AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO ... · Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L. Figura 5 Fotomicrografia

Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO

HIDROALCOÓLICO DE Calendula officinalis L.

Erick José Ramo da Silva

RECIFE 2004


Erick José Ramo da Silva

AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO

HIDROALCOÓLICO DE Calendula officinalis L.

R2

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas doCentro de Ciências da Saúde daUniversidade Federal de Pernambuco, comorequisito parcial para obtenção do grau deMestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Almir GonçalvesWanderley

ECIFE 004



UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Reitor

Amaro Henrique Pessoa Lins

Vice-Reitor

Gilson Edmar Gonçalves e Silva

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

Celso Pinto de Melo

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

José Thadeu Pinheiro

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Silvana Cabral Maggi

Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Antônio Rodolfo de Faria

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas

Miracy Muniz de Albuquerque

Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas

Pedro José Rolim Neto


Dedico este trabalho aos meus pais, Raminho e Fátima, minha irmã Kika, minha tia Evalda, minhas avós Maria e Maria (in memorian) e a minha namorada Lelê. Obrigado por tudo!


AGRADECIMENTOS A Deus. Aos meus pais, Severino Ramo da Silva e Maria de Fátima Ramo da Silva, pelo apoio, investimento, incentivo e compreensão durante toda minha vida. À minha irmã Érika Ramo (kika). À minha tia Evalda Teodózio pelo carinho e apoio que sempre me deu. A minhas avós Maria José Siqueira (in memorian) e Maria Alves da Silva pelos ensinamentos e gestos de carinho. Ao meu professor, orientador e grande amigo Almir Gonçalves Wanderley pela oportunidade, confiança, orientação, incentivo e presença constante. Ao meu Amor Leilyane Conceição de Souza Coelho (Lelê) pelo apoio e carinho fundamentais para a conclusão desse trabalho, bem como seus familiares. A todos os meus familiares pelo apoio e incentivo. A Gustavo Santiago Dimech e Eduardo da Silva Gonçalves pelos conhecimentos transmitidos com boa vontade e pela nossa amizade. A João Henrique Costa-Silva, Irla Maria Vidal de Sousa, Karla Emanuelle Ferreira, Mariana Maria Azevedo de Lyra, Cristiano Ribeiro Lima e Rejane Ferreira da Silva pelo enorme auxílio na elaboração do trabalho e companheirismo no dia-a-dia do Laboratório de Farmacologia e Toxicologia Pré-clinica de Produtos Bioativos. A Marcelo de Albuquerque pela ajuda incondicional em uma etapa crítica do trabalho.


Aos professores Parviz Afiatpour, Simone Sette, Liriane Evêncio e Maria do Carmo Fraga pela orientação e apoio na realização do trabalho. A todos os professores e amigos do Departamento de Ciências Farmacêuticas da UFPE. Aos amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Aos professores e técnicos do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFPE. A Iguacy Duque e Levi Rodrigues pelo valioso apoio administrativo. Aos meus amigos do Colégio de Aplicação Érico, Hugo, Fernando, Gabriel, Marcelo, Marco Antonio, Olga, Osias, Sandra, Taciana, Tiago, Viviane e Yuri, os quais estiveram presentes em todos os momentos importantes da minha vida nesses últimos 12 anos, por me mostrarem o verdadeiro significado da palavra “amizade”. Aos amigos Ádley Antonini, Bráulio César, Cristiano Sampaio, José Walkirdes, Luciano Thiesen e Lamatine Soares. Aos amigos da Farmácia do Hospital Geral do Recife por terem me acolhido calorosamente e pelos ensinamentos transmitidos. A Ron Martinez pelo auxílio na correção dos textos em inglês. Ao Dr. Romildo Alves Paes Barreto (Zé Pimentel) pela nossa amizade e pelo sensacional apoio técnico.


SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS........................................................................................ III

LISTA DE TABELAS....................................................................................... V

RESUMO........................................................................................................ VII

ABSTRACT..................................................................................................... VIII

1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 1

2. REVISÃO DA LITERATURA........................................................................... 4

2.1. ESTUDOS SOBRE CALENDULA OFFICINALIS L.............................................. 5

2.1.1. BOTÂNICO..................................................................................................... 5

2.1.2. FITOQUÍMICO................................................................................................ 6

2.1.3. FARMACOLÓGICO......................................................................................... 8

2.1.4 TOXICOLÓGICO............................................................................................ 13

2.2. ESTUDOS TOXICOLÓGICOS PRÉ-CLÍNICOS DE PLANTAS MEDICINAIS........ 14

2.2.1. TOXICIDADE AGUDA..................................................................................... 16

2.2.2. TOXICIDADE SUBCRÔNICA........................................................................... 16

2.3. TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO....................................................... 17

2.3.1. TERATOGÊNESE E EMBRIOFETOTOXICIDADE............................................. 18

3. OBJETIVO..................................................................................................... 23

3.1. GERAL........................................................................................................... 24

3.2. ESPECÍFICO.................................................................................................. 24

4. ARTIGO I: AVALIAÇÃO DO TRATAMENTO SUBCRÔNICO COM O EXTRATO

HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L. SOBRE OS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E

HEMATOLÓGICOS EM RATAS......................................................... 25

RESUMO........................................................................................................ 26

ABSTRACT..................................................................................................... 27

INTRODUÇÃO................................................................................................ 27

MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 28

RESULTADOS................................................................................................ 30

DISCUSSÃO................................................................................................... 31

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 33

5. ARTIGO II: AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA

OFFICINALIS L................................................................................ 39

RESUMO........................................................................................................ 40

ABSTRACT..................................................................................................... 41

INTRODUÇÃO................................................................................................ 41

METODOLOGIA............................................................................................. 42


RESULTADOS................................................................................................ 45

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO.......................................................................... 46


6. ARTIGO III: AVALIAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L.

SOBRE A PERFORMANCE REPRODUTIVA EM RATOS............................................. 59

RESUMO........................................................................................................ 60

ABSTRACT..................................................................................................... 61

INTRODUÇÃO................................................................................................ 61

METODOLOGIA............................................................................................. 62

RESULTADOS................................................................................................ 64

DISCUSSÃO................................................................................................... 64


7. ARTIGO IV: EFEITOS DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L.

SOBRE A PRENHEZ DE RATAS.............................................................................. 72

RESUMO........................................................................................................ 73

ABSTRACT..................................................................................................... 74

INTRODUÇÃO................................................................................................ 74

METODOLOGIA............................................................................................. 75

RESULTADOS................................................................................................ 77

DISCUSSÃO................................................................................................... 79


8. CONCLUSÃO................................................................................................. 89

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 91


LISTA DE FIGURAS Revisão da Literatura

Figura 1 Calendula officinalis L...................................................................... 6 Figura 2 Estrutura da porção aglicona dos glicosídeos de flavonóis de

Calêndula......................................................................................... 7 Figura 3 Estruturas de alguns triterpenos presentes nas flores de

Calêndula......................................................................................... 8

Artigo I

Figura 1 Figura 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula

officinalis (0,25 a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa

corporal em ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.

Os valores representam as médias ± e.p.m. (n=10/grupo)................. 35 Figura 2 Figura 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula

officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos

órgãos (g/100g) de ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias

consecutivos. Os valores representam as médias ± e.p.m.

(n=10/grupo).................................................................................... 36

Artigo II

Figura 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25

a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa em ratos Wistar

adultos tratados por 30 dias consecutivos Os valores representam

as médias ± e.p.m. (n=10/grupo)...................................................... 53 Figura 2 Figura 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula

officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos

órgãos (g/100g) em ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos.

Os valores representam as médias ± e.p.m. (n=6/grupo). *Indica

estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de

Newman-Keuls, p< 0,05). DDR=ducto deferente de rato.................... 53 Figura 3 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar controle tratado com água

por via oral por 30 dias (grupo controle). Células hepáticas (H) e o

espaço porta (EP) com aspecto normal. (coloração HE, aumento ±

107x)............................................................................................... 54 Figura 4 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar controle tratado com água

por via oral por 30 dias (grupo controle). Hepatócitos (H), células de

Kuppfer (K), os vasos capilares (vc) e a veia centro lobular (V).

(coloração HE, aumento ± 430x)....................................................... 54


Figura 5 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral.

por 30 dias. Infiltrado inflamatório (II) nas adjacências do espaço

porta (EP) e acúmulo de células acidófilas (H) – (coloração HE,

aumento 107x)................................................................................. 55 Figura 6 Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral.

por 30 dias. Presença de infiltrado na região periportal (seta) e

hepatócitos acidófilos (H) – (coloração HE, aumento ±

430x)............................................................................................... 55 Figura 7 Fotomicrografia do pulmão de rato Wistar tratado com extrato

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral

por 30 dias. Bronquíolos (B) com pequena quantidade de infiltrado

inflamatório (II). Epitélio descontínuo em alguns pontos (seta),

sacos alveolares (SA), alvéolos pulmonares (A) intactos – (coloração

HE, aumento ± 107x)........................................................................ 56

Artigo III

Figura 1 Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA)

de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre o ganho de

massa corporal em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Valores

em média ± epm (n=9/grupo)............................................................ 69 Figura 2 Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA)

de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre a massa dos

órgãos sexuais de em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Os

valores representam as médias ± e.p.m. (n=9/grupo)........................ 69 Figura 3 Fotomicrografia do testículo de rato tratado com extrato


por 60 dias consecutivos. Epitélio germinativo (EG) e do tecido

intersticial (TI) com aspecto normal (coloração HE, ampliação ±

107x)................................................................................................ 70 Figura 4 Fotomicrografia do testículo de rato tratado com extrato


por 60 dias consecutivos. Porções de 2 túbulos seminíferos com

células germinativas (CG) e espermatozóides na região central (SP)

com aspecto normal (coloração HE, ampliação ±

430x)................................................................................................ 70


Artigo IV

Figura 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;

0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal em

ratas tratadas durante 30 dias consecutivos (n=12/grupo)................ 84 Figura 2 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;

0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal

materno durante o período da gestação em ratas tratadas durante

30 dias consecutivos e toda a gestação (n=12/grupo)........................ 84


LISTA DE TABELAS

Artigo I

Tabela 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25;

0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros bioquímicos em

ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.................... 37


0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros hematológicos em

ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos..................... 38

Artigo II


0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros hematológicos em

ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos................................. 57


0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros bioquímicos em

ratos Winstar adultos tratados por 30 dias consecutivos................... 58

Artigo III

Tabela 1 Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA)

de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre os parâmetros

reprodutivos de ratas não tratadas acasaladas com ratos tratados

durante 60 dias consecutivos...........................................................

71

Artigo IV

Tabela 1 Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25,

0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os parâmetros reprodutivos em

ratas tratadas por 30 dias consecutivos antes do acasalamento e

durante toda a gestação..................................................................... 85


0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa materno em ratas

tratadas durante o período de pré-implantação (1º ao 6º DDG) e da

gestação (1º ao 20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos............ 86


0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa materno em

ratas tratadas durante o período de organogênese (7º ao 14º DDG) e

da gestação (1º ao 20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos..... 87


0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa materno em ratas

tratadas durante o período fetal (14º ao 19º DDG) e da gestação (1º

ao 20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos............................... 88


RESUMO

Calendula officinalis L., Asteraceae, é cultivada em várias partes do mundo para fins ornamentais e medicinais, sendo conhecida popularmente como Calêndula. Os extratos de suas flores são utilizados como antiinflamatório e cicatrizante (1 a 2g/150mL de água). Em nossa revisão bibliográfica, constatamos carência de informações toxicológicas detalhadas sobre a espécie. Nesse sentido, o trabalho teve como objetivo avaliar a segurança do uso do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis em roedores. Para isso, foram realizados testes de toxicidade aguda por via oral em camundongos e ratos nas doses em progressão geométrica de 0,625 a 5,0g/kg de peso corporal. Efeito da administração sub-crônica do EHA por via oral sobre os parâmetros bioquímico, hematológico, morfológico e reprodutivo nas doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg por dia. Os resultados obtidos mostram que por via oral o EHA não provocou mortes em doses de até 5,0g/kg nos animais. Os perfis bioquímico e hematológico após o tratamento por via oral com EHA durante 30 dias não sofreram variações, com exceção da uréia e alanina aminotransferase (ALT) que aumentaram significativamente em ambos os sexos. Não foram observadas alterações nas massas relativas e morfologia macroscópica externa dos órgãos analisados, porém registrou-se nos machos uma redução na massa do pulmão. A análise histológica do coração, cérebro e rins não mostrou nenhuma modificação, entretanto, o fígado e pulmão apresentaram infiltrados inflamatórios. Ratas tratadas 30 dias antes e durante a prenhez com EHA não apresentaram alterações nas variáveis reprodutivas: duração da gestação, número de prole/mãe, índice de fertilidade, de gestação, de viabilidade e de lactação, percentual de natimortos e massa corporal no 1°, 4º, 7º, 14º e 21° dias de vida. O tratamento com EHA nos períodos de pré-implantação e organogênese não induziu alterações sobre os parâmetros analisados. Entretanto, o tratamento no período fetal provocou redução no ganho de massa corporal associada à redução da massa das placentas em relação ao grupo controle. Na performance reprodutiva de machos, o tratamento com EHA por 60 dias não alterou a massa corporal e dos órgãos reprodutivos, assim como as variáveis reprodutivas descritas acima. A análise histológica dos testículos não evidenciou nenhum efeito tóxico sobre a espermatogênese. Os resultados encontrados nos levam a concluir que o EHA apresentou baixa toxicidade por via oral e não alterou a capacidade reprodutiva dos ratos e o desenvolvimento pós-natal. Entretanto, há indícios de possível nefro e hepatotoxicidade e toxicidade materna durante o período fetal da gestação, que devem ser analisados posteriormente em maior detalhe. Palavras-Chave: Calendula officinalis L., toxicidade aguda, toxicidade subcrônica, hematologia, bioquímica, toxicologia reprodutiva


ABSTRACT

Marigold (Calendula officinalis L., Asteraceae) is cultivated in several parts of the world for ornamental and medicinal purposes. The extracts of C. officinalis flowers are widely used as anti-inflammatory and wound healing (1 to 2g/150ml of water). In our bibliographical review, we verified a lack of detailed toxicological information about the species. For such reason, the aim of the present study was evaluate the safety of the hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis in rodents. For that, it were acomplished the acute toxicity test by oral route in mice and rats in doses from 0,625 to 5,0g/kg. The effect of subchronic daily oral administration of HAE in doses of 0,25; 0,5 and 1,0g/kg per day on biochemical, hematological, morphologic and reproductive parameters in rats. The results showed that HAE failed to cause deaths in doses up to 5,0g/kg. The daily treatment with HAE for 30 days did not provoke biological alterations on biochemical and hematological parameters, except for plasma urea and alanina transaminase (ALT) that increased significantly on both sexes. Alterations on relative weight of organs and macroscopic morphology were not observed, however the lung weight decreased in male rats. While in extract-treated females we observed an increase in spleen and kidney weight when comparing to the control group. Histological analysis of heart, brain and kidneys did not show any modification, however the liver and the lung presented infiltrated inflammatory sites. Female rats treated with HAE for 30 days before and during pregnancy did not present alterations on reproductive parameters: pregnancy time, pup/litter relation, fertility, gestation, viability and lactation index, dead fetuses and pup weight on 1st, 4th, 7th, 14th and 21st

days of life. The treatment with HAE during preimplantation and organogenic periods did not induce alterations. However, the treatment during fetal period provoked a dose-dependent reduction on maternal weight gain related to a reduction of placental weight. In the reproductive male performance trial, treatment with HAE for 60 days did not provoke corporal and sexual organs weight alterations and reproductive parameters. The histological analyses of the testes did not evidence any harzardous effect on espermatogenesis. Based on our results, we conclude that HAE presents low oral toxicity did not alter reproductive performance and offspring development in rats. However, there are signs of nefrotoxicity, hepatotoxicity and maternal toxicity during the fetal period of the pregnancy. Futher studies are needed to confirm that hypothesis. Keywords: Calendula officinalis L., acute toxicity, subchronic toxicity, hematology, biochemistry, reproductive toxicology.


1.Introdução


1. INTRODUÇÃO

Através dos anos, os seres humanos vêm encontrando na natureza

recursos para satisfazerem suas necessidades básicas, alimentação,

vestimenta e a cura para diversos males que lhes afetam. Substâncias de

origem vegetal têm sido utilizadas desde os tempos antigos como fontes

para o tratamento de doenças (LOACES et al., 2003).

Dados históricos demonstram que foi a partir do uso de plantas

medicinais que a produção de medicamento e o tratamento farmacológico

das doenças deram seus primeiros passos. A terapêutica moderna,

composta por medicamentos com ações específicas sobre receptores,

enzimas e canais iônicos não seria possível sem a contribuição dos

produtos naturais, notadamente das plantas superiores. A razão dessa

afirmação pode ser facilmente comprovada quando se analisa o número de

substâncias obtidas direta ou indiretamente a partir de fontes naturais

(CALIXTO, 2003). A estimativa é de que cerca de 40% dos fármacos

empregados atualmente na terapêutica são provenientes de fontes

naturais, sendo 25% de plantas. Este percentual aumenta ainda mais se

nos restringirmos apenas aos fármacos anticancerígenos e antibióticos

(SHU, 1998).

Das 520 drogas aprovadas pelo Food and Drug Administration no

período de 1983 a 1994, aproximadamente 39% são provenientes de

produtos naturais. No mesmo período, 70% dos agentes anticancerígenos

e aprovados são produtos naturais ou seus derivados (CRAGG et al., 1997).

Apesar dos milhares de anos de conhecimento acumulado, o

número de plantas medicinais estudadas sob a óptica da farmacologia e

toxicologia com o intuito de comprovar o seu uso popular e segurança,

respectivamente, ainda é muito pequeno. Estima-se que das 250 a 500 mil

espécies de plantas existentes no planeta, apenas 15% foi estudada e

somente para algum uso específico (FERREIRA, 1998).

É bem verdade que o número de plantas estudadas cresce a cada

ano. Este fato encontra-se associado ao crescimento do interesse da

indústria farmacêutica pelo uso da biodiversidade como fonte de novos


medicamentos (CORDELL, 1995). Atualmente, as maiores indústrias

farmacêuticas mundiais possuem programas de pesquisa na área de

produtos naturais (CALIXTO, 2003).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% da

população mundial façam uso de plantas medicinais para o tratamento de

doenças (CRAGG e NEWMAN, 1999). No Brasil, onde o acesso a

medicamentos pela população é baixo e a biodiversidade é alta, presume-

se que o consumo de plantas com fins medicinais seja bastante elevado.

Com isso, as preparações farmacêuticas contendo extratos padronizados

de uma ou mais plantas, conhecidas como medicamentos fitoterápicos,

ganham uma enorme importância. O mercado mundial de fitoterápicos

movimenta cerca de U$ 20 bilhões anuais (CALIXTO, 2000). No Brasil, os

medicamentos fitoterápicos movimentaram R$ 270 milhões em 2001,

cerca de 5,9% do mercado brasileiro de medicamentos, maior do que a

comercialização de medicamentos genéricos, que foi de R$ 226 milhões,

no mesmo ano (CALIXTO, 2003).

Nesse contexto, a avaliação do potencial terapêutico e toxicológico

das plantas medicinais, assim como de seus metabólitos secundários

isolados (flavonóides, terpenos, alcalóides, etc.) são fundamentais para a

obtenção de medicamentos fitoterápicos eficazes e seguros.


2.Revisão da Literatura


2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Estudos sobre Calendula officinalis L.

2.1.1. Botânico

A família Asteraceae, anteriormente conhecida como Compositae, é

particularmente grande, sendo formada por 1.300 gêneros e cerca de

21.000 espécies. A distribuição geográfica das asteráceas é ampla,

estando presente em todos os habitats, com exceção da Antártida. Isto se

deve à sua elevada taxa de reprodução e ótima adaptabilidade (RUCC,

2004).

Sistematicamente, o gênero Calendula pertence à família

Asteraceae, subfamília Tubiflora, ordem Asterales e classe Magnoliopsida.

Trata-se de um gênero economicamente importante devido ao seu

potencial farmacêutico, cosmético e ornamental (GARCIA et al., 1996).

Calendula officinalis L. (Figura 1) é uma planta originária do

Mediterrâneo e cultivada na Europa a partir do século XII, de onde logo se

estendeu para o resto do mundo. Na região mediterrânea, cresce

espontaneamente nos últimos meses do verão. Sua denominação botânica

é derivada do latim, Kalendulae, que representa o primeiro dia do

calendário romano. Na Roma antiga, acreditava-se que esta planta

florescia sempre nos primeiros dias da maioria dos meses do ano (LUZ et

al., 2001).

Calendula officinalis é uma herbácea anual, com caule ereto,

medindo 35-70cm de altura, com folhas alternas oblongolanceoladas,

inteiras; capítulos florais solitários com 3 a 7cm de diâmetro, terminais e

pedunculados; as flores são de coloração amarelo claro para alaranjado,

linguladas nas margens e tubulares no centro; o invólucro é esverdeado

em forma de platilho de 1,5 a 3cm de diâmetro, o receptáculo é desnudo,

plano ou ligeiramente proeminente; aquênios curvos, providos de

protuberâncias no dorso e crenados na face ventral; papus nulo (CORRÊA,

1978).


No Brasil, a planta é conhecida popularmente como Calêndula,

Calêndula-hortense, Maravilha-dos-jardins, malmequer ou verrucária

(CORRÊA, 1978).

FIGURA 1 – Calendula officinalis L.

2.1.2. Fitoquímico

Estudos fitoquímicos realizados com as flores e os receptáculos de

Calêndula confirmaram a presença de um amplo espectro de compostos

químicos, sobretudo das classes dos flavonóides, terpenos e carotenóides

(VALDÉZ e GARCÍA, 1999).

A Farmacopéia Brasileira IV (1988) edição utiliza como marcador

para a droga vegetal os flavonóides totais (≥ 0,4%). Dentre os compostos

isolados, destacam-se os flavonóis 3-O-glicosídeos isoharmnetina 3-

glucosídeo, isoharmnetina 3-rutinosídeo, quercetina 3-glucosídeo

(isoquercetina), isoharmnetina 3- rutinoharmnosídeo, isoharmnetina 3-

glucoharmnosídeo e quercetina 3-triglucosídeo. Todos esses flavonóides

apresentam a quercetina ou a isoharmnetina como porção aglicona

(Figura 2) (VIDAL-OLLIVIER et al., 1989; YOSHIKAWA et al., 2001).


O

OR

OH

OR1HO

HO

O

R = H – quercetina R = CH3 – isoharmnetina R1 = Açúcares

FIGURA 2 – Estrutura da porção aglicona dos glicosídeos de flavonóis de Calêndula (VIDAL-OLLIVIER et al., 1989).

Nas flores e receptáculos de Calêndula foram encontrados α, β e γ-

caroteno, violaxantina, auroxantina, anteraxantina, microxantina,

citroxantina, flavocromo, licopeno, 5,6-diidróxi-caroteno, luteolina epóxido

e mutatoxantina (AVRAMOVA et al., 1998; BAKÓ et al., 2002).

Devido ao seu potencial farmacológico, os terpenos presentes na

Calêndula officinalis L. despertam um especial interesse. Verificou-se a

presença de sesquiterpenos (cariofileno epóxi-cetona, pedunculatina,

cadinol) e as saponinas sesquiterpênicas oficinosídeos C, e D. Além dos

triterpenos (Figura 3) monoésteres de faradiol, lupeol, α e β-amirina, ψ-

taraxasterol, arnidiol monoésteres de calenduladiol, monoésteres

maniladiol e helianol (GRACZA, 1987; MARUKAMI et al., 2001; HAMBURGER et

al., 2003).

Também foram isoladas 4 saponinas triterpênicas a partir da fração

butanólica do extrato metanólico das flores de Calêndula, chamadas

Calendassaponinas A, B, C e D (YOSHIKAWA et al., 2001).


H

H

HOCH33C

CH3 CH3

OH

CH3

CH3

CH3H3C

HOCH3H3C

CH3 CH3

OH

CH3

CH3

CH2H3C

HOCH33C

CH3 CH3

OH

CH3

CH3

CH2

H3C

HOCH3H3C

CH3 CH3 CH3

CH3

CH3H3C

ArnidiolFaradiol

ψ-Taraxasterol Calenduladiol

FIGURA 3 – Estruturas de alguns triterpenos presentes nas flores de Calêndula (DELLA-LOGGIA et al., 1994).

Outros constituintes presentes nas flores e receptáculos de

Calêndula officinalis L. incluem: óleo essencial, ácidos fenólicos (ácido

ferúlico, salicílico e cumárico), taninos, cumarinas (umbeliferona e

escopoletina), esteróides e polissacarídeos (VALDÉS e GARCÍA, 1999).

2.1.3. Farmacológico

O extrato das flores de Calêndula, nas formas farmacêuticas de

tintura, infuso, gel, creme e pomada são amplamente utilizados como

antiinflamatório e cicatrizante para peles e mucosas (SCHEFFER, 1979).

De acordo com dados etnofarmacológicos, as flores de Calêndula

também são utilizadas como antiséptica, sedativa e para o tratamento de

dismenorréia, gastrite, distúrbios vasculares, hemorróidas, reumatismo e

câncer (BISSET, 1994; ZITTERL-EGLESSER et al., 1997; VALDÉS e GARCÍA,

1999; PARENTE et al., 2003).

Entretanto, seu uso está aprovado pela Comissão E como

antiinflamatório para as mucosas oral e faríngea (uso tópico e interno) e


na cicatrização de ferimentos e queimaduras (uso externo) em proporções

de 1 a 2g de flor seca/150mL de água por dia (BLUMENTHAL, 1998).

No Brasil, o uso da Calêndula está regulamentado pela RE n° 89, de

16 de março de 2004, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(ANVISA) como antiinflamatório e cicatrizante de uso tópico em doses

diárias de 8,8 a 17,6mg de flavonóides (BRASIL, 2004a).

Vários estudos farmacológicos avaliaram a atividade

antiinflamatória e cicatrizante dos extratos das flores de Calêndula. A

aplicação tópica do extrato lipofílico obtido pela extração com CO2

supercrítica de C. officinalis em doses de 0,3 a 1,2mg/orelha promoveu

uma redução de até 71% no edema de orelha de camundongo induzido

por óleo de cróton. A fração triterpênica do mesmo extrato apresentou

uma inibição de até 76% em doses de 0,15 a 1,2mg/orelha sob as mesmas

condições (DELLA-LOGGIA et al., 1990, 1994).

Três triterpenos isolados de Calendula officinalis, ψ-taraxasterol e

dois monoésteres de faradiol, em doses de 0,24 e 0,48mg/orelha

apresentaram atividade anti-edematogênica frente ao modelo de orelha de

camundongo induzido por óleo de cróton de até 86%. O faradiol livre (não

encontrado na planta), obtido por hidrólise, apresentou a mais potente

atividade antiinflamatória, sendo equivalente à da indometacina (ZITTERL-

EGLEER et al., 1997). Outro estudo revelou que triterpenos isolados das

flores de C. officinalis e outras asteráceas apresentam atividade inibitória

frente à inflamação de orelha de camundongo induzida por 12-O-

tetradecanolforbil-13-acetato de até 90% em doses de 0,1 a 0,8mg/orelha

(AKIHISA et al., 1996).

Também utilizando o modelo de edema de orelha de rato induzido

por óleo de cróton, Parente et al. (2003) não encontrou indícios de

atividade antiinflamatória do extrato etanólico de Calêndula administrado

por via oral nas doses de 0,1; 0,3 e 1,0g/kg.

Extrato das flores de Calêndula administrados na dose de

100mg/kg por via oral apresentaram boa atividade inibitória frente ao

edema de pata de rato e infiltração leucocitária induzidos por carragenina

e prostaglandina E1, respectivamente. Entretanto, nenhum foi mais


potente do que os compostos sintéticos usuais (SHIPOCHLIEV et al., 1981;

MASCOLO et al., 1987).

Glicosídeos de isorhamnetina isolados das flores de Calêndula

apresentaram atividade inibidora da lipooxigenase de fígado de rato in

vitro (BEZÁKOVA et al., 1996). Entretanto, a atividade antiinflamatória da

planta é atribuída aos seus terpenos, sobretudo os monoésteres de

faradiol, devido à sua prevalência nas flores (DELLA-LOGGIA et al., 1994;

AKIHISA et al., 1996).

O granulado para encapsulamento obtido a partir da associação dos

extratos hidroalcoólicos de Calendula officinalis e Matricaria recutita

apresentou atividade antiinflamatória por via oral em doses de 100 e

250mg/kg frente aos modelos de edema de pata de rato induzidos por

carragenina, dextrana e histamina de 36 e 43%, 50 e 35%, 40 e 68%,

respectivamente. (SARTORI et al., 2003).

Estudos clínicos demonstraram que a tintura e o gel de Calendula

officinalis L. 10 e 2%, respectivamente, são úteis para o tratamento de

queimaduras do sol e do fogo, além de lesões rebeldes, como úlcera

varicosa de evolução crônica. Nesses casos, a droga vegetal acelerou a

cicatrização e reduziu a dor. O processo de cicatrização foi acelerado ainda

mais quando a Calêndula foi associada ao Stryphnodendron barbadetiman

M. (JORGE NETO et al., 1996).

A aplicação externa do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis

acelerou a taxa de epitelização de ratos após incisões cirúrgicas (RAO,

1991). Patrick et al. (1996) demonstraram que o extrato aquoso das flores

de Calêndula é capaz de induzir a neoformação de vasos sanguíneos in

vitro, processo muito importante para a cicatrização.

A associação de pomada de Calêndula 5% com alantoína apresenta

efeito cicatrizante em feridas cutâneas induzidas por cirurgia em ratos. A

combinação estimulou a regeneração fisiológica e a epitelização através do

aumento do metabolismo de glicoproteínas e fibras colágenas durante a

regeneração tissular (KLOUCHECK-POPOVA et al., 1982).

O tratamento durante 5 dias com a combinação Calendula officinalis

e Symphytum officinale acelerou a neoformação óssea e a cicatrização em


camundongos submetidos à extração dentária do incisivo superior direito

em relação ao grupo controle, nas mesmas condições (BALDUCCI-ROSLINDO

et al., 1999).

Um estudo clínico randomizado envolvendo 254 mulheres que foram

operadas de câncer de mama e que estavam recebendo tratamento de

radioterapia constatou que a pomada de Calêndula aplicada após cada

sessão de radioterapia reduziu em 41% a ocorrência de dermatite aguda e

ainda reduziu a dor induzida pelo tratamento. A pomada de Calêndula foi

considerada efetiva na prevenção de dermatites agudas nível 2, passando

a ser indicada para pacientes que passam por radioterapia pós-operatória

de câncer de mama (POMMIER et al., 2004).

As atividades citotóxica e antitumoral de Calendula officinalis foram

demonstradas por estudos in vitro e in vivo. Em um ensaio in vitro, 5

extratos das flores de Calêndula apresentaram atividade citotóxica frente a

3 linhagens celulares (MRC5, Hep2, Ehrlich) em concentrações de 0,01 a

0,2g/L. A atividade anti-tumoral foi estudada em camundongos com

carcinoma de Ehrlich. Os animais foram tratados diariamente com cada

um dos 5 extratos, na dose de 25mg/kg. Verificou-se que o extrato rico em

saponinas triterpênicas promoveu um aumento no período de sobrevida

dos camundongos, bem como reduziu o desenvolvimento da ascite

tumoral (BOUCAUD-MAITRE et al., 1988).

Os extratos aquoso e hidroalcoólico, em concentrações de ng/mL

foram capazes de proteger os hepatócitos de ratos frente aos efeitos

genotóxicos e carcinogênicos da dietilnitrosamina. Entretanto, em

concentrações de µg/mL, os extratos apresentaram atividade genotóxica.

Apesar de controversos, ambos os efeitos foram atribuídos aos flavonóides

que, em baixas concentrações, são capazes de inibir enzimas do

metabolismo pré-carcinogênico, mas em altas concentrações, podem atuar

como agentes pró-oxidantes (PÉREZ-CARREÓN et al., 2002).

Alguns ensaios foram realizados com Calendula officinalis para

comprovar a sua atividade antiviral. Tinturas de Calêndula suprimiram a

replicação do vírus influenza A2 e APR-8 (BOGDANOVA et al., 1970). O

extrato orgânico de Calêndula (EOC) em concentrações de 10 a 30µg/mL


aumentou a atividade citoprotetora em linfócitos humanos Molt-4

infectados com HIV-1 ao aumentar a viabilidade das células. Além disso, o

mesmo extrato protegeu linfócitos CD4 Molt-4 não infectados em relação

ao contato com células U-937/HIV-1 infectadas. Esse efeito protetor foi

atribuído aos flavonóides que, provavelmente, bloqueiam a adsorção do

vírus e/ou sua internalização interferindo, dessa forma, no ciclo

replicativo do HIV-1. O EOC também apresentou um potente efeito

inibitório da transcriptase reversa do HIV-1 em concentrações de 50, 100

e 200µg/mL, efeito este também atribuído aos flavonóides da planta

(KALVATCHEV et al., 1997).

Estudos de atividade antibacteriana demonstraram que os extratos

aquoso, clorofórmico, etanólico e metanólico não apresentam atividade in

vitro significativa contra bactérias (DOMBERGER e LICH, 1982; RIOS et al.,

1987; ACEVEDO et al., 1993). Entretanto, o óleo essencial isolado das flores

da planta inibiu o crescimento in vitro de B. subtillis, E. coli, K.

pneumonae, P. aeruginosa e C. albicans. Os flavonóides isolados da planta

apresentaram atividade contra S. aureus, Sarcina lútea, E. coli, K.

pneumonae e C. albicans (TARLE e DVORZAK, 1989; JANSSEN et al., 1986).

Yoshikawa et al. (2001) demonstraram que a administração oral da

fração solúvel em 1-butanol do extrato metanólico em doses de 50 a

500mg/kg apresentou efeito hipoglicemiante, inibitório do esvaziamento

gástrico e gastroprotetor em camundongos e ratos. Todos os efeitos foram

atribuídos às saponinas. O calendulosídeo B, isolado dos rizomas de

Calendula officinalis apresentou atividade antiulcerogênica em 3 modelos

experimentais de úlcera (cafeína-arsênica, butadiona e induzida por

ligação pilórica), analgésica e sedativa quando administrada por via oral

em ratos em doses de 5 a 50mg/kg (IATSYNO et al., 1978).

A ação da Calêndula sobre o sistema imunológico ainda não foi

totalmente esclarecida. O extrato hidroalcoólico 70% das flores da planta

apresentou efeito inibitório no ensaio de proliferação mitogênica induzida

por linfócitos em concentrações de 0,1 a 10µg/mL. O mecanismo de ação

desse efeito não está elucidado. Acredita-se que algum constituinte do

extrato possa interagir com as moléculas da superfície do linfócito ou com


fatores de crescimento envolvidos na mitose. O extrato também

apresentou atividade estimulatória sobre a reação mista de linfócitos,

ensaio in vitro que envolve a ativação de células T (AMIRGHOFRAN et al.,

2000).

Entretanto, estudo recente realizado por Pérez et al. (2002)

demonstrou que o decócto de Calêndula (100mg/mL) não aumentou a

proliferação de linfócitos em humanos sadios ou portadores de alguma

imunodeficiência celular, nem provocou alterações na expressão do

marcador de linfócito CD2. Segundo os autores, não há indícios para

afirmar que a planta é imunoestimulante.

2.3.4. Toxicológico

A idéia geral de que as drogas vegetais são seguras e livres de efeitos

colaterais é falsa (DIMECH, 2003). Alguns constituintes das plantas

apresentam elevada toxicidade, como os digitálicos, alcalóides

pirrolizidínicos, ésteres de forbol, etc. Entretanto, segundos estudos

clínicos controlados, a incidência de efeitos colaterais é menor com

produtos fitoterápicos do que com drogas sintéticas (DREW e MYERS, 1997).

Dados de toxicidade aguda apontam que a DL50 para o extrato

aquoso de Calendula officinalis por via intravenosa em camundongos é de

375mg/kg (MANOLOV et al., 1964). Boyadzhiev e Vissh (1964)

demonstraram um valor de DL50 respectivamente por vias subcutânea e

intravenosa de 45mg/camundongo e 526mg/100g de rato a partir do

extrato hidroalcoólico das flores de Calêndula.

Estudos de toxicidade crônica com extratos de Calêndula

(150mg/kg) por via oral em ratos e hamster respectivamente por 22 e 18

meses não demonstraram sinais de toxicidade (AVRAMOVA et al., 1988).

Constituintes triterpênicos da Calêndula foram reportados como

substâncias espermicidas, abortivas e antiblastocísticas (MORELLI et al.,

1983).


O composto isolado Calendulosídeo B apresentou baixa atividade

hemolítica e não promoveu sinais de toxicidade em ratos tratados durante

60 dias nas doses de 20 a 200mg/kg (IATSYNO et al., 1978).

Saponinas isoladas das flores de Calêndula apresentaram atividade

mutagênica na dose de 400µg/mL no teste de Ames utilizando Salmonella

typhimurium TA98 com ou sem ativação metabólica de mistura S9 (ELIAS

et al., 1990). O extrato hidroalcólico 60% não apresentou atividade

genotóxica no teste de Ames para as linhagens de Salmonella typhimurium

TA 153S, TA 98, TA 1537 e TA 100 nas concentrações de 50 a

500µg/placa. O extrato também apresentou resultado negativo no teste de

micronúcleo de medula óssea de camundongo nas doses de 1g/kg.

Entretanto, o mesmo extrato apresentou atividade genotóxica no ensaio de

segregação mitótica em Aspergillus nidulans diplóide heterozigoto D-30, no

qual provocou alterações no crossing over mitótico e na segregação dos

cromossomos. A diferença entre os resultados in vivo e in vitro pode ser

associada a fatores farmacocinéticos e às diferenças organizacionais e de

complexidade do material genético de eucariontes e procariontes (RAMOS et

al., 1998).

Estudos clínicos constataram a presença de reações de

hipersensibilidade dérmica decorrente da exposição aos produtos

contendo Calendula officinalis em 2,03% dos pacientes (REIDER et al.,

2001). Entretanto, estudo realizado por Bruynzeel et al. 1992 apontou

para a extrema raridade desse fenômeno.

2.2. Estudos toxicológicos pré-clínicos de plantas

medicinais

A toxicidade de uma substância pode ser definida como a

capacidade de causar dano grave ou morte a um dado organismo (DRAIZE

et al., 1944). Para que ocorra esse dano, é necessário que haja uma

interação entre o agente nocivo e o organismo vivo. Essas interações

geram modificações, reversíveis ou não, em nível molecular, celular ou


tissular que podem, em casos drásticos, promover a morte do indivíduo

(LOOMIS e HAYES, 1996).

Evidências toxicológicas demonstram que toda substância química é

um agente tóxico em potencial, dependendo apenas das condições de

exposição, como dose administrada ou absorvida, tempo e freqüência da

administração e via de administração (CASTRO, 1993).

Os testes toxicológicos são realizados para se ter dados sobre as

condições em que as entidades químicas produzem efeitos tóxicos, qual a

natureza desses efeitos e quais os níveis seguros de exposição (LOOMIS e

HAYES, 1996).

Por motivos éticos, morais e legais, a obtenção de dados

toxicológicos em seres humanos é bastante limitada. Com isso, as

informações toxicológicas sobre os compostos químicos são obtidas

basicamente a partir de testes toxicológicos pré-clínicos, ou seja, com

animais de laboratórios em condições previamente padronizadas (MORTON,

1998; BOELSTERLI, 2003).

Grande parte dos dados obtidos a partir dos testes toxicológicos pré-

clínicos pode ter valor de aplicação na espécie humana. Desde que sejam

realizados sob condições adequadas e que seja feita à escolha apropriada

da espécie e linhagem animal, via de administração e regime de dosagem

(MORTON, 1998).

O largo uso de plantas como medicamentos tem apontado que as

plantas medicinais não são tão seguras como freqüentemente são

aclamadas. De fato, muitas substâncias extraídas do reino vegetal

apresentam elevada toxicidade, como a estricnina, digitoxina,

tubocurarina, cocaína, entre outras. O medicamento fitoterápico é um

corpo estranho ao organismo e, como todo xenobiótico, os produtos de sua

biotransformação são potencialmente tóxicos e assim devem ser

encarados até que se prove o contrário (LAPA et al., 2000). Na Alemanha,

desde 1978 cerca de quatro mil medicamentos fitoterápicos vêm sendo

submetidos a um rigoroso programa de farmacovigilância e avaliação

toxicológica e muitos deles foram retirados do mercado devido aos seus

efeitos deletérios ao ser humano (KELLER, 1996).


No Brasil, o estudo toxicológico pré-clínico de plantas medicinais é

regulamentado pela Resolução n° 90, de 16/03/2004, que norteia alguns

ensaios de toxicidade aguda, subcrônica e crônica com medicamentos

fitoterápicos (BRASIL, 2004).

2.2.1. Toxicidade aguda

Estudos de toxicidade aguda constituem o primeiro teste

toxicológico realizado com um novo produto. A toxicidade aguda avalia os

efeitos tóxicos detectados após a administração de um agente em doses

única ou múltiplas em 24h, tendo como propósito determinar a

sintomatologia a curto prazo após a administração de um composto, bem

como o binômio dose-efeito letal, que é estimada por um parâmetro

denominado dose letal 50%, mais conhecida como DL50 (LITCHFIELD e

WILCOXON, 1949). A DL50 foi desenvolvida por Trevan (1927) com o objetivo

de padronizar biologicamente a potência dos extratos de digitális e outras

drogas. Este parâmetro é estatístico e representa a probabilidade de uma

dose causar efeito letal em metade da população dos animais em estudo

(FOWLER e RUTTY, 1983; PAUMGARTTEN et al., 1989).

Os ensaios de toxicidade aguda são comumente realizados em

camundongos e ratos, embora em certos casos também se utilizam

animais maiores, como coelhos e cães. Recomenda-se a mesma via de

administração utilizada no homem, sendo a via oral a mais comum

(KLAASSEN et al., 1996).

2.2.2. Toxicidade subcrônica

O estudo toxicológico subcrônico avalia a toxicidade de um produto

a partir da administração de doses repetidas e diárias. Os testes

subcrônicos têm como objetivo determinar os níveis nos quais efeitos

tóxicos não são observados e identificar os órgãos mais afetados pela

substância química, bem como o grau de comprometimento dos mesmos

(FAUSTMAN et al., 1994).


A via oral constitui a principal via de administração nesse tipo de

teste. Os animais devem ser saudáveis e estar em idade adulta jovem.

Durante o estudo, é necessário que haja observação diária do animal

quanto a alterações de massa corporal, cor e textura dos pêlos, consumo

de água e ração, temperatura corporal, parâmetros respiratórios e

cardiovasculares e quanto a mudanças no comportamento e presença de

anormalidades motoras (BARNES e DOURSON, 1988).

Ao final do ensaio, os animais devem ter o sangue coletado para as

dosagens bioquímica e hematológica e, após eutanásia, exames

morfológicos macro e microscópicos dos principais órgãos.

2.3. Toxicologia do desenvolvimento

Após a fecundação, o desenvolvimento normal do concepto depende

tanto de um ambiente intra-uterino propício quanto de uma herança

genética adequada. A ingestão de certos compostos antes e durante a

gestação pode quebrar essa harmonia, provocando danos no concepto.

O consumo de medicamentos durante a gravidez é bastante comum.

No Reino Unido, cerca de 35% das mulheres consomem medicamentos

pelo menos uma vez durante a gravidez, sendo que 6% delas o fazem no

primeiro trimestre da gestação (RUBIN, 1995). Na Austrália, 43% das

mulheres grávidas consomem medicamentos de venda sob prescrição

médica nos dois últimos trimestres da gestação e o percentual aumenta

para 95% quando se trata de medicamentos de venda livre (HENRY e

CROWTHER, 2000).

Até o início da década de 1960, os estudos envolvendo os possíveis

efeitos nocivos das drogas sobre a gravidez e o concepto não eram

realizados de maneira adequada. Em 1962, mais de 10.000 crianças no

mundo inteiro nasceram com graves malformações nos membros

decorrentes do consumo por gestantes da talidomida, indicada como

sedativo e anti-emético. A partir desse momento, as pesquisas envolvendo

toxicologia do desenvolvimento se tornaram essenciais e de rotina do


estudo da segurança de substâncias químicas (CLARK, 1993; WEBSTER e

FREEMAN, 2001).

Após o que ficou conhecido como “O legado da talidomida”, a

toxicologia do desenvolvimento se consolidou como ciência e assumiu seu

importante papel na avaliação da segurança de medicamentos e outros

produtos químicos. É definida como o estudo dos efeitos tóxicos no

organismo em desenvolvimento ocorrendo a qualquer hora durante a vida

do organismo que se submete à exposição a agentes químicos ou físicos

antes da concepção, durante o desenvolvimento pré ou pós-natal até a

puberdade (SCHWETZ et al., 1991).

Os efeitos tóxicos das drogas durante o desenvolvimento podem

promover a morte do concepto, malformações congênitas (teratogênese),

retardo no desenvolvimento intra-uterino e deficiências funcionais. Além

disso, as drogas também podem provocar efeitos deletérios no sistema

reprodutor de indivíduos adultos, bloqueando a gametogênese, evitando a

ovulação, fertilização ou implantação do embrião (SCHWETZ et al., 1991;

BECKMAN, 1997).

Os estudos de avaliação dos efeitos das drogas sobre a reprodução

avaliam os seguintes parâmetros: fertilidade, transporte e implantação do

zigoto, embriogênese, organogênese, função placentária, parto,

desenvolvimento pré e pós-desmame até a maturidade sexual (BARROW,

2003).

2.3.1. Teratogênese e embriofetotoxicidade

Os maiores e mais sérios riscos associados com a exposição a

drogas durante a gestação são a possibilidade de malformações

congênitas, retardo no desenvolvimento e embriofetoletalidade. Os agentes

capazes de promover malformações congênitas são chamados

teratogênicos, enquanto aqueles que produzem retardo no

desenvolvimento, variações na ossificação ou morte do concepto, mas não

promovem malformações são conhecidos como embriofetotóxicos (WEBSTER

e FREEMAN, 2001).


Os efeitos deletérios das drogas podem ser promovidos pela ação

direta sobre o feto ou indiretamente, através da ação tóxica sobre o

organismo materno (MENEGOLA et al., 1998). O impacto e a gravidade

desses efeitos estão diretamente relacionados com o período da gestação,

a dose ou magnitude da exposição, diferenças entre as espécies, fatores

genéticos e toxicocinéticos, como metabolismo, transporte placentário e

via de administração. Postula-se que 2-4% das malformações sejam

espontâneas e que menos de 1% sejam induzidas pelo uso de

medicamentos. O percentual aumenta se o uso ilícito de drogas, o tabaco

e o álcool sejam incluídos (BRENT et al., 1993; WEBSTER e FREEMAN, 2001).

De acordo com a sensibilidade aos agentes teratogênicos e

embriofetotóxicos, a gestação pode ser dividida em 3 fases. A primeira

fase, conhecida como pré-implantação, compreende o período que vai

desde a fecundação até a implantação do blastocisto. Na mulher, esse

período vai até o 17° dia de gestação, enquanto que em ratos e

camundongos, até o 6° dia, aproximadamente (FRITZ e GIESE, 1990).

No período de pré-implantação, o embrião é bastante resistente à

teratogênese, encontra-se com células totipotentes, em divisão, sem que

haja acréscimo citoplasmático (FRITZ e GIESE, 1990; ALMEIDA et al., 2000).

Segundo Wilson et al. (1953 e 1977) e Brent et al. (1993), esse estágio

inicial da gestação é caracterizado por “tudo ou nada”, ou seja, a

exposição materna a agentes químicos pode provocar a embrioletalidade

ou não interferir com o desenvolvimento do embrião. Isto se deve ao alto

grau de indiferenciação e capacidade de divisão das células do embrião,

que quando possível promovem a reposição das células mortas, sem que

haja comprometimento do desenvolvimento do embrião. Entretanto,

outros autores afirmam que certas injúrias nesse estágio podem resultar

em malformações ou retardos no desenvolvimento (GENEROSO et al., 1988;

GIAVINI et al., 1990).

Drogas como a ciclofosfamida, nicotina e adriamicina são capazes de

promover deficiência no ganho de peso e embrioletalidade quando

administradas durante o período de pré-implantação em ratas (FABRO et

al., 1984; GIAVINI et al., 1990).


O extrato hidroalcoólico das folhas de Coleus barbatus administrado

em ratas nas doses de 220, 440 e 880mg/kg por via oral durante o

período de pré-implantação apresentou efeitos embriotóxicos e de anti-

implantação (ALMEIDA et al., 2000). Estudo com embriões de camundongos

in vitro, demonstrou a ação embriotóxica do extrato aquoso das folhas de

Indigofera suffruticosa nas concentrações de 5 e 10mg/mL no período de

pré-implantação (LEITE et al., 2004).

O extrato aquoso de Ruta graveolens, administrado por via oral nos

primeiros 4 dias da prenhez de camundongos, promoveu alterações no

desenvolvimento normal dos blastocistos e atrasou o transporte dos

embriões no útero (GUTIÉRREZ-PAJARES et al., 2003).

