C.A.O. MARTINS et al.

Revista Brasileira de Sementes, vol. 22, nº 1, p.42-46, 2000

42

ATIVIDADE DA ISOCITRATO-LIASE DURANTE A GERMINAÇÃO DESEMENTES DE SOJA1

1 Aceito para publicação em 20.04.2000; suporte financeiro PADCT/FINEPpara M.A.M. e BIOAGRO/UFV.

2 Engo. Agro. Parte da dissertação de Mestrado em Fitotecnia (UFV); bolsistada CAPES

3 Engos. Agros., Ph.D., Prof. do Depto. de Fitotecnia.4 Licenciada e Bacharel em Química (D.S.) e Engo. Agro. (Ph.D.); Profs. do

Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular.5 Técnico de Nível Superior do Núcleo de Biotecnologia Aplicada à Agro-

pecuária (BIOAGRO)/UFV; Av. P. H. Holfs s/no. 36571-000, Viçosa-MG.

CARLOS ALBERTO O. MARTINS2, CARLOS S. SEDIYAMA3, MARIA GORETI DE A. OLIVEIRA4, INÊS CHAMEL JOSÉ5,MAURÍLIO A. MOREIRA4, MÚCIO S. REIS3 E VALTERLEY S. ROCHA3

RESUMO - A atividade da enzima isocitrato-liase foi avaliada durante a germinação de sementesde soja (Glycine max (L.) Merrill) das cultivares Doko e CAC-1, após serem submetidas àscondições de estresse, do teste de frio e do envelhecimento acelerado. As sementes submetidasaos dois testes apresentaram perfis da atividade enzimática muito semelhantes, atingindo um máximono sexto dia de germinação, sendo mais acentuada na cultivar Doko. Observou-se que as sementessubmetidas aos testes de estresse não provocaram variações na taxa de degradação enzimática dasreservas lipídicas das sementes. Esses dados indicam que a enzima é altamente estável na sementede soja, evidenciando a importância do ciclo do glioxilato para o processo germinativo.Termos de indexação: isocitrato-liase, germinação, lipídios, Glycine max (L.) Merrill..

ISOCITRATE-LYASE ACTIVITY DURING SOYBEAN SEED GERMINATION

ABSTRACT - The enzyme activity (isocitrate-lyase) was evaluated during the germination ofsoybean seeds (Glycine max (L.) Merrill) from cultivars Doko e CAC-1, after have been submittedto stress conditions of cold test and accelerated aging. In both seed stress conditioning, the aspectspresented by the enzymatic activities were very similar, reaching a maximum in the sixth day ofgermination, being greater in the Doko cultivar. Different seeds stress conditioning did not affectthe enzymatic degradation tax from the lipidic stock of the seeds. These data indicate that theenzyme is highly stable in soybean seeds, showing the importance of the glyoxylate cycle in thegerminative process.Index terms: isocitrate-lyase, germination, lipids, Glycine max (L.) Merrill.

INTRODUÇÃO

As sementes de soja armazenam grande quantidade delipídios e proteínas em seus cotilédones, os quais são usadoscomo nutriente para a germinação, crescimento e desenvol-vimento da nova plântula (Harrington, 1972). Proporcional-mente, as sementes de soja armazenam 40% de proteínas,20% de lipídios, 9% de açúcares e 15 a 18% de hemicelulose,

sendo que as proteínas, lipídios e carbohidratos compreen-dem cerca de 70% da matéria seca das sementes de soja (Bils& Howell, 1963).

Em sementes de soja, a isocitrato-liase e malato-sintasesão enzimas chaves na regulação do ciclo do glioxilato e en-volvidas no metabolismo de lipídios armazenados nas semen-tes oleaginosas, e no desenvolvimento das atividades noglioxissomos. As atividades dessas enzimas aumentam du-rante a germinação das sementes, obtendo-se valores máxi-mos quando ocorre o máximo da proporção de lipídios de-gradados e na síntese de sacarose (Bewley & Black, 1994).Neste ciclo, os lipídios insolúveis das sementes se transfor-mam em açúcares solúveis (sacarose), os quais são facilmen-te deslocados para os meristemas radiculares e apicais (Cioniet al., 1981). Ambas as enzimas são sintetizadas “de novo”após o início do processo germinativo.

