Autora: Karolina Ribeiro Gonçalves Orientador: André ...‡ÃO... · meus exemplos, por sempre confiarem em mim, me apoiarem e me ensinarem a nunca ... BRE Bloqueio do ramo esquerdo

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Alterações funcionais e histopatológicas induzidas pela sinvastatina

na cardiopatia chagásica em modelo canino

Autora: Karolina Ribeiro Gonçalves

Orientador: André Talvani

Co-orientador: Rosália Morais Torres

Ouro Preto, 2014

I

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Alterações funcionais e histopatológicas induzidas pela sinvastatina

na cardiopatia chagásica em modelo canino

Autora: Karolina Ribeiro Gonçalves

Orientador: André Talvani

Co-orientador: Rosália Morais Torres

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como

parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de

Mestre em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Imunobiologia de protozoários

Ouro Preto

II

Dedicatória

III

“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”

Cora Coralina

Aos meus pais, Ademir e Márcia, por serem

meus exemplos, por sempre confiarem em

mim, me apoiarem e me ensinarem a nunca

desistir. Aos meus irmãos por se fazerem

presentes, mesmo distantes. Aos meus

sobrinhos lindos, por trazerem alegria a

minha vida. Ao Alvaro por me ensinar a ser

paciente e sempre estar ao meu lado. Muito

obrigada! Amo vocês!!!

Agradecimentos

IV

Agradeço a Deus pela dádiva da vida e pela proteção diária. Sem sua luz com certeza não

conseguiria.

Agradeço ao meu orientador André Talvani, pela confiança, apoio e amizade, além de sua

dedicação, competência, generosidade e valiosa orientação.

Agradeço aos meus pais pelo incentivo e por sempre acreditarem em minha capacidade.

Aos meus irmãos pelas palavras de carinho e conforto e por sempre torcerem por meu

sucesso.

A toda minha família, tios. tias e primos por todo o apoio.

Agradeço ao Alvaro, amigo, namorado e pesquisador, por ser tão prestativo, carinhoso e

por estar sempre ao meu lado.

Aos meus sogros por me acolherem sempre tão bem, e me fazerem sentir parte da família.

Isso com certeza fez toda a diferença durante esta etapa.

Agradeço a Lílian Melo, pela generosidade em me ensinar como conduzir um trabalho e

compartilhar comigo todo conhecimento adquirido.

Agradeço a Terezinha por me auxiliar sempre com toda sua experiência, e sempre estar

disposta a ajudar.

Agradeço a Rosália pela disponibilidade e paciência em me ensinar.

Agradeço a Lívia, Ivo, Guilherme e Arlete por sempre estarem dispostos a ajudar e

colaborar com este projeto.

Agradeço aos companheiros de caminhada, Ana Lia, Lud, Laís e Bia pela amizade,

momentos de estudo e por tornar este processo muito mais divertido.

Agradeço a todos do Laboratório Doença de Chagas pelo apoio, conversas e risos, que

tornaram esta caminhada menos árdua.

Aos amigos de Caetanópolis e Ouro Preto, por sempre me encorajarem e torcerem pelo

meu sucesso!

Agradecimentos

V

Agradeço aos mestrandos 2012, em especial Leca, Laura, Helem, João, Vívian, Ana Maria

e Roberta pelos momentos de estudo e por sempre me ajudarem em minhas dificuldades.

Agradeço aos colegas dos outros laboratórios, pela ajuda, empréstimos de reagentes e

compartilhamento de conhecimento. Em especial à Jamile pela paciência em me ajudar

com as lâminas de picrossirius e ao Luís Fernando pela ajuda com os eletrocardiogramas.

Agradeço ao Professor George pela disponibilidade e por me ajudar com a estatística.

Agradeço a República Feijão com Arroz, meu porto seguro, família que escolhi em Ouro

Preto. Obrigada irmãs por me agüentarem, entenderem minha ausência durante a

realização deste trabalho e por todo apoio.

Agradeço também as fontes de fomento e apoio Capes e UFOP. Agradeço também a

Sanval pela doação da sinvastatina, essencial na realização deste projeto.

Índice

VI

1. Introdução

1.1- A doença de Chagas...............................................................................................1

1.2- Aspectos da cardiopatia chagásica crônica............................................................3

1.3- As estatinas............................................................................................................6

1.4- As troponinas.........................................................................................................8

1.5- O modelo canino e suas repercussões na infecção pelo Trypanosoma cruzi.........9

2. Objetivos

2.1- Objetivo Geral.......................................................................................................11

2.2- Objetivos específicos.............................................................................................11

3. Animais, Materiais e Métodos

3.1- Descrição do modelo canino...................................................................................12

3.2- Inoculação dos animais, confirmação da infecção e avaliação da parasitemia.......12

3.3- Esquema terapêutico...............................................................................................13

3.4- Quantificação da troponina I sérica........................................................................13

3.5- Avaliação eletrocardiográfica.................................................................................14

3.6- Avaliação ecocardiográfica.....................................................................................15

3.7- Necrópsia e coleta de fragmentos cardíacos...........................................................16

3.8- Quantificação dos diferentes tipos de colágeno......................................................16

3.9- Quantificação de núcleos celulares no átrio direito................................................17

3.10- Análise estatística.................................................................................................18

4. Resultados

4.1 Curva de parasitemia dos animais infectados com T. cruzi.................................19

4.2 Quantificação da troponina I sérica.........................................................................19

4.3 Efeito da sinvastatina sobre a condução elétrica cardíaca.......................................20

4.3.1 Duração da onda P............................................................................................................20

4.3.2 Duração do intervalo P-R................................................................................................21

4.3.3 Duração de QRS..............................................................................................................22

4.3.4 Alterações eletrocardiográficas detectadas............................................. 23

4.4 Efeitos da sinvastatina sobre a função cardíaca............................................26

4.4.1 Fração de Ejeção...............................................................................................................26

4.4.2 Índice de Massa do Ventrículo Esquerdo.......................................................................26

4.4.3 Tempo de Relaxamento Isovolumétrico..........................................................................27

4.4.4 Volume do átrio esquerdo................................................................................................28

4.5 Análise quantitativa do infiltrado inflamatório e da fibrose no átrio direito...........29

4.6 Análise da área das diferentes fibras colágenas encontradas no átrio direito.........32

5. Discussão.....................................................................................................................33

6. Conclusão....................................................................................................................39

7. Referências..................................................................................................................40

Resumo

VII

Resumo

A cardiopatia chagásica (CC) sustenta-se pela presença do Trypanosoma cruzi e de seus

antígenos no tecido cardíaco e na circulação, induzindo uma complexa resposta

inflamatória ocasionando fibrose miocárdica, além de alterações estruturais e funcionais ao

órgão. Estratégias farmacológicas para amenizar a inflamação na CC e a busca de

marcadores de prognóstico clínico têm se tornado focos de investigação nas últimas

décadas. Nesse contexto, os inibidores da enzima HMG-CoA redutase (estatinas) tem se

mostrado importantes fármacos reguladores da resposta inflamatória em modelo

experimental e, em paralelo, o papel da troponina I (cTnI) na interação actina-miosina nos

músculos estriados e sua liberação na corrente sanguínea também tem sido reforçado na

relação direta com lesões irreversíveis às células miocárdicas, tornando a cTnI um

importante marcador de lesão cardíaca. Neste trabalho, avaliou-se o papel terapêutico da

Sinvastatina sobre (i) a resposta inflamatória e (ii) a função cardíaca empregando-se cães,

de ambos os sexos e sem raça definida (n=5) infectados pela cepa Y do T. cruzi. Esses

animais foram tratados com 20mg/dia de Sinvastatina durante 3 meses (fase aguda) e 6

meses (fase crônica recente) e parâmetros parasitológicos, bioquímicos (cTnI),

histopatológicos (inflamação e fibrose), eletrocardiográficos (ECG) e funcionais

(ecocardiografia) avaliados nesses respectivos tempos. Nossos dados demonstraram que a

concentração sérica de cTnI em cães infectados, na fase aguda, encontrava-se elevada

quando comparado ao grupo controle e aos animais tratados com Sinvastatina. Além disso,

a Sinvastatina foi capaz de reduzir a fibrose e o infiltrado inflamatório no tecido cardíaco

de cães infectados pelo T. cruzi, refletindo na melhoria dos parâmetros de função

ventricular. Em suma, no modelo canino, que melhor mimetiza os aspectos

fisiopatológicos e clínicos observados na doença de Chagas, a cTnI mostrou-se um bom

marcador de lesão miocárdica em fase aguda e o tratamento diário com Sinvastatina uma

promissora estratégia para estabilizar/melhorar as funções cardíacas em cães infectados

pelo T. cruzi.

Palavras chaves: Trypanosoma cruzi, troponina, Sinvastatina, inflamação, cardiopatia,

fibrose

Abstract

VIII

Abstract

The chagasic cardiomyopathy (CC) is a clinical condition sustained by the presence of

Trypanosoma cruzi and its antigens in the cardiac tissue and/or blood circulation, driven a

complex inflammatory response able to induce fibroses and alternate structural and

functional parameters in this organ. Pharmacological strategies aiming reducing

inflammation in CC and the new proposes of biochemical markers with prognosis function

have been the target of clinical investigations in the last decades. In this way, the inhibitors

of HMG-CoA redutase (statins) have been shown as promising drugs capable to interfering

in the inflammatory response in experimental models and, in parallel, the regulatory role of

cardiac troponine I (cTnI) in the interaction of actin-myosin in striated muscle and its

release in blood has also been associated with irreversible lesion to myocardial cells

become cTnI a promising marker of cardiac lesion. In this study, the therapeutic role of

Sinvastatin was evaluated on (i) the inflammatory response and (ii) the cardiac function

using male and female mongrel dogs (n=5) infected with Y strain of T. cruzi. These

animals were treated with 20mg/day of Sinvastatin during 3 (acute phase) and 6 (recent

chronic phase) months and parasitological, biochemical (cTnI), histopathological

(inflammation and fibrosis), electrical (ECG) and functional (echocardiography) evaluated

in these respective times. Our data demonstrated that serum concentrations of cTnI in

infected dogs, during acute phase, were higher in those animals non-infected and infected

under Sinvastatin treatment. Beside, Sinvastatin was able to reduce fibrosis and

inflammatory infiltration in cardiac tissue in infected dogs ameliorating the ventricular

functional parameters. In summary, using the dog model that is considered the best

adequate animal model to reflect clinical findings observed in Chagas disease, the cTnI

showed be a good marker of myocardium lesion in acute phase and, the daily treatment

with Sinvastatin a promising pharmacological strategy to stabilize/ameliorate cardiac

functions in dogs infected by T. cruzi.

Key words: Trypanosoma cruzi, troponin, Sinvastatin, inflammation, cardiopathy,

fibrose.

