c m Ecircoen

AUTARQUIA ASSOCIADA Agrave UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO

ESTUDOS DOS EFEITOS DA RADIACcedilAtildeO GAMA E DE

ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO DE GRAtildeOS DE

MILHO (Zeamays) GENETICAMENTE MODIFICADO

RICARDO GANDARA CREDE

Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear-Aplicaccedilotildees

Orientadora Dra Anna Luacutecia C H Villavicencio

Satildeo Paulo 2005

I N S T I T U T O D E P E S Q U I S A S E N E R G Eacute T I C A S E N U C L E A R E S

A u t a r q u i a assoc iada agrave Un ive r s idade de Satildeo P a u l o

E S T U D O S D O S E F E I T O S DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E D E

A C E L E R A D O R E S D E E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O D E G R Atilde O S DE

M I L H O Zea mays) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

R I C A R D O G A N D A R A C R E D E

Disse r t accedilatildeo a p r e s e n t a d a como

p a r t e dos requ is i tos p a r a

ob tenccedilatildeo do G r a u de M e s t r e em

Ciecircnc ias n a Aacute r e a de Tecnologia

N u c l e a r - Apl icaccedilotildees

O r i e n t a d o r a

D r a A n n a L C H Vil lavicencio

Satildeo Pau lo

2005

(CASAtildeO K poundCIacuteAl DC CfERSAcirc NuumlCLEAaSP-H^i

II

Este trabalho eacute dedicado a todos aqueles

que fazem ou acreditam na ciecircncia brasileira

III

Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos

Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio

Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees

Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho

Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp

Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico

Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo

Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica

Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo

Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico

Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho

A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia

Muito Obrigado

A G R A D E C I M E N T O S

IV

Segundo Albert Einstein

A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa

desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela

pode ser

mas sou brasileiro

e natildeo desisto nunca

E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE

M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

Ricardo Gaacutendara Crede

R E S U M O

A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

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Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

I N S T I T U T O D E P E S Q U I S A S E N E R G Eacute T I C A S E N U C L E A R E S

A u t a r q u i a assoc iada agrave Un ive r s idade de Satildeo P a u l o

E S T U D O S D O S E F E I T O S DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E D E

A C E L E R A D O R E S D E E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O D E G R Atilde O S DE

M I L H O Zea mays) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

R I C A R D O G A N D A R A C R E D E

Disse r t accedilatildeo a p r e s e n t a d a como

p a r t e dos requ is i tos p a r a

ob tenccedilatildeo do G r a u de M e s t r e em

Ciecircnc ias n a Aacute r e a de Tecnologia

N u c l e a r - Apl icaccedilotildees

O r i e n t a d o r a

D r a A n n a L C H Vil lavicencio

Satildeo Pau lo

2005

(CASAtildeO K poundCIacuteAl DC CfERSAcirc NuumlCLEAaSP-H^i

II

Este trabalho eacute dedicado a todos aqueles

que fazem ou acreditam na ciecircncia brasileira

III

Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos

Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio

Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees

Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho

Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp

Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico

Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo

Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica

Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo

Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico

Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho

A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia

Muito Obrigado

A G R A D E C I M E N T O S

IV

Segundo Albert Einstein

A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa

desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela

pode ser

mas sou brasileiro

e natildeo desisto nunca

E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE

M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

Ricardo Gaacutendara Crede

R E S U M O

A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

II

Este trabalho eacute dedicado a todos aqueles

que fazem ou acreditam na ciecircncia brasileira

III

Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos

Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio

Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees

Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho

Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp

Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico

Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo

Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica

Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo

Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico

Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho

A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia

Muito Obrigado

A G R A D E C I M E N T O S

IV

Segundo Albert Einstein

A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa

desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela

pode ser

mas sou brasileiro

e natildeo desisto nunca

E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE

M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

Ricardo Gaacutendara Crede

R E S U M O

A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

III

Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos

Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio

Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees

Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho

Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp

Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico

Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo

Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica

Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo

Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico

Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho

A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia

Muito Obrigado

A G R A D E C I M E N T O S

IV

Segundo Albert Einstein

A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa

desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela

pode ser

mas sou brasileiro

e natildeo desisto nunca

E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE

M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

Ricardo Gaacutendara Crede

R E S U M O

A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

IV

Segundo Albert Einstein

A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa

desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela

pode ser

mas sou brasileiro

e natildeo desisto nunca

E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE

M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

Ricardo Gaacutendara Crede

R E S U M O

A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE

M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O

Ricardo Gaacutendara Crede

R E S U M O

A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

VI

A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF

G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)