Neste trabalho a rota fisiológica do ciclo do glioxilatofoi investigada durante a germinação de sementes de soja,

ATIVIDADE DA ISOCITRATO-LIASE NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA

Revista Brasileira de Sementes, vol. 22, nº 1, p.42-46, 2000

43

previamente submetidas às condições de estresses do teste defrio e do envelhecimento acelerado para medir a atividade daisocitrato-liase.

MATERIAL E MÉTODOS

No presente estudo, utilizaram-se sementes das cultiva-res Doko e CAC-1, provenientes do programa de melhora-mento de soja da Universidade Federal de Viçosa, da safra1993/1994. Foram realizados os seguintes testes: germina-ção - foram semeadas 200 sementes, divididas em quatro ro-los de papel-toalha com 50 sementes cada, colocados emgerminador à temperatura de 25°C e 100% de umidade rela-tiva (Brasil, 1992). O papel substrato foi previamente embe-bido em água deionizada em 2,5 vezes o peso do papel. Fo-ram feitas duas contagens, aos cinco e aos oito dias após asemeadura; de frio - 200 sementes, subdivididas em quatrosubamostras de 50 sementes cada, foram colocadas em rolosde papel germitest, umedecido em torno 2,5 vezes o seu peso.Os rolos foram colocados dentro de sacos plásticos e subme-tidos a baixa temperatura (10±0,3°C), durante sete dias(Loeffler et al., 1985) e após este período, foram submetidasao teste de germinação, como descrito anteriormente; enve-lhecimento acelerado - 200 sementes foram colocadas so-bre uma tela adaptada em caixa de “gerbox”, contendo 40mlde água desmineralizada. A seguir, as caixas foram lacradase transferidas para uma estufa incubadora, por 48 horas, àtemperatura de 41°C e 100% de umidade relativa, conformeKrzyzanowski et al. (1991). Após este período foram subme-tidas ao teste de germinação, como descrito anteriormente;determinação do grau de umidade - as sementes forammoídas e cerca de 1g foi colocada em placas de petri e depoistransferida para a estufa, previamente ajustada à temperatu-ra de 105±3°C, onde permaneceu por 3,5 horas. A soja moí-da foi pesada e repetiu-se o procedimento anterior até atingirpeso constante, de acordo com o procedimento descrito emInstituto Adolfo Lutz (1985), sendo os dados expressos empercentagem de matéria seca; determinação da atividadeda isocitrato-liase - foi determinada em cotilédones de se-mentes de soja após 2, 4, 6 e 8 dias de germinação. O extratoproteico foi obtido pela maceração de 3g de cotilédones emalmofariz previamente resfriado a 4°C, contendo 9ml de tam-pão fosfato 0,05M, pH 6,6, MgCl2 0,01M e 2-mercap-toetanol5mM, e centrifugado a 27.000g por 30 minutos. Em seguidao filtrado foi utilizado para análise, a leitura foi realizada to-mando-se 0,1ml do sobrenadante do filtrado e adicionando-se 2,9ml da solução substrato (contendo tampão fosfato0,05M, pH 6,6; cloreto de magnésio 0,01M; 2-mercaptoetanol

0,005M, fenilidrazina 3,3mM e isocitrato de sódio 1,7mM).A atividade da isocitrato-liase foi obtida pela leitura deabsorbância a 324nm, em espectrofotômetro, durante 10 mi-nutos e a 37°C (Tester, 1976); determinação de proteínas -utilizou-se o método Kjeldahl, conforme recomendado pelaAOAC (1975), tendo como fator de conversão nitrogênio/proteína de 6,23; determinação de lipídios - foram determi-nados em extrator soxhlet, utilizando éter de petróleo comosolvente por 10 horas, segundo o procedimento descrito emInstituto Adolfo Lutz (1985).

