Atividade Antibacteriana in Vitro de Extratos de Rhizophora Mangle L

7/23/2019 Atividade Antibacteriana in Vitro de Extratos de Rhizophora Mangle L.

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Recebido para publicao em 17/09/2009Aceito para publicao em 11/01/2011

Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.13, n.3, p.305-310, 2011.

At iv idade antibacteriana in vitrode extratos de Rhizophora mangleL.

FERREIRA, F.S.1; SANTOS, S.C.1*; BARROS, T.F.1; ROSSI-ALVA, J.C.2;FERNANDEZ, L.G.31 Programa de Ps-Graduao em Microbiologia, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal da Bahia, Ondina,

40170-290, Salvador-Brasil *[email protected] 2Laboratrio de Estudos em Meio Ambiente, Superintendncia

de Pesquisa e Ps-Graduao, Universidade Catlica do Salvador, Pituau, 41740-090, Salvador-Brasil 3Laboratrio

de Bioqumica, Biotecnologia e Bioenergia, Departamento de Biofuno, Instituto de cincias da Sade, Universidade

Federal da Bahia, Vale do Canela, 40160-000, Salvador-Brasil

RESUMO:Ensaios para avaliar o potencial antibacteriano deRhizophora mangle(mangue-vermelho),coletada no municpio de Conde, Bahia, foram realizados com cepas bacterianas Gram-positivas(Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Micrococcus luteusATCC 9341) e Gram-negativas (EcherichiacoliATCC 10536, Salmonella Cholerea-suis 10708, Klebsiela pneumoniaeATCC 700603 ePseudomonas aeruginosaATCC 15442). A atividade antibacteriana foi avaliada pelos mtodos dedifuso em disco e concentrao inibitria mnima (CIM), e os resultados analisadosestatisticamente. Os resultados do ensaio de difuso em disco mostraram diferena significativaquanto sensibilidade dos micro-organismos frente aos extratos testados (p


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possuem atividade biolgica, muitas vezes jconfirmada pelo uso popular e comprovadacientificamente (Miguel et al., 2005).

As espcies vegetais para uso medicinal tmrecebido ateno especial pelos diferentessignificados que as plantas medicinais assumem nassociedades como recurso biolgico e cultural,destacando-se o potencial gentico para o

desenvolvimento de novas drogas, possvel fonte derecursos financeiros, atravs de sua comercializaopara o resgate e fortalecimento da identidade culturale como acesso primrio sade de muitascomunidades (Da Silva, 2006).

O conhecimento sobre o potencialteraputico dos vegetais tem despertado o interessecientifico, buscando nesse conhecimento, novoscaminhos para o controle e tratamento de diversasdoenas (Coutinho, 2004). Pesquisas de tal naturezano Brasil so de grande valia, pelo fato do pas serconsiderado um dos maiores reservatrios debiodiversidade do mundo e, alm disso, a grandeextenso territorial abriga diversos tipos deecossistemas, cada um com as particularidades, oque torna verdadeira fonte quase que inesgotvel demolculas a serem descobertas.

Rhizophora mangle L., conhecidapopularmente como mangue-vermelho, espcieendmica da vegetao de manguezal pertencente famlia Rhizophoraceae; possui carter arbreo comfolhas simples e adaptaes fisiolgicas notveisfrente aos substratos anaerbicos tpicos domanguezal, os rizforos. Tais estruturas soadaptaes caulinares ricas em lenticelas, que

aumentam a aerao e atuam diretamente na fixaoda espcie no substrato lodoso (Lamberti, 1966). Omangue-vermelho rico em substncias fenlicas,como taninos, que so largamente utilizadas naproduo de corantes. Algumas propriedadesfarmacolgicas de R. mangletm sido determinadas,como as atividades antiinflamatria (Marrero et al.,2006), antioxidante (Berenguer et al., 2006),cicatrizante (Fernandez et al., 2002); contra lcera(Perera et al., 2001; Berenguer et al., 2006) ehipoglicmica (Alarcon-Aguilara et al., 1998).

A descoberta de novas drogas para seremempregadas no controle de micro-organismos de

suma importncia para a sade populacional e campopromissor para o desenvolvimento tcnico cientfico,visando descoberta de novas molculas queapresentem atividades biolgicas importantes, como o caso dos antimicrobianos. Tal fato vai fornecerinformaes cientficas para populaes que utilizamvegetais de forma emprica, contribuindo para amelhoria da sade das pessoas que tem a naturezacomo a grande farmcia, alm de possibilitar a geraode novas patentes de inveno e/ou de processos.Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo

avaliar a atividade antibacteriana in vitro de extratosbrutos da raiz, casca e folhas de Rhizophora mangleL., oriundas da regio de Siribinha, situada noMunicpio do Conde, Bahia, Brasil.

