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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
RENAN GUEDES DE BRITO
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO CITRONELOL EM ROEDORES
ARACAJU-SE 2013
ii
RENAN GUEDES DE BRITO
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO CITRONELOL EM ROEDORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior
Co-Orientador: Prof. Dr. Waldecy de Lucca Júnior
ARACAJU-SE 2013
iii
RENAN GUEDES DE BRITO
ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA E ANTI-INFLAMATÓRIA DO CITRONELOL EM ROEDORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.
Aprovada em: _____/_____/_____
_________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Lucindo José Quintans júnior
_________________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Emiliano de Oliveira Barreto
_________________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. Daniel Badauê Passos Júnior
PARECER
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iv
AGRADECIMENTOS
“Agradeça, agradeça, agradeça! Agradeça sempre! Agradeça por tudo que
você tem, por tudo que recebe. Agradeça por tudo que ainda vai receber! Agradeça
até por aquilo que não entende e também não aceita!
Essa é a melhor maneira e também a mais inteligente de ter uma atitude
positiva em relação à vida! O próprio ato de agradecer atrai o melhor para você.
Agradeça pelos fracos, pelos chatos, pelos pobres de espírito. Agradeça
pelos amigos, por aquelas pessoas que te agradam!
Agradeça pelos momentos felizes. Não deixe de manifestar gratidão aos
membros de sua família. Seus pais, seus irmãos são os vínculos mais fortes que
você tem!
O ato de agradecer ajuda o coração! Ajuda a mente a se abrir! Talvez para
sair desse buraco que muitas vezes você se encontra é preciso agradecer.
Experimente agradecer a tudo e a todos! Agora!
Não é possível você passar por essa vida sem ter o hábito de agradecer!
Gratidão continuada, entende isso? Demonstrar pelo seu exemplo, pelos gestos,
pelo afeto, pelo olhar, pelo coração, a gratidão que você tem por ter vindo a esse
mundo!
Você sempre terá algo pelo que agradecer e quando começar a fazer isso,
observe-se! Fique atento e perceba como a vida fica mais gostosa de ser
compartilhada. Assim como é certo que é dando que se recebe, também é verdade
que é agradecendo que se alcança!”
Luiz Carlos Mazzini
Por isso, gostaria de agradecer a meus pais, irmã, tios, prima, orientador, co-
orientador, professores, amigos e a todos aqueles que em algum momento, por
menor que seja, estiveram ao meu lado, apoiando-me e torcendo. Muito obrigado
por existirem em minha vida e por me dar a oportunidade de agradecer todo o
aprendizado humano que venho obtendo através de vocês. A energia que nos une é
inexplicável!!!
Renan Guedes de Brito
v
RESUMO
Renan Guedes de Brito. Avaliação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do citronelol em roedores. Aracaju, Sergipe, 2012.
O Citronelol (CT) é um monoterpeno alcóolico presente no óleo essencial de algumas plantas medicinais, como o Cymbopogon citratus. Alguns efeitos farmacológicos tais como anti-espasmódico e atividade anticonvulsivante já foram descritos, sendo desconhecido seu possível efeito antinociceptivo e anti-inflamatório. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível ação antinociceptiva e anti-inflamatória do CT em roedores. Para tanto, foram utilizados 362 camundongos Swiss machos (25 a 35 g) com 2 a 3 meses. Os animais foram divididos em grupos e foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou droga padrão (i.p.). Para avaliação da atividade antinociceptiva, os animais foram submetidos ao teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético (0,85%), ao teste da formalina (1%) e ao teste da placa quente. Com o intuito de avaliar a ação do CT na nocicepção orofacial, foram realizados os testes de dor orofacial induzida por formalina (2%), capsaicina e glutamato. A coordenação motora dos animais foi avaliada através do teste da coordenação motora (rota rod) e do teste da movimentação espontânea. A atividade anti-inflamatória foi avaliada a partir do modelo de pleurisia induzido por carragenina, realizando-se a contagem de leucócitos totais. Foi quantificado, ainda, através do ensaio imunoenzimático ELISA, o TNF-α e a geração de óxido nítrico por macrófagos. Para determinar a ação central, os animais foram tratados com CT, nas três doses, ou veículo e, noventa minutos após, foram anestesiados, perfundidos, os cérebros extraídos e cortados em criostato. As secções cerebrais foram submetidas ao protocolo de imunofluorescência para proteína Fos. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. As diferenças entre os grupos foram analisadas por meio do teste de variância ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. A administração intraperitoneal de CT produziu uma redução significativa (p < 0,001) das contorções abdominais. Na nocicepção induzida por formalina, o pré-tratamento com CT causou um efeito antinociceptivo significativo (p <0,01) em ambas as fases do teste. No teste da placa quente, o tempo de reação aumentou significativamente em todas as doses de CT (p < 0,05 ou p < 0,001), tendo seu efeito antagonizado pela naloxona. Nos três testes de nocicepção orofacial, o CT produziu uma redução significativa (p < 0,001) no tempo de fricção da região orofacial. Não foram observadas alterações no teste da coordenação motora e no teste da movimentação espontânea. Na avaliação da atividade anti-inflamatória, o tratamento com CT causou uma diminuição significativa (p < 0,01) no número total de leucócitos, diminuindo os níveis de TNF-α (p < 0,05) e de óxido nítrico em macrófagos (p < 0,05). Através da imunofluorescência, observou-se que o CT é capaz de ativar signicativamente (p < 0,05) neurônios do bulbo olfatório, do córtex piriforme, do córtex retroesplenial e da substância cinzenta periaquedutal. Conclui-se, assim, que o CT apresenta ação antinociceptiva e anti-inflamatória, tendo sua ação mediada por mecanismos centrais e periféricos. Descritores: Monoterpenos, Citronelol, Dor, Inflamação, Sistema Nervoso Central.
vi
ABSTRACT
Renan Guedes de Brito. Evaluation of the antinociceptive and anti-inflamatory activity of citronellol in rodents. Aracaju, Sergipe, 2012.
The Citronellol (CT) is an alcoholic monoterpene present in the essential oil of some medicinal plants such as Cymbopogon citratus. Some pharmacological effects such as the antispasmodic and anticonvulsant activities have been described, however it’s possible antinociceptive and anti-inflammatory effect is unknown. Thus, the objective of this study was to evaluate the possible antinociceptive and anti-inflammatory action of CT in rodents. Therefore, 362 male Swiss mice (25-35 g) with 2 to 3 months were used. The animals were divided into groups and were treated with CT (25, 50 and 100 mg/kg, i.p.), vehicle (saline solution 0.9% + Tween 80 0.2%, i.p.) or standard drug (i.p.). To evaluate the antinociceptive activity, the animals were submitted to the test of abdomnal constrictions induced by acetic acid (0.85%), the formalin test (1%) and hot plate test. In order to evaluate the effect of CT on orofacial nociception, it was conducted the orofacial test induced by formalin (2%), capsaicin and glutamate. Motor coordination was assessed using the motor coordination test (rota rod) and the spontaneous movement test. The anti-inflammatory activity was evaluated based on the model of carrageenan-induced pleurisy, making up the total leucocyte count. It was also quantified, by using ELISA, TNF-α and nitric oxide generation by macrophages. To determine the central action, the animals were treated with CT, in three doses, or vehicle and, after ninety minutes, were anesthetized, perfused, the brains removed and cut in a cryostat. The brain sections were subjected to immunofluorescence protocol for Fos protein. Results are expressed as mean ± SEM Differences between groups were analyzed by using one way ANOVA test, and followed by Tukey test. Values of p < 0.05 were considered statistically significant. Intraperitoneal administration of CT produced a significant decrease (p < 0.001) of the abdominal constrictions induced by acetic acid. In nociception induced by formalin, the pretreatment with CT caused a significant antinociceptive effect (p <0.01) in both phases of the test. In the hot plate test, the reaction time increased significantly at all doses of CT (p < 0.05 or p < 0.001), while its effect was antagonized by naloxone. In the three orofacial nociception tests, the CT produced a significant decrease (p <0.001) in the face-rubbing time of the orofacial region. No changes were observed in the motor coordination and in the spontaneous movement test. In the evaluation of anti-inflammatory activity, treatment with CT gave rise to a significant decrease (p < 0.01) in total number of leukocytes, decreasing (p < 0.05) the levels of TNF-α and nitric oxide in macrophages (p < 0.05). By immunofluorescence, it was found that CT is able to activate signicantly (p < 0.05) neurons of the olfactory bulb, the piriform cortex, the restrosplenial cortex and the periaqueductal gray. So, it can be concluded that CT has antinociceptive and anti-inflammatory activity and its action is mediated by central and peripheral mechanisms.
Key-words: Monoterpenes, Citronellol, Pain, Inflammation, Central Nervous System.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química dos monoterpenos .......................................................... 6
Figura 2. Estrutura química do citronelol .................................................................... 8
Figura 3. Conexões entre as fibras aferentes primárias e a medula espinhal .......... 13
Figura 4. Anatomia das vias da dor .......................................................................... 14
Figura 5. Via descendente da dor ............................................................................. 15
Figura 6. Via sensitiva principal da face e da boca ................................................... 18
Figura 7. Processo de quimiotaxia realizado pelos leucócitos.................................. 20
Figura 8. Neutrófilos fagocitando Streptococcus, em azul ........................................ 21
Figura 9. Cascata de transcrição do NF- B .............................................................. 23
Figura 10. Resumo esquemático do teste de contorções abdominais induzidas por
ácido acético. ............................................................................................................ 37
Figura 11. Resumo esquemático do teste da formalina ........................................... 38
Figura 12. Resumo esquemático do teste da placa quente ...................................... 39
Figura 13. Resumo esquemático de teste de nocicepção orofacial induzida por
formalina.................................................................................................................... 41
Figura 14. Resumo esquemático do este de nocicepção orofacial induzida por
capsaicina. ................................................................................................................ 42
Figura 15. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por
glutamato................................................................................................................... 43
Figura 16. Resumo esquemático do teste da coordenação motora (Rota-rod). ....... 44
Figura 17. Resumo esquemático do teste da movimentação espontânea .............. 45
Figura 18. Resumo esquemático da pleurisia induzida por carragenina. ................. 46
Figura 19. Resumo esquemático da quantificação de leucócitos. ............................ 46
Figura 20. Resumo esquemático da quantificação de TNF-α. .................................. 47
Figura 21. Resumo esquemático da geração de óxido nítrico por macrófagos. ....... 47
Figura 22. Resumo esquemático do processo de perfusão, crioproteção e corte .... 48
Figura 23. Resumo esquemático do protocolo de imunofluorescência para proteína
Fos ............................................................................................................................ 50
Figura 24. Microscópio de fluorescência Olympus IX2-ICB, EUA ............................ 51
Figura 25. Efeito do citronelol (CT) no teste das contorções abdominais induzidas
por ácido acético em camundongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou
paracetamol (PAR, 100 mg/kg) foram administrados intraperitonealmete 30 min
viii
antes da injeção de ácido acético. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 8, por
grupo). ***p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo
teste de Tukey). ......................................................................................................... 53
Figura 26. Efeito do citronelol (CT) na nocicepção induzida por formalina em
camudongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou Morfina (MOR, 3
mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de
formalina. (A) representa a primeira fase e (B) representa a segunda fase do teste
da formalina. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6, por grupo). **p <0,01 ou
***p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de
Tukey). ...................................................................................................................... 54
Figura 27. Efeitos do CT sobre o teste da nocicepção orofacial induzida por
formalina. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg)
foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de formalina. (A)
primeira fase (0-5 minutos) e (B) segunda fase (15 a 40 minutos). Valores expressos
em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle
(ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ..................................................... 57
Figura 28. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por capsaicina.
Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram
administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores
expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao
controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey)......................................... 58
Figura 29. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por glutamato.
Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram
administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores
expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). **p < 0,01 e ***p < 0,001 quando
comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ................ 59
Figura 30. Tempo de permanência (s) no rota rod. Veículo (controle), CT (25, 50 e
100 mg/kg) ou Diazepam (DZP; 1,5 mg/kg) foram admnistrados intraperitonealmente
trinta minutos antes do início do teste. A resposta motora foi avaliada por 180 s.
Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando
comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ................ 60
Figura 31. Efeito do CT sobre a pleurisia induzida por carragenina. As análises
foram realizadas 4 h após a injecção de carragenina (300 ng/cavidade), avaliando-se
ix
o recrutamento de leucócitos totais (A), neutrófilos (B), células mononucleares (C) e
TNF-α (D). Os dados foram expressos em média ± e.p.m (n = κ/ por grupo). ++p <
0,01 e +++p < 0,001 em comparação ao controle. *p < 0,05, ** p < 0,01 e ***p < 0,001
em comparação ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey). ........ 62
Figura 32. Efeito do CT na geração de nitrito por macrófagos. As células foram
mantidas em meio de cultura (RPMI) ou pré-incubadas com CT por 24 horas, e em
seguida tratado com LPS (1 ng/mL) durante 24 h. Os níveis de nitrito nos
sobrenadantes de cultura foram avaliadas e os resultados foram expressos em
concentração (uM) de nitrito no meio de cultura. Os dados foram expressos em a
média ± e.p.m., sendo os valores obtidos em triplicado. ++p <0,01 em comparação
com o RPMI e *p < 0,05 quando comparado ao controle (veículo)(ANOVA, uma via,
seguido pelo teste de Tukey). ................................................................................... 63
Figura 33. A. Células FOS positivas no bulbo olfatório. Veículo (B; controle) ou CT
nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado
noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por
grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via
seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.. ................................ 64
Figura 34. A. Células FOS positivas no córtex piriforme. Veículo (B; controle) ou CT
nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado
noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por
grupo). **p < 0,01 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo
Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m. ....................................................... 64
Figura 35. A. Células FOS positivas no córtex retroespinal. Veículo (B; controle) ou
CT nas doses de 25mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado
noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por
grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via
seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.. ................................ 65
Figura 36. A. Células FOS positivas na substância cinzenta periaquedutal. Veículo
(B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p.,
foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ±
e.p.m. (n = 6/por grupo). *p < 0,5 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle
(ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.. .... 65
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características físicas das fibras aferentes nociceptivas. ......................... 11
Tabela 2. Efeito antinociceptivo do citronelol (CT) no teste da placa quente em
camudongos. ............................................................................................................. 56
Tabela 3. Efeitos do citronelol (CT) sobre a movimentação espontânea em
camudongos .............................................................................................................. 61
xi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
5-LOX – lipoxigenase 5;
5HT – serotonina;
AA – ácido araquidônico;
AINS – anti-inflamatórios não esteirodais;
AKT – proteína quinase B;
AMPc – adenosina 4.5-monofosfato cíclico;
AMPA – alfa -amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico;
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitário;
AP-1 – proteína ativadora 1;
APTN – núcleo anterior ipsilateral pretectal;
ATM – articulação temporomandibular;
B1 – receptor de bradicinina 1;
B2 – receptor de bradicinina 2;
BSA – soro albumina bovina;
CB1 – receptor canabinóide 1;
CEPA – comitê de ética em pesquisa animal;
COX-1 – ciclooxigenase 1;
COX-2 – ciclooxigenase 2;
CRM1 – receptor para e frio e mentol 1;
CT – Citronelol;
DNA – ácido desoxirribonucléico;
DPOC – doença pulmonar obstrutiva crônica;
ECA – enzima conversora de angiotensinogênio;
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético;
EMA – European Medicines Agency;
eNOS – óxido nítrico sintase endotelial;
EP1 – receptor de prostaglandina E subtipo 1;
EP2 – receptor de prostaglandina E subtipo 2;
EP3 – receptor de prostaglandina E subtipo 3;
EP4 – receptor de prostaglandina E subtipo 4;
ET1 – receptor de rndotelina isoforma 1;
xii
ET2 – receptor de endotelina isoforma 2;
ET3 – receptor de endotelina isoforma 3;
ETA – receptor de endotelina A;
ETB – receptor de endotelina B;
EUA – Estados Unidos da América;
FDA – Food and Drugs Agency;
FTIs - fatores de transcrição induzíveis;
GABA – ácido alfa-aminobutírico;
GEIs – genes de expressão imediata;
GMPc – guanosina monofosfato cíclico;
H1 – receptor de histamina 1;
H2 – receptor de histamina 2;
H3 – receptor de histamina 3;
H4 – receptor de histamina 4;
HIV – vírus da imunodeficência humana;
IASP – Associação Internacional para o Estudo da Dor;
ICAM-1 – molécula de adesão intercelular 1;
IL-1 – interleucina 1 beta;
IL-2 – interleucina 2;
IL-6 – interleucina 6;
IL-8 – interleucina 8;
IL-10 – interleucina 10;
IL-12 – interleucina 12;
IL-15 – interleucina 15;
IL-17 – interleucina 17;
IL-18 – interleucina 18;
IL-21 – interleucina 21;
IL-21R – receptor de interleucina 21;
IL-22 – interleucina 22;
IL-23 – interleucina 23;
IL-25 – interleucina 25;
IL-27 – interleucina 27;
IL-27R – receptor de interleucina 27;
IL-33 – interleucina 33;
xiii
IFN- – interferon gama;
IFN-α – interferon alfa;
IFN- – interferon beta;
IgG – imunoglobulina G;
iNOS – óxido nítrico sintase induzível;
nNOS – óxido nítrico sintase constitutiva;
LPS – lipopolissacarídeo;
LTB4 – receptor de leucotrieno B4;
LTC4 – receptor de leucotrieno C4;
LTD4 – receptor de leucotrieno D4;
LTE4 – receptor de leucotrieno E4;
MAPK – proteína cinase ativada por mitógenos;
MCP-1 – proteína quimioatraente a monócitos;
mGLUR – recetores glutamatérgicos metabotrópicos;
MHC – complexo principal de histocompatibilidade;
mRNA – ácido ribonucléico mensageiro;
NF-Κb – fator de transcrição nuclear kappa B;
NK – natural killer;
NMDA - N-metil-D-aspartato;
OMS – Organização Mundial da Saúde;
PAC – potencial de ação composto;
PAG – substância cinzenta periaquedual;
PGD – prostaglandina D;
PGE2 – prostaglandina E2;
PGFβα – prostaglandina Fβα;
PGJ2 – prostaglandina J2;
PIγK - fosfatidilinositol 3-quinase gama;
PBS – tampão fosfato salina;
PLAN2 – fosfolipase A2;
RSP – córtex restroesplenial;
RVM – medula rostroventral;
SARA – síndrome da angústia respiratória aguda;
SBCAL – Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório;
SIDA – síndrome da imunodeficiência adquirida;
xiv
SNC – sistema nervoso central;
SNP – sistema nervoso periférico;
TNF-α – fator de necrose tumoral alfa;
TNFR1 – receptor do fator de necrose tumoral 1;
TNFR2 – receptor do fator de necrose tumoral 2;
TRP – receptor de potencial transiente;
TRPA1 – receptor de potencial transiente de cátion 1;
TRPV1 – receptor de potencial transiente vanilóide 1;
TRPV3 – receptor de potencial transiente vanilóide 3;
TXA2 – tramboxano A2;
UFS – Universidade Federal de Sergipe;
VCAM-1 – molécula de adesão vascular da célula 1;
VOCsNa+ - canais operados com voltagem para sódio;
VR1 – receptor vanilóide 1;
xv
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
2 REVISÃO TEÓRICA................................................................................................. 3
2.1 PLANTAS MEDICINAIS ..................................................................................... 3
2.2 DOR ................................................................................................................. 10
2.3 INFLAMAÇÃO .................................................................................................. 18
2.4 PROTEÍNA FOS .............................................................................................. 33
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 35
3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 35
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 35
4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 36
4.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 36
4.2 SUBSTÂNCIAS ................................................................................................ 36
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA .......................................... 36
4.3.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético ................... 36
4.3.2 Teste da formalina ..................................................................................... 38
4.3.3 Teste da placa quente ............................................................................... 39
4.4 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO ..................................................... 40
4.4.1 Teste de nocicepção orofacial induzida por formalina ............................... 40
4.4.2 Teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina ............................. 41
4.4.3 Teste de nocicepção orofacial induzida por glutamato .............................. 42
4.5 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA ................................................. 43
4.5.1 Teste da coordenação motora (rota-rod) ................................................... 44
4.5.2 Teste da movimentação espontânea ......................................................... 44
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA ...................................... 45
xvi
4.6.1 Pleurisia induzida por carragenina ............................................................. 45
4.6.2 Quantificação de leucócitos ....................................................................... 46
4.6.3 Quantificação de TNF-α ............................................................................. 46
4.6.4 Geração de óxido nítrico por macrófagos .................................................. 47
4.7 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL .................................................................. 48
4.7.1 Perfusão, crioproteção e corte dos encéfalos ............................................ 48
4.7.2 Imunofluorescência para Fos ..................................................................... 49
4.7.3 Aquisição das imagens .............................................................................. 50
4.7.4 Análise das imagens .................................................................................. 51
4.8 EUTANÁSIA E DESCARTES DOS ANIMAIS .................................................. 51
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 52
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 53
5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA .......................................... 53
5.2 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO ..................................................... 56
5.3 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA ................................................. 60
5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA ...................................... 61
5.5 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL .................................................................. 63
6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 68
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 69
ANEXOS ................................................................................................................... 94
ANEXO 1 – ARTIGO 1: CITRONELLOL, A MONOTERPENE ALCOHOL,
REDUCES NOCICEPTIVE AND INFLAMMATORY ACTIVITIES IN RODENTS ... 95
ANEXO 2 – ARTIGO 2: CITRONELLOL REDUCES OROFACIAL NOCICEPTIVE
BEHAVIOUR IN MICE - EVIDENCE OF INVOLVEMENT OF RETROSPLENIAL
CORTEX AND PERIAQUEDUCTAL GREY AREAS ............................................ 103
ANEXO 3 - PROTOCOLO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE .................. 110
1
1 INTRODUÇÃO
A dor é definida como uma experiência sensorial e emocional desagradável
associada a dano tecidual real ou potencial (IASP, 2010), sendo reconhecida como
um problema de saúde pública, com importantes consequências físicas e
psicológicas, com alto ônus social e econômico (AZEVEDO et al., 2012). A
prevalência de dor na população adulta varia de 2% a 40%, com uma taxa de
prevalência média de 15% (MANCHIKANTI et al., 2011; HARKER et al., 2012),
ocasionando gastos anuais, apenas nos Estados Unidos (EUA), na ordem de 635
bilhões de dólares (GASKIN; RICHARD, 2012).
O recurso clínico mais eficaz no tratamento da dor é a terapia farmacológica.
Dentre os medicamentos mais utilizados, têm-se os opióides, drogas anti-
inflamatórias não-esteroidais (AINEs), drogas miorelaxantes, analgésicos periféricos
e os antidepressivos (DIONNE, 1997). No entanto, 40 a 60% dos pacientes não
respondem a farmacoterapia, pois alguns tipos de dor podem ser pouco responsivos
a analgésicos comuns (XU et al., 2012; CLAUW; ARNOLD; MCCARBERG, 2011).
Por este motivo, a pesquisa por novas propostas terapêuticas continua sendo uma
constante busca dos pesquisadores em todo o mundo (SRINIVASAN et al., 2001).
A avaliação do potencial terapêutico de plantas medicinais e de seus
constituintes tem sido objeto de incessantes estudos, em que já foram comprovadas
ações farmacológicas de algumas plantas (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).
Vários registros históricos mostraram a busca, nas plantas medicinais, para a cura
ou alívio de moléstias que têm atingido impiedosamente a humanidade. De modo
particular, aquelas indicadas para o tratamento de doenças com manifestações
neurológicas e distúrbios psiquiátricos têm apresentado interesse (QUINTANS
JÚNIOR et al., 2008), instigando os pesquisadores a estudar os efeitos destas
plantas sobre o Sistema Nervoso Central (SNC), principalmente na tentativa de
descobrir novos compostos (FLORENTINO et al., 2009).
BUTLER (2008) realizou um extenso levantamento sobre os medicamentos
liberados pelo Food and Drug Admnistration (FDA, EUA) na última década e
descreveu que cerca de 40% destes novos fármacos se origina de produtos
naturais. De forma geral, cerca de 25% a 30% de todas as drogas avaliadas como
agentes terapêuticos são derivados de produtos naturais (SOUSA et al., 2008).
2
Dentre os produtos naturais com interesse pela indústria farmacêutica
utilizados no desenvolvimento de novas propostas terapêuticas para o manejo de
condições dolorosas, destacam-se os monoterpenos, que são constituídos por duas
unidades isoprênicas, as quais são formadas por 5 carbonos cada, representando
cerca de 90% dos constituintes dos óleos essenciais (BAKKALI et al., 2008). Aos
monoterpenos estão associadas diversas atividades terapêuticas como efeitos
calmante, antioxidante, anticonvulsivante e analgésico (ZEYTINOGLU; INCESU;
BASER, 2003; DE SOUSA; QUINTANS; DE ALMEIDA, 2007; GUIMARÃES;
QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 2012). O Citronelol (CT) é um monoterpeno
presente no óleo essencial de algumas plantas medicinais, como o Cymbopogon
citratus e a Lippia Alba. Alguns efeitos farmacológicos, tais como antibacteriano,
antifúngico, anti-espasmódico e atividade anticonvulsivante já foram descritos para o
citronelol (BASTOS et al., 2010; DE SOUSA et al., 2006).
Baseado na literatura e levando-se em consideração que o uso de produtos
naturais tem um papel importante na saúde mundial, uma vez que alguns dos
medicamentos utilizados no tratamento de diversas doenças são de origem natural e
que estudos científicos voltados à análise da efetividade dessas plantas medicinais
são escassos; e, somando-se ao fato que nos produtos naturais habita a
possibilidade da existência de diferentes compostos químicos que atuam em
conjunto em determinado alvo molecular, o que pode possibilitar a ocorrência de
menores efeitos colaterais ou secundários para o consumidor, tornam-se
necessárias pesquisas voltadas para a descoberta e avaliação de substâncias
naturais com potenciais terapêuticos.
Considerando-se, ainda, que apesar das drogas analgésicas serem a maior
categoria terapêutica, têm-se concentrado esforços na busca de compostos
analgésicos com maior potencial terapêutico, maior seletividade e menores efeitos
colaterais, e que o CT possui efeitos no SNC (DE SOUSA et al., 2006), contudo
desconhecendo-se suas possíveis atividades antinociceptiva e anti-inflamatória,
assim como seus mecanismos de ação central. Desta forma, o presente estudo
buscou, pela primeira vez na literatura, determinar os possíveis efeitos analgésico e
anti-inflamatório do CT, assim como sua ação no SNC, podendo, futuramente, o CT
se tornar uma molécula promissora no desenvolvimento de novas propostas
terapêuticas para o tratamento da dor e de outras nosologias que acometem o
homem.
3
2 REVISÃO TEÓRICA
2.1 PLANTAS MEDICINAIS
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), plantas medicinais são
todas aquelas, silvestres ou cultivadas, empregadas com o intuito de prevenir,
aliviar, curar ou modificar um processo fisiológico normal ou patológico, podendo
também serem utilizadas como fonte de fármacos e de seus precursores. A
divergência entre plantas medicinais e fitoterápicos condiz ao fato dessas atuarem
como prenunciadores dos mesmos na produção de uma formulação específica,
decorrendo na elaboração de produtos medicinais acabados e etiquetados
(CORDEIRO; CHUNG; SACRAMENTO, 2005; VEIGA JUNIOR; PINTO; MACIEL,
2005).
