de residentes de áreas mediterrâneas, onde
esta planta raramente causa alergia. Os moradores desta região não apresentam anticorpos
103
circulantes específicos contra constituintes dessa planta embora a utilizem para fins
medicinais.
O extrato de corpo total (ECT) é utilizado para diagnóstico de pessoas sensíveis à
picada do mosquito e também apresenta bons resultados na terapia de dessensibilização de
tais pessoas. Entretanto, este extrato apresenta uma grande quantidade de constituintes
encontrados em diversas partes do mosquito, fazendo com que, proporcionalmente, os
constituintes da glândula salivar apareçam numa porcentagem reduzida. Essa
complexidade de constituintes pode ser observada na análise eletroforética dos extratos,
principalmente, do ECT. Estas proteínas não salivares podem desencadear novas
sensibilizações e efeitos colaterais (Ariano & Panzani, 2004).
Para compreender melhor a ativação do Complemento e sua importância biológica,
seria necessário isolar os diferentes constituintes desses extratos.
Extratos menos complexos podem ser obtidos a partir da glândula salivar de
mosquitos. A saliva pode ser obtida por dissecção das glândulas salivares ou pela coleta
direta da saliva das fêmeas do mosquito. No caso do C. quinquefasciatus, ambos os
processos não proporcionam o rendimento de material suficiente para a realização de
todos os testes necessários aos estudos de ativação do Complemento. Aproximadamente
20 pares de glândula salivar de mosquitos fêmeas de C. quinquefasciatus contêm apenas
20µg de proteína (Ribeiro et al, 2004). A obtenção da glândula salivar de Culex completa
é particularmente difícil devido à forte musculatura do pescoço e do tórax do inseto, o que
geralmente, leva ao rompimento das glândulas. A localização das glândulas ainda é
dificultada pela presença de grande quantidade de corpos gordurosos que têm o mesmo
contraste quando observados ao microscópio.
A utilização de técnicas de biologia molecular para produzir alérgenos
recombinantes puros de saliva de mosquito pode melhorar a precisão do diagnóstico e
tratamento das alergias causadas pelas picadas (Peng & Simons, 2004). Entretanto, esses
processos não têm sido aplicados a todos os constituintes presentes na glândula e que
podem ser importantes na ativação do sistema Complemento.
A utilização do extrato cabeça e tórax de mosquitos fêmeas (ECTx), embora menos
complexo que o ECT, também produz pouco material para esses estudos. Além disso,
como referido por Smith e colaboradores (1993), substâncias com efeitos alergênicos
podem ser encontradas não só nas glândulas salivares, mas também em outros órgãos do
inseto, mesmo que em pequenas concentrações.
104
Tentativas de isolar constituintes com atividade alergênica e/ou antigênica foram
realizadas por Hahnstadt (1997). O fracionamento do ECT de C. quinquefasciatus por
cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose resultou na obtenção de
diversas frações antigênicas identificadas por ensaio imunoenzimático frente a soros de
indivíduos não sensível e sensível. Calixto, em 2005, preparou e fracionou quatro partidas
de ECT, de acordo com Hahnstadt (1997), e verificou a reprodutibilidade do método de
fracionamento mostrando que as frações isoladas desse material bruto são constituídas de
vários componentes com pesos moleculares predominando na faixa de 20 a 160 kDa.
Adotando a mesma metodologia, fracionamos também quatro preparações do ECT
de C. quinquefasciatus obtendo resultados semelhantes aos da literatura. Em nossos
estudos, a identificação dos antígenos presentes nas frações mostrou a presença de
anticorpos das classes IgM e IgG nos soros tanto de paciente quanto de indivíduo não
sensível. Os antígenos foram detectados por ensaios imunoenzimáticos (ELISA) e
pareceram estar presentes mesmo nas amostras com baixos teores protéicos (Fig. 6 e 7). A
análise, por immunoblotting, das frações reunidas de acordo com sua antigenicidade
mostrou inúmeros antígenos reconhecidos por anticorpos da classe IgM e IgG do soro de
indivíduo normal (Fig. 9). Soro de paciente com urticária papular também reconheceu
antígenos nessas frações, porém em menor número (dados não apresentados).
Analisando comparativamente a presença de antígenos nas frações cromatográficas
e ativação do Complemento por essas frações (Fig.10, 11 e 12), podemos especular sobre
as principais vias envolvidas na ativação do sistema. Assim, a fração I é a que melhor
ativa o Complemento e o faz pela via clássica porque o ensaio com hemácias de coelho
(Fig. 12), que identifica a ativação da via alternada, mostra que não houve consumo do
Complemento por essa via. A presença de antígenos reconhecidos por IgG nesta fração
(Fig. 10A) sugere que o consumo de Complemento se dá efetivamente pela formação de
complexos entre IgG e antígenos do mosquito (via clássica). Resultados semelhantes, mas
em menor grau, foram obtidos com as frações II, III e IV que apresentam antígenos
reconhecidos por anticorpos das classes IgG e IgM. As frações V e VI, que contém
antígenos reconhecidos por anticorpos das classes IgM e IgG, ativam a via clássica mas
também a via alternada.
A fração VII, também não ativa o Complemento pela via alternada (Fig. 12). Como
essa fração não apresenta antígenos reconhecidos por IgM nem IgG, pode-se supor que o
consumo de Complemento observado (Fig. 11) seja devido à ativação pela via das
105
lectinas. Esse tipo de análise, em relação à fração VIII, sugere que ela ativa o
Complemento pela via alternada e que as frações IX e X o fazem pela via clássica. A
fração XI é a que ativa o Complemento pela via alternada em maior grau (Fig. 12), mas,
visto que ela contém inúmeros antígenos reconhecidos por IgM e IgG, é possível que o
consumo de Complemento por esta fração se dê pelo somatório dessas duas vias.
As frações XII, XIII e XIV, não contém antígenos reconhecidos por IgM ou IgG
(Fig. 10) e também não ativam o Complemento pela via alternada (Fig. 12). A ativação do
sistema, observada na Fig.11, sugere que essas frações são capazes de consumir o
Complemento pela a via das lectinas.
Algumas frações, apesar de serem reconhecidas por anticorpos, não foram capazes
de consumir de forma expressiva o sistema Complemento pela via clássica, como é o caso
das Frações II, V e VI. Os anticorpos capazes de reconhecer essas frações podem ser de
isotipos outros que não realizam a ativação do Complemento pela via clássica, como, por
exemplo, a IgG4.
Estes resultados não permitem definir de fato a importância de cada constituinte do
ECT na ativação do Complemento devido à complexidade das diferentes frações do ponto
de vista constitutivo e de concentração. O conteúdo protéico de cada constituinte era
proporcional àquele presente no extrato total. As frações cromatográficas foram
concentradas a um volume constante 35 x menor ao volume original do extrato bruto.
Dessa forma, o conteúdo protéico de cada fração embora variável é proporcional a sua
concentração no extrato original. Assim, o efeito total do ECT é resultado do somatório da
atividade dos vários constituintes e envolvem todas as vias conhecidas de ativação do
Complemento.
As técnicas descritas acima revelam apenas que o sistema Complemento foi
ativado e dão uma indicação das possíveis vias envolvidas. A detecção dos componentes
remanescentes após a ativação do sistema bem como de fragmentos de componentes
gerados nesses processos permitem avaliar melhor as vias envolvidas.
Para verificar o consumo dos componentes do Complemento em presença dos
extratos (ECT e ECTx), adicionamos ao soro remanescente desses tratamentos amostra de
zimosan. Esse polissacarídio é capaz de ativar o Complemento, principalmente pela via
alternada, resultando dessa ativação fragmentos e componentes que se ligam sobre essa
partícula ativadora. Devido à presença de manose nesse polissacaridio, a via das lectinas
mediada por MBL também pode ser ativada. Esses componentes e fragmentos na
106
superfície dessa partícula ativadora podem ser detectados com anticorpos específicos por
técnicas imunoenzimáticas (ELISA) e fluorimétricas (citometria de fluxo).
Nossos resultados mostraram que o ECT consumiu a maior parte do
Complemento da mistura de soros, tanto pela via clássica quanto alternada. Na Fig. 13,
onde estão representados os resultados dos ensaios imunoenzimáticos, verifica-se redução
de componentes e fragmentos ligados ao zimosan, ao comparar esses resultados com
aqueles obtidos após adição de zimosan aos soros não tratados com ECT. Dessa forma
verificamos o consumo de C3 bem como de C5, mostrando que a C5 convertase foi
efetivamente formada. Esses resultados foram confirmados por citometria de fluxo (Fig.
16A) em que verificamos a diminuição de C3 sobre a partícula ativadora. A pesquisa de
MBL sobre zimosan, por citometria de fluxo (Fig. 16B) mostrou que ela não fora
consumida do soro tratado com o ECT. Esse resultado indicou também que o consumo de
C4, após tratamento dos soros com ECT (Fig. 13B) foi decorrente principalmente da
ativação da via clássica.
A ativação do Complemento realizada pelo ECT é capaz de consumir o
componente C3 e também de formar a C5 convertase. Tal fato nos leva a supor que
fragmentos de C3a e C5a são liberados na fase fluida. Estas anafilatoxinas in vivo, poderia
contribuir para o agravamento das reações observadas à picada de mosquito, já que
haveria maior influxo de neutrófilos, por exemplo, para o local da picada.
A pesquisa de componentes remanescentes na mistura de soros após tratamento
com ECTx confirmaram os resultados obtidos nos ensaios de atividade lítica (Fig. 5B).
Assim, a pesquisa de C3 residual ligado ao zimosan mostrou que houve redução deste
componente na mistura de soros tratada com ECTx (Fig. 14A e 16A). A pesquisa de
properdina sobre as partículas de zimosan (Fig. 14D) mostrou que ela estava reduzida e
que, portanto, fora consumida pelo ECTx. Esses resultados indicaram que esse extrato
ativa o sistema Complemento com participação também da via alternada. A presença
reduzida de fragmentos de C4 na superfície do zimosan também revela o consumo deste
componente pelo ECTx (Fig. 14B). Os testes de citometria de fluxo comprovaram o
consumo de MBL por esse extrato (Fig. 16B). Esses resultados de consumo de C4 e MBL
indicam que o ECTx também pode ativar a via das lectinas. Assim, alguns componentes
do ECTx também são capazes de ativar o Complemento por vias que não necessitam da
formação de imunocomplexos.
Como referido anteriormente, todas as frações antigênicas, obtidas no
fracionamento do ECT, foram capazes de ativar o sistema Complemento. A fração XI em
107
particular, apresentou inúmeros componentes reconhecidos por anticorpos das classes IgM
e IgG o que justifica o consumo de Complemento pela via clássica. Por outro lado, essa
fração foi a que apresentou maior consumo pela via alternada. Para confirmar tais
resultados, determinou-se o consumo de C3, C4, C5 e de properdina da mistura de soros
tratada com esta fração (Fig. 15) utilizando-se o ensaio com zimosan. A pesquisa de
fragmentos e componentes fixados sobre o zimosan mostrou que restou pouco C4 no
sobrenadante do tratamento da mistura de soros com a fração, pois há redução de C4b
ligado à superfície da partícula ativadora (Fig. 15B). Esse resultado confirma, de forma
indireta, a participação da via clássica na ativação do Complemento sérico. A redução da
fixação dos fragmentos de C3 (Fig. 15A) e de properdina (Fig. 15C) mostra que a via
alternada foi ativada pela Fração XI, confirmando os resultados encontrados nos ensaios
hemolíticos. Além disso, o consumo do Complemento por essa fração leva à redução
também do C5, indicando a formação da C5 convertase e liberação de C5a para o fluido.
Em vista desses resultados, os ensaios de quimiotaxia foram empregados para
mostrar a presença dos fragmentos de componentes do Complemento liberados para a fase
fluida. A ativação do sistema leva à formação e liberação dos peptídios C4a, C3a e C5a e
promovem a quimiotaxia de leucócitos. As amostras de ECT, ECTx e as frações FrI e
FrXI consomem Complemento por diferentes vias e, por isso, foram ensaiadas quanto a
sua capacidade de ativar o sistema e induzir a quimiotaxia de neutrófilos purificados de
sangue periférico humano.
O ECT e a FrI são capazes de ativar o sistema Complemento principalmente pela
via clássica, enquanto o ECTx e a FrXI realizam a ativação tanto pela via clássica quanto
pela via alternada. Os resultados obtidos mostram que estes últimos são significativamente
mais eficientes em induzir a quimiotaxia de neutrófilos do que o extrato bruto (ECT) e a
fração Fr I (Fig. 17 e 18). Os resultados confirmaram a ativação do sistema Complemento
uma vez que nenhum componente presente no ECT, ECTx, FrI ou FrXI é capaz de por si
só influir na quimiotaxia das células .
Um dos principais objetivos deste trabalho foi mostrar que os extratos do mosquito
C. quinquefasciatus ativam o sistema Complemento in vitro e que, portanto, as reações
cutâneas apresentadas por indivíduos não sensíveis podem ser decorrentes da ativação do
sistema in vivo. Conforme mostrado na literatura (Peng, Yang & Simons, 1996 e Peng &
108
Simons, 1997) pessoas sensíveis às picadas de mosquitos apresentam anticorpos da classe
IgE responsáveis pelo resultado positivo ao prick test. Por outro lado, as pessoas
consideradas não sensíveis apresentam gamaglobulinas séricas contra constituintes de
saliva e extratos dos mosquitos e, algumas dessas pessoas, apresentam reações cutâneas
tipo imediata, embora negativas ao prick test.
Nossos resultados indicam que essas reações inflamatórias em pessoas
consideradas não sensíveis podem ser devidas também à ativação do Complemento. As
anafilatoxinas além de atrair leucócitos, atuam sobre mastócitos e basófilos induzindo a
liberação de mediadores inflamatórios. Estas células são muito importantes nesses
processos visto que tem receptores também para anticorpos da classe IgG. (Zhao et al,
2006). A fixação desses anticorpos e ligação dos antígenos resulta na ativação dessas
células e liberação de mediadores. A ativação do sistema Complemento por complexos
antígeno anticorpo depositados em pequenos vasos e conseqüente atração de neutrófilos,
intensifica os efeitos resultantes da ativação de mastócitos e basófilos, mesmo na ausência
de IgE.
A ativação do sistema Complemento in vivo tem uma função importante que é
facilitar a solubilização e eliminação de imunocomplexos. Os complexos imunológicos
fixam C1 e também os fragmentos de C4 e de C3 gerados durante a ativação do sistema. O
componente macromolecular C1 retarda a precipitação dos imunocomplexos de modo
dose-dependente, porque reduz as interações entre as regiões Fc das imunoglobulinas. A
clivagem de C4 resulta em um fragmento, C4b, que se liga covalentemente ao Fab da IgG.
A ligação de C4b ao complexo tem pouco efeito direto em sua solubilidade, mas permite a
formação da C3 convertase da via clássica que cliva C3, gerando C3b, o qual se liga ao
imunocomplexo tornando-o solúvel. A ativação de C3 é uma etapa essencial na inibição
da precipitação dos imunocomplexos. A última etapa compreende a amplificação da
ativação do Complemento, devido à deposição inicial de C3b, no complexo, e à ligação de
mais moléculas de C3b à sua rede, impedindo as interações Fc-Fc, as quais são
responsáveis pela rápida agregação do complexo (Möller, 1979). Além disso, a presença
do C3b facilita sua remoção via receptores de CR1, por hemácias circulantes que carreiam
esses complexos para o baço ou fígado onde são fagocitados (Krych-Goldberg &
Atkinson, 2001).
A ineficiência destes mecanismos pode levar à deposição dos complexos antígeno-
anticorpo nos tecidos, levando a um processo inflamatório com conseqüente lesão tecidual
109
(Hebert, 1991). Os imunocomplexos que não possuem habilidade para ativar a via clássica
do sistema complemento, rapidamente, formam agregados grandes, os quais podem se
depositar nos tecidos. Uma vez depositados, os complexos podem ativar a via alternativa,
para promover a sua solubilização. A reação de solubilização por esta via não é muito
eficiente e requer intensa ativação do complemento, gerando uma grande quantidade das
anafilatoxinas C3a e C5a (Jelezarova, Vogt & Lutz, 2000 e Jelezarova, Luginbuehl &
Lutz, 2003). As classes e subclasses de imunoglobulinas presentes nesses complexos é
que influenciam a ativação do Complemento. Além disso, outras propriedades dos
complexos imunológicos tais como afinidade do anticorpo, proporções antígeno-anticorpo
e densidade dos epítopos também afetam a ativação do Complemento (Tao, Smith &
Morrison, 1993).
A ativação do Complemento pelos imunocomplexos compostos pelos antígenos do
mosquito e anticorpos circulantes poderia impedir a exacerbação das reações
imunológicas, ocasionadas pela picada do mosquito em alguns indivíduos, uma vez que,
estes antígenos seriam removidos de forma mais rápida e eficiente do que aqueles
antígenos que não são reconhecidos por anticorpos ou que possuem baixa antigenicidade.
Quando os complexos não são removidos e depositam-se, levando à ativação do
Complemento, ocorre a liberação das anafilatoxinas em grande quantidade contribuindo
para as reações cutâneas observadas em alguns indivíduos. Por outro lado, sabe-se que as
reações alérgicas decorrentes da deposição de complexos imunológicos (reação de Arthüs)
pode ser iniciada pela ativação de mastócitos por anticorpos da classe IgG (Zhao et al,
2006). A ativação de mastócitos e basófilos leva à liberação de histamina com aumento da
permeabilidade vascular e deposição tecidual dos complexos Ag-Ac (Getahun & Heyman,
2006).
A formação de imunocomplexos entre antígenos dos mosquitos e anticorpos in
vivo provavelmente favorece a remoção desses complexos formados nos sítios das
picadas. No caso da deposição de tais complexos, o sistema Complemento é ativado in situ
podendo contribuir para as reações inflamatórias do tipo Arthüs observadas (Marzocchi-
Machado & Lucisano-Valim, 1997).
Anticorpos das classes IgG e IgM, que reconhecem constituintes nos extratos de
mosquitos, estão presentes nos soros de indivíduos considerados não alérgicos a picadas.
As reações cutâneas observadas podem resultar da ativação do sistema Complemento.
Nossos resultados mostram que esses extratos são constituídos de inúmeros componentes
reconhecidos por anticorpos das classes IgM e IgG tanto de pessoas não sensíveis quanto
110
de pessoas sensíveis. Neste último caso, a ativação do Complemento pela via clássica
pode contribuir para o agravamento das reações alérgicas como na urticária papular. Além
disso, demonstramos que alguns constituintes podem ativar o Complemento pela via
alternada como, por exemplo, os da fração XI (Fig. 12). A importância desse processo in
vivo pode ser deduzida a partir dos resultados de quimiotaxia de neutrófilos. Como
observamos, esta fração que ativa mais a via alternada do Complemento também é a que
tem maior atividade quimiotática (Fig. 18). Demeure e colaboradores, em 2005,
demonstraram que a saliva de Anopheles pode estimular mastócitos a liberar substâncias
quimiotáticas que levam à infiltração de neutrófilos para o local da picada, entretanto, os
extratos utilizados nesse trabalho não apresentaram atividade quimiotática sobre
neutrófilos na ausência de Complemento ativo.
Portanto, após a picada do inseto, pode ocorrer a ativação do Complemento pela
via alternada o que contribuiria para o desencadeamento das reações alérgicas.
Por outro lado, tem sido demonstrado que a severidade dos sintomas alérgicos está
relacionada com a intensidade da ativação do Complemento como, por exemplo, de
reações alérgicas ao pólen. Nesse caso, esses produtos da ativação do Complemento
podem intensificar os mecanismos patológicos das reações mediadas por IgE tais como a
desgranulação de mastócitos e a quimiotaxia e ativação de eosinófilos. (Varga et al, 2003)
Além de efeitos biológicos importantes tais como a liberação de histamina e
aumento da permeabilidade vascular, outras atividades são atribuídas às anafilatoxinas
C3a e C5a (Sunyer, Boshra & Li, 2005). Esta última anafilatoxina pode amplificar a
resposta inflamatória por induzir a produção de proteínas inflamatórias de macrófagos
como MIP-2, MIP-1α, MIP-1β, proteínas quimioatraentes de neutrófilos e monócitos,
TNF, IL-1 e IL-6 (DiScipio & Schraufstatter, 2007).
Por outro lado, a ativação do complemento induzida por alérgenos resulta na
formação de C5a e C3a que podem afetar, de maneiras distintas, o estágio de
sensibilização nas reações de hipersensibilidade do tipo I. A formação de citocinas do tipo
Th2 e anticorpos da classe IgE é estimulada pela formação de C3a, enquanto a presença de
C5a inibe este processo. Além disso, na fase efetora da reação alérgica, tanto C3a quanto
C5a, podem afetar o processo mediado por IgE nas reações de hipersensibilidade do tipo I
(Köhl & Wills-Karp, 2007).
111
Vários estudos sugerem que as anafilatoxinas regulam o desenvolvimento e a
magnitude das respostas imunológicas adaptativas. Há ainda evidências que indicam que a
sinalização realizada pelo C5aR na região de contato entre células dendríticas e linfócitos
T é importante para proteger o organismo, impedindo o desenvolvimento de uma resposta
imunológica adaptativa do tipo TH2 (Peng et al, 2005).
Em contraste com o C5a, C3a e seu receptor (C3aR) são necessários para uma
resposta efetiva do tipo Th2, após o estímulo imunológico com o alérgeno. Camundongos
C57BL/6 deficientes de C3aR apresentaram uma reduzida produção de citocinas do tipo
TH2 (IL-4, IL-5 e IL-13), acarretando diminuição da inflamação eosinofílica, produção de
IgE e muco em um modelo de alergia pulmonar mediada por Aspergilus (Drouin et al,
2002).
Portanto, a demonstração de que o sistema Complemento humano é ativado por
extratos de corpo total do mosquito C. quinquefasciatus sugere que este sistema é parte
importante dos mecanismos patológicos das reações cutâneas tanto em indivíduos
sensíveis quanto não sensíveis às picadas de mosquitos. É possível ainda que, o
Complemento seja importante na imunopatogênese da alergia às picadas de mosquitos
visto que as anafilatoxinas têm papel na modulação da polarização Th1/Th2 (Hawlisch et
al., 1998). Entretanto, tendo em vista a complexidade desses extratos e sua capacidade de
ativar o Complemento por diferentes vias, a contribuição de cada componente só poderá
ser demonstrada após sua purificação e identificação.
112
CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, podemos concluir que:
Os diferentes extratos obtidos a partir do corpo do C. quinquefasciatus são capazes
de consumir in vitro o sistema Complemento humano;
O ECT é capaz de ativar o sistema Complemento pela via clássica, possivelmente,
através da formação de complexos antígeno-anticorpo dada à presença de
anticorpos nos soros humanos capazes de reconhecer os constituintes do mosquito;
O fracionamento do ECT em coluna de troca iônica pode separar constituintes com
atividade antigênica identificados por anticorpos das classes IgM e IgG;
As frações cromatográficas são capazes de ativar o sistema Complemento;
A ativação do Complemento em soro tratado com EGTA-Mg2+ sugere que alguns
componentes do C. quinquefasciatus são capazes de ativar o sistema também pela
via alternada;
A ativação do Complemento por extratos (ECT e ECTx) e frações (FrI e FrXI)
antigênicas do mosquito gera anafilatoxinas capazes de promover a quimiotaxia de
neutrófilos humanos;
O extrato ECTx e a fração Fr XI que ativam o sistema Complemento pela via
alternada são mais eficientes em promover a quimiotaxia de neutrófilos;
Nenhum constituinte do mosquito foi capaz de promover a quimiotaxia de
neutrófilos na ausência de Complemento ativo;
Os resultados in vitro da ativação do Complemento pelos constituintes do
mosquito C. quinquefasciatus sugerem que in vivo o Complemento também estaria
participando das reações alérgicas observadas após a picada do mosquito, tanto em
indivíduos sensíveis quanto em indivíduos considerados não sensíveis.
113
ANEXOS
Ficha de Anamnese do Paciente
114
Termo de Consentimento Para Participar do Estudo
115
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