MATERIAL E MTODO

Material VegetalAs partes vegetais (casca, raiz e folha) de

Rhizophora mangle foram coletadas no municpio deConde, na regio litoral norte do Estado da Bahia,Brasil, entre as coordenadas 114643 latitude Sul e373236 longitude Oeste (Magellan, GPS 315), deacordo com a metodologia descrita por Campos(1991). A identificao da espcie foi realizada peloInstituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE)e a exsicata se encontra depositada no acervo doHerbrio Radambrasil (HRB) sob o nmero de registro51500.

Extrato BrutoOs extratos brutos foram preparados atravs

do mtodo de macerao (48 h), utilizando-se aproporo de 1:3, sendo 1 g de cada estrutura vegetaltriturada para 3 mL de etanol (Merck) a 70% (v/v)(Matos, 1997). Os extratos foram fil trados em papelfiltro qualitativos (Quanty, ref. noJP42) num sistemade vcuo (Marconi, MA 057/1) e concentrados atravsdo evaporador rotatrio (Heidolph, Laborata 4000) a40C, sob presso reduzida, e por liofilizao(Labconco, Freezone 4.5) para eliminao total dosolvente (Santos et al., 2010). Os extratos foram

armazenados em frasco mbar e conservados nodessecador at o preparo das solues em diferentesconcentraes.

Micro-organismosSeis cepas bacterianas foram usadas nos

ensaios de sensibilidade: Staphylococcus aureusATTC 6835, Micrococcus luteus ATCC 9341,Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonasaeruginosa ATCC 15442, Salmonella Cholerea-suisATCC 10708 e Klebsiella pneumoniae ATCC 700603.As cepas bacterianas tm origem da bacterioteca doInstituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade

(INCQS). As cepas bacterianas foram mantidas emagar triptcasena de soja (TSA) (Merck) a 4C.

Mtodo de Difuso em DiscoO ensaio antimicrobiano foi realizado atravs

do mtodo de difuso em disco (Bauer et al., 1966),com base no documento M2-A8 (NCCLS, 2003a),onde cada disco estril de papel filtro (Qualit, ref. no

045.PF) de 6,0 mm de dimetro foi impregnado comalquotas (10 L) dos extratos de R. mangle nasconcentraes de 1, 2 e 3 mg disco-1(Santos et al.,



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2007). No teste controle negativo foi aplicado 10 Lde dimetilsufxido (DMSO) (Merck), utilizado naressuspenso dos extratos, e como controle positivofoi usado os antibiticos eritromicina (15 g disco-1)e ciprofloxacin (5 g disco-1) (Sensibiodisc, Cecon).O inculo bacteriano foi preparado por suspensodireta em soluo salina (0,9%), a partir de culturade 24 h em TSA. A suspenso foi ajustada atravs da

escala padro 0,5 de McFarland (1,5x108 UFC mL-1),sendo semeada em placa de Petri (90 mm dedimetro) contendo agar Mueller-Hinton (MHA,Himedia). Um conjunto predeterminado de discos deextratos vegetais foi colocado na superfcie do AMH.As placas foram incubadas na estufa a 37C por 24h. Aps o perodo de incubao foi realizada a leiturado dimetro dos halos de inibio total de crescimentobacteriano, incluindo o dimetro do disco. Os halosforam medidos em milmetro com auxlio de halmetro.

Determinao da concentrao inibi tria

mnima (CIM)Os ensaios de sensibilidade de microdiluioem caldo foram feitos, seguindo as recomendaesda National Committee for Clinical LaboratoryStandards (2003b). Os testes foram realizados emcaldo Mueller-Hinton (CMH, Himedia) contido emmicroplacas de 96 poos. Os extratos brutos dacasca, raiz e folha de R. mangleforam aplicados nospoos, seguindo a tcnica de diluio seriada, nasconcentraes de 0.156, 0.312, 0.625, 1.25, 2.5, 5,10, 20 mg mL-1. Foi realizada diluio (0.5, 1, 2, 4, 8,16, 32 mg mL-1) de cloranfenicol (Henrifarma) comocontrole positivo e DMSO como controle negativo. A

partir de uma suspenso ajustada da escala padro0,5 de McFarland das cepas bacterianas testadas,foram feitas diluies com gua destilada de 1:10 (v/v) para obter uma concentrao final de bactrias de5 x 104UFC mL-1. As placas foram incubadas a 37Cpor 24 h. A leitura foi realizada atravs da mudanade cor do revelador cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazlio(TTC, Nuclear), considerando o resultado positivo aausncia de colorao e negativo na presena decolorao rosa-avermelhada (Santos et al., 2010).

Anlise Estatsti ca

Todos os testes de sensibilidade dos extratosvegetais foram realizados atravs de testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, visando comparar astendncias centrais de inibio do crescimentobacteriano entre as estruturas vegetais (raiz, cascae folha) da espcie em estudo (Callegari-Jacques,2003). Foi utilizado o programa estatstico GraphPadInsTat (verso 3) para anlise dos dados. Os testesforam considerados significantes quando o valor de pfoi menor que 0,05.

RESULTADO E DISCUSSOOs extratos vegetais apresentaram atividade

antibacteriana frente aos micro-organismos testados,com exceo da E. coli. O extrato da casca foi capazde inibir o crescimento das cepas ATCC nas trsconcentraes utilizadas (Tabela 1). O extrato da folhainibiu o crescimento das cepas Gram-positivas e deK. pneumoniae, sendo que para o M. luteusa inibio

s foi evidenciada a partir da concentrao de 2 mgdisco-1. O extrato da raiz inibiu o crescimento dascepas de K. pneumoniaeeS.Cholerea-suisnas trsconcentraes analisadas e o crescimento da cepade M. luteussomente a partir de 3 mg disco -1. Oscontroles utilizados para a avaliao do desempenhodos ensaios corresponderam satisfatoriamente. ODMSO utilizado como controle negativo no inibiu ocrescimento das cepas padro e os antibiticos(Ciprofloxacin e Eritromicina) apresentaram halos deinibio de acordo ao perfil de sensibilidade descritono NCCLS (2003a) (Tabela 1). A anlise estatsticamostrou que existe diferena significativa (Kruskal-Wallis, p


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Micro-organismoConcentrao Casca Folha Raiz ERI CIP

mg disco-1

MA* DP MA* DP MA* DP MA* MA*

S. aureus

1 8,0 0,0 7,0 0,0 26,0

2 10,0 0,0 8,0 0,0 26,0

3 13,3 1,0 10,0 0,0 26,0

M. luteus

1 10,0 0,0 16,0

2 12,0 0,0 10,0 0,0 16,0

3 14,3 1,0 12,0 0,0 9,3 0,9 18,0

E.coli

1 12,0

2 12,0

3 14,0

K.penumoniae

1 12,0 0,0 10,0 0,0 7,0 0,0 26,0

2 14,0 0,0 12,0 0,0 9,3 0,5 26,0

3 11,3 1,0 12,0 0,5 12,7 0,9 28,0

P.aeruginosa

1 8,0 0,0 36,0

2 8,0 0,0 36,0

3 7,7 1,0 38,0

S. Cholerea-suis

1 8,0 0,0 12,7 0,9 30,0

2 9,3 1,0 18,0 0,0 30,0

3 10,0 0,0 20,7 0,9 30,0

TABELA 1.Mdia e desvio padro dos halos de inibio (mm) obtidos pelo mtodo de difuso em disco com osextratos brutos (casca, folha e raiz) de R. manglefrente s cepas padro.

* Halos de inibio incluindo o dimetro do disco (6 mm); Ausncia de inibio; MA mdia aritmtica do dimetro do halo de inibiobacteriana; DP desvio padro do dimetro do halo de inibio bacteriana; ERI eritromicina (15 g disco-1); CIP ciprofloxacin (5 g disco-1).

A concentrao inibitria mnima do extratoda folha apresentou o melhor desempenho para inibiro crescimento das cepas Gram-positivas, enquantoo extrato da casca foi mais eficaz para as cepasGram-negativas (Tabela 2). A util izao deformulaes de R. mangle contra processosinfecciosos provocados por Salmonelaprecisam sermelhor estudadas, mas o fato de ter sido encontradauma boa sensibilidade da bactria do mesmo gneroutilizada neste trabalho, permite inferir que os extratosso promissores para serem utilizados contrainfeces causadas por causada pela bactriaSalmonella. O extrato da raiz apresentou maior CIM

(1250-2500 g mL-1) quando comparado com asoutras partes vegetais, indicando que as molculasbioativas com propriedades antimicrobianas estodistribudas em maiores concentrao na casca e nafolha. Os extratos da casca, folha e raiz mostraramdiferena significativa (p=0.0183) quando comparadosentre si, pelo mtodo de Kruskal-Wallis. Os resultadosencontrados para os valores da CIM do Cloranfenicol(Tabela 2) esto de acordo com as normas da Clinicaland Laboratory Standards Institute (2005).

O potencial antibacteriano dos extratos

brutos de R. mangleconfirma os relatos da literaturacom outro membro da famlia Rhizophoraceae,Rhizophora apiculata, que possui o constituinte 2,6-dimethoxy-p-benzoquinone com atividade inibitriacontra fungos e bactrias (Kokpol et al., 1993). Estudocom o extrato da casca de R. apiculatarevelou quetanino hidrossolvel possui atividade antimicrobiana(Lim et al., 2006). A ao anti-sptica e antimicrobianade R. mangleparece estar ligada em grande parte apresena dos taninos. Segundo Snchez et al. (1998),o extrato aquoso da casca de R. mangleapresentapolifenis (80%), representados na maioria por taninospolimricos (80%) e taninos hidrolisveis (20%), onde

se destacam as presenas de epicatequina,catequina, cido clorognico, cido glico, cidoelgico, assim como galotaninos, elagitaninos etaninos condensados. Outras estruturas sorelatadas, entre elas carboidratos livres epolomerixados (xilose, ramnose, fucose, glicose,arabinose, manose e galactose), cidos graxos decadeias longas saturadas e insaturadas (C12:0 atC24:0), leos essenciais e f itoesteries. Todos estesgrupos mostraram atividade antimicrobiana contracepas de Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.



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Rhizophora mangle vegetal bastanteestudado na Amrica Central. Cuba apresenta umdos maiores, se no o maior nmero de publicaesreferentes ao uso teraputico da espcie tanto namedicina humana quanto na veterinria. Fernandezet al. (2002) avaliaram o poder cicatrizante e anti-sptico do mercrio-cromo e do extrato da R. mangleem feridas cirrgicas, obtendo melhor resultado nospacientes que foram tratados com o extrato. Relatatambm que a pelcula formada pela interao doextrato com as protenas favorece o isolamento dotecido do meio externo, acelerando o processo decicatrizao e prevenindo infeces secundrias. O

gnero Rhizophorapossui determinadas substnciaspresentes no extrato, como por exemplo, os taninose polifenis (Bandaranayake, 2002), que so capazesde interagir com estruturas peptdicas formandograndes aglomerados, o que mais uma vez explicariaa formao da pelcula protetora.

No Brasil, o aumento acentuado do consumode fitoterpicos ocorre basicamente pelos mesmosmotivos do restante do mundo. Contudo, existeatualmente maior nmero de profissionais envolvidosnos mais diversos trabalhos com plantas medicinaise/ou fitoterpicos, seja na pesquisa, fomento oudifuso. Outro motivo de suma importncia so os

programas oficiais de sade implementados pormuitos governos estaduais e municipais, como asaes desenvolvidas nos Estados do Cear e Paran.Esses programas vos alm da simples distribuiode fitoterpicos ou recomendao de uso para apopulao mais carente desses estados/municpios.Procuram tambm incentivar o cultivo e produoextrativa sustentvel de plantas medicinais. Dessamaneira, tambm so criadas alternativaseconmicas para as comunidades rurais, que a cadadia perdem o poder de competitividade diante da

Micro-organismo Parte VegetalCIM (g mL-1)

Extrato Cloranfenicol

S. Cholerea-suis

Casca

625 8

S. aureus 625 16

K. peneumoniae 313 4M. luteus 156 8

S. aureus

Folha

313 16

K. peneumoniae 1250 8

M. luteus 313 4

S. Cholerea-suis

Raiz

2500 8

K. pneumonia 1250 4

M. luteus 2500 8

TABELA 2.Determinao da concentrao inibitria mnima dos extratos de R. manglefrente a cepas bacterianasATCC.

chamada economia globalizada (Souza & Miranda,2006). Porm, fundamental a realizaes dos testestoxicolgicos e imunolgicos antes da possvelutil izao de plantas medicinais com finsteraputicos.

Este estudo demonstrou o potencialantibacteriano dos extratos brutos da casca, folha eraiz de R. mangle, confirmando os relatos da famliaRhizophoraceae como interessante fonte deconstituintes antibacterianos. As anlises mostraramque no existe uma parte botnica com maioratividade, pois todas apresentaram perfisantibacterianos diferenciados. Este estudo serve de

subsdio a futuros experimentos que visem elucidaras substncias ativas dos extratos de R. manglecomatividade antimicrobiana, alm de ratificar aimportncia das informaes etnofarmacolgicas demuitas comunidades tradicionais para seleo deplantas com propriedades biolgicas.

AGRADECIMENTOAo Laboratrio de Estudos em Meio

Ambiente (LEMA) da Universidade Catlica doSalvador (UCSal) e ao Laboratrio de Pesquisa emMicrobiologia Clnica (LPMC) da Universidade Federal

da Bahia (UFBA).

REFERNCIA

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