O uso de plantas medicinais tem sido descrito desde os primórdios da
humanidade, sendo que a descoberta de suas diversas utilidades é decorrente de
uma série de conceitos culturais. Muitas comunidades e grupos étnicos possuem o
conhecimento sobre plantas medicinais como o único recurso terapêutico, recurso
este que se mantém em prática até os dias atuais devido às observações populares
sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais de todo o mundo, o que valida às
informações terapêuticas acumuladas durante anos (MACEDO; OSHIIWA;
GUARIDO, 2007).
As plantas medicinais são utilizadas tanto pelas comunidades tradicionais, ou
seja, pelos grupos culturalmente diferenciados, a exemplo dos indígenas,
quilombolas, ribeirinhos e ciganos, como por estudiosos, com o objetivo de obtenção
de novos fármacos (COSTA; MAYWORM, 2011). Na atualidade, vários fatores têm
contribuído para o aumento do uso deste recurso, para tanto se destacam o alto
custo dos medicamentos industrializados, o difícil acesso da população à assistência
médica, além da tendência, nos dias atuais, ao uso de produtos de origem natural
(BRASILEIRO et al., 2008).
Várias formas de tratar e curar doenças, tais como a utilização de
medicamentos, resultantes do avanço no meio técnico científico, foram
apresentadas à sociedade ao longo do tempo por meio de campanhas publicitárias
que prometiam curar as mais diversas doenças. No Brasil, apesar do incentivo da
indústria farmacêutica quanto à utilização de medicamentos industrializados, grande
4
parte da população ainda se utiliza de práticas complementares para cuidar da
saúde, como o uso de plantas medicinais (ETHUR et al., 2011).
As plantas medicinais e os fitoterápicos compõem uma fonte de tratamento que
se encontra em expansão por todo o mundo. No ano 2000, estipula-se que os
produtos a base de plantas medicinais movimentaram cerca de 30 bilhões de
dólares (MELO et al., 2007), representando, sem dúvida, um papel essencial na
terapêutica, o que se justifica pelo fato de 25% dos medicamentos prescritos
mundialmente serem de origem vegetal, conforme resultados divulgados pela OMS
(CORDEIRO; CHUNG; SACRAMENTO, 2005). Ainda de acordo com a OMS, 80%
da população mundial fazem uso de medicamentos derivados de plantas medicinais.
Pesquisas, realizadas no Brasil, mostram que 91,9% da população já fez uso de
alguma planta medicinal e cerca de 46% mantêm o cultivo caseiro dessas plantas
(ETHUR et al., 2011).
Entre os anos de 2005 e 2010, a FDA e a European Medicines Agency (EMA)
aprovaram um total de 19 medicamentos baseados em produtos naturais, a exemplo
do Dronabinol (Sativex®), Exenatide (Byetta®) e Romidepsin (Istodax®), indicados no
tratamento álgico, diabético e oncológico, respectivamente. Desses, 7 correspondem
a produtos naturais, 10 são produtos naturais semi-sintéticos e 2 são drogas
derivadas de produtos naturais, o que remete a grande importância dos produtos
naturais diante da farmacêutica mundial (MISHRA; TIWARI, 2011).
No Brasil temos como exemplo recente o anti-inflamatório tópico Acheflan®, do
Laboratório Aché, produto totalmente produzido nacionalmente a partir do óleo
essencial da planta Cordia verbenacea, rico em terpenóides, sendo registrado na
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em 2004 e lançado no mercado
em 2005, onde, desde então, passou a ser o anti-inflamatório tópico mais prescrito
pela classe médica brasileira, correspondendo a cerca de 44% das prescrições
médicas, deixando claro, assim, a importância dos produtos naturais no mercado
brasileiro (CALIXTO; SIQUEIRA JUNIOR, 2008).
Apesar dos avanços da indústria química, a comercialização de plantas
medicinais ocupa uma importante parcela no mercado mundial, sendo representada
por 14 bilhões de um total estimado de 280 bilhões de dólares (aproximadamente
5% do mercado de produtos farmacêuticos). No Brasil, o valor estimado gasto em
fitoterápicos ainda é relativamente pequeno, cerca de 300 milhões de dólares, o que
5
gira em torno de 4% do mercado farmacêutico, da ordem de 7,4 bilhões de dólares
(CARVALHO et al., 2007).
Apesar do avanço na área científica voltada aos estudos dos fitoterápicos ter
contribuído amplamente para o aumento do uso de plantas medicinais, ainda faltam
inúmeros estudos que comprovem a utilização segura e eficaz de várias plantas
(VIEIRA et al., 2010). O uso das plantas medicinais, o qual se baseia em
conhecimentos populares tradicionais, vinculado à crença de que nada de origem
natural seria capaz de causar reações adversas, contribuíram para o baixo número
de estudos voltados à comprovação da segurança e eficácia das plantas medicinais
(TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).
O Brasil é contentor de aproximadamente 55 mil espécies de plantas
superiores, um terço da flora mundial, o que o caracteriza como o país com maior
biodiversidade no planeta. O potencial econômico da flora brasileira, assim como
sua biodiversidade, principalmente no que se refere às plantas medicinais vem sido
descritos desde 1886. Porém, o Brasil ainda possui um baixo percentual em
conhecimento científico das plantas destinadas ao uso medicinal (KLEIN et al.,
2009).
Embora a aplicação de plantas medicinais na terapêutica mundial tenha sofrido
um forte avanço em busca do desenvolvimento de fitoterápicos confiáveis e
eficazes, ainda faltam estudos que comprovem a utilização segura e eficaz de várias
plantas (VIEIRA et al., 2010).
Os óleos essenciais (OEs) são substâncias de natureza volátil, com
composição lipofílica, encontrando-se contidos em vários órgãos das plantas. Esses
óleos constituem-se por substâncias terpênicas e eventualmente por
fenilpropanóides, acrescidos de moléculas menores, como alcoóis, ésteres, aldeídos
e cetonas de cadeias curtas. Os OEs são expelidos pela planta objetivando-se a
defesa ou atração de polinizadores, o que os tornam fontes potenciais de
substâncias biologicamente ativas, principalmente antimicrobianas. A composição
terpênica dos OEs caracteriza-se normalmente pela presença de moléculas de dez a
quinze carbonos, conhecidas como monoterpenos e sesquiterpenos,
respectivamente (OLIVEIRA et al., 2011).
Estudos pré-clínicos têm demonstrado propriedades benéficas dos OEs, tais
como os efeitos anti-inflamatório e antinociceptivo do óleo essencial da Myrcia
pubiflora (ANDRADE et al., 2012), antimicrobiano da Baccharis dracuncucifolia D.C.
6
e da Baccharis uncinella D.C. (FERRONATTO et al., 2007), além do hipotensor,
vasorrelaxante (DE MENEZES et al., 2010), antinociceptivo e anti-inflamatório do
Cymbopogon winterianus (LEITE et al., 2010).
Os monoterpenos (Figura 1) são substâncias isoladas que pertencem ao
grupo dos terpenóides, cuja estrutura corresponde a duas unidades de isopreno
formadas por uma base de 5 carbonos (C5) cada uma, ligadas entre si. Esses
possuem uma ampla variedade em suas estruturas e correspondem a cerca de 90%
da composição do óleo essencial (BAKKALI et al., 2008).
A utilização desses compostos tem sido descrita desde os primórdios do século
XIX, sendo empregados em fragrâncias e aromas. Ultimamente, eles têm sido
Carvacrol p-Cimeno
(-)-Mentol (+)-Mentol (+)-Pulegona (+)-Limoneno
α-Terpineol (-)-Linalol
Mirceno Citronelal cis-Citral trans-Citral
Timoquinona α-Pimeno
Figura 1. Estrutura química dos monoterpenos. Fonte: Adaptado de GUIMARÃES et al., 2012.
7
utilizados na indústria farmacêutica em virtude de seu potencial terapêutico
(GHASEMI et al., 2009), à exemplo do limoneno, utilizado em ensaios clínicos no
tratamento contra o câncer (GOULD, 1997).
Os monoterpenos representam destaque também na economia mundial, onde
se enquadram na categoria de nutracêuticos, os quais corresponderam, nos EUA, a
cerca de 75,5 bilhões de dólares em 2007, obtendo um crescimento para 167
bilhões de dólares em 2010 (BASU; THOMAS; ACHARYA, 2007). Inúmeros
monoterpenos são tidos como fontes de estudos com o intuito de se elucidar suas
ações sobre o organismo, em especial sobre suas propriedades analgésicas
(GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 2012).
Estudos demonstram que o carvacrol, um monoterpeno encontrado nos óleos
essenciais dos gêneros Thymus e Origanum, bem como o (+)-pulegona, possuem
como uma de suas atividades a anti-inflamatória (KAWATA; KAMEDA; MIYAZAWA,
2008), que pode estar vinculada à inibição da liberação de prostaglandinas, o que
resulta da inibição da enzima cicloxigenase-2 (COX-2) (HOTTA et al., 2010).
A redução do edema de pata, observada com o uso do citral (QUINTANS-
JÚNIOR; GUIMARÃES; et al., 2011) e do α-pimeno (MARTIN et al., 1993), e a
diminuição da migração leucocitária induzida por carragenina, com o uso do
citronelal (QUINTANS-JÚNIOR; DA ROCHA; et al., 2011), do citral (QUINTANS-
JÚNIOR; GUIMARÃES; et al., 2011) e do limoneno (HIROTA et al., 2010) também
indicam a capacidade anti-inflamatória de alguns monoterpenos.
A inibição de mediadores inflamatórios, tais como a diminuição na síntese ou
liberação de óxido nítrico, a exemplo do linalol (PEANA; MARZOCCO; et al., 2006),
encontrado no óleo essencial da Salvia sclarea e da Salvia desoleana (PEANA;
RUBATTU; et al., 2006), e do Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α), como ocorre
com o carvacrol e com o α-terpineol (DE OLIVEIRA et al., 2012), presente em
diversas espécies do gênero Eucalyptus (DAGNE et al., 2000), remetem a
importância dos monoterpenos quanto à propriedade antinociceptiva (GUIMARÃES
et al., 2012).
Além da atividade periférica, os monoterpenos também têm apresentado
atividade sobre o SNC (GUIMARÃES; QUINTANS; QUINTANS-JÚNIOR, 2012) e
cardiovasculares (SANTOS et al., 2011). Muitos monoterpenos potenciam a
neurotransmissão GABAérgica, o que indica sua potencialidade ansiolítica e/ou
anticonvulsivante (PASSOS et al., 2009), a exemplo do linalol (HOSSAIN et al.,
8
2002). Estudos demonstram que a atividade antinociceptiva do linalol pode estar
vinculada ao envolvimento de vários receptores, tais como, glutamatérgicos
ionotrópicos (BATISTA et al., 2008), adenosinérgicos (PEANA; RUBATTU; et al.,
2006) e opioides (SAKURADA et al., 2011).
A antinocicepção central representa um potencial importante vinculado a esses
compostos. O efeito antinociceptivo do citral recebeu destaque por estar relacionado
à inibição prolongada TRPV1 e TRPV3, seguida pela ativação do Transient receptor
cation channel, subfamily M, member 8 (TRPM8), apresentando destaque ao se
tratar da alodinia, coceira ou outros tipos de dor superficial. Além do agonismo total
dos receptores citados, o citral também pode atuar como agonista parcial do TRPV1,
TRPV3 e TRPA1 (STOTZ et al., 2008).
Estudos demonstram, ainda, a ativação do sistema opioide no mecanismo de
ação dos monoterpenos, como ocorre com o p-cimeno (SANTANA et al., 2011),
mentol (GALEOTTI et al., 2002), timoquinona (ABDEL-FATTAH; MATSUMOTO;
WATANABE, 2000) e citronelal, que também apresenta atividades sedativa e
hipnótica (MELO et al., 2010).
O Citronelol (CT) (Figura 2) é um dos componentes do óleo essencial presente
em várias plantas, a exemplo do Cymbopogon citratus, Cymbopogon winterianus e
Lippia alba, pertencendo à família dos produtos naturais derivados do isopreno C5
(BASTOS et al., 2010). Tal monoperno caracteriza-se quimicamente como uma
substância alcoólica de cadeia acíclica pertencente à composição de diversas
plantas de cadeias aromáticas (DE SOUSA, 2007). Ações antifúngicas, anti-
bacterianas, antiespasmódicas, hipotensora (BASTOS et al., 2010),
anticonvulsivante (DE SOUSA et al., 2006) e acaricida (JEON et al., 2008) já foram
descritas.
8
OH
Figura 2. Estrutura química do citronelol. Adaptado de GUIMARÃES et al, 2012.
9
VIOLLON; CHAUMONT (1994), por meio de estudos utilizando o fungo
Cryptococcus neoformans, espécie oportunista em pacientes com a Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA), provaram a eficácia do CT em sua ação
antifúngica. Para tanto, utilizaram o fungo extraído do sangue de portadores de
Human Immunodeficiency Virus (HIV) testado pelo método de diluição em ágar
sólido com cloranfenicol 0,005%. O citronelol foi adicionado ao meio antes da
solidificação. A proporção de 10/~1 (105 células/ml) de Cryptococcus neoformans foi
espalhada no ágar e as células foram contadas utilizando-se um hemocitômetro
Thoma. As culturas foram incubadas a 37 ºC por 48 horas e, posteriormente,
observou-se a concentração mínima capaz de inibir o desenvolvimento do fungo.
Propriedades antibacterianas foram observadas para o CT, onde foram
utilizadas culturas de Streptococcus mutans de dois dias de idade inoculadas em
uma combinação de infusão de cérebro e coração juntamente com a substância
teste. As amostras foram incubadas a 37º C por dois dias e posteriormente foi
realizada a contagem de colônias, onde se observou significativa diminuição do
número de colônias (KUBO; MUROI; KUBO, 1993)).
VIOLLON; CHAUMONT (1994) ao administrarem o óleo essencial de hortelã-
pimenta somado a corante em camundongos machos e fêmeas, por via oral, após
jejum de 2 h de água, conseguiram comprovar a atividade antiespasmódica do
citronelol no intestino desses animais ao observarem por meio de uma laparotomia a
taxa de migração do óleo nesse mesmo órgão.
Estudos realizados utilizaram amostras de Dermatophagoides farinae (ácaro da
poeira americano) e Dermatophagoides ptertonyssinus (ácaro da poeira europeu)
dispostas em discos de tecido preto, depositadas em placas de Petri, cobertas por
tampa. Após 24 h, as amostras foram observadas em microscópio binocular (20x) e
os ácaros foram considerados mortos quando incapazes de movimentar o apêndice
após o estímulo com um alfinete. O experimento demonstrou a ação acaricida do CT
quando comparados ao grupo controle (JEON et al., 2008).
Os efeitos cardiovasculares do CT, administrado por via endovenosa, em ratos,
foram observados por meio de hipotensão seguida por episódios de taquicardia.
Essa deriva, de forma provável, da diminuição da resistência vascular periférica
induzida pelo CT, a qual pode ser observada in vitro, para isso foram utilizadas
preparações de anéis isolados da artéria mesentérica superior de ratos (BASTOS et
al., 2010).
10
A atividade anticonvulsivante do CT foi descrita por DE SOUSA et al. (2006),
onde foram realizados os testes de convulsão induzida por pentilenetrazol,
picotroxina ou eletrochoque máximo (130V, 150Hz, por 0,5 s), sendo registrado que
esse monoterpeno produziu uma proteção significativa quando comparado aos
animais do grupo controle, tanto nas convulsões clônicas induzidas por
pentilenetrazol como nas tônico-clônicas induzidas pelo eletrochoque, o que garante
uma maior vantagem ao CT quando comparado à maioria das drogas
anticonvulsivantes. Os autores atribuíram os efeitos anticonvulsivantes ao CT devido
seu possível efeito sobre o sistema GABAérgico através do bloquei parcial de canais
operados por voltagem para sódio (VOCsNa+)(DE SOUSA et al., 2006). As drogas
anticonvulsivantes são de grande relevância no manuseio da dor, uma vez que
apresentam indicações precisas em determinados quadros de dor neuropática,
como a neuralgia essencial do trigêmeo, a neuropatia diabética e a neuralgia pós-
herpética, devido as sua capacidade de prolongar o período refratário efetivo das
fibras nervosas, limitar o disparo de alta frequência e aumentar a inibição sináptica
central (ALVES NETO, 2010).
2.2 DOR
A dor foi definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)
como sendo uma experiência sensorial e emocional associada a dano tecidual real
ou potencial, ou descrita em termos de tal lesão, a qual pode ser classificada em
aguda e crônica (MOSSEY, 2011). A dor aguda é definida como uma dor de curta
duração e auto-limitada, que pode se tornar persistente e intratável se o processo da
doença subjacente ou lesão não for solucionada. Quando persiste por mais de 3
meses, essa dor é classificada como crônica (DUBOIS; GALLAGHER; LIPPE, 2009).
As estimativas da prevalência de dor variam amplamente e normalmente
entre 10% e 30% na população adulta, embora as taxas de prevalência variem de
2% a 55%. Esta variação pode ser reflexo das diferenças entre as populações e de
divergências na definição e classificação de dor presente nos estudos
epidemiológicos (BEKKERING et al., 2011; HARKER et al., 2012). A dor geralmente
é mais comum em grupos etários mais velhos, grupos com menor renda e entre as
mulheres (OHAYON, 2004; DEMYTTENAERE et al., 2006). Estima-se, por exemplo,
que mais de 22% dos americanos com mais de 18 anos apresentam dor na região
orofacial, prevalência esta que se repete em países como a Inglaterra e Alemanha.
11
De forma geral, a dor orofacial possui uma prevalência de 13% a 26% (MIRANDA et
al., 2012; NIXDORF et al., 2012; HARGREAVES, 2011).
Na sequência dos eventos que originam o fenômeno sensitivo doloroso, o
primeiro passo é a transformação dos estímulos ambientais, físicos ou químicos
intensos em potencial de ação, que são transferidos da fibra nervosa do sistema
nervoso periférico (SNP) para o SNC (ALVES NETO, 2010).
Existem três tipos principais de fibras sensoriais no SNP envolvidos na
nocicepção, as fibras A , A e C, as quais possuem propriedades diferentes, o que
lhes permitem transmitir tipos diferentes de informação sensorial. As fibras A são
grandes em diâmetro e altamente mielinizadas, permitindo-lhes, assim, conduzir
rapidamente potenciais de ação, sendo responsáveis por transmitir a informação
tátil. As fibras A são menores em diâmetro e finamente mielinizadas, o que as torna
mais lentas que a fibra A , respondendo tanto a estímulos térmicos quanto a
mecânicos. Já as Fibras C são amielinizadas, tornando-as fibras de condução lenta,
sendo responsáveis por detectar estímulos dolorosos. Conjuntamente, as fibras A e
C são denominadas de nociceptores, respondendo a estímulos nocivos, sejam eles
mecânicos, térmicos ou químicos (Tabela 1) (RAJA; MEYER; CAMPBELL, 1988)
(BASBAUM et al., 2009) (HUCHO; LEVINE, 2007).
Tabela 1. Características físicas das fibras aferentes nociceptivas.
A A C
Diâmetro 6 a 12 mm
(mielinizadas) 1 a 5 mm
(mielinizadas) 0,2 a 1,5 mm
(Não mielinizadas)
Velocidade 35 a 75 m/s 5 a 30 m/s 0,5 a 2 m/s
Função Tato Temperatura e
nocicepção Nocicepção
Adaptado de MARCHAND, 2008.
As percepções moleculares no processo de sensação de calor veio da
clonagem e caracterização funcional do receptor de capsaicina, o componente
majoritário da pimenta vermelha. A capsaicina produz dor em queimação devido a
ativação do receptor VR1, o qual apresenta um limiar de ativação térmica de
aproximadamente 43 °C, estando localizados predominantemente nas fibras C e A, sendo sensível ao calor nocivo. Os receptores VR1 são responsáveis por abrir os
12
canais de cátions permeáveis ao Ca+2 (CATERINA et al., 2000; CATERINA et al.,
1997; DAVIS et al., 2000; CESSELIN et al., 1984).
Os neurônios sensíveis ao frio respondem ao mentol e exibem um limiar de
ativação térmica de 25 °C, sendo ativados pelos receptores de pontecial melastatina
(TRPM-8) e pelos receptores de frio e mentol do tipo I (CMR1), os quais abrem um
canal não seletivo de cátions (COLBURN et al., 2007; DHAKA et al., 2007). Já os
estímulos mecânicos são transmitidos por uma variedade de receptores
mecanossensíveis, dentre eles as fibras C e fibras A, que respondem a estímulos
mecânicos intensos, fibras Aα, que detectam a tensão muscular e a posição da
articulação, e as fibras A , que processam o tato e são ativadas por estímulos
pressóricos fracos (WETZEL et al., 2007).
A quimionocicepção é o processo pelo qual os neurônios aferentes primários
detectam substâncias ambientais irritantes e fatores endógenos produzidos pelo
stress fisiológico. No contexto da dor aguda, os mecanismos quimionociceptivos
desencadeiam respostas aversivas a uma variedade de irritantes ambientais e
endógenos. Nesse casos, os canais TRP também possuem papéis fundamentais.
Os fatores endógenos capazes de ativar os nervos sensitivos são produzidos em
resposta ao dano tecidual ou ao stress fisiológico, incluindo o stress oxidativo. Tais
fatores podem atuar isoladamente, ou em combinação, na sensibilização dos
nociceptores diminuindo o limiar nociceptivo. Assim, a quimionocicepção representa
uma interface importante entre a dor aguda e persistente, especialmente no contexto
da lesão do tecido periférico e, consequente, instalação de um processo
inflamatório, o qual produz uma série de mediadores que ativam diretamente os
canais de Ca+2 e despolarizam os neurônios, desencadeando, assim potenciais de
ação (BASBAUM et al., 2009; PEIER et al., 2002; BANDELL et al., 2004).
A experiência sensorial iniciada na periferia, a nível dos terminais periféricos
de fibras aferentes primárias, as quais respondem a uma série de estímulos,
traduzem essa informação para o corno dorsal da medula, o qual é organizado em
lâminas (D’MELLO; DICKENSON, β00κ). As fibras A e as C fazem conexões
principalmente com as lâminas I e II, com um número menor de conexões com as
lâminas profundas, enquanto que as fibras A inervam predominantemente as
lâminas III e IV, fazendo conexões com lâmina V (Figura 3) (TODD, 2002).
A maioria dos neurônios presentes nas lâminas I, II e III possuem axônios
que permanecem na medula espinhal, realizando localmente conexões com os
13
neurônios de projeção, estes são chamados de interneurônios, os quais podem ser
divididos em duas classes principais: excitatórios (glutamatérgicos) e inibitórios
(GABAérgicos). Entretando, existem sinapses diretas entre as vias aferentes
primária e as células de projeção, as quais utilizam, por exemplo, a substância P
como transmissor (TODD et al., 2002; NAIM et al., 1997).
Figura 3. Conexões entre as fibras aferentes primárias e a medula espinhal. Adaptado de BASBAUM et al., 2009.
O glutamato é um aminoácido excitatório e é o principal neurotransmissor
encontrado ao longo de todo do sistema nervoso, e é, portanto, essencial para a
sinalização de dor em todos os níveis anatômicos. Assim, a grande maioria das
sinapses aferentes primárias presentes nos corno dorsal da medula espinhal,
independentemente de serem de diâmetro pequeno ou grande, utilizam este
transmissor. O glutamato exerce uma influência excitatória em neurônios pós-
sinápticos, levando a despolarização da membrana através de três subclasses de
receptores distintos: α-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico (AMPA), o N-
metil-D-aspartato (NMDA) e a família de receptores metabotrópicos ligados a
proteína G (mGluR) (TÖLLE et al., 1995; VALERIO et al., 1997; D’MELLO;
DICKENSON, 2008).
Uma vez o estímulo nocivo tenha chegado aos neurônios de projeção,
concentrados na lâmina I e espalhados nas lâminas II, III e IV, estes cruzam a linha
14
média e viajam rostralmente na substância branca contralateral, através dos tratos
espinotalâmico e espinorreticular, para realizar aferências no tronco cerebral e em
vários núcleos talâmicos (SPIKE et al., 2003).
Especificamente, vias de projeção do corno dorsal da medula fazem aferência
com a medula rostroventral, com a substância cinzenta periaquedutal, com o núcleo
ventromedial do tálamo, e, finalmente, com os lóbulos frontais dorsolaterais. Outra
via de projeção ascendente ocorre da medula espinhal para o núcleo parabraquial,
e, subsequentemente, para o hipotálamo e para amígdala. Estudos sugerem ainda
que a informação nociceptiva pode ser transmitida do núcleo parabraquial para o
tálamo intralaminar, e de lá para o córtex frontal. Outra via envolve projeções do
núcleo parabraquial para o núcleo central da amígdala e para o prosencéfalo basal
(Figura 4) (DESBOIS; VILLANUEVA, 2001; BESTER et al., 2000; BOURGEAIS;
GAURIAU; BERNARD, 2001; RAINVILLE, 2002).
Figura 4. Anatomia das vias da dor. Adaptado de BASBAUM et al., 2009.
15
Ao nível de tálamo, os neurônios nociceptivos estão localizados em dois
grupos de núcleos: ventrobasal e centromedial. Os núcleos ventrobasal projetam
seus neurônios terciários para o córtex somatossensorial primário e secundário, já
os neurônios dos núcles centromedial projetam-se para as áreas do sistema límbico,
à exemplo do córtex insular e do córtex cingulado. Tais conexões são responsáveis
pelos componentes sensoriais e motivacionais da dor (COGHILL et al., 1994;
MARCHAND, 2008).
A substância cinzenta periaquedutal (PAG), região que circunda o aqueduto
cerebral a nível mesencefálico, é uma área de grande importância no controle da
dor. A PAG recebe sinais do tálamo, hipotálamo, córtex e conexões colaterais do
trato espinotalâmico, excitando os núcleos da medula rostroventral (RVM), a
exemplo dos núcleos da rafe e a formação reticular, que por sua vez projeta-se até o
corno dorsal da medula espinhal modulando a transmissão de mensagens
nociceptivas. Em adição, a PAG, núcleos da medula rostroventral e o corno dorsal
da medula são alvos de axônios ventrolaterais da coluna vertebral, incluindo os
núcleos parabraquial e o locus coeruleus (Figura 5) (STEEDS, 2009; CROFFORD;
CASEY, 1999; CALVINO; GRILO, 2006; PERL, 2011).
Figura 5. Via descendente da dor. Adaptado de CALVINO & GRILO, 2006.
16
Uma série de neurotransmissores, neuromoduladores e receptores estão
envolvidos na modulação da dor, sendo a serotonina, a noradrenalina e os opiáceos
os principais mediadores envolvidos na ativação da via descendente (CROFFORD;
CASEY, 1999; MARKS et al., 2009).
A inibição da dor por vias descendentes ocorre principalmente através de
neurônios serotoninérgicos e noradrenérgicos originados no mesencéfalo e na
substância cinzenta medular. Os neurônios serotoninérgicos estão principalmete no
núcleo magno da rafe, exercendo, através de uma série de receptors 5-HT, um
papel importante na modulação da dor, entretanto seus mecanismos de ação
precisos ainda não estão claros. Já a noradrenalina, através de seu receptor αβ,
possui um papel importante na antinocicepção. Embora a PAG e a RVM não
contenham neurônios noradrenérgicos, ambas as regiões se comunicam com áreas
noradrenérgicos importantes para a modulação da dor, a exemplo do locus ceruleus.
Estes núcleos noradrenérgicos são uma fonte importante de projeções com
eferência direta com a medula espinhal e, provavelmente, podem inibir a resposta
pré e pós-sináptica de neurônios espinhais envolvidos na transmissão da dor
(OSSIPOV; DUSSOR; PORRECA, 2010; RAHMAN et al., 2009; BAJIC; PROUDFIT,
1999; CROFFORD; CASEY, 1999).
O sistema opióide está envolvido tanto no componente ascendente quanto no
descendente da modulação da dor. Na via ascendente, os receptores , e
desempenham um papel fundamental. Já na via descendente, especificamente na
PAG e RVM, os receptores e são os principais responsáveis pela analgesia
decorrente do efeito modulatório exercido pela morfina, pelos opióides endógenos e
demais opióides, os quais estimulam a liberação de noradrenalina e serotonina no
corno dorsal da medula (STAMFORD, 1995).
Recentemente, têm-se comprovado a presença de receptores carnabinóides
CB1 em áreas do cérebro envolvidas na percepção nociceptiva, tal como a PAG e a
medula rostroventrolateral. Tais receptores também estão presentes na substância
gelatinosa, região esta que recebe sinais de neurônios aferentes primários, os quais
estão intimamente relacionados com a modulação nociceptiva. A nível de bulbo e
medula espinhal, os receptores CB1 são principalmente expressos no corno dorsal e
no funículo dorsolateral, estando, o sistema carnabinóide, envolvido na modulação
da dor (KRAFT, 2012; AGARWAL et al., 2007).
17
Conforme descrito anteriormente, a dor é uma experiência complexa e
multidimensional, compreendendo dimensões sensitivo-discriminativa, cognitiva,
emocional e motivacional. Tais dimensões apresentam expressão particular na
região orofacial, uma vez que esta região é formada por uma complexa variedade de
tecidos, dentre eles a pele, dentes, língua, músculos da mastigação, a articulação
temporomandibular e glândulas salivares, apresentando significados biológico,
emocional e psicológico especial para cada indivíduo (TAKEMURA et al., 2006).
Os tecidos orofaciais são inervados principalmente pelos três ramos (maxilar,
oftálmico e mandibular) do nervo trigeminal. Assim como em outros tecidos do
corpo, as fibras A e C transmitem sinais nociceptivos da região orofacial para o
SNC. Os principais corpos celulares das fibras aferentes primárias estão localizados
no gânglio trigeminal. Cada um destes neurônios presentes no gânglio trigeminal
possui um axônio que projeta-se para os tecidos periféricos e um outro que projeta-
se centralmente através do tronco cerebral ipsilateral, onde realiza sinapses com os
neurônios de segunda ordem, especialmente no complexo nuclear trigeminal
espinhal, o qual inclui o núcleo trigeminal sensorial e o núcleo trigeminal do trato
espinhal, sendo este dividido em três subnúcleos: oral, interpolar e caudal (SESSLE,
2005; SESSLE, 2000).
Os neurônios do complexo trigeminal projetam-se para diversas áreas do
SNC. Alguns neurônios possuem axônios que não saem do tronco cerebral, a
exemplo dos axônios da substância gelatinosa, que liberam localmente encefalina
ou GABA. Alguns neurônios projetam-se para a formação reticular ou para os
núcleos do nervo craniano motor, e, assim, fornece sinais necessários para as
respostas autonômicas e musculares reflexas. Além disso, muitos neurônios
ascendem diretamente para o tálamo através de vias que envolvem outras
estruturas do tronco cerebral, tais como o núcleo parabraquial e a formação reticular
(Figura 6) (SESSLE, 2005; DUBNER; REN, 2004).
O principal tratamento para a dor é a farmacoterapia. Os analgésicos
amplamente utilizados na clínica são classificados em opióides e não-opióides. Os
analgésicos não-opióides incluem o paracetamol e os anti-inflamatórios não
esteróides (AINEs). Já os opióides, a exemplo da morfina, agem como agonistas nos
receptores opióides (BECKER, 2010).
18
2.3 INFLAMAÇÃO
A inflamação é um processo que ocorre após uma infecção ou injúria tissular,
que é intercedido por uma diversidade de células e mediadores. Desta forma, a
resposta inflamatória pode ser benéfica, atenuando uma infecção, em defesa do
hospedeiro em relação ao organismo invasor e prolonga-se até o retorno da
homeostase. No entanto, esse evento pode cronificar-se, por não destruição do
patógeno ou por falta da homeostasia, levando a lesão de algumas estruturas, em
virtude da leucocitose, fibroplasia, da produção excessiva de citocinas e de outros
Figura 6. Via sensitiva principal da face e da boca. Adaptado de SESSLE, 2005.
19
mediadores desse processo. As manifestações moleculares geram uma
sintomatologia característica, conhecida pelos cinco sinais cardinais da inflamação:
eritema, calor, rubor, dor e a perda da função (MEDZHITOV, 2008).
O processo inflamatório é dividido em agudo e crônico por um critério
temporal e por algumas diferenças nos mediadores inflamatórias presentes em cada
condição. A inflamação aguda é subdividida em três fases: vasodilatação, aumento
da permeabilidade vascular e migração leucocitária, sendo cada uma dessas fases
imprescindíveis para o surgimento da próxima (SCOTT; LAM; FERRELL, 1994).
A vasodilatação é responsável por diminuição da velocidade do fluxo
sanguíneo, o que irá facilitar a migração leucocitária. Desta forma, a vasodilatação
em arteríolas e vênulas promoverá acúmulo de células naquela região, além de
interromper o fluxo laminar no lúmen do vaso, gerando o rubor e calor na região
(NORTHOVER; NORTHOVER, 1969). Consequentemente, os mediadores que são
liberados pelos leucócitos, como histamina, aumentam a permeabilidade dos vasos,
levando a extravasamento de plasma e formação do edema, caracterizando a
segunda fase (BIGNOLD; LYKKE, 1975). Após todas essas condições serem
estabelecidas, há expressão de moléculas de adesão para iniciar a terceira fase da
inflamação aguda, com intensa migração leucocitária, que liberam citocinas,
causando um quadro de dor inflamatória (LEY, 2003; CUNHA et al., 2008). A ação
dos leucócitos na fase inicial da inflamação é primordial para a resolução desse
processo (BUCKLEY et al., 2001).
Para o processo de migração leucocitária é necessário que ocorra redução do
fluxo sanguíneo, com emarginação dos leucócitos, para posterior adesão na parede
do endotélio, processo que é mediado por substâncias que promovem
vasodilatação, inicialmente, e por L-selectina, posteriormente (SMITH et al., 1991;
SPERTINI et al., 1991). Após a adesão, ocorre a migração do leucócito, por
transmigração ou por diapedese, processos dependentes de integrinas (ICAM-1 e
VCAM-1) e do gradiente quimiotático, respectivamente (Figura 7) (SPERTINI et al.,
1991; LUSCINSKAS et al., 1991).
Os leucócitos que migram para o local da inflamação na tentativa de
solucionar o quadro são os neutrófilos, macrófagos, mastócitos, eosinófilos e
monócitos. Os neutrófilos ou células polimorfonucleares (Figura 8) são as primeiras
células a migrar após uma lesão, sendo maioria na região afetada durante as
primeiras 24 horas (SPRINGER, 1994; KAPLANSKI et al., 2003). Estas células, ao
20
chegarem ao sítio inflamatório fagocitam os microrganismos, funcionando como a
primeira linha de defesa no combate a invasores, para tanto se faz necessário à
ação da enzima mieloperoxidase, presente nos grânulos azurófilos destas células,
sendo liberada por vesículas secretoras (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003).
Além disso, os neutrófilos são essenciais na fisiopatogênese da dor inflamatória,
uma vez que se inibindo a quimiotaxia destas células, atenua-se a hipernocicepção
(CUNHA et al., 2008).
Figura 7. Processo de quimiotaxia realizado pelos leucócitos. 1- Emarginação, 2-Rolamento, 3 - Adesão e 4 –Transmigração. Adaptado de ROSSITER; ALON; KUPPER, 1997.
É importante destacar que a migração de neutrófilos (quimiotaxia) é
necessária para a sobrevivência do hospedeiro, no combate a infecções e na
resolução do processo inflamatório (ALVES-FILHO; SPILLER; CUNHA, 2010).
Nesse sentido, os leucócitos são a primeira linha de defesa no combate aos
invasores por meio da fagocitose e da quimiotaxia de mais leucócitos (SEGAL,
1981). O processo de quimiotaxia é mediado por diversos fatores quimiotáticos,
além da função de moléculas de adesão que aumentam a adesão dos leucócitos ao
endotélio, mecanismos indispensáveis para a migração leucocitária e defesa do
organismo (LEY, 2003).
21
Figura 8. Neutrófilos fagocitando Streptococcus, em azul. Imagem obtida de um microscópio eletrônico, Hitachi S4500. Fonte: KOBAYASHI; VOYICH; DELEO, (2003).
Os monócitos ou células mononucleares são precursores de macrófagos, sua
migração é dependente da proteína quimiotática para monócitos-1 (MCP-1), que
promove a expressão de moléculas de adesão seletivas para este tipo celular. A
produção desta proteína é lenta, mas tem duração longa, o que justifica a migração
tardia de macrófagos e sua permanência longa, em oposição ao encontrado nos
neutrófilos (YAMASHIRO; KAMOHARA; YOSHIMURA, 1999).
Os macrófagos são células de defesas que atuam na resposta imune,
possuindo duas ações importantes na gênese do processo inflamatório, a fagocitose
de microrganismos e dos neutrófilos sem função e a produção de mediadores
inflamatórios (RENWICK et al., 2004; CAVAILLON, 1994; NEWMAN; HENSON;
HENSON, 1982), a exemplo do TNF-α, IL-1 , IL-8, IL-10 e IFN- . Além destes, os
macrófagos são responsáveis pela produção de óxido nítrico (GILAD et al., 1996;
HASKÓ et al., 1998).
Já os mastócitos são células do sistema imune sintetizadas por tecidos
hematopoiéticos (RODEWALD et al., 1996; CHEN et al., 2005), possuindo como
principal característica a presença de grânulos, estes ao serem desgranulados
liberam várias mediadores pró-inflamatórios, como histamina, leucotrienos e
citocinas (AMIN, 2012). Vale ressaltar que a função do mastócito como célula de
22
defesa se deve a facilitação da migração para o local da injúria de outras células
como neutrófilos, em virtude da vasodilatação promovida pelos constituintes dos
seus grânulos (THEOHARIDES et al., 2012).
Os eosinófilos estão presentes como marcadores de algumas patologias de
caráter inflamatório, como a inflamação alérgica, assim como os mastócitos. Além
disso, os eosinófilos regulam a desgranulação dos mastócitos, como por exemplo,
na liberação de histamina, sendo um importante alvo na terapêutica de doenças
inflamatórias (GLEICH, 1990; ZHEUTLIN et al., 1984; PILIPONSKY et al., 2001).
Se esses eventos persistirem, ocorre a cronificação do processo inflamatório,
caracterizado por expressão excessiva de fibroblastos e de tecido conjuntivo. Em
virtude disso, a inflamação crônica é caracterizada por fibrose, devido à lesão
tecidual persistente (BUCKLEY et al., 2001). Os fibroblastos induzem a expressão
de NF- B, aumentando a síntese de citocinas inflamatórias, além de ativar a via dos
prostanóides por indução da enzima cicloxigenase-2 (SMITH et al., 1997).
O NF- B é um fator de transcrição que promove a transcrição gênica de
alguns mediadores do processo inflamatório, como: citocinas, quimiocinas e enzimas
(iNOS e COX-2) (BALDWIN, 1996; SEBBAN; COURTOIS, 2006). A ativação desse
fator nuclear ocorre através da ativação de I Bcinase, por meio de algum estímulo
inflamatório, fosforilando I B, promovendo dissociação deste em NF- B. Esta
dissociação, por sua vez, promove ativação da proteína dimérica, induzindo a
translocação gênica, levando a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, NF-
B modula o processo inflamatório a partir da formação de um complexo ativo
regulado por um feedback positivo, com produção de outros mediadores
inflamatórios (Figura 9). Entre esses mediadores, as citocinas apresentam um grupo
diverso, sendo constituídos por citocinas pró-inflamatórias (IL-1 , IL-2, IL-6, IL-8. IL-
12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-27, IL-33, IFN- e TNF-α) e anti-
inflamatória (IL-10) (HANADA; YOSHIMURA, 2002).
A IL-1 é uma das principais citocinas que regulam o processo inflamatório,
sendo caracterizada como pirógeno endógeno, ou seja, uma molécula endógena
que possui participação na gênese da febre. Sua produção ocorre através de um
estímulo bacteriano ou inflamatório, com objetivo de participar na resposta imune do
hospedeiro contra os microorganismos (DINARELLO, 1998). Os mecanismos pelos
quais esta citocina modula o processo inflamatório são a produção de proteínas de
fase aguda, como a proteína C-reativa, aumento da permeabilidade dos vasos,
23
produção de prostaglandinas por indução da enzima COX, indução de moléculas de
adesão na parede dos vasos, facilitando o processo migratório de leucócitos para o
local da lesão (RAMADORI; MEYER ZUM BÜSCHENFELDE, 1989; MOSER et al.,
1989).
Figura 9. Cascata de transcrição do NF- B. Fonteμ BARNES; KARIN, 1997.
A IL-2 promove seus efeitos inflamatórios através do controle da migração de
células T CD4+ (Th1 e Th2), sendo encontrada na pele e nos pulmões (SHARMA et
al., 2012). Já a IL-6 possui efeitos pró e anti-inflamatórios (DINARELLO, 1997),
sendo descrita primeiramente como um modulador da produção de IgG (HIRANO et
al., 1986). Atribui-se a essa citocina uma importante função na fisiopatologia de
algumas doenças, como: artrite, asma, diabetes e inflamação intestinal crônica,
sendo encontrados altos níveis dessa citocina nos pacientes com essas doenças
24
(NEURATH; FINOTTO, 2011; SWAAK et al., 1988; DINARELLO, 1997; DOGAN et
al., 2006; MUDTER; NEURATH, 2007).
A IL-8 é um marcador inflamatório encontrado em algumas doenças como a
doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e a síndrome da angústia respiratória
adulta (SARA) (PESCI et al., 1998), sendo liberada após um estímulo inflamatório,
possuindo como função aumentar a adesão de leucócitos à parede dos vasos,
promovendo a quimiotaxia (CUNHA et al., 1991). Esta citocina também está
relacionada com a migração leucocitária para o local da injúria, sendo mais seletiva
para neutrófilos (SALLUSTO et al., 1999).
IL-10 é liberada por macrófagos, células dendríticas e linfócitos T e B, sendo
considerada a principal citocina anti-inflamatória, modulando desta forma a resposta
inflamatória sistêmica, evitando a cronificação do processo (WILSON et al., 2005;
KOYA et al., 2007). Sua atividade anti-inflamatória é mediada pela inibição da
produção de citocinas inflamatórias e na quimiotaxia de leucócitos, inibindo a
resposta imune excessiva (BONFIELD et al., 1995; FIORENTINO et al., 1991; KEEL
et al., 1997). Entretanto, IL-10 não consegue suprimir o efeito pró-inflamatório de IL-
18, a explicação deste fenômeno provavelmente esteja na diferença do mRNA de IL-
18 em relação as outras citocinas pró-inflamatórias (ZEDIAK; HUNTER, 2003).
Durante a sepse, intensa resposta inflamatória, a IL-10 é produzida por neutrófilos
que são responsáveis pela sobrevivência em animais submetidos a um modelo de
sepse (KASTEN; MUENZER; CALDWELL, 2010; ALVES-FILHO; SPILLER; CUNHA,
2010).
A IL-12 é uma citocina produzida por celulas dendríticas, macrófagos e
células B, tendo como uma das principais funções a participação na produção de
IFN- e TNF-α, através de ativação de células Th1. A sua via de sinalização pode
ser estimulada através da ativação de fagócitos por processos infecciosos ou pela
interação destes com a matriz extracelular durante um processo inflamatório (MA,
2001) (SUGIMOTO et al., 2007; TRINCHIERI, 2003).
A IL-15 é produzida por meio de células apresentadoras de antígeno,
estimulando a produção de células T CD4 e CD8, assim como a IL-2, com a qual
possui estrutura e funções biológicas equivalentes (KANEGANE; TOSATO, 1996).
Além de macrófagos, monócitos e células dendríticas, há participação de mastócitos
na liberação de IL-15, possuindo primordial função no controle a infecções, além da
participação na produção de células NK (ORINSKA et al., 2007; SCHLUNS et al.,
25
2004). A quimiotaxia exercida por essa citocina aumenta a migração de neutrófilos e
células T, elevando a produção de IL-8 (WILKINSON; LIEW, 1995; BADOLATO et
al., 1997). Recentemente, foi demonstrado que outro possível mecanismos de ação
para seu efeito pró-inflamatório seria através da via de sinalização IFN- →
Endotelina → Prostaglandinas, existindo relatos de sua participação na
fisiopatogênse da artrite reumatoide (VERRI et al., 2006; MCINNES; LIEW, 1998).
A IL-17 possui produção atípica, uma vez que é produzida por células Th17,
essas células podem ser classificadas como resposta imune Th1 ou Th2,
dependendo do local onde atua, ou seja, se é intracelular (Th1) ou extracelular
(Th2), sendo constituida por uma família formada por seis componentes (DONG,
2008; KOLLS; LINDÉN, 2004). A modulação da inflamação ocorre por aumento da
produção de IL-8, proteína quimioatraente para monócitos (MCP-1), IL-1, TNF-α e
PGE2 (IWAKURA et al., 2008).
A IL-18, pertence a família da IL-1, foi caracterizada pela produção de IFN-
por células apresentadoras de antígenos, possuindo ação mediada por ativação do
NF- B e de MAPK, regulando, possivelmente, a produção de IL-4 e IL-10
(D’ACQUISTO; MAIONE; PEDERZOLI-RIBEIL, 2010; O’NEILL; GREENE, 1λλκ; XU
et al., 2000). Assim como a IL-12 e IL-15, esta citocina está envolvida na
fisiopatogênese de doenças autoimunes como a artrite reumatoide e o lupus
eritematoso (PLATER-ZYBERK et al., 2001; ROBAK et al., 2002; LEUNG et al.,
2000).
A IL-21, assim como as outras citocinas, é expressa por meio das células
apresentadoras de antígenos, bem como células T, B e NK, o que justifica seu papel
na resposta imune inata e adaptativa (COLLINS; WHITTERS; YOUNG, 2003). Suas
atividades biológicas estão relacionadas com ativação do seu receptor IL-21R,
agindo sinergicamente com IL-15, as quais possuem estruturas químicas
semelhantes, na proliferação de células T (ZENG et al., 2005).
Já a IL-22 é uma citocina com estrutura semelhante a IL-10, sendo sua
produção realizada por células T, NK e mastócitos, promovendo controle das
respostas imunes (ZENEWICZ; FLAVELL, 2008). Como outras citocinas, promove a
liberação de proteínas de fase aguda (AGGARWAL et al., 2001), justificando seu
papel modulatório durante a inflamação. No entanto, é interessante destacar que IL-
22 possui ação protetora nos hepatócitos, possuindo, sinergicamente com a IL-17,
ação antimicrobiana (ZENEWICZ et al., 2007; LIANG et al., 2006).
26
A IL-23, expressa por células apresentadoras de antígenos, é estruturalmente
semelhante com IL-12, possuindo atividades biológicas semelhantes, como a
produção de IFN- . Outra importante função da IL-23 é a manutenção da expressão
de IL-17, possuindo desta forma ação moduladora na resposta imunológica
(LANKFORD; FRUCHT, 2003; BONIFACE et al., 2008).
A IL-25 é produzida por células T e mastócitos, sendo estruturalmente
semelhante a IL-17, no entanto, seus efeitos biológicos são distintos, pois induz a
formação de IL-4 e IL-13. Sua ação inflamatória está relacionada com um processo
alérgico, provavelmente por quimiotaxia de eosinófilos, sendo um modulador da
inflamação alérgica (YOSHIDA; MIYAZAKI; YOSHIYUKI, 2008).
A IL-27, assim como IL-23, é estruturalmente similar a IL-12, sendo outra
citocina moduladora da expressão de IFN- (D’ACQUISTO; MAIONE; PEDERZOLI-
RIBEIL, 2010), possuindo efeito dual na expressão de IFN- , já que, conjuntamente
como as IL-12 e IL-23, podem induzir esta formação ou inibi-la por ativação do
receptor IL-27R. A ação inflamatória de IL-27 se deve ao aumento na expressão de
IL-1 e TNF-α (LAROUSSERIE et al., 2004).
A IL-33 está localizada no núcleo das células, sendo considerada um fator
nuclear com função de transcrição gênica, como o NF- B. No entanto, não está bem
estabelecido como isso ocorre, sendo bem relatada sua função extracelular, como
citocina pró-inflamatória (MOUSSION; ORTEGA; GIRARD, 2008). Sua ação
biológica se deve ao aumento da migração de eosinófilos e macrófagos para o sítio
inflamatório, além de estimular a produção de IL-1 , IL-6 e TNF-α, sendo
encontrados altos níveis de IL-33 em doenças pulmonares inflamatórias (MOULIN et
al., 2007; ZHIGUANG et al., 2010).
Os Interforons (IFNs) são produzido por linfócitos T e por células NK, sendo
mediadores de ambas as respostas imunes, atuando na expressão do MHC,
facilitando a fagocitose, e de moléculas de adesão, facilitando o processo
quimiotático. Esta família possui vários membros, como IFN-α, IFN- e IFN- . O IFN-
é um dos principais membros com atividade pró-inflamatória descrita, atuando na
liberação de outras citocinas, COX-2 e óxido nítrico por macrófagos
(GOTTENBERG; CHIOCCHIA, 2007; BOEHM et al., 1997). Além disso, IFN- é um
marcador de algumas doenças autoimunes, como artrite reumatoide e lúpus
eritematoso (DOLHAIN et al., 1996; PALUCKA et al., 2005).
27
O fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) é uma das principais citocinas que
controlam o processo inflamatório, sendo a primeira a ser liberada após um estímulo
inflamatório, levando a aumento da expressão da COX e PGE2 . Seus efeitos são
mediados por dois receptores: TNFR1 e TNFR2, sendo que o primeiro está
relacionado com apoptose, com a dor neuropática e com a dor inflamatória, e o
segundo com o processo inflamatório (CUNHA et al., 2005; SOMMER; SCHMIDT;
GEORGE, 1998). O TNF-α induz a migração de neutrófilos para o local da injúria por
mecanismos indiretos, como a indução de liberação de fatores quimiotáticos para
neutrófilos por estimulação de macrófagos residentes (FACCIOLI et al., 1990). Além
disso, esta citocina induz a migração de neutrófilos por estimulação da via dos
leucotrienos. No entanto, é estabelecido que o TNF-α está relacionado na
sinalização do óxido nítrico, inibindo indiretamente a expressão de moléculas de
adesão (CANETTI et al., 2001; TAVARES-MURTA; CUNHA; FERREIRA, 1998;
MORELAND et al., 1999).
O óxido nítrico (NO) é um gás que possui conhecida função vasodilatadora,
por relaxamento do músculo liso dos vasos, mediada pelo GMPc. A síntese dessa
molécula ocorre através de três isoformas: eNOS, nNOS e iNOS, que convertem L-
arginina e oxigênio em L-citrulina e NO. As isoformas da óxido nítrico sintase (NOS)
são expressas em diferentes tipos celulares, desempenhando em cada uma função
biológica corresponde a isoforma (IALENTI et al., 1992; PALMER; ASHTON;
MONCADA, 1988; KNOWLES; MONCADA, 1994).
A eNOS constitutiva é expressa nas células endoteliais, sendo responsável
pela vasodilatação promovida pelo endotélio. A nNOS constitutiva é encontrada em
neurônios, uma vez que o NO é considerado como neurotransmissor, participando
de alguns eventos fisiológicos, como tônus vascular, tônus bronquial e na
fisiopatologia da dor. A iNOS induzível é expressa em macrófagos e neutrófilos após
um estímulo inflamatório (MURAD, 1986; MONCADA; PALMER; HIGGS, 1991;
ESPLUGUES, 2002).
As duas formas constitutivas são dependentes de cálcio, sendo ativadas
através da cálcio-calmodulina. A forma induzível não é dependente do cálcio, sendo
expressa de forma contínua após um estímulo inflamatório inicial (IALENTI et al.,
2000). Recentemente, foi demonstrado que a forma nNOS possui outra forma de
gatilho para sua ativação, relacionado com a via do PIγK e AKT, sendo esse efeito
28
relacionado com a analgesia periférica promovida pela morfina (CUNHA et al.,
2010).
O NO possui função dual em alguns processos fisiopatológicos, como a dor e
a inflamação. Alguns estudos demonstram que o NO possui efeitos anti-inflamatório
e pro-inflamatório (CURY et al., 2011; MARCINKIEWICZ; GRABOWSKA; CHAIN,
1995; GIRALDELO et al., 1994).
A propriedade anti-inflamatória é relacionada com a diminuição da
quimiotaxia, sendo desmonstrado que, o tratamento com precursor de NO e um
inibidor da NOS, no teste da pleurisia induzida por carragenina, utilizando ratos
Wistar machos, promoveu redução e aumento do processo quimiotático,
respecticamente (IALENTI et al., 2000). Similarmente a isto, foi descrito que
inibidores da NOS aumentam a migração de neutrófilos no teste da peritonite
induzida por carragenina ou LPS. Estas evidências da quimiotaxia são justificadas
pela diminuição da adesão dos neutrófilos na parede do endotélio por atenuação da
expressão de algumas moléculas de adesão como ICAM-1 (DAL SECCO et al.,
2003; DAL SECCO et al., 2006).
No entanto, apesar dessas descrições sobre a ação anti-inflamatória do NO,
alguns trabalhos demonstram sua propriedade oposta. Foi demonstrado que a
administração de carragenina subcutânea em ratos Sprague-Dawley machos induz a
expressão de iNOS, com aumento da produção do NO no local da inflamação
(OMOTE et al., 2001). Já o tratamento com um inibidor da síntese de NO reduziu a
migração de eosinófilos em um teste de inflamação alérgica em ratos Wistar
machos, sugerindo que o NO aumenta a quimiotaxia de eosinófilos (FERREIRA et
al., 1998). Descreveu-se, ainda, que administração de enterotoxina B promove um
processo inflamatório em camundongos Swiss machos, com aumento da migração
de neutrófilos, da permeabilidade vascular, e ampliação da atividade neutrofílica,
sendo que o tratamento com inibidores da NOS atenuaram estes efeitos (FRANCO-
PENTEADO et al., 2001).Tais evidências são reforçadas pelo fato que o tratamento
com inibidor de NOS diminui a expressão de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 ,
IL-2, IL-6 e IFN- , além de aumentar a expressão de citocinas anti-inflamatórias,
como IL-10, em camundongos Swiss machos, no teste do edema de pata induzido
por carragenina (IANARO et al., 1994).
O tratamento para condições inflamatórias busca atenuar a liberação dos
mediadores inflamatórios que causam a sintomatologia descrita.
29
Consequentemente, foram analisados os mecanismos de ações de algumas drogas
com ação anti-inflamatória, como a aspirina. O mecanismo de ação dessa droga e
de seus derivados sintéticos está na inibição da produção de prostanóides, como as
prostaglandinas, produzida através da via do ácido araquidônico, surgindo os
inibidores da enzima cicloxigenase (MONCADA; FERREIRA; VANE, 1973; VANE;
BOTTING, 1997).
