Aula 6

AULA 6 – PARTE I: Bioquímica dos Ácidos Nucleicos

Transcrição e processamento de RNA

OS GTF’s: análogos do factor sigma

Os GTF’s são gerais de transcrição, que são necessários para a transcrição de todos os genes, participando na formação do complexo iniciador da transcrição perto do local de iniciação.

Na figura 1a) podemos ver a representação da ligação do factor sigma à RNA Polimerase aquando da iniciação da transcrição nas bactérias. Em 1b) vemos a ligação da RNA Polimerase à sequencia iniciadora da transcrição e dos factores gerais de transcrição à TATA-box (-35, -25) e ao DPE (elemento do núcleo promotor a montante, +30), nos eucariotas.

Os GTF’s da RNA Polimerase II

TFII - factor de transcrição para a RNA Polimerase II

Existem várias classes de factores de factores de transcrição para a RNA Polimerase II:

TFIID TFIIA TFIIB TFIIE TFIIF TFIIH

Sem a ligação de todos estes factores, não há transcrição.

Formação do Complexo de Pré-Iniciação da RNA Polimerase II

André F.S.N. Úrsula 1

Figura 1 a) Promotor bacterianob) Promotor Eucariótico

Figura 2 – Classes de TFII

TFIID

É um complexo proteíco múltiplo É composto por dois tipos de proteínas:

TBP (que se vai ligar à TATA-box) 14 tipos de TAFs (factores associados à TBP)

É o primeiro factor a ligar-se e que vai catalizar a ligação dos outros factores.

TBP


Figura 3 – Formação do Complexo de Pré-Iniciação

Figura 4 – Complexo proteíco do TFIID

Liga-se à TATA-box Provoca a desdobragem do DNA O complexo DNA-TBP vai servir de plataforma para a ligação

sequencial do TFIIA, TFIIB e os TAF’s. É considerado o factor de transcrição universal, tendo papel

fundamental na transcrição pela acção da RNA Polimerase I, II e III.

TAFs

Factores associados ao TBP As suas subunidades contêm histonas dobradas, formando 5 pares

de histonas. Inicialmente foram descritos como coactivadores essenciais em vez

dos GTFs Não são essenciais universalmente; os promotores têm uma

variedade de requisitos para os TAFs A necessidade dos TAFs é definida pelos elementos que constituem

o núcleo promotor.

Funções dos TAFs

Vão-se ligar aos elementos constituintes do promotor e interagir com os factores de transcrição específicos de cada gene.

O TAF1 e TAF2 ligam-se ao INR (sequência iniciadora)


Figura 5 – Representação tridimensional do TBP e da sua ligação ao DNA

Figura 6 – Complexo proteíco do TFIID

O TAF6 e TAF9 ligam-se ao DPE TAF12 interage com as proteínas activadoras

Estrutura Tridimensional do TFIID

A microscopia electrónica revela que o TFIID que a forma de uma ferradura

O dsDNA vai ligar-se ao sulco Possui duas conformações: aberta e fechada A abertura ou fecho induz ou não a ligação da cadeia de DNA ao

sulco A TFIID actua como uma “pinça” molecular que se liga ao DNA

O TFIID será sempre necessário?

Sim.

1. Os promotores podem ser independentes dos TAFs: mas possuem a TATA-box onde há ligação


Figura 7 – Locais de ligação das TAFs

Figura 8 – Estrutura tridimensional do TFIID; a seta indica o sulco onde o dsDNA se vai ligar

2. Os promotores podem não ter a TATA-box, logo não têm ligação ao TBP, mas requerem TAFs (TFIID), possuindo outra sequência onde irá dar-se a ligação.

Os complexos de TBP não são tão necessários quanto os TAF:

Nenhum contém TBP; todos contêm um subconjunto de TAFs Reconhece uma sequência específica de elementos dos núcleos

promotores É recrutado para os promotores por activadores Tem como função ser coactivador transcripcional

TFIIA

É composto por 3 subunidades Liga-se ao núcleo promotor,

estabilizando o complexo TBP-DNA

Bloqueia os inibidores da transcrição

Por vezes é cofactor em vez de GTF porque não é absolutamente essencial para iniciar a transcrição.

TFIIB

Só uma subunidade Liga-se à BRE (região que reconhece o

TFIIB e que se encontra antes da TATA-box no promotor)


Figura 9 – I: núcleos promotores que não necessitam de TAF; II: núcleos promotores sem TATA-box

Figura 10 – Complexo TFIIA/TBP/DNA

Ajuda a definir o local de início da transcrição Ajuda na limpeza do promotor Estruturas 3D:

Zn-ribbon B-finger Dominio nuclear

TFIIF

Constituído por 2 subunidades: dímero Liga-se à RNA Polimerase II Acompanha a RNA Polimerase II até ao PIC

(função similar à do factor sigma nas bactérias)

Facilita a abertura dp promotor (separação das cadeias de DNA)

Influencia o local de iniciação tal como o TFIIB.

