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AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE INDUZIDA POR PRODUTOS COSMÉTICOS
PELO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS EM CÉLULAS 3T3
Clarice Lima do Canto Abreu Mestrado Acadêmico Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Fundação Oswaldo Cruz
Orientadora: Isabella Fernandes Delgado
Rio de Janeiro
2008
ii
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE INDUZIDA POR PRODUTOS COSMÉTICOS PELO MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS EM CÉLULAS 3T3
Clarice Lima do Canto Abreu
Dissertação submetida à Comissão Examinadora composta pelo corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz e por professores convidados de outras Instituições, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre. Aprovado: ___________________________________________________________(INCQS/FIOCRUZ) Profa. Dra. Ana Cristina Martins de Almeida Nogueira ___________________________________________________________(INCQS/FIOCRUZ) Profa. Dra. Rosaura de Faria Presgrave ___________________________________________________________(UFF) Profa. Dra. Rita Leal Paixão ___________________________________________________________(INCQS/FIOCRUZ) Orientador: Profa. Dra. Isabella Fernandes Delgado
Rio de Janeiro 2008
iii
Abreu, Clarice Lima do Canto Avaliação da citotoxicidade induzida por produtos cosméticos pelo método de Quantificação de Proteínas Totais em células 3T3/Clarice Lima do Canto Abreu. Rio de Janeiro: INCQS/FIOCRUZ, 2008. xiii, 104 p., il., tab. Dissertação (Mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária, Rio de Janeiro, 2008. Orientador: Isabella Fernandes Delgado 1. Quantificação de Proteínas Totais 2. Métodos alternativos 3. Teste de citotoxicidade 4. Irritação ocular 5.Produtos cosméticos
Evaluation of cytotoxicity inducted by cosmetics products utilizing Total Protein Quantification Method with 3T3 cell lineage.
iv
Dedico este trabalho aos animais, que doaram suas vidas ao conhecimento científico. Dedico aos meus pais, presentes em todos os momentos de minha vida. Dedico aos meus familiares e amigos, que me apoiaram durante a confecção deste trabalho.
v
“Human truths, however valuable they seem, are always open to challenge, revision, to refinement, to refutation, to repeal. Only the question is eternal.”
(Andre Geurard)
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AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, que iluminou e guiou meus passos, em sua infinita sabedoria. Agradeço aos meus pais Gláucia Lima do Canto Abreu e Jair do Canto Abreu Jr, por serem meus eternos companheiros de jornada, meus eternos anjos da guarda. Obrigada por estarem ao meu lado nos momentos mais importantes de minha vida! Ao meu marido Marko Olavi Suomela, pelo companheirismo, carinho e compreensão; A minha orientadora, Dra. Isabella Fernandes Delgado, sem a qual, jamais teria chegado até aqui. Isabella, serei eternamente grata pelo apoio, incentivo, paciência e carinho de sempre; Aos meus queridos amigos de laboratório Anna Guimarães, Ana Cristina (Tininha), Isis, Letícia e Daniel Machado pela colaboração na confecção deste trabalho; Ao amigo Rodrigo Costa, pela inestimável ajuda durante a realização deste estudo e por dividir comigo, seus resultados in vitro; Aos queridos amigos Octávio e Rosaura Presgrave e Eloísa Alves, por compartilharem seus profundos conhecimentos e resultados de seus estudos sobre irritação in vivo; Ao colega Wlamir Moura pela grande ajuda na parte estatística do projeto; Aos meus queridos amigos, Cristiane Caldeira, Ludmila Bergstein e João Carlos (Profeta), pelo incentivo e apoio; A toda equipe do Departamento de Farmacologia e Toxicologia e do Departamento de Imunologia do INCQS que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste estudo; A Coordenação de Pós Graduação do INCQS, pela organização do curso de Mestrado Acadêmico em Vigilância Sanitária; A Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela colaboração financeira para a realização deste projeto.
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RESUMO
A sociedade científica mundial vem sofrendo pressão para que seja efetuada a substituição de ensaios in vivo por ensaios in vitro, sendo o teste de irritação ocular de Draize um dos testes in vivo mais fortemente combatidos pelos setores ativistas que lutam pela promoção e preservação do bem estar animal. Como a substituição do teste de Draize por metodologia alternativa se mostrou tarefa mais difícil do que se imaginava inicialmente, sobretudo devido ao grande número de desfechos que esta metodologia quantifica, as agências internacionais de validação de metodologia alternativas adotaram como conduta a busca por uma bateria de ensaios in vitro que possam servir de triagem para avaliação do potencial irritante ocular de produtos e ingredientes. Neste caso, o uso de animais só é recomendado, quando os resultados obtidos in vitro sugerem um baixo potencial irritante. Neste contexto, o presente estudo objetivou avaliar o grau de preditibilidade do método de Quantificação de Proteínas Totais (QPT) na avaliação do potencial citotóxico de tensoativos (N=6) e produtos cosméticos acabados (xampus e condicionadores, N=19). Todos os produtos avaliados no presente estudo foram previamente analisados quanto ao seu potencial irritante pela metodologia in vivo. O teste in vitro foi realizado utilizando linhagem celular proveniente de fibroblasto de embrião de camundongo (3T3) e o corante Azul Brilhante de Coomassie R-250. A avaliação do coeficiente de variação do teste de QPT em células 3T3 mostrou um valor de CV% global de 30,00%. Para a comparação entre os resultados in vivo (MEM) e in vitro (IC50) utilizamos o coeficiente de correlação de Pearson. Obtivemos o valor de -0,420 (p=0,022) para a correlação entre os métodos. A análise entre os valores de IC50 e MEM das diferentes estruturas oculares mostrou uma melhor correlação do método in vitro com lesões ocorridas na conjuntiva, do que na íris e córnea. Além disso, observou-se valores de correlação de melhor calibre para tensoativos do que para produtos acabados. Para a avaliação da preditibilidade do teste in vitro em relação ao teste in vivo, estabeleceu-se um ponto de corte (cut-off) para a diferenciação de substância irritantes (IC50<1,000 mg/ml) de não-irritantes (IC50>1,000 mg/ml) no teste in vitro. Assim, nas condições experimentais do presente estudo, a precisão do ensaio foi de 80%, a sensibilidade de 94% e a especificidade de 43%. Com base nos resultados obtidos, podemos concluir que o método de QPT, utilizando o corante Azul Brilhante de Coomasssie R-250 e linhagem celular 3T3, apresenta melhor capacidade de predizer o potencial irritante de produtos isolados (tensoativos), do que de produtos acabados (xampus e condicionadores). Embora o valor de CV% global seja considerado adequado, segundo a OMS, para ensaios conduzidos com linhagens celulares, a comparação de nossos resultados com dados da literatura demonstra que a utilização de células SIRC é mais vantajosa em termos de precisão inter-ensaio. Também em termos de sensibilidade, especificidade e precisão observamos resultados mais promissores quando da utilização de células SIRC. Concluímos ainda, que o teste proposto tem maior capacidade em predizer o efeito irritante ocorrido na conjuntiva do que nas outras estruturas oculares (íris e conjuntiva). Por fim, vale ressaltar que o método apresenta alto grau de sensibilidade e grau moderado de especificidade e sua utilização pode ser útil como teste adicional à bateria de ensaios com aplicação na avaliação de toxicidade induzida por produtos sujeitos à ação da Vigilância Sanitária.
viii
ABSTRACT
The world scientific community is under pressure to find effective ways to substitute in vivo by in vitro tests. The Draize Eye Test is one of the most disapproved in vivo tests by the animal welfare activists. Since the substitution of the Draize Eye Test by an alternative method turned out to be a more difficult issue than it was first thought, mainly due to the great number of endpoints that this assay is able to quantify, the international validation agencies for alternative methods adopted, as a conduct, the search for a set of in vitro assays, which might work as a screening for the evaluation of the ocular irritant potential of products and ingredients. The use of animals would only be recommended if the results obtained with the in vitro screening tests indicate a low irritant potential for a determined substance. In this context, the main goal of the present study was to evaluate the degree of predictability of the Total Protein Quantification Methodology (QPT) in the evaluation of the citotoxic potential of surfactants (n=6) as well as in cosmetics (shampoos and hair conditioners, n=19). All the evaluated products in this study were previously analyzed in vivo, regarding their irritant potential. The in vitro test was performed using a cellular lineage derived from embryo mouse fibroblast (3T3) and the dye Blue Brilhant of Coomassie – R 250. The evaluation of the test variation coefficient (CV%) in 3T3 cells demonstrated a global CV% of 30%. In order to compare the in vivo (MMS) results with the ones obtained in vitro (IC50), we applied the Pearson´s coefficient of correlation. The value obtained for the correlation between the two methods was –0.420 (p=0.022). The analysis of the IC50 and MMS values of the different ocular structures showed a better correlation of the in vitro method with the injuries on the conjunctive, than with the damage found on the iris or cornea in vivo. Furthermore, an enhanced correlation of the in vitro versus in vivo method was observed for surfactants, when compared to whole products. In order to evaluate the predictability of the in vitro test in regard to the in vivo method a cut-off point was established, where substances with values of IC50<1 mg/ml were determined as irritant and substances with levels of IC50 higher then 1mg/ml were considered as non-irritant. Hence, under the experimental conditions of the present study, the assay accuracy was of 80%, the sensibility was 94% and the specificity was of 43%. Based on the results obtained we conclude that the QPT method, using Dye Blue Brilliant of Comassie R-250 and the cellular lineage 3T3, shows a better ability to predict the irritant potential of isolated products (surfactants) than of entire products. Even though the global CV% value found with our in vitro method, according to WHO, is considered suitable for assays performed with cell lines, the comparison of our results with the published data shows that the SIRC cell line is more interesting once considering inter-assay accuracy. We also conclude that the proposed assay has a better capacity to predict the irritant effect on the conjunctive than on the other ocular structures. At last, it is worth pointing out that this method shows a high sensibility degree and moderate level of specificity, and the application of the QPT assay may be useful to add the screening set assays for the evaluation of toxicity induced by products under the scope of Sanitary Surveillance.
ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS 3T3 - Células de embrião de camundongo
ABIHPEC -Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos.
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATTC - American Type Tissue Collection.
BCOP – Opacidade e Permeabilidade de Córnea Bovina
BSS.CMF – Solução salina balanceada livre de cálcio e magnésio
CBB.R250 – Corante Azul Brilhante de Coomassie
CPSC - Consumer Product Safety Commission
CSHHIB - Chemical Safety and Hazard Investigation Board
CV% – Coeficiente de variação
DFT – Departamento de Farmacologia e Toxicologia
DL50 – Dose letal 50
D.O – Densidade óptica
ECVAM – European Centre for Validation of Alternative Methods
EEC –Economic European Community
e.g – exempli gratia (por exemplo)
ELISA –Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EPA - Environmental Protection Agency. Agência de Proteção Ambiental
ESAC - Scientif Advisory Commitee
FDA - Food and Drug Administration
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
FRAME – Fund for Replacement of Animals in Medical Experiments
GH – Geneticamente modificado
HET-CAM – Teste em Membrana Cório-Alantóide de Ovo Embrionado de Galinha
IC50 – Concentração inibitória50
ICCVAM - Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods
IL – Irritante Leve
IM – Irritante moderado
IMáx – Irritante máximo
IS – Irritante severo
x
ICH - International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration
of Pharmaceuticals for Human Use
ILAR – Institute for Laboratory Animal Research
INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
IRE – Isolated Rabbit Eye
JaCVAM - Japanese Center for the Validation of Alternative Methods
K-S – Teste estatístico Kolmogorov-Smirnov
LACENS - Laboratórios centrais de Saúde Pública
LDH – Enzima Lactato Desidrogenase
LLNA - Local Lymph Node Assay
L929 – Linhagem celular proveniente de fibroblasto de camundongos
MEM – Média dos escores máximos
MTT – Ensaio de captação do corante Tetrazoliun (atividade metabólica mitocondrial)
NI – Não irritante
NRU – Neutral Red Uptake – Ensaio de captação do corante Vermelho Neutro
OSHA: Occupational Safety and Health Administration
OECD: Organization for Economic Co-operation and Development
PBS – solução tampão
POP – Procedimento operacional padrão
QPT – Ensaio de Quantificação de Proteínas Totais
q.s.p – Quantidade suficiente para
RBC – Red Blood Cell Test
REBLAS - Laboratórios da Rede Brasileira de Laboratórios Analíticos em Saúde
RSPA: Research and Special Programs Administration.
SFB – Soro fetal bovino
SINITOX – Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas
SIRC – linhagem celular proveniente de córnea de coelho
ToBI – Teste de Inibição da Ligação da Toxina
WHO – World Health Organization
VSQ – Vaccine and Sera Quality –
ZEBET - Centre for Documentation and Evaluation of Alternatives to Animal Experiments
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Lista dos produtos avaliados: uso, classificação in vivo, fabricante, marca e composição 33 Tabela 2 - Classificação in vivo dos produtos acabados 49 Tabela 3 - Relação dose-resposta entre os escores (MEM) obtidos in vivo e a concentração de tensoativos aplicados nos olhos dos animais 50 Tabela 4 - Categorização do potencial irritante ocular dos tensoativos avaliados 52 Tabela 5 - ICs50 média dos produtos/tensoativos 54 Tabela 6 - Comparação dos resultados in vivo e in vitro obtidos com tensoativos 56 Tabela 7 - Precisão inter-ensaio do teste in vitro 57 Tabela 8 - Valores utilizados para o cálculo dos coeficientes de correlação de Pearson: médias aritméticas das ICs50, valor global de MEM e das estruturas oculares (MEM de córnea, íris e conjuntiva) 64 Tabela 9 - Coeficientes de correlação de Pearson relacionando os valores de IC50 com os escores das estruturas oculares dos ensaios in vivo 65 Tabela 10 - Comparação entre as classificações obtidas no ensaio in vivo e o valor médio de IC50 in vitro 67
Tabela 11 - Tabela de Contingência. 68
Tabela 12: Casos registrados de intoxicação humana por agente tóxico 71
Tabela 13: Avaliação comparativa dos CV% globais do método
de QPT com diferentes linhagens celulares. 81
Tabela 14: Avaliação comparativa da preditibilidade do método de QPT
com diferentes linhagens celulares 82
Tabela15: Avaliação comparativa dos valores de IC50 obtidos com tensoativos no presente estudo em comparação com modelos descritos na literatura 85
xii
Tabela 16: Comparação dos valores de coeficiente de correlação de
Pearson em diferentes ensaios de citotoxicidade 86
xiii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Cartazes da campanha de Henry Spira contra a realização do teste de Draize para a avaliação da segurança de produtos cosméticos 06 Figura 2 - Exemplo de bateria de métodos alternativos propostos para avaliação da irritação ocular 09 Figura 3 - Ilustração divulgada pelo FDA no ano de 1933 13 Figura 4 - Publicações da década de 1930 com registros dos agravos à saúde induzidos por produtos de uso comum, tais como medicamentos, alimentos e cosméticos 14 Figura 5 - John H. Draize, farmacologista do FDA que desenvolveu o teste de irritação ocular de Draize em 1944 15 Figura 6 - Células 3T3 27 Figura 7 - Esquema resumido do procedimento do ensaio in vitro 43 Figura 8 - Esquema da aplicação das amostras diluídas na placa de 96 poços 44 Figura 9 - Distribuição normal dos valores de MEM Global (in vivo) 60 Figura 10 - Distribuição normal dos valores de média aritmética da IC50 60
Figura 11 - Distribuição normal dos valores de MEM de córnea 61 Figura 12 - Distribuição normal dos valores de MEM de íris 61 Figura 13 - Distribuição normal dos valores de MEM de conjuntiva 62 Figura 14: Estratégia para teste de irritação ocular de novas substâncias químicas de acordo com procedimentos de países membros da Comunidade Européia. 78
xiv
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Exemplos de metodologias alternativas validadas/aceitas para fins regulatórios na Europa. 03
Quadro 2: Legislações internacionais e a preconização do teste de irritação ocular de Draize. 16 Quadro 3: Prazos estimados - segundo a Directiva 2003/15/EEC - para a proibição definitiva do uso de animais na avaliação de alguns desfechos toxicológicos comumente investigados pela indústria de cosméticos 18
Quadro 4: Principais testes alternativos usados na avaliação da toxicidade
ocular 20
Quadro 5: Registro do FDA: reclamações de consumidores quanto a reações
adversas provocadas por produtos cosméticos nos EUA, entre 1987 e 1995 73
xv
SUMÁRIO
Resumo iv
Abstract v
Lista de Siglas e abreviaturas vi
Lista de Tabelas. ix
Lista de Figuras xi
Lista de Quadros xii
I.INTRODUÇÃO
1.1 Considerações Gerais 01
1.2 Príncipio dos 3R´s 04
1.3 Exemplos de aplicações da regra dos 3R’s no controle da qualidade
de produtos sujeitos à Vigilância Sanitária 07
1.4 Da origem do Teste de Draize à proibição do uso de animais no
processo de avaliação de segurança de produtos cosméticos 09
1.5 Métodos alternativos ao Teste de irritação ocular de Draize 18
1.6 Ensaios de citotoxicidade 23
1.7 Ensaio da Quantificação de Proteínas Totais (QPT) 24
1.7.1 Células 3T3 26
1.8 Justificativa. 28
II OBJETIVOS 30
III MATERIAIS E MÉTODOS 31
3.1 Produtos acabados e tensoativos 31
3.2 Ensaio in vitro
3.2.1 Linhagem celular 37
3.2.2 Soluções 37
3.2.3 Equipamentos 39
3.2.4 Descongelamento celular 41
3.2.5 Procedimento 41
xvi
3.3 Ensaio in vivo 45
3.4 Análise Estatística 45
IV. RESULTADOS 48
4.1 Resultados in vivo 48
4.1.1 Produtos infantis 48
4.1.2 Produtos da linha adulta 48
4.1.3 Tensoativos 49
4.2 Resultados in vitro 53
4.2.1 Precisão Inter.- ensaio 56
4.3 Comparação entre os ensaios in vivo e in vitro 58
4.3.1 Coeficiente de correlação de Pearson 59
4.3.2 Grau de preditibilidade do ensaio in vitro 66
V.DISCUSSÃO 69
5.1 Toxicologia de Produtos Cosméticos 69 5.2 Avaliação integrada: combinação de testes in vitro e in vivo na avaliação do potencial irritante ocular 75 5.3 Uso de métodos alternativos na avaliação do potencial irritante de
cosméticos 79 5.4 Confronto com dados da literatura 80
VI. Conclusões 90
VII. Referências Bibliográficas 92
1
I. INTRODUÇÃO _______________________________________________
1.1 Considerações Gerais
A pressão política exercida por setores ativistas que lutam em defesa dos direitos
dos animais tem gerado grande impacto na pesquisa científica, sobretudo na área
biomédica. Neste contexto, pode-se dizer que diversos setores da indústria, e.g.
cosméticos, imunobiológicos, fármacos entre outros, assim como órgãos governamentais
de regulamentação e controle da qualidade de produtos, estão sob crescente pressão para -
sempre que possível - substituir a experimentação animal por metodologias alternativas.
Embora a comunidade científica, em sua maioria, concorde com o fato de que
metodologias in vitro podem representar uma opção promissora para a pesquisa na área
biomédica e que em algum ponto do futuro, essas alternativas podem vir a substituir um
número considerável de métodos in vivo hoje preconizados em compêndios oficiais (e.g.
métodos farmacopeicos), há de se considerar que o processo de desenvolvimento e
validação de novos métodos alternativos é laborioso e requer grande investimento de
tempo, dinheiro e pessoal capacitado. Assim alguns países, percebendo a complexidade de
tal processo, se organizaram e criaram centros de pesquisa e fomento para o
desenvolvimento e validação de metodologias alternativas ao uso de animais, como é o
caso do European Centre for Validation of Alternative Methods (ECVAM) em Ispra na
Itália, o Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods
(ICCVAM) nos EUA, o Japanese Center for the Validation of Alternative Methods
(JaCVAM) no Japão, o Fund for Replacement of Animal Medical Experiments (FRAME)
na Inglaterra e o Centre for Documentation and Evaluation of Alternatives to Animal
Experiments (ZEBET) na Alemanha, entre outros. Dentre os principais objetivos destes
centros de estudos, destacam-se: i. o desenvolvimento de novos métodos alternativos em
consonância com o princípio dos 3Rs, ii . o estabelecimento da base de dados sobre
métodos alternativos ao uso de animais, iii. o fomento de projetos de pesquisa
relacionados aos métodos alternativos e a cooperações com outras agências de fomento
nacionais e internacionais e centros de validação, iv. a coordenação de estudos inter-
2
laboratoriais de validação; e por fim, v. a promoção de fóruns de discussão sobre métodos
alternativos ao uso de animais.
Como resultado deste esforço mundial no desenvolvimento/validação de
metodologias alternativas, existe hoje um número considerável de ensaios validados e
aceitos para fins regulatórios (Quadro 1). Tais métodos são aplicáveis ao controle da
qualidade de produtos sujeitos à ação da Vigilância Sanitária e - via de regra - apresentam
boa especificidade, sensibilidade e precisão. Além disso, são considerados vantajosos
quando comparados aos ensaios in vivo que pretendem substituir. Dentre as principais
vantagens quando consideramos tais metodologias alternativas, podemos citar:
1. Questões éticas: embora a utilização de animais em experimentos científicos
ocorra há milhares de anos (RAYMUNDO & GOLDIM, 2002) e sejam
inegáveis os benefícios alcançados para o desenvolvimento da ciência e de
novas tecnologias, principalmente na área da saúde, é necessário o
comprometimento do meio científico pela busca, sempre que possível, de
modelos alternativos.
2. Maior rapidez de resposta: ensaios alternativos apresentam - em sua grande
maioria - menor duração que ensaios in vivo.
3. Maior precisão de resultados: muitos ensaios in vivo apresentam desfechos
subjetivos, que muitas vezes dependem de um treinamento criterioso dos
técnicos envolvidos na análise final dos resultados (e.g. análise qualitativa de
alterações da pele ou olho após aplicação de um determinado produto). Estes
desfechos podem ser hoje substituídos por ensaios automatizados e cuja análise
final é objetiva (e.g. quantificação de citocinas por ELISA ou estabelecimento
da IC50 - concentração inibitória 50% - em testes de citotoxicidade).
3
Quadro 1: Exemplos de metodologias alternativas validadas/aceitas para fins regulatórios
na Europa.
*: The European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare Fonte: ECVAM
Teste Desfechos Avaliados Modelo Usado Ensaio a ser
substituído Validação
Aceito para fins
regulatórios
Teste de Irritação
Dérmica
Potencial irritante de
produtos acabados ou
ingredientes
Modelos de pele reconstituída
(EPISKIN®, EPIDERM®). Análise
através de citotoxicidade (redução de
MTT)e/ou liberação de IL.
Teste de
irritação
dérmica em
coelhos
2007 Não
Teste de Pirogênio
in vitro (LAL)
Pirogênicidade
mediada por
endotoxinas de
origem bacteriana
(Gran-neg.)
Ensaio gel-clot – gelificação de
amebócito sanguíneos de carangueijo
Limullus
Teste e
Pirogênio em
coelhos
1985 Sim. Farmacopéia
(Americana)
Teste de Pirogênio
in vitro
Pirogenicidade -
pirogênios em geral
Quantificação de IL-1 ou IL-6 em sangue
total humano fresco ou criopreservado,
ou quantificação de IL-6 em linhagem
celular Mono-Mac 6 ou em células
monocíticas isoladas de sangue humano
periférico
Teste de
pirogênios em
coelhos
2006 Não
Ensaio do
Linfonodo Local
Murino
Potencial
sensibilizante de
xenobióticos
Quantificação de 3H-timidina nos
linfonodos auriculares de camundongos
tratados com substância teste
Teste de
maximização e
Buehler em
cobaias
2000 2002 (OECD test
guideline 429)
Ensaio de
Fototoxicidade
(3T3-NRU)
Potencial fototóxico
de ingredientes de
produtos
preconizados para
pele humana
(exposição a luz
solar)
Utilização de linhagem celular 3T3 e
corante Vermelho Neutro
Teste de
Fototoxicidade
in vivo (cobaias)
1998
2002 (Directiva
67/548/EEC;
Draft OECD test
guideline 432
Teste de Potência
do componente
tetânico
Potencia do
componente tetânico
presente em vacinas
de uso humano como
DTP, DT, dT e DTP
acelular e no soro
anti-tetânico
Teste in vitro de inibição de ligação da
toxina (ToBI)
Teste de
potência em
camundongos
2000
2003,
EDQM*/Farmaco
péia Européia
4
4. Menor custo: apesar dos altos custos envolvidos no processo de
desenvolvimento/validação de uma nova metodologia, pode-se dizer que, uma
vez validadas, as metodologias alternativas apresentam um custo menor do que
aquelas relacionadas à manutenção de animais e infra-estrutura de biotérios. O
cumprimento das normas internacionais de bioterismo exige cuidados especiais
com o ambiente (controle de temperatura, umidade, luminosidade, troca de ar
etc.), com os animais (freqüência de trocas, limpeza de caixas e gaiolas etc.)
bem como o treinamento e atualização dos técnicos que manipulam esses
animais (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 2003), o que eleva muito o
custo destes ensaios.
5. Maior facilidade de disseminação para outros laboratórios de saúde
pública, e.g. laboratórios centrais de Saúde Pública (LACENS), Laboratórios
da Rede Brasileira de Laboratórios Analíticos em Saúde (REBLAS) e
universidades, pois eliminam a necessidade de infra-estrutura para a criação e
manutenção de animais de experimentação.
1.2 O Princípio dos 3R’s
Em 1959, Willian Russel e Rex Burch apresentaram à comunidade científica o
livro Principles of Humane Experimental Technique, definindo os 3R’s, cuja sigla
representa “refinament”, “ reduction” e “replacement”, que significam respectivamente:
(1) refinamento: a modificação de algum procedimento operacional com animais,
objetivando minimizar a dor e/ou o estresse. A experiência da dor e do estresse tem, como
resultado, mudanças psicológicas que interferem nos resultados obtidos. Sendo assim, o
interesse dos cientistas é assegurar que as condições ambientais para os animais sejam as
melhores possíveis; (2) redução: um menor número de animais sendo utilizado para obter
a mesma qualidade de informação, ou maximização da informação obtida, utilizando-se
mesmo número de animais utilizados no teste clássico; e (3) substituição, dos testes in vivo
por testes in vitro (HENDRIKESEN et al., 1994; PRESGRAVE, 2002; CORRADO, 2007;
ANVISA, 2003).
5
Apesar da pouca atenção da comunidade científica durante a década de 1960 à
regra dos 3R`s, este conceito evoluiu como uma tendência mundial durante os anos
seguintes, iniciando uma forte pressão quanto a implicações éticas para a não utilização de
animais em pesquisas científicas e a mobilização de várias entidades e órgãos regulatórios
no árduo trabalho da validação de métodos alternativos na área biomédica.
Nas décadas de 1970 e 1980 a discussão sobre o uso de animais em pesquisa
científica tornou-se mais abrangente e madura. Estas décadas viveram a discussão de
temas, tais como: meios para reduzir tanto o número de animais de laboratório utilizados
por experimento, quanto o número de experimentos realizados; otimização das condições
que promovessem um maior bem-estar de animais em experimentação; desenvolvimento
de métodos de refinamento das técnicas convencionais, além de, sempre que possível, a
tentativa de substituir modelos in vivo por modelos in vitro.
Em 1975, o filósofo australiano Peter Singer lançou o livro intitulado Animal
Liberation (SINGER, 1975), despertando o movimento de proteção aos animais e
apontando o teste de irritação ocular de Draize (teste preditivo para a determinação da
irritabilidade oftálmica induzida por drogas, cosméticos e substâncias químicas descrito
por John Draize e colaboradores - DRAIZE et al., 1944), como um importante alvo de
combate para os ativistas (WILHELMUS, 2001; CORRADO, 2007). A partir de então, o
teste de Draize gerou muitos protestos, principalmente contra a indústria de cosméticos,
que o utilizava em grande escala. Uma grande campanha deflagrada por ativistas dos
direitos civis contra a indústria de cosméticos REVLON culminou com a publicação dos
seguintes anúncios no jornal The New York Times: “Cego pela beleza” e “Quantos coelhos
a REVLON cega em nome da beleza?” (Figura 1). Após estes protestos a REVLON
providenciou fundos para pesquisas em métodos alternativos ao uso de animais. Outras
companhias, como AVON e Bristol-Myers, seguiram o mesmo caminho e colaboram no
fomento as pesquisas afins (RAYMUNDO & GOLDIM, 2002)
Apesar da década de 1970 ter sido de amadurecimento, como dito anteriormente,
no que se refere à discussão de questões éticas em experimentação animal, a primeira
publicação oficial sobre a aplicação dos 3R´s só surgiu em meados de 1980, quando foi
6
criada na Europa a Directiva 86/906/EEC que descreve as leis que regem a proteção de
animais usados em experimentação científica (ROWAN, 1997).
Figura 1: Cartazes da campanha de Henry Spira contra a realização do teste de Draize para a avaliação da segurança de produtos cosméticos publicada pelo The New York Times na
década de 1980. Fonte: http://pages.cthome.net/pageone/commdesign.html (Acessado em 20/Fevereiro/2008)
Assim, pode-se dizer que foi somente nos anos 1980 que o interesse pela busca de
novas metodologias alternativas à utilização de animais na pesquisa científica se
consolidou. Novas legislações passaram a aderir ao conceito dos 3R´s e as pesquisas em
métodos alternativos aumentaram consideravelmente (ROWAN & ANDRUTIS, 1990;
PAIXÃO, 2001). Como resultado deste processo, pôde-se observar em alguns países uma
diminuição significativa do número de animais utilizados em pesquisa científica. Na
Alemanha, por exemplo, após a fundação do ZEBET em 1989, o número de animais de
laboratório utilizados anualmente diminuiu de 2,7 milhões em 1989 para 1,6 milhões em
1999 (SPIELMANN, 2002). Uma análise mais detalhada destes números revela que esta
diminuição foi devida - predominantemente - à redução do número de animais usados em
pesquisas relacionadas ao desenvolvimento de novos fármacos. Neste setor, a redução foi
7
de mais de 50%, i.e. de 1,4 para 0,6 milhões de animais/ano, no mesmo período de tempo
compreendido entre 1989 e 1999. Tecnologias modernas, como e.g. técnicas físico-
químicas, cultura de células, tecidos e órgãos - aliadas ao investimento financeiro da
indústria farmacêutica - permitiram a concepção de modelos mais adequados de triagem
(tanto no estabelecimento do perfil toxicológico como na avaliação de eficácia) das
moléculas candidatas ao desenvolvimento de novos fármacos. Além disso, a utilização de
ferramentas de informática, bases de dados contendo informações sobre matérias-primas, a
harmonização de diretrizes internacionais através do ICH (International Conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human
Use) contribuíram enormemente para a elaboração de bancos de informações e tornaram
possível a eliminação da duplicidade desnecessária de trabalho com animais.
Apesar de notarmos um aumento na utilização de animais na pesquisa básica a
partir do ano 2000 (e.g. desenvolvimento de animais geneticamente modificados –GM),
percebemos, a partir da mesma época, uma diminuição do número de animais utilizados
em pesquisa aplicada (e.g. análises toxicológicas), em decorrência principalmente de
benefícios oferecidos pelo governo às indústrias para a implementação da filosofia dos 3
R´s (HUDSON, 2007).
1.3 Exemplos de aplicações da regra dos 3R’s no controle da qualidade de
produtos sujeitos à Vigilância Sanitária
Além de tentar validar novos métodos, cabe a comunidade científica o bom senso
de excluir de seus compêndios oficiais metodologias obsoletas, que pouco contribuam no
fornecimento de dados relevantes para a ciência e que utilizem um grande número de
animais ou provoquem dor, angústia ou sofrimento aos mesmos. Um exemplo desta
conduta é a exclusão do método de dose letal 50% (DL50) em 2001, da Directiva
67/548/EEC e das guidelines da OECD.
Alguns métodos alternativos recentemente validados podem substituir por
completo o uso de animais (e.g. modelos de pele reconstituída para avaliação da
irritabilidade dérmica induzida por xenobióticos e testes in vitro para detecção da presença
de contaminantes pirogênicos em imunobiológicos, fármacos, parenterais de grande
volume etc). Em outras situações, a substituição plena ainda não é possível. No entanto, é
8
importante destacar que toda pesquisa na área de métodos alternativos é válida e
recomendada pelas agências de validação internacionais, havendo diversos exemplos de
estudos que geraram importantes contribuições em termos de refinamento das técnicas
e/ou redução do número de animais por desfecho toxicológico avaliado (ALVES &
COLLI, 2006).
Para alguns desfechos, embora permaneça a situação de utilização de animais de
laboratório, alcançou-se importante grau de refinamento na técnica previamente
preconizado. Como exemplo podemos citar o ensaio do linfonodo local murino (LLNA, da
sigla em inglês Local Lymph Node Assay), que é realizado em camundongos e se baseia na
resposta imune celular (i.e. na ativação e proliferação específica de linfócitos) que é
característica da fase de indução (1a fase) do processo de hipersensibilidade dérmica. Das
vantagens deste teste em relação aos seus precursores, listam-se: i. o parâmetro final
analisado é quantitativo (incorporação de 3H-timidina), ii. o teste se passa na fase de
indução, e por isso tem a duração de 5 dias, enquanto os ensaios anteriores duravam em
média 35 dias, iii . características referentes a natureza da substância, tal como cor, não
interferem com desfecho do teste, iv. o número de animais utilizados por substância-teste é
cerca de 50% menor do que nos testes mais antigos, e por fim, v. os animais são poupados
da dor e do desconforto decorrentes das reações de fase 2 (processo inflamatório)
(BASKETEER et al., 2007; BASKETEER & KIMBER, 2007).
Um outro bom exemplo da aplicação da regra dos 3R´s no laboratório de controle
da qualidade é o uso dos métodos in vitro para avaliação da potência de imunobiológicos
de uso humano. A potência dos componentes diftérico e tetânico, presentes em vacinas
como DTP, DT, dT e DTP acelular, por exemplo, é determinada a partir de um teste de
duas etapas (imunização e soroneutralização) que utiliza cobaias e/ou camundongos. A
etapa de soroneutralização é a que envolve maior número de animais, cerca de 80 a 90%
do total utilizado no ensaio. Alguns métodos alternativos foram propostos a fim de
substituir os animais utilizados na etapa de soroneutralização. Destaca-se, neste contexto,
o recém validado teste de inibição de ligação da toxina (ToBI) realizado in vitro
(ESAC/ECVAM, 2000). Assim, mesmo que permanecendo a necessidade de animais na
etapa de imunização, a implementação de ensaios in vitro para avaliação da
soroneutralização permite uma redução significativa do número de animais utilizados (i.e.
cerca de 70 animais por lote de cada produto analisado).
9
Nas circunstâncias em que o teste em animais não possa ser substituído por um
único método alternativo (o que parece hoje ser a situação para o teste de irritação ocular
de Draize), o desenvolvimento de esquema de avaliação que envolva uma bateria de testes
deve ser levado em consideração, podendo também ser desenvolvido um sistema
hierárquico no qual os animais somente sejam utilizados para a confirmação da ausência
de toxicidade, reduzindo ao máximo o risco desses animais sofrerem quaisquer efeitos
tóxicos (Figura 2). Desta forma, é de enorme relevância a busca por novas metodologias
que possam compor tal esquema de avaliação.
Figura 2: Exemplo de bateria de métodos alternativos propostos
para avaliação da irritação ocular.
Bateria de Métodos Alternativos (e.g. HET-CAM, BCOP, citotoxicidade)
Positivo Negativo
in vivo
Positivo
Negativo
10
1.4 Da origem do Teste de Draize à proibição do uso de animais no processo
de avaliação de segurança de produtos cosméticos
Até meados do século XX, mesmo em países europeus e nos Estados Unidos, não
era incomum a comercialização de uma diversidade de produtos que, além de não serem
testados quanto a sua eficácia, colocavam em risco a saúde de seus consumidores. A
necessidade de um maior controle por parte das agências regulatórias internacionais foi
tornando-se evidente, conforme denúncias sobre agravos à saúde associados à utilização
de determinados produtos foram tornando-se públicas. Foi exatamente neste contexto que
surgiu, em meados da década de 1940, o teste de irritação ocular de Draize (DRAIZE et
al., 1944).
Seguem abaixo alguns exemplos de marcos históricos relacionados à utilização
inadequada de produtos que ganharam o mercado sem antes terem sido devidamente
avaliados sob o ponto de vista toxicológico, deixando assim vítimas, como veremos a
seguir:
Elixir de Sulfanilamida:
O primeiro, ou pelo menos um dos primeiros registros, sobre o surgimento de
efeitos adversos associados ao consumo de medicamentos ocorreu no final da década de
1930, mais especificamente em 1937, em um episódio que ficou conhecido como a
Tragédia do Elixir de Sulfanilamida. O Elixir de Sulfanilamida foi considerado à época
um promissor agente anti-infeccioso, tendo sido desenvolvido principalmente para uso
pediátrico, no combate às infecções de garganta. Após a ingestão do Elixir, observou-se o
aparecimento de manifestações clínicas típicas dos quadros de falência renal aguda que,
como se sabe hoje, se deu devido ao alto teor de dietilenoglicol contido em sua formulação
(solução de sulfanilamida em uma mistura aquosa contendo 72% de dietilenoglicol). Os
sintomas incluíam náuseas, vertigens, oligúria e anorexia e levaram à morte de cerca de
105 norte-americanos, a maioria crianças. Dentre as vítimas do Elixir de Sulfanilamida,
destaca-se a morte do farmacêutico responsável pela formulação, que ao perceber a
dimensão da tragédia, suicidou-se ainda em 1937 (BALLENTINE, 1981).
11
Este trágico episódio fez com que já no ano seguinte, as autoridades americanas
competentes publicassem a primeira Lei Federal voltada para a garantia de segurança de
Alimentos, Medicamentos e Cosméticos (Food, Drug and Cosmetics Act, 1938).
Radithor:
Preconizado como terapia fortificante, o Radithor era comercializado pela Bailey
Radium Laboratories de New Jersey na década de 1930. O fabricante - na tentativa de
provar a eficácia do produto em questão - garantia que em cada frasco de Radithor havia
pelo menos 1 microcurie de Ra-226 e/ou Ra-228. Como parte da campanha publicitária, o
laboratório Bailey Radium usava frases de impacto do tipo: “terapaia absolutamente
segura, em todos os aspectos”, e desafiava o público, oferecendo U$1.000,00 a qualquer
indivíduo capaz de provar que o produto contivesse quantidade menor de Radio do que a
anunciada.
Pelo menos uma morte foi comprovadamente relacionada à terapia a base de Ra,
entre 100 indivíduos acometidos pelos efeitos adversos desta terapia, que incluíam queda
generalizada de pêlos e dentes, enfraquecimento ósseo, insuficiência renal e da medula
óssea, entre outros sintomas (MACKLIS, 1990).
Talidomida:
Foi desenvolvida pela indústria alemã Chemie Grünenthal e introduzida no
mercado europeu em meados da década de 1950 como um potente e seguro medicamento
sedativo/hipnótico, com o nome comercial de Contergan. A talidomida foi lançada
através de um marketing agressivo. Um dos motes da campanha da nova droga era: “tão
segura, que seria impossível alguém ter êxito em tentativas de suicídio com a talidomida”.
De fato, sob o ponto de vista de sua toxicidade aguda, a talidomida não representa risco
importante. No entanto, como se observou poucos anos após o início de sua
comercialização, a talidomida apresenta potente ação teratogênica, induzindo
malformações específicas, tais como focomelia e amelia quando ingerida entre a 6a e a 7a
semana de gravidez. O aumento da incidência destas graves malformações, até aquele
momento bastante raras, e que chamam à atenção logo ao nascimento, possibilitou o
12
pronto estabelecimento da relação causal entre a ingestão na talidomida no primeiro
trimestre de gestação e o nascimento de crianças malformadas. Na Alemanha e na
Austrália constatou-se de forma independente, que as mães de crianças com estas
anomalias apresentavam em comum o fato de terem feito uso da talidomida no primeiro
trimestre de gravidez. Assim, em 1961, o Contergan foi retirada do mercado. Estima-se
que ao redor do mundo a talidomida tenha feito cerca de 10.000 vítimas (TRUETA, 1962).
