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Genticae

Melhoramento de Plantas

Universidade de vora2005

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Estrutura dos cidos nucleicos

cido Desoxirribonucleico (DNA)

cido Ribonucleico (RNA)

Dos genes s protenas (eucariotas): transcrio e traduo

Engenharia Gentica de Plantas

Identificao de genes de interesse Extraco de RNA total e purificao de mRNA

Isolamento e clonagem de genes de interesse

Desenho de primers degenerados Desenho de primers especficos para isolamento dasextremidades (5 e 3 de um gene)

Construo de Vectores de Clonagem

Avaliao de colnias recombinantes com enzimas de restrio

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Constitudo por uma sequncia deapenas quatro nucletidos.

Os diferentes nucletidosapresentam uma estrutura comum:

Um grupo fosfato ligado por umaligao fosfoester a uma pentose

(desoxirribose), a qual se liga a umabase azotada resultando numdesoxirribonucletido.

As bases azotadas podem ser purinas(adenina e guanina) ou pirimidinas(citosina e timina).

Os desoxirrinucletidos ligam-se entresi por ligaes fosfodiester originandouma cadeia simples.

DNA: cido DesoxirriboNucleico

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Duas cadeias simples ligam-seentre si devido complementaridade das suas

bases azotadas (A=T, G=C),atravs de ligaes por pontes dehidrognio, originando uma

cadeia dupla.

James Watson and Francis Crick(1953):

Estrutura em dupla hlice

com orientao das duas cadeiasantiparalela.

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Constitudo por uma sequncia deapenas quatro nucletidos.

Os diferentes nucletidosapresentam uma estrutura comum:

Um grupo fosfato ligado por umaligao fosfoester a uma pentose

(ribose), a qual se liga a uma baseazotada resultando numdesoxirribonucletido.

As bases azotadas podem ser purinas

(adenina e guanina) ou pirimidinas(citosina e uracilo).

Os ribonucletidos ligam-se entre si porligaes fosfodiester originando uma

cadeia simples.

RNA: cido RiboNucleico

Apresenta uma estrutura em cadeiasimples.

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Estrutura de um gene:

Promotor:Promotor: Regio do DNA qual se liga a enzimaRNA polymerase antes de iniciar atranscrio do DNA em RNA.DeterminaDetermina:: regio de incio da transcrio; a cadeia de DNA que servir comotemplate; nmero detranscritos; frequncia da transcrio.

Gene:Gene: Segmento de DNA constitudo por um conjunto de intres e exes que ser transcrito emmRNA, codificando os exes a sntese proteica.

TerminadorTerminador:: Regio terminal que bloqueia a enzimaRNA polimerase e induz a sua dissociao.

5 Promoter UTR Exon1 Intron1 Exon2 UTR Terminator 3

GENE

Poly A

Transcription

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Transcrio (decorre no ncleo):sntese de uma cadeia de RNA mensageiro (mRNA) pela enzimaRNApolimerase que decorre de 5 para 3 tendo como modelo apenas uma

das cadeias de DNA. A nova cadeia resultante ser complementar cadeia de DNA que lhe serviu de molde apresentando uracilo em vezde timina:

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Modificaes ps-transcrio: 5 capping: ligao de uma molcula de 7-metilguanilato extremidade 5 do mRNA durante a transcrio, tendo como

objectivo a proteco da nova cadeia.

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Clivagem da extremidade 3 e adio de uma caudaPoly (A)

Ainda no ncleo o mRNAtranscrito primrio sofre a

clivagem da extremidade 3 eposterior adio de uma caudapoly(A).

A dimenso da caudapoly(A)varia entre 100 a 250adeninas.

No citoplasma a dimenso dacauda diminui.

A funon da caudapoly(A)

no ainda bem conhecida.

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Splicing:clivagem dos intres no inteior dacadeia de mRNA e simultnea

ligao dos exes,correspondendo ltima fase do

processamento das molculas de

mRNA no ncleo.

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GenomaGenomaTotal conjunto de genes

de um organismo

TranscritomaTranscritomaConjunto de sequnciastranscritas (mRNA)

ProteomaProteoma

Conjunto de proteinascodificado pelo genoma

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CCdigo gendigo gentico:tico:envolve o reconhecimento de tripletos

(conjunto de trs nucletidos) domRNA denominados codespeloscomplementares anticodes do tRNA.

Codo de iniciao: AUG (Met)Codes stop: UAA; UAG; UGA

O cdigo gentico universal edegenerado (61 codes codificam paraa sntese de apenas 20 aa):

vrios codes = 1 aa1 codo vrios aa

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InIncio da traducio da traduoo:reconhecimento docodo de iniciao(mRNA) AUG peloanticodo (tRNA)UAC transportandoo aminocido inicialMeteonina.

O ribossoma(rRNA+proteina)movendo-se ao

longo da cadeia demRNA (de trs emtrs nucleotidos)cataliza a sntese

proteica.

Final da traduFinal da traduoo:reconhecimento do

codo de terminao(mRNA) UAG pelo

anticodo (tRNA)AUC com aconsequente

separao das duassubunidades que

constituem oribossoma.

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Melhoramento gentico:

Consiste na adio ou subtraco de um ou mais genes de umorganismo, introduzindo ou silenciado uma determinada caracterstica.

Vantagem:

Ultrapassar a barreira da espcie: um gene que codifica umacaracterstica numa determinada espcie pode ser introduzido numaoutra espcie mesmo que filogenticamente muito afastada recorrendo atcnicas de biologia molecular.

Interesse:

Criar plantas tolerantes ou resistentes a determinadas condies de stressbitico e/ou abitico.

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Exemplo:Introduo de Resistncia ao Fungo Uncinula necator (Odio) emVideira (Vitis vinifera)

O fungo em questo possui parede de quitina pelo que as protenas comcapacidade de a hidrolizar quitinasesquitinases podem conferir planta

potencialidade para resistir a esse stress bitico.

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11 PASSO:PASSO:Pesquisar na bibliografia a existncia de espcies vegetais resistentes a este fungo.Ex.: Vitis rupestris

22 PASSO:PASSO:

Pesquisar na base de dados se o gene est descrito para a espcie classificada comoresistente. Caso no esteja, ser objectivo isolar este gene na espcieresistente para introduzir na espcie sensvel (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

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33 PASSO:PASSO: Isolamento de RNA totalIsolamento de RNA total do organismo do qual se pretende isolar o gene(espcie resistente V. rupestris) e purificapurificao deo de mRNAmRNA.

44 PASSO:PASSO: TranscriTranscrio Reversao Reversa

55 PASSO:PASSO: Desenho deprimers degeneradospermitindo-nos amplificar umasequncia correspondente ao gene que se pretende isolar. Para talseleccionam-se na base de dados as sequncias ORF (Open ReadingFrame) de vrias espcies, ou seja, a regio estritamente necessria para a

codificao da sntese da protena. A ORF inicia-se com a sequnciaKozak(CCGCCATGGG) e finaliza com um dos codes stop,correspondendo sempre maior sequncia encontrada;

66 PASSO:PASSO: Alinhamento das diferentes sequencias de um mesmo gene codificando amesma protena em diferentes espcies e desenho de um primerdegenerado (sequencia de 20 a 30 oligonucletidos)forward(extremidade 5) e outro reverse (extremidade 3);

77 PASSO:PASSO: Amplificao de uma sequncia de cDNA por PCRPCRutilizando os primersdegenerados.

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Extraco de RNA total (Protocolo do Hot Borate) A integridade do RNA avaliada em gel de agarose onde

devem ser visveis duas bandas mais fortes correspondentesao RNA ribossomal (28S e 18S);

Pode ocorrer contaminao com DNA; O trabalho com RNA requer mais cuidados, uma vez que este mais instvel que o DNA;

A grande desvantagem de trabalhar com o RNA ser a de no

existir forma de o amplificar.

28S

18S

Purificao do mRNA

mRNA

Permite isolar genes que se estejam a expressar

(constitutivos ou de expresso diferencial, que s se expressemsob uma determinada condio de stress);

A incapacidade de o amplificar levou ao desenvolvimento detcnicas (TranscriTranscrio Reversao Reversa) que permitiram converter estenovamente em DNA (DNA complementarDNA complementar ou cDNAcDNA).

DNA

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TranscriTranscrio Reversao Reversa

Enzimas denominadas Transcriptases Reversas, descobertas por Temin eBaltimore (1960) em retrovrus, catalizam a sntese de cDNA a partir de

RNA.O cDNA mais estvel e apresenta a vantagem de poder seramplificado por tcnica de PCR.

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TranscriTranscrio Reversao ReversaAAAAAAA () Poly(A)mRNA template

AAAAAAA () Poly(A)

Amplificao por PCR

Degradao da cadeiade mRNA com RNase

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G) VIAL 8

GTCGACATCGATACGCGTGGTC VIAL 9

VTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCTGTAGCTATGCGCACCAG (V=A,C ou G)

AAAAAAAAAAAAAAAGTCGACATCGATACGCGTGGTC


Pefw



AAAAAAA () Poly(A)

PeRev

A transcrio (reversa) do cDNA tem a vantagem de permitir posterior amplificao de um gene de interesse

limpo de intres. O conhecimento da sequncia das extremidades do cDNA permite a posterior amplificaodas extremidades de um gene. Para tal dever utilizar-se umprimerespecfico que emparelhe com uma dasextremidades e um outroprimerque emparelhe com uma zona especfica da nossa sequncia.

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PrimerPrimer:: Sequncia de oligonucletidos (16-24 nucletidos) complementar a umaregio do DNA que ao emparelhar permite o funcionamento da enzima Taqpolimerase e consequente formao de uma nova cadeia de DNAcomplementar existente.

Forward (5Forward (5)) Reverse (3Reverse (3))

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5 3AGGCTA()AGGCTA()

GGCAAT()

CCGTTA()

FwFw RvRv

5 ()ATTGCC

Reverse complement

5 AGGCTA()

Osprimers devem ser desenhados tendo em conta os seguintes pontos:

a) primerForwardForward prximo da extremidade 5 com a sequncia igual dacadeia modelo; ReverseReverse prximo da extremidade 3 com a sequncia complementar da cadeia modelo, sendo a sua sequncia colocada em reverse devido a efeitos deencomenda;

b) cada primer no dever exceder os 25 nucletidos;c) o nmero de nucletidos de um primer depende da sua temperatura de

emparelhamento, determinada da seguinte forma: [2x(A+T)]+[4x(G+C)];

d) a extremidade 3 de cada primer dever ser mais rica em G e/ou C.

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Polymerase chain reaction(PCR)

Amplificaoexponencial de uma sequncia especfica de DNA, determinada

pelo emparelhamento dos primers.

CondiCondies necesses necessrias para a reacrias para a reaco:o:a) sequncia de DNA que servir de template

b) um par de primers (forward e reverse)

c) DNA polimerase(TaqDNA polimerase: Thermus aquaticus)

d) dNTPs(C, T, G, A)c) tampo de PCR com MgCl2

Programa de PCR:Programa de PCR:

1: Desnaturao: temperatura de 90-95C2: Emparelhamento: temperatura varia com primers

3: Temperatura de sntese: temperatura 60-72C

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1. cDNA .. 1l

2. PCR Buffer (10x) .... 5l

3. MgCl (50mM) .. 2l

4. dNTPs (10mM) ... 1l

5. Primer forward (10mM) .. 1l

6. Primer reverse (10mM) 1l

7. H2O Milli-Q estril . 38.5l

8. Taq DNA polimerase .. 0.5l

50l

Mix de PCR:

Programa de PCR:

35 ciclos

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3 55 3

Fw

Rv

330 pb 800 pb 1000 pb

500 pb

5

5

1500pb

600pb

500pb

100pb

MM PCR 1

A utilizao de primers degenerados permitenos amplificar fragmentos especficos daespcie em estudo ( 500pb);

Por vezes ocorre a amplificao de outrosfragmentos denominados inespecficos dado o

emparelhamento inespecfico do primer (seexistir uma pequena sequncia na extremidade3 do primer, sobretudo G ou C, queemparelhem com alguma zona complementar

no templete, ocorrer igualmente sntese deDNA).

-

+

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Sequenciao do fragmento amplificadoNa reaco de sequenciao (PCR com apenas 1 primer) o fragmento vai ser

amplificado com nucletidos marcados que o sequenciador vai reconhecer, sendo oresultado da leitura dado por uma cor diferente para cada nucletido;

A leitura do fragmento de DNA amplificado permite determinar se estecorresponde de facto a um fragmento do gene que se pretende isolar.

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Isolamento das extremidades 5 e 3 do gene Desenho de primers especficos

5(330pb)GGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGG CAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCTAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCGCTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACTATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAGACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATCATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCCCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGGATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTTGGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAGGTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATAAGAGGTACTGTGATATACTTAGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCC (800pb)...3

Ta=(4x15)+(2x9)Ta=(4x15)+(2x9)--10=7810=78--10= 6810= 68

Ta=(4x17)+(2x8)Ta=(4x17)+(2x8)--10=8410=84--10= 7410= 74

5 3

Fw

Rv

cDNA

AAAAAAGGG

Poly(A)

Poly(T)

3 5CCC5PCR primer

500pb

700pb

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Clonagem do Gene Completo

A enzima Taq DNA polimerase possui a capacidade adicional de terminaltransferase (para alm de DNA polimerase), ou seja, adiciona ao final da

cadeia amplificada uma base de adenina (A).Esta capacidade permite a ligao do fragmento amplificado a um vector declonagem linearizado possuindo extremidades de timina (T).

5AATGGGGTTGTGGGCATTGGTAGCTTTCTGTCTGTTGTCATTAATACTGGTTGGCTCAGCAGAGCAATGTGGAGGGCAAGCTGGGGGTAGAGTTTGCCCAGGGGGGGCATGCTGCAGCAAGTTTGGTTGGTGTGGCAACACTGCTGATTACTGTGGCAGTGGCTGCCAAAGCCAGTGCAGTTCCACTGGTGACATTGGCCAGCTTATTACCAGGTCCATGTTCAATGATATGCTTAAGCATAGAAATGAGGGGAGTTGCCCTGGCAAGGGCTTCTACACCTATGACGCTTTCATAGCTGCTGCTAAGGCCTTTCCTGGCTTTGGAACAACTGGTGATAC

CACTACTCGTAAAAGGGAAATCGCAGCCTTCTTGGCTCAAACTTCTCATGAAACCACTGGGGGGTGGGCTAGTGCACCTGATGGCCCATACGCTTGGGGATACTGCTACCTCAGGGAACAAGGCAGCCCCGGAGCTTACTGTGTTCCTAGTGCACAGTGGCCTTGTGCCGCTGGTAGGAAATACTATGGCCGAGGCCCCATACAGATTTCCTACAACTACAACTATGGGCAAGCTGGGAAAGCCATAGGGGTAGACCTGGTAAACAACCCTGATCTAGTAGCAACAGATGCAGTCATATCATTCAAGACAGCCTTCTGGTTCTGGATGACACCCCAGTCACCCAAGCCTTCCTGCCATAATGTCATCACAGGAGGATGGACCCCATCAGGTGCAGATAGGTCAGCAGGGCGGCTTCCCGGTTTTGGTGTTATCACAAACATCATCAATGGAGGTGTTGAATGTGGGAAAGGGGTAGTTCCTCAGGTCCAGGACCGCATAGGTTTCTATAAGAGGTACTGTGATATACTTAGGGTTAGCTATGGCAATAACCTGGACTGCAACAACCAAAGGCCTTTCGGGTCTGGCCTCCTGCTGGACACCATCTAAA3

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Vector de Clonagem: Qual a importncia da MCS?

Os locais de restrio identificados nesta regio so nicos no vector, o quesignifica que as enzimas de restrio especficas deste locais apenas cortaro ovector uma nica vez.

As extremidades que se geram no vector aps digesto com uma determinadaenzima de restrio so compatveis com as extremidades geradas num fragmento

digerido com a mesma enzima, permitindo assim a integrao desse fragmento novector.

Estando a regio MCS inserida no meio da sequncia do gene LacZ (responsvel

pela sntese da enzima -galactosidase e consequente expresso azul das colniasbacterianas) a interrupo do gene por insero de um fragmento, leva inibio daexpresso do gene. As bactrias que possuam plasmdio com um fragmentoinserido na regio MCS (transformadas recombinantes) possuem colorao branca.

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Transformao de bactrias

Introduo de um vector plasmdico, integrando o gene de interesse,em bactrias desprovidas de qualquer DNA desta natureza (bactrias

competentes).

O objectivo desta tcnica consiste obter milhares de cpias do vectorintroduzido na bactria e assim do gene inserido neste.

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Screening de bactrias recombinantes com enzimas de restrioO screening de bactrias recombinantes portadoras do fragmento de interesse pode ser efectuados deduas formas:

1. Por PCRPCRutilizando os primers especficos do gene ou do vector;

2. Por digesto com enzimas de restridigesto com enzimas de restrioo que flanqueiem o local de insero do gene.Neste caso necessrio a incubao prvia das colnias seleccionadas em LB lquido para posteriorextraco do DNA plasmdico (protocolo da aula). Somente aps esta extraco que se poderefectuar a digesto do DNA utilizando enzimas de restrio especficas da zona MCS (podendo serapenas uma enzima com dois locais de restrio, um na zona 5 do fragmento e outro na zona 3 ou

duas enzimas diferentes).

Mix Digesto:

1. DNA plasmdico extraido . 10l

2. Buffer (10x) .. 2l

3. Enzima 5 . 0.3l

4. Enzima 3 . 0.3l

5. H2

O Milli-Q estril .. 7.4l

20l Incubar 2-3h a xC (a temperatura ptimavaria com as enzimas, sendo na maior parte doscaso 37C)

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Screening de bactrias recombinantes com enzimas de restrio

1. A reaco de digesto no foi completa,pois observam-se no gel bandascorrespondentes a formas circulares e

superenroladas;2. Apenas as colnias 2 e 4 apresentam o

fragmento de interesse (1000 pb);

3. A colnia 1 apresenta um fragmentoclonado de peso inferior ao desejado;

4. A colnia 3 apesar de apresentar umabanda correspondente a um fragmentode 1000 pb, apresenta uma outra bandacorrespondente a um fragmento de peso

inferior a 100 pb. Como o vector nopossui mais locais de restrio para asenzimas utilizadas, as duas bandascorrespondero a um fragmento de pesototal de 1050pb que possui um local derestrio para uma das enzimasutilizadas a 50 pb de uma extremidade.

MM cl.1 cl.2 cl.3 cl.4

1500 pb

600 pb

Polissacridos

DNA circular com nicks

DNA linearDNA circular superenrolado

Fragmento linear digerido

100 pb

5(0pb)

3(1000pb)

SacI KpnI

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Alguns Mecanismos de Transferncia de genes deinteresse

Construo de Vectores de Expresso

Agrobacterium

Bombardeamento de Partculas

Mecanismos de seleco de transgnicos

Melhoramento Clssico vs. Biotecnologia

Melhoramento gentico: potencialidades, benefcios eriscos

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Construo de Vector de Expresso

Um vector de expresso corresponde a um vector plasmdico integrando uma sequnciadenominada cassete de expresso- sequncia de DNA linear que inclui para alm dos genes,um promotor e um terminador que controlam a expresso de cada gene em particular. Nacassete de expresso podem existir:

a)a) apenas o gene de interesse (ex.: chitinase), no existindo forma de seleco;b)b) o gene de interesse e o gene de seleco (resistncia a antibitico ou herbicida);c)c) o gene de interesse, o gene de seleco e um gene reprter:

--glucuronidase (GUS);

- Green Fluorescent Proteins (GFP).

CHITINASE

Vitis rupestrisGUS

pHKTL1(12.020 Kb)

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AgrobacteriumAgrobacteriumtumefacienstumefaciens

uma bactria que existe naturalmenteno solo infectando um grande nmerode dicotiledneas.

Penetra nas razes atravs de feridasprovocando uma reaco no tecido quese traduz numa multiplicao anormaldas clulas dando origem a tumores.

Os tumores resultam da transferncia, integrao e expresso nas clulas da planta deum segmento especfico do DNA bacteriano designado de T-DNA (DNA transferido).Esta capacidade faz da bactriaA. tumefaciens um instrumento natural de engenhariagentica.

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O T-DNA constitui parte do plasmdio Ti (tumour inducing) que ocorre naturalmente nasclulas deA. tumefaciens e responsvel pela capacidade infecciosa da bactria.

A forma de explorar a capacidade doA forma de explorar a capacidade doA.A.tumefacienstumefaciens consiste em:consiste em: alterar a zona de DNA que

transferida (T-DNA), eliminando os genestumorais e o gene para a opina (aminocidomodificado utilizado como fonte de carbono eazoto pela bactria), substituindo-os pelo gene ougenes que se pretendem introduzir;

as sequncias dos limites so os

nicos elementos que necessrio manter (LE eLD) permitindo a transferncia da sequncia doT-DNA para as clulas do hospedeiro.

Mapa gentico do plasmdio Ti.

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Devido s grandes dificuldades em manipular grandes molculas de DNA como o

plasmdeo Ti, foram desenvolvidos vectores em que toda a manipulao feitarecorrendo Escherichia coli.

Esquema do plasmdeo Ti utilizado para transformao declulas vegetais mediada porA. tumefaciens.

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4.4. Infeco (co-cultura que decorre em mdia

2 dias) do hospedeiro com transferncia dovector Ti para as clulas desse (o materialvegetal utilizado depende do sistema deregenerao seguido);

5. Transferncia da regio T-DNA (suporta osgenes de interesse) do vector Ti da bactria

para o genomagenoma do hospedeiro;

6.6. Integrao do T-DNA no genoma da planta:clulas transformadas;

7.7. Multiplicao da regio T-DNA integrada

no genoma da planta originando uma novaplanta integrando esse(s) gene(s): plantatransgnica.

8.8. Expresso dos genes introduzidos nohospedeiro quando sob a condio de stressque se tentou combater.

Agrobacterium

Ti plasmid withthe new gene

Plant cell

cellsDNA

Transgenic plant Cell division

The newgene

+ Transformation

Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens

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A regenerao de plantas(embriognese somtica) a partir de

zonas integrando o genes GUS originaplantas transformadas. A anlisehistoqumica realizada em plantaspermite detectar por expresso da

colorao azul as plantas que integrameste gene reprter.

SelecSeleco de Plantaso de Plantas TransgTransgnicasnicas

A anlise histoqumica comX-Gluc permite verificar a

eficincia da transformao.A rea azul corresponde a

zonas onde ocorreu aintegrao do gene GUS e

sua expresso com sntese daproteina-glucoronidase.

Calli embriognicos transformados

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LimitaLimitaes da Tes da Tcnicacnica

Apesar de ser utilizado com sucesso na transformao de muitas dicotiledneas,apresenta como grande limitao: a reduzida capacidade na transformao demonocotiledneas.

Na tentativa de incrementar esta capacidade de transformao testaram-se diferentesestirpes deAgrobacterium, condies fisiolgicas da bactria e hospedeiro, bem comotcnicas de co-cultura (Godwinet al., 1992), no se conseguindo ainda assimresultados favorveis.

A transformao de monocotiledneas requer um sistema alternativo detransformao gentica, como por exemplo o bombardemanto de particulas ou a fusode protoplastos.

A integrao de genes peloAgrobacterium d-se unicamente ao nvel do DNAgenmico do hospedeiro. Caso se pretenda introduzir informao noutro qualquerorganelo celular, ter de se recorrer a outras tcnicas, como por exemplo obombardeamento de partculas.

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Bombardeamento de PartBombardeamento de Partculas,culas, GenGen GunGun ouou BiolBiolsticastica

Mtodologia que permite transformar geneticamente plantas de espcies que oAgrobacterium no infecta (como por exemplo o arroz, o milho, a cevada, etc.).

A tA tcnicacnica baseabasea--sese em:em:projectar a uma presso elevada (variando esta com o material vegetal em causa, paracalli de videira utilizada uma presso entre 1100 e 1550 psi) partculas de ouro outungstnio de dimetro varivel (1.00m) com o DNA (vector plasmdico com acassete de expresso ou apenas a cassete de expresso) agregado.

A fora mecnica gerada por uma velocidade elevada permite que sejam quebradas barreirasbiolgicas, podendo ocorrer integrao do DNA estranho no genoma das clulasbombardeadas (DNA nuclear). Para alm deste, esta tcnica possibilita a integrao ao

nvel do genoma dos cloroplastos (Yeet al., 1990; Daniell, 1993) e das mitocondrias.

A aplicao desta tcnica requer:- uma preparao prvia muito cuidada;

- DNA circular ou linear de boa qualidade;- existncia de um protocolo de regenerao optimizado.

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O aparelho utilizado:O aparelho utilizado:

Cmara de Bombardeamento

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Suporte do disco de ruptura (1)

Estrutura onde se colocam osmacrocarriers, respectivos

suportes e stopping screen (2)

Suporte do material Vegetal (3)

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Disco de ruptura

Suporte do disco de ruptura

(1)

O disco de rupturadisco de ruptura determina a presso qual sero projectadas aspartculas com o DNA agregado.

Existem diferentes discos de acordo com a presso que suportam: um

disco de 1550psi significa que suporta presses inferiores a esta e queao atingir este valor rompe, permitindo que as partculas sejamprojectadas sob o material vegetal.

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Macrocarrier Stopping Screen

(2)

Suportes do MacrocarrierTampa

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(3)

O material vegetal utilizado no bombardeamento de partculas depende do sistema de

regenerao utilizado para a espcie vegetal que se pretende transformar, podendo sercalli, embries, discos foliares, etc.

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AnAnliselise histoquhistoqumicamica 2 dias aps o bombardeamento permite determinar o sucesso da

transformao. O nmero de pontos azuis corresponde aos pontos em que ocorreu integrao dogene GUS e sua expresso.

As primeiras clulas do material vegetal a serem bombardeadas so normalmente destrudas, noentanto, junto a essas existe uma rea de clulas envolvente em que as partculas penetraram semas destruir. Algumas destas clulas vo sobreviver agresso provocada pela ferida das partculas

e incorporar no genoma o DNA transportado. Aps a incorporao do(s) gene(s) no genoma daplanta, as clulas podem express-lo com a consequente produo da protena por ele codificada.

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Vantagens relativamente aoVantagens relativamente aoAgrobacteriumAgrobacterium::

Possvel utilizao em dicotiledneas e monocotiledneas;

Inexistncia de falsos positivos, correspondentes a plantas notransformadas mas que possuindo a bactria utilizada como vector datransformao, manifestam a presena do gene;

Necessidade de apenas um antibitico para seleco das plantastransformadas. A utilizao deA. tumefaciens requer a utilizao dedois antibiticos, um para eliminar a bactria e um outro para aseleco das plantas transformadas.

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LimitaLimitaes da tes da tcnica:cnica:

Elevada destruio celular: as camadas celulares mais externas so denominadas dezona de morte por serem destrudas devido ao impacto ou fragmentao daspartculas ou rajada de ar produzida (Birch and Franks, 1991);

Baixa estabilidade dos transformante: apesar de ocorrer integrao de um gene nogenoma de uma clula que poder regenerar uma planta, esta integrao no estvel,apenas 1-5% das clulas expressam integrao estvel (Finer and McMullen, 1990);

Limitado na dimenso das construes genticas: quanto maior o vector de expressomenor a possibilidade de sucesso;

Permite repeties: existe a possibilidade de integrar vrias vezes o mesmo gene no

genoma da clula vegetal, dando origem a repeties e consequente expressodiferencial do mesmo gene;

Desconhecimento do efeito que a velocidade das partculas pode causar, bem como

da composio das mesmas, partculas de tungstnio podem oxidar resultando txicaspara as clulas.

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SelecSeleco de tecidos geneticamente transformadoso de tecidos geneticamente transformados

Aps transformao, mediada porAgrobacterium ou Bombardeamento de Partculas,o material vegetal ser transferido para meio de cultura suplementado com antibitico ouherbicida (depende do marcador de seleco utilizado. Ex.: se na cassete de expresso seintegrou o gene que confere resistncia ao antibitico higromicina, o agente de seleco

adicionado ao meio de cultura ser este antibitico).Apenas as clulas expressando o gene de seleco conseguem sobreviver ao agente

utilizado originando plantas resistentes a esse. Assume-se que estas plantas, por possurem ogene de seleco possuem tambm o gene de interesse (ambos os genes foram integrados na

cassete de expresso utilizada).

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A obteno de resistncia a determinadas condies de stress bitico ou abitico

possvel utilizando mtodos tradicionais ou convencionais.

cruzamento entre espcies sensveis (Vitis vinifera) eespcies resistentes a esse stress (V. rupestris) originando hbridos, alguns dos quais

possuindo a caracterstica desejada. No entanto, este mtodo muito moroso e no estisento de forte controvrsia, j que os hbridos assim obtidos podem colocar em causa atipicidade do produto final.

A biotecnologia, atravs dos seus mtodos de propagao e transformao gentica,apresenta grande potencial para o melhoramento de diversas espcies vegetais.Esta metodologia apresenta, relativamente aos mtodos de melhoramento

convencionais, as seguintes vantagens:- melhoramento de grande preciso, em que apenas o gene pretendido

introduzido no genoma da planta;- reduo do tempo de obteno da nova variedade;

- inexistncia de barreiras quanto provenincia do gene responsvel pelacaracterstica que se pretende introduzir, podendo ter origem em qualquer outra planta.

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