Mediante os efeitos adversos causados por essas drogas, pela importância
fisiológica dos prostanóides, e a descoberta de duas isoformas para essa enzima
(GABRIEL; JAAKKIMAINEN; BOMBARDIER, 1991; HLA; NEILSON, 1992), nasceu
uma nova classe de drogas, os inibidores seletivos para a cicloxigenase-2, enzima
importante na via do ácido araquidônico, que seria a forma induzível, encontrada
apenas em condições patológicas. Diante disso, uma nova abordagem terapêutica
para o tratamento de condições inflamatórias estava surgindo, os inibidores seletivos
da nova isoforma, que deveriam possuir menores efeitos adversos, pela inibição
seletiva da forma induzível (SIMON, 2001). No entanto, foram encontrados alguns
efeitos não esperados para essa nova terapêutica, em virtude da forma considerada
induzível ser expressa constitutivamente em vasos e rins (MAJIMA et al., 2000).
O ácido araquidônico (AA) é formado a partir de uma reação enzimática
mediada pela fosfolipase A2 que degrada os fosfolipídeos de membrana a este
composto. O AA possui importância no processo inflamatório por desencadear a
produção de diversos mediadores inflamatórios, conhecidos como eicosanoides
(BALSINDE; WINSTEAD; DENNIS, 2002).
A liberação destes produtos ocorre por duas vias de produção, intercedidas
por duas enzimas distintas, a enzima ciclooxigenase (COX) e 5-Lipooxigenase (5-
LOX). Ambas atuam na quebra do AA em eicosanoides, sendo este produto dividido
entre os prostanóides (prostaglandinas, protaciclina e tromboxano A2), derivados da
COX, e leucotrienos, derivados da 5-LOX (SMITH, 1989).
A via de sinalização da COX é formada por duas isoformas dessa enzima,
conhecidas como COX-1 ou prostaglandina sintase-1 e COX-2 ou prostaglandina
sintase-2. As duas enzimas levam a produção dos prostanóides, mas por muito
tempo atribui-se como diferença básica entre elas o caráter fisiológico ou constitutivo
para COX-1 e patológico ou induzível para COX-2 (MORITA, 2002).
Desta forma, defendeu-se que a forma constitutiva fosse responsável por
proteção gástrica, renal e por agregação plaquetária, mediante, obviamente, a
30
produção dos prostanóides, sem estar presente no processo inflamatório. Essa
hipótese foi confirmado ao avaliar o mRNA de COX-1 durante um evento
inflamatório, que demonstrou que os níveis permaneceram inalterados a exposição
do estímulo inflamatório (SMITH; DEWITT; GARAVITO, 2000). Os níveis de COX-1
estão elevados no processo de resolução da inflamação, atuando como regulador do
processo inflamatório para que não ocorra cronificação (TAMACHI et al., 2006).
A COX-2 com função induzível estaria presente em quadros inflamatórios,
desagregação plaquetária e em outros eventos patológicos. Diante disso, chegou-se
a conclusão que drogas inibidoras para COX não seletivas possuiriam efeitos
adversos por inibir a forma constitutiva, levando a formulação de inibidores seletivos
da forma tida como induzível (MORITA, 2002). No entanto, os resultados
demonstraram que a COX-2 possui função constitutiva, em vasos e rins, limitando
seu uso terapêutico no tratamento de condições inflamatórias (MAJIMA et al., 2000).
A via da COX leva a produção de alguns prostanóides, sendo os efeitos
mediados por essas enzimas atribuídos a estes produtos. Entre os prostanóides
encontram-se o tromboxano A2 (TXA2), prostaciclina (PGI2), relacionados com o
tônus vascular e com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, e
prostaglandinas (PGE2, PGFβα,PGD2 e PGJ2) (REILLY; FITZGERALD, 1993). Os
efeitos biológicos atribuídos as prostaglandinas são diversos, já que PGFβα e PGJ2
possuem efeitos anti-inflamatórios, PGD2 promove vasoconstricção e PGE2 possui
efeito vasodilatador e tem participação na fisiopatogênese da febre (KOIZUMI;
NEGISHI; ICHIKAWA, 1992; GILROY et al., 1999; HELLIWELL; ADAMS;
MITCHELL, 2004).
A PGE2 possui quatro receptores: EP1, EP2, EP3 e EP4, todos acoplados a
proteína G, que ao ligar-se desempenha suas funções relacionadas ao processo
inflamatório e a dor (ZEILHOFER, 2007). Há relação, ainda, entre o efeito
inflamatório desencadeado por PGE2 e produção de citocinas pró-inflamatórias, uma
vez que o bloqueio dos receptores citados anteriormente atenuou a liberação dessas
citocinas (STRONG et al., 2000).
A outra via de produção de mediadores inflamatórios a partir do AA é ativada
pela enzima 5-LOX, a qual produz leucotrienos (LTB4, LTC4, LTD4 e LTE4). Assim
como as prostaglandinas, os leucotrienos possuem diversas funções biológicas, pois
LTC4, LTD4 e LTE4 são reguladores do processo inflamatório, e LTB4 possui ação
31
na quimiotaxia de leucócitos para o local do processo inflamatório (BISGAARD,
1984; ASAKO et al., 1992).
Outras substâncias de grande importância no processo inflamatório são a
bradicinina, histamina e a endotelina. A bradicinina é um nonapeptídeo sintetizado
através do cininogênio pela calicreína, sendo inativada pela enzima conversora de
angiotensina (ECA) ou por outras enzimas como as aminopeptidases (STEWART,
2004), possuindo efeito vasodilatador, sendo um mediador inicial importante para o
processo inflamatório, uma vez que a migração de leucócitos e o extravasamento de
plasma são dependentes da velocidade do fluxo sanguíneo (REGOLI; BARABÉ,
1980; DAMAS et al., 1990). Desta forma, a bradicinina é um mediador crucial da
fase inicial do processo inflamatório, sem o qual o desencadeamento deste ocorre
de forma menos acentuada (DAVIS; PERKINS, 1994a; DAVIS; PERKINS, 1994b).
Seus efeitos biológicos ocorrem por ativação dos seus receptores, B1 e B2,
os quais promovem a liberação de outros mediadores inflamatórios como citocinas,
histamina, PGE2 e óxido nítrico (TAYLOR; DEFEUDIS; MOREAU, 1989; MARCEAU
et al., 1999; COUTURE et al., 2001). Há evidências que o B2 seja constitutivo e B1
induzível, devido a falta de expressão desse receptor em tecidos sem processo
patológico. De fato, citocinas como IL-1 e TNF-α induzem a expressão desse tipo
de receptor, além do NF- B (MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998; BACHVAROV
et al., 1996).
A histamina é uma amina sintetizada através da L-histidina descarboxilase
que atua sobre a histidina, promovendo descarboxilação para a formação de
histamina (COUTURE et al., 2001). Essa amina é armazenada em mastócitos,
principalmente, até a desgranulação deste e posterior liberação por meio de um
estímulo, que pode ser um processo inflamatório, como citocinas pró-inflamatórias.
Além de participar de eventos inflamatórios, a histamina é expressa
constitutivamente nos pulmões (ENDO, 1982).
Suas propriedades biológicas são mediadas pelos receptores: H1, H2, H3 e
H4. A ativação do receptor H1 gera vasodilatação e aumento da permeabilidade
vascular, favorecendo a migração leucocitária para o local da lesão (TOGIAS, 2003).
O H2 é encontrado no estômago e regula secreção gástrica, desta forma, seu
bloqueio inibi o processo inflamatório desencadeado pelo sulco gástrico, além disso
de aumentar a permeabilidade vascular (WHITE, 1990). A ativação de H4 aumenta a
produção de citocinas, a migração leucocitária, sendo outro receptor histaminérgico
32
com ação inflamatória (LING et al., 2004). Diferentemente dos outros receptores, H3
não está relacionado com o processo inflamatório, possuindo ação na liberação de
neutransmissores, como acetilcolina, dopamina e histamina (ARRANG; GARBARG;
SCHWARTZ, 1983; LOVENBERG et al., 1999).
A endotelina é um peptídeo endógeno, com efeito vasoconstritor, sintetizado a
partir das células endoteliais, cérebro e coração, sendo sua ativação realizada por
endopeptidases. Os efeitos biológicos produzidos por ela são mediados por dois
receptores, ETA e ETB, sendo ambos aclopados a proteína G, nas suas isoformas
ET1, ET2 e ET3 (HICKEY et al., 1985; NUNEZ et al., 1990; LEVIN, 1995).
Apesar de possuir essa ação em vasos, a endotelina é um mediador da
inflamação. Esse fato se deve ao estímulo na liberação de IL-6, IL-8 e TNF-α, além
de estar associado com a ativação da via do AA por ativação de PLA2 (MULLOL et
al., 1996; RUETTEN; THIEMERMANN, 1997; ARAMORI; NAKANISHI, 1992). Tais
evidências são reforçadas por esse peptídeo está relacionado com a gênese de
algumas doenças inflamatórias como dor inflamatória, fibrose pulmonar e
cardiomiopatia (HOCHER et al., 2000; YANG et al., 2004).
Por fim, merece destaque o sistema complemento, o qual é responsável pela
defesa do organismo ao combate de microrganismos que levam à injúria tecidual. O
combate ao invasor ocorre por estimulação da defesa do organismo com estímulo
ao desencadeamento de um processo inflamatório, induzindo maior efeito fagocitário
às células de defesa. Este sistema consiste em um grupo de proteínas que são
ativadas a partir de uma cascata, sendo ativado por três vias distinas: clássica, das
lectinas e alternativa, convergindo para a produção das outras proteínas do sistema
e do complexo de ataque à membrana, funcionando como marcador para a
detecção de antígenos (KIRSCHFINK, 1997; MCGEER; KLEGERIS; MCGEER,
2005).
Um dos principais mecanismos pelos quais o complemento promove um
processo inflamatório está relacionado com a quimiotaxia de leucócitos, impedindo o
dano tecidual. Outras evidências sugerem a aumento da permeabilidade vascular e
produção de citocinas como TNF-α e IL-1 . Além do mais, o sistema complemento é
utilizado como alternativa terapêutica para o tratamento de inflamações articulares,
através da utilização de anticorpos (HUGLI, 1986; WANG et al., 1995).
33
2.4 PROTEÍNA FOS
Os genes de expressão imediata (GEIs) pertence a uma classe de genes que
são rapidamente ativados, geralmente na forma transiente, em resposta a uma
cascata de sinalização intracelular, codificando dos fatores de transcrição induzíveis
(FTIs), os quais constituem um grupo de proteínas nucleares que se ligam a sítios
reguladores do DNA, controlando a transcrição de inúmeros genes alvos e efetores,
compreendendo a família de proteínas Fos, Jun e Krox. Vale destacar, que a
indução dos GEIs ocorre na ausência de qualquer síntese proteica e, portanto, não
pode ser bloqueada pelos inibidores de síntese proteica (SNG; TANIURA; YONEDA,
2004).
Os FTIs são proteínas expressadas poucos minutos após uma célula ter sido
submetida a determinados estímulos. Inicialmente, um estímulo humoral ou sináptico
resulta em elevação dos níveis intracelulares de segundos mensageiros, tais como
cálcio, AMPc, GMPc. Em seguida, proteínas quinases citoplasmáticas são ativadas
e/ou translocadas para o núcleo. Essas enzimas catalisam a fosforilação de fatores
de transcrição constitutivos, que, por sua vez, se ligam a seqüências consensuais de
DNA de alta afinidade, na região promotora dos FTIs, e ativam a RNA polimerase II,
levando à transcrição de outras proteínas (PRADO; DEL BEL, 1998).
Existem quatro genes pertencentes a família fos: c-fos, fos-B, fra-1 e fra-2, os
quais codificam quatro proteínas designadas: Fos, Fos-B, Fra-1, Fra-2 (BIAŁY;
KACZMAREK, 1996). O oncogene Fos foi isolado pela primeira vez em 1982 a partir
do vírus FBJ murine osteogenic sarcoma, e, posteriormente, a sua versão celular c-
Fos foi descrita (CURRAN; TEICH, 1982; HERDEGEN et al., 1995) . A proteína Fos
é formada no citoplasma e vai para o núcleo onde tende a formar heterodímeros
(Fos-Jun), sendo classificadas, então, como proteína ativadora 1 (AP-1) e, dessa
maneira, apresenta maior afinidade de ligação ao DNA, provocando a ativação de
seus genes alvos (PRADO; DEL BEL, 1998).
Após a formação do dímero, a AP-1, se ligará a uma seqüência gênica
específica, o sítio AP-1, o qual é essencial para a ativação de vários genes. Ao
interagir com outros fatores de transcrição, o heterodímero da proteína Fos,
simultaneamente, forma uma ligação entre sistemas de segundos mensageiros
independentes. Essa proteína e outros FTIs atuam, portanto, como terceiros
mensageiros nucleares, ligando eventos mediados pelos segundos mensageiros a
34
alterações subsequentes na expressão gênica (HESS; ANGEL; SCHORPP-
KISTNER, 2004).
A expressão de c-fos é induzível, por exemplo, pelo soro, pelo fator de
crescimento epidérmico, pelos fatores de crescimento, pela radiação ionizante, por
agentes farmacológicos e por stress e citocinas (VAN DAM; CASTELLAZZI, 2001).
Desta forma, a proteína Fos é um marcador útil para o controle das atividades
neuronais nas vias centrais do sistema sensorial, particularmente na via nociceptiva.
A expressão do c-Fos pode ser estavelmente eliciada por vários estímulos nocivos,
tais como os mecânicas, térmicas e químicas. Tal proteína nuclear que pode ser
detectada nos neurônios por técnicas de imunohistoquímica de 20 a 90 minutos
após a ativação neuronal, desaparecendo dentro de 4 a 16 horas após o estímulo
(BURMEISTER; MANGIAMELE; LEBONVILLE, 2008; WILLIAMS; EVAN; HUNT,
1990).
35
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os possíveis efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório do citronelol em
roedores, assim como o envolvimento de áreas centrais nessa ação.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar o possível potencial antinociceptivo do citronelol (CT);
• Avaliar a ação do CT na nocicepção orofacial;
• Avaliar a possível ação anti-inflamatória do CT;
• Investigar o envolvimento de regiões centrais na possível ação do CT;
• Verificar possíveis alterações motoras induzidas pela administração do CT.
36
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados 362 camundongos Swiss machos (25 a 35 gramas) com 2 a 3
meses provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe (UFS).
Os animais foram mantidos em ciclo claro escuro de 12:00h/12:00h (claro: 6 às 18
hs; escuro: 18 às 6 hs), à temperatura de 25º ± 1oC, com dieta balanceada com
ração do tipo “pallet” e acesso livre a água. No presente estudo foram respeitados os
princípios éticos estabelecidos pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animal de
Laboratório (SBCAL) e todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFS (CEPA/UFS: 72/11).
4.2 SUBSTÂNCIAS
-Carragenina, Ácido etilenodiaminatetraacetico (EDTA), lipopolissacarídeo
(LPS), Reagente de Griess, Solução de Türk, Ácido Acético, Tween 80, formalina,
glutamato, capsaicina, glicerol, DABCO, glicina, soro albumina bovina (BSA), triton
X-100 e ((S)-()-B-Citronellol, CT, pureza de 97%) foram obtidos da Sigma (EUA).
Morfina, diazepam, naloxona, indometacina, ketamina, xylasina e paracetamol foram
obtidas da Cristália (Brasil). Kits para ensaio imunoenzimático (ELISA) para
quantificação de TNF-α foi obtido da BD-Bioscience Pharmingen (EUA). Nitrato de
Sódio (NaNO2) foi obtido da Merck (Brasil). O anticorpo primário policlonal produzido
em coelho, específico contra a proteína Fos SC 52 e o anticorpo secundário anti-IgG
de coelho produzido em jumento conjugado com Alexa Fluor 594 foram obtidos da
Santa Cruz Biotechnology (EUA).
4.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
4.3.1 Teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético
O teste das contorções abdominais é descrito como um modelo de
nocicepção inflamatória visceral e permite avaliar tanto o efeito central quanto o
periférico de substâncias. O ácido acético ativa diretamente o canais de cátion
localizados nas vias aferentes primárias, além de promover a liberação de diversos
37
mediadores do processo inflamatório, a exemplo do TNF-α e da IL-1 , estimulando a
liberação de aspartato e glutamato no fluido cérebro-espinhal (JULIUS; BASBAUM,
2001; KOSTER; ANDERSON; DE BEER, 1959). Após a injecção intraperitoneal de
ácido acético, o camundongo apresenta uma resposta que consiste de uma
constrição da parede abdominal, por vezes acompanhada por rotação do tronco e
extensão dos membros posteriores (HONORE et al., 2002; COLLIER et al., 1968).
Este teste consistiu na injeção de ácido acético 0,85% (0,1 mL/10 g; i.p.),
conforme descrito por KOSTER; ANDERSON; DE BEER, (1959). Para avaliar o
efeito da nocicepção causada pelo ácido acético foi adotado o conceito de que uma
contorção é entendida como a torção do corpo inteiro e/ou o alongamento dos
membros posteriores, com o movimento do abdômen tocando a superfície da mesa.
Após 5 min da administração do ácido, o número de contorções foi contado durante
15 min. Trinta minutos antes da injeção de ácido acético, grupos de oito animais
foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% +
tween 80 0,2%; i.p.) ou paracetamol (100 mg/Kg; i.p.) (Figura 10).
Figura 10. Resumo esquemático do teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético. Fotos: Renan G. Brito.
γ0’ 15’
Contagem do número de contorções abdominais
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Paracetamol (100 mg/Kg; i.p.)
5’
Ácido acético 0,85% (0,1 mL/10 g; i.p.)
38
4.3.2 Teste da formalina
O teste da formalina é um dos testes mais utilizados para avaliação da dor,
sendo mais válido que testes mecânicos e térmicos. A formalina desencadeia uma
resposta precoce e uma resposta tardia. A resposta precoce, ou primeia fase do
teste da formalina, caracteriza-se pelo efeito direto sobre os nociceptores seguido
por uma resposta inflamatória, característica da fase tardia, ou segunda fase do
teste da formalina (ROSLAND et al., 1990; TJØLSEN et al., 1992).
Este teste consistiu na injeção subcutânea de formalina (20 L) a 1% na
superfície plantar da pata posterior direita, conforme descrito por HUNSKAAR;
FASMER; HOLE, 1985. Após a injeção, foi mensurado o tempo em que o animal
permanece lambendo a pata injetada de 0-5 min (primeira fase) e 15-30 min
(segunda fase) após a injeção de formalina. Trinta minutos antes da injeção, grupos
de seis animais foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução
salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (3 mg/Kg; i.p.) (Figura 11).
Figura 11. Resumo esquemático do teste da formalina. Fotos: Renan G. Brito.
15’ 10’ 5’
Formalina 1% (β0 L; i.pl.)
γ0’
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Morfina (3 mg/Kg; i.p.)
Tempo de lambida da pata (s)
39
4.3.3 Teste da placa quente
O teste da placa quente é um modelo comportamental de nocicepção
comumente utilizado na avaliação dos efeitos de drogas analgésicas, geralmente por
alterações no limiar nociceptivo, consistindo na exposição dos animais a um
estimulo térmico nocivo (EDDY; LEIMBACH, 1953). A latência para as respostas
comportamentais incluem salto, retirada da pata e lamber a pata (ESPEJO; MIR,
1993; HUNSKAAR; BERGE; HOLE, 1986).
Nesse experimento, a placa quente foi mantida a uma temperatura de 55 °C ±
1°C. O teste consistiu em colocar o camundongo sobre uma superfície metálica
uniformemente aquecida e observar a latência (em segundos) para ele lamber as
patas traseiras ou saltar, nos tempos de 30, 60, 90 e 120 min após o tratamento.
Para evitar lesão tecidual, foi estabelecido um teto de 30 s. Quando o animal não
apresentou nenhum dos comportamentos acima citados, ele foi removido do
aparelho pelo experimentador (ANKIER, 1974). Trinta minutos antes da exposição
ao estimulo térmico, grupos de dez animais foram tratados com CT (25, 50 e 100
mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (3 mg/Kg;
i.p.). O efeito do pré-tratamento com naloxona (0,5 mg/kg, i.p.), um antagonista
opióide, na antinocicepção produzida pelo CT (100 mg/kg) e pela morfina (3 mg/kg,
i.p.) também foi determinado (Figura 12).
Figura 12. Resumo esquemático do teste da placa quente. Fotos: Renan G. Brito
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Morfina (3 mg/Kg; i.p.)
Naloxona (0,5 mg/kg; i.p.)
Tempo de permanência na placa quente
γ0’ 60’ 90’ 120’
40
4.4 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO
4.4.1 Teste de nocicepção orofacial induzida por formalina
A injecção de formalina no lábio superior induz uma resposta comportamental
caracterizada pela fricção da área perinasal com a pata anterior, e, por vezes ,com a
pata traseira. A nocicepção, no modelo de nocicepção orofacial induzida por
formalina, é resultante da ação inflamatória oriunda da ligação da formalina com as
proteínas teciduais, levando a estimulação direta dos nociceptores, na primeira fase,
e a um processo inflamatório, com consequente sensibilização central, na segunda
fase, de forma análoga ao observado em todos os testes que utilizam a formalina
como algógeno. Entretanto, quando injetada na região orofacial, a formalina excita
os neurônios nociceptivos convergentes do núcleo trigeminal espinhal, o que torna o
teste de nocicepção orofacial induzida por formalina mais específico na análise do
componente central da nocicepção quando comparado, por exemplo, ao teste da
injeção intra-plantar (LUCCARINI et al., 2006; CLAVELOU et al., 1989; ANDERSON;
VAKOULA; VEINOTE, 2003; RABOISSON; DALLEL, 2004).
Esse teste consistiu na injeção subcutânea de formalina β% (β0 L) no lábio
superior de camundongos (CLAVELOU et al., 1989). Inicialmente, cada animal foi
colocado em uma caixa de madeira (30 x 30 x 30 cm) com bases e laterais
espelhadas e frente de vidro, por um período de 15 min para minimizar o estresse ao
novo ambiente. Foi realizada a injeção de formalina e, imediatamente após, o animal
retornou a caixa para o período de observação de 0-5 min (primeira fase) e de 15-30
min (segunda fase). A intensidade da nocicepção foi determinada pela contagem do
tempo (em segundos) que o animal permaneceu friccionando a área injetada com as
patas traseiras e/ou dianteiras. Trinta minutos antes da injeção de formalina, grupos
de seis animais foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução
salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (5 mg/Kg; i.p.) (Figura 13).
41
4.4.2 Teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina
4.4.2 Teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina
A capsaicina, o componente majoritário da pimenta vermelha, é uma
ferramenta amplamente utilizada no estudos dos mecanismos fisiológicos da dor. O
uso de capsaicina como algógeno químico oferece uma série de vantagens, uma
vez que a capsaicina tem uma ação seletiva nas fibras sensoriais que transmitem as
sensações dolorosas, provocando a vasodilatação reflexa do axônio. Estes efeitos
resultam da ativação do receptor vanilóide 1, um canal iônico presente em neurônios
sensoriais, principalmente na via trigeminal, mais especificamente no gânglio
trigeminal. A injeção de capsaicina é capaz, ainda, de aumentar a excitabilidade dos
neurônios nociceptivos espinhais, sendo amplamente utilizada no estudo pré-clínico
dos mecanismos centrais envolvidos na nocicepção (HOLZER, 1991; PELISSIER;
PAJOT; DALLEL, 2002).
Esse teste consistiu na injeção subcutânea de capsaicina β.5 g (β0ul) no
lábio superior de camundongos (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Inicialmente,
cada animal foi colocado em uma caixa de madeira (30 x 30 x 30 cm) com bases e
laterais espelhadas e frente de vidro, por um período de 15 min para minimizar o
estresse ao novo ambiente. Foi realizada a injeção de capsaicina e, imediatamente
Figura 13. Resumo esquemático de teste de nocicepção orofacial induzida por formalina. Fotos. Renan G. Brito.
15’ 10’ 5’
Formalina 2% (β0 L; s.c.)
γ0’
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Morfina (5 mg/Kg; i.p.)
Tempo de fricção da região orofacial (s)
42
após, o animal retornou a caixa para um período de observação de 42 min. A
intensidade da nocicepção foi determinada pela contagem do tempo (em segundos)
que o animal permaneceu friccionando a área injetada com as patas traseiras e/ou
dianteiras. Trinta minutos antes da injeção de capsaicina, grupos de seis animais
foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% +
tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (5 mg/Kg; i.p.) (Figura 14).
4.4.3 Teste de nocicepção orofacial induzida por glutamato
O glutamato é um neurotransmissor excitatório com importante papel nos
mecanismos da dor. Níveis de glutamato periféricos estão aumentados na pele ou
tecidos profundos, em resposta à lesão dos tecidos, à estimulação elétrica do nervo
e na inflamação. A administração subcutânea local de glutamato evoca um processo
doloroso ou uma hiperalgesia térmica ou mecânica (GAZERANI et al., 2006; RO,
2003).
Esse teste consistiu na injeção subcutânea de glutamato 25 M (40 ul) no
lábio superior de camundongos (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Inicialmente,
cada animal foi colocado em uma caixa de madeira (30 x 30 x 30 cm) com bases e
Figura 14. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por capsaicina. Fotos: Renan G. Brito.
42’ γ0’
Capsaicina β.5 g (20 ul; s.c.)
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Morfina (5 mg/Kg; i.p.)
Tempo de fricção da região orofacial (s)
43
laterais espelhadas e frente de vidro, por um período de 15 min, para minimizar o
estresse ao novo ambiente. Foi realizada a injeção de glutamato e, imediatamente
após, o animal retornou à caixa para um período de observação de 15 min. A
intensidade da nocicepção foi determinada pela contagem do tempo (em segundos)
que o animal permaneceu friccionando a área injetada com as patas traseiras e/ou
dianteiras. Trinta minutos antes da injeção de glutamato, grupos de seis animais
foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.), veículo (solução salina 0,9% +
tween 80 0,2%; i.p.) ou morfina (5 mg/Kg; i.p.) (Figura 15).
4.5 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA
Os testes de coordenação motora são métodos utilizados na triagem de
drogas com possível atividade neurotóxica/miorrelaxante. Tais testes são
apropriados para detectar o efeito de relaxamento muscular ou de incoordenação
motora produzido por agentes farmacológicos (PULTRINI; GALINDO; COSTA,
2006).
Figura 15. Resumo esquemático do teste de nocicepção orofacial induzida por glutamato. Fotos: Renan G. Brito.
15’ γ0’
Glutamato β5 M (40 L; s.c.)
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Morfina (5 mg/Kg; i.p.)
Tempo de fricção da região orofacial (s)
44
4.5.1 Teste da coordenação motora (rota-rod)
O teste da coordenação motora usa o aparelho Rota-Rod e detecta a possível
interferência de um fármaco em estudo na coordenação motora de roedores
(DUNHAM; MIYA, 1957). Neste teste, os animais foram selecionados 24 h antes do
experimento, em sessões de 2 min de duração, sendo escolhidos aqueles que
permaneceram na barra giratória por esse período, sendo avaliados nos tempos de
30, 60 e 120 min após o tratamento. Grupos de seis camundongos selecionados
foram colocados no Rota-Rod trinta minutos após tratamentos com CT (25, 50 e 100
mg/Kg; i.p.), diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.) ou veículo (solução salina 0,9% + tween 80
0,02%; i.p.). O tempo máximo de permanência permitido dos animais no Rota-Rod
foi de 3 min, sendo avaliado o tempo de permanência na barra giratória, com no
máximo 3 reconduções à barra (Figura 16).