TFIIE

Constituído por 2 subunidades Heterodímero: subunidade de 34kDa

e de 56kDa Liga-se ao promotor num local

próximo ao local de iniciação da transcrição

Cria o local de ligação para o TFIIH Estrutura 3D: Tal como o TFIIF, inclui domínios

“winged helix” (domínios em forma de asa)

TFIIH

É um complexo de múltiplas subunidades: possui 10 subunidades de 500 kDa

Tem 3 funções: Transcrição: promove a

abertura das cadeias de DNA do promotor e a saída da RNA Polimerase II


Figura 11 – TFIIB no complexo TBP/TFIIA/DNA

Figura 12 – TFIIF

Figura 13 – TFIIE

Reparação do DNA Progressão do ciclo celular

Actividades catalíticas: Domínio C-terminal da RNA Polimerase II (CTD) cinase

(fosforila o CTD da Pol II) ATPase dependente de DNA DNA helicase 5’-3’ DNA helicase 3’-5’ E3 ubiquitina ligase (reparação do DNA)

Estrutura em microscópio electrónico: possui uma cavidade no centro do complexo, o que sugere o mecanismo para a abertura do DNA promotor

TFIIH: Estrutura da subunidade

Como é que a Pol II reconhece o gene?


Figura 14 – TFIIH e sua estrutura tridimensional

Figura 15 – TFIIH: estrutura da subunidade

Figura 16 – Núcleo promotor

Requisitos para o reconhecimento:

Núcleo promotor RNA Polimerase II e GTFs

Pol II

É uma estrutura de 12 subunidades: Núcleo promotor: Rpb1, Rpb2, Rpb3, Rpb 11 (Rpb: RNA polimerase

B) Subunidades partilhadas pelas Pol I, II e III: Rpb5, Rpb6, Rpb8,

Rpb10, Rpb12 As subunidades Rpb4, Rpb7 e Rpb9 são necessárias à iniciação do

processo de transcrição mas não são essenciais para a elongação.

Factores de Transcrição Específicos

Reconhecem sequências específicas do DNA Controlam especificamente o padrão de expressão de um dado gene Factores a montante (Upstream): reconhecem sequências

específicas de DNA próximas do promotor (ex: Sp1) Factores indutores: reconhecem sequências de DNA designadas por

elementos de resposta: Controlam os parâmetros de transcrição (tempo e

espaço) Família de receptores nucleares: paradigma para os

factores de transcrição específicos Ligam-se ao Enhancer Têm vários domínios:

Zonas de ligação ao DNA (BD) Zonas de ligação ao ligando (L) Zonas de activação (AD)


Figura 17 – Ligação ao Enhancer

Especificidade dos Activadores

A especificidade dos activadores depende da sequência de DNA que é reconhecida pelo activador

Ciclo de transcrição pela RNA Polimerase II

Como podemos observar na figura 19, a ligação da RNA Polimerase II aos GTFs promove a ligação dos TFII para formar o Complexo de Pré-Iniciação (PIC), ocorrendo isomerização formando um complexo aberto que pode levar a duas situações diferentes:

Ligam-se ribonucleótidos de trifosfatos (NTPs), dando-se o primeiro passo da transcrição, a iniciação, remoção do promoto, elongação e terminação, dando origem ao RNA.

A Polimerase II, bem como o TFIIB e o TFIIF desligam-se do complexo e forma-se um complexo scaffold, ao qual se podem voltar a ligar os elementos que se dissociaram anteriormente, dando-se uma reinciação do processo.

Elongação

Adição de nucleótidos para alongar a cadeia de RNA

Remoção do promotor Remoção dos factores de transcrição TFIIE e TFIIF Síntese de RNA pela Polimerase II TFIIF continua associado à Polimerase II Os factores de elongação associam-se à Polimerase II, havendo

aumento da actividade desta enzima O domínio C-terminal da Polimerase II continua fosforilado


Figura 18 – Reconhecimento pelo activador

Figura 19 – Ciclo de transcrição pela RNA

Polimerase II

Terminação

A sequência sinal Poli(A) é transcrita, dando o sinal para que a transcrição acabe. Esta sequência encontra-se na região 3C não-traduzida (UTR)

Existem dois modelos para a terminação da transcrição pela Polimerase II:

anti-terminação – a Polimerase II sofre alteração da conformação e abandona o complexo

torpedo – o transcripto primário (RNA) é clivado e o terminal 5’ é degradado por uma exonuclease, libertando a Polimerase II

A cadeia dupla do DNA é restaurada A molécula de RNA e a Polimerase II são libertadas

___________________________________________________________________________Bibliografia da 6ª aula:COOPER, Geoffrey M., e HAUSMAN, Robert E., The Cell: A MolecularApproach, 4.ª Edição, Sinauer Associates, 2007.DEVLIN, Thomas M., Textbook of biochemistry with clinical correlations,5.ª Edição, John Wiley & Sons, 2002.LODISH, e outros, Molecular Cell Biology, 5.ª Edição, W. H. Freeman.Slides das aulas teóricas.


Documents

Aula 6