Lis ta de Figuras

IX

Lista de figuras

Figura 1: Curva de parasitemia..................................................................................19

Figura 2: Nível da troponina I sérica (ng/mL)...........................................................20

Figura 3: Duração da onda P (s)................................................................................21

Figura 4: Duração do intervalo PR (s).......................................................................22

Figura 5: Duração do complexo QRS (s)...................................................................23

Figura 6: Traçados eletrocardiográficos....................................................................25

Figura 7: Fração de ejeção (%)..................................................................................26

Figura 8: Índice de massa do ventrículo esquerdo (g/m2).........................................27

Figura 9: Tempo de relaxamento isovolumétrico (m/s)............................................28

Figura 10: Volume do átrio esquerdo (mL)...............................................................29

Figura 11: Análise quantitativa do infiltrado inflamatório no átrio direito.................30

Figura 12: Análise quantitativa da área de fibrose no átrio direito............................31

Figura 13: Área das fibras colágenas tipo I e III........................................................32

Figura 14: Correlações positivas................................................................................33

Lista de Tabelas

X

Lista de tabelas

Tabela 1: Tabela de alterações eletrocardiográficas qualitativas apresentadas em cães

infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados ou não com sinvastatina (20mg). Animais

não infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade. A avaliação foi

realizada no 3o e no 6

o mês após a inoculação....................................................................24

Lis ta de Siglas

XI

BAV Bloqueio átrio-ventricular

BRE Bloqueio do ramo esquerdo

BNP Peptídeo natriurético tipo B

CCC Cardiopatia Chagásica Crônica

CC Cardiopatia Chagásica

CK-MB Creatina kinase

CEUA Comitê de Ética em Pesquisa Animal

COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

CRP Proteína C-reativa

cTnI Troponina cardíaca tipo I

cTnT Troponina cardíaca tipo T

DC Débito cardíaco

DTU Discrete Typing Units

ECG Eletrocardiograma

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FPP Farnesilpirofosfato

GGPP Geranilgeranilpirofosfato

HBAE Hemi bloqueio anterior esquerdo

H&E Hematoxilina e eosina

HMG-CoA b-hidroxi-b-metil-glutaril-CoA

IC Insuficiência Cardíaca

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1

IFN-γ Interferon gama

IgA Imunoglobulina A

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

IL-10 Interleucina 10

IMVE Índice de massa do ventrículo esquerdo

LFA-1 Antígeno associado à função linfocitária 1

MPI Meses pós infecção

TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa

TnC Troponina C

TnI Troponina I

TnT Troponina T

TRIV Tempo de relaxamento isovolumétrico

VE Ventrículo esquerdo

WHO World Health Organization

Int rodução

- 1 -

1- Introdução

1.1 A doença de Chagas

A doença de Chagas é uma zoonose cujo agente etiológico é o protozoário flagelado

Trypanosoma cruzi, sendo descoberta e descrita pelo médico sanitarista brasileiro Carlos

Justiniano Ribeiro Chagas, na cidade de Lassance/MG (Chagas, 1909). No mundo há

aproximadamente 10 milhões de pessoas infectadas por este parasito com pelo menos 25

milhões de indivíduos sob risco de infecção (WHO, 2010). A transmissão do T. cruzi

ocorre, usualmente, através do contato de excretas contaminadas de vetores hemípteras

hematófagos da família Reduviidae, conhecidos popularmente como barbeiros, com a

mucosa ou pele lesionada do homem (Schofield,1994). Mas também pode ser transmitida

pelas vias oral, congênita, transfusão sanguínea, transplante de órgãos sólidos, além de

acidentes de laboratório.

A doença de Chagas apresenta fases clínicas (aguda e crônica) bem distintas. A fase

aguda inicia-se após cerca de 7 a 10 dias de incubação do parasito e, geralmente, é

manifesta-se de forma assintomática ou oligossintomática tendo como principais

características clínicas febre, apatia, edema nos membros inferiores ou na face,

hepatoesplenomegalia, infarto ganglionar generalizado e taquicardia, além da elevada

parasitemia circulante (Andrade, 1958). Esta fase também apresenta curso clínico de curta

duração e reações inflamatórias nos tecidos parasitados que são principalmente os

músculos, incluindo o músculo estriado esquelético e o músculo estriado cardíaco (Coura e

Dias, 2009).

Após a fase aguda da infecção inicia-se a fase crônica, onde a presença do parasito

circulante é escassa e não detectada por métodos de avaliação parasitológica

convencionais. Nesta fase, alguns indivíduos apresentam manifestações ou “formas

clínicas” características e enquanto outros permanecem assintomáticos por tempo

indeterminado. Essa diferença levou às subclassificações: forma crônica (i) indeterminada,

(ii) cardíaca, (iii) digestiva ou (iv) mista. A forma crônica indeterminada pode ser

encontrada em aproximadamente 60 a 70% dos indivíduos infectados, os quais apresentam

sorologia positiva para o T. cruzi, porém assintomáticos com ausência de modificações

anatômicas e fisiológicas cardíacas e digestórias (Coura, 2007).

Introdução

- 2 -

Aqueles indivíduos apresentando a forma clínica digestiva (10-15%) (Rassi Jr e cols.,

2010) apresentam alterações na secreção, na motilidade, na absorção e, nos casos mais

graves, os chamados “megaesôfago” e “megacolon”. As alterações que ocorrem nessa

forma resultam, principalmente, do comprometimento do sistema nervoso entérico, em

particular do plexo mientérico de Auerbach e Meissner (Tafuri & Brener, 1967). As células

nervosas desse plexo sofrem fenômenos degenerativos em meio ao processo inflamatório

causado pelo T. cruzi (Koeberle, 1961; Andrade & Andrade, 1966) e, como consequência,

surgem incoordenações motoras, retenção de alimentos no esôfago, hipertrofia muscular e

conseqüente dilatação muscular levando a formação dos “megas”.

Por outro lado, a forma cardíaca é reconhecida como mais grave e frequente

manifestação das formas crônicas sintomáticas da doença de Chagas (Rassi e cols., 2010).

Desenvolve-se em cerca de 20-30% dos indivíduos e normalmente leva a anormalidades do

sistema de condução que afetam a funcionalidade levando o indivíduo ao óbito, aneurismas

apicais, insuficiência cardíaca, tromboembolismo e morte súbita (Marin-Neto,1999; Rassi

Jr e cols.,2000). A cardiopatia chagásica crônica apresenta como característica principal

um caráter progressivo e fibrosante. Progressivo devido aos crescentes eventos

inflamatórios que ocorrem no coração decorrentes da presença do parasito ou de seus

elementos antigênicos. E fibrosante devido à morte de cardiomiócitos durante esse

processo inflamatório e posterior substituição do mesmo por fibras colágenas. Apesar de se

conhecer tais característica pertinentes à cardiopatia chagásica (CC), pouco se sabe sobre

os mecanismos imunopatológicos que promovem as lesões nos tecidos nessa fase da

doença. A morte súbita cardíaca é responsável por quase dois terços de todas as mortes na

doença de Chagas cardíaca, seguida de insuficiência cardíaca refratária (25% - 30%) e

tromboembolismo (10% - 15%) (Rassi Jr e cols., 2001). A morte súbita pode ocorrer

mesmo em pacientes previamente assintomáticos e é geralmente associada com taquicardia

ventricular e fibrilação ou, mais raramente, com bloqueio atrioventricular total ou

disfunção do nódulo sinusal (Rassi Jr e cols., 2012).

Introdução

- 3 -

1.2 Aspectos da cardiopatia chagásica crônica

A maioria das manifestações clínicas que ocorrem na doença de Chagas deve-se a

ação da resposta imune do hospedeiro contra a presença do parasito, como mencionado

anteriormente. A presença do T. cruzi ou de suas moléculas antigênicas, ativa a resposta

imune favorecendo o recrutamento celular para o sítio do estímulo. Esse processo é

necessário para a redução da carga parasitária no sangue e no tecido e, segundo Marinho e

colaboradores em 1999, essa carga parasitária da fase aguda parece ser essencial na

determinação do perfil da resposta imune durante a fase crônica da infecção.

A dificuldade em se detectar o parasito no miocárdio levou a formulação de teorias

auto-imunes para explicar o desenvolvimento das lesões inflamatórias miocárdicas durante

a fase crônica da doença. Tal resposta auto-imune poderia ser desencadeada por auto-

anticorpos ou por linfócitos T auto-reativos derivados de mimetismo molecular a alguns

antígenos do T. cruzi, homólogos à proteínas do coração do hospedeiro, ou mesmo pela

ativação bystander não envolvendo antígenos do parasito, sendo induzido apenas por

antígenos provenientes de lesões teciduais (Kierszenbaum, 1999; Leon e cols., 2001;

Cunha-Neto e cols.,2011).

Em contrapartida, outros trabalhos apontam para uma participação ativa do parasito

na patogênese da cardiopatia chagásica crônica. Como exemplo, temos que o T. cruzi é

frequentemente achado tanto em animais como em humanos cronicamente infectados

(Viotti e cols., 2006). Também foi comprovado a evidência da presença do parasito no

sangue por Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), mesmo quando o T. cruzi não era

encontrado ao microscópio, em animais e humanos durante a fase crônica (Gutierrez e

cols., 2009).

O mecanismo exato pelo qual o parasitismo desencadeia as lesões teciduais durante

a fase crônica não é bem estabelecido. Acredita-se que a persistência do parasito seja um

ativador da infiltração linfocitária no miocárdio, determinando graves alterações na

estrutura do coração, provocadas pela infiltração das células inflamatórias tanto nas

miofibrilas especializadas do sistema de condução quanto no miocárdio contrátil (Zhang e

Tarleton,1999). A notável plasticidade do parasito, alternando entre tripomastigotas

altamente móveis e a forma replicativa amastigota intracelular, parece desempenhar uma

papel central para assegurar a sobrevivência do T. cruzi, apesar da presença do sistema

imune (Fernandes e Andrews, 2013).

Introdução

- 4 -

A destruição progressiva das fibras cardíacas e a intensa fibrose substituindo os

cardiomiócitos lesionados levando à diminuição da massa muscular miocárdica e à

hipertrofia dos cardiomiócitos remanescentes, além da interrupção de fascículos e fibras

miocárdicos predispõem o paciente cardiopata chagásico a arritmias e à insuficiência

cardíaca (IC) (Bogliolo, 1976). O exame macroscópico do coração de pacientes que

morreram de insuficiência cardíaca secundária à doença de Chagas revela crescimento

biventricular com aneurismas apicais ocasionais e trombos murais. Histologicamente, o

tecido era caracterizado por fibrose intersticial difusa, infiltração linfocítica e miocitólise,

os quais ocorrem na ausência aparente de parasitas, no entanto foi verificado a presença do

DNA do parasito no foco inflamatório (Zhang e Tarleton, 1999). Denervação cardíaca

(principalmente parassimpática) e anormalidades na microvasculatura coronariana também

contribuem na patogênese das lesões crônicas (Marin-Neto, 2007).

A IC é frequentemente uma manifestação tardia da doença de Chagas. Esta falha é

geralmente biventricular com predomínio de falha do lado direito em estágios avançados,

com edema periférico, hepatomegalia e ascite. A IC de etiologia chagásica é associada

com maior mortalidade do que outras decorrentes de outras etiologias, como embolias

sistêmicas e pulmonares (Freitas, 2005). Devido à esse comprometimento da

funcionalidade cardíaca, observa-se sinais de déficit cardíaco e aumento da pressão

intracardíaca (Davies e cols., 2001; Tanowitz e cols., 2009). Na cardiopatia chagásica

crônica é comum a presença de lesão vorticilar ou aneurisma de ponta, que nada mais é

que o adelgaçamento e hipotrofia do miocárdio na região apical, levando a um quadro com

presença de arritmias e fenômenos tromboembólicos.

Na clínica da doença de Chagas, o eletrocardiograma (ECG) ainda é o meio mais

prático para a detecção, avaliação e acompanhamento da cardiopatia chagásica devido ao

acometimento do sistema de condução (Guimarães, 1985; Gonçalves, 2011). As alterações

ao ECG mais comuns são bloqueio de ramo direito, bloqueio fascicular anterior esquerdo,

batimentos ventriculares prematuros, mudanças ST-T, ondas Q anormais e baixa voltagem

de QRS. A combinação de bloqueio do ramo direito e bloqueio fascicular anterior

esquerdo é muito típico na doença de Chagas, como a taquicardia ventricular sustentada

que parece resultar de um circuito de reentrada intramiocárdica ou subepicárdico que

geralmente está localizado na parede inferior, póstero-lateral do ventrículo esquerdo (Rassi

Jr e cols.,1995).

Introdução

- 5 -

Já o ecocardiograma fornece dados da morfologia e dinâmica/funcionalidade

cardíaca, sendo este uma técnica não invasiva na avaliação da cardiopatia chagásica

crônica. Ela permite o reconhecimento da disfunção sistólica e diastólica do ventrículo

esquerdo, o envolvimento do ventrículo direito, disfunção de contratilidade e também os

aneurismas apicais (Biolo e cols., 2010). É uma técnica mais sensível que o ECG, uma vez

que em um estudo com 505 pacientes com ECG normal e com média de fração de ejeção

do ventrículo esquerdo de 67%, 13% apresentavam lesões segmentares e 0,8% tinham

disfunção sistólica (Acquatella., 2007). Infelizmente ainda é uma técnica de alto custo

para submeter todos os pacientes com doença de Chagas, por isso é desejável o

desenvolvimento métodos de triagem para indicar quais os pacientes que deverão ser

submetidos a essa avaliação (Biolo e cols., 2010).

A cardiopatia chagásica crônica é um problema de saúde pública e é de grande

interesse que mais estudos sejam realizados na tentativa de combatê-la. As quimioterapias

anti-T. cruzi atuais baseiam-se em nitroimidazóis ou agentes nitrofuranos como o

benzonidazol (Rochagan®, Rodanil

®, Roche

®) e o nifurtimox (Lampit

®) (Coura e de

Castro, 2002; Guedes e cols., 2006). Porém estes tratamentos ainda são insatisfatórios, pois

sua atividade antiparasitária na fase crônica é baixa (Lauria-Pires e cols., 2000). Vários

especialistas sugerem o tratamento etiológico durante a fase crônica, embora ele não

consiga exterminar o parasita, o fármaco consegue impedir a progressão clínica da doença

(Garcia e cols., 2005; Bustamante e cols., 2007). No entanto, outros estudos concluíram

que o tratamento específico falhou na prevenção da progressão da doença ou de suas

complicações (Lauria-Pires e cols., 2000; Caldas e cols., 2008)

É interessante, pois, avaliar a resposta imune como geradora das lesões cardíacas na

fase crônica considerando que o parasito pode ainda estar presente e desencadeando o

processo inflamatório que culmina nas formas crônicas sintomáticas características. Nesse

contexto algumas estratégias terapêuticas têm sido propostas ao longo dos últimos anos

com fármacos já “utilizados” na rotina clínica da cardiopatia chagásica e doenças

associadas como, por exemplo, os beta-bloqueadores, os inibidores da enzima conversora

da angiotensina, a amiodarona e as estatinas (Botoni e cols., 2007; Melo e cols., 2011).

Introdução

- 6 -

1.3 As estatinas

As estatinas são inibidores seletivos e competitivos da 3-hidroxi-3-metil-glutaril-

coenzima-A redutase (HMG-CoA redutase), responsável pela conversão da HMG-CoA a

mevalonato, que é um precursor do colesterol (Liao, 2002). Elas diminuem os níveis

plasmáticos de colesterol e lipoproteínas através da inibição da enzima HMG-CoA

redutase e da síntese de colesterol no fígado, aumentando o número de receptores de LDL

na superfície do hepatócitos, com consequente aumento da absorção e do catabolismo do

LDL.

Existe uma variada gama de estatinas e elas diferem entre si quanto à

lipossolubilidade e tempo de meia-vida, levando a diferentes potenciais de inibição da

HMG-CoA redutase (Illingworth e Tobert, 2001). Estatinas como a sinvastatina,

fluvastatina e atorvastatina são lipofílicas e capazes de penetrar passivamente nas

membranas celulares, exercendo efeito em uma grande variedade de tecidos, incluindo

células endoteliais e musculares (Manson e cols., 2005). Já a lovastatina, pravastatina e

rosuvastatina, são hidrofílicas e não atravessam passivamente a membrana celular, logo

elas atuam principalmente a nível hepático onde existe um sistema de transporte de ânions

orgânicos que permite às estatinas hidrofílicas entrarem nos hepatócitos (Manson e cols.,

2005).

Através da inibição da síntese do mevalonato, as estatinas reduzem não só a síntese

de colesterol, mas também a síntese de importantes intermediários isoprenóides como o

farnesilpirofosfato (FPP) e o geranilgeranilpirofosfato (GGPP). Estes intermediários

servem como importantes fixadores lipídicos de membrana para várias proteínas, incluindo

as subunidades-γ das proteínas G e para pequenas GTPases como Ras e Rho que são

importantes na sinalização pós traducional, crescimento e diferenciação celular. A

isoprenilação protéica facilita a ligação covalente, a localização subcelular e o tráfego

intracelular destas proteínas relacionadas à membrana e relevantes nas vias de sinalização

celular (Liao, 2005). Deste modo, a inibição da isoprenilação de FPP e GGPP resulta em

acúmulo de Rho e Ras citoplasmáticos, levando a mudanças no citoesqueleto que alteram a

estabilidade da membrana e o tráfego através da mesma. Assim, é capaz de afetar a

sinalização inter e intracelular e, por fim, a própria transcrição gênica. Aparentemente, a

inibição da isoprenilação da Rho e, conseqüentemente, a não ativação de seu alvo, a Rho-

quinase, parece ser o principal mecanismo mediador de outros efeitos colesterol-

independente observados para as estatinas (Manson, 2005). Esta ação sobre a

Introdução

- 7 -

isoprenilação de alguns compostos vem sendo chamada de efeitos pleiotrópicos das

estatinas e têm sido associados a diversos mecanismos como melhoria ou restauração da

função endotelial, aumento da estabilidade de placas ateroscleróticas, diminuição do

estresse oxidativo e inflamação, além da inibição da resposta trombogênica na parede

vascular (Liao, 2002).

Muitos estudos in vitro, em modelos animais e alguns em pacientes com doença

cardiovascular, mostraram a habilidade das estatinas de diminuir os níveis de citocinas

inflamatórias, de inibir a interação de leucócitos com as células endoteliais e de inibir a

quimiotaxia de leucócitos para tecidos inflamados (Node e cols., 2003; Mozaffarian e cols.,

2005; Tousoulis e cols., 2005; Sola e cols., 2006). Evidências indicam que citocinas

inflamatórias podem influenciar a contratilidade do coração, induzir hipertrofia do músculo

cardíaco e promover apoptose ou fibrose, contribuindo com o processo de remodelamento

do miocárdio (Sasayama e cols., 1999; Dama˚s e cols., 2001; Mann, 2002).

O processo inflamatório é considerado um dos fatores mais importantes em ambas

as fases da doença de Chagas em humanos e em modelos experimentais (Lannes-Vieira e

cols., 2009; Talvani e Teixeira, 2011). Por isso torna-se imprescindível o

desenvolvimento de pesquisas de fármacos que minimizem estes processos inflamatórios.

Como já foi explicitado, as estatinas possuem efeitos na diminuição da inflamação. Um

estudo realizado em nosso laboratório, uma dose diária de sinvastatina foi capaz de reduzir

os níveis séricos de citocinas pró- inflamatórias IFN-γ e TNF-α, mas não a regulatória IL-

10 e não houve melhora em parâmetros clínicos como fração de ejeção do ventrículo

esquerdo e diâmetro diastólico do ventrículo, em cães infectados experimentalmente com o

T. cruzi durante a fase crônica da infecção (Melo e cols., 2011). Resultados similares

foram encontrados em experimento com camundongos infectados experimentalmente com

o parasito, e foi constatado em níveis séricos e em sobrenadante de tecido cardíaco, que

citocinas inflamatórias e quimiocinas, as quais são essenciais no controle da infecção pelo

parasito e recrutamento leucocitário para o foco inflamatório, (IFN-γ, TNF-α, CCL2 e

CCL5) foram reduzidas após o tratamento diário com a sinvastatina (Silva e cols., 2012).

Uma importante estratégia para demonstrar as ações das estatinas sobre a resposta

imune é utilização de “marcadores biológicos da inflamação” ou “BIOMARCADORES”.

O National Institutes of Health Biomarkers Definitions Working Group definiu

biomarcador como uma característica objetivamente mensurável e avaliada como indicador

de um processo fisiológico, patológico ou uma resposta do organismo a uma intervenção

Introdução

- 8 -

terapêutica. Um bom biomarcador deve ter alta sensibilidade e especificidade, deve

auxiliar no diagnóstico de uma patologia de curso agudo ou crônico, deve permitir a

estratificação de risco de pacientes e a monitoração da progressão de uma patologia

(Morrow e cols., 2007). Como vimos nos estudos acima, as citocinas e quimiocinas são

amplamente empregados como marcadores ou padrões de avaliação de tratamento. Em

estudos de doenças cardiovasculares têm-se empregado diversos marcadores como:

peptídeo natriurético tipo B (BNP), que é utilizado em diagnóstico de emergência de falha

cardíaca e no prognóstico de pacientes com síndrome aguda coronariana; proteína C-

reativa (CRP), que é um importante indicador de prognóstico de risco cardiovascular e

síndrome aguda coronariana; Creatina kinase (CK-MB), que é utilizada no diagnóstico

precoce de infarte agudo do miocárdio (Tang e Kang., 2006; Qureshia e cols., 2012).

