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1
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NEUROPEPTÍDEO Y EM HIPOCAMPO DE
RATOS COM EPILEPSIA INDUZIDA PELA PILOCARPINA.
MARCELO DE PAULA ALVES DA SILVA
São Paulo
2010
2
MARCELO DE PAULA ALVES DA SILVA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE NEUROPEPTÍDEO Y EM HIPOCAMPO DE
RATOS COM EPILEPSIA INDUZIDA PELA PILOCARPINA.
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ ANTÔNIO SILVA JUNIOR.
São Paulo
2010
Dissertação apresentada à UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
3
FICHA CATALOGRAFICA
Silva, Marcelo de Paula Alves da Avaliação da expressão de neuropeptídeo y em hipocampo de ratos com epilepsia induzida pela pilocarpina. / Marcelo de Paula Alves da Silva. 2010. 63 f. Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho – UNINOVE – Ciências da Reabilitação, São Paulo, 2010. Orientador (a): Profº Dr Jose Antonio Silva Junior 1. Neuropeptídeo Y. 2. Pilocarpina e Epilepsia.
CDU 616
4
i
Dedico aos meus pais
Gilberto e Julia; meus
irmãos Paola, Nicole,
Carolie e Polarah e
sobrinhos Yam e Luan.
Eu os amo!
ii
Ao
Rabi Dr. Jose Antonio Silva Junior: Ser
humano maravilhoso, dotado de olhar
periférico, audição seletiva, palavras
edificadoras, movimento corporal elegante
e inteligência contagiante.
Minha profunda admiração e carinho.
Agradeço-te do fundo do meu coração.
DEUS te abençoe!
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Santíssima Trindade ao DEUS PAI, DEUS FILHO e ao ESPÍRITO SANTO!
O intrigante e engrandecedor nesta odisseia é perceber, a cada dia, a importância do
relacionamento na construção do novo.
A minha gratidão ao time intelectual da UNINOVE, que me estimularam ao
questionamento: Carla Malaguti, Carlos Alberto, Claudia Santos, Daniela Gonzalez, Dirceu
Costa, Edgar Vieira, João Corrêa, Jorge Nascimento, José Antônio, Kristianne Fernandes,
Luciana Sampaio, Luis Vicente, Manoela Martins, Nádia Marconi, Raquel Ferrari, Sandra
Bussadori e Simone Dal Corso. Hoje, meu ser tem um pouco de cada um.
Ao meu grande irmão Moises Silva, quando em diálogos desafiadores, sempre iluminava
o caminho. Eu te amo, irmão. Obrigado por sua contribuição!
Aos amigos Martha Manchini, Raphael Boiati, Thiago Araujo e Eduardo Santana, pela
troca de saberes.
Aos parceiros de estudos científicos do Laboratório de Biologia Celular da UNINOVE,
Tábata Oliveira, Jorge Gabriel, Dannylo Wesley, Fernanda Carvalho, Gabriela Fernanda,
Marcio Gomes, Natalia Aruelo, Marcio Parente, Regina Guimarães, Rhaissa e Rodrigo Fock.
iv
Aqui ratifico a importante relação interpessoal e parcerias construtivas no laboratório de
Fisiologia Cardiovascular da UNIFESP: Paulo Tucci, Andrey Serra, Danilo Bocalini, Ednei
Antonio, Mario Oliveira, Camila Picolo, Leslie Portes e Eduardo Carvalho. Quão excepcional
é a intervenção de vocês nas descobertas científicas.
Aos colegas do Laboratório de cirurgia experimental da UNICAMP: Carina Malaguti e o
Paolo, pouco momentos grandes trocas, obrigado.
Aos grandes colegas do laboratório de morfologia cardiovascular e genética INCOR –
USP: Marcio Chaves, Juliana, Orlando, Suzana, Gabriela e Rafael, foram muitos
aprendizados.
Aos amigos Renata Kelli, Juliana Silva e Samuel Silva, valeu!
Importante aqui deixar um singelo agradecimento a todos que me auxiliaram, no
emprestar de um livro, em auxílios administrativos e demais ações dos atores que fazem e
constroem o mundo acadêmico, muito obrigado a todos.
À Instituição de Ensino Superior Universidade Nove de Julho pela concessão de bolsa de
estudo no stricto sensu em Ciências da Reabilitação.
v
RESUMO
O neuropeptídeo Y foi descoberto na década de 80 e é constituído por 36 aminoácidos. O
objetivo deste estudo foi a avaliação da expressão do RNA mensageiro do neuropeptídeo Y
(NPY) em hipocampos de ratos epiléticos. Ratos Wistar machos foram submetidos ao modelo
de epilepsia induzido por pilocarpina. Os hipocampos foram removidos 6 h (fase aguda), 12 h
(fase aguda atrasada), 5 dias (fase silenciosa) e 60 dias (fase crônica) após o inicio do estado
epilético (SE); e dos animais que receberam a pilocarpina, mas não desenvolveram o SE
(grupo parcial). Os hipocampos coletados foram usados para expressão de RNAm específico,
usando PCR em tempo real. A expressão do RNA mensageiro do neuropeptídeo Y aumentou
no grupo parcial (1.67 ± 0.22) e na fase silenciosa (1.45 ± 0.29), quando comparada com o
grupo controle (0.36 ± 0.12). Os resultados sugerem que o neuropeptídeo Y pode atuar no
mecanismo de proteção ocorrido durante o fenômeno epilético (como anticonvulcionante).
Este peptídeo neuroativo pode estar envolvido na neuroproteção do hipocampo na epilepsia.
Palavras chaves: Neuropeptídeo Y; Pilocarpina; Epilepsia.
vi
ABSTRACT
Neuropeptide Y was discovered in the decade of 80 and consisting of 36 amino acids. The
aim of this study was to analyze the neuropeptide Y (NPY) RNAm expression in hippocampi
of epileptics rats. Male Wistar rats were submitted to the pilocarpine model of epilepsy.
Hippocampi were removed 6h (acute phase), 12h (late acute), 5d (silent) and 60d (chronic)
after status epilepticus (SE) onset, and from animals that received pilocarpine but did not
develop SE (partial group). Hippocampi collected were used to specify RNAm expression
using Real time PCR. Neuropeptide Y RNAm expression increased in the partial group
(1.67±0.22) and in the silent phase (1.45±0.29) when compared to control group (0.36±0.12).
Results suggest that neuropeptide Y (as anticonvulsant) might act in protective mechanisms
occurred during epileptic phenomena. This neuroactive peptide could be involved in
hippocampal neuroprotection in epilepsy.
Words keys: Neuropeptide Y; Pilocarpine; Epilepsy.
vii
SUMÁRIO
Lista de figuras
Lista de abreviaturas
Contextualização
1 Epilepsia ......................................................................................................... 02
2 Pilocarpina ...................................................................................................... 05
3 Neuroproteção ................................................................................................ 07
4 Neuropeptídeos .............................................................................................. 07
4.1 Neuropeptídeo Y ........................................................................................ 09
4.2 Ações neurofisiológicas do NPY ............................................................... 09
4.3 Neuropeptídeo Y e a Epilepsia.................................................................... 10
5. Objetivo ........................................................................................................ 12
6. Tradução do Estudo publicado ..................................................................... 14
7. Resultados obtidos neste estudo ................................................................... 40
7.1 Comportamento animal .............................................................................. 40
7.2 Expressão do RNAm de NPY .................................................................... 42
8. Discussão ...................................................................................................... 44
Conclusão ......................................................................................................... 47
Referências Bibliográficas.................................................................................48
Apêndice............................................................................................................56
viii
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 - Técnica da tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT –
Tomografia computadorizada com emissão de fóton)........................................ 4
Figura 2 – Imagem de localização e liberação de neuropeptídeos...................... 8
Figura 3 – Sequencia do NPY.............................................................................. 9
Figura 4 – Esquema de visualização das crises no decorrer do tempo............... 40
Figura 5 – Gráfico da expressão do RNAm do NPY ......................................... 41
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
NPY = Neuropeptídeo Y
ILK = Integrina associada a quinase
RNAm = Ácido ribonucléico mensageiro
PCR = Reação de polimerização em cadeia
SE = Status epileticus
SRSs = crises epiléticas espontâneas e recorrentes
EEG = Eletroencefalograma
SPCT = Tomografia Computadorizada Com Emissão De Fóton Único
HPLC = Cromatografia liquida de Alto Desempenho
GAPDH = Desidrogenase de Gliceraldeído 3-fosfato
Ct = ciclo Limiar
µ = micrômetro
RT = Transcrição Reversa
mM = milimol
dNTPS = Deoxynucleotidetriphosphates
kDa = kilodalton
Kb = kilobase
NMDA = N metil D-aspartato
ICV = intracérebro ventricular
AKT = proteína quinase B
CA1, 2 e 3 = corno de Amon 1, 2 e 3
PI-3 quinase = Fosfatidilinositol 3-quinase
FKHR = forkhead em rabdomiossarcoma
1
CONTEXTUALIZAÇÃO
2
1. EPILEPSIA
A epilepsia foi a primeira síndrome neurológica descrita na área da saúde. Dados atuais
relatam que a doença afeta aproximadamente 50 milhões de pessoas ao redor do mundo1. No
passado, a doença, decorrente de superstições e preconceitos, era associada ao mau ou a
DEUS. O termo epilepsia vem da palavra grega epilambanein1, que significa ataque ou
apreender. A epilepsia, assim como outros transtornos neurológicos, é exaustivamente
estudada com foco na busca da qualidade de vida da pessoa com epilepsia2.
Para denominar a epilepsia, os estudos descrevem a ocorrência de pelo menos duas crises
afebris e não sintomáticas. A etiologia da crise epilética é eclética e idiopática, decorrente de
alterações congênitas, lesões peri natais, anomalias metabólicas, distúrbios
neurodegenerativos, infecções, tumores e lesão encefálica3.
Em 1981, a Liga Internacional de Epilepsia (ILAE) publicou uma versão modificada da
Classificação Internacional de Crises Epiléticas (ICES), que continua a ser um sistema muito
útil 3,4:
I Crises parciais:
A. Parcial simples, com sinais motores, somatosensoriais, autonômicos de consciência
não danificada;
B. Parcial complexo, crises parciais simples seguidas de perda da consciência;
C. Crise parcial simples, podendo evoluir para as crises secundárias generalizadas.
3
II Crises generalizadas:
A. Ausência de crises;
B. Crises tônico-clônicas, caracterizada por rigidez muscular, contrações musculares
rítmicas e violentas e perda de consciência, causada por atividade elétrica anormal nas
células nervosas cerebrais.
Estas características são peculiares a avaliações clínicas, sendo estes eventos padrões
denominados epileptogênicos. Somando as análises, o eletro encefalograma (EEG)5, as
técnicas de neuroimagem6 e a tomografia computadorizada com emissão de fóton único
(SPCT)6 são muito importantes para diagnóstico mais acurado do foco gênico da crise.
Tais técnicas permitem a detecção do desencadeamento da excitabilidade aumentada de
uma coleção de neurônios (o início da crise), evento este denominado epileptiforme5. Os
55neurônios envolvidos na crise apresentam respostas elétricas estereotipadas e sincronizadas
chamadas de mudança paroxística da despolarização. Logo, a crise epilética tem sua origem
no desequilíbrio das descargas neurofisiológicas e eletroquímicas do sistema nervoso central,
tendo estudo eletrográfico mostrado que as origens das descargas epiléticas ocorrem na
maioria dos casos na região do hipocampo, difundindo-se para amígdala e córtex7.
Informações anteriores expressam que a epilepsia é resultante de excitabilidade e a maior
permeabilidade ao Ca2+, dessensibilização de seus canais, sendo uma doença relacionada ao
sistema colinérgico constituído do arcabouço morfofisiológico, a acetilcolina (Ach), seus
receptores nicotínicos e muscarínicos e as enzimas responsáveis por sua síntese e
degradação8.
Estas informações são produtos de pesquisas e ensaios clínicos com observações
criteriosas em pacientes com epilepsia e pesquisas com modelos experimentais, as quais são,
4
também, realizadas com fármacos de ação convulsionante, sendo um deles, a pilocarpina, que
mimetiza os eventos que ocorrem nas crises epiléticas ou período ictal.
DIEGUES; M.E. et all; Radiol Brás; 2004
Fig.01: Paciente sexo masculino 54 anos. SPECT com descargas ictais (momento da crise) temporal bilateral. Hiperfixação de radiofarmaco á direita (setas). Corte transversal (a esquerda) e coronal (a direita).
5
2. PILOCARPINA
No Brasil, regiões do Norte e Nordeste, nas florestas tropicais, cresce um arbusto do
gênero Pilocarpus. Deste arbusto, conhecida como Pilocarpus jaborandi, é extraído a
pilocarpina, um alcalóide imidazólico9, com propriedades farmacêuticas muito utilizadas
atualmente.
No sistema nervoso central a pilocarpina tem ações parassimpaticomiméticos, que excita
as estruturas inervadas por fibras colinérgicas pós-ganglionares (ação muscarínica da
acetilcolina). Estudos in vivo em roedores, com injeções agudas de pilocarpina no encéfalo
com orientações estereotáxicas e sistêmicas na região intraperitoneal, mimetizam a epilepsia
com episódios de status epilepticus (SE), produto da aguda estimulação colinérgica.
A efeito tem-se um modelo experimental, que inclui lesões semelhantes á esclerose
mesial de lobo temporal em seres humanos acometidos da epilepsia10. Esses achados foram
observados por TURSKI e colaboradores (1983), em que injeções agudas de agonistas
muscarinicos colinérgicos em ratos e camundongos produziram lesões no prosencéfalo.
Posteriormente a administração sistemática de pilocarpina, foi conduzida e resultou em
diversas alterações comportamentais indicando o SE 11,12.
A administração de pilocarpina para induzir o SE é amplamente difundido na pesquisa
experimental possibilitando a investigação da patogênese e a viabilidade de novas drogas
antiepiléticas. O modelo suscita alterações eletrográficas e comportamentais, divididos em
três períodos distintos13, 14.
6
1. Período agudo, depois da administração de pilocarpina, o animal evolui
progressivamente para o SE, o qual perdura por até vinte e quatro horas;
2. Período silencioso onde ocorre a normalização progressiva do comportamento e do
EEG e pode ter uma duração de 4 a 44 dias;
3. Período crônico, em que há o aparecimento de crises epiléticas espontâneas e
recorrentes (SRSs), sendo estas semelhantes às crises parciais complexas dos seres
humanos.
A freqüência das crises é de duas a três vezes por semana e mantém-se durante a
sobrevida do animal. Proporcionando observações clínicas, análises biomoleculares,
avaliações histológicas e fisiopatológicas, as quais são publicadas nos ambientes acadêmicos
e midiáticos que propagam as novas descobertas.
7
3. NEUROPROTEÇÃO
Estudos sugerem a ação neuroprotetora endógena do sistema nervoso central frente a
mecanismos deletérios diversos. No encéfalo, injurias subletais como hipóxia, isquemia
global e crises epiléticas de curta duração protegem células neuronais de danos letais
subseqüentes. Este fenômeno é conhecido como tolerância ou pré-condicionamento15. Em
estudos com modelo experimental, terapia eletroconvulsivante e análises gênicas através de
PCR, foi observado um aumento de níveis de neurotransmissores, neuropeptídeos,
remodelamento sináptico e neurogênese; observações estas verificadas dentre outras
estruturas encefálicas, o hipocampo16.
Atualmente, pesquisas com terapia celular tem sugerido a participação do neuropeptídeo
Y na neurogênese. Situa-se nesta ótica o trabalho que destaca as propriedades pró-
neurogênicas17 do NPY na zona subventricular do encéfalo, participando da neuroproteção e
neurogênese em mamíferos.
4. NEUROPEPTIDEOS
Os neuropeptídeos participam da comunicação das células do sistema nervoso e tendem a
modular funções sinápticas lentas18. Os neuropeptídeos diferenciam-se dos
neurotransmissores pelo tamanho, por serem responsáveis por eventos de longo prazo, terem
8
sua síntese no soma dos neurônios e serem armazenados em vesículas eletrodensas, nome este
decorrente de se mostrarem densas a microscopia eletrônica (Figura 02).
PURVES. D. et al. 2005
Fig.02: Liberação diferencial de neuropeptídeos em vesículas grandes e eletrodensas e neurotransmissores em vesículas pequenas e eletrolúcidas. Estimulação de baixa freqüência eleva a concentração de Ca2+ próximo à membrana liberando os neurotransmissores. Estimulação de alta freqüência conduz a um aumento mais difuso de Ca2+ causando a liberação tanto dos neuropeptídeos das vesículas grandes e eletrodensas, bem como dos neurotransmissores.
9
4.1. NEUROPEPTÍDEO Y:
Na década de oitenta, o pesquisador Kazuhiko Tatemoto19 publicou na Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) a sequencia completa
do neuropeptídeo Y (NPY) (Figura 03), utilizando o método de Cromatografia líquida de Alto
Desempenho (HPLC), em amostras de tecido cerebral de porco. O NPY mostrou
características homologas com o peptídeo YY (70%) e o polipeptídeo pancreático (50%);
levando-o a considerar naquele momento, que o NPY, peptídeo YY e o polipeptídeo
pancreático eram membros de uma mesma família de peptídeos.
No que tange às investigações sobre o NPY; este evento é um marco inicial.
Fig 03: Sequencia peptídica do neuropeptídeo Y.
4.2. AÇÕES NEUROFISIOLÓGICAS DO NPY
Estudos relatam a sua distribuição ubíqua no organismo e sua ação dependente de seus
receptores. Utilizando a técnica de PCR, pesquisadores mostraram a modulação do RNAm de
NPY nas células gustativas, sugerindo o papel do NPY no processo de sinalização junto ao
receptor subtipo Y1.20
Outros estudos sugerem a correlação entre NPY com a estimulação a inibição do apetite, a
obesidade e no tratamento da arterosclerose21, 22, bem como na angiogênese em reparo de
tecidos e como vasodilatador em estudos na retina23. Alguns autores sugerem a participação
1Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr36-Nh2
10
do NPY na regulação e na proliferação de precursores de células; além da diferenciação de
inter neurônios24.
Em estudos eletrofisiológicos de imunorreatividade, de imunofluorescência e microscopia
eletrônica; foi observada a expressão de NPY e seus receptores Y1 e Y2 nas células de
músculo liso, nas arteríolas da base do encéfalo, nos gânglios da raiz dorsal, na medula, nos
nervos simpáticos e no hipocampo; em especifico uma observação positiva no núcleo
arqueado 25, 26.
Também foi observada a correlação do NPY e o peptídeo leptina nos neurônios do núcleo
arqueado do hipotálamo, influenciando o peso corporal e balanço energético27.
4.3. NEUROPEPTÍDEO Y E A EPILEPSIA
Há informações na literatura científica da existência de seis receptores de NPY acoplados
a proteína G; sendo eles: Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e y628. Estudos sugerem a participação do
receptor Y2 na excitabilidade neuronal e na epilepsia. O receptor Y2 tem características
farmacológicas elevadas de afinidade com NPY e é um receptor pré-sináptico. O NPY atua na
neuromodulação de diferentes neurotransmissores e hormônios29. Somando-se a estas
evidências tem sido relatado um papel importante do NPY via interneurônios na excessiva
excitabilidade durante a epilepsia30, atuando como um anticonvulsionante.
11
OBJETIVO
12
5. OBJETIVO
Avaliar a expressão do RNA mensageiro de neuropeptídeo Y em hipocampo de ratos com
epilepsia induzida pela pilocarpina.
13
ESTUDO TRADUZIDO
14
6. ESTUDO TRADUZIDO PUBLICADO NA REVISTA “NEUROPEPTIDES”
Via de ativação da AKT e aumento da expressão do RNA mensageiro do neuropeptídeo
Y em hipocampos de ratos: implicações no bloqueio da crise.
Eduardo M.Goto a.1, Marcelo de Paula Silva b.1, Sandra R. Perosa c, Gustavo A. Argañaraz c, João B. Pesqueiro d, Esper A. Cavalheiro c, Maria G. Naffah-Mazzakoratti c, Vicente P.C. Teixeira a, Jose A. Silva Jr. b.*
a Departamento de Patologia. Universidade Federal de São Paulo. UNIFESP. Brasil. b Departamento de Ciência da Reabilitação. Universidade Nove de Julho. UNINOVE. Brasil. c Departamento de Neurocirurgia / Neurobiologia. Neurologia Experimental. UNIFESP. Brasil. d Departamento de Biofísica. UNIFESP. Brasil. * Autor Correspondente. Rua Vergueiro, 253, Liberdade, São Paulo, SP 01504-001, Brasil. Tel/fax: +55 11 33859222. Endereço email: [email protected] (J.A. Silva). 1 Igual contribuições. __________________________________________________________________________
15
RESUMO
O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de moléculas relacionadas à sobrevivência celular, tais como a AKT e a quinase ligada à integrina (ILK) Avaliou-se a ativação da via AKT no processo da epileptogênese, em epilepsia induzida por pilocarpina. Além disso, também se investigou a expressão do mRNA do neuropeptídeo Y, considerado um neuropeptídeo antiepiléptico. Ratos Wistar machos foram submetidos ao modelo pilocarpina de epilepsia. Os hipocampos foram removidos 6 h (fase aguda), 12 h (fase aguda atrasada), 5 dias (fase silenciosa) e 60 dias (fase crônica), seguidos ao inicio do estado epilético (SE); e dos animais que receberam a pilocarpina, mas não desenvolveram o SE (grupo parcial). Os hipocampos coletados foram usados para expressão de RNAm específico usando o PCR em tempo real. Ensaio de imuno-histoquímica foi empregado para localizar a distribuição de ILK no hipocampo e a técnica de Western blot, foi usada para determinar o nível de ativação da AKT. Uma diminuição no índice do RNAm de ILK foi encontrada durante o período da fase aguda (0,39 ± 0,03) e fase crônica (0,48 ± 0,06), quando comparado com o grupo controle (0,87 ± 0,10). Níveis protéicos de ILK também estavam diminuídos durante ambos os períodos. O grupo parcial mostrou aumento na expressão de ILK (0,80 ± 0,06), quando comparados com animais na fase aguda. O grupo silencioso teve RNAm de ILK e imunorreatividade similar ao grupo controle. O ensaio de Western blot mostrou um aumento na ativação AKT no período silencioso (0,52 ± 0,03) em comparação com o grupo controle (0,44 ± 0,01). A expressão do RNAm do neuropeptídeo Y aumentou no grupo parcial (1,67 ± 0,22) e na fase silenciosa (1,45 ± 0,29), quando comparada com o grupo controle (0,36 ± 0,12). Os resultados sugerem que o neuropeptídeo Y pode atuar no mecanismo de proteção ocorrido durante o fenômeno epilético (como anticonvulsivante). A expressão de ILK e ativação da AKT, estas moléculas podem estar envolvidas na neuroproteção do hipocampo na epilepsia. Palavras chaves: Quinase ligada à integrina, AKT, neuropeptídeo Y, modelo pilocarpina de epilepsia, biologia molecular.
16
1. INTRODUÇÃO
Receptores de integrinas são receptores heterodiméricos de membrana, que consistem de
receptores com canais α e β. Os receptores de integrinas podem assumir uma larga escala de
funções, além do seu papel de mediar à ligação entre o citoesqueleto e a matriz extracelular.
As integrinas podem atuar na fisiologia de células não neuronais controlando a propagação
celular, diferenciação, proliferação e sobrevivência celular (Clark e Brugge, 1995).
No sistema nervoso central, receptores de integrinas podem participar de numerosos
processos. A ativação dos receptores de integrinas em cones de crescimento, pode promover a
parada de crescimento dos neuritos e controlar sua orientação durante o desenvolvimento
(Weaver et al. 1996; Jones, 1996), enquanto a sinalização de integrinas em terminais
sinápticos pode estar envolvida em vários processos, tais como a potencialização de longo
prazo (Staubli et al., 1998).
Sethi et al. (1999) mostrou que as integrinas podem também prevenir a morte de células
não neuronais, enquanto Gary e Mattson (2001) demonstraram o mesmo comportamento em
neurônios.
Embora integrinas não tenham atividade enzimática intrínseca, elas podem ativar uma
larga escala de vias de sinalização intracelular. Depois da ativação das integrinas, há um
recrutamento de algumas moléculas de sinalização, como as quinases, para a porção
citoplasmática dos receptores de integrinas, sendo estas quinases os principais efetores na
condução da sinalização das integrinas (Yamada et al; 1995).
A quinase associada à integrina (ILK) possui peso molecular de 59 kDa, contém um
domínio de anquirina – sendo uma proteína quinase de serina e treonina, que interage com os
domínios citoplasmáticos de integrinas β 1, β 2 e β 3 (Hannigan et al., 1996). Seu transcrito de
1,8 Kb é largamente expresso em tecidos humanos, tais como a placenta, o coração, os
17
músculos esqueléticos, o cérebro, o pulmão, o fígado, os pâncreas e os rins (Chung et al.
1998; Huang et al., 1999).
ILK tem sido demonstrado como o efetor crítico da via de sinalização dependente de 3
fosfatidilinositol quinase (PI-3) abaixo da ativação com fatores de crescimento e ativação de
receptores de integrinas (Deohar et al 1999; Wu et al, 1999). A estimulação de ILK após
exposição a fatores solúveis ou fibronectina resulta na ativação da AKT (Proteína Quinase B)
e inibição de glicogênio sintetase quinase – 3 (GSK-3) (Delcomente et al., 1998; Attwell et
al.; Dedhar, 2000; Persad et al., 2000).
A via de sinalização AKT relacionada com PI-3 quinase tem mostrado estar envolvida na
diferenciação neuronal e está posicionada na cascata de ativação abaixo das integrinas (Sarner
et al, 2000) e de fatores de crescimentos, como o Fator de Crescimento Neuronal – NGF
(Kaplan e Miller, 2000). ILK é um conhecido efetor dentro das vias de sinalização da AKT e
tem sido apontado como regulador de migração e diferenciação (Ishii et al., 2001; Wu e
Deahar, 2001).
A sistemática administração de pilocarpina em roedores reproduz as principais
características da Epilepsia no Lobo Temporal (TLE) em humanos (Cavalheiro et al., 1991).
A pilocarpina é um agonista colinérgico muscarínico, que induz crises límbicas, evoluindo
para crises secundárias generalizadas, envolvendo o SE (status epilepticus), que dura até 18
horas (período agudo). O SE é seguido por um período silencioso “livre de crises” e por um
período crônico, caracterizado por crises espontâneas recorrentes (Cavalheiro et al., 1994;
Leite et al., 1990). As mudanças hipocampais seguidas ao SE incluem um aumento de
mobilização de glutamato (Cavalheiro, 1995, Costa et al., 2004), perda celular, gliose (Turski
et al., 1993) e crescimento de fibras musgosas (Mello et al., 1993).
Levando em consideração que diversos modelos de epilepsia em animais apresentam
padrões similares de morte de células do hipocampo, nós podemos presumir que essa perda
18
neuronal seletiva é uma das primeiras consequências da atividade das crises prolongadas,
geralmente mediada por excitotoxicidade induzida por glutamato em TLE (Cavalheiro et al.,
1994; Smolders et al., 1997; Khan et al., 1999; Costa et al., 2004).
Gary et al. (2003); mostraram, que AKT mediada por ativação de ILK é capaz de proteger
neurônios do hipocampo de apoptose induzida por glutamato. Considerando este efeito e que
diversos modelos de epilepsia mostram perda neuronal associado à excitotoxicidade por
glutamato (Oxbury e Whitty, 1971; Milan et al., 1993; Costa et al., 2004), nós especulamos se
ILK participa no controle da sobrevivência neuronal no modelo pilocarpina de epilepsia.
Além do mais, a estimulação dos receptores de glutamato pode estar envolvida no
desencadeamento da liberação do RNA mensageiro (RNAm) de neuropeptídeo Y (NPY)
(Vezzani e Sperk, 2004); e um forte efeito antiepiléptico do NPY foi igualmente reportado em
numerosos estudos, propondo um papel endógeno crítico ao NPY em crises regulares por
controle da excitabilidade neuronal (Vezzani et al., 1999; DePrato Primeaux et al., 2000;
Sorense et al., 2009).
Foi demonstrado em numerosos estudos, que a expressão de neuropeptídeos é
dramaticamente alterada, aumentada na maior parte, em modelos de epilepsia em animais e
isto ocorre em sub-regiões específicas da formação hipocampal (Fetissov et al., 2003).
Luton e Cavalheiro (1997) mostraram uma pronunciada imunorreatividade para NPY
localizada nas regiões terminais das fibras musgosas em animais tratados com a pilocarpina.
O NPY pode atuar como um agente antiepiléptico endógeno no hipocampo em resposta à
crise (Gruber et al., 1994).
O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do RNAm de NPY e ILK; e níveis de
ativação de AKT no hipocampo de ratos submetidos ao modelo de indução de epilepsia pela
pilocarpina.
19
2. METODOS
2.1. Procedimentos com os animais:
Ratos adultos machos Wistar (230 – 250 g. n=100) foram mantidos em condições
laboratoriais padrões, abrigados em grupos de três a quatro animais por gaiola e mantidos em
salas com controle de temperatura, umidade e ciclo de 12 horas de claro-escuro; com água e
ração disponíveis e á vontade. Os animais receberam única dose intraperitoneal de pilocarpina
(350mg/kg, Sigma, Saint Louis, MO). Em 80 ratos foi administrada uma dose de 1 mg/kg de
metilescopolamina (Sigma), via subcutânea, 30 min antes da pilocarpina, para prevenir efeitos
colinérgicos periféricos da pilocarpina. Um grupo de animais (n=14) foi morto 6 horas depois
do inicio do Status epileticus (6h SE) (Grupo agudo); e outro 12 horas depois do inicio do SE
(12h SE) (Agudo tardio, n=14). Outro grupo (n=14) foi morto 5 dias depois do inicio do SE,
período de livre de crises (Grupo silencioso). O último grupo de animais (n=14) foi morto 60
dias depois da indução do SE (Grupo crônico), período em que os animais iniciam as crises
espontâneas recorrentes. Ratos, que receberam pilocarpina, mas não desenvolveram o SE,
apresentando somente crises parciais (Grupo parcial n=14) foram mortos 6 horas depois da
injeção de pilocarpina. Animais do grupo crônico foram mortos 24 horas depois de uma crise,
durante período interictal. Nove (9) animais morreram nas primeiras 72 horas após
administração de pilocarpina. Os animais do grupo controle foram mortos 6 horas (n=7), 5
dias (n=7) e 60 dias (n=7); depois da injeção de metilescopolamina e salina. O hipocampo dos
grupos experimentais foram dissecados e utilizados para quantificação por PCR de RNAm de
ILK e NPY (n=7, por grupo); e para localização de ILK utilizando imuno-histoquímica (n=3,
por grupo); e ativação de AKT por Western blot (n=4, por grupo).
20
Os procedimentos experimentais foram aprovados pela UNIFESP respeitando todos os
requerimentos éticos. Além disto, durante o período de recuperação, os animais receberam
assistência para alimentação e hidratação, para melhorar o estado clínico geral e reduzir a
mortalidade, diminuindo o número de ratos usados.
2.2. Extração de RNA total:
Níveis de RNAm de neuropeptídeos Y e ILK foram quantificados nos grupos de animais
mencionados acima. Os animais foram mortos por decapitação, os cérebros foram extirpados
do crânio e o hipocampo foi rapidamente dissecado e congelado em gelo seco, antes do
armazenamento em - 80° C. Descongelado, o tecido foi homogeneizado em 1 ml de reagente
Trizol (Gibco BRL, Gaithesburg, MD) e o RNA total foi isolado de acordo com as
orientações do fabricante.
2.3. PCR em tempo real quantitativo:
Um micrograma de RNA Total foi utilizado para síntese de cDNA e análise de expressão
gênica por PCR em tempo real. Inicialmente, possível DNA contaminante foi removido
usando DNASE I (Invitrogen, Carisbad, CA), em uma concentração de 1 unid/µg RNA na
presença de 20 mM de Tris-HCL, pH 8,4, contendo 2 mM MgCl2, por 15 minutos a 37 °C,
seguido por incubação a 95 °C por 5 min para inativação enzimática. Então, a reação de
Transcrição Reversa (RT) foi realizada em 200 µl de reação na presença de 50 mM Tris-HCl,
pH 8,3, 3 mM MgCl2, 10 mM de dithiothreitol, 0,5 mM dNTPS, e 50 ng de primers
randômicos com 200 unidades de Moloney Murine Leukemia Reverse Transcriptase
21
(Invitrogen). As condições da reação foram: 20 °C por 10 min, 42 °C por 45 min e 95 °C por
5 min.
O produto da reação foi amplificada por PCR em tempo real em Sistema de Detecção
Sequencia 7000 (ABI Prism, Applied Biosystems, Foster City, CA) usando um Kit de reação
SYBRGreen (Applied Biosystems). As condições para ciclagem térmica foram: 50 °C por 2
min, a 95 °C por 10 min, seguidos por 40 ciclos a 95 °C por 15 seg e 60 °C por 1 min. Os
experimentos foram executados em triplicatas para cada ponto. A abundância de RNAms de
neuropeptídeos Y e ILK foram quantificados com valores relativos comparados com
referências internas, GAPDH (Gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase), na qual a abundância
foi creditada para não mudar a variação entre as condições experimentais.
Primers usados para PCR em tempo real: Neuropeptídeos Y para rato (GenBankTM
accession number NM 012614), primer senso 5’- TGGCCAGATACTACTCCGCT-3’ e
primer reverso 5’- ATGGAAGGGTCTTCAAGCCT-3’; ILK para rato (GenBankTM accession
number NM 133409), primer senso 5’- ACCCAACCCTCATCACACACT -3’ e primer
reverso 5’- GCCTCTTGCCATGTCCAAA -3’; GAPDH para rato (GenBankTM accession
number NM 017008) primer senso 5’- TGCACCACCAACTGCTTAGC -3’ e primer reverso
GCCCACGGCCATCA -3’. Um microlitro de RT foi usado para o PCR em tempo real.
Valores quantitativos de transcrição do RNAm de neuropeptídeos Y, ILK e GAPDH;
foram obtidos a partir do número de ciclos do ponto inicial, onde o aumento no sinal foi
associado com um crescimento exponencial dos produtos do PCR que começaram a ser
detectados. Curvas de melting foram geradas ao fim de cada funcionamento assegurando um
produto uniforme. O nível do gene alvo foi normalizado com a base na expressão de GAPDH
como controle endógeno de RNA.
Valores de variação ∆Ct da amostra foram determinados por subtração da média de
valores Ct alvos de genes RNAm e a média de valores Ct do controle interno para GAPDH.
22
Como não é comum usar variação ∆Ct para dados relativos devido a suas características
logarítmicas, o parâmetro 2 -∆Ct foi usado para expressar a relativa expressão de dados (Livak,
1999).
2.4 Imuno-histoquímica para ILK:
Cérebros foram fixados em solução de formalina (5%, 48 h), incluídos em parafina e
cortes coronais foram realizados. As espécies oriundos da formalina foram incluídas em
parafina, sendo as recuperações antigênicas de ILK para imunorreatividade obtida pelo
método de Shi et al, (2007) modificado. Inicialmente, os cortes (3 µm de espessura) foram
desparafinados e a peroxidase endógena foi inativada com 3 % H2O2 em solução salina por 15
min. Os cortes foram, então, incubados com 50 mM de Tris-HCl, pH 9,5, e reaquecidos em
forno de microondas a uma potencia de 700 W por 4 minutos, depois um período de 1
minutos de intervalo e por período adicional de 3 minutos de reaquecimento.
Todas as incubações seguintes foram realizadas à temperatura ambiente. Os cortes foram
tratados em microondas e colocados em tampão Tris-glicina (0,1 M glicina, pH 7,4) por 30
minutos para extinção da reação do grupo de aldeído. Os cortes então foram incubados com
20 mM de solução de fosfato de sódio, pH 7,4; 0,45 M NaCl (PBS), 0,3% Triton X-100
(Solução Triton, sigma) e 5% de solução de leite em pó sem gordura por 5 horas. Os cortes
foram incubados por 24 horas com anticorpo monoclonal primário anti-ILK (Santa Cruz
Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) diluídos em solução de bloqueio 1:100.
Protocolos experimentais em tecidos controles, no qual o anticorpo primário foi
substituído por soluções de bloqueio, foram igualmente realizadas. Os cortes foram lavados
quatro vezes em PBS e anticorpo ILK foi detectado com anti-camundongo IgG biotinilizada
(Calbiochem, Biosciences Inc., La Jolla, CA) diluída em solução de bloqueio 1:100 por 60
23
minutos. O complexo foi incubado com Kit ABC (Vectastain Elite, Burlingame, CA) e
visualizado usando 3, 3’ – diaminobenzidina (1 mg/ml em 1% H2O2). Os cortes foram
desidratados, cobertos com as lamínulas e analisados com microscopia de luz de campo claro.
Análises imuno-histoquímicas foram realizadas por dois patologistas através do método
duplo cego, que obtiveram contagens da reação de imunorreatividade para anticorpos-
antígenos. O grau das colorações foi classificado pelos seguintes critérios provisionais: 1+,
baixa marcação detectada por fotomicroscopia na x 200; 2+, moderada coloração
extensamente distribuída, detectada na x 100; ou 3+, abundante coloração prontamente
detectada na x100 (10x objetiva).
2.5 Análise por Western blot:
Para quantificação de ativação de AKT, a técnica Western blot foi executada nos
hipocampos dos animais submetidos ao modelo pilocarpina de epilepsia. Hipocampos foram
dissecados e armazenados a -80°C até o uso. Amostras foram homogeneizadas em soluções
de lise contendo: 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris – HCl, pH 7,6, 0,001M EDTA pH 8,0, 1% NP -40,
10% Glycerol, 10 µM PMSF, 1mM sódio metavanadato, 0,05M NaF; 2nM acido ocadáico
com coquetel inibidor de protease. O método de Lowry (1951) foi utilizado para determinar o
conteúdo protéico.
O homogenato foi diluído em solução de Laemmli e fervido por 5 minutos. 60 µg de
proteína foram carregados em 10% gel de poliacrilamida, separados por eletroforese, e
transferidos para a membrana de nitrocelulose por eletroblotting. O bloqueio foi executado
em 5% de leite desnatado por 2 horas em temperatura ambiente. As membranas foram
resolvidas utilizando para anticorpo policlonal Akt (Ser473) (Santa Cruz Biotecnologia, Inc.)
em TBS-T (50 mM Tris-HCl, 154 mM Nacl, pH 7,5 + 0,1% Tween 20) + 2% de leite sem
24
gordura. Depois de 12 horas de incubação em temperatura ambiente, a membrana foi lavada
em TBS-T (3x10 minutos) e incubada por 2 horas em imunoglobulina biotilada anti-coelho
(Vector Laboratorios, Inc., Burlingame, CA), diluído 1:200 em TBS-T + 2% de leite sem
gordura. As membranas foram lavadas em TBS-T (3x10 minutos) e incubados por 1 hora em
peroxidase-estreptavidina (Vector Laboratórios, Inc.). Após lavagens, reagentes de realce de
quimioluminescência foram aplicados nas membranas (ECL, Amersham Biosciences,
Pittsburgh, PA) as quais foram expostas a uma película de raio X (Amersham Biociência) e
quantificadas por análises das reações de peroxidadese-estreptavidina. Equivalente
carregamento protéico foi mostrado por stripping e ressondagem da membrana com anticorpo
anti-GAPDH como padrão interno (1:2000, Proteimax Biotecnologia Ltda., Cotia Brasil).
2.6 Análise Estatística:
Níveis de expressão RNAm de ILK e neuropeptídeo Y e ativação da AKT durante
diferentes fases do modelo experimental foram comparados usando ANOVA uma-via seguido
por Teste-t. Dados apresentados como media ± S.E.M.; p < 0,05 foi considerado como
significante.
25
3. RESULTADOS:
3.1 Comportamento Animal:
Injeções de pilocarpina causaram, inicialmente, acinesia, vacilação atáxica e tremor,
automatismo mastigatório com mioclonia de músculos faciais e agitações tipo cão molhado,
persistindo por 10 -15 minutos. Como relatado anteriormente (Turski et al., 1984; Cavalheiro
et al., 1991), estas alterações comportamentais progridem para crises do sistema límbico
motor que duraram de 45 a 60 minutos, evoluindo, então, para SE em 75% dos ratos Wistar.
Os remanescentes 25% dos ratos restantes retornaram progressivamente a um
comportamento normal após 3-5 horas. SE persistindo por 12 horas sem remissão.
Aproximadamente 30% dos ratos com SE morreram durante este período. O padrão normal
para comportamento retornou progressivamente, apesar de alguma resposta agressiva à
manipulação. Durante 14 dias, não foram observados sinais de atividade epiléptica no
comportamento, caracterizando o período silencioso. Crises espontâneas recorrentes
começaram a ser observadas com uma frequência de 3 a 4 vezes por semana, e cada crise
durou em média 50 – 60 segundos.
26
3.2 Analise da expressão do RNAm de ILK:
A expressão de RNAm de ILK diminuiu em 55% no grupo de ratos que entraram em SE 6
horas, quando comparada com o grupo controle (p=0,0040), como visto na figura 1. Seguidos
5 dias (grupo silencioso), a expressão retornou a níveis normais, e depois de 2 meses (grupo
crônico), a expressão RNAm de ILK apresentou diminuição de 45% quando comparada com
o grupo controle (p=0,0154) (figura 1). A expressão RNAm de ILK dos grupo agudo e grupo
crônico, quando comparada com o grupo silencioso foi significativamente diferente
(p=0,0017 e p=0,0073, respectivamente).
Nós procuramos determinar se a expressão RNAm de ILK variava os níveis nos estágios
iniciais da epileptogênese, e nós encontramos um aumento no grupo agudo tardio (12 horas
do SE), mas não foi estatisticamente significante (figura 1). Animais, que apresentaram
somente crise parcial, mostraram altos níveis de RNAm de ILK, quando comparada com o
grupo agudo (p=0,0006), sem diferença em comparação com o grupo controle (figura 1).
Fig.1. Níveis de expressão RNAm de ILK no hipocampo dos ratos submetidos ao modelo de
indução de epilepsia por pilocarpina por ensaio de PCR em tempo real. Todos os dados
representam uma relativa quantificação para expressão de nível de GAPDH para cada
amostra. A média dos dados ± SEM. (n=7 por grupo) (*p=0,05, agudo – 6h e crônico versus
Controle Agudo-6h Agudo-12h Silencioso Crônico Parcial
27
controle; &p < 0,05, agudo – 6h e crônico versus silencioso #p < 0,05, agudo - 6h versus
parcial).
(Fig.1). Animais apresentaram somente crise parcial, mostrada com níveis altos de RNAm
ILK, quando comparada com o grupo agudo (p=0,0006), sem diferença em comparação com
o grupo controle (Fig.1).
3.3 Imuno-histoquímica de ILK no hipocampo:
A análise imuno-histoquímica mostrou padrões de distribuição similares de ILK em toda
parte da formação hipocampal de todos os grupos estudados (Figuras 2-4). Regiões de
interesse tais como CA1, CA3 e hilus, assim como as células granulares vindas do giro
denteado, foram marcadas. Os grupos controle (A) e silencioso (C) mostraram aumento da
imunorreatividade em toda formação hipocampal, quando comparados com os grupos agudo
(B) e crônico (D) (Figuras 2-4). O grupo parcial apresentou distribuição similar para ILK
comparada com o grupo controle (dados não mostrados). Todos os dados de
imunorreatividade são apresentados na Tabela 1.
28
Fig. 2. Distribuição de ILK na região de CA1 do hipocampo dos grupos experimentais.
Fotomicrografias da região CA1 do hipocampo processado para imuno-histoquímica de ILK:
(A) grupo controle; (B) grupo agudo 6 horas SE; (C) grupo silencioso e (D) grupo crônico –
barra de escala: 0,02 mm.
Fig. 3. Distribuição de ILK na região de CA3 do hipocampo dos grupos experimentais.
Subtítulos a ilustração fotomicrografias da região CA3 do hipocampo processada para imuno-
histoquímica de ILK: (A) grupo controle; (B) grupo agudo 6 horas SE; (C) grupo silencioso e
(D) grupo crônico – barra de escala: 0,03 mm.
29
Fig. 4. Distribuição de ILK na região do hilo no hipocampo dos grupos experimentais.
Subtítulos a ilustração fotomicrografias da região do hilo no hipocampo processada para
imuno-histoquímica de ILK: (A) grupo controle; (B) grupo agudo 6 horas SE; (C) grupo
silencioso e (D) grupo crônico – barra de escala: 0,02 mm.
Tabela 1 – Imunoreatividade para ILK na formação hipocampal:
Formação
Hipocampal
Grupo
Controle
Grupo
Agudo 6 h
Grupo
Silencioso
Grupo
Crônico
Grupo
Parcial
Geral +++ + ++ + ++
CA1 ++ + +++ ++ ++
CA3 +++ + +++ ++ ++
HILO ++ + +++ ++ ++
Intensidade da marcação: + baixa; ++ moderada; +++ intensa.
30
3.4 Níveis de ativação da AKT:
Utilizando extratos proteicos do hipocampo dos grupos controle, agudo, silencioso e
crônico, o anticorpo fosfo Akt (Ser 473) marcou uma proteína de 60 kDa. Análise
desintométrica e normalização (com iguais quantidades de carregamento das proteínas) de
imunorreatividade mostrou que a Akt fosforilada foi mais expresse no grupo silencioso
(0,5194 ± 0,300), quando comparada com o grupo controle (0,4377 ± 0,0129, p=0,0461)
(Figura 5).
Fig. 5. Análise de Western blot para Akt fosforilada (ativada) no hipocampo dos grupos
experimentais. (A) Representatividade da analise de Western Blot. Linhas: (CT) Grupo
Controle; (AC) Grupo Agudo 6 h SE; (SL) Grupo Silencioso; (CHR) Grupo Crônico (n=4 por
grupo). (B) Análise densitométrica e normalização do sinal de imunoreatividade para Akt
fosforilada. – O.D. – Densidade Óptica (§ p < 0,05).
31
3.5 Expressão RNAm do Neuropeptídeo Y:
Uma maior expressão de RNAm do neuropeptídeo Y foi encontrada na fase silenciosa
(1,45 ± 0,29), onde as crises não são observadas e no grupo que recebeu pilocarpina mas não
desenvolveu SE (1,67 ± 0,22, grupo parcial) quando comparado com o grupo controle (0,36 ±
0,12, Figura 6). Animais do grupo agudo e crônico não apresentaram diferenças significativas
em relação ao grupo controle (0,23 ± 0,07 e 0,19 ± 0,09, respectivamente). Nenhuma
diferença significativa foi observada na expressão de RNA mensageiro de NPY entre o grupo
agudo 6 e 12 horas (agudo tardio) seguidas à injeção de pilocarpina (Figura 6).
Fig. 6. Níveis de expressão de RNAm do neuropeptídeo Y no hipocampo dos ratos
submetidos ao modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina por ensaio de PCR em tempo
real. Todos os dados representam a quantificação relativa para níveis da expressão de
GAPDH de cada amostra. Media dos dados SEM. (n=7 por grupo) (Grupos * p < 0,05,
Silencioso vs Controle, Agudo e Crônico; # p < 0,05, Parcial vs Controle, Agudo e Crônico).
Controle Agudo-6h Agudo-12h Silencioso Crônico Parcial
32
4. DISCUSSÃO:
Nosso grupo tem empregado muitos esforços na identificação de genes específicos que
participam do processo de epileptogênese (Argañaraz et al., 2004; Perosa et al., 2007; Silva Jr
et al., 2008), considerando que esta seja a primeira etapa para adquirir observações
terapêuticas mais exatas, conduzindo a tratamento mais específicos para aqueles que sofrem
desta síndrome.
A ILK é uma proteína quinase serina/treonina descoberta há mais de uma década
(Hannigan et al., 1996). Esta molécula tem funções enzimáticas e também promove interações
entre o citoesqueleto e a matriz extracelular. Esta quinase apresenta uma grande variedade de
funções, como sua participação na proliferação celular, diferenciação e sobrevivência
(Delcommene et al., 1998; Dedhar et al., 1999; Dedhar, 2000), entre outras. Sabe-se, que a
ILK é uma das principais ativadoras da proteína quinase B ou AKT, uma molécula que é
essencial no ciclo de vida e morte das células. Esta é a principal razão que a ILK se
transformou num possível alvo terapêutico para vários tipos de câncer (Koul et al., 2005;
Troussard et al., 2006), isquemia cardíaca (Bock-Marquette et al., 2004) e glomerulonefrites
(Kagami et al, 2006).
Nossos resultados mostraram, que a síntese do RNAm ILK está alterada em diferentes
fases do status epileticus induzido por pilocarpina em ratos. Esta observação pode ser de
grande valor no desenvolvimento do mecanismo fisiopatológico da epilepsia, uma vez que a
ILK foi descrita como um regulador chave no mecanismo de sobrevivência celular (Atwell et
al., 2000; Persad et al., 2000) e diversos estudos tem demonstrado uma relação entre a perda
neuronal no hipocampo e o processo de epileptogênese (Meldrum e Burton, 1992; Mello et
al., 1993; Fuerst et al., 2003).
33
Nós também mostramos que os níveis de RNAm ILK foi significativamente diminuídos
nos períodos agudo e crônico (Figura 1), sugerindo que a síntese da enzima possa estar inibida
no hipocampo dos ratos Wistar. A expressão da proteína ILK está de acordo com os níveis de
RNAm (Figuras 2-4).
Uma vez que o declínio da expressão da ILK pode ser observado exatamente no período
da crise, pode-se especular que a inibição de sua síntese poderia ser uma etapa de uma cadeia
de eventos que culmina na morte neuronal induzida pela crise. Este fato pode ser uma
evidência da importância da sinalização ativada da ILK no mecanismo de sobrevivência
neuronal neste modelo experimental.
Análise da Akt fosforilada mostrou que no período silencioso foi observado um aumento
da ativação desta proteína (Figura 5), quando os níveis de RNAm de ILK estavam igualmente
elevados (Figura 1). Como observado na fase crônica, nós poderíamos especular que com uma
menor quantidade de ILK nos neurônios hipocampais, sua atividade enzimática manteria os
níveis de atividade da Akt. Este tipo de compensação é crucial para a biologia celular. Mesmo
sendo uma das principais ativadoras da Akt, a ILK não é a única quinase com esta função, e,
até o momento, nós não podemos eliminar a hipótese que outras moléculas participem deste
complexo mecanismo de sobrevivência celular.
Aparentemente, esta ativação alterada da Akt pode estar relacionada com o mecanismo de
resposta ao dano celular induzido pela crise no período agudo, na tentativa de diminuir a
extensão da lesão e o número de estruturas cerebrais envolvidas. Kim et al, (2002) mostraram
resultados similares, demonstrando que a ativação da Akt é necessária para a prevenção da
excitotocidade e morte celular induzida pelo acido caínico.
Além disso, Henshall et al, (2002) observaram que a administração de um inibidor de
fosfatidilinositol 3-quinase (LY294002), provavelmente um ativador da Akt, agravou a
34
apoptose cortical depois de crises induzidas pelo acido caínico, enquanto o córtex ileso exibiu
fosforilação aumentada da Akt.
A relação entre Akt e Bim, um poderoso pró-apoptótico membro da família Blc-2, foi
estudada por Shinoda et al, em 2004, em córtex de ratos submetidos ao acido caínico como
modelo de indução a epilepsia. O controle da expressão de Bim foi realizado por fatores
transcricionais vindo da família FKHR (forkhead in rhabdomyosarcoma) e estes, são inibidos
por sua vez diretamente pela fosforilação da Akt. Estes autores observaram que o papel da
Akt foi promove a sobrevivência neuronal por interações FKHR-Bim, que foram evidentes no
córtex dos animais submetidos ao modelo do acido caínico. O bloqueio da atividade de Akt
resultou no aumento nos níveis de ativação FKHR, conduzindo a uma expressão mais elevada
do Bim. Estes eventos são seguidos por um aumento significativo de fragmentação de DNA,
provavelmente por intensa morte apoptótica celular mediada por Bim, evidenciando a
importância da Akt na sobrevivência neuronal e, consequentemente, o papel de seu ativador, a
ILK.
Ainda considerando o modelo de epilepsia induzido pelo acido caínico; o efeito
neuroprotetor atribuído a melatonina foi a ativação da via de sobrevivência da Akt/PKB. Lee
et al, (2006) mostraram, que administração de melatonina uma hora antes da injeção
intracérebro ventricular de acido caínico é capaz de diminuir a morte de neurônios piramidais
vindo da região CA3 do hipocampo, também através de ativação da Akt.
Soriano et al, (2006) mostraram uma neuroproteção relacionada com baixa ativação do
receptor de NMDA. Este receptor tem suas ações fisiológicas mediadas principalmente por
Akt. Estes resultados corroboram com Chong et al, (2006), os quais mostraram, em um
modelo de danos celulares por estresse oxidativo, que atividade neuroprotetora é relacionada à
ativação da via Akt.
35
Mills et al, (2003) mostraram uma participação in vitro da ILK nos fenômenos de
crescimento axonal, estimulado pelo fator de crescimento neuronal (NGF). O NGF participa
de várias funções celulares tais como a diferenciação, sobrevivência, e crescimento axonal e
suas ações são mediadas principalmente pela via da PI-3 quinase. Estes autores verificaram
que ativação de ILK após estimulação por NGF, foi seguida de ativação da Akt. Após inibição
de ILK, o NGF não ativou Akt, demonstrando que ILK é a principal molécula na sinalização
desta neurotrofina.
Interessantemente, em nosso estudo, os animais que receberam a pilocarpina, mas não
desenvolveram o SE (grupo parcial) apresentaram altos níveis de expressão RNAm de ILK
em hipocampos. Há pelo menos duas interpretações para este resultado: primeiro é que a
pilocarpina, por si só, não seria responsável pela diminuição da expressão de RNAm da ILK e
as crises seriam a chave para esta observação. A outra hipótese é que os animais do grupo
parcial que não entraram em SE poderia estar associada a uma falta de inibição da via ILK-
Akt, conduzindo-nos à hipótese que esta via poderia ser um dos mecanismos da progressão da
epilepsia.
Além disso, podemos supor, que a fase crônica de recorrentes crises periódicas poderia
estar associada a um alto nível de expressão de ILK e, assim a uma ativação elevada da Akt.
A Akt ativada poderia exercer suas funções sobre o FKHR, conduzindo a diminuição da
expressão de Bim, entre outros efeitos. Levando em consideração que Bim pode ser o maior
responsável pelas mortes neuronais seguidas a crises, este cenário representaria uma resposta
neuronal contraria à estimulação deletéria constante, tornando-se, desta maneira menos
vulnerável a estes eventos.
Na epilepsia, a hiperatividade que causa as crises epiléticas está associada ao aumento da
sinalização glutamatérgica (Cavalheiro et al., 1994; Costa et al., 2004). Este aumento na
liberação do glutamato é responsável pela morte neuronal por excitotocidade (Meldrum et al.,
36
1991). Gary et al. (2003) encontraram in vitro, que a via de ativação da ILK é capaz de
proteger os neurônios hipocampais da morte celular induzida por glutamato.
O neuropeptídeo Y (NPY) é um peptídeo com 36 aminoácidos, primeiramente
caracterizado e isolado de extratos de cérebro de suíno. Diversos estudos têm estabelecido a
distribuição difusa do NPY no cérebro e nos neurônios simpáticos. No cérebro de rato, uma
alta densidade de imunoreatividade de corpos celulares e fibras são observadas no córtex,
núcleo caudado, putamen e hipocampo (Danger, 1990; Noé et al., 2007). Uma elevada
expressão de NPY no hipocampo foi relatada em vários modelos de crises, incluindo o SE,
abrasamento e crises determinadas geneticamente. Esta elevada expressão consiste no
aumento do nível de RNAm e peptídeos relacionados nas células granulares e nas fibras
musgosas e em interneurônios hilares (Vezzani et al., 1999; Vezzani e Sperk, 2004).
Alterações induzidas por crises na expressão do NPY são acompanhadas por modificações em
seus subtipos de receptores, o que sugere que a neurotransmissão mediada por NPY encontra-
se alterada no tecido epilético (Verzzani e Sperk, 2004). Nosso estudo corrobora esta hipótese
uma vez que observamos que nos períodos em que as crises já não eram observadas ou que
havia ausência das crises, o RNAm do neuropeptídeo Y foi fortemente detectado (Figura 6).
O aumento da expressão de RNAm de ILK no período silencioso (Figura 1) sugere que
ILK pode estar participando do remodelamento no hipocampo seguida ao SE. É conhecido
que no período silencioso acontece uma alta reorganização sináptica, associada com o
fenômeno de crescimento axonal. A expressão de neuropeptídeo Y elevada nesta fase pode
ser uma resposta aos danos ocorridos na fase prévia ao SE.
Camundongos deficientes para NPY são mais propensos à crises (Erickson et al., 1996;
Baraban et al., 1997), sendo que os ratos com superexpressão de NPY diminuem a
susceptibilidade às crise e a epileptogênese (Vezzani et al., 2002). Expresso em um
subconjunto de interneurônios GABAérgicos, o NPY é preferencialmente liberado em
37
frequência alta de disparos neuronais (Thureson-Klein et al., 1986; Kits e Mansvelder, 2000).
O NPY pode modular a inibição mediado por GABA (Sun et al., 2003) e excitação mediado
por glutamato (Haas et al., 1987) na transmissão sináptica. No hipocampo, NPY apresenta
efeito inibitório na liberação pré-sináptica do glutamato e pode reduzir o influxo de Ca2+ nos
terminais axonais dos principais neurônios glutamatérgicos (Colmers et al., 1988),
diminuindo a magnitude das respostas excitatórias evocadas (Colmers et al., 1985).
Os dados vindo deste estudo mostram menores níveis de RNAm de ILK e distribuição
hipocampal desta quinase nos períodos agudos prévio e crônicos de epilepsia induzido por
pilocarpina, quando crises são frequentes. Além disso, um aumento da expressão do RNAm
de neuropeptídeo Y e ativação da Akt foram observados no período quando as crises já não
foram observadas. Estas evidências fortemente sugerem que a via ILK-Akt e o neuropeptídeo
Y contribuem para o estabelecimento do mecanismo de sobrevivência celular, tornando um
possível alvo terapêutico no tratamento da epilepsia.
38
AGRADECIMENTOS
Nós agradecemos à Hilda Silva Reis pela assistência técnica e Dr Henrique Costa pela
captura de imagens. Este trabalho foi assistido pela CNPq, Fapesp, PRONEX, CAPES e
UNINOVE.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
No apêndice junto ao estudo em inglês.
39
RESULTADOS OBTIDOS NESTE ESTUDO
40
7. RESULTADOS OBTIDOS NESTE ESTUDO
7.1 COMPORTAMENTOS ANIMAL
Injeções de pilocarpina causaram, inicialmente, acinesia, ataxia e tremor, automatismo
mastigatório com mioclonia de músculos faciais e agitações, semelhante a um cão molhado,
persistindo por 10 -15 minutos. Como observado em estudos anteriores 32,33, estas alterações
comportamentais progrediram para crises do sistema límbico motor que duraram de 45 a 60
minutos, evoluindo, então, para SE em 75% dos ratos Wistar. Os remanescentes 25% dos
ratos retornaram progressivamente a um comportamento normal depois de 3-5 horas. SE
persistindo por 12 horas sem remissão.
Aproximadamente 30% dos ratos com SE morreram durante este período. O padrão
normal para comportamento retornou progressivamente ao normal, apesar de alguma resposta
agressiva à manipulação. Durante 14 dias, não foram observados sinais epiléticos no
comportamento, caracterizando o período silencioso. Então, crises espontâneas recorrentes
começaram a ser observadas com uma freqüência de 3 a 4 vezes por semana, e cada crise
durou em média 50 – 60 segundos (figura 4), configurando o período crônico.
41
Fig.04: Esquema de visualização das ações neurofisiológica (A.N.) no decorrer do tempo,
onde se verifica o período do Status Epiléticos (SE) e das Crises Recorrentes Espontâneas
(SRSs). Construção a partir das informações dos estudos 32,33.
A.N.
Tempo
1 h 5 h 12 h 14 dias
SE SRSs
42
7.2. EXPRESSÃO de RNAm de NEUROPEPTÍDEO Y
Um aumento de RNAm de neuropeptídeo Y foi encontrado na fase silenciosa (1,45 ±
0,29), onde as crises não foram observadas e no grupo que recebeu pilocarpina mas não
entrou no SE (1,67 ± 0,22, grupo parcial) quando comparado com o grupo controle (0,36 ±
0,12, Figura 5). Animais do grupo agudo e crônico não apresentaram diferenças significativas
em relação ao grupo controle (0,23 ± 0,07 e 0,19 ± 0,09, respectivamente). Nenhuma
diferença significativa foi observada na expressão NPY entre o grupo agudo 6 e 12 horas
(agudo tardio) seguidas à injeção de pilocarpina. (Figura 5).
Fig. 05: Níveis de expressão RNAm de neuropeptídeo Y no hipocampo dos ratos submetidos
ao modelo de epilepsia induzida pela pilocarpina por ensaio de PCR em tempo real . Todos os
dados representam a quantificação relativa para níveis da expressão de GAPDH de cada
amostra. Media dos dados SEM. (n=7 por grupo) (Grupos * p < 0,05, Silencioso vs Controle,
Agudo e Crônico; # p < 0,05, Parcial vs Controle, Agudo e Crônico).
Controle Agudo-6h Agudo-12h Silencioso Crônico Parcial
43
DISCUSSÃO
44
8. DISCUSSÃO
Este estudo quantificou o RNAm do NPY, no intuito de interagir às avaliações da
expressão do RNAm da ILK, que é uma proteína quinase serina/treonina34, que tem funções
enzimáticas e promove interações entre o citoesqueleto e a matriz extracelular, bem como
participa na proliferação celular, diferenciação e sobrevivência35,36,37.
Sabe-se, que a ILK é uma das principais ativadoras da proteína quinase B ou AKT, uma
molécula essencial no ciclo de vida e morte das células, Como uma das principais ativadoras
da Akt, a ILK não é a única quinase com esta função, e, tanto quanto longe este estudo vá, nós
não podemos eliminar a hipótese que outras moléculas participem deste complexo mecanismo
de sobrevivência celular, contribuindo ao processo de neuroproteção.
Na epilepsia, a hiperatividade que causa as crises epiléticas está associada ao aumento da
sinalização glutamatérgica38, 39. Este aumento na liberação do glutamato é responsável pela
morte neuronal por excitotocidade 40, 41, encontraram in vitro, que a via de ativação da ILK é
capaz de proteger os neurônios hipocampais da morte celular induzida por glutamato.
O neuropeptídeo Y (NPY) é um peptídeo com 36 aminoácidos, primeiramente
caracterizado e isolado de extratos de cérebro de suíno. Diversos estudos têm estabelecido a
distribuição difusa do NPY no cérebro e nos neurônios simpáticos. No cérebro de rato, uma
alta densidade de imunoreatividade de corpos celulares e fibras são observadas no córtex,
núcleo caudado, putamen e hipocampo 42, 43. Uma elevada expressão de NPY no hipocampo
foi relatada em vários modelos de crises, incluindo o SE, abrasamento e crises determinadas
geneticamente. Esta elevada expressão consiste no aumento do nível de RNAm e peptídeos
relacionados nas células granulares e nas fibras musgosas e em interneurônios hilares 44, 45.
Alterações induzidas por crises na expressão do NPY são acompanhadas por modificações em
seus subtipos de receptores, o que sugere que a neurotransmissão mediada por NPY encontra-
45
se alterada no tecido epilético 45. Nosso estudo corrobora esta hipótese uma vez que
observamos que nos períodos em que as crises já não eram observadas ou que havia ausência
das crises, o RNAm do neuropeptídeo Y foi fortemente detectado (Figura 5).
O aumento da expressão de RNAm de ILK no período silencioso sugere que ILK pode
estar participando do remodelamento no hipocampo seguida ao SE. É conhecido que no
período silencioso acontece uma alta reorganização sináptica, associada com o fenômeno de
crescimento axonal. A expressão de neuropeptídeo Y elevada nesta fase pode ser uma
resposta aos danos ocorridos na fase prévia ao SE.
Camundongos deficientes para NPY são mais propensos à crises 46, 47, sendo que os ratos
com superexpressão de NPY diminuem a susceptibilidade às crise e a epileptogênese 48.
Expresso em um subconjunto de interneurônios GABAérgicos, o NPY é preferencialmente
liberado em frequência alta de disparos neuronais 49, 50. O NPY pode modular a inibição
mediado por GABA 51 e excitação mediado por glutamato 52 na transmissão sináptica. No
hipocampo, NPY apresenta efeito inibitório na liberação pré-sináptica do glutamato e pode
reduzir o influxo de Ca2+ nos terminais axonais dos principais neurônios glutamatérgicos 53,
diminuindo a magnitude das respostas excitatórias evocadas 54.
Os dados vindo deste estudo mostram menores níveis de RNAm de ILK e distribuição
hipocampal desta quinase nos períodos agudos prévio e crônicos de epilepsia induzido por
pilocarpina, quando crises são frequentes. Além disso, um aumento da expressão do RNAm
de neuropeptídeo Y e ativação da Akt foram observados no período quando as crises já não
foram observadas.
46
CONCLUSÃO
47
CONCLUSÃO
Estas evidências fortemente sugerem que a via ILK-Akt e o neuropeptídeo Y contribuem
para o estabelecimento do mecanismo de sobrevivência celular, tornando um possível alvo
terapêutico no tratamento da epilepsia.
48
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