Após a implantação, o embrião inicia o período de organogênese,

que na espécie humana vai do 18° ao 40° dia de gestação, e no rato, do 7°

ao 14° dia. Esse período é caracterizado por uma intensa proliferação e

migração celular, remodelamento tissular e formação rudimentar das

estruturas do corpo. É o período de maior susceptibilidade à ação de

agentes teratogênicos e embriofetotóxicos e no qual o maior número de

malformações podem ser induzidas (BRENT et al., 1993).

Drogas como o ácido valpróico, carbamazepina, talidomida,

isotretinoina, ciclofosfamida, captopril e tetraciclina são reconhecidamente

teratogênicas ao homem (COLLINS e MAO, 1999; MCELHATTON, 2003).

O extrato liofilizado de Rhazya stricta, quando administrado por via

oral em ratas prenhas nas doses de 0,5; 2,0; 5,0 e 8,0g/kg no período da

organogênese apresentou efeito teratogênico e fetotóxico, além de

promover alterações na placenta (RASHEED et al., 1997).

O extrato hidroalcoólico das folhas secas de Peumus boldus e a

boldina apresentaram atividade teratogênica e abortiva em ratas (ALMEIDA

et al., 2000a).

A administração dos extratos da fruta de Jatropha curcas em

metanol, diclorometano e éter de petróleo por via oral durante os estágios

iniciais da organogênese em ratos aumentou o número de reabsorções

fetais em relação ao grupo controle, indicando um possível efeito fetotóxico

(GOONASEKERA et al., 1995).


Com o fim da organogênese, tem início o período fetal, caracterizado

por diferenciação e crescimento tissular, maturação fisiológica dos

diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto (FRITZ e GIESE, 1990).

Nesse período, a sensibilidade frente a malformações anatômicas é

extremamente baixa, porém a exposição a agentes químicos pode produzir

morte celular e inibição da diferenciação e divisão celular. Essas

alterações podem interferir com a formação dos sistemas nervoso,

endócrino e imunológico, promovendo desordens funcionais e de

comportamento (AUROUX, 1997).

Conforme descrito anteriormente, parâmetros tóxicocinéticos são

fundamentais para determinar o grau de embriofetotoxicidade de um

xenobiótico. Por se localizar entre a mãe e o concepto e ser uma estrutura

responsável pela troca de substâncias entre ambos, a placenta ganha uma

vital importância quando se quer avaliar os riscos de uma substância.

A placenta atua como uma barreira seletiva, pode funcionar como

um reservatório para drogas e ainda é capaz de sintetizar e metabolizar

substâncias. As drogas que têm a capacidade de atravessá-la têm

características semelhantes as que atravessam a barreira hemato-

encefálica, são substâncias lipofílicas, não-polares e de tamanho não

superior a 1000 Ä (ADLER, 1994).

Alterações na estrutura e função placentárias podem provocar

efeitos nocivos para o feto. O etanol, fumo, cocaína, salicilatos e metais

pesados são tóxicos para a placenta e conseqüentemente para o ser em

formação. As drogas podem promover necrose placentária, reduzir o fluxo

sanguíneo ou inibir a passagem de nutrientes pela placenta (PARIZEK,

1964).

Diferenças genéticas e metabólicas entre as espécies e linhagens

também influenciam na resposta embriofetotóxica de uma droga. A

atividade teratogênica da talidomida, tão marcante em humanos, macacos

e coelhos, não é detectada em ratos e camundongos (GAYLOR e CHEN,

1993). Os motivos que levam uma droga a ser teratogênica em uma

espécie e inofensiva em outra são complexos e pouco conhecidos

(STHEPHENS e FILLMORE, 2000).


Todas essas variantes, impedem o extrapolamento dos resultados

obtidos com os estudos de toxicologia do desenvolvimento em animais

para o homem. Mesmo assim, constituem uma importante ferramenta de

alerta para que não tenhamos mais desastres como o da talidomida.

Calendula officinalis L. está entre as espécies medicinais mais

utilizadas pela população mundial, sendo amplamente cultivada e

comercializada (Martins, 1995). Os extratos de suas flores podem ser

encontrados nas formas farmacêuticas de tintura, infuso, gel, creme e

pomada. Como descrito anteriormente, a espécie é bem estudada sob o

ponto de vista botânico, fitoquímico e farmacológico. Entretanto, de

acordo com a OMS (WORLD, 2001) e International Journal of Toxicology

(INTERNATIONAL, 2001), existem raros estudos sobre os efeitos toxicológicos

da Calendula officinalis. Em nossa revisão bibliográfica confirmamos

também a escassez de informações toxicológicas sobre a Calêndula. Nesse

contexto, nosso laboratório tem se dedicado nos últimos anos ao estudo

da farmacologia e toxicologia pré-clínica de fitoterápicos e consideramos

atraente a hipótese de avaliar a toxicidade do extrato hidroalcoólico de

Calendula officinalis produzido e comercializado pelo Laboratório Simões-

RJ.


3.Objetivo


3. OBJETIVO

3.1. Geral

Avaliar a toxicidade pré-clínica do extrato hidroalcoólico (EHA) de

Calendula officinalis, L.

3.2. Específico

• Estimar o valor de DL50 em ratos e camundongos por via oral.

• Investigar o efeito da administração subcrônica do EHA de

Calendula officinalis sobre os parâmetros bioquímicos e hematológicos em

ratos.

• Determinar o efeito da administração subcrônica do EHA sobre a

morfologia e massa dos tecidos em ratos.

• Explorar o efeito da administração subcrônica do EHA durante o

período de gestação em ratas e desenvolvimento da prole.

• Analisar o efeito do EHA durante as fases da gestação em ratas.

• Estudar o efeito da administração subcrônica do EHA sobre a

performance reprodutiva de ratos.


4.Artigo I

Artigo submetido à Revista Brasileira de Farmacognosia


AVALIAÇÃO DO TRATAMENTO SUBCRÔNICO COM O EXTRATO

HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L. SOBRE OS

PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E HEMATOLÓGICOS EM RATAS. Silva, E.J.R.1; Aguiar, F.J.S.; Gonçalves, E.S.1; Sousa, I.M.V.; Dimech,

G.S.; Fraga, M.C.C.A.2; Coelho, M.C.O.C.3; Wanderley, A.G.2* 1 Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Departamento

de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE,

Recife-PE, Brasil.

2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de

Pernambuco – UFPE, Recife-PE, Brasil. 3Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de

Pernambuco – UFRPE, Recife-PE, Brasil.

Resumo

O efeito da administração oral subcrônica do extrato hidroalcoólico (EHA)

de Calendula officinalis L. foi investigado sobre os parâmetros

hematológicos e bioquímicos em ratas Wistar. Quarenta ratas

(n=10/grupo) foram tratadas durante 30 dias consecutivos com EHA por

via oral nas doses de 0,25; 0,5; e 1,0g/kg e em seguida determinados os

perfis bioquímico e hematológico e a massa dos órgãos. Nossos resultados

mostram que não observamos sinais visíveis de toxicidade ou morte

durante o período de tratamento. Os parâmetros bioquímicos e

hematológicos e massa dos órgãos não foram modificados pela

administração subcrônica do EHA, excetuando-se aumento de 23,6% para

uréia na maior dose e aumento respectivamente de 61,4; 29,9 e 43,7%

para ALT. Na hematologia registramos flutuação dentro dos valores de

referência na contagem diferencial de neutrófilos, linfócitos e monócitos.

Concluímos que a administração subcrônica do extrato hidroalcoólico de

Calendula officinalis não produz efeitos tóxicos em ratas, entretanto, os

aumentos de uréia e alanina aminotransferase (ALT) sugerem inicialmente

possível sobrecarga renal e hepática. Unitermos: Calendula officinalis L.; Asteraceae; tratamento subcrônico; hematologia;

bioquímica; rata.


Abstract: Evaluation of hydroalcoholic extract of Calendula officinalis L. on biochemical and hematological parameters in female

rats.

The effect of subchronic oral administration of hydroalcoholic extract

(HAE) of Calendula officinalis L. was investigated on biochemical and

hematological parameters in female Wistar rats. Forty female rats

(n=10/group) were orally treated daily for 30 days with HAE at doses of

0.25; 0.5 and 1.0g/kg and determinated biochemical and hematological

parameters and organ weight. The treatment did not cause any deaths or

clear signs of toxicity in the animals. The administration of HAE failed to

change biochemical and hematological parameters and organ weight,

except for an increase of 23.6% in blood urea nitrogen and 61.4; 29.9 and

43.7% respectively in alanine transaminase (ALT) plasma level. For the

hematological parameters, we registered slight changes in neutrophils,

lymphocyte and monocyte count with were not different from reference

values. In conclusion, the subchronic administration of HAE of Calendula

officinalis did not induce any harzadous effects in female rats, however,

the increase in blood urea nitrogen and ALT suggest a possible renal and

hepatic overload. Keywords: Calendula officinalis L.; Asteraceae; subchronic treatmente; hemathology;

biochemistry; female rat.

Introdução

Calendula officinalis (Asteraceae) é uma herbácea anual originária

da região mediterrânea, sendo amplamente cultivada em várias partes do

mundo para fins ornamentais, cosméticos e medicinais (RAMOS et al.,

1998). No Brasil, a espécie é popularmente conhecida como Calêndula,

Calêndula-hortense, Maravilha-dos-jardins, malmequer ou verrucária.

Formas galênicas preparadas a partir dos extratos das flores de C.

officinalis são amplamente utilizadas como antiinflamatório e cicatrizante

em proporções de cerca de 1,0 a 2,0g de flor seca por 150mL de água ou

8,8 a 17,6mg de flavonóides por dia (SCHEFFER, 1979; BLUMENTHAL, 1998;


BRASIL, 2004). Estudos demonstraram que os triterpenos, sobretudo os

monoésteres de faradiol, são os principais responsáveis pela atividade

antiinflamatória da planta (DELLA-LOGGIA et al., 1994; AKIHISA et al., 1996).

Em nossa revisão, verificamos que a Calêndula se encontra entre as

plantas mais utilizadas para fins medicinais, entretanto, detectamos

poucos estudos sobre a segurança do uso do extrato hidroalcoólico (EHA)

de Calendula officinalis. Nesse sentido, o presente trabalho teve como

objetivo avaliar os efeitos da administração subcrônica do EHA sobre os

parâmetros bioquímicos e hematológicos em ratas.

Materiais e Métodos

Animais

Foram utilizadas ratas Wistar, Rattus norvegicus var. albinus com 3

meses de idade, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia. Os animais receberam água e dieta (Labina) ad libitum e

foram mantidos em condições controle de iluminação (ciclo 12h

claro/escuro) e temperatura (23 ± 2°C). O protocolo experimental foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da

Universidade Federal Pernambuco, processo n° 23076.0011236/2003-44.

Material Botânico

O material botânico utilizado foi constituído pelas flores secas de

Calendula officinalis L. sob a forma EHA (50g do material vegetal para

100ml de solução hidroalcoólica 70%), produzido e fornecido pelo

Laboratório Simões - RJ, Brasil - (lote n° 02.001). Em nosso laboratório, o

EHA foi concentrado até a secura em rota evaporador sob pressão

reduzida para eliminação do solvente orgânico, em seguida o material foi

ressuspenso em água destilada e a concentração final variou entre (350 e

450mg/mL). O material foi dividido em alíquotas e estocado a -20oC.


Tratamento dos Animais

Quarenta ratas correspondendo a quatro grupos (n=10/grupo)

foram tratadas durante 30 dias consecutivos por via oral com EHA nas

doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg (grupo tratado) ou água destilada (grupo

controle). As doses utilizadas no protocolo são respectivamente cerca de

10, 20 e 40 vezes superiores à dose usual. Durante o tratamento, os

animais foram pesados semanalmente e acompanhados quanto a sinais

clínicos de toxicidade, consumo de água e ração. Ao final do tratamento,

os animais foram submetidos a um jejum de 12h e anestesiados com éter.

Em seguida, procedeu-se a coleta de sangue por rompimento do plexo

retro-orbital com auxílio de capilar de vidro (WAYNFORTH, 1980). O sangue

foi dividido em dois tipos de tubo: um com EDTA (parâmetros

hematológicos) e o outro sem anticoagulante (parâmetros bioquímicos).

Parâmetros Bioquímicos

Para análise bioquímica, o sangue foi centrifugado a 3500rpm

durante 10 minutos para obtenção do soro e em seguida determinados os

parâmetros: glicose, uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST),

alanina aminotransferase (ALT), colesterol total, triglicerídeos, fosfatase

alcalina (ALP), bilirrubina total e direta, proteínas totais, albumina e

globulina. Os ensaios foram realizados em aparelho automático Cobas

Mira (Roche) com kits da Boehringer Ingelheim®.

Parâmetros Hematológicos

Os parâmetros eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina,

hematócritos e os índices hematimétricos: volume corpuscular médio

(VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de

hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram determinados

imediatamente após a coleta através do analisador automático de células

hematológicas Coulter STKS. A contagem diferencial de leucócitos foi

realizada com May-Grünwald-Giemsa, em cada caso, 100 células foram

contadas.


Análise morfológica macroscópica

Após a coleta do sangue, procedeu-se a eutanásia por

aprofundamento da anestesia etérea e necrópsia para avaliação da

morfologia macroscópica externa dos órgãos. Os órgãos cérebro, coração,

fígado, rim, glândula adrenal, baço, útero e ovário foram cuidadosamente

removidos, dissecados e tiveram sua massa úmida determinada em

balança analítica a qual foi expressa em termos de massa relativa g/100g

(VIJAYALAKSHMI et al., 2000).

Análise Estatística

Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média

(epm). As diferenças entre os grupos foram determinadas através da

Análise de Variância (ANOVA), seguida, quando detectada diferença, pelo

teste de Newman-Keuls. O nível de significância para rejeição da hipótese

de nulidade foi sempre ≥ a 5%.

Resultados

O ganho de massa corporal das ratas dos grupos controle e tratado

são mostrados na figura 1. O EHA não alterou de forma significativa o

ganho de massa dos animais. Durante o tratamento, não observamos

sinais clínicos de toxicidade e nenhuma morte foi registrada. Não houve

alteração no consumo de água e ração.

O tratamento subcrônico com EHA nas ratas, de forma geral, não

induziu modificações no perfil bioquímico (Tabela 1). Todos os parâmetros

mantiveram-se dentro da faixa de referência, exceto para o valor da uréia

no grupo tratado com a maior dose que aumentou significativamente em

cerca de 23,6% do valor basal, assim como, a ALT que aumentou

respectivamente em 61,4; 29,9 e 43,7% no grupo tratado em relação ao

grupo controle (Tabela 1).

De maneira semelhante ao resultado obtido nos parâmetros

bioquímicos, observamos que o tratamento com EHA não alterou o perfil


hematológico (Tabela 2), contudo, observamos, mesmo dentro dos valores

de referência, pequenas flutuações na contagem diferencial de neutrófilos,

linfócitos e monócitos.

A análise macroscópica externa não revelou nenhuma alteração, a massa

relativa dos tecidos também não foi alterada pela administração do EHA

(Figura 2).

Discussão

Nossos resultados mostraram que a administração sub-crônica do

EHA de Calendula officinalis de forma geral não produziu efeitos tóxicos

em ratas.

Durante o tratamento subcrônico, nenhum sinal clínico visível de

toxicidade foi observado, em adição, a atividade geral das fêmeas não foi

alterada, assim como, o consumo de ração e água. O acompanhamento da

massa corporal do animal é um importante indicador para a avaliação da

toxicidade de uma substância (JAHN e GÜNZEL, 1997), o EHA não alterou o

ganho de massa corporal das ratas, mesmo em doses diárias de cerca de

10, 20 e 40 vezes maiores do que a usual para o tratamento de processo

inflamatório ou como cicatrizante. Nossos resultados estão de acordo com

estudos realizados com os extratos aquoso e etilenoglicólico de Calendula

officinalis e com a saponina terpênica, calendulosídeo B, respectivamente

em ratos e camundongos, os quais também não demonstraram sinais

claros de toxicidade (MANOLOV et al., 1964; RUSSO et al., 1972; IATSYNO et

al., 1978).

De fato, resultados do nosso laboratório (dados não apresentados)

mostram que o EHA em doses de até 5,0g/kg por via oral não produziu

morte em ratos e camundongos de ambos os sexos, por um período de

observação de até 14 dias.

Embora de modo geral o perfil bioquímico dos animais estivesse

dentro da faixa de referência (HARKNESS e WAGNER, 1993), houve exceções

para a uréia e ALT. A alteração verificada nos níveis plasmáticos de uréia

no grupo tratado, apenas com a maior dose pode ser inicialmente


interpretada como uma alteração renal. A elevação nos níveis plasmáticos

de uréia e creatinina fornece indícios de sobrecarga renal, insuficiência

renal aguda ou ainda de aumento no catabolismo protéico (VIJAYALAKSHMI

et al., 2000; ADEBAYO et al., 2003).

As análises das enzimas transaminases séricas (ALT e AST) e da

fosfatase alcalina são importantes indicadores de lesões nas células

hepáticas (MARTIN et al., 1981). Uma droga não provoca dano algum no

fígado sem interferir com a atividade normal dessas enzimas

(VIJAYALAKSHMI et al., 2000). A fosfatase alcalina é fundamental para a

formação de constituintes da membrana celular, influenciando na sua

permeabilidade. As transaminases existem em concentrações muito

pequenas no sangue e são liberadas pelos hepatócitos quando estes

sofrem algum tipo de lesão. Os aumentos nos níveis plasmáticos de ALT

observados em nosso estudo, além de serem estatisticamente significantes

em relação ao grupo controle, ficaram acima do nível de referência para a

espécie, situado entre 21-52 UI/L, segundo COIMBRA et al. (1995). Estes

dados fornecem indícios de alterações na função hepática, pois os níveis

séricos de ALT aumentam quando ocorrem alterações na permeabilidade

ou injúria nos hepatócitos. A AST é essencialmente mitocondrial e não é

liberada tão rapidamente quanto a ALT, que é citoplasmática. Isto pode

justificar o fato de termos encontrado alterações significativas apenas nos

níveis de ALT. Além disso, a ALT é um indicador mais sensível de

hepatotoxicidade do que a AST, pois enquanto a primeira é

essencialmente hepática, a segunda também pode ser encontrada em

altas concentrações em outros órgãos, como rins, pulmões e coração (AL-

HABORI et al., 2002).

Quanto ao estudo hematológico, não observamos alterações do perfil

hematológico. A contagem diferencial de neutrófilo, linfócito e monócito

revelou, embora, dentro dos limites de referência (HARKNESS e WAGNER,

1993), pequenas flutuações, sem indicativo de importância clínica.

Baseados em nossos resultados podemos concluir que a

administração subcrônica do EHA de Calendula officinalis não produziu

efeitos tóxicos sobre os parâmetros bioquímicos e hematológicos em ratas.


Entretanto, o aumento dos níveis de uréia e ALT apontam para uma

possível sobrecarga renal e hepática respectivamente, as quais devem ser

investigadas em maior detalhe posteriormente.

Agradecimentos

A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões-RJ

por ceder gentilmente o extrato hidroalcoólico e a Rejane Ferreira da Silva

pelo valioso apoio técnico.

Referências bibliográficas

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* Autor para correspondência:

Prof. Dr.Almir Gonçalves Wanderley

Universidade Federal de Pernambuco.

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, CCB.

Laboratório de Farmacologia e Toxicologia Pré-Clínica

de Produtos Bioativos.

Av. Prof. Moraes Rego, s/n - Cidade Universitária,

Recife - PE - CEP: 50670-901

E-mail: [email protected]

0 10 20 300

10

20

30

40

50ControleEHA 0,25 g/kgEHA 0,5 g/kgEHA 1,0 g/kg

Tempo (dias)

Gan

ho d

e m

assa

corp

oral

(g)

Figura 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis

(0,25 a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal em ratas

Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos. Os valores representam

as médias ± e.p.m. (n=10/grupo).


0.0 0.2 0.4 0.6

ção

ado

aço

Rim

ebro

mão

enal

tero

ário

ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0g/kg

3.2 3.6 4.0

Massa dos órgãos (g/100g)

vOvário

ÚÚtero

rAdrenal

lPulmão

rCérebro

Rim

BBaço

gFígado

aCoração


(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos órgãos (g/100g) de

ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos. Os valores

representam as médias ± e.p.m. (n=10/grupo).


Tabela 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os

parâmetros bioquímicos em ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.

Paramêtros X Controle X EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kgx EHA 1,0g/kg

Glicose (mg/dL) 69,1 ± 1,1 69,2 ± 4,0 79,0 ± 3,6 73,8 ± 3,9

Uréia (mg/dL) 41,4 ± 2,3 47,3 ± 1,2 46,2 ± 1,7 51,2 ± 1,6*

Creatinina (mg/dL) 0,50 ± 0,06 0,64 ± 0,04 0,58 ± 0,03 0,62 ± 0,02

Aspartato aminotransferase (U/L) 177,8 ± 13,2 209,5 ± 16,3 153,4 ± 12,9 160,8 ± 4,6

Alanina-aminotransferase (U/L) 45,1 ± 3,0 72,8 ± 3,1* 58,6 ± 3,3* 64,8 ± 2,7*

Colesterol total (mg/dL) 68,6 ± 5,4 74,8 ± 6,7 78,6 ± 9,9 76,2 ± 5,1

Triglicerídeos (mg/dL) 81,8 ± 11,4 64,8 ± 7,4 84,6 ± 8,2 92,5 ± 4,5

Fosfatase alcalina (U/L) 57,6 ± 3,8 79,5 ± 14,0 56,6 ± 6,9 81,8 ± 6,4

Bilirrubina total (mg/dL) 0,19 ± 0,02 0,20 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,23 ± 0,02

Bilirrubina direta (mg/dL) 0,11 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,12 ± 0,02

Proteínas totais (g/dL) 7,6 ± 0,2 7,9 ± 0,1 7,6 ± 0,2 8,1 ± 0,1

Albumina (g/dL) 1,7 ± 0,1 1,7 ± 0,1 1,7 ± 0,04 1,8 ± 0,03

Globulina (g/dL) 5,9 ± 0,1 5,8 ± 0,1 6,2 ± 0,2 6,4 ± 0,2

Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. * Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).



parâmetros hematológicos em ratas Wistar adultas tratadas por 30 dias consecutivos.

Parâmetros Controle EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg

Eritrócitos (106/µL) 7,6 ± 0,1 7,6 ± 0,2 7,8 ± 0,2 7,8 ± 0,1

Hemoglobina (g/dL) 14,8 ± 0,2 15,4 ± 0,1 15,3 ± 0,3 15,6 ± 0,3

Hematócrito (%) 41,2 ± 0,8 42,3 ± 0,4 42,3 ± 1,3 42,6 ± 0,9

VCM (fL) 54,0 ± 0,6 56,0 ± 0,7 53,9 ± 1,3 54,8 ± 0,6

HCM (pg) 19,4 ± 0,2 20,4 ± 0,3 19,6 ± 0,5 20,1 ± 0,2

CHCM (g/dL) 35,8 ± 0,3 36,3 ± 0,1 36,2 ± 0,5 36,7 ± 0,1

Plaquetas (103/µL) 933,88 ± 27,60 938,60 ± 26,82 936,60 ± 32,55 954,50 ± 39,40

Leucócitos (103/µL) 6,7 ± 0,2 7,2 ± 0,9 6,2 ± 0,6 8,4 ± 0,5

Bastonetes (%) 0 0 0 0

Neutrófilos (%) 22,3 ± 2,2 11,0 ± 1,3* 26,6 ± 1,8 16,8 ± 1,9*

Eosinófilos (%) 1,6 ± 0,4 0,8 ± 0,2 1,0 ± 0 1,5 ± 0,3

Basófilos (%) 0,22 ± 0,13 0,40 ± 0,22 0,20 ± 0,17 0,50 ± 0,3

Linfócitos (%) 69,3 ± 1,9 85,2 ± 1,6* 69,2 ± 2,2 79,3 ± 2,4*

Monócitos (%) 6,6 ± 0,6 2,6 ± 0,4* 2,8 ± 0,8* 2,0 ± 0,5*

Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média. * Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).


5.Artigo II

Artigo a ser submetido ao Journal of Ethnopharmacology


AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE

CALENDULA OFFICINALIS L. Erick J.R. Silvaa, Fábio Aguiara, Liriane B. Evênciob, Mariana M.A. Lyraa,

Maria Cristina O.C. Coelhod, Parviz Afiatpourc, Maria do Carmo C. A.

Fragac, Almir G. Wanderleyc* aDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. bDepartamento de Histologia e Embriologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. cDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. dDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco –

UFRPE. Recife-PE, Brasil. Resumo

O extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis foi avaliado quanto

à toxicidade aguda por via oral em ratos e camundongos e seus efeitos

subcrônicos sobre os parâmetros hematológicos, bioquímicos e

morfológicos em ratos. Na toxicidade aguda o EHA não provocou morte

nos animais após administrações de até 5,0g/kg. O tratamento por 30

dias com EHA nas doses de 0,25; 0,5; e 1,0g/kg em ratos não produziu

alterações nos parâmetros hematológicos em relação ao grupo controle. No

perfil bioquímico, observamos que o EHA produziu um aumento

significativo nos valores de uréia e alanina aminotransferase (ALT). Os

parâmetros morfológicos do cérebro, rim e coração não sofreram

alterações, entretanto, no pulmão e fígado foram encontrados infiltrados

inflamatórios os quais foram relacionados respectivamente com a gavagem

e possível hepatotoxicidade. Concluímos que o EHA não possui efeitos

tóxicos em ratos, contudo existem evidências de possível toxicidade renal

e hepática. Palavras-chave: Calendula officinalis L.; Asteraceae; tratamento subcrônico; hematologia;

bioquímica; morfologia.

*Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP: 50.670-901, Recife-PE, Brasil. Tel:(81)-21268530, Email: [email protected]


Abstract

The hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis L. was evaluated

as for the acute toxicity by oral route in rats and mice and for the

subchronic effects on the hematological, biochemical and morphologic

parameters in rats. In acute toxicity test, HAE failed to cause death in the

animals after administrations up to 5,0g/kg. The treatment orally with

EHA at 0.25; 0.5; and 1.0g/kg did not induce hematological alterations in

comparison with control group. In biochemical parameters, we observed

an increase in blood nitrogen level and alanina transaminase (ALT).

Morphologic examination of brain, kidney and heart did not show any

modification, however, inflammatory sites were founded in lung and liver

with were associated with oral gavage and a possible hepatotoxic effect.

HAE was non toxic in rats, although there are evidences of renal and liver

overload. Keywords: Calendula officinalis L.; Asteraceae; subchronic treatment; hematology;

biochemistry; morphology.

1. Introdução

Calendula officinalis L. (Asteraceae) é uma herbácea anual originária

da Europa Meridional. A planta é cultivada em vários países do Velho

Mundo e da América (Garcia et al., 1996), tanto para fins ornamentais

quanto medicinais (Ramos et al., 1998).

As atividades antiinflamatória e cicatrizante das flores de Calendula

officinalis foram demonstradas por vários estudos (Scheffer, 1979; Peyroux

et al., 1981; Shipochliev et al., 1981; Lievre et al., 1992; Della-Loggia et

al., 1990, 1994; Jorga Neto et al., 1996). Outras atividades são atribuídas

às flores da planta, como anti-viral (Kavaltchev et al., 1997) e anti-tumoral

(Boucaud-Maitre et al., 1988). Entretanto, seu uso está aprovado pela

Comissão E (Alemanha) apenas como antiinflamatório para as mucosas

oral e faríngea (uso tópico e interno) e na cicatrização de ferimentos e

queimaduras (uso externo) em proporções de 1 a 2g de flor seca/150mL

de água por dia (Blumenthal, 1998).


No Brasil, a espécie é popularmente conhecida como Calêndula, ou

Maravilha-dos-jardins. O Laboratório Simões cultiva e explora

comercialmente a Calêndula sob a forma farmacêutica de pomada, com

indicações antiinflamatória e cicatrizante.

As informações das propriedades farmacológicas do extrato das

flores de Calêndula são amplas, entretanto poucos são os dados

disponíveis sobre a segurança do seu uso. Nesse contexto, o presente

trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade do extrato hidroalcoólico

(EHA) de Calendula officinalis em roedores.

2. Metodologia

2.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus com 3 meses de

idade e camundongos albinos, Mus musculus adultos (25 a 35g), de ambos

os sexos, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia e do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal

de Pernambuco, respectivamente. Os animais receberam água e ração ad

libitum e foram mantidos em condições controles de (ciclo 12h

claro/escuro) e temperatura (23 ± 2°C). O protocolo experimental foi

aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da

UFPE, processo n° 23076.0011236/2003-44.

2.2. Material Botânico O material botânico utilizado foi constituído pelas flores secas de









2.3. Toxicidade Aguda

Cinco grupos de camundongos e ratos (n=5/5 macho/fêmea) foram

privados de ração por 12h, em seguida receberam em dose única, por

gavagem, EHA nas doses de 0,625; 1,25; 2,5 e 5,0g/kg ou água destilada

no maior volume (grupo controle) para a determinação da dose letal 50%

(DL50) de acordo com o método descrito por Litchfield e Wilcoxon (1949).

Os animais foram observados diariamente quanto a alterações gerais de

comportamento, sinais clínicos de toxicidade e mortalidade durante o

período de 14 dias.

2.4. Tratamento dos Animais

Quatro grupos (n=10/grupo) de ratos machos foram tratados

durante 30 dias consecutivos por via oral com EHA nas doses de 0,25; 0,5

e 1,0g/kg por dia ou água destilada (grupo controle). As doses utilizadas

no protocolo são respectivamente cerca de 10, 20 e 40 vezes superiores à

dose usual recomendada na literatura (1 a 2g/150mL de água)

(Blumenthal, 1998). Durante o tratamento, a variação de massa corporal

dos animais foi determinada, bem como o consumo de água e ração e os

ratos foram observados quanto a sinais clínicos de toxicidade e atividade

geral. Ao final do tratamento, todos os animais foram submetidos a um

jejum de 12h e anestesiados com éter. Em seguida, procedeu-se à coleta

de sangue por rompimento do plexo retro-orbital com auxílio de capilar de

vidro (Waynforth, 1980). O sangue foi dividido em dois tipos de tubo: um

com EDTA (parâmetros hematológicos) e o outro sem anticoagulante

(parâmetros bioquímicos).

2.5. Parâmetros Hematológicos

Os parâmetros eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina,

hematócritos e os índices hematimétricos: volume corpuscular médio

(VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de

hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram determinados

imediatamente após a coleta através do analisador automático de células

hematológicas Coulter STKS. A contagem diferencial de leucócitos foi


realizada com May-Grünwald-Giemsa, em cada caso, 100 células foram

contadas.

2.6. Parâmetros Bioquímicos

Para a análise bioquímica, o sangue foi centrifugado a 3500rpm

durante 10 minutos para a obtenção do soro, em seguida determinados os

parâmetros: glicose, uréia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST),

alanina aminotransferase (ALT), colesterol total, triglicerídeos, fosfatase

alcalina (ALP), bilirrubina total e direta, proteínas totais, albumina e

globulina. Os ensaios foram realizados em aparelho automático Cobas

Mira (Roche) com kits da Boehringer Ingelheim.

2.7. Análise morfológica macro e microscópica

Após a eutanásia por aprofundamento da anestesia etérea

prodeceu-se a necrópsia (n=6/grupo) para avaliação da morfologia

macroscópica externa dos órgãos. Os órgãos cérebro, coração, fígado, rim,

glândula adrenal, baço, testículo e ducto deferente foram cuidadosamente

removidos, dissecados e tiveram sua massa úmida determinada em

balança analítica a qual foi expressa em termos de massa relativa g/100g

(Vijayalakshmi et al., 2000). Em outro procedimento, os animais

(n=4/grupo) foram perfundidos com formaldeído 10% em solução tampão

neutra e em seguida os órgãos cérebro, coração, pulmão, rim e fígado

foram retirados e imersos em líquido de Bouin e fixados “in totum” durante

48 horas, à temperatura ambiente. As lâminas histológicas foram

processadas de acordo com Lison (1960) e coradas em

hematoxilina/eosina.

2.8. Análise Estatística

Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média

(epm). As diferenças entre os grupos foram analisadas através da análise

de variância (ANOVA), seguida, quando detectada diferença, pelo teste de

Newman-Keuls. O nível de significância para rejeição da hipótese de

nulidade foi sempre ≥ a 5%.


3.0. Resultados

3.1. Toxicidade aguda

O EHA na dose de até 5,0g/kg administradas por via oral em

camundongos e ratos de ambos os sexos não produziu morte em nenhum

grupo por um período de 14 dias de observação. Os animais não

mostraram sinais clínicos de toxicidade ou alteração comportamental.

3.2. Ganho de massa corporal

O ganho de massa corporal dos ratos dos grupos controle e tratado

são mostrados na figura 1. O tratamento com EHA não alterou o ganho de

massa dos animais, bem como o consumo de água e ração. Durante o

tratamento, não observamos alteração comportamental ou sinais clínicos

de toxicidade. Nenhuma morte foi registrada.

3.3. Perfil Hematológico

O perfil hematológico dos ratos não foi modificado pelo tratamento

com EHA (Tabela 1), contudo, observamos, mesmo dentro dos valores de

referência, variações estatisticamente significativas (cerca de 10% em

relação ao grupo controle) no número de eritrócitos, VCM, HCM e na

contagem diferencial de eosinófilos, basófilos e monócitos.

3.4. Perfil bioquímico

De maneira geral, o tratamento com EHA não promoveu alterações

do perfil bioquímico dos ratos (Tabela 2). Todos os parâmetros

mantiveram-se dentro da faixa de referência, exceto os valores de uréia

que aumentaram significativamente de forma dose dependente em cerca

de 34,3; 38,2 e 50,6% e ALT, em aproximadamente 56,5; 42,2; e 37,3%

para as doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg, respectivamente, quando comparado

ao grupo controle.


3.5. Análise morfológica

A massa relativa dos tecidos não foi modificada pela administração

do EHA (Figura 2). A análise macroscópica externa dos órgãos não revelou

alterações, exceto no pulmão, no qual observamos uma menor massa em

todas as doses do grupo tratado. A análise microscópica não evidenciou alterações histológicas no

coração, rins e cérebro. O parênquima hepático apresentou células de

tamanho normal dispostas em traves codornais com núcleo central de

aspecto eucromático. Disposição vascular de distribuição homogênea

contendo células de Kupffer de forma e distribuição semelhante ao

controle (Figuras 3 e 4). Entretanto, para o grupo tratado com EHA

1,0g/kg, na periferia do lóbulo e nas proximidades do espaço-porta,

notou-se a presença de aglomerado de células hepáticas contendo

citoplasma mais acidófilo e núcleo levemente mais heterocromático.

Observou-se também a presença de um infiltrado inflamatório não muito

intenso no espaço periportal, sendo mais comumente formado por

leucócitos e plasmócitos e algumas células mononucleares características

de reações crônicas (Figuras 5 e 6). Nos pulmões do grupo tratado com

EHA 0,25 e 1,0g/kg observou-se a presença de descontinuidade do

epitélio e circunferência diminuída, com a mucosa apresentando dobras

de constrição. Na conjuntiva ocorre presença de infiltrado inflamatório

contendo muitos linfócitos, plasmócitos e macrófagos, sem alterações no

parênquima (Figura 7).

4.0. Discussão e Conclusão

No ensaio de toxicidade aguda por via oral, o EHA demonstrou-se

seguro, pois utilizando doses até 200 vezes superior à usada na

terapêutica antiinflamatória e cicatrizante não observamos sinal de

toxicidade no período avaliado. Estudo de toxicidade aguda com o EHA de

Calêndula demonstrou uma DL50 de 526mg/100g por via intravenosa em

ratos (Boyadzhiev e Vissh, 1964). Essa ausência de toxicidade por via oral

pode estar relacionada à baixa absorção de vários constituintes do EHA


pelo trato gastrintestinal dos animais, impedindo que os níveis séricos

letais sejam atingidos.

No estudo subcrônico, não houve alterações no comportamento dos

animais ou sinal clínico claro de toxicidade. Avramova et al. (1988)

mostraram que a administração crônica de extrato de Calêndula em ratos

e hamsters não produziu toxicidade.

O tratamento com EHA não alterou o perfil hematológico. As

flutuações encontradas no número de eritrócitos, VCM, HCM e na

contagem diferencial de eosinófilos, basófilos e monócitos encontraram-se

dentro dos limites estabelecidos (Harkness e Wagner, 1993) o que sugere

fortemente que estas variações não estão associadas ao tratamento com

EHA.

Em relação ao perfil bioquímico, o EHA não alterou os parâmetros

analisados que se mantiveram dentro dos valores de referência para a

espécie (Harkness e Wagner, 1993; Kaneko, 1997). Entretanto, o aumento

dose dependente dos níveis plasmáticos de uréia pode ser inicialmente

interpretado como sobrecarga renal. A elevação nos níveis plasmáticos de

uréia e creatinina fornece indícios de sobrecarga renal, insuficiência renal

aguda ou ainda de aumento no catabolismo protéico (Vijayalakshmi et al.,

2000; Adebayo et al., 2003).

Os aumentos nos níveis plasmáticos de ALT observado em nosso

estudo, além de serem estatisticamente significantes em relação ao grupo

controle, ficaram acima dos níveis de referência para a espécie, situados

entre 21-52 UI/l (Coimbra et al., 1995). A elevação dos valores das

enzimas transaminases séricas (ALT e AST) são usadas como indicadores

de lesões nas células hepáticas, devido a sua alta concentração nos

hepatócitos (Martin et al., 1981). Entretanto, a ALT é um marcador mais

específico para a função hepática, já que se encontra predominantemente

nos hepatócitos, enquanto a AST também pode ser encontrada em

concentrações elevadas no músculo cardíaco, pulmão e rim (Al-Habori et

al., 2002). Dados do laboratório (artigo submetido) revelaram que o

tratamento com EHA durante 30 dias em ratas também induziu aumento

nos níveis plasmáticos de ALT. A análise microscópica do fígado revelou


que o extrato na maior dose provocou um infiltrado inflamatório de

pequena intensidade.

Estes resultados fornecem indícios de sobrecarga hepática, pois

aumentos nos níveis séricos de ALT podem ser provocados por

modificações na permeabilidade da membrana ou lesões celulares (Latha

et al., 1998). Normalmente, flutuações nos níveis de ALT ocorrem junto

com os de AST, entretanto, a AST é essencialmente mitocondrial e não é

liberada tão rapidamente quanto a ALT, que é citoplasmática (Al-Habori et

al., 2002). Isto pode justificar o fato de termos encontrado alterações

significativas apenas nos níveis de ALT.

Por outro lado, estudo realizado por Cordova et al. (2002) com a

fração butanólica do extrato de C. offinicinalis revelou atividade

hepatoprotetora, através de um efeito antioxidante in vitro em células

hepáticas de ratos, onde os terpenos e carotenóides presentes no extrato

atuam como aceptores de radicais livres e inibem a peroxidação lipídica no

fígado. Porém, sabe-se que por motivos farmacocinéticos, as atividades in

vitro e in vivo podem ser diferentes. Pérez-Carreón et al. (2002) observaram

que os extratos aquoso e hidroalcoólico de Calêndula, em baixas

concentrações (ng/mL), apresentaram atividade protetora frente aos

efeitos genotóxicos do agente carcinogênico dietilnitrosamina, porém, em

concentrações mais elevadas (µg/mL), os mesmos extratos apresentam

atividade genotóxica. Esses resultados controversos decorrem da

capacidade dos flavonóides atuarem como anti-oxidantes em baixas

concentrações e, em concentrações maiores, serem pró-oxidantes

(Laughton et al., 1989).

Dessa forma, existe a possibilidade que o efeito hepatotóxico

observado em nosso trabalho pode ser decorrente de uma atividade pró-

oxidante dos flavonóides. As alterações no pulmão podem ter sido produzidas pela gavagem

não tendo relação aparentemente com o EHA, visto que o grupo controle

também foi afetado. Lesões semelhantes foram observados por Carlini et

al. (1988) e Palmeiro et al. (2003) em estudos pré-clínicos com os extratos


Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss. e Plantago australis Lam.

respectivamente administrados em ratos durante 60 dias por gavagem.

Nossos resultados mostram que a administração subcrônica do EHA

de Calendula officinalis não produziu efeitos tóxicos sobre os parâmetros

bioquímicos, hematológicos e morfológicos em ratos. Entretanto, o

aumento dos níveis de uréia e ALT e a alteração histológica no fígado

apontam para uma possível sobrecarga renal e hepática respectivamente.

Agradecimentos

CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões-RJ por

ceder gentilmente o extrato hidroalcoólico e a Rejane Ferreira da Silva pelo

valioso apoio técnico.


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0 10 20 300

15

30

45

60ControleEHA 0.25 g/kgEHA 0.5 g/kgEHA 1.0 g/kg

Tempo (dias)

Gan

ho d

e m

assa

corp

oral

(g)


(0,25 a 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa em ratos Wistar

adultos tratados por 30 dias consecutivos Os valores representam as

médias ± e.p.m. (n=10/grupo).

0.0 0.2 0.4 0.6

Controle

EHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kg

EHA 1,0g/kg

2.4 2.8 3.2 3.6 4.0

Massa dos órgãos (g/100g)

***

enteDDR

culoTestículo

enalAdrenal

mãoPulmão

ebroCérebro

RimRim

BaçoBaço

adoFígado

açãoCoração


(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre a massa dos órgãos (g/100g) em

ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos. Os valores representam as

médias ± e.p.m. (n=6/grupo). *Indica estatisticamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05). DDR=ducto

deferente de rato.


H

EP

H

Figura 3: Fotomicrografia do fígado de rato Wistar controle tratado com

água por via oral por 30 dias (grupo controle). Células hepáticas (H) e o

espaço porta (EP) com aspecto normal. (coloração HE, aumento ± 107x).

vc

K

Figura 4: Fotomicrografia do fíga

água por via oral por 30 dias (gru

Kuppfer (K), os vasos capilares (v

HE, aumento ± 430x).

V

H

do de rato Wistar controle tratado com

po controle). Hepatócitos (H), células de

c) e a veia centro lobular (V). (coloração


II

EP

H

Figura 5: Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral. por 30

dias. Infiltrado inflamatório (II) nas adjacências do espaço porta (EP) e

acúmulo de células acidófilas (H) – (coloração HE, aumento 107x).

H

Figura 6: Fotomicrografia do fígado de rato Wistar tratado com extrato

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral. por 30

dias. Presença de infiltrado na região periportal (seta) e hepatócitos

acidófilos (H) – (coloração HE, aumento ± 430x).


SA B

IIB

**

A

Figura 7: Fotomicrografia do pulmão de rato Wistar tratado com extrato

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via oral por 30

dias. Bronquíolos (B) com pequena quantidade de infiltrado inflamatório

(II). Epitélio descontínuo em alguns pontos (seta), sacos alveolares (SA),

alvéolos pulmonares (A) intactos – (coloração HE, aumento ± 107x).



parâmetros hematológicos em ratos Wistar tratados por 30 dias consecutivos.

PARÂMETROS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg

Eritrócitos (106/µL) 7,7 ± 0,1 8,3 ± 0,1* 8,4 ± 0,2* 8,3 ± 0,1*

Hemoglobina (g/dL) 15,4 ± 0,1 15,7 ± 0,1 15,9 ± 0,3 15,5 ± 0,2

Hematócrito (%) 43,1 ± 0,4 43,9 ± 0,3 43,8 ± 1,0 42,4 ± 0,6

VCM (fL) 56,1 ± 0,7 52,5 ± 0,9* 52,0 ± 0,2* 50,8 ± 0,6*

HCM (pg) 20,1 ± 0,3 18,7 ± 0,4* 18,9 ± 0,1* 18,6 ± 0,2*

CHCM (g/dL) 35,8 ± 0,2 35,6 ± 0,3 36,5 ± 0,1 36,5 ± 0,3

Plaquetas (103/µL) 900,54 ± 36,73 980,60 ± 17,35 983,25 ± 10,21 975,40 ± 18,24

Leucócitos (103/µL) 6,9 ± 0,9 6,3 ± 0,2 8,0 ± 0,5 8,0 ± 0,9

Bastonetes (%) 0,18 ± 0,11 0,20 ± 0,17 0 0,20 ± 0,17

Neutrófilos (%) 18,3 ± 2,8 21,2 ± 3,3 21,8 ± 4,6 18,4 ± 4,2

Eosinófilos (%) 0,5 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1 1,4 ± 0,2*

Basófilos (%) 0,27 ± 0,13 0* 0* 0*

Linfócitos (%) 76,5 ± 2,8 77,2 ± 3,4 76,8 ± 4,2 74,8 ± 3,1

Monócitos (%) 4,3 ± 0,5 1,2 ± 0,2* 1,0 ± 0,4* 4,8 ± 1,2

Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média. *Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).



parâmetros bioquímicos em ratos Winstar adultos tratados por 30 dias consecutivos.

PARAMÊTROS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kgx

Glicose (mg/dL) 62,4 ± 3,7 72,0 ± 4,6 77,8 ± 6,1 72,0 ± 6,7

Uréia (mg/dL) 38,7 ± 1,7 52,0 ± 0,8* 53,5 ± 3,2* 58,3 ± 0,10*

Creatinina (mg/dL) 0,45 ± 0,02 0,50 ± 0,04 0,53 ± 0,02 0,48 ± 0,04

Aspartato aminotransferase (U/L) 246,3 ± 9,6 201,4 ± 14,1 225,0 ± 34,4 252,0 ± 21,6

Alanina-aminotransferase (U/L) 48,8 ± 3,3 76,4 ± 5,1* 69,4 ± 2,3* 67,0 ± 3,6*

Colesterol total (mg/dL) 62,4 ± 2,3 66,4 ± 5,3 74,0 ± 1,8 73,4 ± 5,6

Triglicerídeos (mg/dL) 91,9 ± 7,4 116,8 ± 15,7 67,7 ± 6,7 126,5 ± 26,3

Fosfatase alcalina (U/L) 135,7 ± 10,8 121,6 ± 10,1 127,0 ± 12,9 115,0 ± 8,3

Bilirrubina total (mg/dL) 0,20 ± 0,02 0,23 ± 0,02 0,22 ± 0,02 0,21 ± 0,02

Bilirrubina direta (mg/dL) 0,10 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,12 ± 0,02 0,10 ± 0,02

Proteínas totais (g/dL) 7,1 ± 0,1 7,0 ± 0,1 7,2 ± 0,3 7,0 ± 0,1

Albumina (g/dL) 1,5 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,6 ± 0,1 1,5 ± 0,1

Globulina (g/dL) 5,6 ± 0,1 5,5 ± 0,1 5,6 ± 0,1 5,5 ± 0,1

Os valores representam as médias ± e.p.m. de 10 animais. *Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p< 0,05).


6.Artigo III Artigo a ser submetido ao Jounal of Ethnopharmacology


AVALIAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS

L. SOBRE A PERFORMANCE REPRODUTIVA EM RATOS Erick J.R. Silvaa, Eduardo S. Gonçalvesa, Gustavo S. Dimecha, Liriane B.

Evênciob, Maria Cristina O.C. Coelhod, Maria C. C. A. Fragac, Parviz

Afiatpourc, Almir G. Wanderleyc* aDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. bDepartamento de Histologia e Embriologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. cDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. dDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco –

UFRPE. Recife-PE, Brasil.

Resumo

O efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis L.,

Asteraceae, foi investigado sobre a performance reprodutiva de ratos.

Quatro grupos de ratos (n=9/grupo) foram tratados durante 60 dias

consecutivos por via oral com extrato hidroalcoólico de C. officinalis nas

doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg e água destilada (grupo controle). Foram

avaliados parâmetros reprodutivos, desenvolvimento da prole e a

determinação da massa úmida do testículo, epidídimo, vesícula seminal,

ducto deferente e próstata. O tratamento com EHA não alterou os

parâmetros reprodutivos em relação ao grupo controle e não produziu

modificações macroscópica e histológica no testículo. Nossos resultados

sugerem que o EHA não interferiu com a capacidade reprodutiva de ratos. Palavras-chave: Calendula officinalis L.; rato; performance sexual; toxicologia

reprodutiva.

*Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP: 50.670-901, Recife-PE, Brasil. Tel:(81)-21268530, Email: [email protected]


Abstract

The effect of hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis L.,

Asteraceae, was investigated on the reproductive performance of mature

rats. Animals were treated orally with HAE at doses of 0,25; 0,5 and

1,0g/kg and distilled water (group controls) for 60 days. Reproductive

parameters, offspring development and weight of testes, epididymys,

seminal vesicle, vase deference and prostate were determinated. The

treatment with HAE did not change reproductive parameters in

comparison with control group and did not induce morphologic

modifications in testes. Our results suggest that HAE did not provoke

modifications on reproductive performance of rats Keywords: Calendula officinalis L.; male rat; sexual performance; reproductive toxicology.

1. Introdução

Calendula officinalis L., Asteraceae, é uma herbácea anual,

amplamente cultivada nas diferentes partes do mundo. No Brasil, ela é

popularmente conhecida como Verrucária, Calêndula e Maravilha-dos-

Jardins, e em países de língua inglesa, como Marigold (Luz et al., 2001).

De acordo com dados etnofarmacológicos, os extratos das flores de

Calêndula são utilizados como antiinflamatório para peles e mucosas,

auxiliar na cicatrização de feridas, antisséptico, sedativo e para o

tratamento de dismenorréia, gastrite, distúrbios vasculares, reumatismo e

câncer (Scheffer, 1979; Bisset, 1994; Valdéz e Garcia, 1999). Vários

estudos farmacológicos confirmaram a atividade antiinflamatória e

cicatrizante dos extratos das flores de Calêndula (Shipochliev et al.; Della-

Loggia et al., 1990, 1994; Zitterl-Eglseer et al., 1997). A Comissão E

(Alemanha) aprovou a utilização das flores de Calêndula como

antiinflamatório e cicatrizante de 1 a 2g de flor seca/150mL de água por

dia (Blumenthal, 1998).

Atualmente, sabe-se que muitas substâncias químicas são capazes

de interferir no sistema reprodutor masculino (Sharp, 1994; Toppari et al.,


1996). Dessa forma, a análise da toxicidade reprodutiva em machos deve

fazer parte do processo de avaliação da segurança das plantas medicinais

(Dalsenter et al., 2004). Dados da literatura reportam atividade

espermicida para os constituintes triterpênicos da Calêndula (Morelli et

al., 1983). Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar

os efeitos do tratamento subcrônico do extrato hidroalcoólico (EHA) de

Calendula officinalis L. sobre a performance reprodutiva de ratos. 2. Metodologia

2.1. Animais

Foram utilizados ratos Wistar, Rattus norvegicus, com 2-3 meses de

idade de ambos os sexos, provenientes do Biotério do Departamento de

Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).

Os animais receberam água e dieta ad libitum e foram mantidos em

condições controles de iluminação (ciclo claro/escuro 12h) e temperatura

(23 ± 2ºC). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Experimentação Animal da UFPE, processo n° 23076.0011236/2003-44.

2.2. Material Botânico









2.3. Tratamento dos Animais

Quatro grupos (n=9/grupo) de ratos machos foram tratados

respectivamente com EHA de C. officinalis 0,25; 0,5 e 1,0g/kg por dia e

água destilada (controle) por 60 dias consecutivos. As doses utilizadas


nesse estudo correspondem a 10, 20 e 40 vezes à dose utilizada como

antiinflamatório. Durante o tratamento, a variação de massa corporal dos

animais foi determinada e os ratos foram observados quanto a sinais

clínicos de toxicidade e alteração comportamental. Nos dias 55 a 60 do

tratamento, os ratos foram transferidos para gaiolas individuais e

acasalados com fêmeas (1:2) comprovadamente férteis e não tratadas. A

presença de espermatozóides no esfregaço vaginal indicou o sucesso da

cópula e foi admitido como 1o dia de gestação. As ratas foram mantidas

em gaiolas individuais e após o nascimento da prole, foram determinados

os índices reprodutivos: relação prole/mãe, índice de fertilidade (n° de

ratas prenhas/n° de ratas acasaladas), índice de gestação (% de fêmeas

prenhas com todos os fetos vivos), índice de viabilidade (% de sobrevida

no 4º dia de vida), índice de lactação (% de sobrevida do 4º ao 21° dia de

vida), massa corporal no 1°, 4°, 7°, 14° e 21° dia de vida e observação de

aspectos macroscópicos externos e malformação (Elbetieha et al., 1998)

2.4. Massa corporal, dos órgãos e histologia

Após a eutanásia por aprofundamento da anestesia etérea prodeceu-

se a necropsia para avaliação macroscópica externa dos órgãos sexuais.

Os órgãos: testículos, próstata, epidídimo, vesícula seminal e ducto

deferente foram cuidadosamente retirados, dissecados e determinados a

massa úmida em balança analítica e expressa em termos de massa

relativa g/100g (Vijayalakshmi et al., 2000). A vesícula seminal foi pesada

sem fluido. Imediatamente após a determinação da massa, o testículo

direito foi imerso em líquido de Bouin e fixado “in totum” durante 48

horas, à temperatura ambiente. As lâminas histológicas foram preparadas

de acordo com Lison (1960) e coradas em hematoxilina/eosina.


Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média

(epm). A significância estatística entre os grupos tratado e controle foi

determinada através do teste de Análise de Variância seguido por

Newman-Keuls e para os índices de fertilidade, gestação, viabilidade e


lactação, para os quais se realizou o teste de qui quadrado (χ2). O nível de

significância para rejeição da hipótese de nulidade foi sempre ≥ a 5%.

3.0. Resultados

O ganho de massa corporal dos grupos controle e tratado durante

os 60 dias de tratamento é mostrado na figura 1. O tratamento com EHA

não provocou alterações no ganho de massa e no comportamento geral

dos animais. Durante o período de tratamento não registramos morte.

Na tabela 1 são apresentados os parâmetros reprodutivos dos

grupos controle e tratado. O EHA não produziu alteração significativa na

performance sexual dos machos. A relação fêmeas acasaladas/prenhas

não foi diferente entre os grupos tratado e controle, bem como a duração

da gestação e a relação feto/mãe. Os parâmetros reprodutivos: índices de

fertilidade, lactação, viabilidade e gestação não foram alterados pelo

tratamento. A prole apresentou um desenvolvimento normal, sem

alterações comportamentais ou no ganho de massa corporal.

As massas relativas do testículo, epidídimo, vesícula seminal,

próstata e ducto deferente dos grupos tratados não foram estatisticamente

diferentes do grupo controle (Figura 2).

A análise histológica do testículo não evidenciou nenhuma

modificação na estrutura do órgão do grupo tratado em comparação com

o grupo controle. Os testículos apresentaram substância intercelular com

características normais, células de Leydig de forma arredondada ou

poligonal com núcleo central e citoplasma acidófilo. O tecido germinativo

apresentou-se com sua diversidade característica, túbulos regulares,

podendo-se visualizar células germinativas e espermatozóides com

morfologia normal (Figuras 3 e 4).

4.0. Discussão

Os ratos tratados com EHA não apresentaram alterações no ganho de

massa corporal em relação aos animais do grupo controle, indicando que


o extrato não apresentou efeitos tóxicos gerais durante o período de

tratamento.

Estudos de fertilidade avaliam o resultado do acasalamento após o

período de pré-tratamento em pelo menos um dos sexos. A avaliação da

fertilidade e da conseqüente prenhez fornece importantes informações das

conseqüências funcionais do agente químico sobre o sistema reprodutor

(US EPA, 1996). Esses testes podem ser analisados a partir de parâmetros

como o período de acasalamento, proporção de fêmeas

prenhas/acasaladas, relação prole/mãe e duração da gestação. Esses

dados são importantes indicadores de alterações na fertilidade. Os

resultados demonstraram que o tratamento pré-acasalamento com EHA

não alterou a fertilidade dos ratos.

As massas relativas dos órgãos sexuais dos animais tratados com

EHA não foram diferentes das massas dos animais do grupo controle.

Alterações nas massas desses órgãos fornecem indícios de efeitos tóxicos

sobre o sistema reprodutor masculino. Em ratos adultos, as massas do

testículo e epidídimo são os mais importantes parâmetros (Jahn e Günzel,

1997). Juntos, esses órgãos são responsáveis pela formação e maturação

dos espermatozóides, além da produção de hormônios (Moundipa et al.,

1999). Normalmente, uma redução na massa do testículo ou epidídimo

pode ser provocada por agentes que reduzem a fertilidade (Quian, 1984;

Gupta et al., 2001; Mali et al., 2002). A ausência de alterações na massa

relativa da vesícula seminal nos leva a sugerir que o EHA não alterou a

atividade secretória da glândula, que se encontra sob o controle da

testosterona e prolactina (Dadoune, 1995).

Nossos resultados demonstraram que o EHA não interferiu nas linhagens

espermatogênicas nem alterou o processo de formação dos

espermatozóides. A análise histológica das gônadas é uma ferramenta

fundamental para a identificação de efeitos tóxicos sobre o sistema

reprodutor. O exame morfológico microscópico do testículo tem se

mostrado o mais importante método para a avaliação dos efeitos das

substâncias químicas sobre a espermatogênese (Jahn e Günzel, 1997).

Um composto pode afetar a espermatogênese de maneira direta, sobre as


células do túbulo seminífero, ou indireta, através da alteração das funções

hipotalâmicas, das gonadotrofinas ou das células de Leydig (Abdel-Magied

et al., 2001)

Em conclusão, as evidências apontam para uma ausência de efeitos

tóxicos do EHA por via oral sobre a performance reprodutiva em ratos.

Agradecimentos

A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões pelo

fornecimento do material e a Rejane Ferreira da Silva pelo valioso apoio

técnico.

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0 10 20 30 40 50 600

10

20

30

40

50

60

70ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5gkgEHA 1,0g/kg

Tempo (dias)

Gan

ho d

e m

assa

corp

oral

(g)

Figura 1: Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico

(EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre o ganho de

massa corporal em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Valores em

média ± epm (n=9/grupo).

Test

ícul

o

Ves

. Sem

inal

Duc

. Def

eren

te

Pró

stat

a

Epi

dídi

mo0.00

0.050.100.150.200.250.300.350.400.45

ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0g/kg

Mas

sa d

o ór

gão

(g/1

00g)

Figura 2: Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico

(EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e 1,0g/kg) sobre a massa dos

órgãos sexuais de em ratos tratados por 60 dias consecutivos. Os valores

representam as médias ± e.p.m. (n=9/grupo).


EG

I

EG

Figura 3: Fotomicrografia do testículo de rato tratado

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via

dias consecutivos. Epitélio germinativo (EG) e do tecido in

com aspecto normal (coloração HE, ampliação ± 107x).

CG CG

S

Figura 4: Fotomicrografia do testículo de rato tratado

hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (1,0g/kg) por via

dias consecutivos. Porções de 2 túbulos seminíferos

germinativas (CG) e espermatozóides na região central (S)

normal (coloração HE, ampliação ± 430x).

T

com extrato

oral por 60

tersticial (TI)

com extrato

oral por 60

com células

com aspecto


Tabela 1: Efeito do tratamento por via oral com extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25; 0,5 e

1,0g/kg) sobre os parâmetros reprodutivos de ratas não tratadas acasaladas com ratos tratados durante 60 dias

consecutivos.

VARIÁVEIS REPRODUTIVAS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg

Fêmeas acasaladas 18 18 18 18

Fêmeas prenhas 18 18 15 17

Duração da gestação (dias)# 21,6 ± 0,4 22,0 ± 0,8 21,4 ± 0,2 21,9 ± 0,4

Relação prole/mãe# 9,3 ± 0,2 8,3 ± 0,7 9,5 ± 0,7 9,6 ± 0,2

Índice de fertilidade (%) 100 100 83,3 94,4

Índice de gestação (%) 100 75 83,3 91,3

Índice de viabilidade (%) 99,1 100 100 99,5

Índice de lactação (%) 100 100 100 100

Massa corporal 1º dia (g)# 6,3 ± 0,4 6,2 ± 0,1 5,6 ± 0,2 5,8 ± 0,1




Massa corporal 21º dia (g)# 44, 7 ± 0,5 44,7 ± 0,9 39,3 ± 1,1 44,7 ± 0,4

# Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.


7.Artigo IV Artigo a ser submetido à Reproductive Toxicology


EFEITO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE CALENDULA OFFICINALIS L.

SOBRE A PRENHEZ DE RATAS Erick J.R. Silvaa, Eduardo S. Gonçalvesa, Gustavo S. Dimecha, Maria B. S.

Maiab, Maria Cristina O.C. Coelhoc, Maria C. C. A. Fragab, Parviz

Afiatpourb, Almir G. Wanderleya,b* a Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. b Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE.

Recife-PE, Brasil. c Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco –

UFRPE. Recife-PE, Brasil. Resumo

O extrato hidroalcoólico de (EHA) Calendula officinalis L. foi avaliado

quanto aos efeitos sobre a fertilidade de ratas e desenvolvimento

embrionário nas doses de 0,25; 0,5 e 1,0g/kg por dia por via oral. Na

fertilidade, as ratas foram tratadas durante 30 dias consecutivos antes e

durante a prenhez. Após o nascimento da prole, foram determinados os

parâmetros reprodutivos. Em outro procedimento, as ratas foram tratadas

durante cada uma das três fases da gestação: pré-implantação,

organogênese e fetal. No 20º dia de gestação, as ratas foram sacrificadas

para a avaliação dos parâmetros maternos e fetais. Os resultados

demonstram que o tratamento com EHA não provocou alterações nos

parâmetros reprodutivos da fertilidade e nos períodos de pré-implantação

e organogênese, entretanto, o tratamento no período fetal provocou

alterações na massa da placenta associada à toxicidade materna. Esses

resultados sugerem que o EHA de C. officinalis não interferiu na fertilidade

e desenvolvimento da prole, embora constatamos possível toxicidade

materna durante o período fetal que se refletiu de forma parcial sobre a

prole. Palavras-chave: Calendula officinalis L.; performance reprodutiva; embriotoxicidade;

teratogenicidade; fases da gestação.

* Contato com o autor: Av. Prof. Moraes Rego, s/n CEP: 50.670-901, Recife-PE, Brasil. Tel:(81)-21268530, Email: [email protected]


Abstract

The hydroalcoholic extract (HAE) of Calendula officinalis L. was evaluated

for effects on the fertility of female rats and embryogenic development in

the doses of 0,25; 0,5 and 1,0g/kg by oral route. In fertility trial, female

rats were treated for 30 consecutive days before and during pregnancy.

After the birth of the offspring, the reproductive parameters were

evaluated. In another protocol, females were treated during each one of

the three phases of the pregnancy: pre-implantation, organogenesis and

fetal periods. On 20th day of pregnancy, female rats were sacrificed for the

evaluation of the maternal and fetal parameters. The results demonstrated

that the treatment with HAE did not provoke alterations in the

reproductive parameters of fertility and in pre-implantation and

organogenic periods, however, the treatment during fetal period provoked

alterations in placental weight associated to the maternal toxicity. In

conclusion, HAE of C. Officinalis did not interfere with fertility and

offspring development, although we evidenced signs of toxic effects during

fetal period, partially reflected on offspring. Keywords: Calendula officinalis L. (Ham.) Urban; reproductive performance;

embryotoxicity; teratogenicity; pregnancy periods.

1. Introdução

Calendula officinalis L., Asteraceae, é uma herbácea anual originária

da região do Mediterrâneo. Sua denominação botânica é derivada do

latim, Kalendulae, que representa o primeiro dia do calendário romano [1].

Trata-se de um gênero economicamente importante devido ao seu

potencial farmacêutico e ornamental [2]. No Brasil, a espécie é

popularmente conhecida como Calêndula.

Estudos fitoquímicos realizados com as flores de Calêndula

confirmaram a presença de um amplo espectro de metabólitos

secundários, sobretudo das classes dos flavonóides, terpenos e

carotenóides [3-7].

A utilização de extratos das flores de Calendula officinalis está

aprovada pela Comissão E (Alemanha) como antiinflamatório para as


mucosas oral e faríngea (uso tópico e interno) e na cicatrização de

ferimentos e queimaduras (uso externo) em proporções de 1 a 2g de flores

secas por 150mL de água [8].

O laboratório Simões (Rio Janeiro - Brasil) cultiva a Calêndula pelo

método de micropropagação e a explora comercialmente como

antiinflamatório e cicatrizante tópico.

Dados da literatura reportam atividade antiblastocística e abortiva

para os constituintes triterpênicos da Calêndula [9]. Nesse sentido, o

presente trabalho procura avaliar o efeito do extrato hidroalcoólico (EHA)

de Calendula officinalis sobre os parâmetros reprodutivos e

desenvolvimento da prole, bem como sobre as diferentes fases da gestação

de ratas.

2. Metodologia

2.1. Animais

Foram utilizadas ratas Wistar, Rattus norvegicus, com 3 meses de

idade, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais

receberam água e dieta (Labina) ad libitum e foram mantidos em

condições controles de iluminação (ciclo 12h claro/escuro) e temperatura

de 23 ± 2°C. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética

em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE, processo n°

23076.0011236/2003-44.

2.3. Material Botânico










2.5. Fertilidade

Quatro grupos de ratas (n=12/grupo), tratadas diariamente por via

oral por 30 dias, foram acasaladas e tratadas durante toda a prenhez com

EHA 0,25; 0,5 e 1,0g/kg e água destilada (controle). Essas doses são

aproximadamente 10, 20 e 40 vezes superiores àquela utilizada como

antiinflamatória [8]. O sucesso da cópula foi indicado pela presença de

espermatozóides no esfregaço vaginal e foi admitido como 1º dia de

gestação (DDG). As ratas prenhas foram mantidas em gaiolas individuais.

O ganho de massa das ratas foi acompanhado semanalmente durante o

tratamento e gestação, bem como a atividade geral dos animais. Após o

nascimento da prole, foram determinados os índices reprodutivos:

duração da prenhez, relação prole/mãe, índice de fertilidade (n° de ratas

prenhas/n° de ratas acasaladas), índice de gestação (% de fêmeas prenhas

com todos os fetos vivos), índice de viabilidade (% de sobrevida até o 4° dia

de vida), índice de lactação (% de sobrevida do 4º ao 21° dia de vida),

massa corporal no 1°, 4°, 7°, 14° e 21° dias pós-natal (DPN) e observação

de aspectos macroscópicos externos e malformação [10].

2.6. Fases da gestação

Após a identificação da prenhez (presença de espermatozóides no

esfregaço vaginal) as ratas foram aleatoriamente divididas em grupo

controle (água destilada) e tratado por via oral com EHA (0,25; 0,5 e

1,0g/kg) de Calendula officinalis durante os períodos de pré-implantação

(1º ao 6º DDG), organogênese (7º ao 14º DDG) e fetal (14º ao 19º DDG).

Durante a prenhez, as ratas foram observadas quanto a sinais de

toxicidade. O ganho de massa materno foi determinado durante toda a

prenhez (ganho de massa total) e durante o período de tratamento. No 20o

dia de prenhez, as ratas foram submetidas a eutanásia por inalação

excessiva de éter e os cornos uterinos foram retirados para a avaliação

dos seguintes parâmetros: número de sítios de implantação, reabsorção,


corpos lúteos, fetos vivos e mortos e massa das placentas. As massas dos

fetos foram determinadas e examinadas quanto à presença de

malformações macroscópicas externas.

A taxa de perda de pré-implantação foi calculada como: número de

corpos lúteos – número de implantações viáveis/número de corpos lúteos

x 100, e a taxa de perda de pós-implantação foi calculada como: número

de implantações – número de fetos vivos/número de implantações x 100

[11].


A significância estatística entre os grupos tratado e controle foi

determinada através do teste de Análise de Variância (ANOVA) seguido por

Newman-Keuls. Os parâmetros taxa de perda de pré e pós–implantação

foram analisados através do Teste de Kruskal-Wallis. Para os índices de

fertilidade, gestação, viabilidade e lactação, utilizou-se o teste de qui-

quadradro (γ2). O nível de significância para rejeição da hipótese de

nulidade foi sempre ≥ a 5%.

3.0. Resultados

3.1. Fertilidade

O EHA não produziu sinais de toxicidade ou alteração

comportamental durante o período de tratamento. Não observamos

diferenças no ganho de massa corporal antes (Figura 1) e durante a

prenhez (Figura 2) entre os grupos tratado e controle.

O tratamento com EHA não alterou os parâmetros reprodutivos e o

crescimento ponderal da prole (Tabela 1). Não registramos a presença de

malformações externas ou sinais de toxicidade no período pós-natal

avaliado.


3.2. Período de pré-implantação

As ratas tratadas do 1° ao 6° DDG não apresentaram nenhum sinal

de toxicidade. O ganho de massa materno durante o período de pré-

implantação e da gestação não sofreu alteração (Tabela 2).

Nos parâmetros reprodutivos (Tabela 2), observamos que a massa

corporal fetal aumentou significativamente nos grupos tratados com 0,25

e 0,5g/kg por dia e a relação prole/mãe diminuiu no grupo que recebeu

0,25g/kg por dia em relação ao grupo controle.

O tratamento não provocou o desenvolvimento de malformações

macroscópicas externas nos fetos, nem alteração no número de

implantações e reabsorções.

3.3. Período de organogênese

No período de organogênese, as ratas tratadas não apresentaram

nenhum sinal de toxicidade. O ganho de massa materno durante o

período de organogênese e da gestação não sofreu alterações (Tabela 3).

O tratamento provocou redução na massa fetal no grupo que

recebeu 0,5g/kg por dia em relação ao grupo controle. Porém, não alterou

o número de reabsorções, fetos vivos ou a perda de pós-implantação. A

massa das placentas também não foi alterada (Tabela 3).

O tratamento durante o período de organogênese com EHA não

provocou o aparecimento de malformações externas.

3.3. Período fetal

As ratas tratadas com EHA 1,0g/kg apresentaram redução no ganho

de massa corporal no período fetal e durante o período de gestação (Tabela

4). Cabe salientar que não houve diferença estatística entre o ganho de

massa do grupo EHA-1,0g/kg (52,5 ± 5,0g) em relação ao grupo controle

(59,0 ± 2,3g) do 1º ao 14º DDG.

O tratamento produziu uma redução na massa fetal e um aumento

no número de corpos lúteos no grupo que recebeu 0,5g/kg em relação ao

grupo controle. A massa das placentas foi reduzida em todos os grupos

tratados em relação ao grupo controle (Tabela 4).


O tratamento durante o período fetal não provocou aumento no

número de natimortos, nem alterações no número de reabsorções e taxa

de perda de pós-implantação.

4.0. Discussão

Nossos resultados demonstram que o tratamento com EHA não

alterou o índice de fertilidade do grupo tratado em relação ao grupo

controle. Esse índice reflete a capacidade das fêmeas serem fecundadas, o

que nos leva a sugerir que o EHA não interferiu significativamente nos

processos hormonais que levam à ovulação, como também indica não ter

induzido alterações na função ovariana.

Constatamos que o EHA também não provocou alterações na

relação prole/mãe, na duração da gestação e no índice de gestação. Esses

parâmetros também são importantes para indicar a capacidade das

fêmeas serem fecundadas, bem como de manterem a gestação normal.

O índice de gestação indica o percentual de fêmeas com todos os

fetos vivos [12], refletindo a capacidade das fêmeas fecundadas levarem a

prenhez a termo sem que haja alterações fetais que causem a interrupção

da gestação. Esse índice investiga o surgimento de alterações

morfofuncionais durante a gestação tanto na mãe quanto no feto, as quais

podem provocar a inviabilidade do processo de procriação ou a ocorrência

de partos prematuros [13]. Nossos resultados dão um indicativo de que o

EHA não interfere nos processos de fertilização.

O índice de viabilidade indica a presença de alterações estruturais e

funcionais que não provocaram morte in útero, mas que são incompatíveis

com a vida e provocam morte pré-matura. O EHA não provocou reduções

significativas nesse índice em relação ao grupo controle.

O índice de lactação avalia o aparecimento de alterações

morfofuncionais que são incompatíveis com a vida, mas que só promovem

óbito em longo prazo. Nenhuma morte foi registrada nos grupos tratado e

controle durante o período avaliado.


A avaliação do EHA sobre o desenvolvimento embrionário em ratas

foi realizada a partir da administração oral durante as 3 fases distintas da

gestação. Em nossos resultados, não encontramos evidências claras de

que o EHA possa interferir nos processos de pré-implantação e

organogênese. Muitas espécies vegetais são capazes de interferir nos

processos supracitados dos roedores, promovendo aumento da perda de

pré e pós-implantação, retardo no desenvolvimento e morte fetal, além de

malformações [11,14-19].

No período de pré-implantação, o embrião se encontra com células

indiferenciadas em divisão mitótica. Sabe-se que a redução do número de

células no embrião durante essa fase pode provocar retardo na formação

do blastocisto [20], aumento nas perdas de pré e pós-implantação [21]. A

taxa de perda de pré-implantação é o principal parâmetro avaliado nesse

período. Ela estabelece a correlação entre o número de óvulos liberados e

aqueles que, após fecundados, conseguiram sofrer implantação no útero

[11]. Exceto por uma redução pontual na relação feto/mãe na dose de

0,25g/kg, o EHA parece não interferir com o processo normal de

implantação do embrião durante a gestação.

O período de organogênese é o mais susceptível aos agentes

teratogênicos, no qual o maior número de malformações podem ser

induzidas. Esse período caracteriza-se uma intensa proliferação e

migração celular, remodelamento tissular e formação rudimentar das

estruturas do corpo [22]. O tratamento nesse período tem por objetivo

avaliar os possíveis efeitos teratogênicos e embriotóxicos de uma planta. A

redução encontrada na massa dos fetos para a dose intermediária pode

ser considerada uma flutuação estatística, visto que não esteve associada

a outras alterações, como presença de malformações, alterações na massa

da placenta e aumento da taxa de perda de pós-implantação.

O período fetal é caracterizado por diferenciação histológica e

funcional dos diferentes órgãos e sistemas. Os agentes nessa fase podem

provocar alterações funcionais que são capazes de gerar a morte do feto

[23]. A redução da massa corporal materna para o grupo que recebeu a

maior dose pode ser apontada como um sinal de toxicidade decorrente do


tratamento com EHA durante esse período. Este parâmetro é importante

para a avaliação da integridade materna [11].

Esse efeito parece ter refletido sobre a placenta que também

apresentou redução de massa em relação ao grupo controle. Os efeitos

tóxicos das drogas podem ser promovidos pela ação direta sobre o feto ou

indiretamente, através da ação tóxica sobre o organismo materno [24].

Entretanto, foi observada redução significativa na massa dos fetos no

grupo tratado com a dose intermediária.

Dessa forma, podemos concluir que o tratamento com EHA durante

os períodos de pré-acasalamento/prenhez, pré-implantação e

organogênese não interferiu com os processos analisados de performance

reprodutiva, fertilidade e desenvolvimento embrionário em ratos. Para o

período fetal, verificamos uma toxicidade materna que parece ter refletido

sobre a massa da placenta de maneira parcial sobre a prole, entretanto

estudos adicionais são necessários para esclarecer esse aspecto.

Agradecimentos

A CAPES e CNPq pelo apoio financeiro, ao Laboratório Simões pelo

fornecimento do material e a Rejane Ferreira da Silva pelo valioso apoio

técnico.


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0 10 20 300

10

20

30

40ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0g/kg

Tempo (dias)

Gan

ho d

e m

assa

corp

oral

(g)


(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal em

ratas tratadas durante 30 dias consecutivos (n=12/grupo).

0 7 14 210

20

40

60

80ControleEHA 0,25g/kgEHA 0,5g/kgEHA 1,0 g/kg

Tempo (dias)

Gan

ho d

e m

assa

mat

eno

(g)


(0,25; 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho de massa corporal materno

durante o período da gestação em ratas tratadas durante 30 dias

consecutivos e toda a gestação (n=12/grupo).


Tabela 1: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre os

parâmetros reprodutivos em ratas tratadas por 30 dias consecutivos antes do acasalamento e durante toda a gestação.

VARIÁVEIS REPRODUTIVAS CONTROLE EHA 0,25g/kg EHA 0,5g/kg EHA 1,0g/kg

Ratas acasaladas 12 12 12 12

Duração da gestação (dias)# 22,4 ± 0,2 21,8 ± 0,4 22,1 ± 0,3 22,7 ± 0,5

Prole/Mãe# 8,6 ± 0,6 8,8 ± 0,9 9,9 ± 0,3 8,3 ± 0,7

% de natimortos 4,5 4,4 2,5 5,0

Índice de fertilidade (%) 100 83,3 91,6 100

Índice de gestação (%) 91,6 90,0 90,1 83,3

Índice de viabilidade (%) 93,5 100 100 100

Índice de lactação (%) 100 100 100 100






# Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.


Tabela 2: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho

de massa materno em ratas tratadas durante o período de pré-implantação (1º ao 6º DDG) e da gestação (1º ao 20º

DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos.



Período de pré-implantação (g)# 18,9 ± 2,4 20,1 ± 1,3 15,1 ± 3,5 15,00 ± 4,3

Período da gestação (g)# 84,9 ± 6,8 94,3 ± 5,9 82,7 ± 4,9 90,1 ± 5,6

Número de fetos vivos 89 75 103 112

Número de fetos mortos 1 0 1 0

Relação feto/mãe# 9,9 ± 0,5 8,3 ± 0,4* 10,3 ± 0,3 10,2 ± 0,4

Massa dos fetos (g)# 3,79 ± 0,07 4,01 ± 0,09* 4,08 ± 0,05* 3,78 ± 0,06

Massa das placentas (g)# 0,438 ± 0,012 0,470 ± 0,010 0,461 ± 0,006 0,454 ± 0,008

Número de implantações 90 75 104 112

Número de reabsorções 8 10 3 7

Corpos lúteos# 12,7 ± 0,2 12,1 ± 0,2 12,1 ± 0,1 12,1 ± 0,2

Perda de pós-implantação (%)+ 1,1 0 0,9 0

Perda de pré-implantação (%)+ 9,1 16,7 8,3 8,3

*Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p < 0,05). + Os valores representam as medianas. # Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.


Tabela 3: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o

ganho de massa materno em ratas tratadas durante o período de organogênese (7º ao 14º DDG) e da gestação (1º ao

20º DDG) e sobre os parâmetros reprodutivos.



Período de organogênese (g)# 32,2 ± 7,3 31,6 ± 2,6 33,3 ± 2,2 31,8 ± 2,4

Período da gestação (g)# 100,2 ± 4,8 104,0 ± 7,1 99,8 ± 3,7 105,8 ± 3,2



Relação feto/mãe# 11,6 ± 0,6 9,8 ± 0,6 10,5 ± 0,4 10,3 ± 0,7

Massa dos fetos (g)# 3,93 ± 0,06 4,08 ± 0,06 3,68 ± 0,03* 3,94 ± 0,08

Massa das placentas (g)# 0,520 ± 0,008 0,489 ± 0,007 0,512 ± 0,006 0,499 ± 0,009



Corpos lúteos# 12,2 ± 0,2 10,9 ± 0,3 11,3 ± 0,1 11,7 ± 0,1

Perda de pós-implantação (%)+ 0 0 1,2 2,3


*Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p < 0,05). + Os valores representam as medianas. # Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.


Tabela 4: Efeito do extrato hidroalcoólico (EHA) de Calendula officinalis (0,25, 0,5 e 1,0g/kg) por via oral sobre o ganho

de massa materno em ratas tratadas durante o período fetal (14º ao 19º DDG) e da gestação (1º ao 20º DDG) e sobre

os parâmetros reprodutivos.



Período fetal (g)# 48,3 ± 5,4 45,0 ± 5,5 37,3 ± 3,1 31,3 ± 1,7*

Período da gestação (g)# 107,8 ± 4,3 97,7 ± 4,3 90,3 ± 5,8 83,8 ± 5,7*



Relação feto/mãe# 9,8 ± 0,3 10,7 ± 0,2 9,3 ± 0,7 9,8 ± 0,4

Massa dos fetos (g)# 3,96 ± 0,04 4,10 ± 0,09 3,73 ± 0,03* 3,93 ± 0,04

Massa das placentas (g)# 0,484 ± 0,008 0,428 ± 0,007* 0,450 ± 0,007* 0,450 ± 0,008*



Corpos lúteos# 11,2 ± 0,3 11,5 ± 0,2 12,3 ± 0,3* 11,7 ± 0,3

Perda de pós-implantação (%)+ 0 0 2,6 1,7


*Indica estatisticamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido de Newman-Keuls, p < 0,05). +Os valores representam as medianas. # Os valores representam as médias ± erro padrão das médias.


8.Conclusão


8. CONCLUSÃO

Baseados em nossos resultados podemos concluir que o EHA de

Calendula officinalis L. apresenta baixa toxicidade por via oral. De

maneira geral, a sua administração subcrônica por via oral não produziu

efeitos tóxicos sobre os parâmetros bioquímicos, hematológicos e

morfológicos em ratos de ambos os sexos. Entretanto o aumento dos

níveis de uréia e ALT verificado nos ratos de ambos os sexos, associado à

alteração histológica no fígado dos machos, aponta para uma possível

sobrecarga renal e hepática, respectivamente.

Em relação ao estudo de toxicidade reprodutiva, os resultados

obtidos sugerem uma ausência de toxicidade por via oral sobre a

performance reprodutiva em ratos. O tratamento com EHA durante os

períodos de pré-acasalamento/prenhez, pré-implantação e organogênese

em ratas também não demonstrou sinais tóxicos sobre a fertilidade das

ratas ou de embriofetotoxicidade. Porém, para o período fetal, verificamos

indícios de toxicidade materna que parecem ter refletido sobre a massa da

placenta de maneira parcial sobre a prole.


9.Referências Bibliográficas


9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

9.Referências Bibliográficas


9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO ... · Silva, E.J.R.; Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato hidroalcoólico de Calendula officinalis L. Figura 5 Fotomicrografia