Existem também as troponinas, que são reconhecidamente empregadas na clínica médica

como marcador de degeneração cardíaca. Dessa forma, o estudo deste biomarcador

durante a infecção pelo T. cruzi seria interessante para se avaliar a ação da sinvastatina

sobre a lesão causada pela inflamação.

1.4 As troponinas

As troponinas cardíacas são biomarcadores de alta sensibilidade e especificidade

para a degeneração do miocárdio no homem e têm sido consideradas como padrão ouro de

diagnóstico e prognóstico associado a esta patologia (Antman, 2002; Sarko & Pollack,

2002). Essas proteínas contráteis (Troponinas C,I e T) formam um complexo que se liga

ao filamento de actina e medeiam a ativação e inativação, em presença de cálcio, da

contração muscular esquelética e cardíaca. A troponina C (TnC) é idêntica tanto no

músculo esquelético como cardíaco, mas os genes codificadores das troponinas I (TnI) e T

(TnT), nos diferentes músculos, são diferentes. A troponina I tem afinidade pela actina,

enquanto a troponina C tem afinidade pelos íons cálcio e a troponina T tem afinidade pela

tropomiosina (Oyama e Sisson, 2004).

As troponinas estão presentes nos músculos, entretanto são liberadas para corrente

sanguínea quando há lesão tissular e a conseqüente ruptura da fibra (O’Brien, 2006), logo a

detecção de altas concentrações de cTnI ou cTnT na circulação é visto como um indicador

específico da lesão do miocárdio e necrose (Morrow, 2001; Fishbein e cols., 2003). Esta

relação é demonstrada em cães com oclusão da artéria coronária experimental em que a

Introdução

- 9 -

concentração de cTnI na circulação é proporcional à extensão da injúria cardíaca

(Ricchiuti, 1998).

O-Brien, em 2006, demonstrou que o aumento sérico de cTnI em animais não

humanos, correlacionava-se com disfunções cardíacas, como hipertrofia ventricular,

taquicardia, contração ventricular prematura e dispnéia associada à insuficiência cardíaca.

Devido a esta associação, seria importante a proposta de avaliação da dosagem deste

biomarcador em doenças de acometimento cardíaco, como é o caso da doença de Chagas.

Em 2003, foi avaliada a concentração de troponina I em soro de pacientes positivos para o

T. cruzi sendo o valor médio para os pacientes chagásicos de 0,46ng/dl e 0.027ng/dl para,

indivíduos sadios. Os pacientes que estavam na forma cardíaca apresentaram níveis mais

altos (0,60ng/dl) em relação aos pacientes na forma indeterminada (0,25ng/dl) (Aras e

cols., 2003). Já em outro estudo, altos níveis de autoanticorpos contra troponina T foram

encontrados em pacientes na forma indeterminada e na forma cardíaca da doença de

Chagas (Nunes e cols., 2013). Nesse estudo também foi demonstrado que em pacientes

com autoanticorpos anti-troponina T a fração de ejeção estava diminuída, evidenciando

uma disfunção cardíaca.

1.5 O modelo canino e suas repercussões na infecção pelo Trypanosoma cruzi

A estreita homologia da isoforma cardíaca cTnI entre as espécies de mamíferos

permite rápida e precisa medição das concentrações de troponina em cães utilizando

imunoensaios desenvolvido para humanos (O’Brien e cols., 1997, Fredericks e cols.,

2001). Os genes da troponina I de gatos e cães foram codificados apresentando homologia

de 96% e 95%, respectivamente, em relação ao mesmo gene do homem (Rishniw e cols.,

2004). O cão tem sido apresentando como o modelo animal mais adequado para se estudar

aspectos clínicos da cardiopatia chagásica por apresentar manifestações clínicas muito

similiares àquelas observadas em seres humanos. Logo, seria interessante estudar os efeitos

da sinvastatina na cardiopatia chagásica crônica, mensurada pela troponina, no modelo cão.

O modelo cão permite o estudo da evolução natural e outros aspectos clínicos

observados na infecção pelo T. cruzi, além de ser um animal de fácil aquisição, manuseio e

manutenção (Lana e cols.,1992).

Lana e cols em 1988 encontrou em autópsia feita em cães infectados

experimentalmente pelo T. cruzi: epicardite, miocardite crônica produtiva fibrosante, com

Introdução

- 10 -

presença às vezes de granulomas periganglionite, ganglionite, perineurite e neurite, com

possível despopulação neuronal, quadro muito semelhante ao encontrado em seres

humanos infectados. Andrade e cols em 1997 observaram que alterações no

eletrocardiograma estavam presentes em 80% dos cães durante a fase aguda da infecção e

entre os animais sobreviventes foi observada a normalização do ECG, caracterizando a

forma indeterminada da doença de Chagas, bem como acontece em humanos. Guedes e

cols em 2009 mostrou que os beagles deste estudo apresentaram parasitemia, produção de

anticorpos (IgA, IgM e IgG) e alterações eletrocardiográficas, além de ter observado

miocardite crônica difusa, fibrose e produção de citocinas similares aos encontrados em

pacientes chagásicos. O cão torna-se um modelo ainda mais viável, uma vez que já foi

demonstrado que ele apresenta resposta imune à fase aguda e crônica muito similar àquela

encontrada em humanos, além de apresentar um quadro clínico e patológico semelhantes

(Laranja & Andrade, 1980; Lana e cols., 1992; Guedes e cols., 2009).

Diante do exposto, o cão se apresenta como um modelo ideal dentro dos requisitos

estabelecidos pelo Comitê de Doença de Chagas do Programa Especial de Treinamento e

Pesquisa de Doenças Parasitárias da Organização Mundial de Saúde (WHO, 1984) por:

1. Permitir o isolamento do parasito ao longo da infecção;

2. Apresentar reações sorológicas positivas indicativas da persistência da infecção;

3. Apresentar manifestações clínicas da doença de Chagas crônica;

4. Desenvolver miocardite, miosite e outras alterações patológicas que caracterizam a

doença;

5. Induzir resposta imune contra tecido do hospedeiro.

Portanto, diante de um modelo experimental que reproduza as fases da infecção

chagásica tal como no humano, podemos então, comprovar se de fato as estatinas exercem

um papel protetor ao funcionamento cardíaco nesses animais infectados pelo T. cruzi e, se

tais efeitos podem ser mensuráveis através de biomarcadores utilizados na clínica médica

como, por exemplo, a troponina estimulando, assim, estudos futuros em pacientes

chagásicos.

Objet ivos

- 11 -

2. Objetivos

2.1 Objetivo geral

Avaliar o papel da troponina I associada às alterações funcionais e histopatológicas

cardíaca em cães infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados com sinvastatina.

2.2 Objetivos específicos

(i) Avaliar a concentração da troponina I sérica como marcador de lesão

durante a fase aguda e crônica da infecção experimental pelo T. cruzi;

(ii) Avaliar o processo inflamatório cardíaco e os diferentes tipos de colágenos

de cães infectados com T. cruzi nas fases aguda e crônica, tratados ou não

com sinvastatina durante 6 meses;

(iii) Avaliar as alterações elétricas (ECG) e funcionais (ecocardiografia)

cardíacas de cães infectados com T. cruzi nas fases aguda e crônica, tratados

ou não com sinvastatina durante 6 meses;

Animais, materiais e métodos

- 12 -

3- Animais, material e métodos.

3.1 Descrição do modelo canino

Para esse estudo foram utilizados 15 cães, sem raça definida e de ambos os sexos,

mantidos no canil do Centro de Ciência Animal (CCA) da Universidade Federal de Ouro

Preto. Todos os animais foram alimentados durante o estudo com ração comercial para

cães, água ad libitum sendo os mesmos, previamente, tratados com anti-helmínticos e

vacinados contra doenças infecciosas.

A distribuição dos animais empregados nesse estudo procedeu da seguinte forma: 5

não foram infectados pelo T. cruzi (grupo controle) e os outros 10 cães foram inoculados

com a cepa Y do T. cruzi, sendo que 5 foram tratados diariamente com 20mg de

sinvastatina e os outros 5 apenas com o veículo utilizado para diluir o fármaco.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os princípios éticos de

experimentação animal, pré-estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação

Animal (COBEA) e também foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal

(CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto (número 2009/28).

3.2 Inoculação dos animais e avaliação da parasitemia

Aos quatro meses de idade, dois grupos de 5 cães foram inoculados com 2.000

formas tripomastigotas sanguíneas/Kg corporal, via intraperitoneal. Os parasitos foram

obtidos do sangue de camundongos Swiss infectados com a cepa Y do T. cruzi e mantidos

pela equipe do laboratório de doença de Chagas da UFOP no CCA da UFOP.

A partir do 1º dia de inoculação foi coletado, diariamente, 5l de sangue da veia

marginal da orelha dos cães para a confirmação da infecção e contagem dos parasitos,

através da análise microscópica do sangue à fresco. A quantificação dos parasitos foi

realizada de acordo com a técnica descrita por Brener (1962) até o 15º dia de infecção.


- 13 -

3.3 Esquema terapêutico

O tratamento com a sinvastatina foi iniciado no dia da infecção e realizado

diariamente, ao final da tarde, com comprimidos contendo 20 mg de Sinvastatina (Sanval

Ltda, S.P.), administrados individualmente por via oral. Como forma de auxiliar e

assegurar a deglutição do medicamento foi administrado água, por meio de uma seringa

concomitantemente com o comprimido. A dose foi estabelecida em função da dose

humana, empregada não para a reversão da hipercolesterolemia primária, mas para

prevenção de danos cardiovasculares (Rosendo e cols., 2007) sendo o cálculo realizado de

acordo com o peso dos animais. A biodisponibilidade do fármaco varia com o peso, mas

os animais selecionados para o estudo apresentavam medidas de comprimento e peso,

semelhantes.

3.4 Quantificação de Troponina I sérica

Para quantificação da troponina I sérica foram coletados 10 mL de sangue de cada

animal, através da veia femural. O sangue foi coletado em tubos falcon de 15mL. As

amostras foram, imediatamente após a coleta, centrifugadas a 3000rpm durante 10

minutos. O sobrenadante (soro) foi armazenado em tubos da marca eppendorf de 0,5 mL à

-80ºC para posterior análise. As coletas sanguíneas dos animais foram feitas antes da

inoculação dos parasitos, aos 3 e 6 meses de infecção.

Foram utilizados cartuchos i- STAT®

cTnI utilizando como analisador o clínico

portátil i- STAT®1. De forma geral, o cartucho de teste i- STAT

® utiliza o método de

ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) em dois locais. Os anticorpos específicos

para a troponina cardíaca I humana estão localizados num sensor eletroquímico fabricado

num chip de silicone. Em outro local do chip de silicone do sensor encontra-se também

depositado um conjugado enzimático de fosfatase alcalina/anticorpo específico de uma

porção separada da molécula de cTnI. Assim, a amostra de soro entra em contato com os

sensores, permitindo a dissolução do conjugado enzimático na amostra alvo. A cTnI na

amostra fixa-se com a fosfatase alcalina, sendo arrastada para a superfície do sensor

eletroquímico durante um período de incubação de, aproximadamente, sete minutos.