4.5.2 Teste da movimentação espontânea
Grupos de seis camundongos foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/Kg;
i.p.), diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.) ou veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%;
i.p.). Os animais foram colocados em uma caixa (50 × 50 × 50 cm) dividida em 16
quadrantes e a atividade locomotora espontânea foi avaliado 30, 60 e 90 min,
durante 3 min, após o tratamento, sendo quantificado o número de quadrantes
percorridos pelos animais (ASAKURA et al., 1993) (Figura 17).
Figura 16. Resumo esquemático do teste da coordenação motora (Rota-rod). Fotos: Renan G. Brito.
γ0’ 60’ 90’
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.)
Tempo de permanência
Seleção dos animais 24 h
45
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
4.6.1 Pleurisia induzida por carragenina
A carragenina é um polissacárido obtido a partir de diferentes algas marinhas.
A injecção de carragenina acarreta um processo inflamatório localizado,
sensibilizando os nociceptores aferentes primários. A indução de inflamação com
carragenina é um modelo clássico e tem sido amplamente utilizado para o
desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios (URBAN; GEBHART, 1999;
CHATTOPADHYAY et al., 2012).
A pleurisia foi induzida através de injecção intratorácica de carragenina (300
g; 0,1 mL) diluída em solução salina estéril. Grupos de seis animais foram pré-
tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.), solução salina ou indometacina (10
mg/kg, i.p.) 30 min antes da injecção do agente inflamatório. Quatro horas após a
estimulação, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2, as cavidades
pleurais foram abertas e lavadas com 1 mL de solução salina tamponada (PBS; 1x)
contendo EDTA (10 mM) (Figura 18).
Figura 17. Resumo esquemático do teste da movimentação espontânea. Fotos: Renan G. Brito.
γ0’ 60’ 120’
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Diazepam (1,5 mg/Kg; i.p.)
Número de quadrantes (3 min)
46
4.6.2 Quantificação de leucócitos
A contagem de leucócitos totais recolhidos no lavado pleural foi realizada em
câmara de Neubauer em microscópio óptico. As amostras foram diluídas (40x) em
solução de Turk. A análise diferencial de leucócitos foi feita com microscópio de luz
com objetiva de imersão em esfregaços citocentrifugados com corante de May-
Grunwald-Giemsa, onde foram contadas 100 células por lâmina (Figura 19).
4.6.3 Quantificação de TNF-α
4.6.3 Quantificação de TNF-α
A quantidade de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) produzido na cavidade
pleural foi avaliado 4 horas após a injecção de carragenina. O lavado pleural
recuperado foi centrifugado a 770 xg durante 10 min. TNF-α foi quantificado no
Ressuspensão e diluição (10 L em 400 L de solução de Turk) do
precipitado.
nº de cél./mL = nº de cél. x fator de diluição x fator de correção da
câmara x vol. de ressuspensão.
Figura 18. Resumo esquemático da pleurisia induzida por carragenina.
Figura 19. Resumo esquemático da quantificação de leucócitos.
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/Kg; i.p.) Indometacina (10 mg/kg; i.p.)
Carragenina γ00 g (0,1 mL; i.t.)
Eutanásia
Lavagem da pleura: 1 mL de PBS + EDTA
(10 mM)
Coleta e centrifugação do fluito
Câmara de CO2
γ0’ 4 h
47
sobrenadante isento de células através de um ensaio imunoenzimático (ELISA),
seguindo o protocolo do fabricante (BD-Bioscience Pharmingen) (Figura 20).
4.6.4 Geração de óxido nítrico por macrófagos
Uma suspensão de macrófagos peritoneais (5 x 106 células/100 L) foi
incubada em microplacas de 96 poços com 100 L de CT (1, 10 e 100 g/mL) ou
meio de cultura RPMI-1640, durante 24 horas a 37 °C com 5% CO2. Como controle
positivo utilizou-se 100 L de uma solução de LPS de 1 g/mL. Após incubação,
alíquotas de 100 l de sobrenadantes de cultura foram misturados com 100 l de
reagente de Griess (sulfanilamida 0,1%, N-naftil-etilenodiamina e 0,1% de ácido
fosfórico 3%). Após 10 min, à temperatura ambiente, a absorvância foi lida a 540 nm
em leitor de ELISA. Os dados foram expressos como a concentração ( M) de nitrito
por meio de uma curva padrão conhecida, com concentrações molares de NaNO2
em meio RPMI-1640 (GREEN et al., 1982). Os resultados foram obtidos a partir de
culturas em triplicata (Figura 21).
Coleta do fluido pleural
Centrifugação (770 rpm por 10 min)
Sobrenadante ensaio imunoenzimático
Leitor de elisa
5% CO2
24 h 24 h 37 ºC LPS
(1 g/mL)
Sobrenadante (100 L) +
Reagente de Griess (100 l)
Macrófagos (5 x 106 células/ 100 L)
CT (1, 10 e 100 g/mL) Meio de cultura (RPMI)
Leitor de elisa
Figura 20. Resumo esquemático da quantificação de TNF-α.
Figura 21. Resumo esquemático da geração de óxido nítrico por macrófagos.
48
4.7 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL
4.7.1 Perfusão, crioproteção e corte dos encéfalos
Grupos de seis animais foram tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.),
veículo (solução salina 0,9% + tween 80 0,2%; i.p.). Noventa minutos após o
tratamento, os animais foram anestesiados com cetamina (80 mg/kg; i.p.) e xylazina
(8 mg/kg; i.p.) para perfusão intracárdica, a qual consiste na injeção, no ventrículo
esquerdo, de uma agulha sem bizel conectada a um sistema de perfusão, que tem
por objetivo trocar o tecido sanguíneo por PBS (pH 7,4 ; 10 mM) à temperatura
ambiente, por um período de 5 min a um fluxo de 6 mL/min. Após perfusão por 5
minutos, o PBS foi substituído por uma solução de formalina tamponada 10% (pH
7,4) à temperatura ambiente, por um período de 30 min a um fluxo de 6 ml/min.
Após a perfusão, os animais foram decapitados e os encéfalos extraídos para o
processo de pós-fixação, crioproteção e congelamento. A pós-fixação consistiu em
submergir o encéfalo em formalina tamponada 10% por 2 h. Após o processo de
pós-fixação, o cérebro foi submetido ao processo de crioproteção que consiste em
transferí-lo para uma solução de sacarose 30% em tampão fosfato (pH 7,4), por 48
h. Após a crioproteção, o encéfalo foi congelado à -22 ºC, e posteriormente foram
levados ao criostato (Hestion HC4000) a -23 ºC para obtenção de secções com 20
m montadas em lâminas previamente gelatinizadas (Figura 22).
Figura 22. Resumo esquemático do processo de perfusão, crioproteção e corte. Fotos: Renan G. Brito.
48 h
2 h γ0’
Tratamento: Veículo (salina + tween 80 0,2%; i.p.)
CT (25, 50 e 100 mg/gg; i.p.)
Perfusão intracárdica
Extração do cérebro e pós-fixação
(formalina 10%)
Crioproteção (Sacarose 30%)
Corte (β0 m)
49
4.7.2 Imunofluorescência para Fos
O proto-oncogene, c-fos, codifica uma fosfoproteína nuclear a qual se liga ao
DNA, cuja função precisa ainda é desconhecida. O gene c-fos é expresso
constitutivamente num número limitado de tecidos e células. No entanto, a
expressão rápida e transiente do gene é induzida tanto em animais quanto em
culturas de células. Desta forma, o c-fos interfere nos eventos ocorridos a nível de
membrana, tais como a ligação de um fator de crescimento ao seu respectivo
receptor, para posterior alteração na expressão de genes, tão necessárias para a
progressão do ciclo celular (YANG et al., 1994; GUBITS; HAZELTON; SIMANTOV,
1988).
A proteína Fos é um marcador útil para o controle das atividades neuronais
das vias centrais do sistema sensorial, particularmente na via da dor. A expressão
de c-Fos pode ser estavelmente eliciada por vários estímulos nocivos, tais como
mecânicos, térmicos e químicos. Devido à modulação funcional de diferentes
populações neuronais no SNC, os padrões de expressão de c-Fos podem ser
distinguidos de acordo com diferentes estímulos nocivos (BAI et al., 2002;
MUNGLANI; HUNT, 1995).
Para a realização do protocolo de imunofluorescência para a proteína Fos,
além dos anticorpos primário e secundário, são utilizados três reagentes principais:
glicina, soro albumina bovina (BSA) e triton x-100. A reação de aldeídos, presente
no formaldeído utilizado na fixação e pós-fixação, com componentes do tecido, gera
um aumento da autofluorescência desse tecido. Objetivando a redução dessa
autofluorescência, é utilizada a glicina. Essa redução ocorre porque a glicina
alimenta o tecido com grupos amina (NH2), reduzindo o grupo -CHO a –OH
(DAVIES, 1998).
O anticorpo primário utilizado pode se ligar a sítios teciduais inespecíficos
gamaglobulinas, podendo levar a falsas interpretações. Por isso, faz-se necessário a
utilização de proteínas inertes alheias ao sistema reacional, tais como o BSA, as
quais ao competirem com os sítios de ligação inespecíficos, reduzem a reação
inespecífica, evitando a existência de reações indesejáveis (ABBAS, 2011).
O Triton X-100 é um detergente tensioativo não iônico frequentemente utilizado
em bioquímica, apresentando uma ampla gama de aplicações em sistemas
biológicos. Sua função no protocolo de imunfluorescência é a solubilização da
50
membrana plasmática, faciliando a entrada dos anticorpos nas células (PRETÉ et
al., 2002; PARTEARROYO; URBANEJA; GOÑI, 1992).
Para a execução da imunofluorescência para a proteína Fos, todas as secções
encefálicas foram processadas a temperatura ambiente (22 ºC) e lavadas em PBS
(pH 7,4; 5 x 5 min) após cada etapa de exposição aos reagentes, a qual teve início
com a lavagem em glicina (0,01 M) diluída em PBS, por 10 min, para reduzir a
autofluorescência do tecido. Em seguida, as ligações para gamaglobulina foram
bloqueadas com BSA (2%) em PBS por 30 min. Após a realização dessas etapas
para bloqueio de reações inespecíficas, seguiram-se as incubações com os
anticorpos primários e secundários. As secções encefálicas foram incubadas com o
anticorpo primário policlonal produzido em coelho, específico contra a proteína Fos
(SC 52, Santa Cruz Biotechnologies, USA), diluído 1/2000 em PBS, triton (0,2%) e
BSA (1%), por 16 h. Em seguida, os cortes foram expostos ao segundo anticorpo
(anti-IgG de coelho produzido em jumento e conjugado com Alexa Fluor 594), diluído
1/2000 em PBS, por 2 h. Finalmente, os cortes foram montados em solução de
glicerol (89% glicerol + 1% DABCO + 10% PBS) (Figura 23).
4.7.3 Aquisição das imagens
Todas as regiões encefálicas foram avaliadas e as secções contendo
neurônios marcados positivamente para Fos foram classificadas em regiões de
acordo com o Atlas Paxinos & Watson (1997) e fotografadas, bilateralmente,
Figura 23. Resumo esquemático do protocolo de imunofluorescência para proteína Fos. Fotos: Renan G. Brito.
5 x 5’ 2 h 5 x 5’ 16 h γ0’ 5 x 5’ 10’ 5 x 5’
PBS Glicina (0,01 M)
PBS BSA (2%)
Anticorpo Fos BSA (1%)
Triton (0,2%)
PBS Alexa Flúor
PBS Montagem em lâminas
51
utilizando-se um microscópio de fluorescência (Olympus IX2-ICB; E.U.A.) com
câmera digital (XM-10) (Figura 24).
4.7.4 Análise das imagens
Nas fotomicrografias das regiões encefálicas de cada animal, foi contado o
número de neurônios Fos positivos. Após a contagem dos neurônios, foi calculada
uma média aritmética do número de neurônios marcados em cada região de cada
animal. Dessa forma, cada animal apresentou um valor médio de neurônios
marcados para cada uma das regiões marcadas positivamente para Fos. Em
seguida, foi calculada, novamente, outra média aritmética (média do grupo) a partir
das médias obtidas de cada animal, encontrando-se o valor médio de neurônios Fos
positivos por grupo.
Para análise quantitativa das marcações, foi utilizada uma macro no programa
computacional Image J® (programa computacional disponibilizado gratuitamente
pelo National Institute of Health, EUA - http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) que viabiliza
as contagens automáticas do número de neurônios marcados para Fos, utilizando-
se, assim, um controle matemático para evitar o viés.
4.8 EUTANÁSIA E DESCARTES DOS ANIMAIS
Após a eutanásia dos animais, as carcaças foram depositadas em sacos
plásticos apropriados e armazenadas no freezer de coleta de material biológico,
Figura 24. Microscópio de fluorescência Olympus IX2-ICB, EUA. Foto: Renan G. Brito.
52
situado no Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da UFS, para posterior
recolhimento durante a coleta de lixo hospitalar. Os resíduos perfurocortantes foram
armazenados em caixas adequadas e levados até o Hospital Universitário para
descarte junto ao material hospitalar.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos em média ± e.p.m. A normalidade das amostras
foram avaliadas através do teste de Shapiro-Wilk e as diferenças entre os grupos
foram analisadas através do teste de variância ANOVA, uma via, seguido pelo teste
de Tukey, utilizando-se o software Graph Pad Prism 5.0® (San Diego, EUA). Valores
de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
53
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
A administração intraperitoneal de CT (25, 50 ou 100 mg/kg; i.p.), trinta minutos
antes da injecção do ácido acético, produziu uma diminuição significativa (p <0,001),
das contorções abdominais (Figura 25). O paracetamol (100 mg/kg, i.p.), utilizado
como controle positivo, também produziu uma redução significativa do
comportamento nociceptivo.
0
5
10
15
20
Veículo 25 50 100 100
CT (mg/kg) PAR (mg/kg)
***
*** ******
Nº
de
con
torç
ões
ab
do
min
ais
Figura 25. Efeito do citronelol (CT) no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou paracetamol (PAR, 100 mg/kg) foram administrados intraperitonealmete 30 min antes da injeção de ácido acético. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 8, por grupo). ***p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
O teste das contorções abdominais induzida por ácido acético é simples e
sensível para aferição da analgesia induzida tanto por opióides quanto por
analgésicos de ação periférica (HAYES; SHEEHAN; TYERS, 1987). Segundo LE
BARS; GOZARIU; CADDEN, (2001) a nocicepção induzida pela injeção de ácido
acético na cavidade peritoneal produz episódios característicos por movimentos de
alongamento (contorção), sendo a redução do número destes episódios facilmente
quantificável. A diminuição das contorções abdominais observada no presente
estudo pode ser justificada pelo fato do CT participar na inibição da síntese de
54
prostaglandinas, agindo, assim, sobre os mecanismos nociceptivos de
processamento ou de liberação de metabolitos do ácido araquidônico através da
COX e da biossíntese de prostaglandinas (GUIMARÃES et al., 2010).
O efeito de CT na nocicepção induzida por formalina em camudongos. O pré-
tratamento com CT (25, 50 ou 100 mg/kg) por via intraperitoneal, 30 min antes da
injeção formalina, causou um efeito antinociceptivo significativo (p < 0,01 ou p <
0,001) em ambas as fases (Figura 26). A morfina também causou uma ação
antinociceptiva significante em ambas as fases (p <0,001).
Veículo 25 50 100 30
10
20
30
40
50
60
CT (mg/kg)
A
*** ***
***
**
MOR (mg/kg)
Tem
po
de
lam
bid
a (s
)
Vehicle 25 50 100 30
25
50
75
100
125
CT (mg/kg)
B
****** ******
MOR (mg/kg)
Tem
po d
e la
mbi
da (
s)
Figura 26. Efeito do citronelol (CT) na nocicepção induzida por formalina em camudongos. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou Morfina (MOR, 3 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de formalina. (A) representa a primeira fase e (B) representa a segunda fase do teste da formalina. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6, por grupo). ** p <0,01 ou *** p <0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
55
O formaldeído diluído (1-8%), administrado por via subcutânea, produz um
comportamento nociceptivo que consiste em uma resposta bifásica: uma resposta
de curta duração designada por fase precoce e uma fase mais longa, causada por
um processo inflamatório, chamada de fase tardia (TJØLSEN et al., 1992; MOGIL,
2009; LUCCARINI et al., 2006). O componente bifásico da nocicepção induzida por
formaldeído reflete diferentes mecanismos subjacentes. A primeira fase parece estar
relacionada à estimulação química direta de terminações nervosas livres
nociceptivas, provavelmente um resultado direto da estimulação na pata, refletindo a
dor centralmente mediada com a liberação de substância P (LE BARS; GOZARIU;
CADDEN, 2001; RABOISSON; DALLEL, 2004), enquanto a segunda fase depende
de uma combinação de entradas contínuas de aferentes nociceptivos, devido à
liberação de aminoácidos excitatórios como, PGE2, óxido nítrico (NO) e de
taquiquininas, cininas, entre outros peptídeos (OKUSE, 2007; CAPUANO et al.,
2009). De acordo MOGIL, (2009) o teste de formalina é conhecido por atuar como
agonista do receptor TRPA1. Além disso, o NMDA contribui para o estímulo químico
persistente durante a fase tardia de sensibilização central dos neurônios do corno
dorsal da medula (HUNTER; SINGH, 1994). A maioria das drogas capazes de
reduzir a excitabilidade de neurônios da medula espinhal, incluindo os opióides,
AINEs e antagonistas do glutamato, também pode reduzir ou mesmo eliminar o
comportamento nociceptivo (HERRERO; LAIRD; LÓPEZ-GARCÍA, 2000), assim
como observado com o CT, o qual reduziu significativamente as duas fases do teste
da formalina.
No teste da placa quente, o tempo de reação aumentou significativamente em
todas as doses de CT (p <0,05 ou p <0,001) quando comparado ao controle.
Resultados semelhantes foram observados para o tratamento com morfina (3 mg/kg,
i.p.). Observou-se, ainda, que a naloxona (NAL, 1,5 mg/kg, i.p.) antagonizou a
resposta antinociceptiva da morfina (MOR) quando comparado com o grupo controle
no teste da placa quente. Da mesma forma, a naloxona antagonizou o efeito da CT
(100 mg/kg) quando comparado com o controle (tabela 2).
Substâncias que produzem um forte efeito de inibição no teste de placa
quente podem inibir a dor induzida centralmente e atuam como analgésicos fortes
(PARKHOUSE, 1979; LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001). Os resultados
sugerem que o CT, em todas as doses testadas, apresenta um efeito analgésico
central, fato evidenciado pelo aumento no tempo de resposta quando os animais
56
foram submetidos ao estímulo nociceptivo durante o teste. Esta ação analgésica
central foi confirmada através do bloqueio do efeito antinociceptivo do CT pela
naloxona, um antagonista específico dos receptores opióides (MUNDEY et al.,
2000).
Tabela 2. Efeito antinociceptivo do citronelol (CT) no teste da placa quente em camudongos. Tratamento Dose
(mg /kg)
Tempo de reação (s)a
Basal 30 min 60 min 90 min 120 min
Veículo - 10,3 ± 1,6 9,6 ± 1,1 8,1 ± 0,9 7,1 ± 0,3 9,0 ± 1,2
CT 25 8,0 ± 0,8 11,6 ±1,2 13,1 ± 1,7 15,8 ± 3,1b 19,0 ± 3,0b
CT 50 4,8 ± 0,6 15,8 ± 1,5b 17,5 ± 1,8d 17,3 ± 0,9c 19,5 ± 2,3b
CT 100 8,3 ± 0,9 16,0 ± 2,1b 15,3 ± 0,8c 15,6 ± 1,7b 22,0 ± 1,0c
CT + NAL 100 + 0.5 8,5 ± 0,7 8,1 ± 1,0 9,1 ± 1,1 7,5 ± 0,9 9,6 ± 1,3
MOR 3 9,2 ± 1,8 28,9 ± 2,3d 28,3 ± 1,5d 30,0 ± 0,0d 29,3 ± 2,1d
MOR + NAL 3 + 0.5 8,9 ± 2,2 10,3 ± 2,8 9,5 ± 3,7 9,9 ± 3,9 10,4 ± 5,5
n = 10, por grupo; a Valores expressos em media ± e.p.m; bp < 0,05, cp < 0,01 e dp < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
5.2 TESTES OROFACIAIS DE NOCICEPÇÃO
A administração de CT, nas doses, produziu uma redução significativa (p <
0,001) no tempo de fricção da região orofacial no teste da nocicepção orofacial
induzida por formalina quando comparado ao controle (Figura 27).
Veículo 25 50 100 50
25
50
75
100
CT (mg/kg)
*** ***
***
***
A
MOR (mg/kg)
Fri
cção
da
reg
ião
oro
faci
al (
s)
57
Veículo 25 50 100 50
60
120
180
240
CT (mg/kg)
******
******
B
MOR (mg/kg)
Fri
cção
da
reg
ião
oro
faci
al (
s)
Figura 27. Efeitos do CT sobre o teste da nocicepção orofacial induzida por formalina. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de formalina. (A) primeira fase (0-5 minutos) e (B) segunda fase (15 a 40 minutos). Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
O teste de nocicepção orofacial induzida por formalina representa um modelo
animal de nocicepção cutânea persistente na região trigeminal. Nesse teste a
resposta comportamental expressa pelo animal difere acentuadamente do que é
observado nos ensaios mais comuns, em que a pata traseira é estimulada. As vias
que controlam essas respostas motoras são distintas, o que ajuda a compreender as
diferenças nos processos de informação nociceptiva entre as regiões da coluna
vertebral e do trigêmeo, sendo possível examinar diferentes níveis de integração do
mesmo estímulo nocivo nos sistemas nervosos periférico e central (RABOISSON;
DALLEL, 2004). Desta forma, a inibição do comportamento nociceptivo pelo CT,
observada no presente estudo, torna tal monoterpeno uma substância
possivelmente útil no tratamento de processos nociceptivos na região trigeminal.
O CT, em todas as doses, também reduziu, de forma significativa (p < 0,001),
o tempo de fricção da região orofacial no teste da nocicepção orofacial induzida pela
administração de capsaicina (Figura 28).
58
Veículo 25 50 100 50
50
100
150
200
250
*** ****** ***
CT (mg/kg) MOR (mg/kg)
Fri
cção
da
reg
ião
oro
faci
al (
s)
Figura 28. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por capsaicina. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
A capsaicina tem ação seletiva sobre as fibras sensitivas que transmitem
sensações de dor e provocam vasodilatação reflexa do axônio, a qual resulta da
ativação do receptor vanilóide 1, um canal iônico sensível ao calor presente em
neurônios sensoriais de pequeno diâmetro. A injeção de capsaicina também é capaz
de aumentar a excitabilidade dos neurônios nociceptivos trigeminais (PELISSIER;
PAJOT; DALLEL, 2002). Esta inibição observada tanto no teste da capsaicina
quanto no teste da formalina pode ser resultado de uma inibição da substância P ou
do bloqueio do receptor neuroquinina 1 (NK-1) (HOLANDA PINTO et al., 2008), pois
estudos demonstraram que a administração de um antagonista de NK-1 é capaz de
bloquear a segunda fase do teste de formalina (LUCCARINI et al., 2003).
Os resultados do teste de nocicepção orofacial induzida pelo glutamato. O
CT, em todas as doses, promoveu uma redução significativa (p <0,01 ou p <0,001)
do tempo de fricção da região orofacial (Figura 29).
59
Veículo 25 50 100 50
25
50
75
100
CT (mg/kg)
*****
******
MOR (mg/kg)
Fri
cção
da
reg
ião
oro
faci
al (
s)
Figura 29. Efeitos do CT sobre a nocicepção orofacial induzida por glutamato. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/ kg) ou morfina (MOR, 5 mg/kg) foram administrados intraperitonealmente 30 min antes da injeção de capsaicina. Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). **p < 0,01 e ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
O glutamato é capaz de ativar os nociceptores aferentes primários após a sua
liberação a partir de tecidos inflamados, uma vez que a administração de cetamina,
um antagonista do receptor NMDA, na articulação temporomandibular (ATM),
provocou uma atenuação significativa da dor induzida por glutamato (HONDA et al.,
2011). Assim, a inibição da nocicepção induzida por glutamato por meio do
tratamento com CT pode estar associada com a sua interação com o sistema
glutamatérgico.
Além disso, como a inibição da excitabilidade neuronal está associada ao
bloqueio dos canais de Na+, DE SOUSA et al. (2006) mostraram que o CT foi capaz
de reduzir a excitabilidade dos nervos isolados através de uma diminuição do
potencial de ação composto (CAP) de amplitude. Vários estudos sugerem que a
avaliação do CAP permite analisar a ação de novas substâncias sobre os canais de
Na+ e sobre a condutância elétrica de fibras mielinizadas (DE SOUSA et al., 2006;
QUINTANS-JÚNIOR et al., 2010). Desta forma, este efeito poderia estar
influenciando a resposta antinociceptiva do CT observada nos modelos
experimentais de nocicepção utilizados neste estudo.
60
5.3 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA
No teste rota rod, os animais tratados com CT não apresentaram qualquer
alteração significativa no desempenho motor nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg
(Figura 30). Entretanto, conforme esperado, o diazepam (DZP), drogra depressora
do SNC, reduziu o tempo em que os animais permaneram no rota rod quando
comparado ao controle.
Veículo 25 50 100 DZP Veículo 25 50 100 DZP Veículo 25 50 100 DZP0
50
100
150
200
CT (mg/kg) CT (mg/kg) CT (mg/kg)
0,5 h 1 h 2 h
******
***
Tem
po (s
) no
Rot
a ro
d
Figura 30. Tempo de permanência (s) no rota rod. Veículo (controle), CT (25, 50 e 100 mg/kg) ou Diazepam (DZP; 1,5 mg/kg) foram admnistrados intraperitonealmente trinta minutos antes do início do teste. A resposta motora foi avaliada por 180 s. Valores expressos em média e.p.m. (n = 6, por grupo). ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
No teste de movimentação espontânea, os animais tratados com as diferentes
doses de CT não apresentaram redução significativa da locomoção espontânea
(número de cruzamentos) nos tempos de 30, 60 e 120 min após a administração, ao
contrário do DZP, que reduziu significativamente o número de cruzamentos ( p <
0,001) (Tabela 3).
Levando-se em consideração o efeito antinociceptivo do CT observado no
teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético, no teste da formalina,
no teste da placa quente e nos testes de nocicepção orofacial, decidiu-se, também,
examinar os efeitos do CT sobre o desempenho motor no teste do Rota rod, uma
vez que estudos anteriores sugeriram que a depressão do SNC e os efeitos de
relaxamento muscular não específicos podem reduzir a coordenação motora e
61
invalidar os resultados obtidos nos testes comportamentais (LE BARS; GOZARIU;
CADDEN, 2001; RABOISSON; DALLEL, 2004). Desta forma, os resultados do
presente estudo não mostraram qualquer interferência, nas doses testadas, na
coordenação motora dos animais, eliminando-se, assim, a possibilidade da
existência de um efeito de relaxamento muscular inespecífico gerado pelo CT nas
doses utilizadas. Para descartar qualquer possibilidade de interferência do CT sobre
a atividade motora dos animais, consolidando os efeitos nociceptivos, foi avaliado,
ainda, o efeito do CT na movimentação espontânea no campo aberto. Os resultados
mostraram que o CT, mais uma vez, não foi capaz de alterar a coordenação motora
dos animais, nas doses avaliadas. Este resultado confirma que a hipótese da ação
antinociceptiva do CT observada neste estudo não é resultado de uma possível ação
depressora dos centros que coordenam a atividade motora do animal a nível de
SNC.
Tabela 3. Efeitos do citronelol (CT) sobre a movimentação espontânea em camudongos
Tratamento Dose
(mg/kg)
Número de cruzamentosa
γ0’ 60’ 1β0’
Veículo - 47,6 ± 6,4 31,8 ± 1,7 26,0 ± 2,8
CT 25 57,6 ± 5,9 39,3 ± 3,1 29,5 ± 3,9
CT 50 36,1 ± 2,2 27,5 ± 3,6 24,6 ± 4,3
CT 100 40,6 ± 7,6 31,0 ± 2,9 26,3 ± 2,9
DZP 1,5 0,6 ± 0,3*** 0,5 ± 0,2*** 2,6 ± 0,8***
n = 6, por grupo. aValores expressos em media ± e.p.m. ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
A administração de carragenina na cavidade pleural induziu um aumento no
número de leucócitos caracterizado por um aumento no número de neutrófilos 4 h
após a injeção. O tratamento com CT (25, 50 e 100 mg/kg; i.p.) causou uma
diminuição dose dependente significativa no número total de leucócitos quando
administrado 0,5 h antes da carragenina (Figura 31A). Tal redução foi atribuída à
62
inibição do influxo de neutrófilos (Figura 31B). Entratanto, o CT não alterou a
migração mononuclear (Figura 31C). A injecção de carragenina também leva um
aumento substancial na produção de TNF-α no exsudato pleural quando comparado
com o grupo controle (Figura 31D). Uma redução significativa nos níveis de TNF-α
foi observada nos grupos tratados com CT (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) quando
comparado ao controle (Figura 31D).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Citronelol (mg/kg) Indo
Carragenina (300 g/cavidade)
Salina Veículo 25 50 100 10
*****
***
***
++
Leu
cóci
tos
tota
is(1
06
célu
las/
cavi
dad
e)
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Citronelol (mg/kg) Indo
Carragenina (300 g/cavidade)
Salina Veículo 25 50 100 10
+++
*****
******
Neu
tró
filo
s(1
06cé
lula
s/ca
vid
ade)
0
1
2
3
4
5
Citronelol (mg/kg) Indo
Carragenina (300 g/cavidade)
Salina Veículo 25 50 100 10
*
Cél
ula
s M
on
on
ucl
eare
s(1
06
célu
las/
cavi
dad
e)
0
100
200
Salina Veículo 25 50 100 10
Citronelol (mg/kg) Indo
Carragenina (300 g/cavidade)
++
**
**
TN
F-
(ng
/mL
)
A B
C D
Figura 31. Efeito do CT sobre a pleurisia induzida por carragenina. As análises foram realizadas 4 h após a injecção de carragenina (300 ng/cavidade), avaliando-se o recrutamento de leucócitos totais (A), neutrófilos (B), células mononucleares (C) e TNF-α (D). Os dados foram expressos em média ± e.p.m (n = 8/ por grupo). ++p < 0,01 e +++p < 0,001 em comparação ao controle. *p < 0,05, ** p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação ao controle (ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
Os macrófagos peritoneais estimulados com LPS durante 24 horas liberaram
uma quantidade significativa (p < 0,01) de nitrito quando comparado as células não
estimuladas. O pré-tratamento das células com CT (1 e 100 g/mL) inibiu
significativamente (p < 0,05) a liberação de nitrito (Figura 32).
63
0
5
10
15
20
25
RPMI Veículo 25 50 100
Citronelol (mg/kg)
LPS (1 g/mL)
++
**
Pro
du
çã
o d
e n
itri
to ( M
)
Figura 32. Efeito do CT na geração de nitrito por macrófagos. As células foram mantidas em meio de cultura (RPMI) ou pré-incubadas com CT por 24 horas, e em seguida tratado com LPS (1 ng/mL) durante 24 h. Os níveis de nitrito nos sobrenadantes de cultura foram avaliadas e os resultados foram expressos em concentração (uM) de nitrito no meio de cultura. Os dados foram expressos em a média ± e.p.m., sendo os valores obtidos em triplicado. ++p <0,01 em comparação com o RPMI e *p < 0,05 quando comparado ao controle (veículo)(ANOVA, uma via, seguido pelo teste de Tukey).
A pleurisia induzida por carragenina é um modelo de inflamação aguda em
que o extravasamento de líquidos, a migração leucocitária e os diversos parâmetros
bioquímicos envolvidos na resposta inflamatória, tal como o TNF-α, podem ser
facilmente medidos nos exsudados (MIKAMI; MIYASAKA, 1983; LORAM et al.,
2007). O CT inibiu a migração de neutrófilos induzida por carragenina, podendo, sua
ação, estar associada à inibição da síntese de vários mediadores inflamatórios
envolvidos na migração de células, como TNF-α. Além disso, o CT também reduziu,
nas doses de 25 e 100 mg/kg) os níveis de nitrito, o que pode indicar uma redução
na produção de óxido nítrico (NO), um importante mediador envolvido em condições
dolorosas inflamatórias. Estes resultados corroboram com SU et al. (2010) que
mostraram que o CT inibiu a atividade enzimática da iNOS e foi capaz de reduzir
significativamente a expressão da proteína COX-2 e do mRNA induzidos por LPS.
5.5 AVALIAÇÃO DA AÇÃO CENTRAL
No bulbo olfatório (Figura 33), córtex piriforme (Figura 34), córtex
retroesplenial (Figura 35) e na substância cinzenta periaquedutal (Figura 36), o
64
número médio de neurónios marcados positivamente para proteína Fos aumentoui
significativamente (p < 0,05) noventa minutos após a injeção intraperitoneal de CT
quando comparado ao controle (veículo). No entanto, o CT na dose de 25 mg/kg não
alterou significativamente o número médio de neurônios marcados para proteína Fos
no córtex piriforme quando comparado ao controle.
Veículo 25 50 1000
10
20
30
40
CT (mg/kg)
**
***
***
Cél
ulas
FO
S P
osit
ivas
A
Figura 33. A. Células FOS positivas no bulbo olfatório. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.
Figura 34. A. Células FOS positivas no córtex piriforme. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). **p < 0,01 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.
Veículo 25 50 1000
10
20
30
CT (mg/kg)
** **
Cél
ulas
FO
S p
osit
ivas
A
65
A ativação de neurônios nociceptivos aferentes primários estimula a
expressão de proteínas codificadas pelos genes de expressão imediata, a exemplo
da proteína Fos, a qual é codificada pelo gene c-Fos. A expressão destas proteínas
Figura 35. A. Células FOS positivas no córtex retroespinal. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). **p < 0,01 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.
Figura 36. A. Células FOS positivas na substância cinzenta periaquedutal. Veículo (B; controle) ou CT nas doses de 25 mg/Kg (C), 50 mg/Kg (D) e 100 mg/kg (E), i.p., foi administrado noventa minutos antes da perfusão. Valores expressos em média ± e.p.m. (n = 6/por grupo). *p < 0,5 ou ***p < 0,001 quando comparado ao controle (ANOVA uma via seguido pelo Teste de Tukey). Aumento: 20x. Escala: 20 m.
Veículo 25 50 1000
10
20
30
CT (mg/kg)
**
******
Cél
ula
s F
OS
po
siti
vas
A
Veículo 25 50 1000
10
20
30
CT (mg/kg)
*
*** ***
Cél
ulas
FO
S p
osit
ivas
A
66
que controlam a transcrição dos genes alvo é desencadeada pela excitação
sináptica das fibras nociceptivas A e C. Desta forma, a proteína Fos é rapidamente
expressa em neurônios centrais após estímulos nocivos, sendo utilizada, através da
realização de técnicas de imunohistoquímica e imunofluorescência, como um
marcador para a visualização das vias e áreas centrais envolvidas na nocicepção
(COGGESHALL, 2005).
No presente estudo, foi realizado o protocolo de imunofluorescência para
proteína Fos objetivando avaliar a ação do CT sobre as regiões centrais envolvidas
na nocicepção, demonstrando-se uma ativação significativa do bulbo olfatório, córtex
piriforme, córtex restroesplenial e da substância cinzenta periaquedutal. O bulbo
olfatório projeta-se para córtex piriforme não apresentando qualquer aparente
organização espacial. As células mitrais e do glomérulo do bulbo olfativo inervam
diversas e grandes regiões do córtex piriforme (LEINWAND; CHALASANI, 2011). O
córtex piriforme também recebe informações da amígdala e hipocampo e projeta
seus axônios para a própria amígdala e para o hipotálamo, áreas relacionadas com
o comportamento agressivo e de acasalamento dos animais (SEMBA, 2000).
O córtex retroesplenial (RSP) se projeta para o núcleo anterior ipsilateral
pretectal (APTN), uma estrutura implicada na antinocicepção, que envolve
resceptores locais muscarínicos, colinérgicos, opióides e serotoninérgicos
(ROSSANEIS; REIS; PRADO, 2011). REIS et al. (2010) demonstraram que a
estimulação elétrica do córtex occipital ou RSP induz antinocicepção em ratos nos
testes de retirada da cauda e da formalina. Esta ação ocorre, provavelmente, devido
à capacidade do RSP ativar o APTN e, consequentemente, estimular a ativação da
via descendente da dor, que descende pelo funículo dorsolateral para inibir os
neurônios da lâmina V (FOSTER et al., 1989; ROBERTS; REES, 1986).
A substância cinzenta periaquedutal (PAG) circunda o aqueduto
mesencefálico e desempenha um papel fundamental na via descedente inibitória da
dor, a qual modula a informação nociceptiva por meio da ativação de vias que atuam
na inibição dos neurônios sensoriais presentes na medula espinhal. Mais
especificamente, a PAG faz conexões com o núcleo magno da rafe, com o
paragigantocelular e com os núcleos da medula rostroventromedial, e em seguida,
projeto-se através do funículo dorsolateral para a medula espinhal (DESANTANA et
al., 2009; GUIMARÃES; PRADO, 1999). Dessa forma, a ativação da PAG exerce
efeito antinociceptivo e inibe as respostas de neurônios espinhais a estímulos
67
nociceptivos centrais e periféricos (ZUBRZYCKA; SZEMRAJ; JANECKA, 2011). A
antinocicepção evocada a partir da PAG é mediada pelos receptores opióides e
pode ser atenuada pela administração simultânea de um antagonista de opióides,
tais como a naloxona (AKIL; MAYER; LIEBESKIND, 1976; JENSEN; YAKSH, 1986).
O efeito antinociceptivo da CT, descrito no presente estudo, é bloqueado pela
administração de naloxona no teste da placa quente, sugerindo-se, assim, que o CT
ativa a via descendente inibitória da dor, fato evidenciado pelo aumento significativo
do número de células Fos positivas observadas na PAG através do protocolo de
imunofluorescência para proteína Fos, sendo tal ativação mediada, provavelmente,
por receptores opióides centrais.
Os canais de sódio voltagem-dependentes são fundamentais na regulação da
excitabilidade dos neurônios e a expressão desses canais pode facilitar a
transmissão nociceptiva, ou seja, a expressão contínua desses canais pode ser um
dos principais contribuintes para a sensibilização de neurônios aferentes primários e,
consequente, geração de dor (SCHUELERT; MCDOUGALL, 2012). Desta forma, o
bloqueio dos canais de sódio pode facilitar a ativação da via descendente inibitória
da dor, através da ativação de receptores opióides presentes na PAG, uma vez
que estudos vêm descrevendo que o efeito antinociceptivo oriundo da ativação dos
receptors opióides pode estar relacionado com a inibição dos canais de sódio (LI;
BACCEI, 2011; KANG et al., 2009). Diante disso, pode-se sugerir que o CT pode
estar facilitando a ativação da via descendente inibitória da dor tanto pelo bloqueio
do canais de sódio, conforme descrito por (DE SOUSA et al., 2006), quanto pela
ativação direta da PAG, conforme descrito no presente estudo.
Sendo assim, a ativação do bulbo olfatório e córtex piriforme indicam que o
CT apresenta alguma influência sobre o comportamento agressivo e de
acasalamento. Já, a ativação do RSP e da PAG sugere o envolvimento do SNC no
efeito antinociceptivo do CT, corroborando os resultados mostrados na primeira fase
do teste de formalina e no teste da placa quente.
68
6 CONCLUSÃO
Os dados apresentados no presente estudo nos permitem sugerir que o
citronelol:
apresenta ação antinociceptiva, sendo capaz de reduzir a nocicepção
orofacial em roedores;
possui ação anti-inflamatória, provalvemente mediada pela inibição de
citocinas pró-inflamatórias, a exemplo do TNF-α;
apresenta ação sobre o SNC, atuando sobre o bulbo olfatório, córtex
piriforme, córtex restroesplenial e a substância cinzenta periaquedutal (PAG),
provavelmente por sinalização opióide, visto que o efeito antinociceptivo do
citronelol foi revertido pela naloxona e que o córtex restroesplenial e o PAG
são estruturas centrais intimamente relacionadas com os mecanismos
modulatórios da dor;
nas doses utilizadas não induz qualquer tipo de incoordenação motora.
Outros estudos são necessários visando elucidar os mecanismos de ação, tanto
centrais quanto periféricos, do citronelol, assim como a ação do citronelol sobre
doenças que apresentam, como característica clínica principal, dor, podendo-se,
assim, entender melhor tal perfil analgésico sugerido para o citronelol.
69
REFERÊNCIAS
ABBAS, A. Imunologia Básica. 6ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011.
ABDEL-FATTAH, A. M.; MATSUMOTO, K.; WATANABE, H. Antinociceptive effects of Nigella sativa oil and its major component, thymoquinone, in mice. European Journal of Pharmacology, v. 400, n. 1, p. 89–97, 14 jul. 2000.
AGARWAL, N. et al. Cannabinoids mediate analgesia largely via peripheral type 1 cannabinoid receptors in nociceptors. Nature Neuroscience, v. 10, n. 7, p. 870–879, 2007.
AGGARWAL, S. et al. Acinar cells of the pancreas are a target of interleukin-22. Journal of Interferon & Cytokine Research, v. 21, n. 12, p. 1047–1053, dez. 2001.
AKIL, H.; MAYER, D. J.; LIEBESKIND, J. C. Antagonism of stimulation-produced analgesia by naloxone, a narcotic antagonist. Science, v. 191, n. 4230, p. 961–962, 5 mar. 1976.
ALVES NETO, O. Dor: princípios e prática. 1. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.
ALVES-FILHO, J. C.; SPILLER, F.; CUNHA, F. Q. Neutrophil paralysis in sepsis. Shock (Augusta, Ga.), v. 34 Suppl 1, p. 15–21, set. 2010.
AMIN, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine, v. 106, n. 1, p. 9–14, jan. 2012.
ANDERSON, L. C.; VAKOULA, A.; VEINOTE, R. Inflammatory hypersensitivity in a rat model of trigeminal neuropathic pain. Archives of Oral Biology, v. 48, n. 2, p. 161–169, fev. 2003.
ANDRADE, G. S. et al. Phytochemical screening, antinociceptive and anti-inflammatory effects of the essential oil of Myrcia pubiflora in mice. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 22, n. 1, p. 181–188, fev. 2012.
ANKIER, S. I. New hot plate tests to quantify antinociceptive and narcotic antagonist activities. European Journal of Pharmacology, v. 27, n. 1, p. 1–4, jun. 1974.
ARAMORI, I.; NAKANISHI, S. Coupling of two endothelin receptor subtypes to differing signal transduction in transfected Chinese hamster ovary cells. The Journal of Biological Chemistry, v. 267, n. 18, p. 12468–12474, 25 jun. 1992.
ARRANG, J. M.; GARBARG, M.; SCHWARTZ, J. C. Auto-inhibition of brain histamine release mediated by a novel class (H3) of histamine receptor. Nature, v. 302, n. 5911, p. 832–837, 28 abr. 1983.
ASAKO, H. et al. Indomethacin-induced leukocyte adhesion in mesenteric venules: role of lipoxygenase products. The American Journal of Physiology, v. 262, n. 5 Pt 1, p. G903–908, maio. 1992.
ASAKURA, W. et al. Effect of alpha 2-adrenergic drugs on REM sleep deprivation-induced increase in swimming activity. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, v. 46, n. 1, p. 111–115, set. 1993.
70
AZEVEDO, L. F. et al. Epidemiology of chronic pain: a population-based nationwide study on its prevalence, characteristics and associated disability in Portugal. The Journal of Pain, v. 13, n. 8, p. 773–783, ago. 2012.
BACHVAROV, D. R. et al. Structure and genomic organization of the human B1 receptor gene for kinins (BDKRB1). Genomics, v. 33, n. 3, p. 374–381, 1 maio. 1996.
BADOLATO, R. et al. Interleukin-15 (IL-15) induces IL-8 and monocyte chemotactic protein 1 production in human monocytes. Blood, v. 90, n. 7, p. 2804–2809, 1 out. 1997.
BAI, Z.-T. et al. c-Fos expression in rat spinal cord induced by scorpion BmK venom via plantar subcutaneous injection. Neuroscience Research, v. 44, n. 4, p. 447–454, dez. 2002.
BAJIC, D.; PROUDFIT, H. K. Projections of neurons in the periaqueductal gray to pontine and medullary catecholamine cell groups involved in the modulation of nociception. The Journal of Comparative Neurology, v. 405, n. 3, p. 359–379, 15 mar. 1999.
BAKKALI, F. et al. Biological effects of essential oils--a review. Food and Chemical Toxicology, v. 46, n. 2, p. 446–475, fev. 2008.
BALDWIN, A. S., Jr. The NF-kappa B and I kappa B proteins: new discoveries and insights. Annual Review of Immunology, v. 14, p. 649–683, 1996.
BALSINDE, J.; WINSTEAD, M. V.; DENNIS, E. A. Phospholipase A2 regulation of arachidonic acid mobilization. FEBS Letters, v. 531, n. 1, p. 2–6, 30 out. 2002.
BANDELL, M. et al. Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron, v. 41, n. 6, p. 849–857, 25 mar. 2004.
BARNES, P. J.; KARIN, M. Nuclear Factor- B — A Pivotal Transcription Factor in Chronic Inflammatory Diseases. New England Journal of Medicine, v. 336, n. 15, p. 1066–1071, 1997.
BASBAUM, A. I. et al. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell, v. 139, n. 2, p. 267–284, 16 out. 2009.
BASTOS, J. F. A. et al. Hypotensive and vasorelaxant effects of citronellol, a monoterpene alcohol, in rats. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, v. 106, n. 4, p. 331–337, abr. 2010.
BASU, S.; THOMAS, J.; ACHARYA, S. Prospects for Growth in Global Nutraceutical and Functional Food Markets: A Canadian Perspective. n. 1, p. 637–649, 2007.
BATISTA, P. A. et al. Evidence for the involvement of ionotropic glutamatergic receptors on the antinociceptive effect of (-)-linalool in mice. Neuroscience Letters, v. 440, n. 3, p. 299–303, 8 ago. 2008.
BECKER, D. E. Pain Management: Part 1: Managing Acute and Postoperative Dental Pain. Anesthesia Progress, v. 57, n. 2, p. 67–79, jun. 2010.
71
BEKKERING, G. E. et al. Epidemiology of chronic pain and its treatment in The Netherlands. The Netherlands Journal of Medicine, v. 69, n. 3, p. 141–153, mar. 2011.
BESTER, H. et al. Physiological Properties of the Lamina I Spinoparabrachial Neurons in the Rat. Journal of Neurophysiology, v. 83, n. 4, p. 2239–2259, 4 jan. 2000.
BIAŁY, M.; KACZMAREK, L. c-Fos expression as a tool to search for the neurobiological base of the sexual behaviour of males. Acta Neurobiologiae Experimentalis, v. 56, n. 2, p. 567–577, 1996.
BIGNOLD, L. P.; LYKKE, A. W. Increased vascular permeability induced in synovialis of the rat by histamine, serotonin and bradykinin. Experientia, v. 31, n. 6, p. 671–672, 15 jun. 1975.
BISGAARD, H. Leukotrienes and prostaglandins in asthma. Allergy, v. 39, n. 6, p. 413–420, ago. 1984.
BOEHM, U. et al. Cellular responses to interferon-gamma. Annual Review of Immunology, v. 15, p. 749–795, 1997.
BONFIELD, T. L. et al. Normal bronchial epithelial cells constitutively produce the anti-inflammatory cytokine interleukin-10, which is downregulated in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 13, n. 3, p. 257–261, set. 1995.
BONIFACE, K. et al. From interleukin-23 to T-helper 17 cells: human T-helper cell differentiation revisited. Immunological Reviews, v. 226, p. 132–146, dez. 2008.
BOURGEAIS, L.; GAURIAU, C.; BERNARD, J. F. Projections from the nociceptive area of the central nucleus of the amygdala to the forebrain: a PHA-L study in the rat. The European Journal of Neuroscience, v. 14, n. 2, p. 229–255, jul. 2001.
BRASILEIRO, B. G. et al. Medicinal plants used by the population assisted by the “Programa de Saúde da Família” (Family Health Program) in Governador Valadares County - MG, Brazil. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 44, n. 4, p. 629–636, dez. 2008.
BUCKLEY, C. D. et al. Fibroblasts regulate the switch from acute resolving to chronic persistent inflammation. Trends in Immunology, v. 22, n. 4, p. 199–204, abr. 2001.
BURMEISTER, S. S.; MANGIAMELE, L. A.; LEBONVILLE, C. L. Acoustic modulation of immediate early gene expression in the auditory midbrain of female túngara frogs. Brain Research, v. 1190, p. 105–114, 23 jan. 2008.
BUTLER, D. Translational research: crossing the valley of death. Nature, v. 453, n. 7197, p. 840–842, 12 jun. 2008.
CALIXTO, J. B.; SIQUEIRA JUNIOR, J. M. Desenvolvimento de Medicamentos no Brasil: Desafios. Gazeta Médica da Bahia, v. 78, n. 1, 7 out. 2008.
CALVINO, B.; GRILO, R. M. Central pain control. Joint Bone Spine, v. 73, n. 1, p. 10–16, jan. 2006.
72
CANETTI, C. et al. Tumour necrosis factor-alpha and leukotriene B4 mediate the neutrophil migration in immune inflammation. British Journal of Pharmacology, v. 134, n. 8, p. 1619–1628, dez. 2001.
CAPUANO, A. et al. Antinociceptive activity of buprenorphine and lumiracoxib in the rat orofacial formalin test: a combination analysis study. European Journal of Pharmacology, v. 605, n. 1-3, p. 57–62, 1 mar. 2009.
CARVALHO, A. et al. Aspectos da legislação no controle dos medicamentos fitoterápicos. T&C Amazônia, p. 26–33, 2007.
CATERINA, M. J. et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature, v. 389, n. 6653, p. 816–824, 23 out. 1997.
CATERINA, M. J. et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science, v. 288, n. 5464, p. 306–313, 14 abr. 2000.
CAVAILLON, J. M. Cytokines and macrophages. Biomedicine & Pharmacotherapy; v. 48, n. 10, p. 445–453, 1994.
CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais: conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Química Nova, v. 21, n. 1, p. 99–105, fev. 1998.
CESSELIN, F. et al. Basic and regulatory mechanisms of in vitro release of Met-enkephalin from the dorsal zone of the rat spinal cord. Journal of Neurochemistry, v. 43, n. 3, p. 763–774, set. 1984.
CHATTOPADHYAY, P. et al. Vitex negundo inhibits cyclooxygenase-2 inflammatory cytokine-mediated inflammation on carrageenan-induced rat hind paw edema. Pharmacognosy Research, v. 4, n. 3, p. 134–137, 2012.
CHEN, C.-C. et al. Identification of mast cell progenitors in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, n. 32, p. 11408–11413, 8 set. 2005.
CLAUW, D. J.; ARNOLD, L. M.; MCCARBERG, B. H. The science of fibromyalgia. Mayo Clinic proceedings. Mayo Clinic, v. 86, n. 9, p. 907–911, set. 2011.
CLAVELOU, P. et al. Application of the formalin test to the study of orofacial pain in the rat. Neuroscience Letters, v. 103, n. 3, p. 349–353, 11 set. 1989.
COGGESHALL, R. E. Fos, nociception and the dorsal horn. Progress in Neurobiology, v. 77, n. 5, p. 299–352, dez. 2005.
COGHILL, R. C. et al. Distributed processing of pain and vibration by the human brain. The Journal of Neuroscience, v. 14, n. 7, p. 4095–4108, 7 jan. 1994.
COLBURN, R. W. et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron, v. 54, n. 3, p. 379–386, 3 maio. 2007.
73
COLLIER, H. O. et al. The abdominal constriction response and its suppression by analgesic drugs in the mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy, v. 32, n. 2, p. 295–310, fev. 1968.
COLLINS, M.; WHITTERS, M. J.; YOUNG, D. A. IL-21 and IL-21 receptor: a new cytokine pathway modulates innate and adaptive immunity. Immunologic Research, v. 28, n. 2, p. 131–140, 2003.
CORDEIRO, C. H. G.; CHUNG, M. C.; SACRAMENTO, L. V. S. DO. Drug interactions between herbs and medicines: Hypericum perforatum and Piper methysticum. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 15, n. 3, p. 272–278, set. 2005.
COSTA, V. P.; MAYWORM, M. A. S. Medicinal plants used by the community of Tenentes District - Extrema Municipality, Minas Gerais State, Brazil. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 13, n. 3, p. 282–292, jan. 2011.
COUTURE, R. et al. Kinin receptors in pain and inflammation. European Journal of Pharmacology, v. 429, n. 1-3, p. 161–176, 19 out. 2001.
CROFFORD, L. J.; CASEY, K. L. Central modulation of pain perception. Rheumatic Disease Clinics of North America, v. 25, n. 1, p. 1–13, 1 fev. 1999.
CUNHA, F. Q. et al. Interleukin-8 as a mediator of sympathetic pain. British Journal of Pharmacology, v. 104, n. 3, p. 765–767, nov. 1991.
CUNHA, T. M. et al. A cascade of cytokines mediates mechanical inflammatory hypernociception in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, n. 5, p. 1755–1760, 2 jan. 2005.
CUNHA, T. M. et al. Crucial role of neutrophils in the development of mechanical inflammatory hypernociception. Journal of Leukocyte Biology, v. 83, n. 4, p. 824–832, abr. 2008.
CUNHA, T. M. et al. Morphine peripheral analgesia depends on activation of the PI3K /AKT/nNOS/NO/KATP signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences, 10 fev. 2010.
CURRAN, T.; TEICH, N. M. Candidate product of the FBJ murine osteosarcoma virus oncogene: characterization of a 55,000-dalton phosphoprotein. Journal of Virology, v. 42, n. 1, p. 114–122, abr. 1982.
CURY, Y. et al. Pain and analgesia: The dual effect of nitric oxide in the nociceptive system. Nitric Oxide: biology and chemistry, v. 25, n. 3, p. 243–254, 30 out. 2011.
D’ACQUISTO, F.; MAIONE, F.; PEDERZOLI-RIBEIL, M. From IL-15 to IL-33: the never-ending list of new players in inflammation. Is it time to forget the humble aspirin and move ahead? Biochemical Pharmacology, v. 79, n. 4, p. 525–534, 15 fev. 2010.
D’MELLO, R.; DICKENSON, A. H. Spinal cord mechanisms of pain. British Journal of Anaesthesia, v. 101, n. 1, p. 8–16, jul. 2008.
74
DAGNE, E. et al. Essential Oils of Twelve Eucalyptus Species from Ethiopia. Journal of Essential Oil Research, v. 12, n. 4, p. 467–470, 2000.
DAL SECCO, D. et al. Neutrophil migration in inflammation: nitric oxide inhibits rolling, adhesion and induces apoptosis. Nitric Oxide: biology and chemistry, v. 9, n. 3, p. 153–164, nov. 2003.
DAL SECCO, D. et al. Nitric oxide inhibits neutrophil migration by a mechanism dependent on ICAM-1: role of soluble guanylate cyclase. Nitric Oxide: biology and chemistry, v. 15, n. 1, p. 77–86, ago. 2006.
DAMAS, J. et al. Kinins and peritoneal exudates induced by carrageenin and zymosan in rats. British Journal of Pharmacology, v. 101, n. 2, p. 418–422, out. 1990.
DAMIÃO P DE SOUSA, F. F. F. N. Pharmacological effects of the monoterpene α, -epoxy-carvone in mice. Revista Brasileira de Farmacognosia, Abr./Jun, v. 17, p. 170–175, 2007.
DAVIES, J. S. Amino Acids, Peptides and Proteins. [S.l.] Royal Society of Chemistry, 1998.
DAVIS, A. J.; PERKINS, M. N. Induction of B1 receptors in vivo in a model of persistent inflammatory mechanical hyperalgesia in the rat. Neuropharmacology, v. 33, n. 1, p. 127–133, jan. 1994a.
DAVIS, A. J.; PERKINS, M. N. The involvement of bradykinin B1 and B2 receptor mechanisms in cytokine-induced mechanical hyperalgesia in the rat. British Journal of Pharmacology, v. 113, n. 1, p. 63–68, set. 1994b.
DAVIS, J. B. et al. Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature, v. 405, n. 6783, p. 183–187, 11 maio. 2000.
DE MENEZES, I. A. C. et al. Cardiovascular effects induced by Cymbopogon winterianus essential oil in rats: involvement of calcium channels and vagal pathway. The Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 62, n. 2, p. 215–221, fev. 2010.
DE OLIVEIRA, M. G. B. et al. α-terpineol reduces mechanical hypernociception and inflammatory response. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, v. 111, n. 2, p. 120–125, ago. 2012.
DE SOUSA, D. P. et al. Study of anticonvulsant effect of citronellol, a monoterpene alcohol, in rodents. Neuroscience Letters, v. 401, n. 3, p. 231–235, 3 jul. 2006.
DE SOUSA, D. P.; QUINTANS, L.; DE ALMEIDA, R. N. Evolution of the Anticonvulsant Activity of -Terpineol. Pharmaceutical Biology, v. 45, n. 1, p. 69–70, 2007.
DEMYTTENAERE, K. et al. Comorbid painful physical symptoms and depression: prevalence, work loss, and help seeking. Journal of Affective Disorders, v. 92, n. 2-3, p. 185–193, jun. 2006.
DESANTANA, J. M. et al. Transcutaneous electrical nerve stimulation at both high and low frequencies activates ventrolateral periaqueductal grey to decrease
75
mechanical hyperalgesia in arthritic rats. Neuroscience, v. 163, n. 4, p. 1233–1241, 10 nov. 2009.
DESBOIS, C.; VILLANUEVA, L. The organization of lateral ventromedial thalamic connections in the rat: a link for the distribution of nociceptive signals to widespread cortical regions. Neuroscience, v. 102, n. 4, p. 885–898, 2001.
DHAKA, A. et al. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron, v. 54, n. 3, p. 371–378, 3 maio. 2007.
DINARELLO, C. A. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Chest, v. 112, n. 6 Suppl, p. 321S–329S, dez. 1997.
DINARELLO, C. A. Interleukin-1 beta, interleukin-18, and the interleukin-1 beta converting enzyme. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 856, p. 1–11, 29 set. 1998.
DIONNE, R. A. Pharmacologic treatments for temporomandibular disorders. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, v. 83, n. 1, p. 134–142, jan. 1997.
DOGAN, Y. et al. Serum IL-1beta, IL-2, and IL-6 in insulin-dependent diabetic children. Mediators of Inflammation, v. 2006, n. 1, p. 59206, 2006.
DOLHAIN, R. J. et al. Increased expression of interferon (IFN)-gamma together with IFN-gamma receptor in the rheumatoid synovial membrane compared with synovium of patients with osteoarthritis. British Journal of Rheumatology, v. 35, n. 1, p. 24–32, jan. 1996.
DONG, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology, v. 8, n. 5, p. 337–348, maio. 2008.
DUBNER, R.; REN, K. Brainstem mechanisms of persistent pain following injury. Journal of Orofacial Pain, v. 18, n. 4, p. 299–305, 2004.
DUBOIS, M. Y.; GALLAGHER, R. M.; LIPPE, P. M. Pain medicine position paper. Pain Medicine, v. 10, n. 6, p. 972–1000, set. 2009.
DUNHAM, N. W.; MIYA, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association, v. 46, n. 3, p. 208–209, mar. 1957.
EDDY, N. B.; LEIMBACH, D. Synthetic analgesics. II. Dithienylbutenyl- and dithienylbutylamines. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v. 107, n. 3, p. 385–393, mar. 1953.
ENDO, Y. Simultaneous induction of histidine and ornithine decarboxylases and changes in their product amines following the injection of escherichia coli lipopolysaccharide into mice. Biochemical Pharmacology, v. 31, n. 8, p. 1643–1647, 15 abr. 1982.
76
ESPEJO, E. F.; MIR, D. Structure of the rat’s behaviour in the hot plate test. Behavioural Brain Research, v. 56, n. 2, p. 171–176, 30 set. 1993.
ESPLUGUES, J. V. NO as a signalling molecule in the nervous system. British Journal of Pharmacology, v. 135, n. 5, p. 1079–1095, mar. 2002.
ETHUR, L. Z. et al. Formal trade and profile of consumers of medicinal plants and phytomedicine in Itaqui Municipality, Rio Grande do Sul State, Brazil. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 13, n. 2, p. 121–128, jan. 2011.
FACCIOLI, L. H. et al. Recombinant interleukin-1 and tumor necrosis factor induce neutrophil migration “in vivo” by indirect mechanisms. Agents and Actions, v. 30, n. 3-4, p. 344–349, jun. 1990.
FAURSCHOU, M.; BORREGAARD, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes and Infection, v. 5, n. 14, p. 1317–1327, nov. 2003.
FERREIRA, H. H. et al. Nitric oxide modulates eosinophil infiltration in antigen-induced airway inflammation in rats. European Journal of Pharmacology, v. 358, n. 3, p. 253–259, 9 out. 1998.
FERRONATTO, R. et al. Antimicrobial activity of essential oils produced by Baccharis dracunculifolia D.C. and Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17, n. 2, p. 224–230, jun. 2007.
FIORENTINO, D. F. et al. IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. Journal of Immunology, v. 147, n. 11, p. 3815–3822, 1 dez. 1991.
FLORENTINO, L. A. et al. Sesbania virgata stimulates the occurrence of its microsymbiont in soils but does not inhibit microsymbionts of other species. Scientia Agricola, v. 66, n. 5, p. 667–676, out. 2009.
FOSTER, G. A. et al. Afferent projections to the rostral anterior pretectal nucleus of the rat: a possible role in the processing of noxious stimuli. Neuroscience, v. 29, n. 3, p. 685–694, 1989.
FRANCO-PENTEADO, C. F. et al. Role of nitric oxide on the increased vascular permeability and neutrophil accumulation induced by staphylococcal enterotoxin B into the mouse paw. Biochemical Pharmacology, v. 61, n. 10, p. 1305–1311, 15 maio. 2001.
GABRIEL, S. E.; JAAKKIMAINEN, L.; BOMBARDIER, C. Risk for serious gastrointestinal complications related to use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. A meta-analysis. Annals of Internal Medicine, v. 115, n. 10, p. 787–796, 15 nov. 1991.
GALEOTTI, N. et al. Menthol: a natural analgesic compound. Neuroscience Letters, v. 322, n. 3, p. 145–148, 12 abr. 2002.
GASKIN, D. J.; RICHARD, P. The economic costs of pain in the United States. The Journal of Pain, v. 13, n. 8, p. 715–724, ago. 2012.
77
GAZERANI, P. et al. Effects of subcutaneous administration of glutamate on pain, sensitization and vasomotor responses in healthy men and women. Pain, v. 124, n. 3, p. 338–348, out. 2006.
GHASEMI, Y. et al. Biotransformation of monoterpenes; World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 25, n. 7, p. 1301–1304, 2009.
GILAD, E. et al. Effects of radiodetoxified endotoxin on nitric oxide production in J774 macrophages and in endotoxin shock. Innate Immunity, v. 3, n. 6, p. 513–519, 1 dez. 1996.
GILROY, D. W. et al. Inducible cyclooxygenase may have anti-inflammatory properties. Nature Medicine, v. 5, n. 6, p. 698–701, 1 jun. 1999.
GIRALDELO, C. M. et al. Effect of arginine analogues on rat hind paw oedema and mast cell activation in vitro. European Journal of Pharmacology, v. 257, n. 1-2, p. 87–93, 12 maio. 1994.
GLEICH, G. J. The eosinophil and bronchial asthma: current understanding. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 85, n. 2, p. 422–436, fev. 1990.
GOTTENBERG, J.-E.; CHIOCCHIA, G. Dendritic cells and interferon-mediated autoimmunity. Biochimie, v. 89, n. 6–7, p. 856–871, jun. 2007.
GOULD, M. N. Cancer chemoprevention and therapy by monoterpenes. Environmental Health Perspectives, v. 105, n. Suppl 4, p. 977–979, jun. 1997.
GREEN, L. C. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Analytical Biochemistry, v. 126, n. 1, p. 131–138, out. 1982.
GUBITS, R. M.; HAZELTON, J. L.; SIMANTOV, R. Variations in c-fos gene expression during rat brain development. Molecular Brain Research, v. 3, n. 2, p. 197–201, abr. 1988.
GUIMARÃES, A. G. et al. Bioassay-guided evaluation of antioxidant and antinociceptive activities of carvacrol. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, v. 107, n. 6, p. 949–957, dez. 2010.
GUIMARÃES, A. G. et al. Carvacrol attenuates mechanical hypernociception and inflammatory response. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, v. 385, n. 3, p. 253–263, mar. 2012.
GUIMARÃES, A. G.; QUINTANS, J. S. S.; QUINTANS-JÚNIOR, L. J. Monoterpenes with Analgesic Activity—A Systematic Review. Phytotherapy Research, In press. 2012.
GUIMARÃES, A. P.; PRADO, W. A. Pharmacological evidence for a periaqueductal gray-nucleus raphe magnus connection mediating the antinociception induced by microinjecting carbachol into the dorsal periaqueductal gray of rats. Brain Research, v. 827, n. 1-2, p. 152–159, 8 maio. 1999.
HANADA, T.; YOSHIMURA, A. Regulation of cytokine signaling and inflammation. Cytokine & Growth Factor Reviews, v. 13, n. 4-5, p. 413–421, out. 2002.
78
HARGREAVES, K. M. Orofacial pain. Pain, v. 152, n. 3 Suppl, p. S25–32, mar. 2011.
HARKER, J. et al. Epidemiology of chronic pain in denmark and sweden. Pain research and treatment, v. 2012, p. 371248, 2012.
HASKÓ, G. et al. Isoproterenol Inhibits IL-10, TNF-α, and Nitric Oxide Production in RAW 264.7 Macrophages. Brain Research Bulletin, v. 45, n. 2, p. 183–187, 1998.
HAYES, A. G.; SHEEHAN, M. J.; TYERS, M. B. Differential sensitivity of models of antinociception in the rat, mouse and guinea-pig to mu- and kappa-opioid receptor agonists. British Journal of Pharmacology, v. 91, n. 4, p. 823–832, ago. 1987.
HELLIWELL, R. J. A.; ADAMS, L. F.; MITCHELL, M. D. Prostaglandin synthases: recent developments and a novel hypothesis. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids, v. 70, n. 2, p. 101–113, fev. 2004.
HERDEGEN, T. et al. Basal expression of the inducible transcription factors c-Jun, JunB, JunD, c-Fos, FosB, and Krox-24 in the adult rat brain. The Journal of Comparative Neurology, v. 354, n. 1, p. 39–56, 27 mar. 1995.
HERRERO, J. F.; LAIRD, J. M.; LÓPEZ-GARCÍA, J. A. Wind-up of spinal cord neurones and pain sensation: much ado about something? Progress in Neurobiology, v. 61, n. 2, p. 169–203, jun. 2000.
HESS, J.; ANGEL, P.; SCHORPP-KISTNER, M. AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings. Journal of Cell Science, v. 117, n. 25, p. 5965–5973, 12 jan. 2004.
HICKEY, K. A. et al. Characterization of a coronary vasoconstrictor produced by cultured endothelial cells. The American Journal of Physiology, v. 248, n. 5 Pt 1, p. C550–556, maio. 1985.
HIRANO, T. et al. Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature, v. 324, n. 6092, p. 73–76, 6 nov. 1986.
HIROTA, R. et al. Anti-inflammatory effects of limonene from yuzu (Citrus junos Tanaka) essential oil on eosinophils. Journal of Food Science, v. 75, n. 3, p. H87–92, abr. 2010.
HLA, T.; NEILSON, K. Human cyclooxygenase-2 cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 89, n. 16, p. 7384–7388, 15 ago. 1992.
HOCHER, B. et al. Pulmonary fibrosis and chronic lung inflammation in ET-1 transgenic mice. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 23, n. 1, p. 19–26, jul. 2000.
HOLANDA PINTO, S. A. et al. Antinoceptive effect of triterpenoid α, -amyrin in rats on orofacial pain induced by formalin and capsaicin. Phytomedicine, v. 15, n. 8, p. 630–634, 1 ago. 2008.
HOLZER, P. Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory neurons. Pharmacological Reviews, v. 43, n. 2, p. 143–201, jun. 1991.
79
HONDA, K. et al. Involvement of peripheral ionotropic glutamate receptors in orofacial thermal hyperalgesia in rats. Molecular Pain, v. 7, p. 75, 2011.
HONORE, P. et al. TNP-ATP, a potent P2X3 receptor antagonist, blocks acetic acid-induced abdominal constriction in mice: comparison with reference analgesics. Pain, v. 96, n. 1-2, p. 99–105, mar. 2002.
HOSSAIN, S. J. et al. Effects of tea components on the response of GABA(A) receptors expressed in Xenopus Oocytes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, n. 14, p. 3954–3960, 3 jul. 2002.
HOTTA, M. et al. Carvacrol, a component of thyme oil, activates PPARalpha and gamma and suppresses COX-2 expression. Journal of Lipid Research, v. 51, n. 1, p. 132–139, jan. 2010.
HUCHO, T.; LEVINE, J. D. Signaling pathways in sensitization: toward a nociceptor cell biology. Neuron, v. 55, n. 3, p. 365–376, 2 ago. 2007.
HUGLI, T. E. Biochemistry and biology of anaphylatoxins. Complement, v. 3, n. 3, p. 111–127, 1986.
HUNSKAAR, S.; BERGE, O. G.; HOLE, K. A modified hot-plate test sensitive to mild analgesics. Behavioural Brain Research, v. 21, n. 2, p. 101–108, ago. 1986.
HUNSKAAR, S.; FASMER, O. B.; HOLE, K. Formalin test in mice, a useful technique for evaluating mild analgesics. Journal of Neuroscience Methods, v. 14, n. 1, p. 69–76, jun. 1985.
HUNSKAAR, S.; HOLE, K. The formalin test in mice: dissociation between inflammatory and non-inflammatory pain. Pain, v. 30, n. 1, p. 103–114, jul. 1987.
HUNTER, J. C.; SINGH, L. Role of excitatory amino acid receptors in the mediation of the nociceptive response to formalin in the rat. Neuroscience Letters, v. 174, n. 2, p. 217–221, 20 jun. 1994.
IALENTI, A. et al. Modulation of acute inflammation by endogenous nitric oxide. European Journal of Pharmacology, v. 211, n. 2, p. 177–182, 11 fev. 1992.
IALENTI, A. et al. Nitric oxide inhibits leucocyte migration in carrageenin-induced rat pleurisy. Inflammation Research, v. 49, n. 8, p. 411–417, ago. 2000.
IANARO, A. et al. A nitric oxide synthase inhibitor reduces inflammation, down-regulates inflammatory cytokines and enhances interleukin-10 production in carrageenin-induced oedema in mice. Immunology, v. 82, n. 3, p. 370–375, jul. 1994.
IWAKURA, Y. et al. The roles of IL-17A in inflammatory immune responses and host defense against pathogens. Immunological Reviews, v. 226, p. 57–79, dez. 2008.
JENSEN, T. S.; YAKSH, T. L. Examination of spinal monoamine receptors through which brainstem opiate-sensitive systems act in the rat. Brain Research, v. 363, n. 1, p. 114–127, 15 jan. 1986.
80
JEON, J.-H. et al. Mite-control activities of active constituents isolated from Pelargonium graveolens against house dust mites. Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 18, n. 10, p. 1666–1671, out. 2008.
JULIUS, D.; BASBAUM, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature, v. 413, n. 6852, p. 203–210, 13 set. 2001.
KANEGANE, H.; TOSATO, G. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, v. 88, n. 1, p. 230–235, 1 jul. 1996.
KANG, X. et al. δ-opioid receptors protect from anoxic disruption of Na+ and K+ homeostasis via Na+ channel regulation. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 66, n. 21, p. 3505–3516, nov. 2009.
KAPLANSKI, G. et al. IL-6: a regulator of the transition from neutrophil to monocyte recruitment during inflammation. Trends in Immunology, v. 24, n. 1, p. 25–29, jan. 2003.
KASTEN, K. R.; MUENZER, J. T.; CALDWELL, C. C. Neutrophils are significant producers of IL-10 during sepsis. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 393, n. 1, p. 28–31, 26 fev. 2010.
KAWATA, J.; KAMEDA, M.; MIYAZAWA, M. Cyclooxygenase-2 inhibitory effects of monoterpenoids with a p-menthane skeleton. International Journal of Essential Oil Therapeutics, v. 2, n. 4, p. 145–148, 2008.
KEEL, M. et al. Interleukin-10 counterregulates proinflammatory cytokine-induced inhibition of neutrophil apoptosis during severe sepsis. Blood, v. 90, n. 9, p. 3356–3363, 1 nov. 1997.
KIRSCHFINK, M. Controlling the complement system in inflammation. Immunopharmacology, v. 38, n. 1–2, p. 51–62, dez. 1997.
KLEIN, T. et al. Fitoterápicos: um mercado promissor. Revista de Ciência Farmacêutica Básica e Aplicada, v. 3, n. 30, p. 241–248, 2009.
KNOWLES, R. G.; MONCADA, S. Nitric oxide synthases in mammals. The Biochemical Journal, v. 298 ( Pt 2), p. 249–258, 1 mar. 1994.
KOBAYASHI, S. D.; VOYICH, J. M.; DELEO, F. R. Regulation of the neutrophil-mediated inflammatory response to infection. Microbes and Infection, v. 5, n. 14, p. 1337–1344, nov. 2003.
KOIZUMI, T.; NEGISHI, M.; ICHIKAWA, A. Inhibitory effect of an intracellular glutathione on delta 12-prostaglandin J2-induced protein syntheses in porcine aortic endothelial cells. Biochemical Pharmacology, v. 44, n. 8, p. 1597–1602, 20 out. 1992.
KOLLS, J. K.; LINDÉN, A. Interleukin-17 family members and inflammation. Immunity, v. 21, n. 4, p. 467–476, out. 2004.
KOYA, T. et al. IL-10-treated dendritic cells decrease airway hyperresponsiveness and airway inflammation in mice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 119, n. 5, p. 1241–1250, maio. 2007.
81
KRAFT, B. Is there any clinically relevant cannabinoid-induced analgesia? Pharmacology, v. 89, n. 5-6, p. 237–246, 2012.
KUBO, I.; MUROI, H.; KUBO, A. Antibacterial activity of long-chain alcohols against Streptococcus mutans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 41, n. 12, p. 2447–2450, 1 dez. 1993.
LANKFORD, C. S. R.; FRUCHT, D. M. A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity. Journal of Leukocyte Biology, v. 73, n. 1, p. 49–56, jan. 2003.
LAROUSSERIE, F. et al. Expression of IL-27 in human Th1-associated granulomatous diseases. The Journal of Pathology, v. 202, n. 2, p. 164–171, fev. 2004.
LE BARS, D.; GOZARIU, M.; CADDEN, S. W. Animal models of nociception. Pharmacological Reviews, v. 53, n. 4, p. 597–652, dez. 2001.
LEINWAND, S. G.; CHALASANI, S. H. Olfactory networks: from sensation to perception. Current Opinion in Genetics & Development, v. 21, n. 6, p. 806–811, dez. 2011.
LEITE, B. L. S. et al. Assessment of antinociceptive, anti-inflammatory and antioxidant properties of Cymbopogon winterianus leaf essential oil. Pharmaceutical Biology, v. 48, n. 10, p. 1164–1169, out. 2010.
LEUNG, B. P. et al. Combined effects of IL-12 and IL-18 on the induction of collagen-induced arthritis. Journal of Immunology, v. 164, n. 12, p. 6495–6502, 15 jun. 2000.
LEVIN, E. R. Endothelins. The New England Journal of Medicine, v. 333, n. 6, p. 356–363, 10 ago. 1995.
LEY, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends in Molecular Medicine, v. 9, n. 6, p. 263–268, jun. 2003.
LI, J.; BACCEI, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. The Journal of Neuroscience, v. 31, n. 24, p. 9010–9022, 15 jun. 2011.
LIANG, S. C. et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. The Journal of Experimental Medicine, v. 203, n. 10, p. 2271–2279, 2 out. 2006.
LING, P. et al. Histamine H4 receptor mediates eosinophil chemotaxis with cell shape change and adhesion molecule upregulation. British Journal of Pharmacology, v. 142, n. 1, p. 161–171, maio. 2004.
LORAM, L. C. et al. Cytokine profiles during carrageenan-induced inflammatory hyperalgesia in rat muscle and hind paw. The Journal of Pain, v. 8, n. 2, p. 127–136, fev. 2007.
LOVENBERG, T. W. et al. Cloning and functional expression of the human histamine H3 receptor. Molecular Pharmacology, v. 55, n. 6, p. 1101–1107, jun. 1999.
82
LUCCARINI, P. et al. Contribution of neurokinin 1 receptors in the cutaneous orofacial inflammatory pain. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, v. 368, n. 4, p. 320–323, out. 2003.
LUCCARINI, P. et al. The orofacial formalin test in the mouse: a behavioral model for studying physiology and modulation of trigeminal nociception. The Journal of Pain, v. 7, n. 12, p. 908–914, dez. 2006.
LUSCINSKAS, F. W. et al. Cytokine-activated human endothelial monolayers support enhanced neutrophil transmigration via a mechanism involving both endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 and intercellular adhesion molecule-1. Journal of Immunology, v. 146, n. 5, p. 1617–1625, 1 mar. 1991.
M KOSTER; M ANDERSON; E. J. DE BEER. Acetic acid for analgesic screening. Federation Proceedings, v. 18, p. 412, 1959.
MA, X. TNF-alpha and IL-12: a balancing act in macrophage functioning. Microbes and Infection, v. 3, n. 2, p. 121–129, fev. 2001.
MACEDO, A.; OSHIIWA, M.; GUARIDO, C. Ocorrência do uso de plantas medicinais por moradores de um bairro do município de Marília-SP. Revista de Ciência Farmacêutica Básica e Aplicada, 1. v. 28, p. 123–128, 2007.
MAJIMA, M. et al. Cyclo-oxygenase-2 enhances basic fibroblast growth factor-induced angiogenesis through induction of vascular endothelial growth factor in rat sponge implants. British Journal of Pharmacology, v. 130, n. 3, p. 641–649, jun. 2000.
MANCHIKANTI, L. et al. A systematic review of randomized trials of long-term opioid management for chronic non-cancer pain. Pain Physician, v. 14, n. 2, p. 91–121, abr. 2011.
MARCEAU, F. et al. Effect of endogenous kinins, prostanoids, and NO on kinin B1 and B2 receptor expression in the rabbit. The American Journal of Physiology, v. 277, n. 6 Pt 2, p. R1568–1578, dez. 1999.
MARCEAU, F.; HESS, J. F.; BACHVAROV, D. R. The B1 Receptors for Kinins. Pharmacological Reviews, v. 50, n. 3, p. 357–386, 9 jan. 1998.
MARCHAND, S. The physiology of pain mechanisms: from the periphery to the brain. Rheumatic Diseases Clinics of North America, v. 34, n. 2, p. 285–309, maio. 2008.
MARCINKIEWICZ, J.; GRABOWSKA, A.; CHAIN, B. Nitric oxide up-regulates the release of inflammatory mediators by mouse macrophages. European Journal of Immunology, v. 25, n. 4, p. 947–951, abr. 1995.
MARKS, D. M. et al. Serotonin-Norepinephrine Reuptake Inhibitors for Pain Control: Premise and Promise. Current Neuropharmacology, v. 7, n. 4, p. 331–336, dez. 2009.
MARTIN, S. et al. Anti-inflammatory activity of the essential oil of Bupleurum fruticescens. Planta Medica, v. 59, n. 6, p. 533–536, dez. 1993.
83
MCGEER, E. G.; KLEGERIS, A.; MCGEER, P. L. Inflammation, the complement system and the diseases of aging. Neurobiology of Aging, v. 26, n. 1, Supplement, p. 94–97, dez. 2005.
MCINNES, I. B.; LIEW, F. Y. Interleukin 15: a proinflammatory role in rheumatoid arthritis synovitis. Immunology Today, v. 19, n. 2, p. 75–79, fev. 1998.
MEDZHITOV, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature, v. 454, n. 7203, p. 428–435, 24 jul. 2008.
MELO, J. G. DE et al. Quality of products made from medicinal plants commercialized in Brazil: horsechestnut (Aesculus hippocastanum L.), lemongrass (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf), and gotu kola (Centella asiatica (L.) Urban. Acta Botanica Brasilica, v. 21, n. 1, p. 27–36, mar. 2007.
MELO, M. S. et al. Antinociceptive effect of citronellal in mice. Pharmaceutical Biology, v. 48, n. 4, p. 411–416, abr. 2010.
MIKAMI, T.; MIYASAKA, K. Effects of several anti-inflammatory drugs on the various parameters involved in the inflammatory response in rat carrageenin-induced pleurisy. European Journal of Pharmacology, v. 95, n. 1-2, p. 1–12, 11 nov. 1983.
MIRANDA, H. F. et al. Synergism between fentanyl and tramadol in tonic inflammatory pain: the orofacial formalin test. Inflammation, v. 35, n. 3, p. 1132–1137, jun. 2012.
MISHRA, B. B.; TIWARI, V. K. Natural products: an evolving role in future drug discovery. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 46, n. 10, p. 4769–4807, out. 2011.
MOGIL, J. S. Animal models of pain: progress and challenges. Nature Reviews. Neuroscience, v. 10, n. 4, p. 283–294, abr. 2009.
MONCADA, S.; FERREIRA, S. H.; VANE, J. R. Prostaglandins, Aspirin-like Drugs and the Oedema of Inflammation. v. 246, n. 5430, p. 217–219, 23 nov. 1973.
MONCADA, S.; PALMER, R. M.; HIGGS, E. A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacological Reviews, v. 43, n. 2, p. 109–142, jun. 1991.
MORELAND, L. W. et al. Etanercept therapy in rheumatoid arthritis. A randomized, controlled trial. Annals of Internal Medicine, v. 130, n. 6, p. 478–486, 16 mar. 1999.
MORITA, I. Distinct functions of COX-1 and COX-2. Prostaglandins & Other Lipid Mediators, v. 68-69, p. 165–175, ago. 2002.
MOSER, R. et al. Interleukin 1 and tumor necrosis factor stimulate human vascular endothelial cells to promote transendothelial neutrophil passage. Journal of Clinical Investigation, v. 83, n. 2, p. 444–455, fev. 1989.
MOSSEY, J. M. Defining racial and ethnic disparities in pain management. Clinical Orthopaedics and Related Research, v. 469, n. 7, p. 1859–1870, jul. 2011.
84
MOULIN, D. et al. Interleukin (IL)-33 induces the release of pro-inflammatory mediators by mast cells. Cytokine, v. 40, n. 3, p. 216–225, dez. 2007.
MOUSSION, C.; ORTEGA, N.; GIRARD, J.-P. The IL-1-Like Cytokine IL-33 Is Constitutively Expressed in the Nucleus of Endothelial Cells and Epithelial Cells In Vivoμ A Novel “Alarmin”? PLoS ONE, v. 3, n. 10, p. e3331, 6 out. 2008.
MUDTER, J.; NEURATH, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Diseases, v. 13, n. 8, p. 1016–1023, ago. 2007.
MULLOL, J. et al. Endothelin-1 induces GM-CSF, IL-6 and IL-8 but not G-CSF release from a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B). Neuropeptides, v. 30, n. 6, p. 551–556, dez. 1996.
MUNDEY, M. K. et al. Pharmacological examination of contractile responses of the guinea-pig isolated ileum produced by mu-opioid receptor antagonists in the presence of, and following exposure to, morphine. British Journal of Pharmacology, v. 131, n. 5, p. 893–902, nov. 2000.
MUNGLANI, R.; HUNT, S. P. Molecular biology of pain. British Journal of Anaesthesia, v. 75, n. 2, p. 186–192, ago. 1995.
MURAD, F. Cyclic guanosine monophosphate as a mediator of vasodilation. Journal of Clinical Investigation, v. 78, n. 1, p. 1–5, jul. 1986.
NAIM, M. et al. Cells in laminae III and IV of the rat spinal cord that possess the neurokinin-1 receptor and have dorsally directed dendrites receive a major synaptic input from tachykinin-containing primary afferents. The Journal of Neuroscience, v. 17, n. 14, p. 5536–5548, 15 jul. 1997.
NEURATH, M. F.; FINOTTO, S. IL-6 signaling in autoimmunity, chronic inflammation and inflammation-associated cancer. Cytokine & Growth Factor Reviews, v. 22, n. 2, p. 83–89, abr. 2011.
NEWMAN, S. L.; HENSON, J. E.; HENSON, P. M. Phagocytosis of senescent neutrophils by human monocyte-derived macrophages and rabbit inflammatory macrophages. The Journal of Experimental Medicine, v. 156, n. 2, p. 430–442, 1 ago. 1982.
NIXDORF, D. R. et al. Classifying orofacial pains: a new proposal of taxonomy based on ontology. Journal of Oral Rehabilitation, v. 39, n. 3, p. 161–169, mar. 2012.
NORTHOVER, A. M.; NORTHOVER, B. J. The effects of histamine, 5-hydroxytryptamine and bradykinin on rat mesenteric blood vessels. The Journal of Pathology, v. 98, n. 4, p. 265–275, ago. 1969.
NUNEZ, D. J. et al. Endothelin-1 mRNA is widely expressed in porcine and human tissues. Journal of Clinical Investigation, v. 85, n. 5, p. 1537–1541, maio. 1990.
O’NEILL, L. A.; GREENE, C. Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptor family: ancient signaling machinery in mammals, insects, and plants. Journal of Leukocyte Biology, v. 63, n. 6, p. 650–657, jun. 1998.
85
OHAYON, M. M. Specific characteristics of the pain/depression association in the general population. The Journal of Clinical Psychiatry, v. 65 Suppl 12, p. 5–9, 2004.
OKUSE, K. Pain signalling pathways: from cytokines to ion channels. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 39, n. 3, p. 490–496, 2007.
OLIVEIRA, M. M. M. et al. Yield, chemical composition and antilisterial activity of essential oils from Cymbopogon species. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 13, n. 1, p. 08–16, jan. 2011.
OMOTE, K. et al. Peripheral nitric oxide in carrageenan-induced inflammation. Brain Research, v. 912, n. 2, p. 171–175, 7 set. 2001.
ORINSKA, Z. et al. IL-15 constrains mast cell-dependent antibacterial defenses by suppressing chymase activities. Nature Medicine, v. 13, n. 8, p. 927–934, ago. 2007.
OSSIPOV, M. H.; DUSSOR, G. O.; PORRECA, F. Central modulation of pain. The Journal of Clinical Investigation, v. 120, n. 11, p. 3779–3787, nov. 2010.
PALMER, R. M.; ASHTON, D. S.; MONCADA, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature, v. 333, n. 6174, p. 664–666, 16 jun. 1988.
PALUCKA, A. K. et al. Cross-regulation of TNF and IFN-alpha in autoimmune diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, n. 9, p. 3372–3377, 1 mar. 2005.
PARKHOUSE, J. Analgesic Drugs. Oxford μ Blackwell Scientific Publications; c1λ7λ.
PARTEARROYO, M. A.; URBANEJA, M. A.; GOÑI, F. M. Effective detergent/lipid ratios in the solubilization of phosphatidylcholine vesicles by Triton X-100. FEBS Letters, v. 302, n. 2, p. 138–140, 11 maio. 1992.
PASSOS, C. S. et al. Terpenoids with activity in the Central Nervous System (CNS). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 1A, p. 140–149, mar. 2009.
PEANA, A. T.; MARZOCCO, S. et al. (-)-Linalool inhibits in vitro NO formation: Probable involvement in the antinociceptive activity of this monoterpene compound. Life Sciences, v. 78, n. 7, p. 719–723, 11 jan. 2006.
PEANA, A. T.; RUBATTU, P. et al. Involvement of adenosine A1 and A2A receptors in (-)-linalool-induced antinociception. Life Sciences, v. 78, n. 21, p. 2471–2474, 18 abr. 2006.
PEIER, A. M. et al. A heat-sensitive TRP channel expressed in keratinocytes. Science, v. 296, n. 5575, p. 2046–2049, 14 jun. 2002.
PELISSIER, T.; PAJOT, J.; DALLEL, R. The orofacial capsaicin test in rats: effects of different capsaicin concentrations and morphine. Pain, v. 96, n. 1-2, p. 81–87, mar. 2002.
86
PERL, E. R. Pain mechanisms: a commentary on concepts and issues. Progress in Neurobiology, v. 94, n. 1, p. 20–38, jun. 2011.
PESCI, A. et al. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. The European Respiratory Journal, v. 12, n. 2, p. 380–386, ago. 1998.
PILIPONSKY, A. M. et al. Human eosinophils induce histamine release from antigen-activated rat peritoneal mast cells: a possible role for mast cells in late-phase allergic reactions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 107, n. 6, p. 993–1000, jun. 2001.
PLATER-ZYBERK, C. et al. Therapeutic effect of neutralizing endogenous IL-18 activity in the collagen-induced model of arthritis. The Journal of Clinical Investigation, v. 108, n. 12, p. 1825–1832, dez. 2001.
PRADO, P. T. C.; DEL BEL, E. A. C-fos, um gene de ativaçäo imediata como marcador neural de nocicepçäo; C-fos, an immediate early gene as a neuromarker for nociception. Medicina, v. 31, n. 3, p. 424–33, set. 1998.
PRETÉ, P. S. C. et al. Quantitative assessment of human erythrocyte membrane solubilization by Triton X-100. Biophysical Chemistry, v. 97, n. 1, p. 1–5, 23 maio. 2002.
PULTRINI, A. DE M.; GALINDO, L. A.; COSTA, M. Effects of the essential oil from Citrus aurantium L. in experimental anxiety models in mice. Life Sciences, v. 78, n. 15, p. 1720–1725, 6 mar. 2006.
QUINTANS JÚNIOR, L. J. et al. Plants with anticonvulsant properties: a review. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, p. 798–819, dez. 2008.
QUINTANS-JÚNIOR, L.; DA ROCHA, R. F. et al. Antinociceptive action and redox properties of citronellal, an essential oil present in lemongrass. Journal of Medicinal Food, v. 14, n. 6, p. 630–639, jun. 2011.
QUINTANS-JÚNIOR, L. J. et al. Antinociceptive effects of citronellal in formalin-, capsaicin-, and glutamate-induced orofacial nociception in rodents and its action on nerve excitability. Journal of Orofacial Pain, v. 24, n. 3, p. 305–312, 2010.
QUINTANS-JÚNIOR, L. J.; GUIMARÃES, A. G. et al. Citral reduces nociceptive and inflammatory response in rodents. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 21, n. 3, p. 497–502, jun. 2011.
RABOISSON, P.; DALLEL, R. The orofacial formalin test. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, v. 28, n. 2, p. 219–226, abr. 2004.
RAHMAN, A.-U. Studies in Natural Products Chemistry: Bioactive Natural Products (Part K). [S.l.] Elsevier, 2005.
RAHMAN, W. et al. Descending serotonergic facilitation and the antinociceptive effects of pregabalin in a rat model of osteoarthritic pain. Molecular Pain, v. 5, p. 45, 2009.
87
RAINVILLE, P. Brain mechanisms of pain affect and pain modulation. Current Opinion in Neurobiology, v. 12, n. 2, p. 195–204, 1 abr. 2002.
RAJA, S. N.; MEYER, R. A.; CAMPBELL, J. N. Peripheral mechanisms of somatic pain. Anesthesiology, v. 68, n. 4, p. 571–590, abr. 1988.
RAMADORI, G.; MEYER ZUM BÜSCHENFELDE, K. H. [Acute phase reaction and its mediators. 1: Interleukin-1]. Zeitschrift für Gastroenterologie, v. 27, n. 12, p. 746–750, dez. 1989.
REGOLI, D.; BARABÉ, J. Pharmacology of bradykinin and related kinins. Pharmacological Reviews, v. 32, n. 1, p. 1–46, mar. 1980.
REILLY, M.; FITZGERALD, G. A. Cellular activation by thromboxane A2 and other eicosanoids. European Heart Journal, v. 14 Suppl K, p. 88–93, dez. 1993.
REIS, G. M. et al. Antinociceptive effect of stimulating the occipital or retrosplenial cortex in rats. The Journal of Pain, v. 11, n. 10, p. 1015–1026, out. 2010.
RENWICK, L. C. et al. Increased inflammation and altered macrophage chemotactic responses caused by two ultrafine particle types. Occupational and Environmental Medicine, v. 61, n. 5, p. 442–447, maio. 2004.
RO, J. Y. Contribution of peripheral NMDA receptors in craniofacial muscle nociception and edema formation. Brain Research, v. 979, n. 1–2, p. 78–84, 25 jul. 2003.
ROBAK, E. et al. Proinflammatory interferon-gamma--inducing monokines (interleukin-12, interleukin-18, interleukin-15)--serum profile in patients with systemic lupus erythematosus. European Cytokine Network, v. 13, n. 3, p. 364–368, set. 2002.
ROBERTS, M. H.; REES, H. The antinociceptive effects of stimulating the pretectal nucleus of the rat. Pain, v. 25, n. 1, p. 83–93, abr. 1986.
RODEWALD, H.-R. et al. Identification of a Committed Precursor for the Mast Cell Lineage. Science, v. 271, n. 5250, p. 818–822, 9 fev. 1996.
ROSLAND, J. H. et al. The formalin test in mice: effect of formalin concentration. Pain, v. 42, n. 2, p. 235–242, ago. 1990.
ROSSANEIS, A. C.; REIS, G. M.; PRADO, W. A. Stimulation of the occipital or retrosplenial cortex reduces incision pain in rats. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, v. 100, n. 2, p. 220–227, dez. 2011.
ROSSITER, H.; ALON, R.; KUPPER, T. S. Selectins, T-cell rolling and inflammation. Molecular Medicine Today, v. 3, n. 5, p. 214–222, maio. 1997.
RUETTEN, H.; THIEMERMANN, C. Endothelin-1 stimulates the biosynthesis of tumour necrosis factor in macrophages: ET-receptors, signal transduction and inhibition by dexamethasone. Journal of Physiology and Pharmacology, v. 48, n. 4, p. 675–688, dez. 1997.
88
SAKURADA, T. et al. Intraplantar injection of bergamot essential oil induces peripheral antinociception mediated by opioid mechanism. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, v. 97, n. 3, p. 436–443, jan. 2011.
SALLUSTO, F. et al. Distinct patterns and kinetics of chemokine production regulate dendritic cell function. European Journal of Immunology, v. 29, n. 5, p. 1617–1625, maio. 1999.
SANTANA, M. F. et al. p-Cymene reduces orofacial nociceptive response in mice. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 21, n. 6, p. 1138–1143, dez. 2011.
SANTOS, M. R. V. et al. Cardiovascular effects of monoterpenes: a review. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 21, n. 4, p. 764–771, ago. 2011.
SCHLUNS, K. S. et al. Distinct cell types control lymphoid subset development by means of IL-15 and IL-15 receptor α expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 101, n. 15, p. 5616–5621, 13 abr. 2004.
SCHUELERT, N.; MCDOUGALL, J. J. Involvement of Nav 1.8 sodium ion channels in the transduction of mechanical pain in a rodent model of osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy, v. 14, n. 1, p. R5, 2012.
SCOTT, D. T.; LAM, F. Y.; FERRELL, W. R. Acute joint inflammation—Mechanisms and mediators. General Pharmacology: The Vascular System, v. 25, n. 7, p. 1285–1296, nov. 1994.
SEBBAN, H.; COURTOIS, G. NF-kappaB and inflammation in genetic disease. Biochemical Pharmacology, v. 72, n. 9, p. 1153–1160, 30 out. 2006.
SEGAL, A. W. The antimicrobial role of the neutrophil leukocyte. The Journal of Infection, v. 3, n. 1, p. 3–17, mar. 1981.
SEMBA, K. Multiple output pathways of the basal forebrain: organization, chemical heterogeneity, and roles in vigilance. Behavioural Brain Research, v. 115, n. 2, p. 117–141, nov. 2000.
SESSLE, B. J. Acute and chronic craniofacial pain: brainstem mechanisms of nociceptive transmission and neuroplasticity, and their clinical correlates. Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, v. 11, n. 1, p. 57–91, 2000.
SESSLE, B. J. Peripheral and central mechanisms of orofacial pain and their clinical correlates. Minerva Anestesiologica, v. 71, n. 4, p. 117–136, abr. 2005.
SHARMA, R. et al. A novel function of IL-2: chemokine/chemoattractant/retention receptor genes induction in Th subsets for skin and lung inflammation. Journal of Autoimmunity, v. 38, n. 4, p. 322–331, jun. 2012.
SIMON, L. S. COX-2 inhibitors. Are they nonsteroidal anti-inflammatory drugs with a better safety profile? Gastroenterology Clinics of North America, v. 30, n. 4, p. 1011–1025, viii, dez. 2001.
89
SMITH, C. W. et al. Chemotactic factors regulate lectin adhesion molecule 1 (LECAM-1)-dependent neutrophil adhesion to cytokine-stimulated endothelial cells in vitro. The Journal of Clinical Investigation, v. 87, n. 2, p. 609–618, fev. 1991.
SMITH, R. S. et al. Fibroblasts as sentinel cells. Synthesis of chemokines and regulation of inflammation. The American Journal of Pathology, v. 151, n. 2, p. 317–322, ago. 1997.
SMITH, W. L. The eicosanoids and their biochemical mechanisms of action. Biochemical Journal, v. 259, n. 2, p. 315–324, 15 abr. 1989.
SMITH, W. L.; DEWITT, D. L.; GARAVITO, R. M. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology. Annual Review of Biochemistry, v. 69, p. 145–182, 2000.
SNG, J. C. G.; TANIURA, H.; YONEDA, Y. A tale of early response genes. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v. 27, n. 5, p. 606–612, maio. 2004.
SOMMER, C.; SCHMIDT, C.; GEORGE, A. Hyperalgesia in experimental neuropathy is dependent on the TNF receptor 1. Experimental Neurology, v. 151, n. 1, p. 138–142, maio. 1998.
SOUSA, F. C. F. et al. Plantas medicinais e seus constituintes bioativos: uma revisão da bioatividade e potenciais benefícios nos distúrbios da ansiedade em modelos animais. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 18, n. 4, p. 642–654, dez. 2008.
SPERTINI, O. et al. Regulation of leukocyte migration by activation of the leukocyte adhesion molecule-1 (LAM-1) selectin. Nature, v. 349, n. 6311, p. 691–694, 21 fev. 1991.
SPIKE, R. C. et al. A quantitative and morphological study of projection neurons in lamina I of the rat lumbar spinal cord. The European Journal of Neuroscience, v. 18, n. 9, p. 2433–2448, nov. 2003.
SPRINGER, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell, v. 76, n. 2, p. 301–314, 28 jan. 1994.
SRINIVASAN, K. et al. Evaluation of anti-inflammatory activity of Pongamia pinnata leaves in rats. Journal of Ethnopharmacology, v. 78, n. 2-3, p. 151–157, dez. 2001.
STAMFORD, J. A. Descending control of pain. British Journal of Anaesthesia, v. 75, n. 2, p. 217–227, 8 jan. 1995.
STEEDS, C. E. The anatomy and physiology of pain. Surgery, v. 27, n. 12, p. 507–511, dez. 2009.
STEWART, J. M. Bradykinin antagonists: discovery and development. Peptides, v. 25, n. 3, p. 527–532, mar. 2004.
STOTZ, S. C. et al. Citral Sensing by TRANSient Receptor Potential Channels in Dorsal Root Ganglion Neurons. PLoS ONE, v. 3, n. 5, p. e2082, 7 maio. 2008.
90
STRONG, V. E. et al. Blocking prostaglandin E2 after trauma attenuates pro-inflammatory cytokines and improves survival. Shock, v. 14, n. 3, p. 374–379, set. 2000.
SU, Y.-W. et al. Inhibitory effects of citronellol and geraniol on nitric oxide and prostaglandin E₂production in macrophages. Planta Medica, v. 76, n. 15, p. 1666–1671, out. 2010.
SUGIMOTO, K. et al. Inducible IL-12-producing B cells regulate Th2-mediated intestinal inflammation. Gastroenterology, v. 133, n. 1, p. 124–136, jul. 2007.
SWAAK, A. J. et al. Interleukin-6 (IL-6) in synovial fluid and serum of patients with rheumatic diseases. Scandinavian Journal of Rheumatology, v. 17, n. 6, p. 469–474, 1988.
TAKEMURA, M. et al. Mechanisms of orofacial pain control in the central nervous system. Archives of Histology and Cytology, v. 69, n. 2, p. 79–100, jun. 2006.
TAMACHI, T. et al. IL-25 enhances allergic airway inflammation by amplifying a TH2 cell-dependent pathway in mice. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 118, n. 3, p. 606–614, set. 2006.
TAVARES-MURTA, B. M.; CUNHA, F. Q.; FERREIRA, S. H. The intravenous administration of tumor necrosis factor alpha, interleukin 8 and macrophage-derived neutrophil chemotactic factor inhibits neutrophil migration by stimulating nitric oxide production. British Pournal of Pharmacology, v. 124, n. 7, p. 1369–1374, ago. 1998.
TAYLOR, J. E.; DEFEUDIS, F. V.; MOREAU, J. P. Bradykinin-antagonists: Therapeutic perspectives. Drug Development Research, v. 16, n. 1, p. 1–11, 1989.
THEOHARIDES, T. C. et al. Mast cells and inflammation. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1822, n. 1, p. 21–33, jan. 2012.
TJØLSEN, A. et al. The formalin test: an evaluation of the method. Pain, v. 51, n. 1, p. 5–17, out. 1992.
TODD, A. J. Anatomy of primary afferents and projection neurones in the rat spinal dorsal horn with particular emphasis on substance P and the neurokinin 1 receptor. Experimental Physiology, v. 87, n. 2, p. 245–249, mar. 2002.
TODD, A. J. et al. Projection neurons in lamina I of rat spinal cord with the neurokinin 1 receptor are selectively innervated by substance p-containing afferents and respond to noxious stimulation. The Journal of Neuroscience, v. 22, n. 10, p. 4103–4113, 15 maio. 2002.
TOGIAS, A. H1-receptors: localization and role in airway physiology and in immune functions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 112, n. 4 Suppl, p. S60–68, out. 2003.
TÖLLE, T. R. et al. Flip and Flop variants of AMPA receptors in the rat lumbar spinal cord. The European Journal of Neuroscience, v. 7, n. 6, p. 1414–1419, 1 jun. 1995.
91
TRINCHIERI, G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nature Reviews. Immunology, v. 3, n. 2, p. 133–146, fev. 2003.
TUROLLA, M. S. DOS R.; NASCIMENTO, E. DE S. Toxicological information of some herbal medicines used in Brazil. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 42, n. 2, p. 289–306, jun. 2006.
URBAN, M. O.; GEBHART, G. F. Supraspinal contributions to hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 96, n. 14, p. 7687–7692, 6 jul. 1999.
VALERIO, A. et al. Metabotropic glutamate receptor mRNA expression in rat spinal cord. Neuroreport, v. 8, n. 12, p. 2695–2699, 18 ago. 1997.
VAN DAM, H.; CASTELLAZZI, M. Distinct roles of Jun μ Fos and Jun μ ATF dimers in oncogenesis. Oncogene, v. 20, n. 19, p. 2453–2464, 30 abr. 2001.
VANE, J. R.; BOTTING, R. M. Mechanism of action of aspirin-like drugs. Seminars in Arthritis and Rheumatism, v. 26, Supplement 1, n. 0, p. 2–10, jun. 1997.
VEIGA JUNIOR, V. F.; PINTO, A. C.; MACIEL, M. A. M. Medicinal plants: safe cure? Química Nova, v. 28, n. 3, p. 519–528, jun. 2005.
VERRI, W. A., Jr et al. IL-15 mediates immune inflammatory hypernociception by triggering a sequential release of IFN-gamma, endothelin, and prostaglandin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 103, n. 25, p. 9721–9725, 20 jun. 2006.
VIEIRA, S. C. H. et al. Levantamento de fitoterápicos manipulados em farmácias magistrais de Dourados-MS. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, n. 1, p. 28–34, mar. 2010.
VIOLLON, C.; CHAUMONT, J. Antifungal properties of essential oils and their main components upon Cryptococcus neoformans. Mycopathologia, n. 128, p. 151–153, 1994.
WANG, Y. et al. Anti-C5 monoclonal antibody therapy prevents collagen-induced arthritis and ameliorates established disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 92, n. 19, p. 8955–8959, 12 set. 1995.
WETZEL, C. et al. A stomatin-domain protein essential for touch sensation in the mouse. Nature, v. 445, n. 7124, p. 206–209, 11 jan. 2007.
WHITE, M. V. The role of histamine in allergic diseases. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 86, n. 4 Pt 2, p. 599–605, out. 1990.
WILKINSON, P. C.; LIEW, F. W. Chemoattraction of human blood T lymphocytes by interleukin-15. The Journal of Experimental Medicine, v. 181, n. 3, p. 1255–1259, 1 mar. 1995.
WILLIAMS, S.; EVAN, G. I.; HUNT, S. P. Changing patterns of c-fos induction in spinal neurons following thermal cutaneous stimulation in the rat. Neuroscience, v. 36, n. 1, p. 73–81, 1990.
92
WILSON, E. H. et al. A critical role for IL-10 in limiting inflammation during toxoplasmic encephalitis. Journal of Neuroimmunology, v. 165, n. 1-2, p. 63–74, ago. 2005.
XU, B. et al. Translational investigation and treatment of neuropathic pain. Molecular Pain, v. 8, p. 15, 2012.
XU, D. et al. IL-18 induces the differentiation of Th1 or Th2 cells depending upon cytokine milieu and genetic background. European Journal of Immunology, v. 30, n. 11, p. 3147–3156, nov. 2000.
YAMASHIRO, S.; KAMOHARA, H.; YOSHIMURA, T. MCP-1 is selectively expressed in the late phase by cytokine-stimulated human neutrophils: TNF-alpha plays a role in maximal MCP-1 mRNA expression. Journal of Leukocyte Biology, v. 65, n. 5, p. 671–679, maio. 1999.
YANG, K. et al. Increased expression of c-fos mRNA and AP-1 transcription factors after cortical impact injury in rats. Brain Research, v. 664, n. 1-2, p. 141–147, 21 nov. 1994.
YANG, L. L. et al. Conditional cardiac overexpression of endothelin-1 induces inflammation and dilated cardiomyopathy in mice. Circulation, v. 109, n. 2, p. 255–261, 20 jan. 2004.
YOSHIDA, H.; MIYAZAKI, Y.; YOSHIYUKI, M. Regulation of immune responses by interleukin-27. Immunological Reviews, v. 226, p. 234–247, dez. 2008.
ZEDIAK, V. P.; HUNTER, C. A. IL-10 fails to inhibit the production of IL-18 in response to inflammatory stimuli. Cytokine, v. 21, n. 2, p. 84–90, 21 jan. 2003.
ZEILHOFER, H. U. Prostanoids in nociception and pain. Biochemical Pharmacology, v. 73, n. 2, p. 165–174, 15 jan. 2007.
ZENEWICZ, L. A. et al. IL-22 but not IL-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation. Immunity, v. 27, n. 4, p. 647–659, out. 2007.
ZENEWICZ, L. A.; FLAVELL, R. A. IL-ββ and inflammationμ leukin’ through a glass onion. European Journal of Immunology, v. 38, n. 12, p. 3265–3268, dez. 2008.
ZENG, R. et al. Synergy of IL-21 and IL-15 in regulating CD8+ T cell expansion and function. The Journal of Experimental Medicine, v. 201, n. 1, p. 139–148, 3 jan. 2005.
ZEYTINOGLU, H.; INCESU, Z.; BASER, K. H. C. Inhibition of DNA synthesis by carvacrol in mouse myoblast cells bearing a human N-RAS oncogene. Phytomedicine, v. 10, n. 4, p. 292–299, maio. 2003.
ZHEUTLIN, L. M. et al. Stimulation of basophil and rat mast cell histamine release by eosinophil granule-derived cationic proteins. Journal of Immunology, v. 133, n. 4, p. 2180–2185, out. 1984.
ZHIGUANG, X. et al. Over-expression of IL-33 leads to spontaneous pulmonary inflammation in mIL-33 transgenic mice. Immunology Letters, v. 131, n. 2, p. 159–165, 8 jul. 2010.
93
ZUBRZYCKA, M.; SZEMRAJ, J.; JANECKA, A. Effect of tooth pulp and periaqueductal central gray stimulation on the expression of genes encoding the selected neuropeptides and opioid receptors in the mesencephalon, hypothalamus and thalamus in rats. Brain Research, v. 1382, p. 19–28, 25 mar. 2011.
94
ANEXOS
95
ANEXO 1 – ARTIGO 1: CITRONELLOL, A MONOTERPENE ALCOHOL,
REDUCES NOCICEPTIVE AND INFLAMMATORY ACTIVITIES IN RODENTS
103
ANEXO 2 – ARTIGO 2: CITRONELLOL REDUCES OROFACIAL NOCICEPTIVE
BEHAVIOUR IN MICE - EVIDENCE OF INVOLVEMENT OF RETROSPLENIAL
CORTEX AND PERIAQUEDUCTAL GREY AREAS
110
ANEXO 3 - PROTOCOLO DE APROVAÇÃO NO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE