Avaliação da diversidade microbiana

Amostragem, processamento e técnicas

Dificuldades na avaliação:• Falta de recursos humanos capacitados

• Falta de financiamento

• Amplitude da diversidade

• Erosão da diversidade

• Falta de metodologias

Porquê avaliar?

Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade.Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

   

• Amostragem

• Processamento

• Detecção e avaliação – técnicas:

         i.   Fenotípicas

        ii.   Moleculares

iii. Imunológicas

• Etapa crítica

• São usados equipamentos especializados

• Devem ser considerados os seguintes fatores:

Representatividade

Não alterar os números e as atividades

Evitar a introdução de contaminantes

Estocar em condições adequadas

• Uso de amostras compostas para minimização do erro

• Determinação do numero de amostras mínimo

• Estatística determinará os limites de confiança

Problema da representatividade

Estratégias de amostragem

Acesso - direto

Número de microrganismos - Baixo

Equipamentos

Processamento - Concentração em filtros

Ar é um meio restritivo

para os microrganism

os (1)

(1) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos

Amostragemno

Microbiota do Ar

Morte dos microrganismos no ar

Xt = X0-k.t

K- coeficiente de inativação

Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais

Fatores:Umidade relativa

Temperatura

Radiação (pigmentação, reparo do DNA)

Radicais de O2

Íons, dentre outros

Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis

Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

Amostragem do ar

1.Simulação respiratória

(tamanho partícula 0,8 – 15 μm; fluxo de ar e velocidade)

2. Colisão - Captura em liquido. Ex: AG-30

3. Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Anderson

4. Centrifugação

5. Filtração

6. Deposição - Coleta passiva

Coletor de AndersonAG-30

Equipamentos para amostragem do ar:

Amostragem passivaApenas microrganismos que caem nas placas

Amostragem ativaRecuperação forçada usando um volume determinado

Método usado nas estações espaciaisDados NASA

Importância Aeromicrobiologia extramural:

Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS)

Fitopatógenos (ferrugem)

Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais

Despejo de resíduos (sólidos e líquidos)

Guerra biológica

Aeromicrobiologia intramural:

Edificios (doenças dos Legionários-Legionella

pneumophila, bactéria aquática disseminada

pelos aparelhos de ar condicionado e água potável)

Viagens de avião

Saúde pública - gripes

Acesso - Direto ou remoto

Números - elevados ou baixos

Equipamentos -Recipientes, filtros

Processamento - diluição ou concentração

Amostragemna

Depende nível de matéria orgânica

Equipamentos

• ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais Yellowstone Park

• Águas termais (difíceis de amostrar convencionalmente)

Mensageiro controlado remotamente abre o recipiente para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades

Acesso - Remoto

Número de microrganismos - elevado

Equipamentos - observatórios, sondas

Processamento - diluição

Amostragemem

Profundezas oceânicas mostrando as conexões entre a crosta e os sedimentos. Ocorrem trocas entre os sedimentos e a crosta.

Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios.

Microbiota dos sedimentos

Cowen, 2004

Observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas

Baixa abundância (biomassa) porém microrganismos sempre presentes

Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica.

Fisk et al., 1998

Ventarolas marinhas

Sedimentos:

• Elevada diversidade de Bacteria e Archaea

• 180 reações metabólicas envolvendo N,S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos

• Diversos micro-nichos existentes

Acesso - direto

Números de microrganismos - elevado ou baixo

Equipamentos - trados, pás

Processamento - diluição

Amostragemno

SOLO

Uma simples pá de solo de jardim contem mais espécies de organismos do que pode

ser encontrado em toda a floresta amazônica.

Problemas

solo

Distribuição dos microrganismos em

agrupamentos

Bactérias existem em “hot-spots”

1-5 g solo

Elevada variabilidade entre amostras

Estatística

SOLO

Solo propriamente dito

Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera.

BIOMASSA - 1010 /g

Características:

1. Microcolônias (interação ativa dentro das populações)

2. Estímulo ao crescimento

(populações com elevadas velocidades crescimento)

3. Modificações ambientais

4. Troca genética

Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig.

Subsolo

BIOMASSA - 107/g

Distribuição não homogênea

Alguns números sobre a estrutura do solo

Microrganismos no solo

Em cada grama solo tipicamente franco

• 2,8 X 105 m2 - dimensões continentais para microrganismos

• > 1X 1010 células viáveis

• > 4 X103 espécies

• << 0,1% são cultivadas in vitro

• Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA

• Apenas 1 ou 2 membros cultivados pertencem a ordens conhecidas

Maioria diversidade é desconhecida!

Números no solo

Números de microrganismos no solo:

Bactérias: 106 a 109 g-1 solo Gram - bacilos 17-29% Gram + bacilos 2-7% Actinomicetos: 11-32% Arthrobacter, etc., 31-46%

Algas: 101 x 106 g-1 Fungos: 104 a 106 g-1 Protozoários : 104 a 105 g-1 Bacteriófagos: ? % Culturabilidade por grupo: 0.8 a 7 %

• Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar

usando riqueza especifica e outros índices.

• Mas no solo as estimativas da diversidade da microbiota :

• Envolvem dificuldades: heterogeneidade, grupos dificeis de cultivar em

meio de cultura • Estratégias

•Fame •CHO utilização •Técnicas moleculares usando PCR •Sorologia

Solo

Populações - 107 /g

Importantes patogênicos para

homem

Amostragemno

Cerca de 40 % água consumida pelo homem provem do fontes subterrâneas

Existem gradientes nestas regiões:Forçado - quando água é movimentada em elevadas quantidades produzindo a movimentação dos microrganismos Passivo - natural sem influência artificial

Inúmeros trabalhos mostram a dificuldade de remediação de contaminantes nas águas subterrâneas. Processo dispendioso.

1 litro de petróleo pode contaminar 2.000 m3 de água

Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados.

Estudo da diversidade da microbiota da sub-superficie é muito complexa.

Doenças causadas aumentou 40 % nos últimos 10 anos

Movimentação da microbiota na sub-superfície

Microbiota da subsolo

Pesquisada na última década (dificuldades de amostragem)

Inúmeros aeróbios

oligotróficos: 103-107/gAnálise comunidades: Archaea e Bacteria (muitas BRS)

Como vivem?

Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos

Metanogênicas

(CO2) CH4

Acetogênicas

(HCO3-) acetato

Bactérias redutoras de sulfatos (BRS)

(SO4-2) sulfídrico

H2 é gerado pelo FeO+H2O H2+FeO2

Sedimentos profundos

1. Número de bactérias cultiváveis em sedimentos foi cerca de 3 ou 5

ordens de magnitude (1000 a 100.000 x) MENOR do que em solos

superficiais.  

2. Camadas areia-água apresentaram contagens e atividade mais elevadas,

do que as camadas argilosas perto da superfície. 

3. Profundidade não é necessariamente limitante ao crescimento e

atividade.

4. Estudo enumerou coliformes, redutores de sulfato e metanogênicas:

- Atividade anaeróbia medida pelo desaparecimento de lactato, formato e

acetato e produção de metano e H2S.

Sedimentos não incluem apenas anaeróbios, sendo inclusive de

100 a 100.000 vezes menos do que os aeróbios.  

- Número de coliformes baixou drasticamente com a profundidade, mas

estão presentes nos fluidos dos poços.

Microbiota da subsolo

A 3,4 Km abaixo da superfície

Possibilidades:

1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de “dieta mínima”.

2. Infiltraram as águas subterrâneas a partir de águas de superfície (maioria das bactérias que ocorrem em rochas como basalto e granito)

3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa (SLiME - Subsurface Lithautotrophic Microbial Ecosystems).

A. 1-10 microrganismos /g de rocha (10-9 /g de solo superficial rizosférico)

B. Densidade das comunidades é desconhecida:

- Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de

inviável)

- Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo

movimento de água e nutrientes)

- Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório

- Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas.

- Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície.

Subsolo

Interação

microrganismos - macrorganismos

Plantas - seiva, filosfera

Animais - sangue, dentes

Não destrutivas

Amostras

ProcessamentoObjetivo: recuperação ótima

Concentração - centrifugação e passagem por filtros

Diluição - Diluições seriadas

Problemas:Porosidade dos filtrosComposição quimica

Problemas:Composição do

diluenteTempo de misturaGrau de agitação

Microrganismos encontram-se em números inapropriados (elevados ou baixos) e em comunidades

(diversas espécies)

Enriquecimento

Enriquecimento

Seleção natural aplicada in vitro

Para microrganismos que metabolizam uma determinada substância ou que ocorrem em baixas populações na amostra.

Desenvolvidas por Beijerinck

Cultura de enriquecimento consiste na promoção de condições favoráveis especí.ficas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo.

Exemplo 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio.

Exemplo 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de C é o naftaleno.

Exemplo 3: coluna de Winogradsky, enriquecimento para quimilitotróficos.

Exemplo 4: Para isolar Bacillus formadores de esporos aquecer a cultura mista e plaquea.

Detecção dos microrganismos

Métodos:Fenotípicos - baseadas no cultivo ou avaliação de certas

propriedades do microrganismos

Moleculares - baseadas na constituição genotípica

Imunológicos - baseadas nas características imunológicas

FenotípicosMétodos baratos e não requerem

treinamento diferenciado

Amplificação de sinal:CULTIVO EM MEIO DE CULTURA

Técnicas morosas

Em alguns sistemas não são precisas

Isolamento cultura pura identificação

Diluição seriada

Plaqueamento

Amplificação sinal fenotípico

colônias

Ex: Geobacter metallireducens:

CH3COO - + 8Fe3+ + 4H2O

2HCO3- + 8Fe 2++ 9H+

Adicionar acetato como única fonte de C no meio de cultura permite a detecção de microrganismos que podem metabolizar acetato e usam oxido de ferro como fonte de energia

Cultivo

Crescer microrganismos em laboratório com base em características fenotípicas.

Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico-químicas.

Corantes vitais e Imunofluorescência

Perfil lipídico

Perfil de FAME (Fatty acids methyl ester analysis)

1. Existe grande variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos (membranas).

Perfil FAME = impressão de uma espécie

2. Usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água.

Outras técnicas fenotípicas

MARA - multiple antibiotic resistance activity

ARA - antibiotic resistance analysis

CSU - carbon source utilization

Detecção de hospedeiros de vírus

Avaliação da abundância relativa

Enumeração Biomassa Atividade

Contagem direta

Contagem indireta

Contagem direta

Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio

Fluorecência, anticorpos

Vantagens:

Não requerem separação do microrganismo.

Fornecem estimativas elevadas

Desvantagens:

Não distingue entre viáveis e não viáveis.

Não permite análises subsequentes

Lâminas para contagem direta

Contagem indireta

Contagem em placas NMP

Técnica de Diluição e plaqueamento

Diluições seriadas (resultado)

Enumeração NMP

NMP – número mais provável

Contagens indiretas

Vantagens:

-Detecção de viáveis

-Seletividade (uso de meios específicos)

Desvantagens:

- Seletividade

permite a contagem de alguns tipos

- Ausência de não cultiváveis

Avaliação da biomassa

Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade.

Expresso em g e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco

Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica.

Proteína

Peptideoglicano

Quitina

LPS

DNA

Dentre outros

Indireta

Direta Filtração

Centrifução

Pesagem

Avaliação da atividade

Fotossíntese – taxa de produção primária

Respiração - consumo de O2 ou produção de CO2

Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos

Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase

Viáveis mas não cultiváveis (VNC)

< 1% dos microrganismos podem ser cultivados no laboratório usando técnicas convencionais de cultivo. Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção.

Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.