O delineamento experimental utilizado foi um fatorial 2x 3 x 4 (duas cultivares, três estados de condicionamento desementes e quatro períodos de coleta de cotilédones), em blo-cos cazualizados com três repetições. Foram feitas análisesde variância e de regressão, para atividade específica, teoresde proteínas e teores de lipídios. Utilizando o teste t com 5%e 1% de significância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As determinações da atividade da isocitrato-liase sobreo isocitrato de sódio, em cotilédones de sementes de soja, dascultivares CAC-1 e Doko, durante a germinação, estão naFigura 1A, B e C. Ocorreu aumento da atividade enzimáticaà partir do 2o dia de germinação, para ambas as variedades,nos três tratamentos. Os cotilédones das sementes de soja dacultivar CAC-1 submetidas ao estresse de frio e de envelhe-cimento acelerado apresentaram perfis da atividade enzimáticamuito semelhantes, onde o maior valor da atividade ocorreuno 4o dia de germinação (Figura 1A e B). No teste de germi-nação o maior valor da atividade ocorreu no 6o dia de germi-nação (Figura 1C). Na cultivar Doko, os cotilédones de se-mentes de soja submetidas ao estresse de frio e ao teste degerminação, apresentaram maior atividade no 6o dia de ger-minação (Figura 1A e C), enquanto que no envelhecimentoacelerado o maior valor da atividade ocorreu no 4o dia degerminação (Figura 1B). Os valores da atividade da isocitrato-liase se apresentaram maiores na variedade Doko quando com-parados com os valores obtidos na cultivar CAC-1, nos trêstratamentos. Vale a pena ressaltar que as sementes da cul-tivar Doko normalmente apresenta maior qualidade fisio-lógica, quando comparada com outras sementes de outrascultivares de soja, como as cultivares Uberaba e Rio Doce(Costa, 1986).

Tester (1976) também observou um aumento na ativida-de da isocitrato-liase antes do 6o dia de germinação emcotilédondes de sementes de soja da cultivar “Essex”, tendoainda observado um decréscimo no 12o dia. Polanowski &

C.A.O. MARTINS et al.

Revista Brasileira de Sementes, vol. 22, nº 1, p.42-46, 2000

44

Obendorf (1991) verificaram um gradual aumento na ativi-dade enzimática da isocitrato-liase em cotilédones de soja docultivar “Maple” após a germinação e durante o crescimentoda plântula, tendo observado maiores valores da atividade no

FIG. 1. Atividade da isocitrato-liase em sementes de soja submetidas ao teste defrio [A] e ao envelhecimento acelerado [B] e sementes normais (C), noteste de germinação.

0

40

80

120

2 4 6 8

Ativ

idad

e (n

M/s

)

Doko

CAC-1

B

0

40

80

120

2 4 6 8

Ativ

idad

e (n

M/s

)

Doko

CAC-1

A

0

40

80

120

2 4 6 8

Ativ

idad

e (n

M/s

)

Doko

CAC-1

C

Germinação (dias)

período entre o 5o e o 11o dia da germinação. Estes autorestambém detectaram atividade enzimática durante as primei-ras 24 horas de germinação, porém, a atividade não foi maisdetectada após o 14o dia de germinação.

ATIVIDADE DA ISOCITRATO-LIASE NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA

Revista Brasileira de Sementes, vol. 22, nº 1, p.42-46, 2000

45

As determinações da atividade específica, estão na Fi-gura 2A, B e C. Quando os valores da atividade foram dividi-dos pela concentração de proteína pode-se observar, com

maior evidência, maiores valores da atividade na variedadeDoko em relação a CAC-1. Os perfis da atividade específicada isocitrato-liase das cultivares CAC-1 e Doko foram seme-

FIG. 2. Atividade específica da isocitrato-liase em sementes de soja submetidasao teste de frio [A] e ao envelhecimento acelerado [B] e sementes normais[C], no teste de germinação.

Atividade específica (nm.s/kg) 1i

Atividade específica (nm.s/kg) 2 i Atividade específica (nm.s/kg)

Atividade específica (nm.s/kg) Atividade específica (nm.s/kg)

02468

1012

2 4 6 8

Doko

CAC-1

A

02468

1012

2 4 6 8

Doko

CAC-1

B

02468

1012

2 4 6 8

Doko

CAC-1

C

Germinação (dias)

Ativ

idad

e es

pecí

fica

(mM

.s-1/m

g)A

tivid

ade

espe

cífic

a (m

M.s

-1/m

g)A

tivid

ade

espe

cífic

a (m

Ms-1

/mg)

C.A.O. MARTINS et al.

Revista Brasileira de Sementes, vol. 22, nº 1, p.42-46, 2000

46

lhantes nos três tratamentos. Em ambas as cultivares, oscotilédones de sementes de soja submentidos ao estresse defrio e ao teste de germinação, apresentaram maior valor daatividade específica no 6o dia de germinação (Figura 2A e C),enquanto que no envelhecimento acelerado, o maior valor daatividade específica foi observado no 4o dia da germinação(Figura 2B).

Comparando-se as Figuras 1 e 2, há padrões distintosentre as atividades da isocitrato-liase para ambas as cultiva-res, para os três testes avaliados. Os resultados demonstramque a atividade da isocitrato-liase não foi afetada pelo estressede frio e de envelhecimento acelerado. Smith & Fites (1973)trabalharam com sementes de algodão, sensíveis a baixa tem-peratura e sementes de mamona, que foram tolerantes aoestresse. Foi possível detectar uma redução na atividade daisocitrato-liase em sementes de algodão, o que não foi encon-trado nas sementes de mamona, quando foram previamentesubmetidas ao teste de frio.

No entanto, a isocitrato-liase e malato-sintase são enzimaschaves na regulação do ciclo do glioxilato e envolvidas nometabolismo de lipídios armazenados nas sementes oleagi-nosas. As atividades dessas enzimas aumentam durante a ger-minação das sementes, obtendo-se valores máximos quandoocorre o máximo de lipídios degradados que são convertidosem sacarose (Bewley & Black, 1994). Através da determina-ção de lipídios foi observado que houve diminuição da con-centração de lipídios nas duas cultivares e a concentração delipídios foi maior na cultivar Doko do que na cultivar CAC-1.

CONCLUSÕES

Pode-se determinar a atividade da isocitrato-liase, emcotilédones, durante a germinação de sementes de soja previ-amente submetidas ao estresse de frio ou de envelhecimentoacelerado. Este fato mostra que ocorreu consumo de lipídiosdurante o processo germinativo. Além disso, mostra que aenzima é estável em sementes de soja, participando do ciclo doglioxilato e auxiliando o processo de germinação das sementes,respondendo à condições de estresse de frio e de envelheci-mento acelerado, através do aumento da atividade enzimática.

REFERÊNCIAS

AOAC - ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICALCHEMISTS. Official methods of analysis. Washington, 1975.1054p.

BEWLEY, J.D. & BLACK, M. Seeds physiology of developmentand germination. New York: Plenum Press, 1994. 445p.

BILS, R.F. & HOWELL, R.W. Biochemical and cytological changesin developing soybean cotyledons. Crop Science, Madison,v.3, n.4, p.304-308, 1963.

BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras paraanálise de sementes. Brasília, SNDA/DNDV/CLAV, 1992.365p.

CIONI, M.; PINZAUTI, G. & VANNI, P. Comparative biochemistryof the glyoxylate cycle. Comparative Biochemestry andPhysiology, Oxford, v.70, n.1, p.1-26, 1981.

COSTA, A.F.S. Avaliação da qualidade fisiológica das sementesde genótipos de soja (Glycine max (L.) Merrill), produzidasem cinco localidades de Estado de Minas Gerais. Viçosa:UFV, 1986. 110p. (Dissertação Mestrado).

HARRINGTON, J.F. Seed storage and longevity. In: KOZLOWSKI,T.T. (ed.). Seed biology. New York: Academic Press, 1972.p.145-245.

KRYZANOWSKI, F.C., FRANÇA-NETO, J.B. & HENNING,A.S. Relato dos testes de vigor disponíveis para grandesculturas. Informativo ABRATES, Londrina, v1, n.2, p.15-50, 1991.

LOEFFLER, N.L.; MEIER, J.L. & BURRIS, J.S. Comparison oftwo cold test procedures for use in maize drying studies. SeedScience and Technology, Wageningen, v.13, n.3, p.653-658,1985.

INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do InstitutoAdolfo Lutz: métodos químicos e físicos para análise dealimentos. 3.ed. São Paulo, 1985. 533p.

POLANOWSKI, A.J. & OBENDORF, R.L. Soybean isocitrate lyase:purification, properties, immunoassays and N-Terminalsequence. Plant Physiology and Biochemistry, Cambridge,v.29, n.2, p.119-129, 1991.

SMITH, E.W. & FITES, R.C. The influence of chilling temperaturealteration of glyoxysomal succinate levels on isocitrataseactivity from germinating seedlings. Biochemistry andBiophysics Research Communication, New York, v.55, n.3,p.647-654, 1973.

TESTER, C.F. Control of the formation of isocitrate lyase in soybeancotyledons. Plant Science Letters, Amsterdam, v.6, n.2, p.325-333, 1976.

!"!"!