Procede-se à lavagem dos sensores para retirar a amostra, assim como o conjugado

enzimático em excesso. No fluído de lavagem encontra-se um substrato para a enzima de

fosfatase alcalina. A enzima ligada ao complexo tipo “sandwich” de

anticorpo/antígeno/anticorpo cinde o substrato liberando um produto detectável


- 14 -

eletroquimicamente. O sensor eletroquímico mede este produto enzimático que é

proporcional à concentração de cTnI presente na amostra. Para cada análise, foram

utilizados 16µL de soro. O teste apresenta resultados no intervalo de 0,00 a 50ng/mL.

Cada cartucho i- STAT®

cTnI contém uma entrada para amostras, sensores para

detectar cTnI e todos os reagentes necessários para a realização do teste. Em seguida é

apresentada uma lista dos ingredientes reativos:

Ingredientes reativos Origem biológica Composição %

Conjugado de fosfatase

alcalina/anticorpo

IgG caprina: Intestino

bovino

0,005µg

IgG IgG caprina: IgG murina 4 µg

Fosfato aminofenil de sódio N/A 700 µg

heparina Intestino porcino 0,4 IU

3.5 Avaliação eletrocardiográfica

O eletrocardiógrafo utilizado nesta avaliação foi o modelo ECG 06, ECAFIX-

FUNBEC, São Paulo- Brasil. Para este processo, os cães foram anestesiados com 0,5

mL/Kg de peso corporal do anestésico Tiopental sódico (0,03 g/mL de solução salina

0,9%) via endovenosa e foram posicionados em decúbito lateral direito, com os membros

mantidos em ângulos direitos em relação ao corpo e paralelamente um ao outro, sobre uma

superfície isolante elétrica (Ettinger & Suter, 1970).

A padronização foi de 1mV/cm e velocidade de 50mm/seg. Os eletrodos foram

adaptados em agulhas 13 x 0,38mm que foram introduzidas na pele dos animais durante o

exame. As derivações registradas foram as periféricas (DI, DII, DIII, aVL e aVF) e as

precordiais (V10, CV5RL ,CV6RL e CV6LU). As leituras e interpretações foram feitas

por um especialista que não conhecia a situação dos cães. Essas avaliações foram

realizadas antes da infecção (4 meses de idade), 3 meses pós infecção (7 meses de idade) e

6 meses pós infecção (10 meses de idade).


- 15 -

3.6 Avaliação ecocardiográfica

Os animais foram anestesiados com 0,5 mL/Kg corporal de Tiopental sódico (0,03

g/mL de solução salina 0,9%) por via endovenosa e logo após posicionados em decúbito

lateral direito, com os membros mantidos em ângulo de 90º em relação ao corpo, sobre

uma superfície isolante elétrica.

A avaliação ecodopplercardiográfica foi realizada de forma sistematizada, por um

só examinador experiente, utilizando-se aparelhagem de ecocardiografia portátil Cypress

dotada dos modos Unidimensional, Bidimensional, Doppler pulsado, contínuo,

mapeamento de fluxo em cores e adaptado para obtenção do Doppler tecidual. Utilizou-se

transdutor multifreqüencial de 3,0-3,5 MHZ, com registro eletrocardiográfico simultâneo.

Utilizou-se a técnica convencional de exame, já estabelecida na literatura (Sahn e

cols.,1978; Feingenbaum, 1994), empregando-se as diversas modalidades do exame

ecocardiográfico acima descritas. Os cortes ecocardiográficos foram realizados com o

paciente posicionado em decúbito lateral esquerdo, inicialmente na posição paraesternal,

onde foram obtidos os cortes longitudinais do ventrículo esquerdo e cortes transversais ao

nível da valva mitral e músculos papilares e, em seqüência, na posição apical, onde foram

obtidos os cortes de quatro, duas e cinco câmaras (Oh e cols., 2006).

Através da análise combinada das técnicas Unidimensional, Bidimensional e

Doppler foram avaliadas as dimensões cardíacas, a funções sistólica e diastólica ventricular

esquerda e a contratilidade global e segmentar do VE. Ao longo da sistemática do exame,

procurou-se identificar a presença de trombos, aneurismas, regurgitações valvares,

hipertensão pulmonar e alterações pericárdicas.

As medidas ao Unidimensional foram guiadas pela imagem ao Bidimensional e

realizadas no pico da onda R, identificado através do registro eletrocardiográfico

simultâneo de uma derivação. Foram seguidas as recomendações da Sociedade Americana

de ecocardiografia para obtenção das medidas ecocardiográficas. Foram mensurados os

diâmetros diastólicos da raiz de aorta, do átrio esquerdo e do ventrículo esquerdo, a

espessura diastólica do septo interventricular; a espessura diastólica da parede posterior do

ventrículo esquerdo e o diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo. A partir dessas medidas

e utilizando-se o sistema de cálculos automáticos do equipamento, foram calculados os

parâmetros ecocardiográficos de avaliação da função sistólica ventricular esquerda ao

Unidimensional fração de ejeção do ventrículo esquerdo pela fórmula de Teichholz e cols.


- 16 -

(1976) e o percentual de encurtamento sistólico. A massa ventricular esquerda foi

calculada segundo recomendações da American Society of Echocardiography.

A avaliação ao Bidimensional envolveu a mensuração dos volumes sistólico e

diastólico finais do ventrículo esquerdo nos cortes apicais de duas e quatro câmaras,

utilizando-se a fórmula de Simpson biplanar para cálculo da fração de ejeção (Wyatt e

cols., 1980). Qualitativamente, foram também avaliadas, ao Bidimensional, ao Doppler e

ao color Doppler, a morfologia e movimentação das valvas cardíacas, o grau de

regurgitação valvar, a morfologia e dimensões das câmaras cardíacas, a espessura e textura

miocárdicas. Avaliou-se, ainda, qualitativamente, a contratilidade global e segmentar das

paredes do ventrículo esquerdo utilizando-se o modelo de subdivisão do ventrículo

esquerdo em 16 segmentos, segundo proposto pela American Society of Echocardiography

nas projeções paraesternal e apical (Oh e cols., 2006), presença de trombos, aneurismas e

alterações pericárdicas. Sempre que possível obteve-se uma estimativa da pressão sistólica

em artéria pulmonar através da mensuração da velocidade máxima da regurgitação

tricúspide.

3.7 Necrópsia e coleta de fragmentos cardíacos

Os cães foram eutanasiados e, a seguir, necropsiados por um patologista

experiente, aos seis meses de infecção. Assim, o coração foi removido para análise

microscópica. Em seguida, foram feitos cortes da parede atrial direita de todos os cães. Os

fragmentos obtidos foram armazenados em formol 10% tamponado (temperatura

ambiente) para análises histopatológicas. No processo de fixação esses fragmentos são

primeiramente desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico por 30 minutos

em cada concentração (70%, 80%, 90% e 100%). Depois esses tecidos são diafanizados

em dois banhos de xilol de 10 minutos cada. E a última etapa de fixação é a inclusão em

parafina também em dois banhos de 10 minutos cada para assegurar que todo xilol foi

removido.

3.8 Quantificação dos diferentes tipos de colágeno

Para a avaliação dos diferentes tipos de colágenos presentes no átrio direito, foi

utilizada a coloração de picrosirius red, um composto aniônico que distingue a espessura e

densidade das fibras de colágeno pela coloração emitida sob a luz polarizada. Enquanto as

fibras finas dissociadas típicas do colágeno tipo III são esverdeadas, as fibras mais grossas


- 17 -

fortemente associadas do colágeno tipo I emitem cores com comprimento de ondas

maiores, como vermelho e amarelo (Kesler e cols., 2000).

A área de colágeno foi quantificada por meio da análise (analisador de imagens

Leica Qwin V3) de 20 imagens aleatórias das lâminas de fragmentos (5µm) do átrio direito.

Essas imagens foram vizualizadas na objetiva de 10x e digitalizadas através da

microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite versão 2.4.0R1).

(i) Técnica do picrosirius red

Cortes seriados dos fragmentos cardíacos de cada cão foram desparafinizados em

imersões de xilol, hidratados em soluções alcoólicas de concentrações decrescentes e

lavados em água corrente. Em seguida, os cortes foram corados pelo picrosirius red por

60 minutos, lavados em água corrente e corados pela hematoxilina por 1 minuto e 30

segundos e novamente lavados em água corrente. Após esse processo, as lâminas foram

para estufa para secagem e depois montadas com Entellan.

3.9 Quantificação de núcleos celulares no átrio direito

Os núcleos celulares foram quantificados em 20 imagens (campos) aleatórias que

foram coradas pela técnica de hematoxilina e eosina. As imagens visualizadas pela objetiva

de 40x foram digitalizadas através de microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application

Suite, versão 2.4.0R1) e processadas por meio do programa analisador de imagens Leica

Qwin V3. A miocardite foi determinada pela média do número de núcleos celulares

presentes nas imagens dos animais controles não infectados mais dois desvios padrões,

assim, os cães infectados com o T. cruzi com valores da quantificação de núcleos

celulares acima desta média foram considerados com inflamação cardíaca.

(i) Técnica de Hematoxilina & Eosina (H&E)

Para análise e quantificação do infiltrado inflamatório, fragmentos do tecido

cardíaco foram corados pela H&E. Cortes seriados da parede atrial direita de cada cão

infectado foram desparafinizados em imersões em xilol, hidratados em soluções alcoólicas

de concentrações decrescentes e lavados em água corrente e em tampão fosfato

(PBS). Em seguida, os cortes foram corados pela hematoxilina, lavados em água corrente

e diferenciados rapidamente em álcool acidulado e corados pela Eosina. Após o último


- 18 -

processo de lavagem em água corrente, foram levados até a estufa para secagem.

Posteriormente colocados em banho de xilol e, então, montadas as lâminas com auxílio de

Entellan.

3.10 Análise Estatística

Para os dados (quantificáveis) entre os grupos de animais estudados, utilizou-se o

teste não paramétrico de Kruskal-Wallis com intervalo de confiança de 95%. As análise

foram realizadas no GraphPad prism versão 5.

Resultados

- 19 -

4- Resultados

4.1 Curva de parasitemia dos animais infectados com T. cruzi

A parasitemia dos animais foi avaliada diariamente pelo exame de sangue a fresco.

Não foram observadas diferenças no o período pré-patente (3 a 4 dias) entre os grupos

infectados tratados ou não com a Sinvastatina. No entanto, observou-se (Fig. 1) que os cães

infectados sem tratamento apresentaram pico de parasitemia no 13° dia, enquanto aqueles

infectados e tratados diariamente com sinvastatina (20mg) apresentaram antecipação do

pico, sendo este no 8° dia pós infecção.

0 5 10 150

1

2

3

4

5

T.cruzi

T. cruzi + Sinvastatina

**

*

Dias pós infecção

Parasi

tos/

0.1

ml

de s

an

gu

e

(x1

03)

Figura 1: Curva de parasitemia de cães infectados com 2.000 formas tripomastigotas

sanguíneas/kg de peso da cepa Y do Trypanosoma cruzi via intraperitoneal. Os círculos

cinza representam animais infectados sem tratamento e os círculos em negrito os animais

infectados tratados com sinvastatina. * p<0.05 realizado entre os animais em cada dia da

parasitemia pelo test t-student.

4.2 Quantificação da troponina I sérica

Quanto à quantificação sérica da troponina I, observou-se elevação nos níves

séricos nos animais em fase aguda da infecção (Fig 2). O tratamento com doses diárias de

sinvastatina propiciou uma redução da produção da troponina I durante a mesma fase, em

relação ao grupo de animais infectado e não tratado (p= 0,0195).

Aos seis meses de infecção, considerada fase crônica recente, os níveis séricos

da troponina I em todos os grupos voltam ao estado basal em torno de 0,02ng/mL.

Resultados

- 20 -

0.00

0.05

0.100.2

0.3

0.4

T.cruzi T.cruzi + sinvastatinaNão infectado

Mês 0 Mês 3 Mês 6

Tro

po

nin

a I

(n

g/m

L)

*

Figura 2: Nível sérico da troponina cardíaca I determinado por cartuchos i- STAT®

cTnI e

mensurados antes e durante as fases aguda e crônica recente da infecção pelo Trypanosoma

cruzi. As cores das barras no gráfico, como indicadas, representam animais não infectados

(brancas), infectados (cinza) e infectados tratados com sinvastatina (preto), sendo o *

indicativo de diferença estatística p<0.05 em relação aos demais grupos.

4.3 Efeito da sinvastatina sobre a condução elétrica cardíaca

4.3.1 Duração da onda P

A análise comparativa da duração da onda P indica alterações atriais e,

indiretamente, sobrecarga ventricular esquerda. Na figura 3 é observada a ausência de

anormalidades na duração da onda P, bem como entre as medianas (0.03 e 0.04 segundos)

dos grupos nos diferentes tempos de infecção.

Resultados

- 21 -

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

Não infectado T.cruzi T.cruzi + sinvastatina

mês 0 mês 6mês 3

Du

ração

on

da P

(s)

Figura 3: Duração da onda P (s) em cães sem raça definida, infectados pelo Trypanosoma

cruzi e tratados com Sinvastatina (cinza escuro) ou sem tratamento (cinza claro). Animais

não infectados foram utilizados como grupo controle (branco). A avaliação foi realizada

antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6

o mês após a inoculação. Não foram encontradas

diferenças estatísticas entre os grupos p>0.05.

4.3.2 Duração do intervalo P-R

O intervalo PR reflete o tempo de condução elétrica pelo nodo átrio ventricular. Na

figura 4 observa-se que antes da infecção todos os grupos apresentavam-se semelhantes.

No entanto, durante a fase aguda houve diferença entre os grupos infectados e aquele não

infectado, não havendo diferenças associadas à sinvastatina. Durante a fase crônica esse

parâmetro permaneceu inalterado em relação ao mês 0 em todos os grupos experimentais.

Resultados

- 22 -

0.05

0.10

0.15

mês 0 mês 6mês 3

a,b

a,b

a,b

a

b a,b a,b

a,b a,b


Du

ração

iP

R (

s)

Figura 4: Duração do intervalo P-R de cães sem raça definida infectados com o

Trypanosoma cruzi. Esses animais foram tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro) com

sinvastatina (20mg) e os animais não infectados utilizados como controle encontram-se

representados pelos boxes brancos. A avaliação foi realizada antes da infecção (mês 0), no

3o e no 6

o mês após a inoculação. Letras diferentes significam diferença estatística p<0.05.

4.3.3 Duração de QRS

A duração do complexo QRS pode indicar o aumento ventricular, bloqueios dos

ramos direito e esquerdo do feixe de His, além de contrações ventriculares prematuras. Na

figura 5 observa-se que durante o mês 0 todos os animais apresentaram a duração de QRS

similares. Aqueles cães tratados com sinvastatina tiveram aumento deste parâmetro no 3º

mês em relação ao período anterior à infecção (mês 0). No mês 6 houve diferença entre os

grupos infectados e o grupo sem infecção sendo, no entanto, equivalentes aos valores

observados com a fase aguda (3 meses).

Resultados

- 23 -

0.00

0.05

0.10

0.15

a

a,d a

a

a,b,c,d

b,c,d

a

c,d

d

mês 0 mês 6mês 3


Du

ração

QR

S (

s)

Figura 5: Duração de QRS de cães sem raça definida infectados pelo Trypanosoma cruzi e

tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro) com sinvastatina (20mg). Animais não

infectados foram utilizados como controle (branco). A avaliação foi realizada antes da

infecção (mês 0), no 3o e no 6

o mês após a inoculação e letras diferentes significam

diferença estatística p<0.05.

4.3.4 Alterações eletrocardiográficas detectadas

As alterações qualitativas detectadas ao ECG nos animais infectados pelo T. cruzi e

infectados e tratados com Sinvastatina encontram-se representadas na Tabela 1. Aos 3

meses pós infecção (MPI) foram observadas alterações ao ECG em 20% dos cães

infectados pelo parasito (1/5 animais) e de 40% nos cães infectados e tratados com

sinvastatina (2/5animais). A evolução da infecção foi demonstrada pelo aumento do

número de animais que apresentaram alterações ao ECG realizado nos 6 MPI naqueles

cães infectados apenas, uma vez que aos 3 MPI apenas 1 animal apresentava alteração e

aos 6 MPI este número subiu para 3 animais. No entanto, no grupo infectado e tratado com

a Sinvastatina, o número de cães com alterações qualitativas ao ECG permaneceu

inalterado, todavia é importante salientar que houve regressão em 1 cão que aos 3 MPI

apresentava bloqueio do ramo esquerdo de 3° grau e ao final do estudos apresentava

bloqueio do ramo esquerdo de 2° grau.

Resultados

- 24 -

Tabela 1: Tabela de alterações eletrocardiográficas qualitativas apresentadas em cães

infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados ou não com sinvastatina (20mg). Animais

não infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade. A avaliação foi

realizada no 3o e no 6

o mês após a inoculação.

Infectados Infectados +

sinvastatina

Alterações de ECG Normais 3 MPI 6 MPI 3 MPI 6 MPI

BRE- 1° grau 0/5 1/5 1/5 0/5 0/5

BRE- 2° grau 0/5 0/5 0/5 0/5 1/5

BRE- 3°grau 0/5 0/5 0/5 2/5 1/5

HBAE 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5

BA-V 1° grau 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5

ECG anormal/cão 0/5 1/5 3/5 2/5 2/5

(0%) (20%) (60%) (40%) (40%)

MPI: meses pós infecção, BRE: bloqueio do ramo esquerdo, HBAE: hemi-bloqueio anterior

esquerdo, BA-V: bloqueio átrio-ventricular.

Na figura 6 estão mostrados traçados eletrocardiográficos representativos de

alterações encontradas. As figuras 6A, B e C mostram um traçado eletrocardiográfico de

cães infectados (sendo em C tratado com sinvastatina) com aumento na duração do

complexo QRS. O impulso ventricular esquerdo é retardado, de modo que o ventrículo

direito se despolariza antes, dando-se a seguir a despolarização do ventrículo esquerdo,

caracterizando bloqueio do ramo esquerdo, porém em graus diferentes (6A- 1° grau, 6B- 2°

grau e 6C- 3°grau). A figura 6D mostra um traçado eletrocardiográfico de um cão

infectado pela cepa Y com aumento do intervalo PR, caracterizando bloqueio

atrioventricular de 1°grau (BAV 1°grau).

Resultados

- 25 -

Figura 6: Traçados eletrocardiográficos obtidos de cães infectados com 2.000

tripomastigotas/kg da cepa Y do T. cruzi. (A) Bloqueio ramo esquerdo 1° grau (B)

Bloqueio ramo esquerdo 2° grau (C) Bloqueio ramo esquerdo 3° grau (D) Bloqueio átrio

ventricular 1° grau (F).

A

D

C

B

Resultados

- 26 -

4.4 Efeitos da sinvastatina sobre a função cardíaca

4.4.1 Fração de Ejeção

A medida da fração de ejeção (FE) é de grande relevância na avaliação da função

sistólica ventricular esquerda. Na Figura 7, avaliação realizada pelo método de discos de

Simpson, a FE mostrou-se inalterada ao mês 0 e também ao mês 3 entre todos os grupos

experimentais. Durante a fase crônica recente da infecção (mês 6) foi observada uma queda

nesse parâmetro nos animais infectados e naqueles infectados tratados com Sinvastatina,

mas não havendo diferenças entre esses dois grupos (p>0,05).

50

60

70

80

90


mês 0 mês 3 mês 6

Fração

de e

jeção

(%

)

aa

a a a a

bb

a,b

Figura 7: Fração de ejeção ventricular em cães sem raça infectados pelo Trypanosoma

cruzi e tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro) com sinvastatina (20mg). Animais não

infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade (branco). A avaliação foi

realizada antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6

o mês após a inoculação e letras diferentes

significam diferença estatística p<0.05.

4.4.2 Índice de Massa do Ventrículo Esquerdo

O índice de massa do ventrículo esquerdo (IMVE) reflete uma dilatação cardíaca,

possivelmente associada a um grau de hipertrofia e fibrose. Na Figura 8 podemos observar

que no mês 0 não houve diferença entre os grupos avaliados. Durante a fase aguda da

infecção (mês 3) observamos redução deste parâmetro no grupo de animais infectados, em

Resultados

- 27 -

relação ao grupo infectado tratado (p= 0,0159). Já no 6º mês, observamos novamente

ausência de diferença entre os grupos. De modo geral, o grupo infectado permaneceu sem

alterações significativas no decorrer da infecção. O grupo que recebeu tratamento com

Sinvastatina apresentou aumento deste parâmetro na transição do mês 0 para o meses 3,

não sendo encontrada diferença entre os meses 3 e 6.

0

100

200

300

T.cruzi + sinvastatinaT.cruziNão infectado

mês 0 mês 6mês 3

a,b,c

a,b,c

ba,b,c

b,c

a

a,c

a,b,c

a,b,c

índ

ice d

e m

ass

a V

E (

g/m

2)

Figura 8: Índice de massa do ventrículo esquerdo mensurado por ecocardiografia em cães

sem raça infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados (cinza escuro) ou não (cinza claro)

com sinvastatina (20mg). Animais não infectados foram utilizados como parâmetros de

normalidade (branco). A avaliação foi realizada no mês 0 (antes da infecção), no 3o e no 6

o

mês após a inoculação e letras diferentes significam diferença estatística p<0.05.

4.4.3 Tempo de Relaxamento Isovolumétrico

O tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) é uma medida obtida pela

ecocardiografia e expressa algumas alterações patológicas na função cardíaca diastólica.

Na Figura 9 observamos ausência de diferença entre todos os grupos experimentais no

decorrer dos tempos de infecção. No entanto, dentro do grupo tratado com sinvastatina

houve um aumento deste parâmetro na progressão dos animais para a fase aguda da

infecção, não havendo essa progressão durante a fase crônica recente (6 meses).

Resultados

- 28 -

40

60

80

100

120

a,b a,ba

a,b

a,b

b

a,b


a,b a,b

mês 0 mês 6mês 3

TR

IV (

m/s

)

Figura 9: Tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) mensurado por ecocardiografia

em cães infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados (cinza claro) ou não (cinza escuro)

com sinvastatina (20mg). Animais não infectados foram utilizados como parâmetros de

normalidade (branco). A avaliação foi realizada antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6

o

mês após a inoculação e letras diferentes significam diferença estatística p<0.05.

4.4.4 Volume do átrio esquerdo

A medida do Volume do Átrio Esquerdo, mais correlacionada à avaliação da

função diastólica do VE, foi realizada pelo método uniplanar de Simpson, ao final da

sístole, na projeção apical de quatro câmaras. Na Fig. 10 pode-se observar que não foram

encontradas diferenças estatísticas entre os grupos estudados em nenhum dos tempos de

infecção.

Resultados

29

5

10

15

20


mês 0 mês 3 mês 6

Vo

lum

e A

E (

mL

)

Figura 10: Volume do átrio esquerdo mensurado por ecocardiografia em cães infectados

pelo Trypanosoma cruzi e tratados (cinza claro) ou não (cinza escuro) com sinvastatina

(20mg). Animais não infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade

(branco). A avaliação foi realizada antes da infecção (mês 0), no 3o e no 6

o mês após a

inoculação. Não houve diferença estatística entre os grupos estudados.

4.5 Análise quantitativa do infiltrado inflamatório e da fibrose no átrio direito

O átrio direito é considerado a região onde a miocardite chagásica canina processa-

se com maior intensidade (Caliari e cols., 2002). Na avaliação microscópica do átrio

direito os animais infectados pelo T. cruzi sem tratamento com Sinvastatina apresentaram

maiores índices de infiltrado inflamatório do que aqueles cães infectados e tratados, como

representado através das fotomicrografias coradas com hematoxilina & eosina

apresentadas na figura 11.

De modo diferente, a área fibrose do átrio direito do grupo de animais infectados

foi maior do que a área encontrada nos animais infectados submetidos ao tratamento, como

apresentado pelas fotomicrografias da figura 12.

Resultados

30

0

100

200

300

T.cruzi + sinvastatinaT.cruzi

a

b

c

Não infectado

Nú

cle

os/7

49

31

m2

Figura 11: Sinvastatina reduz o infiltrado inflamatório no átrio direito. Representação

quantitativa de células inflamatórias no átrio direito de cães infectados e infectados

tratados com sinvastatina 20mg. Fotomicrografias de fragmentos do átrio direito de

animais não infectados (A), infectados (B) e infectados tratados (C). Coloração:

Hematoxilina & Eosina. Barra=10 micrômetros. Letras diferentes significam diferença

estatística p<0.05.

Resultados

31

0

20000

40000

60000

80000

T.cruzi T.cruzi + sinvastatinaNão infectado

a

b

bÁ

rea d

e f

ibro

se

/14

31

40

5

m2

Figura 12: Representação quantitativa de área de colágeno no átrio direito de cães

infectados e infectados tratados com sinvastatina 20mg . Fotomicrografias de fragmentos

do átrio direito de animais não infectados (D), infectados (E) e infectados tratados (F).

Coloração: picrossirius red. Barra=10 micrômetros. Letras diferentes significam diferença

estatística p<0.05.

D F E

Resultados

32

4.6 Análise da área das diferentes fibras colágenas encontradas no átrio direito

Foram encontradas três cores representativas para as fibras colágenas: (i) fibras

finas dissociadas típicas do colágeno tipo III e representadas pela cor verde, (ii) fibras mais

espessas associadas ao colágeno tipo I e emitem cores com comprimento de ondas maiores,

como vermelho e amarelo sob a luz polarizada (Kesler et al., 2000). Na figura 13 pode–se

observar que o grupo infectado apresentou maior área de colágeno tipo I e o grupo não

infectado apresentou maior área de colágeno tipo III em relação aos outros dois grupos

estudados.

0

20000

40000

60000

80000

Colágeno tipo IIIColágeno tipo I

Não infectado Infectado Infectado

tratado

Áre

a d

e c

olá

ge

no

I e

III

/14

31

40

5

m2

Figura 13: Área de fibras de colágeno presente no átrio direito de cães sem raça definida

infectados pelo Trypanosoma cruzi e tratados ou não com sinvastatina. Animais não

infectados foram utilizados como parâmetros de normalidade. A avaliação foi realizada aos

seis meses de infecção.

Discussão

33

5- Discussão

A busca por modelos experimentais para o estudo da patogênese da infecção pelo

Trypanosoma cruzi perpassa os 100 anos da primeira publicação sobre a descoberta da

doença causada pelo ainda denominado Schizotrypanum cruzi, pelo Dr. Carlos Justiniano

das Chagas em 1909 (Chagas, 1909). É considerado um bom modelo experimental aquele

capaz de reproduzir eventos clínicos/patológicos observados em indivíduos chagásicos,

além de permitir o isolamento do parasito no decorrer de toda infecção. Ainda, um bom

modelo de estudo para a infecção pelo T. cruzi deveria reproduzir as fases da doença

humana, além de algumas particularidades clínicas como a cardiopatia chagásica

fibrosante, os eventos da resposta imune e ainda ser passível de estudo de possíveis agentes

terapêuticos contra o parasito. Nesse sentido, o modelo utilizado no presente estudo, o cão,

tem sido proposto como um excelente modelo experimental por permitir a monitorização

das diferentes formas clínicas da infecção tanto aquelas presentes na fase aguda quanto

aquelas particulares da fase crônica (Andrade & Andrade, 1980; Lana e cols., 1988; Tafuri

e cols.,1988; Bahia e cols., 2002). Além disso, nosso grupo ainda demonstrou que este

modelo apresenta índices similares de cura aos observados em seres humanos em ambas as

fases da infecção (Guedes e cols., 2002).

Em consonância com o que se observa na doença de Chagas humana, a infecção

pelo T. cruzi em cães, também apresenta um substrato inflamatório decisivo para a

definição do curso clínico das manifestações cardíacas. A resposta imune aparece, nesse

caso, como essencial para a destruição do parasito, mas a responsável indireta pela

destruição celular e deposição, posterior, de colágeno e processo de fibrose no tecido

muscular cardíaco (Zhang e Tarleton, 1999). Não bastasse esse indicativo da resposta

imune conduzindo as lesões cardíacas durante a infecção pelo parasito, outras variáveis

também exercem importante papel no desenvolvimento das alterações clínicas: (i) a

genética do parasito – sabe-se que as diferentes cepas e Discrete Typing Units apresentam

tropismos diferentes e são capazes de desencadear intensidades diferenciadas da resposta

inflamatória no hospedeiro mamífero (Macedo e Pena, 1998; Guedes e cols., 2009;

Fernandes e Andrews, 2013); a genética do hospedeiro – da mesma forma que o parasito,

tem-se mostrado que a espécie animal infectada pelo T. cruzi reflete diretamente na

resposta inflamatória, na eliminação do parasito e no desenvolvimento de alterações

elétricas ou funcionais cardíacas (Andrade, 1999; Freitas e cols., 2009; Caradonna e cols.,

Discussão

34

2013); (iii) a carga parasitária – outro fator decisivo no processo de desenvolvimento das

alterações patológicas e clínicas na infecção pelo T. cruzi é o número de parasitos que

rompe as barreiras de proteção do hospedeiro e o invade. Sabe-se, por exemplo, que a

maioria dos estudos experimentais onde se trabalham com infecções variando de 102, 10

3,

104 formas tripomastigotas/hospedeiro apresenta respostas inflamatórias e danos teciduais

diferenciados (Marinho e cols., 1999; Borges e cols., 2012). Nesse sentido, o curso

fisiopatológico do hospedeiro mamífero passa a sofrer uma interferência exógena e, da

mesma forma, refletir em uma resposta clínica amenizada, exacerbada ou protetora.

Seguindo o ponto das interações farmacológicas, o presente estudo propôs avaliar,

utilizando o modelo cão, avaliar a interferência do grupo farmacológico das estatinas no

desenvolvimento inflamatório e funcional cardíacos na infecção pelo T. cruzi. As estatinas

vêm sendo alvo de diversos estudos, pois além de sua ação primária de fármaco

hipocolesterolêmico, têm também apresentado efeitos denominados pleiotrópicos, sendo

eles a melhoria da função endotelial, a diminuição da migração e proliferação das células

musculares lisas vasculares, a atenuação da remodelagem vascular e miocárdica e a

diminuição da inflamação vascular e da oxidação (Liao e Takemoto, 2001; Node e

cols.,2003; Calabro e Yeh, 2005; Laufs e Liao, 2005; Adam e Laufs, 2008, 2014). Há

alguns anos nosso grupo tem avaliado o uso de doses baixas de sinvastatina em modelo

camundongos e cães infectados pelo T. cruzi, observando nesses animais redução dos

níveis séricos de citocinas inflamatórias (IFN-γ,TNF-α) e quimiocinas (CCL2 e CCL5),

redução do processo inflamatório e na função cardíaca (Melo e cols., 2011; Silva e cols.,

2012).

No presente estudo trabalhamos com a dose de 20mg de sinvastatina/dia e com a

mesma cepa Y do T. cruzi utilizada por Melo e cols. (2011). Observou-se um pico de

parasitos circulantes no 8º dia pós-infecção, sendo maior nos animais tratados com

sinvastatina. Outros autores mostraram picos de parasitemia, com a mesma cepa do T.

cruzi, no 15º dia pós-infecção utilizando cães da raça Beagle. Neste estudo os animais não

apresentavam raça definido, reforçando a importância da genética do hospedeiro mamífero

para o curso da infecção pelo T. cruzi (Guedes e cols., 2007). Quanto ao pico mais elevado

em associação com a sinvastatina, é plausível imaginar que o tratamento com a sinvastatina

iniciada 24 horas após a infecção tenha alterado, em parte, a resposta imune desses animais

prejudicando o controle da replicação desses protozoários nos primeiros dias de infecção.

Discussão

35

Esse aspecto, se confirmado, torna-se questionável, pois uma resposta imune eficaz é

necessária para o controle do parasito, mas persistente passa a destruir as células do

próprio hospedeiro gerando os quadros clínicos conhecidos. Por essa razão, foram

avaliados três tempos distintos nesse estudo: uma fase inicial, uma fase intermediária e

uma fase final (crônica recente) em função dos diferentes parâmetros bioquímicos,

histopatológicos e clínicos desses animais infectados pelo T. cruzi.

Além do efeito direto nos parasitos circulantes, nesse estudo verificou-se, também,

que o uso diário de sinvastatina por seis meses preveniu a miocardite no átrio direito. Esse

achado histopatológico pode ser justificado pela propriedade da sinvastatina em inibir a

interação da LFA-1 (antígeno associado à função linfocitária 1), cujo papel relaciona-se

com a ativação e movimentação linfocitária, além de inibir também a molécula de adesão

intercelular-1(ICAM-1),inibindo parte do processo de recrutamento celular para os tecidos

(Pruefer e cols.,1999; Weitz-Schmidt e cols., 2001; Silveira e cols.,2013). Apesar da

redução da miocardite atrial, a sinvastatina não foi eficaz em diminuir a área de fibrose no

átrio direito. Martin e cols.(2005) mostraram, em culturas de fibroblastos humanos e de

ratos, que a atorvastatina reduzia a síntese de colágeno, a expressão RNAm do pro-

peptídeo aminoterminal do pró-colágeno tipo-1 e a expressão genética do peptídeo pró-

fibrótico do fator de crescimento do tecido conectivo. Da mesma forma, em outro estudo

avaliando hipertrofia cardíaca em ratos, o tratamento com pitavastatina reduziu a expressão

de genes hipertróficos e pró-fibróticos, além de reduzir a deposição de colágeno e da

fibrose intersticial (Saka e cols., 2006). Talvez a discordância dos nossos achados deva-se

a duas hipóteses: (i) o tipo de estatina utilizada, uma vez que diferentes enzimas estão

envolvidas no metabolismo das diferentes estatinas, levando a um único perfil de interação

droga-droga (Davignon, 2012) e (ii) o tempo de avaliação de 6 meses pós-infecção ter sido

suficiente para expressar a realidade da inflamação nesse sítio, mas insuficiente para

diferenciar o depósito de colágeno no átrio direito. Estudos anteriores em nosso grupo,

utilizando a mesma cepa do T. cruzi (cepa Y) em animais de raças distintas sob tratamento

com sinvastatina demonstrou redução no colágeno no ventrículo esquerdo após 6 meses de

infecção (Melo e cols., 2011).

Mesmo sem obter diferenças entre os grupos tratados e não tratados om

sinvastatina, optou-se por avaliar os tipos de colágeno utilizando a coloração picrossirius

red. Junqueira e cols. (1978) observaram que este tipo de coloração sob luz polarizada, as

Discussão

36

fibras colágenas mais espessas aparecem amarela ou amarela- vermelho (tipo I) enquanto

as fibras finas (tipo III) são verdes. Colágeno I e o colágeno III são componentes essenciais

do miocárdio mantendo a sua integridade estrutural e funcional. Por causa de suas

propriedades físicas diferentes, a alteração da razão colágeno I/III pode, portanto, ter um

impacto importante sobre a função diastólica e sistólica do coração. O colágeno III forma

uma rede elástica capaz de armazenar energia cinética como um elástico, enquanto o

colágeno I representa uma proteína fibrilar rígida fornecendo resistência à tração

(Pauschinger e cols., 1999). Portanto, os níveis de colágeno I poderia impor aumento na

rigidez do miocárdio (Lapiere e cols., 1977), fato observado em nosso estudo com

predominância do colágeno tipo I em todos os grupos infectados.

Com o aperfeiçoamento das estratégias para antecipar um diagnóstico e/ou realizar

o prognóstico clínico nos indivíduos chagásicos, tem havido uma redução nos índice de

óbitos entre esse grupo por receberem atenção e cuidados terapêuticos preventivos

(Gontijo e cols., 1996; Dias e Coura, 1997). Um importante marcador, utilizado na rotina

clínica, é a troponina cardíaca. As troponinas cardíacas são biomarcadores de alta

sensibilidade e especificidade para a degeneração do miocárdio em seres humanos e têm

sido consideradas como padrão ouro de diagnóstico e prognóstico associado a esta

patologia (Antman, 2002; Sarko e Pollack, 2002). Neste estudo foi observada sua elevação

sérica da troponina I em cães em fase aguda da infecção, sendo o tratamento com doses

diárias de sinvastatina capaz de preveni-la. A intensa destruição de fibras cardíacas descrita

para a fase aguda da infecção deve-se ao à acentuada miocardite, consequência da

multiplicação do T. cruzi e do infiltrado de células inflamatórias nas miofibrilas

especializadas do sistema de condução e no miocárdio contrátil. Nesses locais são

observadas áreas de destruição de fibras cardíacas parasitadas com liberação de formas

tripomastigotas, amastigotas e restos celulares, além de inúmeros fatores solúveis que são

altamente imunogênicos (Tafuri, 1979; Zhang e Tarleton, 1999). O tratamento com a

sinvastatina foi eficaz ao prevenir a destruição de cardiomiócitos durante a fase aguda da

infecção. Esta ação pode ter sido desencadeada pelos efeitos pleiotrópicos do fármaco que

estão associados com a inibição da síntese de citocinas inflamatórias, redução no

remodelamento ventricular e consequentemente redução da destruição das fibras cardíacas

(Elrod e Lefer 2005; Greer e cols., 2006; Devaraj e cols., 2007; Yeganeh e cols., 2014). No

entanto, o uso de biomarcadores inflamatórios para diagnóstico e prognóstico para a

Discussão

37

infecção pelo T. cruzi será utilizado como complemento às duas estratégias de avaliação

clínicas essenciais ao manejo do paciente chagásico: a eletrocardiografia e a

ecocardiografia.

A avaliação eletrocardiográfica é um exame de rotina e de baixo custo que nos

mostra uma variedade de anormalidades como arritmias cardíacas, alargamento e

hipertrofia de câmaras cardíacas, dentre outras (Tilley e cols., 2002; Nascimento e cols.,

2012). As alterações mais comuns encontradas ao ECG em humanos ou animais

experimentalmente infectados pelo T. cruzi são bloqueio completo do ramo direito,

bloqueio fascicular anterior esquerdo, arritmias ventriculares complexas, bloqueios átrio-

ventriculares e taquicardia sinusal (Pellegrino e cols., 1947, Laranja e cols., 1949, Lana e

cols., 1992, Rassi Jr e cols., 2009). O bloqueio do ramo esquerdo está presente em apenas 5

a 10% dos casos, mas é frequente em cardiopatias de outras etiologias (Almeida, 2004) e,

no presente estudo, foi a alteração mais encontrada (3/15 cães). Observamos, ainda,

alterações de duração do intervalo PR, que é indicativo de bloqueios no nodo átrio

ventricular, devido substituição de células cardíacas nessa região por fibras colágenas,

dificultando e tornando lento o processo de condução de estímulos nervosos por essa área.

E também foi observado um aumento no complexo QRS que é indicativo de bloqueios nos

ramos direito e esquerdo, devido a um atraso na despolarização de um dos ventrículos.

Muitos estudos clínicos e experimentais já demonstraram anormalidades ao ECG em

modelo murino e em infecção humana com aumento no intervalo PR (Postan e cols., 1987;

Garcia e cols.,2005; Williams-Blangero e cols.,2007) e na duração de QRS (Bustamante e

cols., 2002;Williams-Blangero e cols., 2007; Eickhoff e cols., 2010).

Finalmente, de acordo com o último Consenso Brasileiro em Doença de Chagas

(2005) o ecocardiograma, como mencionado anteriormente, apresenta-se como um exame

essencial para avaliação da função miocárdica, pois fornece dados da morfologia e

dinâmica/funcionalidade cardíaca e por ser um método de grande acurácia, não invasivo,

reprodutível e de fácil execução. A identificação de disfunção sistólica do ventrículo

esquerdo, correlacionada à variável fração de ejeção mensurada ao ecocardiograma, é de

extrema relevância pelo fato deste se constituir o mais forte preditor de morbidade e

mortalidade na doença de Chagas (Carrasco e cols., 1994; Viotti e cols., 2005; Nunes e

cols. 2008; Ribeiro e cols., 2008). Neste estudo, investigamos nos animais os seguintes

parâmetros: (i) a fração de ejeção para avaliar a função sistólica do ventrículo esquerdo,

Discussão

38

(ii) o índice de massa do ventrículo esquerdo para avaliação das dimensões ventriculares,

(iii) o tempo de relaxamento isovolumétrico e (iv) o volume do átrio esquerdo para se

avaliar a função diastólica VE. Bestetti e cols, em estudo com pacientes chagásicos,

definiram a presença de disfunção ventricular esquerda quando a fração de ejeção se

encontrava abaixo de 55%, o que foi evidenciado em 44 dos 74 indivíduos avaliados

(Bestetti e cols., 2011). Os animais deste estudo (infectados e infectados tratados)

mantiveram cerca de 60% de sua capacidade de ejeção, condição considerada normal para

os parâmetros funcionais cardíacos (Buckberg e cols., 2008).

Foi demonstrado, pelo nosso grupo, que a cepa Y apresenta intensa miocardite e

fibrose em cães com 24 meses de infecção, sendo mais patogênica que a cepa Berenice-78

(Guedes e cols., 2009). Outro estudo também do grupo demonstrou, em cães infectados

com a cepa Berenice-78, alterações na função cardíaca em animais infectados apenas aos

18 meses de infecção (Santos e cols., 2012). Esses dados estão de acordo com a evolução

clínica descrita para a cardiopatia chagásica – uma miocardite com processo inflamatório

clinicamente silencioso na fase aguda, mas que aumenta com o avançar da fase crônica, na

qual são evidenciados mecanismos patogênicos de hipoperfusão miocárdica contribuindo

com a característica disfunção do ventrículo esquerdo (Andrade e cols., 1997; Marin-Neto

e cols., 2007).

Em suma, nosso achados apontam para a sinvastatina como um importante alvo

terapêutico a ser melhor avaliado no modelo canino e, futuramente, em seres humanos.

Esse fármaco pode ser proposto como estratégia profilática para o remodelamento cardíaco

induzido pela infeção pelo T. cruzi, principalmente pela sinvastatina ser capaz de diminuir

a lesão cardíaca e consequentemente os níveis séricos de troponina I e minimizar algumas

alterações eletrofuncionais cardíacas. Essa proposta é apenas a ponta de um grande iceberg

considerando a complexidade da fisiopatologia da infecção pelo T.cruzi.

Conclusão

39

6- Conclusão

A sinvastatina foi eficaz em minimizar a miocardite causada pela infecção do

Trypanosoma cruzi no átrio direito, e consequentemente os níveis de troponina sérica na

fase aguda e promover regressão de um parâmetro eletrofuncional, sendo por isso,

potencial alvo de investigação terapêutica profilática na cardiopatia chagásica.

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Autora: Karolina Ribeiro Gonçalves Orientador: André ...‡ÃO... · meus exemplos, por sempre confiarem em mim, me apoiarem e me ensinarem a nunca ... BRE Bloqueio do ramo esquerdo