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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
Avaliação da Fotobiomodulação a Laser no Reparo
Tecidual em Ratos Submetidos à Dieta Hiperlipídica
VIRGÍNIA DIAS UZÊDA E SILVA
Salvador 2014
VIRGÍNIA DIAS UZÊDA E SILVA
Avaliação da Fotobiomodulação a Laser no Reparo
Tecidual em Ratos Submetidos à Dieta Hiperlipídica
Dissertação apresentada ao Programa de Pós - graduação em Odontologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Odontologia e Saúde com área de concentração em Diagnóstico Oral. Orientador(a): Profa Dra Luciana Maria Pedreira Ramalho Co-orientador(a): Profa Dra Tania Tavares Rodriguez
Salvador
2014
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária de Saúde, SIBI - UFBA.
S586 Silva, Virgínia Dias Uzêda e
Avaliação da fotobiomodulação a laser no reparo tecidual
em ratos submetidos à dieta hiperlipídica/ Virgínia Dias Uzêda e
Silva. – Salvador, 2014.
80 f.
Orientadora: Profª. Drª Luciana Maria Pedreira Ramalho
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal da Bahia.
Faculdade de Odontologia, 2014.
1. Dieta Hiperlipídica. 2. Reparo Tecidual. 3. Laserterapia.
I. Ramalho, Luciana Maria Pedreira. II. Universidade Federal
da Bahia. III. Título.
CDU 613.2
DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a toda minha família e entes queridos, por todo o carinho, apoio
e atenção. Em especial, a todas as mulheres que dela fazem parte; fortes,
batalhadoras, vencedoras. Sempre foram exemplos na minha vida e me fazem ver, a
cada dia, que a força que temos é maior do que qualquer obstáculo que nos possa
ser imposto. As minhas vitórias são mais do que minhas, SÃO NOSSAS!
"Não há nada mais gratificante do que dirigir a própria vida.
Nossas atitudes escrevem nosso destino. Nós somos responsáveis pela vida que
temos... A aprendizagem é nossa e ninguém poderá fazê-la por nós, assim como
nós não poderemos fazer pelos outros. Quanto mais depressa aprendermos isso,
menos sofreremos."
Zibia Gasparetto
AGRADECIMENTOS
São tantos, tão importantes, tão especiais...
À Deus, em primeiro lugar, por ter me guiado pelos caminhos certos, nas horas
certas e me tornar merecedora de tantas vitórias. Com a tua ajuda mais uma vez
venci, mas não cheguei ao fim, e sim ao início de uma longa caminhada.
À minha mãe, Georgina, o meu exemplo de vida, pelo seu apoio, esforço, dedicação
e amor incondicional, SEMPRE. Obrigada por acreditar nos meus sonhos e junto
comigo torná-los realidade.
À meu pai, Walter, obrigada pelo seu amor e por sempre tentar fazer de tudo para
que eu realizasse os meus sonhos.
Aos meus queridos irmãos, Thaise e Vitor, pelos momentos de risadas, alegrias e
companheirismo durante esta vida.
Ao meu sobrinho, Guilherme, acompanhar seu crescimento tornam meus dias bem
mais divertidos.
Aos meus eternos amigos, tios, avós e primos, em especial vovó Valdelina, vovó
Antonieta, tio Waldeck, tia Rita e tia Geocélia, obrigada por vibrarem tanto com as
minhas conquistas. Vocês são o alicerce do meu eterno encanto pela vida.
À Profª. Drª Luciana Ramalho, minha orientadora, agradeço pela confiança
depositada no meu trabalho, pelas palavras de apoio, incentivo e por percorrer
comigo estes dois anos. Espero que nossos caminhos continuem seguindo juntos
pelas nossas jornadas.
À Profª. Drª Tania Rodriguez, minha orientadora, segurou em minhas mãos com
todo o carinho e paciência que uma aprendiz necessita para desenvolver novas
habilidades. Sua ajuda e contribuição na execução, principalmente experimental, do
meu projeto foram imprescindíveis. Espero que ainda possamos compartilhar muitas
experiências.
À Profª. Drª Zeca Ramalho, que mesmo na correria de suas longas atividades,
sempre se dipôs a me ajudar e a contribuir para o melhoramento do meu trabalho.
Ao Profº. Drº. Jean Nunes, que contribuiu diretamente nas minhas atividades do
projeto, obrigada por sempre me ouvir e dar contribuições valiosas ao meu trabalho.
Às Profª. Drª. Flávia Caló e Luciana Casais, que direta e indiretamente
contribuiram e me apoiaram neste processo.
Aos meus Mestres de ontem e de hoje, espero que tudo que aprendi com vocês
perdure para todo sempre, pois foi indispensável ao meu amadurecimento
profissional. Obrigada por me ensinarem a amar a arte de ensinar.
Aos colegas do mestrado, Ana Cristina Sobreira, Anderson Maciel, Anderson
Carvalho, Daniel Rodrigues, José Augusto Tuy, Ernesto Neto, Inêssa Barbosa,
Katia Gally, Lia Porto, Livia Vitória, Patricia Keller, Mércia Sacramento, Manuela
Mello, Paula Paes, Poliana Santos, Thais Amorim, Wolf Maia, por estarem ao
meu lado nestes últimos dois anos e dividir cada momento de aprendizagem em sala
de aula. Com toda certeza nunca serão esquecidos.
Às amigas Taíse Santos e Rebeca Vasconcelos, obrigada por compartilharem
tantos momentos comigo, nas alegrias e nas dificuldades. A amizade e apoio de
vocês foram essenciais, e é por isso que na vida não apenas fazemos amigos, e sim
os reconhecemos.
À Gardênia Paraguassú, pelo grande auxílio na realização da etapa experimental
da minha pesquisa.
Às bolsistas de Iniciação científica, Isadora Rios e Ísis Franco, agradeço pela
enorme dedicação que depositaram à pesquisa e pelos momentos de companhia e
descontração, sem dúvidas vocês foram o meu braço direito. Não posso esquecer
de Ilana Castro e Alana Oliveira, obrigada por nos auxiliarem com o cuidado e
manutenção dos animais no laboratório.
À Stª Sueli Paixão, pela paciência, apoio e colaboração em todos os momentos, ao
Srº Edilson Amancio e a Srª Miriam Moraes, pela disponibilidade e cuidado nas
confecções das minhas lâminas.
À Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pelo
apoio e investimento na minha qualificação profissional.
Ao Instituto de Ciências da Saúde da UFBA, por ceder o espaço para realização
do meu projeto e onde passei boa parte da minha pesquisa.
À Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, por ter se
tornado a minha casa.
Enfim, agradeço a todos, pois cada gesto, mesmo que parecendo pequeno, me
ajudou a chegar aqui com força e esperança. Aprendi que apoio é o que realmente
importa e é por isso que: Ninguém Vence Sozinho!
SUMÁRIO
LISTA DE QUADROS E TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO 17 2. REVISÃO DE LITERATURA 19 2.1 SOBREPESO E OBESIDADE 19 2.1.1 TECIDO ADIPOSO 21 2.2 REPARO TECIDUAL 23 2.2.1 INFLAMAÇÃO 24 2.2.2 PROLIFERAÇÃO 25 2.2.3 REMODELAÇÃO 26 2.3 LASER 27 2.3.1 FOTOTERAPIA LASER 29 2.4 REPARO X OBESIDADE X FOTOTERAPIA LASER 32 3. PROPOSIÇÃO 34 3.1.OBJETIVO GERAL 34 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 34 4. MATERIAS E MÉTODOS 35 4.1 RESPALDO ÉTICO DA PESQUISA 35 4.2 AMOSTRA 35 4.3 DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS 35 4.4 MANIPULAÇÃO NUTRICIONAL 36 4.5 AVALIAÇÃO PONDERAL 38 4.6 PROCEDIMENTO CIRÚRGICO 39 4.7 PROTOCOLO DE IRRADIAÇÃO 40 4.8 MORTE DOS ANIMAIS E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS 42 4.9 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO 43 4.10 ANÁLISE DOS DADOS 45 5. RESULTADOS 46 5.1 AVALIAÇÃO PONDERAL, PESO DE GORDURA RETROPERITONEAL E FÍGADO
46
5.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA 48 5.2.1 ANÁLISE DESCRITIVA 48 5.1.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA 54 6. DISCUSSÃO 60 7. CONCLUSÃO 70 REFERÊNCIAS 71 ANEXO 80
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 01
Distribuição dos ratos nos grupos experimentais de acordo
com o tipo de dieta, protocolo de irradiação e tempo
experimental (UFBA, 2014).
36
Tabela 01 Composição da dieta padrão (DP) e dieta hiperlipídica (DH) 37
Quadro 02 Parâmetros utilizados no protocolo de irradiação (UFBA,
2014).
41
Quadro 03
Critérios utilizados na análise histológica (UFBA, 2014).
44
LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Dieta Hiperlipídica (DH) e Dieta Padrão (DP) (UFBA, 2013).
37
Figura 02
Ratos dos grupos Dieta Hiperlipídica e Dieta Padrão (UFBA, 2013).
38
Figura 03
Demarcação dos pontos correspondentes ao ângulo da ferida cirúrgica (UFBA, 2013).
39
Figura 04
Incisão para confecção da ferida (UFBA, 2013).
39
Figura 05
Ferida cirúrgica imediatamente após a sua confecção (UFBA, 2013).
40
Figura 06
Aparelho utilizado para realização da fototerapia laser (UFBA, 2013).
41
Figura 07
Irradiação da ferida cirúrgica com a luz Laser de emissão vermelha (UFBA, 2013).
41
Figura 08
Gordura retroperitoneal Grupo Dieta Padrão (UFBA, 2013).
42
Figura 09
Gordura retroperitoneal Grupo Dieta Hiperlipídica (UFBA, 2013).
42
Figura 10
Evolução do peso corporal em 20 semanas de consumo de dieta padrão e hipelipídica.
46
Figura 11
Peso relativo da gordura retroperitoneal após 20 semanas de dieta padrão e hiperlipídica.
47
Figura 12 Fotomicrografia do grupo dieta padrão aos 7 dias mostrando intenso infiltrado inflamatório. (HE, aumento aproximado de 200X) (UFBA, 2014
51
Figura 13 Fotomicrografia do Grupo Dieta Padrão Laser aos 7 dias mostrando infiltrado inflamatório moderado. HE, aumento aproximado de 400X) (UFBA, 2014).
51
Figura 14 Fotomicrografia do Grupo Dieta Padrão Controle aos 14 dias mostrando hiperemia moderada. (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
51
Figura 15 Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Controle aos 14 dias mostrando hiperemia intensa. (HE, aumento
51
aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
Figura 16 Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Controle aos 7 dias mostrando proliferação fibroblástica moderada. (HE, aumento aproximado de 200X) (UFBA, 2014).
52
Figura 17 Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 7 dias mostrando proliferação fibroblástica intensa. (HE, aumento aproximado de 200X) (UFBA, 2014).
52
Figura 18 Fotomicrografia do Grupo Dieta Padrão Laser aos 7 dias mostrando deposição discreta de colágeno. (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014)
52
Figura 19 Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 7 dias mostrando deposição moderada de colágeno. (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
52
Figura 20 Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Controle aos 14 dias mostrando reepitelização incompleta. (HE, aumento aproximado de 50X) (UFBA, 2014).
53
Figura 21 Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 14 dias mostrando reepitelização completa. (HE, aumento aproximado de 50X) (UFBA, 2014).
53
Figura 22 Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 7 dias mostrando tecido de granulação com intensa quantidade de adipócitos. (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
53
Figura 23 Comparação entre os grupos Dieta Padrão Controle e Dieta Padrão Laser avaliados no período de 7 dias em relação ao infiltrado inflamatório
55
Figura 24 Comparação entre os grupos Dieta Hiperlipídica Controle e Dieta Hiperlipídica Laser avaliados no período de 7 dias em relação ao infiltrado inflamatório
55
Figura 25 Comparação entre os grupos Dieta Padrão Laser e Dieta Hiperlipídica Laser avaliados no período de 7 dias em relação a proliferação fibroblástica
56
Figura 26 Comparação entre os grupos Dieta Hiperlipídica Controle e Dieta Hiperlipídica Laser avaliados no período de 7 dias em relação à Deposição de fibras colágenas
57
Figura 27 Comparação entre os grupos Dieta Padrão Laser e Dieta Hiperlipídica Laser avaliados no período de 7 dias em relação à Deposição de fibras colágenas
57
Figura 28 Comparação entre os grupos Dieta Padrão Controle e Dieta
Hiperlipídica Laser avaliados no período de 7 dias em relação à Hiperemia
59
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ATP Adenosina-trifosfato
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
BA Bahia
cm Centímetro
cm2 Centímetros quadrados
CW Continuous wave
DNA Ácido desoxirribonucléico
et al. E colaboradores
FOUFBA Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia
GaAs Arseneto de gálio
GaAlAs Arseneto de gálio-alumínio
g Grama
ºC Grau Celsius
h Hora
HeNe Hélio Neônio
HE Hematoxilina-eosina
ICS Instituto de Ciências da Saúde
J Joule
J/cm2 Joules por centímetros quadrados
Kg Quilograma
Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
(Amplificação da Luz por Emissão Estimulada de Radiação)
LTBI Laserterapia de Baixa Intensidade
LED Light Emmitting Diode (Diodo emissor de luz)
ml Mililitro
mm Milímetro
mW Miliwatts
min Minuto
nm Nanômetro
O2 Oxigênio
p Probabilidade de erro ou variabilidade amostral
s Segundo(s)
SAEF Spatial Average Energy Influence
(Densidade de energia média espacial)
t Tempo
TBE Tribromoetanol
UFBA Universidade Federal da Bahia
W Watts
W/cm2 Watts por centímetro quadrado
Comprimento de onda
µm Micrômetro
Φ Diâmetro do Spot
% Porcentagem
® Marca registrada
RESUMO
O Laser tem estimulado o reparo em modelos de distúrbios sistêmicos, porém a literatura é incipiente em se tratando da obesidade, já associada a distúrbios
cicatriciais. Verificou-se a influência da fototerapia Laser (λ660nm, 40mW, 6J/cm², 0,04cm2, CW, Twin Flex Evolution, MMoptics®, São Carlos, SP) no reparo tecidual de ratos submetidos a dieta hiperlípidica. Quarenta e oito ratos Wistar albinus, desmamados foram divididos em dois grupos experimentais: Dieta Padrão (DP) e Dieta Hiperlipídica (DH), por 20 semanas. Em seguida, os ratos foram submetidos à anestesia geral para confecção de feridas cutâneas dorsais, excisionais, padronizadas em 1cm². Os grupos foram subdivididos em DPC e DHC sem tratamento adicional e DPL e DHL irradiados pelo protocolo supracitado, imediatamente após o ato cirúrgico e a cada 48 horas durante 7 ou 14 dias. Os ratos foram mortos por aprofundamento anestésico, os espécimes processados pela técnica de coloração de rotina Hematoxilina/ Eosina (H/E) e avaliados por microscópica de luz. Os ratos submetidos à dieta hiperlipídica apresentaram maior intensidade no processo inflamatório cicatricial e hiperemia prolongada. O protocolo de irradiação empregado modulou a intensidade da inflamação, reduzindo-a. Avaliando-se a reação fibrocelular, observou-se o aumento na deposição de colágeno e estímulo a proliferação fibroblástica, principalmente no grupo LHD. Esses resultados foram observados para o período de 7 dias. É lícito concluir que adoção de dieta hiperlípidica modificou o padrão do processo inflamatório em ratos e que a fotobiomodulação a laser contribuiu favoravelmente para o processo cicatricial nas fases iniciais, não havendo diferença estatística aos 14 dias.
Palavras-chave: dieta hiperlipídica, reparo tecidual, laserterapia
ABSTRACT
The Laser irradiation has improved the cutaneous repair in different models of systemic disorders. However, up to date, the literature is lacking regarding phtobiomodulation influence in obesity, which has been reported to delayed
cicatrization. The influence of laser phototherapy (λ660nm, 40mW, 6J/cm ², 0.04 cm2, CW, Twin Flex Evolution , MMOptics ®, São Carlos , SP) was assessed in rats cutaneous repair submitted to a hyperlipidic diet. Forty-eight male Wistar Albinus, weaned, were divided into two experimental groups: standard diet (SD) and hyperlipidic diet (HD), for 20 weeks. After general anesthesia, standardized surgical wounds were created (1cm ²) in the dorsal midline region of each animal. The groups were then divided into: CSD and CHD, non-irradiated; and LSD and LHD, irradiated immediately after surgery and every 48h for 7 or 14 days. The rats were killed by overdose anesthesia, the specimens were processed for routine staining hematoxylin/eosin (H/E) and evaluated by light microscopy. The rats submitted to the hyperlipidic diet showed higher intensity of the inflammatory healing process and prolonged hyperemia. The irradiation protocol employed modulated the repair, reducing the intensity of inflammation. Regarding to fibrocellular reaction, it was observed the increased deposition of collagen and fibroblast proliferation, specially in the LHD group. These results were observed for 7 days. It is reasonable to conclude that the adoption of a hyperlipid diet altered the pattern of inflammation in rats and that the laser photobiomodulation had contributed positively to the healing process in earlier stages, with no statistical difference at 14 days.
Key words: hiperlypidic diet, repair, lasertherapy.
17
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é um problema de saúde mundial e que pode ter como origens
fatores nutricionais, genéticos, metabólicos, sociais e culturais associados
(GRUNDY, 1998). Indivíduos obesos mórbidos apresentam risco aumentado para
outras doenças sistêmicas e co-morbidades, dentre os quais, o comprometimento da
reparação tecidual, que pode resultar da hipoperfusão e isquemia que ocorrem no
tecido adiposo subcutâneo (GUO & DIPIETRO, 2010; NASCIMENTO & COSTA,
2006).
O reparo tecidual é um processo que envolve contínuas, sobrepostas, mas
bem ordenadas fases: inflamação, proliferação e remodelação (ENOCK & LEAPER
2007) e requer a interação com uma variedade de células, citocinas, fatores de
crescimento e moléculas da matriz extracelular. Para que ocorra a cicatrização
adequada da ferida, a sequência temporal destes eventos deve ser mantida;
interrupções, defeitos e prolongamento de uma destas etapas podem levar a um
atraso na cicatrização ou o não fechamento da ferida (BELDON, 2010; WITTE &
BARBUL, 1997).
O Aumento do número de indivíduos obesos, bem como o aumento do
número da parcela destes indivíduos que passam por experiências de injúrias
físicas, devido ao excesso de peso ou a procedimentos cirúrgicos, como a cirurgia
bariátrica, tem motivado a busca da compreensão dos fatores que impedem a
cicatrização das feridas (WILSON & CLARK, 2003) e, por conseguinte, a busca por
novas terapias que facilitem o adequado reparo tecidual neste grupo.
Nas situações nas quais o processo de cicatrização é comprometido, seja em
virtude de condições locais ou sistêmicas, estudos têm sido realizados na busca de
desenvolver novos métodos terapêuticos que possam reduzir ou minimizar as falhas
no processo de reparo tecidual. Dentre estes métodos, a fototerapia laser tem sido
indicada como um recurso terapêutico capaz de modular e acelerar o reparo tecidual
melhorando as características do tecido neoformado, principalmente no
comprimento de onda vermelho e infravermelho próximo (PINHEIRO et al., 2009;
NICOLAU et.al, 2003).
18
A fototerapia laser é considerada um recurso terapêutico devido aos efeitos
biomodulatórios promovidos aos tecidos, sendo de grande relevância na cicatrização
das feridas, pois é capaz de aumentar a síntese de colágeno pelos fibroblastos,
angiogênese, além de estimular a diferenciação miofibroblástica nas fases iniciais da
cicatrização (RIBEIRO et al., 2009). Deste modo, a sua utilização é justificável em
tecidos cuja cicatrização está sendo comprometida, como nos casos em que a
obesidade leva à isquemia do tecido e interfere no reparo da lesão.
Nestes casos, o favorecimento do reparo cicatricial seria importante na
redução da morbidade pós-cirúrgica de indivíduos obesos, com redução dos custos
globais dos atendimentos ambulatoriais e hospitalares e antecipação do retorno dos
indivíduos às suas atividades sociais e laborais. Todavia, a literatura ainda carece de
estudos envolvendo a fototerapia laser na presença de desordens sistêmicas como
a obesidade. Desta forma, o presente estudo visa avaliar histologicamente os efeitos
da fototerapia laser durante a cicatrização de feridas em ratos submetidos a dieta
hiperlipídica para avaliar se haveria algum benefício de sua utilização nas alterações
cicatriciais associadas à obesidade.
19
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. SOBREPESO E OBESIDADE
O sobrepeso e a obesidade são definidos pela Organização Mundial da
Saúde (OMS, 2013) como excesso ou acúmulo anormal de gordura que podem
representar um risco para a saúde. Estas são doenças multifatoriais que podem ter
como origens fatores nutricionais, genéticos, metabólicos, sociais e culturais
associados (GRUNDY, 1998) e que, devido ao aumento da prevalência, tem se
tornando um problema de saúde pública mundial. Embora sejam maiores nos países
desenvolvidos, os países em desenvolvimento têm apresentado um crescente
aumento nos últimos anos (MULLER-RIEMENSCHNEIDER et al., 2008).
O excesso de peso e a obesidade nos adultos são comumente avaliados pelo
Índice de Massa Corporal (IMC), que é uma medida simples de peso em relação a
altura. Um IMC igual ou superior a 25 classifica a pessoa no grupo de sobrepeso e o
IMC maior ou igual a 30 a classifica como obesa. Baseando-se neste parâmetro, a
OMS (2013) calcula que bilhões de indivíduos estão com sobrepeso e milhões já
sejam obesos.
A industrialização, a modernidade e a facilidade em se obter alimentos,
associada ao estilo de vida seguido de uma dieta mal balanceada e ao
sedentarismo, muito tem contribuído para a incidência da obesidade em adultos,
bem como em crianças e adolescentes (FABRICATORE & WADDEN, 2006;
GRUNDY, 1998).
Uma das razões para a preocupação em relação ao sobrepeso e a obesidade
está relacionada à associação com o aumento do risco para outras doenças
sistêmicas e co-morbidades. Dentre as quais podemos citar: a resistência à insulina,
diabetes tipo 2, dislipidemia, hipertensão arterial (DOBRIAN et al., 2000), alguns
tipos de cânceres (LARSSON & WOLK, 2008; CALLE & KAAKS 2004), bem como o
retardo do processo de cicatrização de feridas (BIONDO-SIMOES et al., 2010;
NASCIMENTO & COSTA, 2008). Este quadro representa, portanto, um sinal de
alerta para o futuro da saúde pública.
20
O tecido adiposo pode estar distribuído em diferentes regiões do organismo,
anatomicamente classificados em tecido adiposo visceral (TAV) ou abdominal e
tecido adiposo subcutâneo (TAS), podendo ser distinguidos claramente pelas
técnicas de imagem, como a tomografia computadorizada (TC), a qual permite a
medição da gordura abdominal visceral e subcutânea (SMITH et al., 2001). Estudos
epidemiológicos relatam frequentemente uma associação entre a obesidade grave e
mortalidade devido ao aumento das taxas de doenças cardiovasculares e diabetes.
Nestes casos, a distribuição regional do tecido adiposo relacionada à obesidade
abdominal está fortemente relacionadas às alterações metabólicas (NASCIMENTO
et al., 2008; FAIN et al., 2004; WAJCHENBERG, 2000).
Estudos revelam que a obesidade subcutânea pode prejudicar a cicatrização
das feridas (BIONDO-SIMÕES et al., 2010; NASCIMENTO & COSTA, 2006), visto
que em obesos o tecido adiposo encontra-se em um estado de hipóxia devido à
expansão do tecido e o consequente afastamento entre os vasos e os adipócitos
(LEE, WU & FRIED, 2010). A avascularidade do tecido adiposo diminui a
capacidade de combater a infecção e impede os neutrófilos de fagocitar as bactérias
(BAKER, 2006).
Além disso, a obesidade provoca alterações fisiológicas na pele e estruturas
de suporte. As dobras na pele tornam-se focos de abrigo para os microorganismos
que se desenvolvem em áreas úmidas e causam infecção, aliada à fricção causada
pelo contato de pele/pele e pela diminuição da vascularidade do tecido adiposo,
transformam-se em fatores de alto risco para o desenvolvimento de feridas na pele,
que muitas vezes tornam-se crônicas (SCHWEINBERGER & ROUKIS, 2009;
BAKER, 2006).
Portanto, um grande desafio para a prestação de cuidados com a saúde da
população obesa é alcançar a cicatrização das feridas, sem complicações. Sendo
assim, a prestação de cuidados à saúde destes pacientes requer conhecimento e
compreensão das mudanças intrínsecas do corpo induzidas pela obesidade e como
estas podem prolongar, ou mesmo, impedir a cicatrização de feridas (WILSON &
CLARK, 2003).
21
2.1.1. TECIDO ADIPOSO
O tecido adiposo (TA) é dividido em dois tipos e apresenta funções
fisiológicas diferentes, dependendo de sua estrutura celular, localização, cor e
função. O tecido adiposo branco (TAB) é o principal local de armazenamento de
energia, seus adipócitos armazenam uma única e grande gota lipídica que preenche
a maior porção da célula e apresenta-se distribuído por todo o corpo. O tecido
adiposo marrom (TAM) possui adipócitos com várias gotículas lipídicas
citoplasmáticas de diferentes tamanhos e um grande número de mitocôndrias que
são responsáveis pela liberação de calor na regulação termogênica, contudo, em
seres humanos o TAM encontra-se abundante em recém-nascidos, mas na vida
adulta se apresenta em menor escala (MEDINA-GOMEZ, 2012; GESTA, TSENG &
KAHN, 2007).
O tecido adiposo é constituído não só pelos adipócitos, que são as únicas
células especializadas e perfeitamente adaptadas para armazenar lipídeos sem que
isso comprometa a sua integridade funcional, mas é composto também por matriz de
tecido conjuntivo, tecido nervoso, células endoteliais, células do estroma vascular e
células do sistema imunológico. Esses componentes funcionam de forma integrada
e provavelmente contribuem para a síntese e volume de componentes da matriz
extracelular (MEC) (LEE, WU & FRIED, 2010).
A crescente preocupação com a obesidade tem levado à ênfase do
conhecimento e entendimento sobre as funções do tecido adiposo branco, visto que,
ele desempenha funções essenciais à fisiologia dos mamíferos e, além de servir
como fonte de armazenamento de energia, desempenha importante ação como
órgão endócrino na produção de hormônios (KERSHAW & FLIER, 2004).
Dos hormônios produzidos pelos adipócitos, destacam-se a leptina e a
adiponectina. A leptina é um hormônio que após interagir com os sistemas
neuroendócrinos leva à inibição da ingestão de alimentos (KERSHAW & FLIER,
2004). Em modelos animais obesos, os níveis plasmáticos deste hormônio
encontram-se diminuidos, em contraste, no indivíduos obesos, os níveis encontram-
se elevados, isto indica que os mecanismos que controlam o metabolismo e o peso
corporal em humanos são mais complexos comparados aos animais experimentais.
22
Já a adiponectina está associada a resistência à insulina e juntamente com as
outras proteínas secretadas pelos adipócitos são chamadas de adipocinas
(TRAYHURN & WOOD, 2004).
Manter uma quantidade adequada de tecido adiposo é essencial para a
saúde, pois níveis fora do normal levam ao desequilíbrio na produção de adipocinas
e consequências adversas à saúde. Como resultado, o baixo TA leva a anorexia e
caquexia, e muito TA leva à obesidade ou a uma distribuição anormal de tecido
adiposo (lipodistrofia) (WOOD et al., 2009).
Uma importante compreensão acerca da obesidade é que ela é caracterizada
por um estado de inflamação crônica de baixo grau, que foi sugerida quando níveis
elevados de citocinas pró-inflamatórias como a TNF-α e a interleucina 6 (IL-6)
circulatória foram observadas em obesos (DAS, 2001). Algumas destas citocinas
pró-inflamatórias também são reconhecidas como adipocinas e encontram-se
elevadas em obesos. Tendo em vista o grau de inflamação crônica amplamente
presente no tecido adiposo branco de obesos, YE et al. (2007), na tentativa de
responder a causa desta mudança, avaliaram ratos ob/ob obesos e perceberam que
na obesidade existe uma hipóxia no tecido adiposo, sugerindo ser esta, a
contribuição para o estado de inflamação crônica nos obesos.
O fluxo reduzido da vascularização no tecido adiposo branco o torna mal
vascularizado, esta redução ocorre devido à hipertrofia dos adipócitos que, em
indivíduos obesos, podem chegar a um tamanho de cerca de 150-200 mm de
diâmetro, ultrapassando assim a distância de difusão normal de O2 de 100-200 mm
(WOOD et al., 2009). Além da hipóxia que ocorre no tecido adiposo, o adipócito
também sofre diminuição da oxigenação, a consequência metabólica da redução
destes níveis dentro do adipócito pode resultar na geração de espécies reativas de
oxigênio liberando enzimas para degradar subunidades do citrocomo c oxidase,
responsável pela produção de energia (WOOD et al., 2009).
A presença do macrófago ao redor do tecido adiposo em obesos sugere que,
a obesidade, ao induzir a necrose dos adipócitos, promove a ativação deste
componente celular (CINTI et al., 2005, WEISBERG et al, 2003). Estas observações
podem definir o envolvimento potencial do adipócito necrosado, devido ao estresse
23
celular, no recrutamento e ativação de macrófagos no TAB de indivíduos obesos
(CINTI et al., 2005) e, sendo este uma fonte de liberação de citocinas pró-
inflamatórias, justificaria o potencial de prolongamento da fase inflamatória do reparo
tecidual.
2.2. REPARO TECIDUAL
A função primária da pele é servir com barreira protetora contra o meio
ambiente, a perda da sua integridade pode causar deficiência ou mesmo a morte
(SINGER & CLARK, 1999). O processo de reparo tecidual é um mecanismo de
sobrevivência que se inicia imediatamente após a injúria ao tecido, pelo qual o tecido
destruído ou danificado é removido e a ruptura na integridade do tecido é
restaurada. A cicatrização pode ocorrer por dois processo: reepitelização completa
do tecido por regeneração, na qual existe o reparo das células destruídas por outras
do mesmo tipo, ou pelo retorno da estrutura anatômica e funcional pela substituição
do tecido por células de outro tipo, geralmente tecido conjuntivo, que resulta na
formação de cicatriz (BELDON, 2010).
A cicatrização de feridas é um processo complexo, mas essencial à
manutenção do organismo, com o objetivo de reparar o tecido. Ela envolve uma
série de eventos incluindo quimiotaxia, divisão celular, neovascularização, síntese
de matriz extracelular e formação e remodelação de tecido cicatricial. Estes eventos
são regulados pela integração de mediadores como plaquetas, células inflamatórias,
citocinas, fatores de crescimento e moléculas da matriz extracelular (ENOCK &
LEAPER, 2007).
Uma parte fundamental para o desenvolvimento deste processo é a
oxigenação, essencial para o metabolismo celular, especialmente para a produção
de energia por meio de ATP. Esta molécula é necessária nos casos de injúria ao
tecido, no qual o rompimento vascular e o alto consumo de oxigênio pelas células
metabolicamente ativas tornam o ambiente inicial ao redor da ferida esgotado de
oxigênio e bastante hipóxico (GUO & DIPIETRO, 2010; TANDARA & MUSTOE,
2004).
24
Este processo envolve três fases contínuas, sobrepostas, porém bem
ordenadas: inflamação, proliferação e remodelação (GUO & DIPIETRO, 2010). Para
a cicatrização normal de feridas, a sequência temporal destes eventos deve ser
mantida; interrupções, defeitos e prolongamento de uma destas etapas podem levar
a um atraso na cicatrização ou o não fechamento da ferida (WITTE & BARBUL,
1997).
2.2.1 INFLAMAÇÃO
Imediatamente após a ocorrência da ferida, inicia-se o extravasamento
sanguíneo que preenche a área lesada com plasma e elementos celulares,
principalmente plaquetas, ocorrendo assim a vasoconstricção, agregação
plaquetária e deposição de fibrina para a formação do coágulo (GUO & DIPIETRO,
2010; MONACO & LAWRENCE, 2003). As plaquetas presas no coágulo liberam
citocinas pró-inflamatórias e fatores de crescimento, como o fator de crescimento
transformante (TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de
crescimento fibroblástico (FGF) e o fator de crescimento epidérmico (EGF) que
iniciarão a cascata de cicatrização da ferida pela ativação de fibroblastos, células
endoteliais e macrófagos. O coágulo também fornece uma matriz provisória rica em
glicoproteínas adesivas como a fibronectina, essencial para migração celular
(BELDON, 2010; ENOCH & LEAPER, 2007).
O coágulo, formado pelo processo de hemostasia, evita que mais fluidos e
eletrólitos sejam perdidos pela ferida e limita a contaminação pelo ambiente exterior.
O processo de cicatrização não pode prosseguir até que a hemostasia esteja
finalizada. Quando o sangramento é controlado, células inflamatórias migram para a
ferida e promovem a fase inflamatória, que é caracterizada pela infiltração
seqüencial de neutrófilos, macrófagos e linfócitos (GUO & DIPIETRO, 2010;
MONACO & LAWRENCE, 2003).
Uma das principais funções da inflamação é levar células inflamatórias para a
área lesionada; elas fagocitam bactérias, fragmentos celulares e corpos estranhos
para que o processo de reparo possa continuar (AL-WATBAN & ZHANG, 2004;
MONACO & LAWRENCE, 2003). As primeiras células a chegarem ao local são os
25
neutrófilos, atraídos pelos agentes quimiotáticos liberados pelas bactérias (ou
células lesadas). No 2º a 3º dia, os neutrófilos começam a desaparecer por apoptose
ou fagocitose pelos macrófagos. O processo de limpeza da ferida é
continuadamente realizado pelos monócitos que estão presentes desde o início da
inflamação e se diferenciam em macrófagos, sendo estas as células mais
importantes na fase final do processo inflamatório (MARTIN, 1997).
Uma vez ativado, o macrófago é responsável pela liberação de fatores de
crescimento responsáveis pela proliferação (PDGF e TGF-β) que atraem os
fibroblastos e as células da musculatura lisa para dentro da ferida, como também
células endoteliais vasculares que participarão do processo de angiogênese
(BELDON, 2010; GUO & DIPIETRO, 2010). Qualquer inibição na função dos
macrófagos retarda a cicatrização das feridas, conduzindo a um pobre debridamento
da ferida, atraso na proliferação de fibroblastos, angiogênese e fibrose inadequados.
O resultado da fase inflamatória é o controle da inflamação e o estabelecimento de
um leito de ferida limpa. Esta fase dura aproximadamente 3 dias (BELDON, 2010;
ENOCH & LEAPER, 2007).
2.2.2. PROLIFERAÇÃO
A fase proliferativa geralmente segue e se sobrepõe à fase inflamatória, e é
representada pela proliferação e migração epitelial sobre a matriz provisória no
interior da ferida. Este processo é caracterizado principamente pela angiogênese,
formação do tecido de granulação, deposição de colágeno, epitelização e contração
da ferida (YONG & MCNAUGHT, 2011). Nesta fase, o ambiente celular e as células
inflamatórias, inicialmente presentes na matriz provisória, são substituídas por
fibroblastos e células endoteliais (MONACO & LAWRENCE, 2003).
Os fibroblastos proliferam e migram para a matriz extracelular provisória da
ferida oriundos dos fibroblastos presentes nos tecidos adjacentes, ou pela
transformação de células indiferenciadas ao redor da área, que influenciadas pelas
citocinas, podem se transformar em fibroblastos (WILLIAMSOM & HARDING, 2004;
MONACO & LAWRENCE, 2003). A proliferação é estimulada por uma variedade de
26
citocinas, sendo as mais importantes o PDGF e TGF-β (YONG & MCNAUGHT,
2011; ENOCH & LEAPER, 2007).
Uma vez no interior da ferida, os fibroblastos proliferam e produzem proteínas
da matriz como a fibronectina e o ácido hialurônico e, mais tarde, o colágeno
e proteoglicanos. Estes componentes ajudam a construir uma nova matriz
extracelular dando suporte à migração celular, essencial para o processo de
reparação (SINGER & CLARK, 1999; THOMAS, 1995). A formação dos novos
capilares, a partir de vasos preexistentes (angiogênese), é responsável pelo
fornecimento de oxigênio, especialmente na produção de energia por meio de ATP e
nutrientes necessários ao metabolismo celular no local. Nesta fase as células
consumem 3 a 5 vezes mais oxigênio do que em fases de repouso no ciclo celular
(MONACO & LAWRENCE, 2003).
2.2.3. REMODELAÇÃO
A terceira e última fase do processo de cicatrização é a remodelação. Esta é
uma tentativa de recuperação da estrutura tecidual normal e sua principal
característica é a deposição de colágeno na ferida.
A síntese e a remodelação da matriz extracelular é iniciada simultaneamente
ao desenvolvimento de tecido de granulação e continua por longos períodos. Os
fibroblastos se transformam em miofibroblastos através da interação com a matriz
extracelular e influenciados por citocinas como o TGF-β, PDGF, FGF. Os
miofibroblastos exercem papel importante na promoção da contração da ferida
(ENOCH & LEAPER, 2007).
Com o decorrer do processo, o colágeno tipo III vai sendo degradado e
substituído pelo colágeno tipo I pela ação das metaloproteinases da matriz (MMPs);
as atividades celulares vão diminuindo com redução do fluxo sanguíneo; há
regressão no crescimento de capilares, redução da atividade de macrófagos e
fibroblastos, sendo que estes começam a desaparecer do local da ferida por
mecanismos de emigração ou apoptose. Esta finalização de atividade celular leva a
formação da cicatriz (MENDONÇA & COUTINHO-NETO, 2009).
27
O processo de remodelação está associado com o aumento substancial da
resistência da ferida à ruptura. Conforme as semanas vão passando, a ferida vai se
aproximando da resistência da derme normal. Entretanto, mesmo que a
remodelação continue ao longo dos meses, a cicatriz nunca recupera totalmente a
força tensil, chegando no máximo a 80% da força da derme normal (WILLIAMSOM &
HARDING, 2004; MONACO & LAWRENCE, 2003).
Nas últimas décadas, várias pesquisas tem sido realizadas com o intuito de
identificar mecanismos capazes de interferir nesta complexa cadeia de eventos do
processo de reparo (GUPTA & ZHANG, 2005; MARTIN, 1997). Além destes fatores
intrínsecos ao organismo, algumas condições locais ou sistêmicas podem contribuir
para o prolongamento destas fases, e desta forma, agravar o reparo.
Vascularização inadequada, infecção, presença de trauma, são alguns dos
fatores que podem influenciar diretamente no reparo (ANAYA & DELLINGER, 2006;
TANDARA & MUSTOE, 2004; WILSON, 2003). Aliado a isso, condições como
diabetes não controlada, anemia, obesidade, desnutrição e idade são outras
situações que podem contibuir para o retardo no reparo tecidual (PINHEIRO et al,
2009; SCHWEINBERGER & ROUKIS, 2009; NASCIMENTO & COSTA, 2006;
BAUER et al, 2004).
2.3 LASER
O Laser é uma forma de radiação eletromagnética não ionizante e acrônimo
para: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation. Apresenta
propriedades únicas que o diferencia de outras fontes de luz, tais como
monocromaticidade, coerência e colimação, sendo a base para as aplicações com
finalidade terapêutica (CARROL & HUMPHREYS, 2006).
A monocromaticidade é uma importante propriedade do laser, pois está
relacionada à emissão de radiação em um único comprimento de onda direcionado a
um fotorreceptor específico que absorve seletivamente diferentes comprimentos de
onda. A coerência refere-se ao sincronismo entre as ondas propagadas durante a
irradiação; significa que, as ondas de luz são na mesma fase em termos de tempo e
28
espaço. E a colimação é o paralelismo dos feixes de luz emitido que permite a
obtenção de alta densidade de energia em pequenos pontos (TANZI, LUPTON &
ALSTER, 2003).
Pensava-se que a coerência fosse imprescindível para a ação do laser no
tecido. Porém, Karu em 1983, após comparar o efeito entre fonte de luz coerente e
incoerente sobre o crescimento celular, observou que o efeito estimulante na síntese
do DNA ocorreu independente da coerência da luz utilizada, sugerindo que a
coerência não é importante para o efeito fotobiológico do laser. Hoje, o uso do LED
(Diodo emissor de luz), uma luz não coerente, tem sido utilizado nas pesquisas,
principalmente devido ao seu baixo custo e fácil manuseio e tem demonstrado
resultados positivos no auxilio do fechamento da ferida e na reepitelização nos
estágios iniciais do processo de reparo (PARAGUASSÚ et al., 2013).
Os primeiros efeitos biológicos da luz laser foram descobertos na década de
60 por Endre Mester. Desde então, e devido à multiplicidade de ações que o laser
tem demonstrado, tem suscitado pesquisadores de todo o mundo a investir nas
investigações dos benefícios do uso do laser como método de tratamento nas mais
variadas questões relacionadas à saúde. O laser já apresentou resultados positivos
na diminuição da resposta inflamatória (RABELLO et al., 2006), na neoformação dos
vasos (GONÇALVES, et al, 2006), estimulando a proliferação fibroblástica (MENDEZ
et al, 2004), promovendo a regeneração musculoesquelética (SHEFER et al, 2001),
nervosa (MOGES et al., 2011) e a reparação óssea (WEBER et al., 2006).
Os Lasers apresentam duas classificações, os de alta potência ou cirúrgicos e
os de baixa potência, baixa intensidade ou terapêuticos (COLUZZI, 2004). Os
primeiros são usados em tratamentos cirúrgicos, permitindo o corte, a vaporização e
a coagulação dos tecidos. Os lasers de baixa potência atuam promovendo a
analgesia, antiinflamação e a biomodulação.
Vários lasers de baixa potência tem sido estudados para avaliação da
interação com os tecidos. As pesquisas iniciais foram realizadas com os lasers de
Rubi 694 nm (MESTER et al., 1971), Hélio Neônio (HeNe) 632,8 nm (SCHINDL et
al., 1998), argônio 488 e 514 nm e criptônio 670 nm (AL-WATBAN & ZHANG, 1997).
Os estudos mais recentes têm utilizado lasers como o arseneto de gálio (GaAs) 904
29
nm (PIRES-OLIVEIRA et al., 2010) e arseneto de gálio-alumínio (GaAlAs) 820 e 830
nm. Nestas décadas, a maioria dos estudos apresentaram resultados positivos,
entretanto, em outros estudos o laser atuou como inibidor ou não apresentou
nenhum benefício (BAGIS et al., 2003; HOUGHTON & BROWN 1999; USUBA, AKAI
& SHIRASAKI, 1998; GOATS et al., 1996).
A Fototerapia a laser, anteriormente aplicada somente nas áreas médicas,
vem despertando cada vez mais o interesse da Odontologia. Seu uso já vem sendo
testado para aplicação nas diversas especialidades odontológicas, com o uso na
prevenção e tratamento da mucosite (DE CASTRO et al., 2013), no reparo tecidual
pós exodontias (TAKEDA, 1988), hipersensibilidade dentinária (KIMURA et al.,
2000), prévio ao preparo cavitário (TANBOGA et al., 2011), promovendo o reparo
ósseo (NISSAN et al., 2006) e na aceleração do movimento ortodôntico (CRUZ et
al., 2004).
2.3.1. FOTOTERAPIA LASER
Na busca pela melhora no resultado das intervenções cirúrgicas que
necessitem de um reparo tecidual adequado, várias modalidades terapêuticas têm
sido pesquisadas no intuito de proporcionar uma cicatrização estética e satisfatória.
Neste contexto, a incorporação da fototerapia a laser, também conhecida como
laserterapia de baixa intensidade (LTBI) ou fotobiomodulação, como opção
terapêutica tem sido amplamente difundida em inúmeras áreas biomédicas,
principalmente com objetivo de modular a resposta inflamatória e acelerar o
processo de reparo tecidual.
A luz pode interagir com o tecido de quatro maneiras. A primeira é pela
transmissão, quando ela passa pelo tecido, mas não causa nenhum efeito nele; a
reflexão acontece quando a luz é refletida e não penetra no tecido; a dispersão é
quando a luz é espalhada dentro do tecido e a quarta maneira é a absorção,
fundamento da fotobiomodulação, que é a absorção dos fótons emitidos pela luz
laser, promovendo, desta forma, um efeito sobre o tecido. Os componentes do
tecido que absorvem os fótons dependem, preferencialmente, do comprimento de
onda e são conhecidos como cromóforos (CARROL & HUMPHREYS, 2006).
30
Considerando o espectro eletromagnético, os principais comprimentos de
onda utilizados na laserterapia de baixa intensidade então nos comprimentos de
onda vermelho (de 630 a 700nm) e infravermelho próximo (de 700 a 904nm)
(VLADIMIROV, OSIPOV & KLEBANOV, 2004). Em geral, a profundidade de
penetração da luz laser aumenta com o aumento do comprimento de onda dentro do
espectro de luz visível, tecidos mais superficiais são tratados com comprimentos de
onda na gama de 600-700 nm, e tecidos mais profundos utilizam comprimentos de
onda mais longos na gama de 780-950 nm (CHUNG et al., 2012).
A principal razão para o uso das fontes de radiação nestes comprimentos de
onda é o fato da hemoglobina não absorver neste espectro de luz e, portanto, a luz
conseguir penetrar nos tecidos (VLADIMIROV, OSIPOV & KLEBANOV, 2003). O
laser de baixa intensidade atua sem aquecer, e ao invés disso, após ser absorvido,
ele induz reações fotoquímicas nas células através da biomodulação, agindo nos
processos moleculares e bioquímicos que ocorrem normalmente nos tecidos (LINS
et al., 2006).
Após a inserção do laser como uma modalidade terapêutica, surgiram os
questionamentos sobre o seu mecanismo de ação tecidual. Nos estudos iniciais, os
autores limitavam-se a descrever apenas toda a cadeia respiratória como
fotorreceptor (KARU, 1987). Mas hoje, sabe-se que a ação fotobiológica do laser
ocorre através da ativação da cadeia respiratória da mitocôndria e que o citrocomo
c oxidase, uma enzima da cadeia terminal da cadeia respiratória mitocondrial, é a
molécula responsável (KARU et al., 2005).
A excitação do fotorreceptor inicia uma cascata de atividades celulares,
resultando assim na maior produção de ATP. Pequenas mudanças no nível de ATP
podem alterar significativamente o metabolismo celular, com isso, aumentar a
quantidade dessa energia pode promover a melhora no metabolismo celular,
especialmente nas células que estejam comprometidas (WONG-RILEY et al., 2005).
De acordo com Karu 1989, o efeito da ação bioestimuladora do laser na célula
está na dependência do estado fisiológico da mesma antes da irradiação, isso pode
explicar o porquê do efeito da biestimulação nem sempre ser possível. Neste caso,
se uma célula se encontra em seu estado normal, não há estímulo para que o laser
31
aja sobre ela com um efeito terapêutico. Entretanto, se uma célula está com déficit
funcional, este é o ponto gatilho e estímulo para a ação do laser na tentativa de
melhorar e normalizar a atividade celular.
Os efeitos a nível celular são bastante diversificados, pois a fotobiomodulação
atua sobre diferentes tipos celulares e obtêm várias respostas. A interpretação dos
resultados obtidos pelos pesquisadores, nos diferentes estudos, torna-se
complicada, pois a diversidade de parâmetros utilizados como densidade de energia
(dose), comprimentos de onda, potências e tempos de tratamento, algumas vezes,
dificultam as comparações. (POSTEN et al., 2005).
Avaliando esta dificuldade em se comparar alguns dos parâmetros relatados
na literatura, Jenkins & Carroll em 2011 sugeriram alguns parâmetros relacionados
ao aparelho e parâmetros de tratamento utilizados que deveriam ser citados pelos
autores ao enviar um artigo para uma revista, estas informações ajudariam a evitar
problemas causados pela informação incompleta dos dados utilizados e que tornam
muitos dos trabalhos publicados irreprodutíveis. Dentre os parâmetros mais
importantes destacados pelos autores estão: comprimento de onda, potência,
densidade de energia, parâmetros do pulso, área do feixe, tempo de irradiação,
número de pontos irradiados, números de sessões e intervalo entre elas.
Ao longo dos anos, os estudos para avaliação da eficácia da irradiação laser
vem sendo desenvolvidos em diversos modelos animais e em estudos in vitro.
Embora as pesquisas de cultura in vitro de células possam ajudar a determinar o
mecanismo de ação do LTBI, elas não podem reproduzir o complexo processo de
cicatrização de feridas que ocorrem in vivo, por isso modelos animais são os mais
utilizados nos estudos para avaliação deste evento biológico, proporcionando assim
uma simulação mais realista do efeito do laser sobre o tecido e, nestes casos, a
relativa facilidade de trabalhar com os roedores os tornam o modelo mais escolhidos
para uso nas pesquisas científicas (POSTEN et al., 2005).
32
2.4. REPARO TECIDUAL x OBESIDADE x FOTOTERAPIA LASER
A síntese e a liberação de citocinas inflamatórias são necessárias durante o
reparo tecidual, contudo, quantidades excessivas são encontradas em lesões que
retardam para cicatrizar, como no caso das feridas crônicas (BARRIENTOS, 2008).
O Fator de necrose tumoral-α (TNF-α) é uma citocina pró-inflamatória responsável
por regular a ativação de MMPs na pele humana e seus efeitos são dependentes da
sua concentração; Em baixos níveis ele pode promover a cicatrização de feridas por
estimular a inflamação e aumentar a produção de fatores de crescimento pelos
macrófagos. Por outro lado, como elas são encontradas em níveis elevados em
feridas crônicas, a ativação de MMPs pelo TNF-α, sugere o mecanismo pelo qual o
prolongamento da fase inflamatória pode prejudicar a cicatrização normal (HAN et
al., 2000).
As etapas do processo de reparo tecidual podem ser influenciadas por
diversos fatores sistêmicos, e no caso da obesidade, este ciclo pode ser postergado,
principalmente, devido ao prolongamento da fase inflamatória (NASCIMENTO &
COSTA, 2006). Logo após a lesão tecidual aguda, o microambiente do ferida é
praticamente desprovido de oxigênio, como resultado não só do rompimento
vascular causado pela lesão, mas também do alto consumo de oxigênio necessário
para as atividades celulares.
Apesar do ambiente hipóxico no início do curso de ferida, células endoteliais e
fibroblastos ainda funcionam promovendo a migração, a síntese de proteínas e
proliferação. Enquanto as fases da cicatrização prosseguem, os níveis de oxigênio
normalizam gradualmente através da neoformação vascular. Assim, o estado de
oxigenação em que o tecido se encontra, desempenha um papel importante como
estímulo precoce para o reparo do tecido (TANDARA & MUSTOE, 2004).
Em situações nas quais o processo de cicatrização é comprometido, seja em
virtude de condições locais ou sistêmicas, novos métodos terapêuticos têm sido
utilizados na tentativa de reduzir ou minimizar as falhas no processo de reparo
tecidual; a utilização da oxigenação hiperbárica (WUNDERLICH, PETERS, &
33
LAWRENCE, 2000), fatores de crescimento, substitutos da pele (NAKAGAWA et al.,
2005) e a terapia por pressão negativa (ARMSTRONG & LAVERY, 2005) têm sido
algumas das técnicas implementadas.
Dentre estes métodos a fototerapia Laser tem sido indicada como um recurso
terapêutico capaz de modular e acelerar o reparo tecidual, melhorando as
características do tecido neoformado, principalmente no comprimento de onda
vermelho e infravermelho próximo (RAMALHO et al. 2010; PINHEIRO et al., 2009).
Os benefícios promovidos pela técnica são devidos aos efeitos biomodulatórios nos
tecidos, pois são capazes de aumentar a síntese de colágeno pelos fibroblastos, a
angiogênese, além de estimular a diferenciação miofibroblástica nas fases iniciais da
cicatrização (GONÇALVES et al., 2010; ROCHA-JUNIOR et al., 2006; RABELO et
al., 2006; MENDEZ et al., 2004; MEDRADO et al., 2003). Portanto, a sua utilização é
justificável em tecidos cuja cicatrização está sendo comprometida, como nos casos
em que a obesidade leva à isquemia do tecido interferindo no reparo da lesão.
Deste modo, o favorecimento do reparo cicatricial seria importante na redução
da morbidade pós-cirúrgica de indivíduos obesos, com redução dos custos globais
dos atendimentos ambulatoriais e hospitalares e antecipação do retorno dos
indivíduos às suas atividades sociais e laborais (WILSON & CLARK, 2003). Todavia,
a literatura ainda carece de estudos envolvendo a fototerapia Laser na presença de
desordens sistêmicas como a obesidade. No entanto, há evidências comprobatórias
da ação fotobiomodulatória destas fototerapias no reparo cicatricial de modelos
animais normais ou com outras disfunções sistêmicas, como já verificados em ratos
diabéticos, desnutridos (PINHEIRO et al., 2006; PINHEIRO et al., 2005) e
hipotireoidianos (PARAGUASSÚ et al., 2013).
34
3. PROPOSIÇÃO
3.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar, através de análise histológica, o padrão de reparo em feridas
cutâneas excisionais dorsais de ratos submetidos a dieta hiperlipídica e os efeitos da
fototerapia Laser (λ660nm) com densidade de energia de 6J/cm².
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
– Avaliar o tecido adiposo retroperitonial para verificar o efeito da dieta
hiperlipídica na lipogênese.
– Verificar o efeito da adoção de dieta hiperlipídica no reparo tecidual em ratos,
através da análise histológica da reepitelização, do processo inflamatório, da
proliferação fibroblástica, da deposição colagênica e da hiperemia nos
períodos experimentais de 7 e 14 dias.
– Verificar a influência da fototerapia Laser (λ660nm), com densidade de
energia de 6J/cm², no reparo tecidual em ratos submetidos a dieta
hiperlipídica, através da análise histológica da reepitelização, do processo
inflamatório, da proliferação fibroblástica, da deposição colagênica e da
hiperemia nos períodos experimentais de 7 e 14 dias.
35
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 - RESPALDO ÉTICO DA PESQUISA
Este experimento em animais seguiu os princípios éticos e legais de conduta
de experimentação animal da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da
Bahia (UFBA), sendo aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA),
desta Instituição protocolo nº 02/12 (ANEXO), de acordo com a LEI Nº 11.794, de 8
de outubro de 2008.
4.2 – AMOSTRA
Foram utilizados 48 ratos albinos da espécie Rattus norvegicus, classe
Mammalia, ordem Rodentia, da linhagem Wistar, desmamados e obtidos no Biotério
Suprilab (Suprimento de Laboratórios e Biotérios) em Cachoeira/Ba.
Os procedimentos e a manutenção dos ratos foram realizados no biotério de
experimentação animal do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal
da Bahia. Os ratos foram mantidos em gaiolas plásticas apropriadas, contendo no
máximo três ratos/gaiola, em local livre de ruídos, com condições normais de
umidade, temperatura média de 23oC e em ciclo de 12h de luz-escuridão. Cada
gaiola foi forrada por maravalha, sendo substituída a cada 48 horas, propiciando,
assim, condições favoráveis de higiene e preenchendo os requisitos físico-químicos
para a saúde e bem-estar dos animais.
4.3 – DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS
Após o período de desmame, os ratos foram distribuídos aleatoriamente em
dois grupos experimentais: os que foram alimentados com dieta padrão (DP) e os
que foram alimentados com dieta hiperlipídica (DH), ad libitum, durante o período de
20 semanas. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em quatro subgrupos,
avaliados em dois tempos biológicos pós-operatórios (7 e 14 dias) de acordo com o
tipo de dieta, protocolo de irradiação e tempo experimental (Quadro 1).
36
Quadro 1: Distribuição dos ratos nos grupos experimentais de acordo com o tipo de
dieta, protocolo de irradiação e tempo experimental.
GRUPO
TEMPO
EXPERIMENTAL
(DIAS)
NÚMERO
DE
RATOS
TIPOS
DE
DIETA
DESCRIÇÃO
TRATAMENTO
DPC 7 ou 14dias 12 Dieta Padrão
Controle
Controle
(sem laser)
DPL 7 ou 14dias 12 Dieta Padrão
Laser
Laser GaAlAs λ660nm –
24 J/cm², 40mW, CW
DHC 7 ou 14dias 12 Dieta
Hiperlipídica
Controle
Controle
(sem laser)
DHL 7 ou 14dias 12 Dieta
Hiperlipídica
Laser
Laser GaAlAs λ660nm –
24 J/cm², 40mW, CW
4.4 – MANIPULAÇÃO NUTRICIONAL
O grupo controle foi alimentado com uma dieta padrão (NUVILAB - Nuvital
Nutrientes S / A, Brasil). O grupo DH foi alimentado com uma dieta de cafeteria, rica
em gordura, que foi iniciada no 22º dia depois do aleitamento. A Dieta Hiperlípidica
foi composta de alimentos que constituem as refeições básicas. Esta dieta contém
17% de proteína e um elevado teor de gordura (23%) (Tabela 1). Todos os ratos
foram alimentados durante 20 semanas.
37
TABELA 1. Composição da dieta padrão (DP) e dieta hiperlipídica (DH)
Componentes (%) Dieta DP
DH
Carboidratos (%) 57 46
Proteínas (%) 22 17
Gordura (%) 4 23
Energia (Kcal/g) 3,5 4,5
A dieta padrão (Nuvilab® CR1, Brasil) foi composta de milho integral moído,
farelo de trigo, carbonato de cálcio, fosfato bicálcico, vitaminas e sais minerais. A
dieta hiperlipídica previamente padronizada por Estadella et al. (2004) e analisada
por Oliveira et al. (2011) foi composta de uma mistura da ração padrão (Nuvilab®
CR1, Brasil), chocolate ao leite, amendoim torrado e biscoito maisena (Figura 1), na
proporção de 3:2:2:1, seguindo a sequência citada, os ingredientes foram triturados,
misturados e peletizados e, após a secagem em estufa, a dieta era oferecida aos
ratos.
Figura 1 - Dieta Hiperlipídica (DH) e Dieta Padrão (DP) (UFBA, 2014).
DH DP
38
4.5 – AVALIAÇÃO PONDERAL
Os ratos foram pesados duas vezes por semana, desde a introdução da dieta
até a finalização do experimento (Figura 2). Para isso foi utilizada uma balança
digital (Filizola,MF-3) com capacidade máxima de 3000g e precisão de 0,5g. Após a
morte dos ratos, foi feita uma incisão no abdômen, remoção de todas as vísceras,
separação da gordura retroperitoneal e pesagem para comparação da quantidade
de tecido adiposo entre os grupos.
Figura 2 - Ratos que receberam dieta hiperlipídica e dieta padrão (UFBA, 2014).
DH DP
39
4.6 – PROCEDIMENTO CIRÚRGICO
Após o período de 20 semanas de indução da obesidade, os ratos foram
submetidos à anestesia geral, com injeção intraperitoneal de cloridrato de quetamina
10% (Cetamin®) e cloridrato de xilazina 2% (Xilazin®) na posologia de 80mg/Kg e
14mg/Kg, respectivamente. Em seguida, com os ratos posicionados em decúbito
ventral, foi realizada a tricotomia manual da região média do dorso e antissepsia da
área cirúrgica com Digluconato de Clorexidina a 2%. Em todos os ratos foram
confeccionadas feridas cutâneas excisionais padronizadas de 1cm x 1cm com
auxílio de um bisturi modificado com lâminas de bisturi nº 15 e um gabarito
padronizado de 1cm². As feridas foram deixadas sem sutura para cicatrizar por
segunda intenção.
Após o procedimento cirúrgico, os ratos foram mantidos individualmente em
suas respectivas gaiolas plásticas, devidamente identificadas de acordo com o grupo
ao qual fazia parte, e mantidos em constante observação até a finalização do
período experimental.
Figura 3 - Demarcação dos pontos correspondentes aos ângulos da ferida cirúrgica (UFBA, 2014).
Figura 4 - Incisão para confecção da ferida cirúrgica (UFBA, 2014).
40
4.7 – PROTOCOLO DE IRRADIAÇÃO
Para a irradiação dos grupos experimentais, foi utilizado o aparelho de Laser
diodo de Arseneto de Gálio e Alumínio (GaAlAs), (modelo Twin Flex Evolution,
MMoptics®, São Carlos, SP) no comprimento de onda vermelho (λ660nm), com
emissão de radiação contínua (Continuous Wave), potência de 40mW e área de
saída do feixe da ponteira de 0,04cm2. O protocolo de irradiação nos grupos
irradiados por laser DPL e DHL, por sessão, consistiu na aplicação da densidade de
energia de 24J/cm2, sendo iniciada imediatamente após a confecção da ferida
excisional, repetindo-as com intervalo de 48 horas, até a morte dos ratos (7 ou 14
dias pós-operatórios). A dose total de tratamento consistiu de 96J/cm² e 168J/cm²,
ao final dos períodos experimentais de 7 e 14 dias, respectivamente
A irradiação com o laser foi realizada de forma pontual em quatro pontos
correspondentes aos ângulos da ferida, o mais próximo de suas bordas. A ponta do
laser foi mantida em posição perpendicular ao tecido irradiado, a fim de garantir
maior absorção da energia. Em cada ponto foi depositada uma densidade de
energia de 6J/cm² com o tempo de aplicação de 2 minutos e 30 segundos,
totalizando 24J/cm² e um tempo de aplicação total de 10 minutos por sessão.
Figura 5 - Ferida cirúrgica imediatamente após a confecção (UFBA, 2014).
41
Quadro 2: Parâmetros utilizados no protocolo de irradiação (UFBA, 2014).
GRUPOS
PARÂMETROS
DIETA PADRÃO
E DIETA
HIPERLIPÍDICA
CONTROLE
DIETA PADRÃO E DIETA
HIPERLIPÍDICA
LASER
7 dias 14 dias 7 dias 14 dias
Comprimento de onda (nm)
-
-
660nm
660nm
SAEF (J/cm² - sessão)
-
-
24J/cm²
24J/cm²
SAEF (J/cm² - tratamento)
-
-
96J/cm²
168J/cm²
Potência Output (mW)
-
-
40mW
40mW
Área do tecido iluminada
(cm²)
1 cm²
1 cm²
1 cm²
1 cm²
Área do Spot (cm²)
-
-
0,04cm²
0,04cm²
Irradiância (mW/cm²)
-
-
1000mW/cm²
1000mW/cm²
Tempo de irradiação
(sessão)
-
-
10 min
10 min
Tempo de irradiação
(tratamento)
-
-
40 min
70 min
Figura 6 - Aparelho utilizado para realização da fototerapia laser (UFBA, 2014).
Figura 7 - Irradiação da ferida cirúrgica com a luz Laser de emissão vermelha (UFBA, 2014).
42
4.8 – MORTE DOS RATOS E OBTENÇÃO DA AMOSTRA
Ao final do período experimental para cada grupo (7 ou 14 dias), os ratos
foram submetidos a aprofundamento anestésico, através de TBE (tribromoetanol),
via jugular. A partir da cessação dos sinais vitais e opacificação da córnea, as peças
foram removidas através de uma excisão realizada ao redor da ferida com margem
de tecido de 1cm, e acondicionadas em frascos plásticos devidamente identificados
contendo formol a 10%, com volume aproximadamente igual a cinco vezes o volume
da peça, onde permaneceram por 24h para sua fixação. Em seguida foram
encaminhadas ao Laboratório de Patologia Cirúrgica Oral do Departamento de
Propedêutica e Clínica Odontológica da Faculdade de Odontologia da Universidade
Federal da Bahia (FOUFBA), onde foram processadas. A gordura retroperitoneal foi
removida e, após pesagem, descartada.
Figura 8 - Gordura retroperitoneal de ratos do Grupo Dieta Padrão (UFBA, 2014).
Figura 9 - Gordura retroperitoneal de ratos do Grupo Dieta Hiperlipídica (UFBA, 2014).
43
4.9 – PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Após o período de fixação, as peças foram submetidas ao processamento
pela técnica histológica de rotina e incluídas em parafina. Os cortes foram realizados
em micrótomo com espessura de 4m, sendo destinada à coloração histológica com
Hematoxilina e Eosina (HE).
A avaliação histológica foi realizada sob microscopia de luz (AxioStar®, Zeiss,
Germany) em estudo cego por um patologista experiente, de forma semi-
quantitativa, de acordo com os critérios encontrados nos Quadros 3.
44
Quadro 3: Critérios utilizados na análise histológica.
Variáveis
Scores
Reepitelização
Reepitelização ausente
Reepitelização recobrindo menos da metade da ferida Reepitelização recobrindo mais da metade da ferida Reepitelização recobrindo toda a ferida, com espessura irregular Reepitelização recobrindo toda a ferida, com espessura regular
Inflamação Aguda
Discreta Presença de até 25% de neutrófilos na área
Moderada Presença de 25 a 50% de neutrófilos na área
Intensa Presença superior a 50% de neutrófilos na área
Inflamação Crônica
Discreta Presença de até 25% de células inflamatórias crônicas na área
Moderada Presença de 25 a 50% de células inflamatórias crônicas na área
Intensa Presença superior a 50% de células inflamatórias crônicas na área
Hiperemia
Discreta Quantidade de vasos sanguíneos dilatados e congestos inferior ao tecido adjacente normal
Moderada Quantidade de vasos sanguíneos dilatados e congestos similar ao tecido adjacente normal
Intensa Quantidade de vasos sanguíneos dilatados e congestos superior ao tecido adjacente normal
Fibroblastos
Discreta Presença de até 25% de fibroblastos em relação a outros tipos celulares do tecido.
Moderada Presença de 25 a 50% de fibroblastos em relação a outros tipos celulares do tecido.
Intensa Presença superior a 50% de fibroblastos em relação a outros tipos celulares do tecido.
Deposição de colágeno
Discreta Presença de até 25% de deposição de fibras colágenas na área
Moderada Presença de 25 a 50% de deposição de fibras colágenas na área
Intensa Presença superior a 50% de deposição fibras colágenas na área
Distribuição das fibras colágenas
Regular Distribuição regular das fibras colágenas quando comparadas ao tecido normal adjacente
Irregular Distribuição irregular das fibras colágenas quando comparadas ao tecido normal adjacente
45
4.10 – ANÁLISE DOS DADOS
Os dados obtidos foram tabulados utilizando o programa Microsoft Excel e
analisados estatisticamente com auxílio do programa SPSS versão 13.0. Foram
utilizados os seguintes testes estatísticos: para comparação do peso corporal e
gordura retroperitoneal foi utilizado o teste t de Student, considerando uma
significância de 5%. Para a comparação intra e intergrupo das variáveis histológicas
foi utilizado o teste não paramétrico Exato de Fisher, considerando uma significância
de 5%.
46
5. RESULTADOS
5.1 – AVALIAÇÃO PONDERAL E PESO DA GORDURA RETROPERITONEAL
A avaliação ponderal demonstrou que não houve diferença estatisticamente
significante entre os grupos DP e DH (p>0,05). Entretanto, a dieta hiperlipídica foi
capaz de promover o acúmulo de gordura na região retroperitoneal dos ratos do
grupo DH. Este grupo apresentou um acúmulo de gordura abdominal
significantemente mais elevado quando comparado com o grupo alimentado com
dieta padrão (p=0,000). A evolução do peso corporal e do peso absoluto e relativo
da gordura retroperitonial podem ser observadas nas figuras 10, 11 e 12.
Figura 10 - Evolução do peso corporal em 20 semanas de dieta padrão ( ) e dieta
hiperlipídica ( ). Os resultados estão expressos como ± desvio padrão da média.
Comparação entre os grupos DP e DH não foram significantes (p>0,05) (Teste t de
Student).
47
DP DH 0
1
2
3
4
Gordura Retroperitoneal
Peso
(g
) em
100 g
de
peso
co
rpo
ral
**
Figura 11 - Peso relativo da gordura retroperitoneal após 20 semanas de dieta padrão e
hiperlipídica. Os resultados estão expressos como ± desvio padrão da média. Comparação
entre os grupos DP e DH foi estatisticamente significante (p=0,000) (teste t de Student).
48
5.2 – ANÁLISE HISTOLÓGICA
Os resultados foram obtidos por meio da microscopia de luz, para todos os
grupos experimentais, como descrito anteriormente.
5.2.1 – ANÁLISE DESCRITIVA
GRUPO DPC
Aos 7 dias, o grupo DPC mostrou a presença de ferida cutânea com
reepitelização em fase inicial ocupando uma área inferior a 1/3 em 100% dos
espécimes. Na derme observou-se quadro inflamatório intenso (Figuras 15 e 16)
caracterizado por hiperemia intensa e células predominantemente mononucleares
(100% dos espécimes). Em 20% dos espécimes observou-se população de células
polimorfonucleares em maior destaque que no restante. A reação fibrocelular foi
caracterizada por proliferação moderada de fibroblastos de núcleos ovóides em 60%
dos espécimes e deposição moderada de fibrilas colágenas em 60% dos espécimes.
Aos 14 dias, o grupo DPC mostrou processo de reepitelização avançado, com
recobrimento total da ferida em 50% dos espécimes e recobrimento moderado em
33,3%. A intensidade do processo inflamatório decresceu, sendo considerado leve
em 100% dos espécimes, com linfócitos esparsamente distribuídos e hiperemia
reduzida (Figuras 17 e 18). Observou-se maior atividade fibroblástica e
espessamento das fibras colágenas, que se apresentaram regularmente distribuídas
em 100% das amostras.
49
GRUPO DPL
Aos 7 dias do experimento, foi observado repavimentação epitelial inferior a
30% da área da ferida em todos os espécimes. A intensidade do processo
inflamatório foi considerada moderada em 100% dos espécimes (Figuras 15 e 16),
entretanto, observou-se hiperemia vascular intensa em 83,3% casos e presença de
células polimorfonucleares (33,3%). O padrão do infiltrado inflamatório foi crônico em
66,6% dos casos. A reação fibrocelular variou de discreta a moderada em 50% dos
casos (Figuras 19 e 20), com deposição discreta de fibrilas colagênicas em 66,6%
(Figuras 21 e 22). Em áreas focais observou-se exsudato fibrinoso.
Aos 14 dias, o grupo DPL mostrou epitelização inferior a 1/3 da área da ferida
em 66,6% dos espécimes, enquanto que em 33,3% da amostra apresentou
epitelização recobrindo mais da metade da ferida. O infiltrado inflamatório foi leve
em 100% dos espécimes, caracterizadas por células predominantemente
linfocitárias. Em relação à proliferação fibrocelular, observou-se proliferação intensa
de fibroblastos em 33,3% da amostra e moderada em 66,6%. A deposição de fibras
colágenas foi moderada em todas as amostras e a hiperemia esteve moderada em
66,7%.
GRUPO DHC
Aos 7 dias, no grupo DHC, observou-se úlcera cutânea com repavimentação
epitelial inferior a 30% da área da ferida e hiperemia severa em 100% dos
espécimes, infiltrado inflamatório predominantemente misto (66,7%) e intenso
(77,8%), com presença de exsudato fibrinoso. Em termos de reação fibrocelular,
proliferação fibroplástica moderada em 77,8% e deposição de fibrilas colagênicas
discretas e regulares.
Aos 14 dias, observou-se no grupo DHC, repavimentação completa em
apenas 11,1% dos espécimes, enquanto que 55,6% dos espécimes mostraram
repavimentação maior que 50% da área da ferida (Figuras 23 e 24). O infiltrado
inflamatório decresceu de intensidade, sendo que 66,7% dos espécimes
50
apresentaram inflamação discreta, predominantemente crônica 66,6%. Entretanto,
observou-se a persistência de neutrófilos polimorfonucleares em 33% da amostra, e
hiperemia moderada em 77,8% dos espécimes (Figuras 17 e 18). A proliferação
fibroblástica foi intensa (55,6%) e a deposição de fibras colágenas de padrão regular
e intensidade moderada compatível com tempo pós-operatório.
GRUPO DHL
Aos 7 dias, observou-se no grupo DHL, repavimentação epitelial em área
inferior a 1/3 da ferida em 100% das espécimes. A intensidade do processo
inflamatório foi moderada em 77,8% dos espécimes, sendo de celularidade mista em
66,6% dos espécimes. A hiperemia variou de moderada a intensa (50% - 50%) e em
relação à proliferação fibroblástica, esta foi moderada a intensa (66,6% e 33,3%
respectivamente) (Figuras 19 e 20). A deposição de colágeno foi moderada em
todos os espécimes (Figuras 21 e 22). Observou-se neste grupo uma expressiva
presença de adipócitos no tecido de granulação de 66,6% das amostras (Figura 25).
Aos 14 dias do experimento, observou-se ferida recoberta completamente por
epitélio em 1/3 dos espécimes (Figuras 23 e 24) e pela metade em outros 1/3. A
derme apresentou infiltrado inflamatório discreto em 77,8%, predominantemente
linfocitário. As fibras colágenas apresentaram deposição regular e intensa, assim
como a proliferação de fibroblastos 88,8% dos espécimes. A hiperemia vascular foi
variável entre discreta e intensa.
51
Figura 12 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Padrão Controle aos 7 dias mostrando intenso infiltrado inflamatório (HE, aumento aproximado de 200X) (UFBA, 2014).
Figura 13 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Padrão Laser aos 7 dias mostrando infiltrado inflamatório moderado (HE, aumento aproximado de 400X) (UFBA, 2014).
Figura 14 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Padrão Controle aos 14 dias mostrando hiperemia moderada (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
Figura 15 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Controle aos 14 dias mostrando hiperemia intensa (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
52
Figura 16 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Controle aos 7 dias mostrando proliferação fibroblástica moderada (HE, aumento aproximado de 200X) (UFBA, 2014).
Figura 17 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 7 dias mostrando proliferação fibroblástica intensa (HE, aumento aproximado de 200X) (UFBA, 2014).
Figura 18 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Padrão Laser aos 7 dias mostrando deposição discreta de colágeno (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
Figura 19 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 7 dias mostrando deposição moderada de colágeno (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
53
5.2.2 – Análise estatística
Figura 20 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Controle aos 14 dias mostrando reepitelização incompleta (HE, aumento aproximado de 50X) (UFBA, 2014).
Figura 21 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 14 dias mostrando reepitelização completa (HE, aumento aproximado de 50X) (UFBA, 2014).
Figura 22 - Fotomicrografia do Grupo Dieta Hiperlipídica Laser aos 7 dias mostrando tecido de granulação com intensa quantidade de adipócitos (HE, aumento aproximado de 100X) (UFBA, 2014).
54
5.2.1 – ANÁLISE ESTATÍSTICA
GRUPOS EXPERIMENTAIS DE 7 DIAS
Nos grupos dieta padrão, em relação à variável reepitelização, a análise
estatística não demonstrou diferença estatisticamente significante entre os grupos
DPC e DPL (p>0,05). No grupo dieta hiperlipídica, o grupo irradiado DHL também
não diferiu estatisticamente quando comparado com o grupo controle DHC. Quando
os grupos dieta padrão (DPC e DPL) foram confrontados com os respectivos grupos
dieta hiperlipídica (DHC e DHL), observou-se que também mantiveram graus
similares de reepitelização.
Quando a intensidade do infiltrado inflamatório foi avaliada, observou-se
inflamação significativamente intensa para o grupo controle DPC (p=0,002) (Figura
23) quando comparado ao grupo irradiado DPL. O grupo irradiado DHL também
diferiu estatisticamente do grupo controle DHC, apresentando menor grau de
intensidade no processo inflamatório (p=0,01) (Figura 24). Não houve diferença
estatisticamente significante quando a avaliação foi feita intergrupo.
A análise estatística em relação à variável tipo do infiltrado inflamatório agudo
e crônico não revelou diferença estatisticamente significante entre os grupos
avaliados.
55
DPC DPL0
25
50
75
100discreta
moderada
intensa
Dieta
Infl
am
ação
(%)
DHC DHL0
25
50
75
100discreta
moderada
intensa
Dieta
Infl
am
ação
(%)
Figura 23: Comparação entre os grupos Dieta Padrão Controle e Dieta Padrão Laser
avaliados no período de 7 dias em relação ao infiltrado inflamatório.
Infiltrado inflamatório: p=0,002 (DPC x DPL) (UFBA, 2014).
Figura 24: Comparação entre os grupos Dieta Hiperlipídica Controle e Dieta
Hiperlipídica Laser avaliados no período de 7 dias em relação ao infiltrado inflamatório.
Infiltrado inflamatório: p=0,01 (DHC x DHL) (UFBA, 2014).
**
*
56
Na análise da proliferação fibroblástica, não houve diferença estatisticamente
significante quando os grupos dieta padrão e dieta hiperlipídica controles e
irradiados foram confrontados entre si na avaliação intragrupo. Na avaliação
intergrupo, quando os grupos dieta padrão foram comparados com o grupo dieta
hiperlipídica, a análise revelou que o grupo irradiado DHL apresentou proliferação
fibroblástica mais intensa que o grupo DPL (p=0,01) (Figura 25), nenhuma diferença
estatisticamente significante foi observada entre os grupos controles.
DPL DHL0
25
50
75
discreta
moderada
intensa
Dieta
Pro
life
ração
de
Fib
rob
lasto
s (
%)
Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos quando a
variável hiperemia foi analisada.
A análise da variável deposição de fibras colágenas revelou que os grupos
dieta hiperlipídica diferiram estatisticamente, o grupo DHL apresentou maior
deposição de fibras colágenas que o grupo DHC (p<0,05) (Figura 26), os grupos
dieta padrão não apresentaram diferença estatisticamente significante. Quando a
avaliação foi realizada intergrupo, a análise revelou que o grupo DHL apresentou
diferença estatisticamente significante e maior deposição de fibras colágenas
quando comparado ao grupo DPL (p=0,001) (Figura 27), porém não foram
observadas diferenças entre os grupos controles.
Figura 25: Comparação entre os grupos Dieta Padrão Laser e Dieta Hiperlipídica Laser
avaliados no período de 7 dias em relação a proliferação fibroblástica.
Proliferação fibroblástica: p=0,01 (DHL x DPL) (UFBA, 2014).
*
57
DHC DHL0
25
50
75
100discreta
moderada
intensa
Dieta
Dep
osiç
ão
Co
lág
en
o (
%)
DPL DHL0
25
50
75
100 discreta
moderada
intensa
Dieta
Dep
osiç
ão
Co
lág
en
o (
%)
Figura 26: Comparação entre os grupos Dieta Hiperlipídica Controle e Dieta
Hiperlipídica Laser avaliados no período de 7 dias em relação à Deposição de fibras
colágenas.
Deposição de fibras colágenas: p<0,05 (DHL x DHC) (UFBA, 2014).
Figura 27: Comparação entre os grupos Dieta Padrão Laser e Dieta Hiperlipídica Laser
avaliados no período de 7 dias em relação à Deposição de fibras colágenas.
Deposição de fibras colágenas: p=0,001 (DHL x DPL) (UFBA, 2014).
*
**
58
GRUPOS EXPERIMENTAIS DE 14 DIAS
Quando a análise estatística foi aplicada aos grupos dieta padrão e dieta
hiperlipídica em 14 dias, não foram encontradas diferenças estatisticamente
significantes quando as variáveis reepitelização, inflamação e tipo de infiltrado
inflamatório foram aplicadas nas avaliações intra e intergrupos (p>0,05). Embora,
observou-se maior intensidade no grau de reepitelização no grupo DPC em relação
ao grupo DHC, e maior intensidade no infiltrado inflamatório com persistência de
células da inflamação aguda tenham sido visualizadas no grupo DHC quando
comparado ao grupo DPC.
Em relação à proliferação fibroblástica, os melhores resultados foram
observados no grupo DHL em comparação com o grupo DPL, porém sem
significância estatística (p>0,05). As outras associações também não apresentaram
diferenças estatisticamente significantes.
Quando a hiperemia foi avaliada, houve uma diferença estatisticamente
significante entre os grupos DPC e DHC. O grupo dieta hiperlipídica apresentou
hiperemia mais intensa do que o grupo dieta padrão (p=0,001) (Figura 28). As outras
avaliações não demonstraram diferenças estatisticamente significantes quando a
variável foi hiperemia.
Avaliando o grupo dieta hiperlipídica, a deposição de colágeno foi menor no
grupo controle quando comparado ao grupo irradiado, porém não significante
estatisticamente (p>0,05). As outras associações não demonstraram diferenças
estatisticamente significantes.
59
DPC DHC0
25
50
75
100
discreta
moderada
intensa
Dieta
Hip
ere
mia
(%
)
Figura 28: Comparação entre os grupos Dieta Padrão Controle e Dieta Hiperlipídica
Laser avaliados no período de 14 dias em relação à Hiperemia.
Hiperemia: p=0,001 (DPC x DHC) (UFBA, 2014).
**
60
6. DISCUSSÃO
No presente estudo, avaliou-se o consumo de uma dieta com maior teor
lipídico e os efeitos desta dieta e da fototerapia a laser no reparo tecidual de feridas
subcutâneas em ratos Wistar. Nosso estudo mostrou que o acúmulo de tecido
adiposo retarda o processo de reparo por prolongar a fase inflamatória da
cicatrização.
Com a mudança nos hábitos alimentares e a crescente inserção de alimentos
com alto teor calórico, que induzem à obtenção de peso e consequente risco para a
o desenvolvimento da obesidade, tem aumentado também o número de problemas
relacionados a este estado de saúde. A obesidade é um fator negativo quando se
trata do reparo das feridas, os estudos realizados em animais têm comprovado esta
afirmativa, sendo a cicatrização deficiente quando comparados animais acima do
peso com os animais normais (SLAVKOVSKY et al., 2011; BIONDO-SIMÕES et al.,
2010).
Tendo-se em vista o uso de uma dieta hiperlipídica, esta pode promover a
obesidade em ratos. Entretanto, nas pesquisas de avaliação com modelos animais,
alguns se mostram resistentes à indução a obesidade, como observado neste
estudo. Nossos resultados corroboram com trabalhos anteriores (NASCIMENTO et
al., 2008; NASCIMENTO & COSTA, 2006; DOBRIAN et al., 2000), demonstrando
que, semelhante aos humanos, os ratos também apresentam uma distribuição
bimodal de massa corporal, e portanto, nem todos os ratos alimentados com uma
dieta rica em gordura tornam-se obesos.
A dieta hipercalórica utilizado para promover a obesidade experimental tem
sido apresentada em diversas formas de pastilhas ou como alimentos in natura, esta
segunda é mais conhecida como dieta de cafeteria, sendo uma dieta altamente
energética, saborosa e contendo diferentes formas, portanto, mais próxima do
alimento consumido em geral pelos seres humanos (ESTADELLA et al., 2011;
NASCIMENTO et al., 2008). Por isso, a dieta de cafeteria foi utilizada na nossa
pesquisa e, de fato, a ingestão de uma dieta rica em gordura promove um aumento
significativo de tecido adiposo e de ganho de peso corporall em animais que a
61
consomem, mas este perfil não acontece nos casos dos animais resistentes a esta
dieta (PÉREZ-ECHARRI et al., 2008).
Tem sido demonstrado que a obesidade conduz a uma redução na
quantidade de alimento consumido (NASCIMENTO, 2008), como resposta ao alto
nível de leptina nos ratos obesos. A leptina, um hormônio sintetizado e secretado
pelo tecido adiposo é, principalmente, envolvida na regulação do apetite e
metabolismo energético, por sua vez, indicando ao cérebro que uma alimentação
adequada já foi alcançada (BUETTNER, SCHOLMERICK & BOLHEIMER, 2007;
KERSHAW & FLIER, 2004; JEQUIER, 2002; DE SCHEPPER et al., 1998). Neste
estudo, os animais alimentados com DH não ganharam sobrepeso corporal, porém
apresentaram uma massa de gordura retroperitoneal significantemente maior
comparado ao grupo dieta padrão, possivelmente devido a produção de leptina pelo
tecido adiposo que reduziu a quantidade de ração consumida pelo grupo
hiperlipídico.
Os modelos animais usualmente utilizados em pesquisas relacionadas à
obesidade e insulino resistência apresentam mutação nos receptores do hormônio
leptina e, por ingerirem maiores quantidades de alimentos, tornam-se obesos
rapidamente. Bauer et al. (2004) utilizaram ratos JCR: LA cp para avaliar a
associação da obesidade e diabetes com o retardo da cicatrização da ferida, estes
animais apresentaram uma diminuição do conteúdo de colágeno e uma diminuição
significativa na contração da ferida.
Mais recentemente, outro modelo utilizado por Slavskovky et al. (2011), com
ratos Zucker diabetic Fatty (ZDF), geneticamente modificado, foram utilizados para
avaliar o reparo tecidual das feridas, os ratos obesos e diabéticos apresentaram um
retardo no processo de cicatrização, com prolongamento no processo inflamatório e
demora na redução da ferida quando comparado com os ratos normais,
corroborando com os relatos previamente encontrados por Bauer et al. (2004).
Como sugerido por Slavskovky et al. (2011), o tecido adiposo pode influenciar
na cicatrização de feridas por diversos fatores, como a limitação da migração celular
e o aumento na produção de adipocinas. Pode prejudicar a organização de
fibroblastos e miofibroblastos e, além disso, o retardo na contração pode ser
62
mediado através de alterações físicas tais como tensão na pele devido à obesidade.
Nós corroboramos com estes autores quando o processo inflamatório foi avaliado, o
prolongamento da fase inflamatória associada à dieta hiperlipídica também foi
verificada e a hiperemia persistiu após os 14 dias da realização da ferida.
A obesidade é causada por uma desregulação na massa de tecido adiposo
branco e, as alterações neste tecido são causadas por mudanças no tamanho e/ou
número de adipócitos através de uma interação complexa entre proliferação e
diferenciação de pré-adipócitos (GREGOIRE, SMAS & SUL, 1998). As recentes
pesquisas em relação à biologia do tecido adiposo têm demonstrado que o tecido
adiposo branco desempenha uma função não apenas na regulação do balanço
energético, mas também atua como um órgão secretor/endócrino que medeia vários
processos fisiológicos e patológicos (MEDINA-GOMEZ, 2012; GESTA, TSENG &
KAHN, 2007; KERSHAW & FLIER, 2004)
É consistente na literatura que os adipócitos e os fibroblastos pertencem à
mesma família, a chamada família de células do tecido conjuntivo. Neste grupo
também fazem parte os condrócitos, osteócitos e células musculares lisas, que não
estão apenas correlacionadas, mas também, geralmente são conversíveis entre si.
No entanto, embora a diferenciação destes tipos de células seja frequentemente
interconversível, a transformação de fibroblastos em adipócitos é considerado um
fenômeno de sentido único (BROWNNELL et al., 1996).
A evidência da possibilidade do inverso foi apresentado por De Andrade et al.
em 1998, que após os resultados de sua pesquisa consideraram mais consistente a
ideia de que os adipócitos se transformem em fibroblastos, não o contrário. Sua
hipótese foi baseada na sequência de tempo do estudo, no qual observou-se
inicialmente células de gordura grandes com múltiplas gotículas e, mais tarde, o
aparecimento de células progressivamente alongadas, onde as gotículas de gordura
tenderam a diminuir em tamanho e número, enquanto o retículo endoplasmático
rugoso se tornou cada vez mais proeminente, fato considerado para a interpretação
dos resultado.
O relato supracitado poderia explicar um achado incomum neste estudo e
pouco relatado na literatura (MEIRELES et al. 2008; MENDEZ et al., 2004), a
63
presença de inúmeros adipócitos na porção mais superficial do tecido de granulação
após sete dias de irradiação, neste sentido os adipócitos presentes na área,
induzidos pela irradiação, seriam recrutados e transformados em fibroblastos para
desta forma reparar o tecido danificado, pois essa célula desempenha um
importante papel no processo de reparo tecidual.
Estudos in vitro tem sido realizados com o intuito de avaliar a
desdiferenciação de adipócitos maduros em células tronco. As células tronco tem
forte atividade reprodutiva, bem como osteogênica, condrogênica e forte capacidade
adipogênica (LIAO, GAO & LU, 2011). SHEN et al. (2013) avaliaram in vitro o efeito
da irradiação com laser de baixa intensidade na proliferação e transdiferenciação de
células-tronco derivadas do tecido adiposo em células neuronais. Os resultados
mostraram que, embora a laserterapia não tenha induzido a proliferação das células,
ela acelerou a diferenciação de células-tronco derivadas do tecido adiposo em
células neuronais. Eles acreditam que ajustando a dose e o tempo de aplicação do
laser, e desta forma, alcançando parâmetros ideais, melhores resultados poderão
ser obtidos e a partir de novos estudos em modelos animais poderão contribuir para
o desenvolvimento de terapia celular, o que pode beneficiar os pacientes com
Acidente Vascular Cerebral.
Os efeitos da laserterapia de baixa intensidade sobre o processo de
cicatrização de feridas é um dos aspectos mais completamente estudados deste tipo
de terapia e influencia todos as fases deste complexo processo. Vários são os
fatores considerados importantes para os resultados dos tratamentos que envolvem
a laserterapia e o uso de muitos dos protocolos utilizados geram resultados
conflitantes. Por isso, a escolha de parâmetros apropriados é essencial para que
bons resultados sejam conseguidos. Estes parâmetros devem incluir o comprimento
de onda, a densidade de potência, dose, duração, frequência de aplicações, dentre
outros (PINHEIRO, 2001).
Diante dos conhecidos benefícios da aplicação do laser nos diversos tecidos
já demonstrados na literatura, alguns autores (HAWKINS & ABRAHAMSE, 2006;
CHEN et al., 2005) relatam resultados controversos em que a laserterapia não
obteve nenhum efeito, ou mesmo inibiu o processo de reparo. Estes resultados
tendem a ocorrer devido ao uso de diversificados modelos experimentais, tipos de
64
lasers, comprimento de onda, potência, fluência, tempo, frequência e número de
irradiações. Embora, alguns estudos que utilizaram parâmetros similares relataram
resultados conflitantes (WALKER et al., 2000).
Alguns estudos mostram que múltiplas exposições com doses mais elevadas
podem causar tensão adicional à célula, reduzindo a viabilidade celular e atividade
do ATP e a inibição da proliferação celular. Hawkins & Abrahamse (2006) avaliaram
a resposta celular à exposição de 3 diferentes doses (2.5, 5.0, e 16.0 J/cm²) de
irradiação. Os resultados mostraram que uma única dose de 5,0 J/cm², e duas ou
três doses de 2,5 J/cm² tiveram um efeito estimulador sobre os fibroblastos, com
aumento da migração e proliferação celular. Entretanto, múltiplas exposições a
doses mais elevadas (16 J/cm²) causaram tensão adicional às células, o que reduziu
a migração celular, a viabilidade celular, a atividade de ATP e inibiu a proliferação
celular. Desta forma, a combinação de densidade de energia e número de
exposições são necessárias para que a atividade mitocondrial seja estimulada sem
que ocorram danos adicionais às celulas e os efeitos estimulantes da fototerapia a
laser sejam alcançados.
Mendez et. al. (2004) avaliaram os efeitos de diferentes comprimentos de
onda na cicatrização de feridas de ratos utilizando 2 doses de energia. Eles
observaram que, quando comparadas as 2 doses, os experimentos com menores
doses de energia obtiveram os melhores resultados, independente do comprimento
de onda utilizado. Porém, avaliando os animais com aplicação de uma dosagem de
energia mais alta os animais controles, os irradiados tiveram melhores resultados,
eles consideraram que, mesmo uma alta dose de irradiação, que poderia ser
prejudicial ao processo de reparo, pode ser benéfica em consequência da atenuação
da luz durante a penetração e quando uma maior quantidade de energia é usada,
mais energia é deixada dentro do tecido depois da atenuação.
Quando a laserterapia é utilizada de maneira adequada como ferramenta para
promover o reparo tecidual, sua ação pode ser visualizada em todas as etapas deste
processo. A literatura indica que a fotobiomodulação a laser acelera a inflamação,
promove a proliferação de fibroblastos, facilita síntese de colágeno, estimula a
imunidade, e até mesmo acelera a cicatrização (HAWKINS, HOURELD &
ABRAHAMSE, 2005).
65
A escolha do comprimento de onda utilizado no presente estudo baseou-se
no fato de que 660 nm possui uma absorção superficial (PINHEIRO et al., 2009),
sendo indicada para as lesões que acometem feridas excisionais mais superficiais,
já que os efeitos dos lasers nas células são dependentes do comprimento de onda e
doses utilizadas, podendo influenciar no processo de cicatrização, como já bem
relatado na literatura (KARU, 1989).
Em relação ao protocolo utilizado, nós concordamos com a maioria dos
autores que sugerem que um intervalo de 48h entre as aplicações do laser seja o
mais indicado (RAMALHO et al., 2010; AL-WATBAN et al., 2009; VIEGAS et al,
2007; NICOLAU et al., 2003), contudo, existem trabalhos que sugerem a aplicação
com intervalos de 24h e, conseguiram os mesmos efeitos satisfatórios quando
comparados com os trabalhos realizados com aplicações intercalados (USUMEZ et
al., 2013; PINHEIRO, 2009).
A primeira fase do processo de reparo tecidual é a inflamação, esta é uma
etapa que pode ser modulada pela fototerapia a laser e por isso essa técnica vem
sendo aplicada com esta finalidade. Viegas et al. (2007) compararam os efeitos da
laserterapia utilizando dois comprimentos de onda (685 nm e 830 nm) e uma droga
antiinflamatória na modulação da resposta inflamatória durante o reparo tecidual em
diferentes tempos cirúrgicos. Eles observaram que os resultados foram similares
para os dois comprimentos de onda, apesar de seus diferentes mecanismos de ação
nas células. Porém, em comparação com o grupo controle e o grupo antiinflamatório,
uma melhor qualidade histológica durante o reparo foi observada nos grupos
irradiados, o que é favorável para a recuperação do tecido, porém, não foram
observados efeitos antiinflamatórios do laser na cicatrização das feridas.
Neste estudo foi possível observar que o infiltrado inflamatório foi mais
duradouro e intenso nos grupos dieta padrão e dieta hiperlipídica controles quando
comparados aos respectivos grupos irradiados aos 7 dias, concordando com os
estudos que afirmam que durante as fases iniciais da ferida, as células inflamatórias
são importantes para o debridamento da área e liberação de citocinas e fatores de
crescimento. Porém, estes eventos também aumentam a produção de oxidantes que
podem conduzir a danos oxidativos de lípidos e / ou proteínas e, por conseguinte, a
66
necrose celular, comprometendo a recuperação do tecido quando postergados
(SILVEIRA et al., 2011).
A luz laser estimula as células com déficit funcional a proliferarem no
momento que estão sendo irradiadas. Sendo assim, ao avaliarmos que um tecido é
completamente funcional e suas células estão crescendo de maneira ordenada e
normal, o potencial celular é suficientemente forte e não existe nenhum estímulo
para que a ação do laser seja iniciada, por isso o efeito sobre o tecido será fraco, ou
nenhum efeito terapêutico será observado. Contudo, se o tecido está alterado, a luz
laser agirá com maior efeito sobre ele tentando restabelecer a função celular. Isto
justificaria alguns dos resultados encontrados no nosso estudo, no qual o grupo
dieta hiperlipídica irradiado apresentou melhores resultados quando confrontados
aos grupos dieta padrão irradiado. Diante disto, há que se destacar que um dos
fatores para a fotosenssibilidade celular depende do estado em que ela se encontra
no momento da irradiação (Karu, 1989). Isso pode explicar porque os efeitos
fotobiomoduladores nem sempre podem ser detectados.
Uma variedade de estudos encontrados na literatura também tem
demonstrado o efeito da luz laser na proliferação celular durante o processo de
reparo. Kreisler et al. (2002) investigaram os efeitos da laserterapia (809 nm) na taxa
de proliferação de fibroblastos gengivais humanos in vitro. As células irradiadas
revelaram uma considerável atividade proliferativa superior às células não irradiadas
e as diferenças foram altamente significativas 24 horas após a irradiação. Vinck et
al. (2003) avaliaram a proliferação celular após laserterapia em variados
comprimentos de onda (950 nm, 660 nm e 570 nm) e observaram que todos os
grupos irradiados apresentaram melhores resultados quando comparados com o
grupo controle.
Quando a proliferação fibroblástica foi avaliada, no presente estudo, foi
verificada uma maior atividade fibroblástica no período de 7 dias no grupo DHL em
comparação ao grupo DPL. Este resultado demonstra os efeitos fotobiomoduladores
do laser na fase proliferativa do reparo, bem como a concordância com Karu (1989)
quando a mesma relata a maior interação do laser com células com déficit funcional.
Nos grupos irradiados no período de 14 dias também foi observada uma maior
intensidade proliferativa no grupo DHL quando comparada ao grupo DPL. Hawikins
67
et al. (2006) concluiram que um protocolo adequado da laserterapia pode estimular
respostas celulares nos fibroblastos e promover a migração e proliferação celular
sem causar estresse ou destruição às células.
Nossos achados demonstram que não houve diferença na deposição e
distribuição das fibras colágenas entre os grupos DPC e DHC no tempo de 7 dias,
discordando do estudo de Nascimento & Costa (2006) que utilizaram uma dieta rica
em gordura para avaliar a influência na cicatrização da ferida e observaram que os
animais alimentados com esta dieta apresentaram feridas com menor deposição
colagênica quando comparadas às do grupo controle. Porém, ao avaliarmos os
grupos DHL e DHC, no mesmo tempo experimental, observamos que o laser auxiliou
a deposição de fibras colágenas no grupo DHL. Neste aspecto, concordamos com
Mendez et al. (2004) que demonstraram que a laserterapia aplicada em regiões que
necessitem de reparo tecidual promove uma maior maturação de colágeno,
essencial para o compeleto fechamento da ferida.
Ao avaliar a deposição de fibras colágenas aos 14 dias, este estudo
demonstrou que todos os grupos, irradiados ou não, apresentaram quantidades e
deposição de fibras colágenas similares e compatíveis com o tempo operatório,
independente da dieta utilizada. Medrado et al. (2003) avaliaram o papel da matriz
extracelular e dos miofibroblastos sob efeito da laserterapia no processo de
cicatrização de ferida de ratos utilizando diferentes dosagens de irradiação (4J/cm² e
8J/cm²) por 14 dias. Eles observaram que uma melhor ação do laser foi alcançada
com a menor dosagem e que, o laser induziu uma série de mudanças morfológicas,
que presumivelmente seriam favoráveis para a resolução da ferida, pois reduziu a
reação inflamatória, induziu o aumento da deposição de colágeno e proliferação de
miofibroblastos nas feridas que utilizaram esta dosagem. E, apesar de não
obervarem uma redução no tempo de cicatrização, a contração da ferida favorece
uma cicatrização mais eficaz, embora não necessariamente, de uma forma mais
rápida.
A neoformação vascular no início do processo de reparo é imprescindível
para carrear oxigênio e nutrientes essenciais para a neoformação tecidual, com
posterior regressão destes vasos na etapa de remodelação. Os vasos neoformados
são responsáveis pelo recrutamento de células inflamatórias que permitem a
68
continuada liberação de citocinas pró-inflamatórias responsáveis pelo
prolongamento da inflamação. A maior intensidade e presença de vasos congestos
no grupo DHC, quando comparado ao grupo DPC aos 14 dias, caracterizou a
persistência do quadro de hiperemia neste grupo, levando ao prolongamento da fase
vascular da inflamação. Desta maneira, como já visto em estudos anteriores
(PÉREZ-ECHARRI et al., 2008; NASCIMENTO & COSTA, 2006), a adoção de dieta
hiperlípica favoreceu o acúmulo em excesso de tecido adiposo e modificou as
características do processo reparo, prolongando a sua etapa inflamatória.
A reepitelização da ferida se inicia horas após a lesão, ocorre com a migração
e proliferação de células epiteliais oriundas tanto das margens como dos apêndices
epidérmicos localizados no centro da lesão (MENDONÇA & COUTINHO-NETO,
2009). As lesões incisionais são normalmente reepitelizadas dentro de 24-48 horas
após a lesão inicial, entretanto, as feridas excisionais podem demorar muito mais
tempo para reepitelizar (MONACO & LAWRENCE, 2003). A fototerapia a laser tem
sido utilizada no tratamento de lesões, podendo acelerar a reparação tecidual nas
suas diferentes fases, sendo possível melhorar tanto a velocidade da cicatrização,
quanto a qualidade do tecido cicatricial. Estes benefícios podem ser verificados em
diferentes períodos de tempo e independentes da dose e comprimento de onda
utilizados (RABELO et al., 2006, MAIYA, KUMAR & RAO, 2005).
No presente estudo, como nos estudos supracitados, também foi possível
observar que um maior grau de reepitelização foi encontrado no grupo irradiado, aos
14 dias, porém sem diferença estatísticamente significante. Neste período, os
parâmetros aplicados do laser não foram suficientes para promover um maior grau
de reepitelização da ferida. Embora, em outros trabalhos do nosso grupo, a
fototerapia a laser tenha contribuído para promover uma maior pavimentação
epitelial no grupo irradiado estatisticamente significante quando comparado ao grupo
controle (RAMALHO et al. 2010; PINHEIRO et al. 2009).
Visto que a cicatrização de feridas é um processo complexo e que envolve
uma série articulada de eventos biológicos com o intuito de reparar o tecido, no
entanto, que qualquer interferência neste organizado processo pode levar ao
prolongamento do reparo tecidual e acarretar inúmeros prejuízos à saúde. As
pesquisas com o uso da fototerapia a laser devem ser estimuladas, para que seus
69
parâmetros sejam, cada vez mais, padronizados e os seus benefícios se ampliem ao
mais variados problemas de saúde que possam interferir no meticuloso processo de
reparo tecidual.
70
7. CONCLUSÃO
A ingestão de dieta hiperlipídica aumentou a massa de tecido adiposo
retroperitoneal resultando no prolongamento da fase inflamatória do reparo tecidual.
A fototerapia a laser, nos parâmetros empregados, foi capaz de melhorar o reparo
dentro do período de 7 dias, principalmente quando a variável intensidade de
infiltrado inflamatório foi avaliada. A fototerapia a laser aplicada sobre tecidos dos
ratos alimentados com uma dieta hiperlipídica promoveu o reestabelecimento das
atividades celulares e melhor recuperação do tecido.
71
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ANEXO
![[MARKEETOO SILVA] Um designer infiltrado nas Artes Visuais](https://img.document.onl/doc/110x75/55acb3551a28ab045a8b4598/markeetoo-silva-um-designer-infiltrado-nas-artes-visuais.jpg)