A lista de produtos, cuja comercialização levou a severos danos à saúde da
população em geral, não era restrita aos medicamentos. Produtos cosméticos foram
igualmente responsáveis pelo surgimento de sérios efeitos adversos, como veremos a
seguir:
Linha de cosméticos Lash Lure®:
Cosméticos da linha Lash Lure® eram aplicados em salões de beleza da época e se
apresentavam como corantes permanentes para cílios e sobrancelhas. Continham em sua
formulação parafenileno de amina, substância com alto potencial dermo-sensibilizante,
que causou severa alteração - geralmente bilateral - de córnea em mulheres que fizeram
uso destes produtos semanas após tê-los aplicado. Estima-se que os produtos da Linha
Lash Lure® tenham deixado pelo menos 12 mulheres cegas e causado a morte de uma
pessoa na década de 1930 nos EUA (WILHELMUS, 2001). O FDA divulgou o caso, com
cartazes como o ilustrado na Figura 3, alertando a população para o risco associado ao uso
do produto.
13
Figura 3: Ilustração divulgada pelo FDA no ano de 1933.
O cartaz descreve o mote da campanha do Lash Lure: “Irradie personalidade”, e afirma “esta é a versão do fabricante para os efeitos de seu produto” (com a foto de uma das vítimas do Lash Lure, uma mulher de 38 anos de Ohio, EUA, horas antes fazer uso do produto). À direita: “Totalmente cega: este foi o verdadeiro efeito de Lash Lure, em pelo menos um dos casos” (com a foto da mesma mulher com severa alteração bilateral de córnea, semanas após ter utilizado o produto).
Fonte: http://www.fda.gov/oc/history/historyoffda/section2.html (acessado em 28/Fevereiro/2008).
A lista de princípios ativos tóxicos presentes em produtos para higiene pessoal e
embelezamento era significativa. Há registros da comercialização de produtos como o
Berry’s Freck, uma pomada a base de mercúrio, o Anti-Mole, um creme anti-sinais
contendo 5% de ácido nítrico acrescido a 25% de ácido acético glacial, tônicos capilares
como Dr. Denni’s e Dewsberry a base de cloreto de cobre e hidrato de cloro, ou ainda,
xampus contendo em suas formulações substâncias hoje sabidamente carcinogênicas como
o tetracloreto de carbono (ILAR, 2004; RIORDAN, 2004; COSTA, 2006).
No final da década de 1930 eram tantos os casos de agravos à saúde e óbitos
induzidos por produtos de uso comum nos EUA, que coleções conhecidas como “The
American Chamber of Horrors: the truth about food and drugs”, organizada pela FDA –
“Food and Drug Administration”, e o best-seller americano “100.000.000 Guinea pigs:
dangers in everyday foods, drugs, and cosmetics” (Figura 4) foram publicadas com a
finalidade de alertar a opinião pública para tal fato (Calver, 1936). Estes registros
14
culminaram na publicação, do “The Federal Food, Drug, and Cosmetic Act”, uma
importante lei que pela primeira vez na história regulamentou os produtos cosméticos e
trouxe inovações para o campo de medicamentos, como por exemplo, a exigência de
comprovação de eficácia/segurança de novos produtos numa etapa prévia a
comercialização.
Figura 4: Publicações da década de 1930 com registros dos agravos à saúde induzidos por produtos de uso comum, tais como medicamentos, alimentos e
cosméticos. Fonte: http://www.fda.gov/oc/history/slideshow/Slide_158.html (acessado em
28/Fevereiro/2008)
Como mencionado anteriormente, o teste de irritação ocular de Draize surgiu
exatamente neste momento de crise do sistema de saúde pública americano, como fruto da
necessidade detectada pelos órgãos regulatórios competentes de se controlar
adequadamente aspectos relacionados à segurança de produtos cosméticos, antes mesmo,
destes ganharem o mercado consumidor (KURIAN,.1998). O teste foi desenvolvido em
1944 pelo farmacologista John H. Draize (Figura 5) do FDA e seus colaboradores, com o
propósito de se avaliar o potencial tóxico de produtos que pudessem vir a entrar em
contato com o olho humano.
15
O teste de irritação ocular de Draize foi preconizado durante muito tempo como
procedimento padrão universal para avaliação da irritação ocular e o potencial de risco de
substâncias químicas manufaturadas em vários tipos de indústrias (e.g. cosméticos,
fármacos, produtos de uso agrícola e domissanitários, entre outros), como mostra o
Quadro 2. Ao longo dos anos, desde sua criação, o teste sofreu diversas alterações.
Algumas versões modificadas do teste foram apresentadas pela comunidade científica
(DRAIZE et al., 1944; DRAIZE, 1959; KAY & CALANDRA, 1962; DASTON &
FREEBERG, 1991; CHAMBERS et al., 1993 e CHAN & HAYES, 1994) e diversos
protocolos foram objeto de discussão em fóruns técnico-científicos no mundo todo
(WILHELMUS, 2001).
Figura 5: John H. Draize, farmacologista do FDA que desenvolveu o teste de irritação ocular de Draize em 1944.
Fonte: Wilhelmus 2001
16
Quadro 2: Legislações internacionais e a preconização do teste de irritação
ocular de Draize.
Legislação/ano da
primeira versão
Agência regulatória Produto
Federal Insecticide,
Fungicide and Rodenticide
Act / 1947 e Federal
Environmental Pesticide
Control Act / 1972
EPA* Pesticidas
Federal Hazardous
Substances Act /1964 e
Toxic Substances Control
Act / 1977
EPA* Químicos de uso agrícola e
industrial
Occupational Safety and
Health Act / 1970
OSHA** Produtos que oferecem risco
ocupacional
Consumer Product Safety
Act / 1972
CPSC# Produtos de uso doméstico
Hazardous Materials
Transportation Act / 1974
RSPA## Químicos transportados
comercialmente
Clean Air Act Amendment/
1990
CSHHIB♣ Produtos que oferecem risco
ambiental
OECD Guidelines for
testing of chemicals / 2002
OECD♣♣ Substâncias químicas em
geral *EPA: Environmental Protection Agency.
** OSHA: Occupational Safety and Health Administration. # CPSC: Consumer Product Safety Commission
##RSPA: Reasearch and Special Programs Administration ♣: CSHHIB: Chemical Safety and Hazard Investigation Board
♣♣:OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development
17
Hoje, apesar das duras críticas e de existirem controvérsias quanto à validade de
seus resultados, o teste de irritação ocular de Draize permanece preconizado em diretrizes
internacionais para avaliação de segurança de substâncias químicas (OECD, 2002) e é o
único teste aceito pela entidade regulatória brasileira, i.e. ANVISA, para a avaliação do
efeito irritante ocular de produtos sujeitos à ação da Vigilância Sanitária.
Na questão específica do controle da qualidade de cosméticos, esta situação gera
um importante impasse, que dificulta enormemente a exportação de nossos produtos para
outros países. Isto porque, enquanto o Brasil exige a comprovação de segurança de
cosméticos através de testes in vivo, a Europa já proíbe desde 2004 a comercialização de
produtos acabados testados em animais e estabelece novos prazos de proibição do uso de
animais na avaliação de segurança de ingredientes isolados (e.g. tensoativos) utilizados
em cosméticos em países membros da Comunidade Econômica Européia (DIRECTIVA
2003/15/EEC), conforme demonstrado no Quadro 3.
18
Quadro 3: Prazos estimados - segundo a Directiva 2003/15/EEC - para a proibição
definitiva do uso de animais na avaliação de alguns desfechos toxicológicos comumente
investigados pela indústria de cosméticos.
Prazos estimados Desfechos toxicológicos
Proibição definitiva do uso de animais
Proibição definitiva da comercialização de produtos testados por ensaio in vivo
Validação final de ensaios alternativos ao uso de animais
Substituição plena do uso de animais na CEE
Corrosividade cutânea
2009 2009 Já validado B40 Anexo V Directiva 67/548/EEC, e TG430 e TG 431 da OECD
Efeitos tóxicos induzidos pela UV: fototoxicidade aguda
2009 2009 Já validado B41 Anexo V Directiva 67/548/EEC, e TG432 da OECD
Absorção/penetração Dérmica
2009 2009 Já validado
(2005)
TG428 da OECD
Irritação Dérmica
2009 2009 Já validado
(2007)
2008
Irritação Ocular
2009 2009 2008 2009
Fonte: Commission Staff Working Document (Commission of the European Communities), Brussels, 2004
1.5 Métodos alternativos ao Teste de irritação ocular de Draize
Embora o teste de irritação ocular de Draize cause grande desconforto e sofrimento
aos animais e tenha sido, por esta razão, um dos primeiros testes usados para fins
regulatórios pelo qual se procurou abordagens alternativas (PRESGRAVE, 2002), ele
permanece na condição de ensaio cujas alternativas ainda não foram plenamente validadas
(Quadro 3). Muitos métodos válidos vêm sendo pesquisados (Quadro 4), entre eles: 1.
19
HET-CAM - membrana cório-alantóide de ovo embrionado de galinha (LUPKE et al.,
1985); 2. células 3T3 com NRU - captação de vermelho neutro (VIAN et al., 1995) e
MTT – captação de MTT ou ensaio da atividade metabólica mitocondrial (CHIBA et al.,
1999); 3. RBC - red blood cell assay (PAPE et al., 1999); 4. BCOP - opacidade e
permeabilidade de córnea de bovinos (BURDICK et al., 2002); 5. ICE - olho de galinha
isolado (BURTON et al., 1981); e 6. IRE - olho de coelho isolado (De TORRES et al.,
1997).
Através deste conjunto de métodos in vitro agrupam-se informações que oferecem
subsídios para garantir a segurança do produto ao nível ocular. Como há mais de um
mecanismo indutor de irritação ocular, apenas um ensaio in vitro não é suficiente para uma
completa avaliação. O ideal é obtermos dados relacionados à vascularização (e.g. HET-
CAM), opacidade/permeabilização (e.g. BCOP) e citotoxicidade (e.g. MTT, RBC).
É importante ressaltar que vários destes testes vêem sendo utilizados na avaliação
do risco irritativo de ingredientes isolados. Entretanto, como nenhum deles está
plenamente validado até o presente momento, os modelos citados acima só podem ser
contemplados como modelos experimentais de “triagem”, ou seja, de caráter preliminar.
20
Quadro 4: Principais testes alternativos usados na avaliação da toxicidade ocular.
BCOP – Opacidade e permeabilidade de Córnea Bovina. ÓRGÃO
ISOLADO ICE – Olho Isolado de Galinha – Avalia edema corneal, opacidade
corneal e retenção de fluoresceína.
NRU – mede a atividade de retenção do corante vermelho neutro
pelos lisossomos de células viáveis ( e.g. SIRC e 3T3).
MTT – avalia a metabolização de sais de tetrazolium por mitocôndrias de células
viáveis ( e.g. SIRC e 3T3).
AGAROSE DIFFUSION METHOD – realizado em células L929 e avalia a
morte celular.
FLUORESCEIN LEAKAGE - realizado em células MDCK (rins de cão) e avalia
injúrias causadas às junções celulares.
CULTURA DE
CÉLULAS
EPIOCULAR – epitélio ocular humano reconstituído – avalia a viabilidade celular,
liberação de mediadores inflamatórios e permeabilidade celular.
HET-CAM – teste realizado em membrana cório-alantóide de ovo embrionado de
galinha. Avalia danos na membrana cório-alantóide. OVO
EMBRIONADO CAM – TBS – OVO DE GALINHA – método quantitativo com corante Azul de Tripan.
Avalia danos na membrana cório-alantóide. Hiperemia, Hemorragia e Coagulação.
SANGUE DE
MAMÍFEROS
RBC – teste de hemólise – utiliza amostras de sangue bovino.Avalia danos causados à
membrana citoplasmática em combinação com danos às proteínas celulares
(desnaturação).
21
A seguir, serão apresentadas breves informações sobre os ensaios mais
freqüentemente utilizados para a avaliação in vitro da toxicidade ocular (e.g. na avaliação
do potencial irritante de xampus, sabonetes líquidos e outros produtos de higiene pessoal,
além da avaliação de ingredientes isolados).
HET-CAM (membrana corio-alantóide de ovo embrionado de galinha)
O objetivo do ensaio HET-CAM é avaliar semi-quantitativamente o potencial
irritante de um produto (produtos solúveis, emulsões, géis e óleos), sobre a membrana
cório-alantóide de ovo embrionado de galinha, no décimo dia de incubação. O ensaio é
baseado na observação dos efeitos irritantes durante 5 minutos após a aplicação do
produto, puro ou diluído, sobre a membrana cório-alantóide. A avaliação final é feita a
partir de uma escala que considera cada fenômeno observado (hiperemia, hemorragia e
coagulação) em função do seu tempo de aparecimento (LIEBSCH & SPIELMANN,
2002).
O método apresenta praticidade de execução, demonstra boa sensibilidade e não
requer recursos financeiros altos (LUEPKE, 1985). Porém, como desvantagem, o método
não apresenta boa predição do potencial irritante ocular para produtos opacos ou coloridos,
pois dificulta a visualização dos efeitos hemodinâmicos ocorridos na membrana cório-
alantóide (VINARDELL & MITJANS, 2006)
RBC - Red Blood Cell System
Este ensaio permite quantificar os efeitos adversos de ingredientes isolados e de
produtos acabados sobre a membrana plasmática das hemácias e a conseqüente liberação
da hemoglobina (hemólise) e ainda, o índice de desnaturação da hemoglobina, avaliado
através de sua forma oxidada, ambos quantificados por espectrofotometria. A relação entre
a hemólise e oxidação da hemoglobina fornece um parâmetro de caracterização dos efeitos
dessas substâncias in vitro (ALVES, 2003).
22
O teste RBC vem se mostrando bastante útil na avaliação do potencial irritante de
tensoativos, gerando resultados confiáveis e reprodutíveis em estudos intra e inter
laboratoriais (PAPE et al., 1999; MEHLING et al., 2007)
BCOP (Opacidade e Permeabilidade de córnea bovina)
O objetivo do ensaio é avaliar quantitativamente o potencial irritante de um
produto ou de uma substância química após aplicação sobre a córnea isolada de bezerro. O
ensaio é baseado na medida da opacidade e da permeabilidade da córnea após o contato
com o produto-teste.
A medida da opacificação da córnea é realizada com o auxílio de um opacitômetro,
aparelho que determina a transmissão do fluxo luminoso através da córnea a ser avaliada e
fixando um valor numérico de opacidade. Já a medida da permeabilidade da córnea é
realizada em função do tempo de contato do produto com o olho, após adição de
fluoresceína. A densidade óptica é medida em 490nm. Obtém-se uma escala que considera
os fenômenos observados (ANVISA, 2003)
O teste é rápido, apresenta boa predição do grau de irritação ocular de uma grande
variedade de substâncias e se mostra como uma alternativa confiável ao método in vivo
(teste de irritação ocular de Draize) (PRICE & ANDREWS, 1985).
Citotoxicidade pela difusão em gel de agarose
Indicado para emulsões e géis com fase contínua aquosa. Aplica-se os produtos à
superfície de um gel de agarose em contato com células de tecido conjuntivo de
camundongo da linhagem NCTC – clone L929 (ATCC CCL1) onde, a citotoxicidade é
avaliada com a ajuda de um corante vital, o MTT ou o NRU, observando-se o diâmetro
médio do halo de lise celular revelado pela coloração. O halo reflete a citotoxicidade de
um produto testado e a sua capacidade em se difundir no gel de agarose (ANVISA, 2003).
23
Citotoxicidade pelo método MTT
Utiliza-se cultura de células, como e.g. a SIRC (linhagem celular derivada da
córnea do coelho) ou outras, adicionadas do corante vital MTT [ou 3-(4,5 dimethyl
thiazole-2yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide]. Este método mede a atividade
mitocondrial das células viáveis em metabolizar sais de tetrazolium. O parâmetro final de
avaliação é o estabelecimento da IC50 (i.e. a concentração da substância-teste que inibe
50% do crescimento celular). Não aplicável a produtos insolúveis em água (ANVISA,
2003).
Citotoxicidade pela método NRU
Assim como no método de citotoxicidade com MTT, neste ensaio utiliza-se cultura
de células adicionada de um corante vital, i.e. o NR (ou seja, o corante vermelho neutro).
O método mede a atividade de retenção do corante pelos lisossomas das células viáveis. A
captação do NR pelas células viáveis é quantificada por espectrofotometria, através de um
leitor automático de microplacas. O parâmetro final de avaliação também é o
estabelecimento da IC50 (i.e. concentração da substância-teste que inibe 50% do
crescimento celular). Este método é empregado para todo tipo de formulação, exceto
aquelas que possuam propriedades fixadoras, como as formulações alcoólicas (ANVISA,
2003), pois a avaliação da acurácia de álcoois, ácidos fortes e substâncias alcalinas fica
dificultada (TANI et al., 1999).
1.6 Ensaios de citotoxicidade
Os ensaios de citotoxicidade têm sido os métodos in vitro mais estudados como
possíveis alternativas ao teste de irritação ocular de Draize (VIAN et al., 1995; GUILLOT,
1992; RENZI et al., 1993; EUN & SUH, 2000; LAGARTO et al., 2005).
Sabe-se que linhagens celulares quando mantidas em cultura dividem-se e
multiplicam-se continuamente. A base dos ensaios de citotoxicidade está exatamente na
avaliação da interferência induzida por agentes químicos (e.g. tensoativos) nos processos
24
metabólicos celulares e na investigação a respeito da maneira em que esses processos
podem vir a intervir no crescimento/multiplicação celular, ou até mesmo culminar na
morte celular, reduzindo, assim o número de células viáveis se comparado com culturas
controles não-tratadas. Estes ensaios tendem a simplificar os eventos quantificados,
contudo, por serem métodos simples, de baixo custo e reprodutíveis são extensamente
empregados em processos de triagem (FRESHNEY, 1994).
Os testes realizados para a medição da viabilidade celular e integridade da
membrana citoplasmática (como o NRU, o MTT, o teste de liberação de enzimas
citoplasmáticas como a lactato desidrogenase (LDH) ou RBC) têm apresentado uma boa
correlação com o potencial de irritação ocular in vivo (YANG & ACOSTA, 1994; EUN &
SUH., 2000, VIAN et al., 1995; SPIELMANN, 1996; RENZI et al., 1993; GEURTSEN,
1998, DICKSON, 1993; COSTA, 2006; DEBBASCH et al, 2005; HARBELL et al.,
1997). Dentre os desfechos que fornecem informações sobre diferentes funções celulares,
aqueles que utilizam estimativas quantitativas sobre funções metabólicas (como e.g. o
NRU e MTT) são os mais usados. Apesar destes ensaios apresentarem vantagens como
precisão e serem sujeitos a automação, eles são extremamente dependentes de possíveis
alterações fisiológicas celulares, como alterações nas atividades lisossomal (NRU) e
mitocondrial (MTT). Estes parâmetros são dependentes das condições da cultura celular,
que podem ser modificados por aspectos como densidade celular e secreção celular.
Conseqüentemente, somente células crescendo em condições similares podem ser
comparadas por estes métodos (MARGIS & BOROJEVICH, 1989).
1.7 Ensaio da Quantificação de Proteínas Totais (QPT)
A metodologia do teste de quantificação de proteínas totais foi descrita em 1986
por Knox e colaboradores. Desde aquela época até os dias de hoje, a metodologia vem
sendo refinada e modificada para a utilização de placa com 96 orifícios (CLOTHIER,
1995), além da utilização de esquema de lavagem automatizado de microplacas,
conferindo uma maior rapidez e praticidade durante o ensaio (COSTA, 2006).
O método avalia a taxa de crescimento celular através da determinação
colorimétrica da quantificação de proteínas totais contidas em cultura celular (SHOPSIS &
25
ENG, 1985 E VIAN et al., 1995). Assim, o ensaio tem como desfecho final a avaliação do
efeito de uma determinada substância sobre o crescimento/proliferação celular, ou seja, o
grau de inibição do crescimento celular provocado pela substância em questão fornece um
indicativo de sua toxicidade (KNOX et al., 1986; CLOTHIER, 1995).
Apesar de apresentar algumas limitações (i. quantifica as células indiretamente, ou
seja, de forma relativa à quantidade de proteínas totais e ii. os resultados obtidos são
dependentes do tipo celular utilizado (EUN & SUH, 2000); este teste é considerado
rápido, sensível, reprodutível, possui simplicidade de execução, custo relativamente baixo,
requer reagentes com baixa toxicidade, é sujeito a automação e não é tão dependente das
modificações fisiológicas celulares como os ensaios de viabilidade através da avaliação do
metabolismo celular (SHOPSIS, 1985; KNOX et al., 1986; MARGIS & BOROJEVICH,
1989).
Este método baseia-se na adsorção, eluição e medição de densidade ótica (D.O.) do
corante Azul Brilhante de Coomassie (CBB-R250) que cora as proteínas celulares. Há
uma relação linear entre o teor de proteínas totais dosadas e o número de células existente
na cultura. Os tensoativos existentes na composição dos xampus e condicionadores
apresentam ação citolítica sobre a cultura celular. A quantificação do teor de proteínas
totais,é realizada após a lavagem das placas e a fixação das células que permaneceram
vivas e aderidas após o contato com a substância-teste. Esta metodologia apresenta ainda a
vantagem da possibilidade de se estocar as placas para um processamento posterior, além
da possibilidade da realização de repetições do ensaio utilizando as mesmas microplacas.
Assim sendo, o método indireto pode ser usado nas mais diversas metodologias,
onde a quantificação celular é requerida (MARGIS & BOROJEVICH, 1989). Portanto, é
possível utilizá-lo na avaliação da citotoxicidade de compostos, avaliando diferentes
doses, produtos e tratamentos aos quais a monocamada celular for submetida. Além disso,
o método possibilita o uso de microplacas de 96 cavidades, permitindo a avaliação
simultânea de um maior número de diluições e a utilização de lavadores e leitores
automáticos de microplacas, agilizando o processo metodológico (SHOPSIS, 1985;
RENZI et al., 1993). Por todas as razões citadas acima, este foi o método de escolha para o
presente estudo.
26
1.7.1 Células 3T3
As células 3T3 (Figura 6) são provenientes de uma linhagem celular estabelecida
em 1962 por dois cientistas - George Todaro e Howard Green - do Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de Nova York. Todaro e Green
obtiveram as células 3T3 de tecido de embrião de camundongo suíço albino (TODARO &
GREEN, 1963).A designação “3T3” se refere ao fato de que esta linhagem celular cresceu
originalmente em uma concentração de 3 x 105 células por cm² (primeiro “3”), com um
intervalo de transferência (“T”) de 3 dias (segundo “3”).
Na década de 1950, Dulbelco e Vogt publicaram importantes artigos (GREEN,
2006) demonstrando que fibroblastos recentemente retirados de animais e cultivados por
curtos períodos de tempo poderiam ser transformados pela infecção por poliomavírus.
Porém, o pesquisador Howerd Green na tentativa de reprodução dos resultados obtidos por
Dulbelco e Vogt, encontrou dificuldades na utilização de culturas primárias ou secundárias
de fibroblastos, pelo fato de serem estas, culturas bastante heterogênias, o que dificultava a
reprodutibilidade do ensaio. Dessa forma, ficava clara a necessidade do desenvolvimento
de culturas celulares mais homogêneas, pois somente uma linhagem celular imortalizada
(estabelecida) capaz de realizar propagação indefinida se prestaria de forma adequada à
reprodutibilidade destes ensaios (GREEN, 2006).
27
Figura 6: Células 3T3
Fonte: www.answers.com/topic/3t3-cells - acessado em 07/03/2008
Muitas linhagens celulares foram testadas, porém nenhuma apresentava as
características desejadas (GREEN, 2006). Assim, como mencionado anteriormente, na
década de 1960, George Todaro e Howard Green iniciaram seus trabalhos cultivando
fibroblasto embrionado de camundongo, com o objetivo de estabelecer uma linhagem
celular imortalizada que atendesse adequadamente às necessidades da pesquisa de
transformação celular ocasionada pelo poliomavírus. Assim, percebeu-se que
diferentemente da linhagem celular proveniente de fibroblastos humanos, a linhagem
celular de fibroblastos proveniente de embrião de camundongo possui uma maior
capacidade de se manter estável, mesmo em um alto número de passagens (TODARO &
GREEN, 1963)
A 3T3 foi escolhida para o presente estudo por apresentar facilidade de obtenção,
manutenção e manipulação, além do fato de que esta possui a capacidade de se manter
estável mesmo após muitas passagens, o que facilita o trabalho, nos fornecendo resultados
mais confiáveis. Além disso, esta linhagem celular é largamente utilizada em outros
28
ensaios de avaliação da citotoxicidade (GEURTSEN, et al., 1998; SPILEMANN, et al.,
1996; DICKSON, 1996; WILLSHAW et al., 1994; COSTA, 2006; VIAN et al., 1995;
KNOX et al., 1986; CLOTHIER et al., 1988; CLOTHIER et al., 1992; CLOTHIER et al.,
2006 ) induzida por produtos e ingredientes de cosméticos (e.g. MTT e NRU), o que
permite a comparação dos resultados obtidos no presente estudo com os descritos na
literatura.
1.8 Justificativa
O ensaio de QPT apresenta características importantes, como rapidez, simplicidade
de execução, baixo custo, alto grau de automação; além de não ser tão dependente das
modificações fisiológicas celulares como outros ensaios de viabilidade através da
avaliação do metabolismo celular (MARGIS & BOROJEVICH, 1989; KNOX et al., 1986;
SHOPSIS & ENG, 1985). Vale ressaltar que o método proposto requer reagentes de baixa
toxicidade, e.g. o corante azul brilhante de comassie, que é sabidamente menos tóxico que
os corantes NR e MTT. Além disso, resultados recentes obtidos pelo nosso grupo
demonstraram que o ensaio de QPT em células SIRC apresenta resultados promissores,
quando comparados aos resultados obtidos pelo teste de irritação ocular de Draize
(COSTA, 2006).
Acreditamos ser importante avaliar de forma consistente a aplicabilidade do ensaio
de QPT em outra linhagem celular (3T3), investigando o potencial deste ensaio como
método in vitro para a avaliação do potencial irritante ocular de produtos sujeitos a ação da
Vigilância Sanitária. Os estudos existentes sobre o ensaio proposto, utilizando a mesma
linhagem celular (3T3) e o mesmo corante (azul brilhante de Coomassie) (e.g VIAN et al.,
1995; CLOTHIER et al., 1988; CLOTHIER et al., 2006) avaliam somente ingredientes
isolados (i.e. tensoativos). Pretendemos, com nossa investigação, avaliar tensoativos e
produtos acabados (i.e. xampus e condicionadores), onde se concentram as análises
realizadas pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS).
Assim, o presente trabalho se propõe a contribuir com uma maior compreensão da
aplicabilidade deste método de citotoxicidade, utilizando nova linhagen celular, através da
quantificação de proteínas celulares totais na avaliação do potencial de irritação ocular de
29
tensoativos, xampus e condicionadores, como mais uma possível alternativa ao teste de
irritação ocular de Draize.
30
II. OBJETIVOS ______________________________________________________ Objetivo Geral: Avaliar os efeitos citotóxicos produzidos por tensoativos e produtos acabados
(xampus e condicionadores) pelo ensaio QPT utilizando o corante Azul Brilhante de
Comassie R-250 em células 3T3; comparando os resultados obtidos nesse ensaio com
aqueles obtidos no teste de irritação ocular de Draize
Objetivos Específicos:
• Avaliar a correlação existente entre achados macroscópicos em cada uma das
estruturas oculares (córnea, íris e conjuntiva) estudadas no teste de irritação ocular
de Draize e os resultados obtidos no ensaio QPT.
• Estabelecer um ponto de corte (cut-off) para a diferenciação de substâncias
irritantes e não-irritantes e avaliar parâmetros como precisão, sensibilidade e
especificidade do ensaio proposto em comparação com o teste de irritação ocular
de Draize.
• Comparar os resultados finais do ensaio de QPT em células 3T3 com resultados
previamente obtidos em nosso laboratório com células SIRC, correlacionando-os
com os dados obtidos in vivo pelo teste de irritação ocular de Draize (banco de
dados do Departamento de Farmacologia e Toxicologia – DFT do INCQS).
31
III. MATERIAIS E MÉTODOS _____________________________________________________
3.1 Produtos acabados e tensoativos
Os produtos acabados e tensoativos do presente estudo foram selecionados de
modo a atender a dois critérios: i. produtos previamente analisados no teste in vivo1, e ii.
contemplar todas as cinco categorias de classificações possíveis (i.e. NI: Não Irritante,
IL: Irritante Leve, IM: Irritante Moderado, IS: Irritante Severo e IMax: Irritante
Máximo) no teste de Draize (Tabela 1).
Foram avaliados tensoativos, xampus e condicionadores, de uso adulto e infantil,
de marcas e formulações idênticas aos produtos testados anteriormente pela equipe do
DFT no ensaio in vivo e no teste in vitro utilizando células SIRC (COSTA, 2006).
Os xampus infantis (N = 6), xampus de uso adulto (N = 6), condicionadores de uso
infantil (N = 5) e condicionadores de uso adulto (N = 2) foram adquiridos em
estabelecimentos comercias no município do Rio de Janeiro no ano de 2006.
1 Cabe ressaltar que todo o procedimento in vivo havia sido conduzido previamente
pela equipe do Departamento de Farmacologia e Toxicologia (DFT) do INCQS. Assim, os resultados do teste de irritação ocular de Draize provêm de um banco de dados em software Microsoft Excel pertencente ao DFT.
32
Com relação aos fabricantes, podemos dizer que foram avaliados produtos
acabados de 12 diferentes laboratórios, que receberam códigos conforme descrito na
Tabela 1. No caso dos F1, F2, F3 e F4 avaliamos mais de uma marca produzida pelo
mesmo fabricante. Assim, nossos produtos foram codificados, de modo a expressar o
código do fabricante (F1 a F12) e a marca (M1, M2, M3 e M4).
Alguns exemplos que seguem abaixo ilustram o procedimento adotado para criar
os códigos do presente estudo:
F1M1: O produto é proveniente do fabricante 1, sendo da marca 1 (a primeira
marca testada proveniente do fabricante 1);
F1M2: O produto é proveniente do fabricante 1, sendo da marca 2 (a segunda
marca testada proveniente do mesmo fabricante 1);
F4M2: O produto é proveniente do fabricante 4, sendo da marca 2 (a segunda marca testada proveniente do mesmo fabricante 4);
F4M4: O produto é proveniente do fabricante 4, sendo da marca 4 (a quarta marca testada proveniente do mesmo fabricante 4).
33
Tabela 1: Lista dos produtos avaliados: uso, classificação in vivo, fabricante, marca e composição.
N° Produto Classifi-cação in vivo
Lote Fabricante Código Final
Composição
1 Xampu Infantil
NI 10099
94 F1 F1M1
Aqua, PEG-150, pentaerythril tetrastearate, dissodium laureth sulfosuccinate, laurete sulfate, sodium lauroyl sarcosinate, sodium cocoamphoacetate, PEG-80 sorbitan laurate, avena sativa, kernel extract, parfu, dazolidynil, urea, iodopropynyl butylcarebamate, citric acid,tetrasodium EDTA
2 Xampu Infantil
MI B304 F2
F2M1
Água, lauril éter sulfato de sódio, lauril-éter-8 sulfato de sódio, lauril éter sulfato de magnésio, lauril éter-8 sulfato de magnésio, oleiléter sufato de magnésio, cocoanfodiacetato dissódico, palmato de glicerila hidrogenado etoxilado (200 OE), cocato de glicerila etoxilado (30 OE) CI 14700, CI 14005, metilparabeno sódico, DMDM hidrontoína, cocoato, de glicerila etoxilado (7 OE), poliquatérni-10, ricinoleamido, olamida, sufoccinato dissódico edeato dissódico, fragrância, hexileno glicol, ácido tartárico
3 Xampu Infantil
LI 0437B01
F3 F3M1
Água, cocoamidopropil betaína, PEG-80, laurat de sorbitano, tridecil éter sulfato de sódio, distearato de PEG-150, fragrância, poliquatérnio 10,ácido cítrico, EDTA tetrassódico, quatérnio 15, corante amarelo DeC n°10(cl47005) e corante laranja DeC n° 4(cl 15510)
4
Xampu Infantil
MI
50703
F4 F4M1
Lauril sulfato de sódio/lauriléter sulfossuccinato dissódico, cocoamidopropilabeaína, laurilglicosídio, cocoamida DEA, cocoato de glicerina PEG-7, edeato dissódico, benzofenona-4, fenoxietanol/metil etil propil e butil parabenos, CL 16185, tretolamina, cloreto de sódio, extrato de calêndula, extrato de aloe Vera, água deionizada.
34
[Continuação da Tabela 1]
N° Produto Classifi-cação in vivo
Lote Fabricante Marca/ Código Final
Composição
5 Xampu Infantil
MI 60403 F4 F4M2
Edetato dissódico, benzofenona-4,2-bromo-2-2nitropropano-1, 3-diol, metilparabeno,lauriléter sulfato de sódio/lauril sulfossuccinato dissódico, cocoamidopropilbetaína, lauril glicosídio,cocoamida DEA, fragrância, propilparabeno, cocoanato de glicerina PEG-7, Cl 16255, trietanolamina, cloreto de sódio, água deionizada, pró milk
6 Xampu infantil
SI 3/10B F5 F5M1
Água, lauril sulfato de sódio, lauret sulfosuccnato dosódico, cocoamidopropil betaína, DEA cocamida, dioleato de PEG –120 Metilglucosa, perfume, cloruro de sódio, EDTA tetrasódico, trietanolamina, poloxámero 124,formaldeído. Metilcloroisotiazolinona, amarillo ácido 23 (CL 19140)
7 Cond. Infantil
N I 100088032
F3 F3M2
Cloreto de distearildimônio, álcool estearílico, laurato deorbitano PEG-80, hidroetilcelulose, álcool benzílico, EDTA tetrassódico, fragrância, ácido cítrico, corante amarelo DeC n°10 ( cl 47005), corante laranja DeC n°4 (cl015510) e água
8 Cond. Infant.
NI 60502 F4 F4M3
Detato dissódico, cloreto de estrealcônio, propilenoglicol,metilparabeno, propilparabeno,álcool cetoestearílico, cetearet 20, éter dicaprílico, trietanolamina, CI 19140 CI 16255, fragrância, água deionizada, pró-milk
9 Cond. Infantil
NI 60101 F4 F4M4
Metilparabeno, propilparabeno,álcool cetostearílico, cetearet-20,éter dicaprílico, edeato dissódico, cloreto estearalonio, trietolamina, CI 74160, ciclometicona/dimeticona,extrato de aloe Vera, extrato de calêndula,fragrância e água deionizada
10
Cond. Infant.
LI
0602
F6 F6M1
Álcool cetoestearílico, cloreto de cetiltrimetilamônio, cocoamidopropil betaína, dimeticona,mistura de isotiazolonas, extrato de calêndula, ácido cítrico, fragrância, CI 42090, água
35
[Continuação da Tabela 1]
N° Produt
o
Classifi-cação in vivo
Lote Fabricante Código Final
Composição
11 Cond. Infant.
NI 10047
07 F1 F1M2
EDTA tetrassódico, ácido cítrico,anidro, álcool ceto estearílico etoxilado, diazolidinil uréia e iodopropinil butilcarbamato, metosulfato de betrimônio e álcool cetoestearílico, MÊS-acetomida, extrato natural de aveia, dimeticonol, essência e água desmineralizada.
12 Xampu Adulto
MI
6144259804
F7 F7M1
Água, lauril éter sulfato de amônio, lauril sulfato de amônio, cloreto de sódio, cocamida MEA, perfume, citrato de sódio, EDTA dissódico, ácido cítrico, poliquatérnio-10, pantenol, éter pantenil etílico, xilenosulfonato de amônio, metilcloroisotiazolina, metilisotiazolina
13 Xampu Adulto
MI 50548
1 F8 F8M1
Água, lauril éter sulfato de sódio, cocoamidopropilbetaína, aquilpoliglicosídeo, alcanolamida do ácido graxo de coco, poliquatérnio 55, EDTA tetrassódico, quatérnio 70, mistura de extratos hidrogicólicos de acerola,maracujá, guaraná e uva associados com lipoproteínas de amêndoas, aminometilpropanol, cloreto de sódio, mistura e iotiazolonas, associação de cocoisotionato de sódio com ácido esteárico, álcool cetoestearílico, carbômero, cloreto de guar hidroxipropiltrimônio.
14 Xampu Adutlto
MI 186/3 F9 F9M1
Água desmineralizada, lauril éter sulfato de sódio, cocoamidopropilbetaína, lauril éter sulfossuccinato de sódio, base perolizante, pragrancia, extrato de jaborandi, goma Agar quaternizada, proteína de trigo hidrolizada, metilparabeno, propilparabeno, edetato dissódico, benzotriazol sulfonodo, ácido lático, isotiazolinas e corante.
15 Xampu Adulto
SI 033920s2p
F10 F10M1
Água, lauril éter sulfato de sódio, c-12-13 sulfato de sódio, diestearato de glicol, cocoamidopropil betaína, cloreto de sódio, perfume, carbomer, EDTA dissódico, goma guarquaternizada,formaldeído, dimeticonol, metoxicinamato de octila, hidroxipropil polisiloxano de proteína de trigo hidrolizada, ácido cítrico/hidróxido de sódio
36
[Continuação da Tabela 1]
N° Produto Classifi-cação in vivo
Lote Fabricante Código
Final
Composição
16 Xampu Adulto
SI 0437B01
F11 F11M1
Lauril sulfato de sódio, cocoamidopropil betaína, cocoamido DEA, glicol distearato,cloreto guar hidroxipropiltrimonium, hidroxietil uréia, dissodium EDTA, methylchloroisothiazoline/methilisothiazoline, coffea arábica/ethyl methoxycinnamate/ethylhexyl triazone/isodecyl neopentanoate/ciclodextrin., ácido cítrico, cloreto de sódio
17 Xampu Adulto
LI 36040
17 F12 F12M1
Água, lauril sulfato de sódio, EDTA tetrasódio, cocoamido propil betaína,extratos de flores e frutas (jasmim, girassol...),Lauril DEA, metilparabeno, propilparabeno, cloreto de sódio, ácido cítrico,metilclorothiazollione,metilisothiazoline,Cl 15985.
18 Cond
Adulto LI
B582927
F7 F7M2
Água, álcool cetearílico, cloreto de cetrimônio, álcool, perfume, pantenol, formaldeído, dimeticona, acetato de tocoferila, lactato de cetila, ácido cítrico, álcool cetílico
19 Cond. Adulto
NI bC10
7 F2 F2M2
Água, álcool cetílico, PEG-180, hidroxietilcelulose, estearamidopropil dimetilamina, tridecet-12,dicloridrato de clorexidina, lanolina, amodimeticona, 2-oleamido-1,3-actadecanodiol, cloreto de cetrimônio, ésteres cetílicos, metilparabeno, ácido cítrico, amido de batata modificado, copoliol, laurimeticona, fragrância
Todos os tensoativos testados (N = 6) eram da marca Sigma. Foram avaliados os
seguintes tensoativos: Lauril Sulfato de Sódio, Triton X, Tween 20, Cloreto de
Benzalcônio, Brometo de Cetildimetiletilamônio e Lauril Éter Sulfato de Sódio.
37
3.2 Ensaio in vitro
3.2.1 Linhagem Celular
Linhagens 3T3 obtidas da “American Type Tissue Collection” (ATCC) mantidas
no Setor de Cultura de Células (SCC) do Laboratório de Vacinas Virais do Departamento
de Imunologia (DI) do INCQS.
3.2.2 Soluções
PBS 0,01 M pH = 7,2 (solução de lavagem):
Solução A
NaHPO4.2H2O - 35,61 g
Água Deionizada q.s.p - 1000 ml
Solução B
NaH2PO4.H2O 27,6g
Água Deionizada q.s.p 1000 ml
Homogeneizar 36ml da solução A + 14ml da solução B, completando o volume de 100ml
com água deionizada. Ajustar para pH = 7,2 e levar até 1000 ml com água deionizada,
estocar a 4° C.
PBS 0,01 M/ 4% Formol (fixador):
Formaldeído 40 % 100ml
PBS 0,01 M q.s.p 1000ml
Estocar a 4° C
SDS 1% (Eluente):
Dodecilsulfato de Sódio 10g
Água Deionizada q.s.p 1000ml
Estocar a temperatura ambiente
38
Azul Brilhante de Comassie 0,2% (corante):
Azul Brilhante de Comassie R-250 0,2g
Ácido Acético Glacial 10ml
Metanol 40ml
Água Deionizada q.s.p. 100ml
Filtrar e estocar a temperatura ambiente e ao abrigo da luz
Solução de Tripsina 0,05% e EDTA 0,02% Tripsina 1: 250 0,5g
EDTA 0,2g
NaCl 8,0g
KCl 0,4g
Dextrose 1,0g
NaHCO3 0,58g
Água deionizada q.s.p. 1000ml
Esterilizar por filtração em membrana de 0,22µm e estocar a -20° C
Solução de Bicarbonato de Sódio 7,5%:
Bicarbonato de Sódio 7,5g
Água Deionizada q.s.p. 100ml
Esterilizar por filtração em membrana de 0,22µm e estocar a 4° C
Solução de Penicilina 10.000 UI e Estreptomicina 10 mg/ml Penicilina G Potássica 1.000.000 UI
Sulfato de Estreptomicina 1g
Água deionizada q.s.p 100 ml
Esterilizar por filtração em membrana de 0,22 µm e estocar a – 20° C
Solução de Glutamina 3%:
L- Glutamina 3,0g
Água Deionizada q.s.p. 100ml
Esterilizar por filtração em membrana de 0,22µm e estocar a -20° C
39
Solução salina balanceada livre de cálcio e magnésio (BSS.CMF): (estoque)
Solução A - 20 vezes concentrada
Meio de Cultura DMEM 1 X
Meio base - 134,7 g
H2O deionizada q.s.p 5 L
Este modo de preparo é específico para reagente Sigma, código D-7777.
Estocar a 4° C
Meio DMEM 1 X suplementado para manutenção da linhagem celular 3T3 em estufa
com atmosfera de 3,5 % de CO2:
Soro fetal bovino – SFB (Cultilab lote 1210) 10% - 100 ml
Solução de Glutamina 3 % - 15 ml
HEPES - 20Mm
NaCO3 - 26mM
Completar o volume para 1000 ml q.s.p de meio DMEM 1X e estocar a 4° C
DMEM 1 X suplementado para diluição dos produtos testados no ensaio de
citotoxicidade
SFB (Cultilab lote 1210) - 50 ml
Solução de Bicarbonato de Sódio 7,5 % 30 ml
Solução de Glutamina 3% 15 ml
Completar o volume para 1000 ml q.s.p de meio DMEM 1 X
Estocar a 4 ° C.
3.2.3 Equipamentos:
• Balança Digital Metler Pe 3600
• Banho Maria Fanen Modelo 10210
• Câmara de Fluxo Laminar marca VECO
40
• Microscópio invertido Olimpus modelo IM
• Capela química de exaustão marca BNF
• Estufa de CO2 para cultura celular marca REVCO
• Pipetador automático Pipet Aid Drummond modelo serial 72834
• Placa agitadora Analiton modelo 704
• Potenciômetro Analion modelo PM 608
• Sistema de criopreservação Cryometal modelo DS – 34
• Bomba a vácuo/pressão
• Sistema de purificação de água Milli –Q Millipore
• Autoclave da marca Lutz Ferrando
• Sistema de filtração a vácuo Nalgene volume de 500 ml
• Leitor de Elisa Elx 800 Bio-Tec (filtro de 595 nm)
• Lavador automático de microplacas Elx 50 Step Washer Bio – Tek
• Agitador de tubos Vortex
• Micropipetas para volumes de 5 - 40 µL, 50 - 200 µL, e 500 – 2500 µL
• Micropipeta Multicanal 40 – 200 µL
• Cronômetro
41
3.2.4. Descongelamento Celular
As células 3T3 foram retiradas do reservatório de nitrogênio a -196°C e
descongeladas rapidamente em banho-maria. Foram transferidas em câmara de fluxo
laminar para garrafa de cultura contendo aproximadamente 9 ml de meio DMEM
suplementado para manutenção e crescimento celular em estufa de CO2. O repique foi
realizado no momento em que era observada uma monocamada confluente.
3.2.5 Procedimento
A metodologia foi realizada com base no estudo proposto por Costa, 2006 e
Clothier, 1995 conforme demonstrado nas Figuras 7 e 8. As células 3T3 foram semeadas
em microplacas de 96 cavidades (excetuando-se as extremidades) em um volume de
100µL na concentração de 1,0 x105 em meio DMEM (10% SFB) suplementado para
manutenção e crescimento celular e mantidas por 24 horas em estufa a 36,5°C com 3,5%
de CO2. Posteriormente, o meio foi trocado por 100µL de diluições pré-estabelecidas das
amostras em meio DMEM (5% de SFB). Após 24 horas de incubação, todo o conteúdo de
meio existente nas microplacas foi descartado e as mesmas foram então lavadas com
solução tampão PBS 0,01M e lavadas em lavador automático de microplacas em quatro
ciclos de lavagem. Posteriormente, a solução tampão foi descartada e foi adicionado às
cavidades da microplaca (em cabine de segurança química) 100µL de solução fixadora
PBS 0,01M/formol 4%, procedendo-se a incubação das mesmas por 15 minutos. O fixador
foi descartado e as microplacas foram secas em temperatura ambiente. Depois de secas, foi
adicionado às cavidades da microplaca 50µL de solução corante CBB-R250 0,2% p/v,
incubando-se por 30 minutos ao abrigo da luz em temperatura ambiente.
O corante foi descartado após esse intervalo de tempo e as microplacas foram
submersas imediatamente em recipiente plástico contendo água destilada e logo após,
lavadas manualmente por três vezes, procedendo-se a troca do recipiente com água a cada
lavagem. As microplacas foram colocadas em agitador automático (ainda com água
destilada no interior de suas cavidades) por 20 minutos a 500rpm, seguido de uma última
lavagem manual com água destilada. As microplacas foram secas em temperatura
ambiente. Depois de secas, o corante foi eluído com a adição de 100µL de SDS 1% em
42
cada cavidade da microplaca. A substância eluente foi mantida overnight ao abrigo da luz
e a densidade óptica (D.O) foi medida em leitor de Elisa a 595 nm.
Uma curva inicial foi obtida com oito concentrações de cada produto diluído em
meio de cultura (100; 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001, 0,00001 mg/ml). A partir daí, uma
segunda curva com uma faixa mais estreita de oito concentrações foi realizada a partir da
primeira curva. A concentração em que se obteve, nesta segunda curva, a redução de 50%
na absorbância quando comparado às células não-tratadas (controle) foi considerado a
concentração de efeito tóxico (i.e. a IC50 ou concentração inibitória 50%). O valor de IC50
para cada produto foi calculada pela média de três ensaios independentes.
43
Plaq uea me ntoD issociação do Cultivo Ce lular
Tratamento das cé lulas com amostras diluídas
Fixaçã oPB S/Formo l 4% 15 m in.
Inc uba ção por 24 horas a 36,5°C 3,5% CO 2
Diluiçã o das am ostras
Inc uba ção por 24 horas a 36,5°C 3,5% CO 2
ColoraçãoCB B-R25 0 0,2% 30 min
EluiçãoSD S 1% (overnight)
Leit ura da D.O595 nm
Lavage m a utom ática
Lavagem Manual
Figura 7: Esquema resumido do procedimento do ensaio in vitro.
44
Vazio
Diluições da amostra
Controle
Branco
Amostra [-]Amostra[+]
Figura 8: Esquema da aplicação das amostras diluídas na placa de 96 poços
.
45
3.3 Ensaio in vivo
Conforme mencionado anteriormente, foram utilizados dados provenientes do
banco de dados do DFT/INCQS. O ensaio in vivo foi realizado segundo o POP n°
65.333.004 do INCQS/FIOCRUZ, cujo objetivo é a detecção e avaliação do potencial de
irritabilidade para o homem de qualquer substância ou produto acabado que possa vir a
entrar em contato com os olhos (Anexo 1).
3.4 Análise Estatística
Para estabelecer a precisão inter-ensaio foi realizado o cálculo do coeficiente de
variação (CV%) segundo Bland & Altaman (BLAND & ALTMAN, 2008). Através dos
resultados obtidos nos três ensaios independentes realizados em cada uma das 25 amostras
de produtos acabados/tensoativos. O CV% foi calculado dividindo-se o desvio padrão (DP)
de cada amostra por sua respectiva média aritmética e multiplicando-se por 100.
Para o cálculo do coeficiente de variação global (CV% overall), procedemos
segundo Bland (BLAND, 2006). Primeiramente, dividimos a média das variâncias
encontradas entre os três ensaios independentes de cada amostra pelo quadrado da média
das ICs50.
CV = DP * 100
Média arit. IC50
CV2=Média das Variância (Média das IC50)
2
46
Posteriormente calculamos a média dos valores de CV2. A partir deste valor calculamos a
raiz quadrada e multiplicamos por 100.
A distribuição normal dos dados, tanto dos valores das ICs50 do teste in vitro quanto
das MEM do teste in vivo, foi aferida pelo teste Kolmogorov-Smirnov (K-S), através do
programa estatístico SPSS® 12.0.
Uma vez demonstrada a distribuição normal dos dados in vivo e in vitro, a
correlação existente entre os resultados foi calculada, através do coeficiente de correlação
de Pearson, utilizando para este fim, o software MINITAB 10.5 (MINITAB Statistical
SoftwareTM, Minitab Inc. PA, USA, 1995)
CV% global = √√√√Média CV2 * 100
47
Para calcular o grau de preditibilidade do ensaio in vitro foi montada uma tabela de
contingência, calculando-se a sensibilidade, especificidade e precisão dos testes in vitro
com relação ao teste in vivo:
NI: Não irritante I: Irritante
Onde:
1) Sensibilidade é a capacidade de uma metodologia in vitro detectar os produtos
positivos (irritante) = d/c+d
2) Especificidade é a capacidade de uma metodologia in vitro detectar produtos
negativos (Não irritantes) = a/a+b
3) Precisão é a capacidade de uma metodologia in vitro fornecer os mesmos
resultados que o teste in vivo = a+d/a+b+c+d
In vitro
NI I
NI a b
In vivo I c d
48
IV RESULTADOS _______________________________________________________
4.1 Resultados in vivo
Todos os produtos foram testados quanto ao seu potencial de irritação utilizando
modelos in vivo e in vitro. A Tabela 2 demonstra a distribuição dos produtos acabados tanto
pela sua classificação de uso (infantil ou adulto; condicionador ou xampu) quanto pela
classificação do seu potencial irritante ocular segundo o teste de Draize (in vivo).
4.1.1 Produtos infantis
Foram avaliados 11 produtos de uso infantil (Tabela 2), sendo que destes 05 (46%)
foram considerados como não irritantes no teste in vivo, 02 como irritantes leves (18%), 03
como irritantes moderados (27%) e 01 como irritante severo (9%).
Dentre os 11 produtos infantis avaliados, 06 eram xampus e 05 eram
condicionadores. Os condicionadores apresentam menor potencial irritante; dentre os 05
condicionadores infantis analisados, 04 foram não irritantes e 01 classificado como irritante
leve. Já a análise dos dados relacionados aos xampus infantis mostra somente 01 produto
não irritante e 01 irritante leve. Cabe destacar a observação de 04 xampus, que apesar da
designação como infantil, foram classificados como irritantes moderados (N=3) e severo
(N=1).
4.1.2 Produtos da linha adulta
Com relação à linha adulta, foi avaliado um total de 08 produtos, sendo 02
condicionadores e 06 xampus. Chama atenção o fato de que destes produtos, somente 01
49
(13%) recebeu classificação não irritante; 01 foi classificado como irritante leve (13%), 04
(50%) como irritantes moderados e 02 (24%) como irritantes severos.
Os 02 condicionadores foram classificados como não irritante (N = 1) e irritante
leve (N = 1), sugerindo assim, que a exemplo dos produtos infantis, também para linha
adulta observa-se um menor potencial irritante ocular por parte dos condicionadores. Cabe
ainda ressaltar, que todos os xampus adultos foram irritantes ao olho do coelho: 04
moderados e 02 severos. Nenhum dos produtos estudados recebeu a classificação de
irritante máximo.
Tabela 2: Classificação in vivo dos produtos acabados.
in vivo NI IL IM IS IMax Infantil 5 (46%) 2 (18%) 3 (27%) 1 (9%) 0 Xampus 1 1 3 1 0 Condicionadores 4 1 0 0 0
Adulto 1 (13%) 1 (13%) 4 (50%) 2 (24%) 0 Xampus 0 0 4 2 0 Condicionadores 1 1 0 0 0 Total 6 (32%) 3 (16%) 7 (36%) 3 (16%) 0
NI: Não Irritante; IL: Irritante leve; IM: Irritante Moderado; IS: Irritante Severo; IMax: Irritante Máximo. Fonte: dados gentilmente cedidos pelo DFT/INCQS.
4.1.3 Tensoativos
A maioria dos tensoativos foi avaliada in vivo em diferentes concentrações (banco
de dados DFT/INCQS). A relação dose-resposta e o potencial irritante ocular de cada
tensoativo estudado estão demonstrados na Tabela 3.
50
Tabela 3: Relação dose-resposta entre as Médias dos Escores Máximos (MEM) obtidos in vivo e a concentração de tensoativos aplicados nos olhos dos animais.
Concentração aplicada nos olhos dos coelhos (%)
100 30 16 10 8 4 1 0,5
Tween 20 (não-iônico)
2,0
(NI)
- - - - - - -
Lauril Éter a 27% (aniônico)
- 26,8
(IM)
- 3,2
(IL)
- - - -
Lauril Sulfato de Sódio (aniônico)
- 56,0
(IS)
38,8
(IS)
15,6
(IM)
15,6
(IM)
5,6
(IL)
- -
Triton X (não-iônico)
- 59,8
(IMax)
- - - - 2,8
(IL)
1,6
(NI)
Cloreto de Benzalcônio (catiônico)
- - - - - - 46,4
(IS)
6,0
(IM)
Brometo de cetil-dimetiletilamônio (catiônico)
- - - - - - - 8,4
(IM) Valores: Escores obtidos no ensaio de irritação ocular de Draize (MEM).
(): Classificação final obtida no ensaio de irritação ocular de Draize. Fonte: Dados gentilmente cedidos pelo DFT/INCQS.
Os dados compilados na Tabela 3 demonstram que todos os tensoativos
apresentaram potencial irritante ocular, com exceção do tween 20, um tensoativo não-
iônico, que mesmo quando testado puro, foi classificado como não irritante.
51
Os tensoativos aniônicos, i.e. lauril éter a 27% e lauril sulfato de sódio,
apresentaram potencial irritante moderado (MEM = 26,8) e severo (MEM = 56,0),
respectivamente, na maior concentração testada (30%). Assim, pode-se dizer que o lauril
sulfato de sódio foi discretamente mais irritante para os olhos dos coelhos que o lauril éter a
27% (Tabelas 3 e 4).
O triton X induziu lesões graves nos olhos dos animais aqui avaliados. Este
tensoativo recebeu classificação compatível com “irritante máximo”, quando aplicado nos
olhos dos coelhos na concentração de 30%, demonstrando assim, que apesar de pertencer à
classe de tensoativos não-iônicos (que via de regra é considerada uma classe que
compreende ingredientes com baixo potencial irritante), é mais irritante para os olhos que
os tensoativos aniônicos lauril éter a 27% e lauril sulfato de sódio (Tabelas 3 e 4).
Os tensoativos que demonstraram os maiores potenciais irritantes neste estudo
foram os catiônicos cloreto de benzalcônio e brometo de cetildimetiletilamônio. Estes
ingredientes, mesmo quando avaliados em concentrações muito baixas (e.g. 0,5%),
induziram lesões oculares compatíveis com a classificação de “irritante moderado” (Tabela
3).
A Tabela 4 busca categorizar os tensoativos estudados de acordo com seu potencial
irritante ocular, usando como base a análise da relação dose resposta obtida in vivo.
52
Tabela 4: Categorização do potencial irritante ocular dos tensoativos avaliados.
Tensoativo Natureza
do
tensoativo
Resultado
in vivo
[conc. teste]
classificação
Potencial
irritante
in vivo
Tween 20 Não-ionico [100%]
NI
-
Lauril Éter 27% Aniônico [30%],[10%]
IM IL
+
Lauril Sulfato de Sódio Aniônico [30%],[16%],[10%],[8%],[4%]
IS IS IM IM IL
++
Triton X Não-iônico [30%], [1%],[0,5%]
IMáx, IL NI
+++
Cloreto de Benzalcônio Catiônico [1%],[0,5%]
IS IM
++++
Brometo de
Cetildimetiletilamônio
Catiônico [0,5%]
IM
++++
Assim, se considerarmos a classificação do teste de Draize em função da relação
dose-resposta observada nos animais estudados, podemos ordenar os tensoativos de acordo
com o seu potencial irritante ocular in vivo; onde [tween 20] < [lauril éter a 27%] < [lauril
sulfato de sódio] = [triton x] < [cloreto de benzalcônio = brometo de cetildimetilamônio],
conforme demonstra a Tabela 4.
53
4.2 Resultados in vitro
As médias das ICs50 de cada um dos 19 produtos acabados e dos 06 tensoativos
foram obtidas a partir de três ensaios in vitro realizados independentemente e que são
demonstradas na Tabela 5.
O pH dos produtos acabados variou entre 3,76 e 7,25 (tabela5).
A Tabela 5 mostra ainda os valores das regressões lineares das curvas obtidas em
cada um dos três ensaios independentes realizados para cada um dos 25
produtos/tensoativos. Os valores das regressões lineares variaram entre 0,746 e 1,000.
O valores médios de IC50 aqui obtidos variaram entre 0,004 e 3,771mg/mL. O maior
valor (representa teoricamente um produto com baixo potencial irritante) foi atribuído ao
produto F3M2, um condicionador classificado in vivo como não irritante, enquanto que os
menores valores de IC50 observados foram atribuídos a tensoativos com forte potencial
irritante (Tabela 5).
54
Tabela 5: ICs50 média dos produtos/tensoativos avaliados.
Produtos in vivo pH IC 50∗ Regressão linear∗ IC50 Média
(1°) (2°) (3°) R2(1°) R2(2°) R2(3°) (mg/mL)
M1 NI 6,31 3,002 1,102 3,321 0,962 0,864 0,943 2,475
F2M1 IM 6,8 1,103 0,713 0,836 0,933 0,895 0,993 0,884
F3M1 IL 7,25 1,371 1,096 1,368 0,891 0,935 0,860 1,278
F4M1 IM 6,55 1,127 0,715 0,840 0,975 0,986 0,961 0,894
F4 F1M2 IM 7,01 0,539 0,389 0,263 0,974 0,972 0,939 0,397
F5M1 IS 6,71 0,513 0,836 0,643 0,934 0,921 0,882 0,664
F3M2 NI 4,23 2,725 2,752 5,837 0,908 0,938 0,919 3,771
F4M3 NI 4,26 0,628 0,728 0,459 0,857 0,958 0,967 0,605
F4M4 NI 3,76 0,379 0,306 0,300 0,991 0,968 0,901 0,328
F6M1 IL 3,82 0,575 0,562 0,466 0,994 0,986 0,841 0,534
F1M2 NI 3,98 0,664 0,666 0,643 0,852 0,882 0,911 0,657
F7M1 IM 5,6 0,633 0,310 0,330 0,997 0,968 0,760 0,424
F8M1 IM 5,81 0,888 0,729 0,917 0,961 0,912 0,971 0,844
F9M1 IM 4,84 0,164 0,225 0,095 0,929 0,811 0,746 0,161
F10M1 IS 6,17 0,453 1,051 0,555 0,935 0,993 0,978 0,686
F11M1 IS 5 0,692 0,673 0,624 0,869 0,979 0,905 0,663
F12M1 IL 6,92 1,012 0,478 1,403 0,921 0,952 0,960 0,964
F7M2 IL 4,09 0,863 0,507 0,853 0,952 0,843 0,934 0,741
F2M2 NI 4,67 2,432 1,829 3,369 0,916 0,994 0,970 2,543
Lauril Sulf. de Sódio ++ 0,0597 0,0637 0,0615 1,000 0,961 0,989 0,062
Triton X +++ 0,0024 0,0078 0,0063 0,999 0,931 0,916 0,005
Tween 20 - 0,3990 0,4072 0,3740 0,999 0,985 0,825 0,393
Cloreto de Benzalcônio ++++ 0,0072 0,0097 0,0040 0,897 0,975 0,961 0,007
Br. de Cetilmetiletilam ++++ 0,0041 0,0045 0,0030 0,929 0,995 0,986 0,004
Lauril Éter + 0,2763 0,2650 0,2900 0,903 0,896 0,900 0,277
∗Valores de ICs50 e Regressão linear (R2) obtidos em cada um dos três ensaios independentes (1o), (2o) e (3o ).
55
Na Tabela 6 podemos observar os valores médios de IC50 obtidos somente para os
tensoativos aqui estudados. Os menores valores de IC50 deste estudo foram observados para
os dois tensoativos catiônicos avaliados, i.e. o cloreto de benzalcônio (IC50 = 0,007mg/mL)
e o brometo de cetildimetiletilamônio (IC50 = 0,004mg/mL) e para o triton X (IC50 =
0,005mg/mL). As ICs50 médias destes tensoativos foram cerca de 10 vezes menores que
aquela observada para o lauril sulfato de sódio (IC50 = 0,062 mg/mL) e aproximadamente
50 vezes menores que a IC50 obtida para o lauril éter a 27% (IC50 = 0,277mg/mL). O maior
valor de IC50 obtido entre os tensoativos, foi observado para o tween 20 (IC50 = 0,393
mg/mL), o único tensoativo classificado como não irritante in vivo neste estudo.
Em uma análise semelhante àquela realizada para o teste de Draize, podemos
ordenar os tensoativos de acordo com o seu potencial irritante in vitro; onde [tween 20] <
[lauril éter a 27%] < [lauril sulfato de sódio] < [triton x = cloreto de benzalcônio = brometo
de cetildimetiletilamônio]. Assim, podemos afirmar com base nos dados compilados na
Tabela 6, que os resultados obtidos in vitro são compatíveis com o potencial irritante dos
tensoativos estabelecidos in vivo.
56
Tabela 6: Comparação dos resultados in vivo e in vitro obtidos com tensoativos.
Tensoativo Natureza do
tensoativo
Potencial
irritante
in vivo
Resultado
in vitro
Média IC50
(mg/mL)
Potencial
irritante
in vitro
Tween 20 Não-ionico - 0,393 +
Lauril Éter 27% Aniônico + 0,277 +
Lauril Sulfato de Sódio Aniônico ++ 0,062 ++
Triton x Não-iônico +++ 0,005 +++
Cloreto de Benzalcônio Catiônico ++++ 0,007 +++
Brometo de
Cetildimetiletilamônio
Catiônico ++++ 0,004 +++
4.2.1 Precisão inter-ensaio
Para estabelecer a precisão inter-ensaio2 do método proposto, calculamos o
coeficiente de variação, conforme protocolo preconizado pela OMS para validação de
ensaios biológicos (WHO/VSQ/97.02). Os coeficientes de variação (CV%) de cada uma
das amostras ensaiadas neste estudo foram calculados de acordo com metodologia descrita
no capítulo 3.6 de “Materiais e Métodos” e estão demonstrados na Tabela 7.
2Precisão inter-ensaio (também conhecida como precisão intermediária): é medida através do coeficiente de variação, obtido pela análise de múltiplas determinações de uma (ou várias) amostra(s), ensaiada(s) em série de experimentos independentes, conduzidos por um mesmo laboratório.
57
Tabela 7: Precisão inter-ensaio do teste in vitro.
Produtos
in vivo
(1°)
IC50
(2°)
(3°) Média aritmética
DP CV%
F1M1 NI 3,002 1,102 3,321 2,475 1,200 48,47
F2M1 IM 1,103 0,713 0,836 0,884 0,199 22,55
F3M1 IL 1,371 1,096 1,368 1,278 0,158 12,36
F4M1 IM 1,127 0,715 0,840 0,894 0,211 23,63
F4M2 IM 0,539 0,389 0,263 0,397 0,138 34,80
F5M1 IS 0,513 0,836 0,643 0,664 0,163 24,48
F3M2 NI 2,725 2,752 5,837 3,771 1,789 47,44
F4M3 NI 0,628 0,728 0,459 0,605 0,136 22,47
F4M4 NI 0,379 0,306 0,300 0,328 0,044 13,40
F6M1 IL 0,575 0,562 0,466 0,534 0,060 11,15
F1M2 NI 0,664 0,666 0,643 0,657 0,013 1,94
F7M1 IM 0,633 0,310 0,330 0,424 0,181 42,69
F8M1 IM 0,888 0,729 0,917 0,844 0,101 11,98
F9M1 IM 0,164 0,225 0,095 0,161 0,065 40,40
F10M1 IS 0,453 1,051 0,555 0,686 0,320 46,63
F11M1 IS 0,692 0,673 0,624 0,663 0,035 5,29
F12M1 IM 1,012 1,403 0,478 0,964 0,276 28,68
F7M2 IL 0,863 0,507 0,853 0,741 0,203 27,36
F2M2 NI 2,432 1,829 3,369 2,543 0,776 30,52
Lauril Sulfato de Sódio ++ 0,0597 0,0637 0,0615 0,062 0,002 3,23
Triton X +++ 0,0024 0,0078 0,0063 0,005 0,003 46,45
Tween 20 - 0,3990 0,4072 0,3740 0,393 0,017 4,40
Clor. de Benzalcônio ++++ 0,0072 0,0097 0,0040 0,007 0,003 40,81
Br. de Cetiletildimetilamônio ++++ 0,0041 0,0045 0,0030 0,004 0,001 19,42
Lauril Éter 27% + 0,2763 0,2650 0,2900 0,277 0,013 4,52
CV% Global
30,00
58
Dentre os 25 produtos acabados/tensoativos ensaiados, nenhum apresentou
coeficiente de variação maior que 50%. O coeficiente de variação global do estudo foi
estabelecido como sendo de 30,00 (Tabela 7).
Os produtos acabados apresentaram os coeficientes de variação com valores
compreendidos entre 1,94% (F1M2) e 48,47% (F1M1). Esta grande variação entre os
produtos, no que tange os valores de CV%, também foi observada para os tensoativos.
Observamos entre os tensoativos avaliados, amostras com valores de CV% bastante
satisfatórios, como e.g o lauril sulfato de sódio (CV%: 3,23%), o tween 20 (CV%: 4,40) e o
lauril éter (CV%: 4,52) e outros com valores acima de 20%, como nos casos do triton x
(CV%:46,45) e o cloreto de benzalcônio (CV%: 40,81%).
4.3 Comparação entre os ensaios in vivo e in vitro
Os resultados do presente estudo foram comparados (in vivo versus in vitro) através
da análise do coeficiente de correlação de Pearson existente entre os escores (MEM)
obtidos no teste de Draize e os valores médios de IC50 obtidos in vitro. Além disso, com o
intuito de avaliar o grau de preditibilidade do ensaio in vitro em relação ao teste de Draize,
estabelecemos um ponto de corte (cut-off) para diferenciação de substâncias irritantes
daquelas não-irritantes (no teste in vitro) e calculamos parâmetros como precisão,
sensibilidade, especificidade.
59
4.3.1 Coeficiente de correlação de Pearson
Para avaliar a correlação entre os valores de MEM (média dos escores máximos)
obtidos no ensaio in vivo e os valores médios de IC50 obtidos no presente estudo realizamos
o cálculo do coeficiente de correlação de Pearson. Tal análise estatística se aplica à
investigação da correlação existente entre médias de grupos que apresentam valores
paramétricos (CANN, 2003; OSBORNE, 2005; MALONEY, 2003; FILHO et al., 2005),
i.e. obedecem a uma distribuição normal, como é o caso dos resultados in vitro e in vivo
encontrados pelo presente estudo.
As distribuições normais dos dados (KS teste >0,05) estão demonstradas para os
valores de MEM global na Figura 9, para os valores médios de IC50 do teste in vitro na
Figura 10, assim como para os valores de MEM de córnea (Figura 11), para os valores de
MEM de íris (Figura 12) e para os valores de MEM de conjuntiva (Figura 13).
60
Figura 9: Distribuição normal dos valores de MEM Global (in vivo).
Figura 10: Distribuição normal dos valores de média aritmética da IC50.
61
Figura 11: Distribuição normal dos valores de MEM de córnea.
Figura 12: Distribuição normal dos valores de MEM de íris.
62
Figura 13: Distribuição normal dos valores de MEM de conjuntiva.
63
Para a análise dos coeficientes de correlação de Pearson (Tabelas 8 e 9),
confrontamos os valores de MEM com os valores de IC50 de todos os produtos testados
neste estudo (produtos acabados/tensoativos, N=25); somente dos produtos acabados
(N=19) e posteriormente, somente dos tensoativos (N=6). Tais cálculos foram realizados
com a intenção de se observar a correlação existente entre a citotoxicidade e o grau de lesão
induzido no olho por cada categoria de amostra ensaiada.
Em uma segunda etapa, confrontamos os valores de MEM específicos para cada
estrutura ocular separadamente (córnea, íris e conjuntiva) com os valores das médias
aritméticas das ICs50 de todos os produtos acabados/tensoativos (N=25), somente dos
produtos acabados (N=19) e posteriormente, somente dos tensoativos (N=6), para que
pudéssemos relacionar o potencial citotóxico das amostras testados com as lesões ocorridas
em cada uma das estruturas oculares (Tabela 9).
No caso dos tensoativos, para efeito de cálculo do coeficiente de correlação de
Pearson entre os resultados in vitro e in vivo (onde diferentes doses foram testadas no teste
de Draize) utilizamos como critério o uso dos valores de MEM obtidos com a maior dose
de tensoativo avaliada in vivo, como mostra a Tabela 8.
64
Tabela 8: Valores utilizados para o cálculo dos coeficientes de correlação de Pearson: médias aritiméticas das ICs50, valor global de MEM (olho como um todo) e das estruturas oculares (MEM de córnea, íris e conjuntiva).
Produtos
In
vivo
MEM Global
Média Aritimética
IC50
(mg/ml)
MEM Córnea
MEM íris
MEM conjuntiva
F1M1 NI 1,6 2,475 0,0 1,0 1,6
F2M1 IM 25,4 0,884 16,0 1,0 8,4
F3M1 IL 4,8 1,278 0,0 0,0 4,8
F4M1 IM 36,8 0,894 20,0 4,0 12,8
F4M2 IM 28,6 0,397 16,0 1,0 11,6
F5M1 IS 41,0 0,664 28,0 3,0 10,8
F3M2 NI 0,8 3,771 0,0 0,0 0,8
F4M3 NI 1,2 0,605 0,0 0,0 1,2
F4M4 NI 0,8 0,328 0,0 0,0 0,8
F6M1 IL 3,6 0,534 0,0 0,0 3,6
F1M2 NI 0,4 0,657 0,0 0,0 0,4
F7M1 IM 52,2 0,424 36,0 5,0 13,2
F8M1 IM 29,4 0,844 16,0 5,0 8,8
F9M1 IM 13,0 0,161 6,0 1,0 6,4
F10M1 IS 52,2 0,686 36,0 3,0 12,8
F11M1 IS 32,0 0,663 18,0 4,0 11,6
F12M1 IM 23,4 0,964 10,0 3,0 10,4
F7M2 IL 3,4 0,741 0,0 1,0 2,4
F2M2 NI 2,4 2,543 0,0 0,0 2,4
Lauril Sulf. de Sód. (30%) IS 56,0 0,062 23,20 3,2 12,4
Triton X (30%) Imáx 59,8 0,005 40,0 5,0 11,2
Tween 20 (100%) NI 2,0 0,393 0,0 0,0 2,0
Clor. Benzalcônio (1%) IS 46,4 0,007 30,4 4,0 13,2
Brom. cetildimetil. (0,5%) IM 8,4 0,004 0,8 0,0 7,6
Lauril Éter a 27% (30%) IM 26,8 0,277 18 2,0 7,6
65
Os coeficientes de correlação de Pearson entre os valores médios de IC50 do teste in
vitro e os escores das três estruturas oculares (córnea, íris e conjuntiva) e escore global do
teste de Draize encontram-se descritos na Tabela 9.
Tabela 9: Coeficientes de correlação de Pearson relacionando os valores de IC50 com os escores das estruturas oculares dos ensaios in vivo.
(grau de confiança: 99%).
N=25 (todos os produtos) Correlação de Pearson Córnea -0,397 ( p= 0,050)
Íris -0,313 ( p= 0,128) Conjuntiva -0,455 ( p=0,035)
Escore total (MEM) -0,420 (p=0,022) N=19 (produtos acabados)
Córnea -0,359 (p=0,131) Íris -0,289 (p=0,230)
Conjuntiva -0,413 (p=0,079) Escore total (MEM) -0,381 (p=0,108)
N= 6 (tensoativos)
Córnea -0,531 ( p=0,278 ) Íris -0, 550 (p=0,258)
Conjuntiva -0,824 (p =0,044) Escore total (MEM) -0,611 (p=0,197)
Quando consideramos todos os produtos acabados/tensoativos avaliados (N=25),
obtivemos um valor de coeficiente de correlação de Pearson de -0,420 (p=0,022). Este
coeficiente, juntamente com os coeficientes de correlação estabelecidos a partir da
comparação de escores da conjuntiva vs. IC50 (-0,455, p=0,035) e da córnea vs. IC50 (-
0,397, p = 0,050) foram estatisticamente significativos (Tabela 9).
66
Quando consideramos somente produtos acabados (N=19, Tabela 9), observamos
coeficientes de correlação de menor calibre, e sem significância estatística, tanto para o
escore total como para as estruturas oculares analisadas individualmente.
Já a análise dos resultados obtidos com tensoativos mostra valores de coeficiente de
correlação de maior calibre que aqueles obtidos para produtos acabados, porém devido ao
pequeno número de tensoativos analisados (N=6), não se obteve significância estatística
(Tabela 9). Uma exceção foi observada para o coeficiente de correlação estabelecido entre
os escores da conjuntiva vs. IC50. Este foi o coeficiente de maior calibre observado neste
estudo (-0,824, p=0,044).
É importante destacar que em todos os casos avaliados (produtos acabados +
tensoativos, somente produtos acabados e somente tensoativos), os achados observados na
conjuntiva, dentre as estruturas oculares analisadas, foram os que melhor se
correlacionaram com o efeito citotóxico in vivo.
4.3.2 Grau de preditibilidade do ensaio in vitro
A classificação dos produtos de acordo com a graduação das lesões obtidas nos
testes in vivo, juntamente com as médias de IC50 dos experimentos in vitro, encontra-se na
Tabela 10.
Para avaliar o grau de preditibilidade do teste in vitro em relação ao teste de Draize,
estabelecemos um ponto de corte (cut-off) para diferenciação de substâncias irritantes
daquelas não-irritantes no teste in vitro. Consideramos o valor de IC50 = 1,00mg/mL como
um possível ponto de corte para a diferenciação de produtos acabados irritantes
(IC50<1,00mg/mL) de não-irritantes (IC50>1,00mg/mL). Calculamos, assim, parâmetros
como precisão, sensibilidade, especificidade conforme descrito no capítulo 3.6 de
“Materiais e Métodos” e de acordo com a Tabela 11.
67
Tabela 10: Comparação entre as classificações obtidas no ensaio in vivo e o valor médio de IC50 in vitro.
Classificação
Produtos in vivo (MEM)
in vitro (IC50 mg/mL)
Final (in vivo)
Final♣ (in vitro)
F1M1 F3M2 F4M3 F4M4 F1M2 F2M2 Tween 20
1,6 0,8 1,2 0,8 0,4 2,4 2,0
2,475 3,771 0,605 0,328 0,658 2,543 0,393
NI NI NI NI NI NI NI
NI NI I I I
NI I
F3M1 F6M1 F7M2
4,8 3,6 3,4
1,278 0,534 0,741
LI LI LI
NI I I
F12M1 F2M1 F4M1 F4M2 F7M1 F8M1 F9M1 Brom. Cetildim. (0,5%) Lauril Éter (30%)
23,4 25,4 36,8 28,6 52,2 29,4 13,0 8,4 26,8
0,964 0,884 0,894 0,397 0,424 0,844 0,161 0,004 0,277
MI MI MI MI MI MI MI MI MI
I I I I I I I I I
F5M1 F10M1 F11M1 Clor. Benzalcôn. (1%)
41,0 52,2 32,0 46,4
0,664 0,686 0,663 0,007
SI SI SI SI
I I I I
Lauril Sulf. Sód. (30%) 56,0 0,062 SI I Triton X (30%)
59,8
0,005
IMáx
I
♣: Ponto de corte: IC50=1,0mg/mL
68
Usando o valor de 1,000mg/ml como ponto de corte, obtivemos 5 resultados discordantes
entre os testes in vivo e in vitro, sendo4 falsos positivos (F4M3, F4M4, F1M2 e tensoativo
tween 20) e 1 resultado falso negativo (F3M1).
Tabela 11: Tabela de Contingência.
Assim, a precisão do ensaio foi de 80%, a sensibilidade foi de 94% e a
especificidade foi de 43%.
in vitro
NI I
NI A = 3 B = 4 in vivo
I C = 1 D= 17
69
V. DISCUSSÃO ______________________________________________
5.1 Toxicologia de produtos cosméticos
Segundo dados da ABIHPEC (Associação Brasileira da Indústria de Higiene
Pessoal, Perfumaria e Cosméticos), um dos setores da indústria brasileira que apresentou
maior crescimento nos últimos anos foi o da indústria de produtos cosméticos, com um
crescimento médio deflacionado composto de 10,9% na ultima década, contra 2,8% da
indústria em geral (ABIHPEC, 2008).
Uma variedade de fatores tem contribuído para o enorme crescimento deste
segmento da indústria nos últimos anos. Entre eles destacam-se a participação crescente da
mulher brasileira no mercado de trabalho, a utilização de tecnologia de ponta e o
conseqüente aumento da produtividade (favorecendo assim os preços praticados pelo setor,
que têm aumentos menores do que os índices de preços da economia em geral), os
lançamentos constantes de novos produtos atendendo cada vez mais às necessidades do
mercado e, por fim, o aumento da expectativa de vida, o que traz a necessidade de
conservar uma impressão de juventude.
O aumento de vendas de produtos cosméticos e de higiene pessoal deve ser
atentamente acompanhado pelos setores regulatórios competentes, uma vez que o
entusiasmo no crescimento de vendas pode induzir o surgimento de novas empresas, que
devem, todavia, atender a um criterioso grau de exigência quanto à comprovação da
segurança de seus produtos. Ao contrário da situação de exposição humana a fármacos,
onde em dadas circunstâncias pode-se ponderar sobre a relação risco-benefício, no caso
particular de produtos cosméticos, não se pode admitir o surgimento de quaisquer efeitos
danosos em conseqüência deste tipo de exposição.
No Brasil, dados levantados pelo Sistema Nacional de Informações Tóxico-
Farmacológicas (SINITOX) apontam para uma baixa incidência de intoxicações
decorrentes da exposição a produtos cosméticos, i.e. 808 casos, ou 0,96% do total de casos
70
de intoxicação humana notificados nos Centros de Informação e Assistência Toxicológica
no âmbito nacional, durante o ano de 2005, conforme mostra a Tabela 12 (SINITOX,
2005). Não há neste site dados disponíveis sobre a natureza dos produtos cosméticos que
levaram aos registros junto aos Centros de Informação e Assistência Toxicológica e nem
sobre a severidade dos sintomas apresentados, embora nenhum óbito tenha sido associado
ao uso de cosméticos durante o período estudado. Ainda segundo o SINITOX, as regiões
em que mais observa-se casos de agravos à saúde em decorrência ao uso de produtos
cosméticos são as regiões sul, com 330 casos e a região sudeste, com 315 em 2005. Na
região sul, por exemplo, a incidência de reações adversas induzidas por cosméticos foi
superior ao número de casos de intoxicação alimentar (42 casos notificados em 2005).
71
Tabela 12: Casos registrados de intoxicação humana por agente tóxico (Brasil,
2005).
Total
n° %
Agente
Medicamentos 21926 25,96 Agrotóxicos agrícolas 5577 6,60 Agrotóxicos domésticos 2590 3,07 Produtos veterinários 877 1,04 Raticidas 3213 3,80 Domissanitários 6506 7,70 Cosméticos 808 0,96 Produtos químicos industriais 4631 5,48 Metais 720 0,85 Drogas de abuso 2942 3,48 Plantas 1765 2,09 Alimentos 833 0,99 Animais peçonhentos/Serpentes 4944 5,85 Animais peçonhentos/ Aranhas 4661 5,52 Animais peçonhentos/Escorpiões 8208 9,72 Outros animais peçonhentos 5834 6,,91 Animais não peçonhentos 5146 6,09 Desconhecido 2005 2,37 Outros 1270 1,50
Total 84456 100
Fonte: http://www.fiocruz.br/sinitox
O baixo grau de severidade de efeitos adversos induzidos por determinados
produtos, assim como a percepção do risco por parte do consumidor, podem ser
importantes aspectos no que diz respeito a possíveis sub-notificações de casos de
intoxicações por cosméticos em nosso país, sobretudo se levarmos em consideração dados
72
do mercado norte-americano (CORBETT et al., 1999). Segundo estes autores, os casos de
intoxicações humanas em decorrência da exposição a cosméticos e produtos de higiene
pessoal representaram a terceira principal causa de registros (8,5%, ou cerca de 170 mil
casos) aos centros de controle de intoxicação nos EUA no ano de 1995, sendo menos
freqüente somente do que os casos de intoxicações por produtos domissanitários e
medicamentos (analgésicos). Estes mesmos autores relatam que os efeitos adversos
observados nos casos registrados com cosméticos são de baixa gravidade e que em menos
de 10% dos casos foi necessário tratamento em unidades hospitalares.
Outro dado interessante sobre a incidência de reações adversas induzidas por
produtos cosméticos pode ser observado através de registros dos casos de reclamações
feitas ao FDA por consumidores norte-americanos. Tais registros são feitos por classes de
produtos comercializadas neste país. O Quadro 5 mostra dados do FDA sobre a incidência
de reações adversas (e.g. irritações de pele e mucosas, dermatites, dor/desconforto, efeitos
sobre o sistema respiratório etc) induzidas por produtos cosméticos entre os anos de 1987 a
1995 nos EUA, relacionando-os com a natureza dos produtos. Cremes para cuidados da
pele e tinturas de cabelo foram os produtos que levaram ao maior número de reações
adversas. Xampus foram responsáveis pela indução de cerca de 80 tipos distintos de
reações e aparecem como a terceira maior causa de reclamações, juntamente com produto
para as unhas.
73
Quadro 5: Registro do FDA: reclamações de consumidores quanto a reações adversas provocadas por produtos cosméticos nos EUA, entre 1987 e 1995. Número de reações adversas observadas Natureza do produto
262 Produtos para o cuidado da pele (cremes de
uso diário e noturno, cremes anti-rugas,
cremes para clareamento da pele, hidratantes,
soluções para limpeza da pele etc).
111 Tinturas de cabelo.
70-89 Xampus e produtos para unhas.
50-69 Fixadores para cabelos cacheados, produtos
para os olhos, condicionadores de cabelo.
30-49 Bronzeadores, desodorantes, depiladores,
alisantes de cabelo.
20-29 Fragrâncias, dentifrícios e outros produtos
para higiene bucal, batons e tônicos
capilares.
10-19 Sabonetes, produtos para o banho e produtos
infantis.
≦ 10 Descolorantes de cabelo, produtos para o
barbear.
Fonte: CORBETT et al., 1999. N= 1305 casos
74
No Brasil, o artigo 50 do Decreto no 79.094 de 05 de janeiro de 1977 dispõe sobre
produtos de higiene e cosméticos para uso infantil e é claro quanto à proibição de xampus
infantis com potencial irritante ocular:
“... Xampus destinados à limpeza do cabelo e do couro cabeludo das crianças por
ação tensoativa ou absorção sobre sujidades podem ser apresentados em formas e veículos
apropriados, mas sem ser irritantes ao couro cabeludo e aos olhos da criança, devem ser
facilmente removíveis após a sua aplicação e o pH deve estar compreendido entre os limites
de 7,0 (sete vírgula zero) e 8,5 (oito vírgula cinco)...”
É importante destacar, que tal legislação é a única existente em nosso país que trata
da segurança dos produtos cosméticos em questão, e a mesma impõe limites quanto ao pH
somente para a classe de xampus infantis. Sendo assim, não existem parâmetros para a
faixa aceitável de pH para as outras categorias avaliadas, i.e. os condicionadores da linha
infantil e os xampus e condicionadores de uso adulto. Vale ainda ressaltar que, todos os
produtos contemplados no presente estudo foram avaliados quanto ao seu pH e que cerca de
65% dos xampus infantis encontravam-se fora da faixa preconizada pela legislação
brasileira (DECRETO n° 79.094,1977).
Outro dado que evidencia a discrepância entre a Lei em vigor e a situação real dos
produtos comercializados no município do Rio de Janeiro é o fato de cerca de 70% dos
produtos acabados aqui avaliados (incluindo a maioria dos xampus da linha infantil)
induzirem algum grau de irritação ocular pelo teste de Draize, o único teste oficialmente
aceito para avaliação da irritabilidade ocular pela autoridade regulatória nacional.
A análise comparativa entre o potencial irritante ocular de xampus e
condicionadores demonstra que, tanto para a linha adulta como para a linha de produtos
recomendados para o público infantil, são os xampus os produtos que apresentam o maior
potencial irritante. Todos os xampus da linha adulta foram considerados insatisfatórios no
teste de Draize; 04 deles receberam a classificação de irritantes moderados e 02 irritantes
severos. A situação é ainda mais crítica se considerarmos os produtos da linha infantil.
75
Dentre os 06 xampus infantis aqui estudados, somente 01 foi aprovado no teste de Draize,
embora seu pH estivesse fora da faixa preconizada por Lei. Sendo assim, todos os xampus
infantis foram considerados impróprios para comercialização e consumo, embora tenham
sido adquiridos comercialmente. Tal fato demonstra a necessidade de intensificação de
ações fiscalizadoras, exigindo o pleno cumprimento da Lei por parte de algumas indústrias
de cosméticos.
5.2 Avaliação integrada: combinação de testes in vitro e in vivo na avaliação do
potencial irritante ocular
Poucos foram os testes de segurança que até hoje sofreram tão grande pressão pela
sua abolição como o teste de irritação ocular de Draize. Dentre as razões que contribuíram para este cenário, podemos citar:
i. O teste de Draize é um teste fácil de ser compreendido pela população em
geral; enquanto que o grau de dor/desconforto ao qual os animais são
submetidos durante o teste é difícil de ser explicado pelo meio científico
(sobretudo antes do teste passar por um certo grau de refinamento, que
eliminou a avaliação de substâncias corrosivas com pH < 2,0 e > 11,5);
ii. O teste de Draize sempre teve grande aplicação pela indústria de
cosméticos e a opinião pública tem se mostrado pouco tolerante no que diz
respeito à avaliação de segurança desta classe de produtos;
iii. A existência de questionamentos sobre o poder preditivo do teste de
Draize e sua real relação com o potencial irritante ocular em humanos.
76
Somado aos aspectos levantados acima, vale ressaltar o fato da comunidade
científica ter, inicialmente, acreditado que a substituição do teste de Draize fosse uma tarefa
mais simples do que de fato ela se revelou ser.
Desde o início da década de 1980, inúmeros testes alternativos ao teste de Draize
foram sugeridos pela comunidade científica mundial (VIAN et al., 1995; CLOTHIER et al.,
1988; CLOTHIER, 1995; CLOTHIER et al., 2006; KNOX et al., 1986; RIDDEL et al.,
1986; HOCKLEY & BAXTER, 1986.; LUEPKE & KEMPER, 1986.; LUEPKE, 1986;
PAPE et al., 1999; BURDICK et al., 2002.; BURTON et al., 1981; DE TORRES et al.,
1997.; PRICE & ANDREWS, 1985; TANI et al., 1999.; GUILLOT, 1992; RENZI et al.,
1993; EUN & SUH, 2000; LAGARTO et al., 2005; YANG & ACOSTA, 1994.;
SPIELMANN,1996; MARGIS & BOROJEVICH, 1989), porém alguns fatores dificultaram
sua plena validação. O primeiro destes fatores diz respeito à complexidade das estruturas
oculares. Para muitas das alternativas estudadas não se tem observado suficiente
concordância entre os mecanismos que realmente influenciam o processo de irritação
ocular e o desfecho proposto. Além disso, não há pleno conhecimento científico da biologia
envolvida no processo de irritação ocular e, em humanos, os dados sobre o potencial
irritante ocular de ingredientes e produtos são escassos (SPIELMANN & GOLDBERG,
1999).
Como a variedade de ensaios alternativos ao teste de Draize até hoje propostos não
substitui plenamente o uso de animais, a comunidade científica e órgãos regulatórios de
alguns países (e.g. a agência regulatória alemã, o EPA e a OECD) vêm sugerindo uma
estratégia integrada de avaliação, que compreenda a realização de ensaios in vitro, e em
alguns casos, a aplicação do ensaio in vivo conforme descrito por Spielmann & Goldberg,
1999 (Figura 14).
Neste tipo de abordagem, os dados físico-químicos, a análise quanto à
estrutura/atividade da substância química em questão e resultados obtidos a partir de
ensaios in vitro e in vivo são levados em consideração para a avaliação do potencial
irritante de novas substâncias químicas. Com esta abordagem integrada, substâncias
classificadas como “perigosas para os olhos: causadoras de lesão severa ocular” (i.e. com
77
base na análise de resultados obtidos nas etapas preliminares, incluindo medida de pH,
avaliação de dados relacionados ao potencial irritante cutâneo, considerações sobre
estrutura/atividade e a realização de testes in vitro) não são testadas em animais. Somente
as substâncias que apresentam resultados negativos na bateria de ensaios in vitro (até o
passo 4 da Figura 14) são submetidas ao ensaio in vivo, mesmo assim tomando como
precaução a utilização inicial de somente 01 coelho no teste de irritação ocular. Tal
abordagem já é utilizada em diversos países membros da comunidade européia, porém
segundo normas e diretrizes dos países membros, já não pode ser aplicada a produtos
cosméticos, uma vez que a Europa já proíbe desde 2004 a comercialização de produtos
cosméticos testados em animais e estabelece como novo prazo o ano de 2009 para a
proibição definitiva do uso de animais na avaliação de segurança de ingredientes isolados
(e.g. tensoativos) utilizados em cosméticos (DIRECTIVA 2003/15/EEC).
78
Figura 14: Estratégia para teste de irritação ocular de novas substâncias químicas de acordo
com procedimentos de países membros da Comunidade Européia.
Fonte: De Silva et al, 1997
1° Passo
Mensuaração do pH
Avaliação da irritação cutânea
Considerações sobre estrutura/atividade
Testes alternativos
2° Passo
3° Passo
4° Passo
Teste de irritação ocular de Draize com 1 animal
5° Passo
Teste de irritação ocular de Draize com 3 animais
6° Passo
Nenhuma indicação de risco
Não é irritante, de acordo com critérios estabelecidos pela Comunidade Européia
Não é irritante ou é irritante reversível ocular
Irritante moderado e reversível ocular
R 36
Irrit ante severo/corrosivo
Nenhum outro teste solicitado
Não é irritante ocular importante
Irritante severo/corrosivo ocular
Teste de irritação ocular de Draize não recomendado
Irritante severo/corrosivo ocular
Teste de irritação ocular de Draize não recomendado
Positivo no teste de corrosividade cutânea
Teste de irritação ocular de Draize não recomendado
pH ›11,5 ou ‹ 2
Teste de irritação ocular de Draize não recomendado
R 36
R 41
R 34
R 34 ou R35
R 41
Não é corrosivo ocular
79
[continuação da Figura 14]
Onde:
R36 – Produtos classificados como irritantes oculares moderados in vivo
R41 – Produtos classificados como irritantes severos/corrosivos oculares in vivo
R35 – Produtos classificados como corrosivos cutâneos in vivo
R34 - Produtos classificados como irritantes severos cutâneos in vivo
5.3 Uso de métodos alternativos na avaliação do potencial irritante de cosméticos
Diante do aumento no consumo de produtos cosméticos e devido às questões éticas
relacionadas à diminuição do número de animais em pesquisa científica, sobretudo no
controle da qualidade desta classe de produtos, os laboratórios brasileiros oficiais que
controlam a qualidade de produtos sujeitos à Vigilância Sanitária devem estar
particularmente atentos ao desenvolvimento, implantação e validação de metodologias
alternativas. Uma das etapas do processo de validação consiste em estimar a variação intra-
laboratorial do ensaio em questão, avaliando, inclusive, a variação dos resultados obtidos
em diferentes ensaios por um mesmo analista e entre analistas diferentes.
No presente estudo observou-se um elevado valor de coeficiente de variação para
alguns produtos acabados e também para alguns tensoativos. No entanto, este parece não
ser de fato, um aspecto limitante para o ensaio proposto, já que de acordo com a OMS
(WHO/VSQ/97.02), ensaios biológicos apresentam - via de regra - uma variação entre 5 e
20%, se considerarmos ensaios de ligação (e.g. imunoensaios) ou ainda, superiores a 50%
quando consideramos ensaios realizados com linhagens celulares (e.g. ensaios de
citotoxicidade) e/ou modelos animais (e.g. ensaios de toxicidade, pirogênio etc). Além
disso, o fato do coeficiente de variação global do ensaio (30,00%) se encontrar dentro do
limite preconizado para ensaios biológicos conduzidos com células, segundo protocolo de
80
validação de bioensaios da OMS, parece ser mais um indício de que o elevado coeficiente
de variação de alguns poucos produtos não deva ser um fator limitante do ensaio proposto.
Em outro estudo realizado por nosso laboratório (COSTA, 2006), em que avaliamos
através do método de QPT em células SIRC o potencial citotóxico somente de xampus
(N=20) e tensoativos (N=5) foi encontrado um valor de CV% global de 16,82 (Tabela 13).
Percebemos, desta forma, que os coeficientes de variação globais dos estudos diferem,
sendo os dados de Costa, 2006 mais satisfatórios em termos de precisão inter-ensaio.
Para avaliar se a maior variabilidade encontrada no presente estudo se deveu à
escolha da linhagem celular (e descartar a possibilidade de ser uma interferência da
utilização de produtos de diferentes naturezas, e.g. o uso de condicionadores no presente
estudo) recalculamos os CV%s globais com base nos valores obtidos com 17 amostras (12
xampus e 5 tensoativos), as únicas amostras que foram ensaiadas tanto no presente estudo
como por Costa, 2006. Concluímos, assim, que os coeficientes de variação globais do
método diferem quando utilizamos linhagens celulares distintas, e que os resultados dos
ensaios conduzidos com células SIRC (CV% global: 18,43%) são mais satisfatórios em
termos de precisão inter-ensaio do que os obtidos com as mesmas 17 amostras usando
células 3T3 (CV% global: 31,00%). Também em termos do grau de preditibilidade do
ensaio, nos parece que a utilização de células SIRC se mostra mais vantajosa, como
veremos no item 5.3.1.
81
Tabela 13: Avaliação comparativa dos CV% globais do método de QPT com
diferentes linhagens celulares.
N Linhagem
celular
CV% Global
Presente estudo 25 3T3 30,00
17* 3T3 31,00
Costa, 2006 25 SIRC 16,82
17* SIRC 18,43
* Número de produtos/tensoativos usados em ambos os estudos.
5.3.1 Grau de preditibilidade do método proposto
Para a avaliação do grau de preditibilidade do teste in vitro em relação ao teste in
vivo foi necessário o estabelecimento de um ponto de corte (cut-off) que possibilitasse a
diferenciação de substâncias irritantes daquelas não-irritantes no teste in vitro. Após análise
dos resultados obtidos in vitro e a avaliação destes, tendo como base os resultados obtidos
in vivo, optamos pelo ponto de corte de 1,00mg/mL. Assim, amostras com
IC50<1,00mg/mL foram consideradas como irritantes in vitro, enquanto aquelas com
IC50>1,00mg/mL como não-irritantes.
82
Usando este valor como ponto de corte, obtivemos 5 resultados discordantes entre o
teste in vitro e o teste in vivo, sendo 4 falsos positivos e 1 falso negativo, enfatizando uma
maior fragilidade da célula 3T3 em relação a outras linhagens celulares (e.g SIRC), como
mostram o resultados de sensibilidade, especificidade e precisão (Tabela 14).
Tabela 14: Avaliação comparativa da preditibilidade do método de QPT com diferentes linhagens celulares.
N Sensibilidade Especificidade Precisão
Costa, 2006
(SIRC)
25 100% 83% 96%
Presente estudo
(3T3)
25 94% 43% 80%
A análise dos dados nos permitiu ainda concluir, que há uma melhor capacidade do
método proposto em detectar produtos classificados como irritantes na metodologia in vivo
(sensibilidade) do que aqueles classificados como não-irritantes (especificidade). A
precisão do método foi de 96%, quando realizado com células SIRC e de 80% no presente
estudo (Tabela 14).
Alguns erros de estimação que ocorrem na maioria dos ensaios de citotoxicidade
parecem estar relacionados com a classe química das substâncias-teste. Substâncias que
apresentam pH extremo, i.e. sabidamente irritantes in vivo, podem apresentar resultados
subestimados in vitro. Por outro lado, substâncias com baixo potencial irritante in vivo, em
alguns casos, podem apresentar resultados superestimados in vitro, devido ao fato dos
parâmetros de medição serem mais sensíveis nos testes de citotoxicidade (SEIFREID,
1986; BENOIT et al., 1987; GUILLOT, 1992; COSTA, 2006). Neste contexto, possíveis
influências de componentes presentes no meio de cultura e outras características de
exposição devem ser levadas em consideração:
83
i. Enquanto no teste in vivo, o olho dispõe de alguma proteção em relação ao
contato com a substância irritante, como o extrato córneo e a produção de
lágrimas, no ensaio in vitro, a cultura celular é exposta diretamente à
substância teste (HERZINGER et al., 1994);
ii. Alguns ingredientes do meio de cultura, como soro fetal bovino, glicose e
algumas proteínas podem exercer efeito protetor nas células, já que tais
substâncias do meio podem inativar algum produto testado (Costa 2006).
Substâncias teste podem vir a sofrer interação com compostos do meio de
cultura e assim, o efeito de substâncias ácidas ou alcalinas pode ser
mascarado pela solução tampão presente no meio para incubação celular
(HERZINGER et al., 1994). Por outro lado, proteínas do meio podem
desnaturar e gerar uma toxicidade não presente in vivo (COSTA, 2006).
Algumas substâncias testadas, como, por exemplo, alguns tensoativos,
interagem com proteínas do soro fetal bovino (HERZINGER et al., 1994),
fazendo com que o efeito tóxico dessas substâncias possa vir a ser
mascarado in vitro;
iii. Adicionalmente, deve-se levar em consideração o fato das diferentes
solubilidades apresentadas pelas diversas substâncias-teste nos meios de
cultura, que também podem ser causa de resultados discordantes entre o
teste in vitro e o teste in vivo (SEIFREID 1986; BENOIT et al., 1987;
GUILLOT, 1992; COSTA, 2006).
84
5.3.2 Confronto com dados da literatura
Existem diversos artigos na literatura científica que dizem respeito à investigação da
aplicabilidade de testes de citotoxicidade para avaliação de produtos com potencial irritante
ocular. Muitos deles utilizaram como corantes o MTT e/ou o vermelho neutro (NR) e foram
realizados em células SIRC e 3T3 (DE ANGELIS et al, 1986; VIAN et al, 1995;
CLOTHIER et al, 1988; CLOTHIER, 1995; CLOTHIER et al, 2006; KNOX et al, 1986;
RIDDEL et al, 1986; GUILLOT, 1992; RENZI et al, 1993; EUN & SUH, 2000; YANG &
ACOSTA, 1994; SPIELMANN et al,1996; MARGIS & BOROJEVICH, 1989;
BORENFREUND & PUERNER, 1985; DICKSON et al, 1993; HOCKLEY & BAXTER,
1986; PASTERNAK & MILLER, 1995; ROUGUET et al, 1992; SHOPSIS & ENG, 1992;
TANI et al, 1999). Estudos utilizando a metodologia de QPT são um pouco mais escassos
(KNOX et al., 1986; RIDDEL et al., 1986; CLOTHIER et al., 1988; CLOTHIER, 1995;
CLOTHIER et al., 2006., VIAN et al., 1995 e COSTA, 2006).
Desde sua criação até os dias de hoje, a metodologia de QPT vem sofrendo algumas
modificações, como por exemplo, a adaptação do teste com placas de 24 poços (KNOX et
al., 1986; RIDDEL et al., 1986; CLOTHIER et al., 1988) para a utilização de placas com
96 poços (VIAN et al., 1995; CLOTHIER, 1995; CLOTHIER et al., 2006; COSTA, 2006).
Em 1995, houve a publicação do protocolo n°15 do INVITOX - FRAME (CLOTHIER,
1995), afirmando que o corante utilizado no teste de QPT (Azul de Kenacid) poderia ser
substituído pelo corante Azul Brilhante de Comassie R-250, sem nenhum tipo de prejuízo à
técnica. Desta forma, o método pode ser realizado tanto com o corante Azul de Kenacid
(KNOX et al, 1986; RIDDEL et al, 1986; CLOTHIER et al, 1988; CLOTHIER, 1995;
CLOTHIER et al, 2006) quanto com o corante Azul Brilhante de Coomassie R-250 (VIAN
et al., 1995; Costa, 2006), como mostra a Tabela 15.
A Tabela 15 nos mostra ainda que os resultados do presente estudo são muito
semelhantes aos encontrados por outros autores, que utilizaram o mesmo método em
estudos conduzidos com células 3T3, ou mesmo com outras linhagens celulares, e que a
utilização deste método permite diferenciar tensoativos quanto ao seu potencial irritante.
85
Tabela 15: Avaliação comparativa dos valores de IC50 obtidos com tensoativos no presente estudo em comparação com modelos descritos na literatura.
# Corante Azul de Kenacid, *Corante Azul Brilhante de Coomassie R-250
BCL-D1: fibroblasto humano
No entanto, na grande maioria das vezes, os estudos que buscam investigar a
aplicabilidade de testes de citotoxicidade utilizam somente ingredientes isolados (como e.g.
tensoativos), não sendo contemplados neste tipo de estudo os produtos acabados (WOLF et
al, 2001). Muitos produtos acabados apresentam em sua formulação um conjunto de
tensoativos (2 a 4 tensoativos diferentes como e.g. catiônicos, aniônicos, anfotéricos e não-
iônicos), e esta mistura de ingredientes dificulta a predição do potencial irritante. Esta é
uma provável explicação para o baixo coeficiente de correlação de Pearson observado em
nosso estudo entre os testes in vitro e in vivo, quando consideramos apenas produtos
acabados (0,381), conforme demonstrado na Tabela 16
IC50 (mg/ml)
3T3 SIRC BCL-D1
Tensoativos *Presente
estudo #Riddel, et al., 1986
#Clothier et al., 1988
*Clothier et al., 2006
*Vian et al., 1995
*Costa, 2006
#Knox et al., 1986
Tween 20 0,393 _ 0,263 0,262 0,344 1,208 _
Lauril Éter 0,277 _ _ 0,114 _ _ _
Lauril Sulfato de Sódio
0,062
0,100
0,090
0,072
0,080
0,040
0,084
Triton X
0,006 _
0,014
0,014
0,003
0,030
_
Cloreto de Benzalcônio
0,007 _ 0,007 0,007 0,006 0,004 0,002
Brometo de Cetildimetiletilamônio
0,004 _ _ 0,002 _ 0,003 --
86
Tabela 16: Comparação dos valores de coeficiente de correlação de Pearson em diferentes
ensaios de citotoxicidade.
*Tensoativos
# Produtos acabados (xampus e condicionadores)
Com relação aos tensoativos, apesar do valor de coeficiente de correlação de
Pearson ter se apresentado de melhor calibre (e.g. -0,611, p = 0,197), tal valor não
apresenta significância estatística. Devemos ressaltar o fato de que o número reduzido de
amostras provavelmente influenciou a significância estatística (N=6).
No que se refere às estruturas oculares, podemos observar que as ICs50 dos testes in
vitro se correlacionam melhor com as lesões ocorridas na conjuntiva do que na íris e
córnea. Este dado se confirma na análise de todos as amostras avaliadas conjuntamente,
SIRC 3T3 L929
NRU -0,59 (N=20)* -0,580 (N=20)* -0,57 (N=20)*
MTT -0,59 (N=20)* -0,620 (N=20)* - Vian et al., 1995
QPT -0,56 (N=20)* -0,480 (N=19)* -0,55 (N=20)*
NRU -0,816 (N=35)* - - Ohono et al., 1999
MTT - - --
Tani et al., 1999 NRU -0,787 (N=30)* - -
Costa, 2006 QPT -0,62 (N=21)*# - -
Presente Estudo QPT -
-0,611 (N=6)*
-0,381 (N=19)#
-0,420 (N=25)*#
-
87
sendo tal correlação estatisticamente significativa na análise de produtos acabados +
tensoativos, e somente tensoativos.
A face anterior do olho é recoberta pela córnea e pela conjuntiva. A córnea é a
estrutura ocular mais exposta, e assim, é a estrutura mais susceptível à exposição química e
conseqüente lesão ocular. Injúria corneal em testes com animais, após a exposição a
substâncias fortemente irritantes/corrosivas, demonstra ser responsável por 73% do escore
total de toxicidade ocular (ESAC/ECVAM, 2007). Por essa razão, modelos in vitro, que
analisam possíveis lesões ocorridas na córnea apresentam melhor correlação com o teste de
irritação ocular de Draize (sobretudo para substâncias com forte potencial irritante) e vêm
sendo o principal foco dos estudos para o desenvolvimento de metodologias alternativas ao
teste de irritação ocular de Draize.
Existem, neste contexto, dois métodos alternativos ao teste de irritação ocular de
Draize em vias de receber a validação oficial para a avaliação de segurança de produtos
cosméticos isolados, são eles: o BCOP (teste que avalia opacidade e permeabilidade
corneal utilizando córnea isolada de bovino) e o ICE (teste que avalia opacidade e
permeabilidade corneal, além da retenção de fluoresceína, utilizando córnea isolada de
galinha). Tais métodos demonstram uma excelente correlação com o teste de irritação
ocular de Draize (BURDICK et al, 2002.; BURTON et al, 1981). Cabe ressaltar que tanto o
BCOP como o ICE foram recentemente validados (2007) como métodos integrantes de uma
bateria de ensaios de triagem para a detecção de substâncias não cosméticas (agrotóxicos,
pesticidas etc.) classificadas como irritantes severos/corrosivos oculares (ESAC/ECVAM,
2007).
Além da córnea, a íris é outra estrutura ocular investigada na avaliação da resposta a
substâncias químicas no teste de irritação ocular de Draize. Existe concordância no meio
científico de que, em geral, a avaliação in vitro de lesões ocorridas na íris não se faz
necessária, já que a resposta desta estrutura ocular ocorre somente após uma significante
disrupção da barreira ocular anterior da córnea (BAGLEY et al., 2006; ALTOX, 2007).
88
A conjuntiva é a terceira estrutura ocular investigada na avaliação da resposta a
substâncias químicas no teste de irritação ocular de Draize. As lesões ocorridas na
conjuntiva são responsáveis por apenas cerca de 18% do escore total de toxicidade ocular
observado no teste de Draize (ALTOX, 2007). Por isso, testes alternativos que apresentam
como desfecho final a medição de alterações vasculares, i.e. mais correlacionáveis à injuria
de conjuntiva (e.g. HET-CAM), tendem a superestimar os resultados obtidos in vivo
(CORRADO, 2007). Este parece ser também o caso do teste de citotoxicidade pelo método
de QPT. Podemos dizer que a dificuldade em correlacionar a metodologia in vitro com a
metodologia in vivo, assim como a baixa especificidade do método em questão, parece
residir no fato de que o teste proposto demonstrou maior correlação com o efeito tóxico
ocorrido na conjuntiva, que por sua vez, é a estrutura ocular que recebe o menor peso
durante a análise do teste de irritação ocular in vivo (alterações de íris e córnea recebem
peso 5, enquanto conjuntiva recebe peso 2, conforme etapa 1 do anexo 1).
Apesar de receber um menor peso no teste in vivo, a possibilidade de dano à
conjuntiva não deve ser negligenciada. Lesões nesta estrutura ocular podem até ser
consideradas de menor relevância em se tratando de produtos com potencial irritante
moderado a severo, porém, a avaliação das lesões ocorridas na conjuntiva, são úteis na
avaliação de efeitos mais leves, especialmente os ocasionados por produtos aplicados no
olho propriamente dito e ao redor do mesmo (ALTOX, 2007). Cabe ressaltar que a
avaliação da conjuntiva representa grande importância em termos de sistema vascular e
imunológico, e que possíveis alterações nesta estrutura são importantes na resposta
inflamatória relacionada ao processo de toxicidade ocular (ALTOX, 2007).
Assim, cada vez mais se torna clara a idéia de que uma metodologia substitutiva in
vitro não deve ser utilizada isoladamente para a avaliação da irritação ocular, e sim através
de um conjunto de outras metodologias alternativas, com capacidade de detecção de
diferentes desfechos.
89
5.4 Considerações finais
De acordo com o publicado na 7a Emenda da Diretiva 76/768/CEE (2000), países
membros da União Européia se comprometem a “abolir o uso de animais de forma
definitiva e permanente no controle toxicológico de produtos cosméticos acabados”. E
complementam: “A comissão se esforçará em obter o reconhecimento recíproco dos
resultados de validação dos estudos in vivo/in vitro”. Cabe ao profissional envolvido em
questões como essa, o bom senso na utilização de abordagens alternativas, evitando sempre
que possível o sofrimento e a morte desnecessárias dos animais e contribuindo para o
desenvolvimento de pesquisa científica de melhor qualidade.
Neste contexto se inseriu o presente trabalho, buscando por alternativas que
integram o modelo combinado de avaliação do potencial irritante ocular, ampliando o
elenco de alternativas e aprimorando nosso conhecimento a respeito de vantagens,
limitações e peculiaridades dos modelos propostos.
90
VI. CONCLUSÕES _________________________________________________________________________
A análise dos resultados obtidos no presente estudo nos permite concluir, que:
i. Cerca de 70% dos produtos acabados aqui avaliados induziram
algum grau de irritação ocular no teste de Draize. Como este é o
único teste preconizado pela autoridade regulatória nacional para
a avaliação da irritação ocular, e mediante a legislação vigente,
que proíbe a comercialização de xampus da linha infantil com
potencial irritante, concluímos que há uma evidente discrepância
entre a Lei em vigor e a situação real dos produtos acabados aqui
avaliados. Nossos dados demonstram a necessidade de
intensificação de ações fiscalizadoras, especificamente nesta are
de atuação da Vigilância Sanitária;
ii. A avaliação do coeficiente de variação do teste de QPT
conduzido com células 3T3 mostrou um valor de CV% global de
30,00%. Embora este valor seja considerado adequado, segundo
a OMS, para ensaios conduzidos com linhagens celulares, a
comparação de nossos resultados demonstra que a utilização de
células SIRC (CV% global 16,82%) é mais vantajosa em termos
de precisão inter-ensaio;
iii. Também em termos de sensibilidade, especificidade e precisão
observamos resultados mais promissores quando da utilização de
células SIRC (Costa, 2006). Ainda em relação ao grau de
preditibilidade do método de QPT, pode-se concluir que há uma
melhor capacidade em detectar produtos classificados in vivo
como irritantes (sensibilidade = 94%) do que aqueles
classificados in vivo como não irritantes (especificidade = 43%).
91
Nas condições experimentais do presente estudo, a precisão do
método foi estabelecida em 80%;
iv. A avaliação de tensoativos pelo método de QPT nos mostrou
que este teste é capaz de diferenciar tensoativos quanto ao seu
potencial irritante. Os valores de IC50 obtidos nesta etapa do
estudo foram muito semelhantes aos encontrados na literatura
internacional, demonstrando que, pelo menos para ingredientes
isolados, o método apresenta pouca variabilidade inter-
laboratorial;
v. A análise dos valores de correlação de Pearson entre os
resultados obtidos in vivo e in vitro mostrou que o método de
QPT em células 3T3 tende a apresentar valores de correlação de
melhor calibre para tensoativos do que para produtos acabados.
O fato de xampus e condicionadores serem constituídos, via de
regra, por uma mistura de ingredientes é uma provável razão
para a baixa correlação observada entre os testes para esta classe
de produtos;
vi. No que tange a análise das estruturas oculares, concluímos que
os valores obtidos in vitro (IC50) se correlacionam melhor com
as lesões ocorridas na conjuntiva do que na íris e córnea. Esta
característica foi observada tanto quando analisamos dados de
tensoativos, como quando consideramos produtos acabados.
92
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101
ANEXO
___________________________________________
Teste in vivo:
Serão utilizados dados provenientes do banco de dados do DFT/INCQS. Os ensaios
in vivo foram realizados segundo o POP n° 65.333.004 do INCQS/FIOCRUZ 11, cujo
objetivo é a detecção e avaliação do potencial de irritabilidade para o homem de qualquer
substância ou produto acabado que possa vir a entrar em contato com os olhos.
O teste de Draize permite cinco classificações dos produtos quanto ao seu potencial irritante ocular, são elas: não irritantes (NI), irritante leve (IL), irritante moderado (IM), irritante severo (IS) e irritante máximo (IMax).
1) Animais: Coelhos albinos, machos ou fêmeas da raça Nova Zelândia, hígidos e com
peso corpóreo acima de 2,0 Kg. Foram utilizados 5 animais por amostra/substância-
teste
2) Acondicionamento: Os animais foram mantidos em gaiolas individuais em
condições controladas de temperatura (20 +/- 2°C) e umidade relativa doa ar (30 –
70%) e ciclo claro/escuro constante (12 horas cada). Os animais receberam ração e
água ad libidum.
3) Preparo dos animais: Ambos globos oculares de cada animal foram examinados 24
horas antes do início do ensaio. Os animais que apresentaram injúrias na conjuntiva
e globo ocular foram descartados.
4) Aplicação: Instilou-se 0,1 mL do produto no saco conjuntival inferior e, em seguida
massageou-se gentilmente durante 30 segundos. As substâncias ou produtos
fortemente ácidos ou alcalinos (pH menor que 2,0 e maior que 11,5) não foram
testados, pois são reconhecidamente corrosivos.
5) Leitura: Foram realizadas leituras, por três analistas, nos períodos de 24h, 48h, 72h
e 7 dias, para a observação das alterações e graduação das lesões (Quadro 1)
6) Avaliação dos resultados: Foi dividida em etapa I e etapa II
ETAPA I:
1) Determinação da quantificação da lesão ocular
102
Este cálculo deve ser realizado para cada animal com base nas leituras de 24, 48, 72 horas
e 7 dias, conforme a graduação das lesões, segundo a equação abaixo e registrando-se os
valores na ficha de soma das leituras para, em seguida, calcular a média aritmética de cada
tempo de leitura
Lxt = [(AxB) x 5 + (Cx5) + [(D+E+F) x 2]. Onde:
Lxt – Leitura de um animal em um intervalo de tempo (t)
A – densidade da opacidade
B – área da opacidade
C – irite
D – hiperemia
E – quimose
F – secreção
2) Seleção da maior média aritmética entre as médias de 24, 48, 72 horas (ME24h,
ME48h, ME72h)
Seleciona-se a média de valor máximo (ME max), e posteriormente calcula-se a faixa de
confiança de acordo com a seguinte equação: FC=MEmax+/-5, onde:
Fc – faixa de confiança
MEMAX – média aritmética de maior valor entre os tempos de 24h, 48h e 72h.
Uma vez selecionada a ME max verifica-se se pelo menos dois valores de Lxt encontram-se
dentro da Fc. Se tais valores forem encontrados, deve-se considerar o MEmax e utilizar a
tabela 2, referente à classificação prévia do produto.
103
Tabela 2: classificação prévia do potencial de irritabilidade de um produto
Classe Faixa/Escores Classificação
I 0,0 a 14,9 Produto não –irritante (NI)
II 15,0 a 24,9 Produto levemente irritante (IL)
III 25 a 49,9 Produto irritante moderado (IM)
IV 50,0 a 79,9 Produto irritante severo (IS)
V 80,0 a 110,0 Produto Irritante Máximo (IMax)
ETAPA II – Classificação final do potencial de irritabilidade ocular
Esta etapa foi utilizada para confirmar ou alterar a classificação da amostra ou substância-
teste encontrada da etapa I. Para tal, fez-se uso da Tabela 3, referente à classificação final
do produto.
Tabela3: Classificação final do potencial de irritabilidade ocular de um produto
* M = Média; h = horas; d = dias; L = leitura
Classificação Confirmação da classificação inicial
Não irritante (classe I) M24h < 2.4 – classe I; se M24> 2.4 ir para classe II
Irritante leve (classe II) (1) M48h </= 2.4, classe II; se M48h> 2.4, ir para o item (2)
(2) M72h</=2.4, classe II; se M72h > 2.4, ir para classe III
Irritante moderado (classe
III)
(1) M7d</= 20, ir para o item (2); se M7d > 20, ir para classe IV
(2) L7d </= 10 em pelo menos 3 animais, classe III; se L7d>30 em pelo menos 1
animal, classe IV
Irritante severo (classe IV) (1) M7d</= 40, ir para i item (2); se M7d > 40, ir para a classe V
(2) L7d </= 30 em pelo menos 3 animais, classe IV; se L7d > 60 em pelo menos
um animal, classe V
Irritante máximo (classe v) (1) M7d > 40, ir para item (2)
(2) L7d > 60 em pelo menos 1 animal, classe V
104
Graduação
Estrutura Alteração 0 1 2 3 4
Quanto à
densidade
Nenhuma
área
afetada
Área difusa ou
disseminada,
ligeira perda de
brilho
Áreas translúcidas
facilmente
discerníveis,
detalhamento da
íris ligeiramente
dificultado.
Área opalascente,
nenhum
detalhamento
visível da íris.
Opaca.
Íris invisível
Córnea
O
P
A
C
I
D
A
D
E
Quanto à área
afetada
Sem
opacidade
¼ (ou menos),
mas nunca zero
Entre ¼ e ½ da
córnea
Entre ½ e ¾
Entre ¾ e área
total
Íris Irite Íris normal Raias com
congestão,
edema,
congestão
circuncorneal,
íris ainda
reativa à luz
Nenhuma reação à
luz, hemorragias,
destruição de
tecido
X X
Conjuntiva Hiperemia Vasos
normais
Vasos injetados
acima do
normal
Congestão difusa,
vasos visualizados
com muita
dificuldade.
Congestão difusa.
Não visualização
de vasos
X
Quimose Ausência
de edema
Leve edema Edema moderado
com eversão
parcial das
pálpebras
Edema severo com
pálpebras cobrindo
metade do olho
Edema severo
com eversão
de pálpebras
podendo haver
fechamento
total do olho
Secreção Ausência
de secreção
Quantidade
pequena de
secreção
Umedecimento de
pálpebras e pêlos
adjacentes
Umedecimento
severo de área ao
redor do olho
X
105
106
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