Ricardo Gandara Crede

A B S T R A C T

The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

VII

S U M A R I O

Paacutegina

1- Introduccedilatildeo 1

2- Objetivos 10

3- Revisatildeo da Literarura 11

-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11

-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15

33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17

34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20

bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23

-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31

38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34

39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36

4- Materiais e Meacutetodos 40

41- Amostras 40

42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41

-43- Controles positivos 43

44- Adequaccedilatildeo das amostras 43

45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43

46- Primers 46

47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47

48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47

49- Programaccedilatildeo do termociclador 48

410- A eletroforese dos produtos da PCR 49

5- Delineamento Experimental 51

6- Resultados 52

7- Discussatildeo 62

8- Conclusotildees 69

9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

VIII

LISTA DE Q U A D R O S

Paacutegina

Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34

Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47

Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

IX

L I S T A D E F I G U R A S

Paacutegina

Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2

Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics

pertencente ao IPEN 7

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao

IPEN 8

Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de

Spodotera frugiperda 12

Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no

colmo do milho 12

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea

grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea

alimentando-se em urna espiga de milho 12

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do

IPENCNEN em Satildeo Paulo 28

Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

X

Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais

estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38

Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho

utilizadas no experimento 41

Figura 11 Amostras devidamente embaladas para

irradiaccedilatildeo na Gammacell 42

Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo

no acelerador de eleacutetrons 42

Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de

extraccedilatildeo de DNA 46

Figura 14 termociclador utilizado modelo

Mastercycler (Eppendoriacute) 49

Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para

o registro dos resultados 50

Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e

sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52

Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54

Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando

a presenccedila ou ausecircncia de milho 55

ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

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Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

XI

Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl

mesmo com doses de 50kGy 56

Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se

amostras irradiadas em diferentes doses 56

Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76

natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57

Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho B t l l 58

Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras

de milho MON810 59

Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo

milho Btl I depois de irradiadas 60

Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo

milho MON8I0 depois de irradiadas 60

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais

1- Introduccedilatildeo

A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar

perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades

geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996

o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em

1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o

melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995

no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em

1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em

1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado

transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores

como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com

mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior

resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-

paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro

alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua

conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos

produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos

cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia

dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia

influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo

Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico

econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)

A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia

produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo

propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a

sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no

mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a

biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees

do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o

comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial

As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute

o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de

multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do

terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente

modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees

culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)

Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes

geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP

Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos

transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir

de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural

efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de

riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada

por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias

resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos

alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute

necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses

alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da

seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da

fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A

seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e

qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos

transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de

seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)

Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho

(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar

- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente

alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a

alguns insetos

- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas

produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da

bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil

transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes

- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui

resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb

- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a

proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer

A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser

realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)

A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute

um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se

dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que

flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-

96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA

eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos

repetitivos (IKUNO 2000)

Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez

que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos

tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a

DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada

para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas

inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo

que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de

uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que

habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes

sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores

automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de

temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)

O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia

Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e

patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a

identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na

detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se

altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente

5

cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW

modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise

pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise

pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo

geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)

Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR

demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais

pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de

Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no

Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de

alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos

geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica

ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready

produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda

natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos

industrializados (SiLVA 2000)

Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos

como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado

do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo

natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos

(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de

DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes

acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o

DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de

biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)

Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro

independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma

tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de

trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em

relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam

estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia

nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias

utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)

A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua

composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros

Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo

destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de

produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e

propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por

meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de

aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de

esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas

reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil

(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela

produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees

ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo

mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de

Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo

(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de

profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)

Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em

produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material

Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN

Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de

alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex

para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995

ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de

diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de

patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a

aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU

1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle

dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de

seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos

microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas

estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)

As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo

constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em

desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne

peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final

(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de

msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o

brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de

fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da

produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio

mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de

alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo

prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim

de sanar diversos destes problemas

Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN

COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute

o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas

a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA

(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas

naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para

alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da

quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos

autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou

natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A

RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO

DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram

estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que

poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da

teacutecnica da PCR

2- Objetivos

Este trabalho teve como principaacuteis objetivos

- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na

detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o

possuam como ingrediente

- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados

- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente

modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados

11

3 - Revisatildeo da Literatura

3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados

Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com

propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes

foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de

pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al

1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum

tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e

ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a

insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis

(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As

proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens

Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se

alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do

tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura

osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos

consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)

Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em

milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da

planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de

Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do

colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens

de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)

verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta

praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser

mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)

12

Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda

Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho

Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta

de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho

13

A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado

contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e

Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes

de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal

liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos

lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com

tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos

geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram

a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea

grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena

CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas

no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados

de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas

no milho Btl 1

Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que

expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos

mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas

resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em

relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos

MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera

frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente

reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas

respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram

no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros

lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho

modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor

dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos

14

MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade

devido ao ataque de ambas as pragas

No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos

geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para

Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os

dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em

niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas

ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e

ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente

menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1

e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera

frugiperda e de Heliothis zea

Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos

geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia

nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos

milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e

MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste

crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave

formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados

e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi

efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no

cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente

modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas

folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e

B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as

folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos

inclusive da populaccedilatildeo mais resistente

15

Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia

dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418

(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia

nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do

milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se

manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos

da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes

padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810

MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os

instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto

na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a

expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode

determinar maior ou menor controle da praga

Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l

(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no

controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados

obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia

independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica

(BURKNESS et al 2002)

32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em

alimentos

A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na

presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente

modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou

imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de

16

proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com

detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta

resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)

Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados

imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas

mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western

Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a

proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave

membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a

proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um

composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena

Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere

toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)

Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute

ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um

meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em

alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes

de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC

(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de

milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus

thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)

Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a

possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo

comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do

cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e

17

permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0

ILSIAACC 2 0 0 2 )

Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante

para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo

dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises

baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena

transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos

pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso

algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas

como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma

variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )

33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A

Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA

exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de

promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes

marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo

Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de

proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos

geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do

DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )

A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes

alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos

analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise

quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo

desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou

[g

menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN

et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias

contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a

escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos

este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para

plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da

lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)

Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares

de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de

um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da

variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi

publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras

existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm

fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e

do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium

tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram

validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research

Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and

Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -

^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo

Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -

BgVV(LlPP et al 2000)

Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas

geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos

laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para

diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma

indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado

19

mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo

subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do

ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp

WAIBLINGER 2001)

Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para

anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo

no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste

num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto

geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em

um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do

fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de

equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com

este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees

conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras

desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo

semi-quantitativo (LAUTER 2000)

Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou

instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et

al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado

que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de

agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos

obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se

conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de

monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se

representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos

de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva

de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma

20

forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do

DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas

coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada

medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da

PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA

Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses

casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR

Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram

publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente

modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e

milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)

Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR

competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a

coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos

resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados

para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo

Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os

diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo

controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de

material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER

2000)

34 - A rotulagem dos geneticamente modificados

A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor

(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para

garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de

21

escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na

sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos

No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria

Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no

acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta

rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo

produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador

do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos

transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente

modificados ( M O M M A 1999)

Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi

encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex

Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da

CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas

internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de

OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas

transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo

baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada

equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta

nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais

e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave

rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)

encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)

Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque

entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute

inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai

1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente

expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia

77

Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido

tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no

conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por

teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente

elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da

outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica

inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados

nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos

pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis

(GACHET 1999)

Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada

para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo

como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial

nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais

carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser

abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais

aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem

base cientiacutefica

Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e

testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta

insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da

seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis

americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )

23

35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos

O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando

no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea

alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos

da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios

alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de

seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de

alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees

com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente

para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira

investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of

Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella

trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de

material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL

1990)

Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes

tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se

utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na

Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos

acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta

voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em

praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que

viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou

agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy

inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames

e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de

alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o

2 4

desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca

foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses

pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a

irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)

Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo

Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base

para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram

que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios

ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de

penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas

geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo

denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a

ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e

bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o

Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy

Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas

pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios

eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por

problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser

supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT

University of California Davis University of Washington Seattle e mais

recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)

No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e

incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros

paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas

estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no

Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment

25

Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos

estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do

uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal

da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade

higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf

No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta

tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a

germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar

aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra

fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)

Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola

Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de

Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda

em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional

sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy

Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas

realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades

responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo

dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga

Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo

nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)

No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a

deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no

Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para

aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo

Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos

anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de

26

alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80

foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos

alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos

foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela

International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization

(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como

oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos

que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados

com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a

exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta

perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo

satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)

Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o

seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration

(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e

microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)

Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias

secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para

controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias

principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)

Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o

nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem

aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais

(IAEA 2001)

Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90

nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs

causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria

de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e

pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA

1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do

uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo

aprovada

No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como

processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de

29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25

de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria

de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de

2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)

Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente

Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela

FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em

qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes

condiccedilotildees

a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade

pretendida

b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as

propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos

c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de

irradiaccedilatildeo e

d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por

Radiaccedilatildeo

Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em

irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de

Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-

60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50

ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada

na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de

cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa

uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a

CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu

mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais

moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -

CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro

uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN

com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui

dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter

semi-mdustnal (RELA ei al 2005)

Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das

Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo

29

36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos

Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da

FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas

provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais

difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade

econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came

bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente

rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente

incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda

econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com

organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o

comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )

Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com

radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto

e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou

reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que

deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se

utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra

natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as

qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado

natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento

(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )

Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos

podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como

derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos

3 0

dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma

reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)

O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente

ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento

quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas

modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de

irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como

conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de

pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria

quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente

500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo

aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns

casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)

Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes

em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da

FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os

tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios

gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e

066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de

eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito

abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material

incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma

dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees

gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande

espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)

satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de

31

37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos

Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos

armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a

fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de

produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade

de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por

ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com

radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos

quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)

O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a

infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a

qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria

atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave

contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor

nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para

controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)

fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente

para o processamento de alimentos (lAEA 2001)

Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser

usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos

produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a

irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o

consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )

32

Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade

dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas

tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose

produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes

Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos

devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado

desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes

especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades

funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados

(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e

geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)

O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o

grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no

tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos

econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose

deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO

1 9 9 8 )

Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos

indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser

utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade

espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo

taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata

de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a

completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)

A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos

estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados

33

Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o

uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso

de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST

1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os

insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma

constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma

teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa

muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para

desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para

a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que

possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da

irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)

Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade

de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer

produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)

Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o

uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os

custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos

irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa

qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade

por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o

caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do

produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil

(DiEHL 1995)

3 4

38 - Perdas na armazenagem de gratildeos

As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de

fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos

germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede

humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos

brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute

armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas

meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra

Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total

produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada

por ano (LORINl 2004)

Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros

Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda

Anual (RS)

Milho 41536000 4154000 465 milhotildees

Soja 37216000 3722000 587 milhotildees

Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees

Trigo 2967000 296000 44 milhotildees

Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees

Cevada 338000 33000 58 milhotildees

Outros 3103300 310000 -

Total 98117000 9811000 14268 milhotildees

bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004

35

Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia

uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para

outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes

de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute

que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em

outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o

manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as

pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a

realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos

armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de

limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas

conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de

destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento

curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade

armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )

Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a

armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo

ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto

fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )

No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente

viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de

produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao

produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo

assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )

Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos

quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou

controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais