avaliação da produção de etanol em temperaturas elevadas por

AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL EM TEMPERATURAS

ELEVADAS POR UMA LINHAGEM DE S. CEREVISIAE

CRISLA SERRA SOUZA

São Paulo

2009

Tese (Doutorado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutora em Biotecnologia.

Avaliação da produção de etanol... Crisla S. Souza

AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL EM TEMPERATURAS ELEVADAS POR

UMA LINHAGEM DE S. CEREVISIAE

CRISLA SERRA SOUZA

Tese (Doutorado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, para obtenção do Título de Doutor em Biotecnologia.

Área de concentração: Biotecnologia

Orientadora: Profª. Drª. Cecília Laluce

São Paulo

2009


Resumo

RESUMO

SOUZA, C. S. Avaliação da produção de etanol em temperaturas elevadas por uma linhagem de S. cerevisiae. 2009. 155 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) – Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, São Paulo, 2009.

A metodologia de superfície de resposta foi utilizada como uma ferramenta para

otimizar as condições de produção máxima de etanol com maior retenção de

viabilidade da linhagem de S. cerevisiae 63M em processo descontínuo. As

condições de concentração de sacarose, inóculo e temperatura foram avaliadas em

Erlenmeyers utilizando um planejamento fatorial completo 23 seguido de um

planejamento de superfície de resposta 23 e as melhores condições obtidas foram:

200 g.L-1 de sacarose, 40 g.L-1 de inóculo a 30 °C resultando em uma produção de

etanol de 82,7 g.L-1 com viabilidade de 90% após 4 horas de fermentação.

Processos descontínuo, descontínuo alimentado com vazão constante e

alimentado por pulsos foram avaliados para a linhagem 63M em mini-reatores

contendo meio sintético e o processo que apresentou maior viabilidade (99%), alta

produtividade (18,6 g.L-1.h-1) e alto rendimento (99,2%) foi o descontínuo

alimentado por cinco pulsos de volumes decrescentes de sacarose a 30 °C. A

redução da concentração de sacarose na alimentação foi uma estratégia que

permitiu aumentar a temperatura da fermentação até 37 °C sem perdas em

viabilidades. Uma linhagem utilizada nas destilarias brasileiras foi comparada com

a linhagem 63M em temperaturas elevadas e observou-se que a 63M produziu uma

maior concentração final de etanol em menor tempo e conseqüentemente maior

produtividade e rendimento. A redução do inóculo para 20 g.L-1 permitiu alongar o

tempo de fermentação a 37 °C, de 3 horas para 6 horas, mas sem ganhos em

viabilidade. Oito ciclos sucessivos de fermentação com reutilização de células da

linhagem 63M foram realizados em meio sintético em processo descontínuo

alimentado por pulsos de sacarose (150 g.L-1) e inóculo de 20 g.L-1 a 37 °C e uma

perda gradual de viabilidade foi observada (até 30% no 8° ciclo), mas o etanol final

permaneceu constante (ao redor de 70 g.L-1) em todos os ciclos.

Palavras-chave: S. cerevisiae. Produção de etanol. Metodologia de superfície de

resposta. Temperaturas elevadas. Ciclos sucessivos de fermentação.

Avaliação da produção de etano... Crisla S. Souza

Abstract

ABSTRACT

SOUZA, C. S. Evaluation of ethanol production at high temperatures by a strain of S. cerevisiae. 2009. 155 f. Doctor thesis (Biotechnology) - Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, São Paulo, 2009.

Surface response methodology was used as a tool to optimize the conditions of

maximum ethanol production with high viability retention of strain 63M of S.

cerevisiae in batch culture. Sucrose concentration, inoculum and temperature

conditions were evaluated in Erlenmeyers flasks using a 23 complete factorial

planning followed by a 23 response surface planning and the best obtained

conditions were: 200 g.L-1 sucrose, 40 g.L-1 inoculum at 30 °C, resulting in 82.7 g.L-1

ethanol production with 90% viability after 4 hours of fermentation. Simple batch,

fed-batch of constant flow and pulse fed-batch cultures were compared using strain

63M in mini-reactors containing synthetic medium and the process showed the

highest viability (99%), productivity (18,6 g.L-1.h-1) and high yield (99.2%) was pulse

fed-batch using five decreasing pulses of sucrose at 30 °C. The reduction of the

sucrose concentration in the feeding was a strategy that allowed increasing the

temperature of the fermentation up to 37 °C without losses in viabilities. An

industrial strain BG1 used in Brazilian distilleries was compared with strain 63M in

fermentations at high temperatures and it was observed that strain 63M produced a

higher final ethanol concentration in shorter time with higher productivity and yield.

Decreasing the inoculum to 20 g.L-1 (dry mass) allowed increasing the fermentation

time at 37 °C, from 3 hours to 6 hours, but without increase in viability. Eight

successive cycles of fermentation with reuse of cells of strain 63M were carried out

in synthetic medium in fed-batch process using sucrose pulses (150 g.L-1) and an

inoculum of 20 g.L-1 at 37 °C. A gradual and decreasing viability was observed (up

to 30% in the 8° cycle), but the final ethanol was kept constant (70 g.L-1) though the

eight fermentation cycles.

Key words: S. cerevisiae. Ethanol production. High temperatures. Response

surface methodology. Successive cycles of fermentation.

17

Introdução e Revisão de Literatura



18

1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

1.1 ASPECTOS GERAIS

A produção de etanol é muito importante para a economia nacional. Assim,

faz-se necessário conhecer as leveduras, as diversas formas de estresse (alcoólico,

térmico, osmótico) que as células são submetidas, as formas de respostas das

leveduras aos estresses (proteínas de choques térmicos), os tipos de processos de

fermentação que podem ser utilizados, incluindo vantagens e desvantagens, e por

fim a importância do uso do planejamento estatístico na otimização do processo

escolhido.

1.1.1 Etanol: Importância e papel na economia brasileira

O etanol é utilizado como combustível nos motores de ciclo Otto,

especificamente no setor de transporte rodoviário. Conhecido desde a antigüidade,

tanto como parte da cerveja dos egípcios como no vinho dos povos da Mesopotânia

e da Grécia, o álcool ocupou lugar de destaque nas mais variadas culturas. Tanto

como produto resultante da fermentação do arroz, na China, quanto do milho, no

Império Inca no Peru, o conhecimento envolvido na fabricação do etanol era

guardado a sete chaves, dada a importância das bebidas, e seu uso no preparo de

remédios, especialmente na conservação de plantas medicinais. O etanol é

produzido a partir de cana-de-açúcar, cereais, tubérculos como beterraba e

mandioca, entre outros derivados agrícolas (UNICA, 2007).

O Brasil foi o primeiro país a produzir a bioenergia em larga escala, com a

implementação do Programa Nacional do Álcool (PROÁLCOOL) pelo decreto nº

76.596/73 do Governo Federal datado de 1973. Este programa trouxe diversos

benefícios, como o desenvolvimento rural e a criação de um combustível que

colabora com a redução da poluição ambiental (PARRO, 1996). O Brasil lançou em

2003, o automóvel flex-fuel que é movido tanto pelo etanol quanto pela gasolina. Em

2004, esse tipo de automóvel representou 21,6% do total de carros vendidos,

enquanto que em 2005 a cifra de 61,7% de carros vendidos e atingiu em 2007 o

correspondente a 90% das vendas de automóveis (JORNAL DA CANA, 2007)



19

A produção de álcool etílico no Brasil chegou a 17,5 bilhões de litros na safra

2006/2007, das quais três bilhões de litros foram exportados, sendo o restante

consumido pelo mercado interno (JORNAL DA CANA, 2007). Devido ao alto custo

da gasolina, o etanol está ganhando abertura para tornar-se uma importante matriz

energética mundial e renovável.

1.1.2 Leveduras utilizadas nas destilarias brasileiras

A maioria das unidades produtoras de etanol, tradicionalmente iniciava a safra

usando toneladas de levedura oriunda da indústria de panificação até meados dos

anos 90. Essa estratégia permite uma partida rápida e mais segura minimizando

possíveis problemas relativos a acidentes fermentativos. A partir dos anos 90,

constatou-se que as leveduras utilizadas como inóculo são completamente

substituídas por leveduras nativas ainda no início da safra (ANDRIETTA et al.,

2006). Constatou-se ainda que a única levedura que tem a capacidade de

permanecer no processo é aquela isolada da mesma unidade em safras anteriores

(BASSO et al., 1993).

A partir dessa constatação, as usinas começaram a propagar a sua própria

levedura para o início da safra. As unidades se equiparam de modo a serem aptas a

realizarem a propagação de sua própria levedura nativa para o início da

fermentação. Parte dessas unidades realiza uma análise de cariotipagem para

constatar a permanência dessa linhagem nas dornas de fermentação durante a

safra. Os resultados confirmam o esperado, isto é, quando as leveduras utilizadas

como inóculo são as isoladas da própria unidade, essas dominam o processo até o

final do período da safra (ANDRIETTA et al., 2006). Nos meados dos anos 50, o

professor Jayme Rocha de Almeida (1905-1964), do Instituto Zimotécnico da

Universidade de São Paulo (ESALQ) isolou uma levedura eficiente IZ-1940

(AMORIM, 2005), que foi distribuída para as usinas no início das safras. A

dificuldade na obtenção de grandes volumes desse fermento desestimulou as usinas

fazerem uso desse fermento, passando a utilizar fermento de panificação para a

partida da planta.

Atualmente existe o fornecimento por unidades produtoras de biomassa, de

grandes volumes de leveduras previamente isoladas de unidades brasileiras durante

o período da safra. Essas leveduras foram isoladas do próprio processo, sendo



20

assim consideradas nativas. Essas são utilizadas como inóculo tanto para as

unidades das quais foram isoladas como para outras unidades. Algumas linhagens

de S. cerevisiae isoladas de processos de fermentação alcoólica são largamente

utilizadas como inóculo para início das safras brasileiras. Essas foram nomeadas

com as iniciais das unidades de origem, dessa forma têm-se disponíveis as

seguintes linhagens: BG-1 (Usina Barra Grande), CR-1 (Usina Cresciumal), AS-1

(Usina Santa Adélia), CAT-1 (Usina Catanduva), PE-2 (Usina da Pedra), CL (Usina

Clealco), entre outras. Embora a utilização de uma levedura qualquer selecionada

seja uma alternativa viável para o início da safra, o uso de leveduras provenientes

do próprio processo é a expectativa para o futuro das usinas brasileiras. A

estabilidade microbiológica em relação às leveduras do processo de produção de

álcool está relacionada à utilização de inóculo de uma levedura isolada do próprio

processo (STROPPA, 2002).

1.1.3 Leveduras termotolerantes

S. cerevisiae é uma levedura mesofílica (20-40 °C) utilizada em muitos

processos industriais, tais como produção de bebidas alcoólicas, biomassa

(panificação, alimento) e vários produtos do metabolismo (DEMAIN et al., 1998). A

produção de etanol combustível a partir do melaço de cana-de-açúcar por linhagens

termotolerantes (de ambientes terrestres) de leveduras, merece atenção especial

por estas cepas de leveduras serem capazes de crescerem e fermentarem durante

os meses de verão em países não-tropicais, bem como em países tropicais,

reduzindo, assim, os custos com a refrigeração dos fermentadores. Por outro lado,

uma concentração mais alta de etanol produzido a temperaturas elevadas poderia

minimizar os gastos com a destilação (UENO et al., 2003). O número de tentativas

para obter leveduras capazes de crescerem e fermentarem a 40 °C ou acima desta

temperatura é pequeno (UENO et al., 2001). Um programa de “screening” e

isolamento de leveduras foi financiado pela Fundação do Banco do Brasil no período

de 1985 a 1993. Leveduras amilolíticas e termotolerantes foram isoladas e

transferidas para Fleishman & Royal para a produção de leveduras de panificação

em 1985. Dentro deste mesmo programa foram realizados estudos de estabilidade

genética e obtenção de híbridos melhorados de leveduras (PERES et al., 2001).



21

Alguns pesquisadores descreveram a obtenção de leveduras termotolerantes por

fusão de protoplastos (SEKI et al., 1983; KIDA et al.,1992) e cruzamentos entre

leveduras haplóides (KAWAMURA, 1999). Com relação à origem das amostras para

seleção de leveduras termotolerantes, duas situações parecem ser comuns.

Primeiro, a seleção tem sido realizada dos tanques de fermentação de cervejarias

ou leveduras de destilarias (HACKING et al., 1984; D’AMORE et al., 1989). Em

segundo lugar, os isolados têm sido obtidos de ambientes naturais, especialmente

das regiões quentes. Linhagens termotolerantes de Kluyveromyces marxianus

capazes de crescerem a 52 °C e de fermentarem a 50 °C foram isoladas de

amostras de solo ao redor de destilarias da Índia (BANAT et al., 1992) e suas

características foram estudadas (FLEMING et al., 1993; BARRON et al., 1994;

BRADY et al., 1994; HACK e MARCHANT 1998). Uma destas leveduras foi também

testada em fermentadores para produção de etanol usando melaço de cana-de-

açúcar (SINGH et al., 1998) com bons resultados.

1.2 PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE ETANOL

O etanol pode ser produzido por quatro principais tipos de operações

industriais: processo descontínuo, descontínuo alimentado, semicontínuo e contínuo

(KEIM, 1983).

1.2.1 Processo descontínuo

Na fermentação em processo descontínuo (ou batelada), o substrato e as

células da levedura são adicionados juntos ao bioreator (KEIM, 1983), sendo

efetuado um inóculo por tanque (SCHMIDELL e FACCIOTTI, 2001). O único material

adicionado e removido durante a fermentação em batelada é a troca de gases e as

soluções para controle de pH e anti-espumantes. Terminada a fermentação,

descarrega-se a dorna e o meio fermentado segue para os tratamentos finais. Então,

deve-se lavar a dorna, esterilizá-la e recarregá-la com mosto e inóculo. Uma das

vantagens da operação em batelada (processo descontínuo) é a maior flexibilidade

que pode ser alcançada usando um bioreator para várias especificações de produtos

(ÇAYLAK e SUKAN, 1996). Este processo é mais utilizado na indústria de alimentos.



22

Alguns dos alimentos e bebidas produzidos por esse processo fermentativo são:

iogurte, chucrute, picles, cerveja, vinho, entre outros. Por outro lado, a principal

desvantagem da fermentação descontínua é o tempo gasto entre as bateladas,

compreendendo a carga e descarga do fermentador, a limpeza, esterilização e a

reinício do processo (REVIEW, 2007). Outra desvantagem é que a fermentação em

processo descontínuo pode levar a baixos rendimentos e/ou produtividades, quando

o substrato adicionado de uma vez só no início da fermentação exerce efeitos de

inibição, repressão ou desvia o metabolismo celular para formação de produtos que

não interessam (CARVALHO e SATO, 2001b). Segundo uma referência que trata de

um cultivo descontínuo (GRUBB e MAWSON, 1993), os cultivos em bateladas

apresentaram algumas limitações mesmo para diversas leveduras termotolerantes.

Um rendimento de etanol alto requer alta concentração inicial de açúcar e isto gera

uma alta pressão osmótica do meio sobre as células. A adição gradual de açúcar no

meio conforme sugerido por Melle-Boinot (SCHIMIDELL e FACCIOTTI, 2001),

minimiza os efeitos da pressão osmótica e dos níveis altos de etanol produzido. Por

outro lado, a combinação da alta concentração de açúcar com a elevação da

temperatura pode inibir o crescimento (GRUBB e MAWSON, 1993). O efeito da

pressão osmótica alta pode ser observado em destilarias brasileiras quando a

concentração de açúcar do mosto é maior ou igual a 250 g.L-1. Dependendo do nível

de etanol nas dornas de fermentação, pode ocorrer diminuição da tolerância à

temperatura (D’AMORE et al., 1990; LYND et al., 1991). Por outro lado, leveduras

termotolerantes pertencendo principalmente aos gêneros de Saccharomyces e

Kluyveromyces têm sido crescidas em condições de bateladas simples produzindo

concentrações de etanol variando entre 4-8% (m/v) (HUGHES et al., 1984;

HACKING et al., 1984; ANDERSON et al.; 1986; SZCZODRAK e TARGONSKI,

1988; D’AMORE et al., 1989; BALLESTEROS et al., 1991; BANAT et al., 1992;

FLEMING et al., 1993; BARRON et al., 1994; BRADY et al., 1994; BANAT e

MARCHANT, 1995; BANAT et al., 1996).

Em escala industrial, o processo descontínuo foi adaptado tendo em vista

otimizar a produção, de modo a atender o objetivo de diferentes indústrias

(BORZANI, 1975). No caso das destilarias de álcool, o processo com recirculação de

microrganismo foi utilizado e como o próprio nome indica, usa como inóculo o

microrganismo da batelada anterior. Para isto, o meio fermentado é centrifugado,

separando assim as células e reutilizando-as. No entanto, como há a tendência de



23

aumentar o número de contaminantes a cada nova batelada, as usinas normalmente

empregam uma metodologia para eliminá-los. Consiste num tratamento do leite de

levedura (suspensão de leveduras altamente concentrada, obtida a partir da

centrifugação do meio fermentado) com água e ácido sulfúrico. Deixado nessas

condições, sob agitação por 2 a 3 horas, proporciona a eliminação de

contaminantes, bem como de células que já se apresentam em fase de degeneração

(CARVALHO e SATO, 2001b).

1.2.2 Processo semicontínuo

Em processos semicontínuos, uma porção da cultura é coletada em intervalos

de tempos e o meio fresco é adicionado ao sistema. Nos processos semicontínuos

há variação no volume da cultura. Este método tem algumas vantagens sobre as

operações contínuas e de bateladas. Não há necessidade de ter um frasco separado

para o inóculo, exceto no início. O tempo também não é desperdiçado para limpeza

e re-esterilização. Outra vantagem desta operação é que não é requerido muito

controle. No entanto, há um alto risco de contaminação e mutação devido aos

longos períodos de cultivos e as operações manuais. Além disso, são necessários

reatores de volumes maiores e os custos de investimento são levemente mais

elevados (ÇAYLAK e SUKAN, 1996).

1.2.3 Processo descontínuo alimentado

O processo descontínuo alimentado (ou batelada alimentada) é definido como

uma técnica onde um ou mais nutrientes são adicionados ao fermentador durante o

cultivo e os produtos permanecem no fermentador até o final da fermentação. Em

alguns casos, todos os nutrientes são gradualmente adicionados à dorna

(CARVALHO e SATO, 2001a). Outros autores (BROWN, 1990; WHITAKER, 1980)

estendem esse conceito para o acréscimo de aditivos. A vazão de alimentação pode

ser constante ou variar com o tempo (KELLER e DUNN, 1978) e a adição de mosto

pode ser de forma contínua ou intermitente. Mudança de volume pode ou não

ocorrer, dependendo da concentração de substrato e da taxa de evaporação do

sistema (CARVALHO e SATO, 2001a). Devido à flexibilidade de utilização de

diferentes vazões de enchimento de dornas com o meio nutriente, é possível



24

controlar a concentração de substrato no fermentador, de modo que, por exemplo, o

metabolismo seja deslocado para uma determinada via metabólica, levando ao

acúmulo de um produto específico (CARVALHO e SATO, 2001a).

A principal vantagem do sistema descontínuo alimentado é que a inibição e

repressão de catabólitos são impedidas por alimentação intermitente do substrato.

Se o substrato tem um efeito inibitório, a adição intermitente melhora a produtividade

da fermentação pela manutenção de uma concentração baixa de substrato. É

essencial manter o volume da cultura constante na operação contínua, enquanto

que no processo descontínuo alimentado há variação no volume do meio. Para

solucionar estes problemas surgidos com o uso de leveduras termotolerantes em

processo descontínuo, a técnica de cultura em processo descontínuo alimentado

geralmente tem sido utilizada. Neste sistema, parte do problema de alta

concentração inicial de açúcar pode ser solucionada através da adição gradual do

substrato por certo período a partir do início da cultura. Esta forma de alimentação,

entretanto, não parece reduzir os efeitos inibitórios do acúmulo de etanol na cultura

(BANAT et al., 1998).

Com outra visão, pode-se definir o processo descontínuo alimentado como

um processo no qual as células separadas por centrifugação são retornadas ao

volume de reação, a fim de se iniciar um novo período de alimentação, o que evita o

preparo de um novo inóculo. No processo descontínuo alimentado repetido, certa

fração do líquido fermentado é retirada, iniciando-se então um novo período de

alimentação.

Em grande escala, há a possibilidade de combinações de processos, a fim de

se conseguir o máximo de desempenho de um dado sistema, como por exemplo, o

caso da fermentação alcoólica executada segundo o processo de Melle-Boinot.

Neste processo, ao término de uma fermentação, o vinho é separado por

centrifugação, retornando-se as células ao reator após tratamento adequado para

diminuir os contaminantes das leveduras. A seguir, inicia-se a alimentação com o

mosto a ser fermentado (na verdade, a introdução do inóculo e a alimentação de

mosto ocorrem simultaneamente desde o início do processo), e assim, o processo é

operado na forma de um reator descontínuo alimentado na maior parte do tempo.

Quando as dornas encontram-se preenchidas, aguarda-se tempo suficiente para o

consumo total dos açúcares fermentescíveis (SCHMIDELL e FACCIOTTI, 2001).



25

1.2.4 Processo contínuo

No processo contínuo, o material nutriente (o qual contém a fonte de carbono

e outros nutrientes) é bombeado continuamente dentro de um frasco agitado, onde

os microrganismos estão ativos e ao mesmo tempo, o produto é retirado do sistema.

Neste tipo de processo, é essencial manter um volume de cultura constante. O

produto, o qual é retirado do topo de um bioreator, contém etanol, células e açúcar

residual (ÇAYLAK e SUKAN, 1996). A manutenção de volume constante de líquido

no reator é de primordial importância, a fim de que o sistema atinja a condição de

estado estacionário, condição na qual as variáveis de estado (concentração de

células, de substrato limitante e de produto) permanecem constantes ao longo do

tempo de operação do sistema (FACCIOTTI, 2001).

As principais vantagens do processo contínuo de fermentação (FACCIOTTI,

2001), em relação ao descontínuo tradicional, são decorrentes da operação em

estado estacionário, dentre eles estão: a) aumento de produtividade do processo,

em virtude de uma redução do “tempo morto” ou não-produtivo; b) obtenção de

caldo fermentado uniforme, o que facilita o projeto das operações de recuperação do

produto de interesse; c) manutenção das células em um mesmo estado fisiológico, o

que torna o processo contínuo uma excelente ferramenta para estudos de

mecanismo de regulação metabólica (MARTINI et al., 1989; SCHMIDELL e

FACCIOTTI, 1994) ou, ainda, para estudos de otimização da composição de meio

de cultura (GOLDBERG e ER-EL, 1981; KUHN et al., 1979; MATELES e BATAT,

1974; YEE e BLANCH, 1993); d) possibilidade de associação com outras operações

contínuas de linha de produção; e) maior facilidade no emprego de sistemas de

controle mais sofisticado; f) menor necessidade de mão-de-obra.

O processo contínuo possui algumas desvantagens ou problemas práticos

(FACCIOTTI, 2001), que podem limitar o emprego deste tipo de sistema em escala

industrial, para alguns processos fermentativos. Assim, podem-se destacar: a) maior

investimento inicial da planta; b) possibilidade de ocorrência de mutações genéticas

espontâneas, resultando na seleção de mutantes menos produtivos; c) maior

possibilidade de ocorrência de contaminações por se tratar de um sistema aberto, no

entanto, necessita de manutenção de condições de assepsia nos sistemas de

alimentação e retirada de meio; d) dificuldades de manutenção de homogeneidade

no reator, quando se trabalha com baixas vazões, ou quando o caldo adquire



26

comportamento pseudoplástico, como é o caso do cultivo de fungos filamentosos; e)

dificuldades de operação em estado estacionário em determinadas situações

(formação de espuma, crescimento de microrganismo nas paredes do reator, ou

ainda, nos sistemas de entrada e saída de líquidos).

Apesar dos problemas acima mencionados, a utilização do processo contínuo

de fermentação encontra grande aplicação prática, como por exemplo, a

fermentação alcoólica, onde se utiliza normalmente, em escala industrial, o processo

contínuo com reciclo de células ou, ainda, o processo contínuo em múltiplos

estágios (FINGUERUT, 1993), permitindo, desta forma, a obtenção de elevados

rendimentos e produtividades do processo.

1.3 FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

A levedura realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir

energia química necessária à sua sobrevivência, sendo o etanol somente um

subproduto desse processo. Portanto, é desejável produzir tanto álcool, quanto

conhecer as condições ideais para as leveduras produzirem etanol com maior

eficiência. O etanol só é formado pelas leveduras a partir de monossacarídeos,

sendo necessário decompor a sacarose, C12H22O11, em D-glicose e D-frutose. Na

fermentação alcoólica, estes microrganismos fornecem a enzima invertase, que

hidrolisa a sacarose. A reação da inversão é demonstrada abaixo:

C12H22011 + H2O invertase C6H1206 + C6H1206

D-glicose D-frutose

Dois ciclos distintos que definem o processo de transformação de açúcares

solúveis em moléculas menores pela ação da levedura. O primeiro é a glicólise

(ocorre na mitocôndria) que possui a função de “quebrar” a molécula de glicose até

ácido pirúvico, através de uma série de reações catalisadas por enzimas

específicas, que se situam na parede celular e no interior da célula. Na ausência de

oxigênio há uma tendência à atuação das enzimas piruvato descarbosilase e álcool-

desidrogenase, produzindo etanol e água a partir de ácido pirúvico (ocorre no

citoplasma). A equação de Gay-Lussac faz um balanço desta etapa. Porém, na

presença de oxigênio há um deslocamento de parte do ácido pirúvico para o Ciclo



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de Krebs, onde este será oxidado enzimaticamente a dióxido de carbono e água. Os

balanços globais dos dois ciclos estão nas seguintes equações:

Equação de Gay-Lussac

C6H12O6 + 2Pi + 2ADP 2C2H50H + 2 CO2 + 2ATP + 2H2O + 57kcal

Ciclo de Krebs

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688kcal

O rendimento teórico (YP/S) para a produção de etanol é de 0,511 g/g. Na

prática, este valor não é observado devido a utilização de parte da glicose para a

produção de glicerol e alcoóis superiores, substâncias necessárias para síntese de

material celular e manutenção da levedura.

Assim, frente a um número elevado de reações catalisadas enzimaticamente

no metabolismo celular, fatores como pH, temperatura, pressão, concentração de

reagentes, micronutrientes, etc. afetam os parâmetros cinéticos que definem as

taxas de reprodução celular, consumo de substrato e produção de etanol.

1.4 FATORES QUE AFETAM A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

As células de leveduras são submetidas a vários tipos de estresses à medida

que as condições do meio mudam, tanto em ambientes naturais como durante os

processos industriais. Tanto os danos provocados pelo estresse quanto a resposta

da levedura, dependem do tipo e grau do estresse, e da posição da levedura em seu

ciclo de divisão celular no momento em que ocorre o estímulo (FOLCH-MALLOL et

al., 2004). Em geral, as condições adversas, que estes microrganismos enfrentam,

afetam principalmente as estruturas celulares (ex. as membranas) e as diferentes

macromoléculas, especialmente os lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, as quais

sofrem modificações estruturais que danificam suas funções (FOLCH-MALLOL et al.,

2004). Para se defender destas situações desfavoráveis, a levedura responde

rapidamente sintetizando moléculas que permitem aumentar o grau de reparo dos

danos causados pelo estresse. Entre as moléculas bem caracterizadas estão as



28

“proteínas de estresses”. Estas respostas a nível transcricional são importantes para

a sobrevivência celular e possui várias vias de transdução de sinais (RUIS e

SCHÜLLER, 1995).

Durante os ciclos sucessivos de fermentação em processos descontínuos

alimentados, as células da levedura Saccharomyces cerevisiae são expostas aos

estresses oxidativos, hiperosmóticos, iônicos, elevações de temperaturas e

limitações por nutrição (QUEROL et al., 2003). O estresse nutricional ocorre nas

células em fase estacionária o qual resulta em interrupção do crescimento. Os

fatores que mais afetam a produção de etanol e que estão descritos abaixo são:

temperatura, concentração de etanol e substrato, pH, oxigênio, viabilidade e

contaminação bacteriana que dependendo da concentração podem causar estresse

ácido às células e consumir nutrientes podendo levar a sérios prejuízos.

1.4.1 Temperatura

A temperatura afeta diretamente a ecologia microbiana e as reações

bioquímicas da levedura (TORIJA et al., 2003). A temperatura exerce um efeito em

todos os aspectos do crescimento, metabolismo, viabilidade e fermentação das

leveduras. A escolha da temperatura de operação na fermentação alcoólica é

influenciada tanto por fatores fisiológicos quanto físicos, tais como a perda do etanol

por evaporação e a grande formação de espumas a temperaturas elevadas.

Diminuições em produção de etanol em fermentações de bateladas repetidas

foram observadas quando a temperatura foi gradualmente aumentada de 30 °C a 35

°C (MORIMURA et al., 1997). No entanto, em um sistema contínuo de produção de

etanol a partir de xarope de cana-de-açúcar (sistema de cinco reatores em série,

operando com temperaturas decrescentes), a biomassa e a viabilidade foram mais

altas no último reator em série quando a temperatura deste foi de 35 °C (LALUCE et

al., 2002).

A produção industrial de etanol em destilarias ocorre na faixa de 25-35 °C. A

temperatura ótima varia entre as leveduras, sendo que as leveduras termofílicas

apresentam temperaturas ótimas de crescimento acima de 40 °C (WALKER, 1998).

Segundo Oliveira (1988), S. cerevisiae em temperaturas elevadas, afeta o

metabolismo da levedura levando a uma diminuição da tolerância ao etanol e

formação de metabólitos secundários como o glicerol. O efeito inibitório do etanol



29

está intimamente relacionado à temperatura da fermentação. Segundo Sá-Correia e

Van Uden (1983), a faixa de melhor resistência ao etanol para cepas usuais de

Saccharomyces cerevisiae é de 13 a 27 °C a 11% (v/v) de etanol no mosto. A

tolerância ao etanol diminui para temperaturas mais baixas que 13 °C ou maiores

que 27 °C, de forma que a inibição do crescimento do microrganismo ocorre tanto

em processos à baixa temperatura (cervejas, champanhes), como em processos à

alta temperatura (álcool combustível, vinhos tintos).

Além disto, bactérias láticas podem tolerar temperaturas mais elevadas (ex.:

temperaturas ótimas na faixa de 55 °C a 58 °C (EPSTEIN e GROSSOWICZ, 1969)

que aquelas toleradas pelas células de leveduras (BALAKUMAR et al., 2001).

Assim, a competição das células de bactérias e de leveduras pela fonte de carbono

aumenta quando a temperatura se eleva.

A produção de etanol através de fermentação não é uma alternativa muito

viável economicamente em climas quentes devido à alta energia exigida para manter

a temperatura da fermentação entre 25 e 35 °C (BANAT et al., 1992). O controle da

temperatura é essencial para maximizar a produção de etanol e prever inativação

irreversível das células de leveduras. Este problema poderia ser amenizado pelo uso

de leveduras termotolerantes (MORIMURA et al., 1997). Fermentações a 34-40 °C

ou acima possuem a vantagem de facilitar a recuperação do etanol com significante

economia relativa dos custos do controle de refrigeração em destilarias de produção

de etanol combustível, especialmente em países tropicais (LALUCE et al., 1991).

A termotolerância pode ser definida como a capacidade transitória das células

sobreviverem quando expostas a temperaturas elevadas (LASZLO, 1988). As

leveduras que apresentam termotolerância intrínseca suportam choques térmicos a

50 °C, enquanto que as leveduras que apresentam termotolerância induzida

resistem a choques térmicos somente quando adaptadas a elevações suaves de

temperaturas (p. ex., 30 minutos de exposição a 37 °C). Outros fatores são capazes

de afetarem a termotolerância das leveduras e estes são: agentes químicos, pressão

osmótica, valores baixos de pH externo, fase de crescimento, aquisição de

resistência na fase estacionária e estado nutricional (PIPER, 1993).

As respostas ao estresse térmico em leveduras estão bem estudadas. Um

aumento de 10 a 15 °C acima da temperatura ótima de crescimento induz a síntese

de um grupo de proteínas chamado HSP (Heat Shock Proteins). A maioria das

proteínas deste grupo são as proteases e chaperoninas que estão envolvidas em



30

impedir a desnaturação ou induzir a renaturação de proteínas, a degradação de

proteínas com defeito no seu empacotamento e desintegração de agregados

protéicos formados por desnaturação. Algumas destas proteínas se encontram

também presentes em temperaturas ótimas e estudos genéticos indicam que são

proteínas indispensáveis para manutenção da estrutura correta da folha pregueada

de outras proteínas, unir e separar unidades protéicas em estruturas oligoméricas e

degradar proteínas desnaturadas ou com defeitos na estrutura secundária

(LINDQUIST, 1992).

Em S. cerevisiae, atenção grande tem sido dada à família das proteínas de

choque térmico ou Hsp (SANCHEZ e LINDQUIST, 1990), entre as quais está a

proteína Hsp 104 que desempenha um papel chave sobre a tolerância ao calor e a

outros agentes estressantes (SANCHEZ et al., 1992). As proteínas Hsp 104, Hsp 70

e Hsp 40 formam o complexo chaperonina, o qual reverte a conformação de

proteínas alteradas pelo calor (GLOVER e LINDQUIST, 1998), restaurando as

atividades essenciais de proteínas na célula viva. Um aumento na síntese das

proteínas de choque térmico pode também ser induzido por condições hipertônicas e

etanol elevado entre muitos outros agentes de estresse (SANCHEZ et al., 1992). A

ubiquitina (proteína de baixo peso molecular envolvida com a degradação de

proteínas celulares), a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase da via glicolítica, a

catalase são outras proteínas envolvidas com a resposta ao estresse térmico

(WALKER, 1998).

O conteúdo celular de trealose eleva-se durante o crescimento exponencial

em resposta a mudanças de temperaturas atingindo um valor máximo em fase

estacionária, o qual leva a aquisição da tolerância ou resistência ao calor, ao

estresse osmótico e etanólico (ELEUTHERIO et al., 1995). Por outro lado, a

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase da via glicolítica passa a ser acumulada na

superfície das células sob estresse térmico (DELGADO et al., 2003).

1.4.2 Etanol

Do ponto de vista fisiológico, o etanol inibe o crescimento e a viabilidade das

leveduras por atuar negativamente sobre os diferentes sistemas de transportes

(incluindo permeases de aminoácidos), sobre a sinalização celular da glicose e a



31

atividade de enzimas chaves da via glicolítica (ALEXANDRE e CHARPENTIER,

1998; BISSON, 1999).

O etanol parece alterar o grau de polaridade da membrana celular

citoplasmática, causando interrupção do crescimento em concentrações elevadas

(LYND et al., 1991) e, ainda, aumentando a fluidez da membrana (LLOYD et al.,

1993). Estas alterações em fluidez resultam em mudanças na permeabilidade das

espécies iônicas, principalmente, na permeabilidade de prótons (CARTWRIGHT et

al., 1986). Concentrações elevadas de ácidos graxos insaturados na membrana,

vitaminas e proteínas parecem aumentar a tolerância ao etanol. Outros fatores

fisiológicos, tais como, composição do meio, acúmulo intracelular de etanol,

temperatura e pressão osmótica podem contribuir para a elevação da tolerância ao

etanol (D’AMORE e STEWART, 1987). A ação da trealose consiste em estabilizar a

membrana e proteger as células das leveduras frente aos efeitos do etanol. Assim, a

concentração intracelular deste dissacarídeo tem desempenhado um importante

papel sobre capacidade da célula em tolerar elevadas concentrações de etanol

(MAJARA et al., 1996).

Holzberg et al. (1967) demonstraram que o crescimento celular não é inibido

em concentrações de etanol inferiores a 26 g.L-1, mas é inibido totalmente quando a

concentração de etanol atinge 68,5 g.L-1 no meio da fermentação. Luong (1984)

observou que o etanol apresentava efeito significativo sobre a velocidade de

crescimento celular a concentrações acima de 15 g.L-1 e que a concentração de

etanol máxima a partir da qual as células não mais cresciam era aproximadamente

100 g.L-1. Esse mesmo autor também verificou que a capacidade de produção de

etanol de Saccharomyces cerevisiae era completamente inibida a uma concentração

de etanol de 105 g.L-1. Daugulis e Swaine (1987) encontraram valores máximos de

etanol onde as células não cresciam mais de 87,5 a 140 g.L-1, para sistemas

utilizando diversas linhagens de leveduras. A análise desses valores deve ser

cuidadosa, entretanto, uma vez que eles dependem do tipo de microrganismo, do

seu estado fisiológico, do meio de cultura e da temperatura.

Leveduras isoladas de destilarias mostraram inibição de suas atividades

fermentativas em batelada simples a 30 °C quando a concentração de etanol no

meio foi superior a 8%. Acima de 8% de etanol a fermentação ocorre de forma

gradativamente reduzida. Por outro lado, grandes perdas em biomassa foram



32

observadas em concentração de etanol no meio da ordem de 4% (PERES e

LALUCE, 1998).

1.4.3 Substrato (açúcar)

As linhagens de leveduras normalmente utilizadas nos processos industriais

apresentam uma osmotolerância limitada. Por esta razão, fermentações alcoólicas

são conduzidas em concentrações de açúcar usualmente ≤ 20% (m/v).

Concentrações elevadas de açúcar resultam em perdas da atividade de transporte

de açúcar, produzindo menos etanol (SALMON e MURICO, 1994). O estresse

induzido pelo aumento da osmolaridade externa leva a redução em crescimento e

perda da viabilidade das células das leveduras, devido às perturbações no gradiente

osmótico através da membrana plasmática. Isto leva, por sua vez, a perdas em

volume das células que se contraem (MAGER e VARELA, 1993) por causa de

diferenças em pressão osmótica entre o exterior e o interior das células.

Quando as células de Saccharomyces cerevisiae se encontram em uma

condição de alta osmolaridade externa, sofre uma mudança imediata em seu volume

celular devido à perda de água do citosol. Esta desidratação é um processo rápido

(aproximadamente 1 minuto) sendo parcialmente compensada por um influxo de

água no vacúolo para o citoplasma quando íons tóxicos se acumulam em organelas

(SERRANO, 1996). Para sobreviverem e continuarem a crescer, as células

desidratadas podem recuperar a turgência sempre e quando a intensidade do

estresse for fisiologicamente tolerável. A proliferação celular se renova após um

período de adaptação no qual varia dependendo de um número de fatores, como por

exemplo, o tipo e a intensidade do estresse, a genética da linhagem e sua fase de

crescimento (BLOMBERG, 2000). Nesta fase de adaptação, as células de levedura

experimentam uma série de mudanças como a reestruturação do citoesqueleto de

actina, interrupção transitória do ciclo celular e reprogramação do metabolismo (TAO

et al., 1999). Ao mesmo tempo, mecanismos envolvidos com a resistência dos

estresses são induzidos, como o aumento na concentração intracelular de glicerol e

a exclusão de íons tóxicos. Além disto, se induz a expressão de uma série de genes

cujos produtos participam de diferentes processos como o potencial redox, a

produção de proteínas protetoras e o reajuste dos níveis de carboidratos, lipídios e

aminoácidos (REP et al., 2000).



33

As células adaptam-se a concentrações elevadas de NaCl e outros solutos

através do acúmulo de glicerol interno, por aumento da osmolaridade (BLOMBERG

e ADLER, 1989). O acúmulo de glicerol resulta em aumentos da atividade de

glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD1) codificada pelo gene GPD1 (LARSSON et

al., 1993). Além disso, o acúmulo de glicerol estimulado pelo estresse osmótico

requer a expressão de outros dois genes, tais como os genes HOH1 (codifica para

proteína mitogênica e pertencente à família das MAP quinases) e PBS2 (codifica

para uma proteína componente da família das MAP quinases) (BREWSTER et al.,

1993).

A tolerância das linhagens de leveduras ao estresse osmótico e temperaturas

elevadas pode aumentar através do aumento da concentração de peptona e extrato

de levedura no meio (STEWART et al., 1988). Thomas e colaboradores (THOMAS et

al., 1994) estudaram os efeitos de substâncias osmoprotetoras sobre a fermentação

de uma linhagem de cervejaria, S. cerevisiae, numa concentração muito elevada de

glicose (35%, m/v) e mostraram que quando o meio é suplementado por glicina

betaína, glicina e prolina, ocorre um aumento na quantidade de açúcar fermentado.

1.4.4 pH

O pH é um fator significativo para as fermentações industriais devido à sua

importância tanto no controle da contaminação bacteriana quanto ao seu efeito

sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentação e formação de subprodutos

(AMORIM et al., 1996).

Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-se na faixa de

4,5 a 5,5 com uma boa capacidade tampão (THOMAS et al., 2002), mas as

leveduras mantêm uma homeostase de forma quase independente dos valores de

pH do meio, por isso toleram o tratamento ácido. O tratamento ácido também

provoca lixiviação de nutrientes tais como N, P e K da levedura que acaba por elevar

o pH. Embora o tratamento ácido se mostre estressante à levedura, ainda assim,

apresenta efeito benéfico de controlar a contaminação bacteriana, pois ocorre a

redução significativa no número de bactérias (AMORIM et al., 1996).

O pH ótimo para a produção de etanol por leveduras de S. cerevisiae situa-se,

geralmente, na faixa de 4 a 5. Aumentando-se o pH até 7, observa-se uma



34

diminuição do rendimento em etanol, com aumento da produção de ácido da

produção de ácido acético (MAIA, 1989).

O pH interno da célula se mantém na faixa de 5,8 a 6,9, seja qual for o valor

do pH extracelular na faixa de 2 a 7. Entretanto, baixos valores de pH tornam o meio

mais agressivo, uma vez que exigem das leveduras um maior dispêndio de energia

na manutenção do pH interno, além de afetar as proteínas de transporte da

membrana citoplasmática que ficam expostas ao meio externo. O pH do meio

externo também afeta a velocidade de crescimento das leveduras, a qual atinge um

máximo quando o pH está compreendido entre 5 e 6. Na fermentação alcoólica, o

estabelecimento e controle do pH do meio em valores inferiores a 5 é também

considerado importante como meio para prevenir a contaminação por bactérias

láticas e acéticas (MAIA, 1989).

1.4.5 Oxigênio

A fermentação alcoólica é inibida na presença de grandes concentrações de

oxigênio, fenômeno este denominado “Efeito Pasteur”. Este efeito está intimamente

associado ao estado fisiológico da célula, sendo que se manifesta principalmente

nas leveduras que não estão na fase de crescimento (fase estacionária) nas quais

ocorre nítida diminuição do consumo específico de glicose. Por outro lado, em

células na fase de crescimento (fase exponencial), não se observa diferença

significativa quanto à velocidade de consumo da glicose entre uma célula aeróbia e

outra anaeróbia.

O uso de condições microaeróbicas (0,5% de saturação) permite aumentar a

utilização do substrato, aumentando a tolerância da levedura ao etanol, sem haver

um decréscimo significativo no rendimento em etanol por unidade de substrato

consumido. Tal fato está relacionado à síntese de ácidos insaturados constituintes

da membrana celular, que depende da disponibilidade de oxigênio. Além de

indispensáveis à viabilidade celular, os ácidos graxos insaturados e esteróis

aumentam a permeabilidade da membrana ao etanol (MAIA, 1989).

Apesar do oxigênio molecular ter tornado essencial à vida durante a evolução

continua a oferecer perigo para manutenção da viabilidade celular. O ânion

superóxido (O2-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH•) são as

mais importantes espécies de oxigênio reativo (ROS) produzidos pelas células.



35

Estes compostos altamente oxidativos são continuamente formados durante o

metabolismo celular normal através das reações catalisadas por metais em

processos tais como respiração, β-oxidação de ácidos graxos, bem como, durante

as elevações em temperatura, etanol e concentrações de agentes químicos

estressantes (FRIDOVICH, 1981). Os radicais ROS causam danos oxidativos aos

ácidos nucléicos, lipídios, proteínas, carboidratos e outros componentes celulares

(VALENTINE et al., 1998). Além disso, alguns dos produtos resultantes de danos

oxidativos sobre lipídios e açúcares reagem rapidamente com proteínas e ácidos

nucléicos. Isto resulta em perdas na viabilidade celular e mutagênese. Células

requerem sistemas antioxidantes, que elimina o oxigênio ativo, para manter um

estado intracelular reduzido. O principal antioxidante é a glutationa cujo papel

consiste em proteger as células de leveduras contra agentes oxidantes, radicais

livres e agentes alquilantes. Os níveis de atividade de GPX2 (glutationa peroxidase)

aumentam com o estresse oxidativo celular (INOUE et al., 1999). Tais antioxidantes

representam o maior sistema de defesa oxidante não enzimático das leveduras.

Leveduras também possuem mecanismos enzimáticos para neutralizar os efeitos

dos radicais de oxigênio ativo. A defesa biológica primária contra os danos

oxidativos envolve os sistemas de proteção das proteínas, os quais removem os

radicais ROS ou seqüestram os íons metálicos. As defesas secundárias consistem

em enzimas que removem e/ou reparam os componentes dos produtos gerados pela

oxidação (MORADAS-FERREIRA et al., 1996). A enzima antioxidante denominada

superóxido dismutase encontra-se envolvida com conversão do ânion superóxido

em O2 e H2O2. A água oxigenada é degradada pela catalase ou peroxidase

(JAMIESON, 1998). A levedura S. cerevisiae possui duas isoformas

correspondentes a superóxido dismutase (codificada pelo gene SOD), uma

citoplasmática e dependente de Cu/Zn e outra mitocondrial dependente de Mn

(codificada pelos genes SOD1 e SOD2), as quais têm desempenhado um importante

papel na proteção de leveduras contra a toxidade do oxigênio (GRALLA e

VALENTINE, 1991). Além da elevação da sensibilidade a peróxidos e incapacidade

de crescimento das leveduras em certas fontes de carbono, outros diversos defeitos

metabólicos (p. ex. auxotrofias relativa à lisina e metionina) têm sido também,

associados com a deficiência na expressão do gene SOD (CHANG e KOSMAN,

1990).



36

Embora pareça contraditório, sabe-se hoje que a completa falta de oxigênio

não é benéfica ao processo de produção de etanol (ALFENORE et al., 2004). Níveis

mais altos de rendimentos alcoólicos e menos glicerol formado foram obtidos em

culturas nas quais havia certa quantidade de oxigênio disponível.

1.4.6 Viabilidade

A viabilidade celular é sem dúvida um aspecto importante no controle da

fermentação alcoólica. Quanto maior esse número melhor será o desempenho do

processo. Como o ambiente das dornas de fermentação não é propriamente ideal

para manutenção da viabilidade celular, um controle minucioso deve ser feito pelas

unidades produtoras de etanol. Milanese-Rubilar e Maugeri (1990) verificaram que a

viabilidade celular dependia da concentração celular e do tempo de residência.

Aumentos da temperatura de fermentação produzem uma forte diminuição da

viabilidade celular, devido ao aumento das taxas de produção e acúmulo de etanol

no meio e nas células. A linhagem 19G, isolada de reatores durante a operação de

uma indústria brasileira, mostrou rendimentos máximos de etanol dentro de uma

faixa de 40 °C a 43 °C quando fermentou xarope de cana-de-açúcar 15% (açúcar

redutor total). No entanto, decréscimos em viabilidades foram observados para esta

linhagem acima de 37 °C (LALUCE et al., 1991).

Cysewski e Wilke (1977) observaram que a viabilidade celular diminui

continuamente em anaerobiose, mas permaneceu acima de 95% em aerobiose num

sistema de fermentação a vácuo. As leveduras utilizam o oxigênio para produzir

ácidos graxos polisaturados e seus precursores, compostos necessários para a

biosíntese de lipídeos constituintes da membrana plasmática e mitocondrial. A

adição ao meio de cultura de ácidos graxos insaturados ou esteróis melhora a

tolerância das leveduras ao etanol, assim, aumenta a viabilidade celular.

A fonte de nitrogênio, ácido oléico e ergosterol desempenham um importante

papel na produção de altas concentrações de etanol em altas velocidades com

manutenção de viabilidade. Diversos autores têm observado que o extrato de

levedura (CASEY et al., 1983; THOMAS e INGLEDEW, 1992; THOMAS et al., 1993;

JONES e INGLEDEW, 1994; BAFRNCOVÁ et al., 1999), amônia (LEAO e VAN

UDEN, 1983; JONES e INGLEDEW, 1994; NIESSEN et al., 2000), magnésio

(DOMBEK e INGRAM, 1986; CIESAROVA et al., 1996; BIRCH e WALKER, 2000) ou



37

cálcio (NABAIS et al., 1988) exercem um efeito protetor sobre o crescimento,

fermentação, ou viabilidade, com estímulo sobre a velocidade de produção de

etanol. Uma suplementação com extrato de levedura melhorou a viabilidade e a

formação de biomassa em fermentações com alta densidade de células (CASEY et

al., 1983).

1.4.7 Contaminação bacteriana

As leveduras da fermentação alcoólica competem pelo substrato com

bactérias que normalmente habitam as dornas. Um processo de fermentação

considerado sadio trabalha com níveis de bactérias nunca menores que 105

células/mL (ANDRIETTA et al., 2006).

A procedência dessas é a mesma das leveduras nativas, isto é, a matéria

prima. As fontes de contaminação incluem: a cana-de-açúcar, as práticas agrícolas,

industrialização, extração, equipamentos (STUPIELLO, 1993). Entretanto a presença

de bactérias no processo, diferindo das leveduras nativas, nunca é benéfica para a

fermentação.

Embora o caldo ou o melaço diluído sejam um excelente meio de cultivo para

a grande maioria dos microrganismos, quando esse substrato passa a fazer parte do

processo de fermentação suas características são completamente modificadas. Os

microrganismos habitantes do mesmo, que se beneficiavam de todas as

propriedades não restritivas desse substrato, encontram na dorna de fermentação

um ambiente hostil. Nesse novo ambiente, os microrganismos contaminantes além

de competir com a levedura de processo têm que apresentar características que

lhes permitam crescer em condições de altos teores alcoólicos e alta acidez. São

alguns representantes dos gêneros Lactobacillus e Bacillus que reúnem as

características que os colocam como os principais contaminantes do ambiente

fermentativo. Gallo (1989) trabalhou em um extenso levantamento da microbiota

predominante de amostras de todo o ambiente fermentativo. Os resultados obtidos

revelaram que 98,52% das bactérias isoladas eram pertencentes ao grupo das

Gram+. O gênero Lactobacillus foi o mais freqüente (59,75%) e o gênero Bacillus

representaram 26,58% do total dos microrganismos isolados. Outros trabalhos

(RODINI, 1985; ROSALES, 1989; SEKI et al., 1989; OLIVA-NETO, 1990) de



38

levantamento da microbiota de processos fermentativos confirmam os resultados

obtidos por Gallo (1989).

Talvez o maior problema relativo aos altos níveis de contaminação nas dornas

sejam os problemas operacionais que o produto do metabolismo de certas bactérias

cause ao processo. A floculação do fermento é o mais sério deles. A falta de

homogeneidade do vinho fermentado faz com que a centrífuga não opere de forma

eficiente provocando sérios danos ao processo (ANDRIETTA et al., 2006).

1.5 FERMENTAÇÕES COM ALTA DENSIDADE DE CÉLULAS

O uso de altas densidades de células reduz o período de fermentação. As

destilarias brasileiras operam com altas concentrações de açúcar (10-20% de açúcar

redutor total, m/v) e altas densidades de células (10-12% de massa de células

úmidas, v/v). Altas densidades de células minimizam os efeitos do substrato e a

inibição pelo produto (RIESENBERG e GUTHKE, 1999), tornando possível realizar

fermentações em curtos períodos de tempo. Se a formação de biomassa for

significativa, ocorrerá a diminuição na produção de etanol. Em destilarias brasileiras,

o excesso de biomassa obtido no final de cada ciclo de fermentação é descartado

antes de iniciar um novo ciclo e usado na preparação de ração para animais

(LALUCE, 1991).

1.6 OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS

O planejamento estatístico de experimentos é uma ferramenta útil para

otimizar os processos onde muitas variáveis são envolvidas, possibilitando uma

melhor manipulação dos parâmetros, e uma análise mais representativa dos

resultados (CAZETTA et al., 2005). Os experimentos convencionais, nos quais

apenas uma variável passa por alterações com o tempo, não permitem avaliação

dos efeitos combinados de todos os fatores envolvidos no processo. Além disso, o

estudo de cada variável, de forma independente, consome muito tempo

experimental. Estas restrições podem ser superadas pelo uso de um planejamento

experimental estatístico combinado com a metodologia de superfície de resposta

(DE FAVERI et al., 2004). A metodologia de superfície de resposta (MSR) é uma

coleção de técnicas para delinear experimentos, construções de modelos, avaliando



39

os efeitos dos fatores ou parâmetros e encontrando condições ótimas de fatores

para as respostas desejáveis (WANG e LU, 2005). A MSR tem sido extensivamente

aplicada em muitas áreas da biotecnologia para otimização da produção de sorbitol

(CAZETTA et al., 2005), xilitol (DE FAVERI et al., 2004), ácido lático

(KOTZAMANIDIS et al., 2002), ácido cítrico (LI et al., 2002) e etanol (SREEKUMAR

et al., 1999).

1.6.1 Planejamento fatorial

O planejamento fatorial é muito empregado para avaliar a significância de

variáveis, bem como indicar condições ótimas para obtenção dos melhores

resultados.

Em um planejamento fatorial, inicialmente é preciso decidir os níveis

específicos dos valores dos fatores que serão usados nos experimentos. Neste tipo

de planejamento é necessário elaborar vários experimentos para todas as

combinações de níveis possíveis (FERREIRA et al., 2005). De acordo com SILVA

(1998), o principal objetivo do planejamento fatorial é relacionar empiricamente as

variáveis dependentes com as variáveis independentes, além disto, descobrir

estatisticamente o efeito de cada variável sobre a resposta desejável.

Uma das vantagens do planejamento fatorial consiste no agrupamento das

variáveis, o qual reduz o número de variáveis a ser estudado, ou reduz o número de

seus níveis e conseqüentemente ajuda a analisar as correlações entre eles. Assim,

torna-se possível reduzir consideravelmente o número de ensaios experimentais a

ser realizado (FERREIRA et al., 2005).

1.6.2 Metodologia de superfície de resposta (MSR)

Uma MSR pode ser definida como um método estatístico que utiliza dados

quantitativos de um delineamento experimental adequado para determinar e

simultaneamente solucionar equações multivariadas. Essas equações podem ser

representadas graficamente como superfícies de resposta, que podem ser usadas

de três formas: a) descrever como as variáveis em teste afetam as respostas; b)

para determinar as interrelações entre as variáveis em teste; e c) para descrever



40

efeitos combinados de todas as variáveis em teste sobre a resposta

(MONTGOMERY, 2001).

Seguem, abaixo, algumas definições de alguns termos considerados

relevantes:

a) Fatores ou variáveis independentes são características que podem ser

variadas no sistema; por exemplo, concentração de reagentes, força iônica,

pH, temperatura, etc;

b) Níveis se referem ao grau ou a faixa de variação que um fator no

processo sofrerá; exemplo, pH 2-10, tampão acetato 0,0 a 2 mol.L-1;

c) Respostas ou variável dependente consiste na variável que nos

interessa e seus efeitos sobre diferentes fatores; por exemplo, produção de

etanol, viabilidade.

Basicamente a MSR é um procedimento de quatro etapas:

a) identificar os fatores: o primeiro passo é identificar até 5 fatores que

sejam críticos ao estudo, ou seja os fatores responsáveis pela maior

variação no processo. Esta etapa presume que o pesquisador conheça

quais são os fatores que influenciam o processo. Se os fatores não forem

conhecidos, experimentos preliminares devem ser realizados para

identificar os principais fatores;

b) definir os níveis: o segundo passo consiste em definir a faixa em que os

fatores estão sendo estudados. Se a faixa for muito ampla corre-se o risco

de não encontrarmos o ponto ótimo. Neste caso, um segundo

planejamento com uma faixa mais restrita deve ser realizado;

c) escolher o delineamento experimental apropriado: os delineamentos

estabelecem uma ordem de como os experimentos devem ser realizados.

Ao cobrir toda faixa escolhida para o experimento, enfatizam-se os pontos

mais próximos ao ponto médio (ponto central), ao mesmo tempo em que

um número reduzido de experimentos é realizado para validação;

d) análise dos dados: a quarta etapa consiste em analisar os dados usando

um programa computacional adequado. As conclusões desses

experimentos devem ser confirmadas por experimentos posteriores nas

condições consideradas ótimas. Como em qualquer outro estudo

científico, os resultados não podem ser extrapolados para além dos

limites estabelecidos.



41

Fatores que devem ser considerados quando usamos a MSR

O uso efetivo da MSR deve levar em consideração cinco tipos de

presuposições:

a) os fatores que são críticos ao processo são conhecidos;

b) a região em que os fatores influem o processo é conhecida;

c) os fatores variam continuamente ao longo da faixa experimental

escolhida;

d) existe uma função matemática que relaciona os fatores à resposta

medida;

e) a resposta que é definida por essa função é uma superfície lisa.

A MSR apresenta as seguintes limitações:

a) grandes variações dos fatores podem resultar em conclusões falsas;

b) os fatores críticos não foram especificados corretamente;

c) a região de ótimo pode não ser determinada devido ao uso de uma faixa

muito estreita ou muito ampla de níveis de variação;

d) como em qualquer experimento, resultados distorcidos podem ser

obtidos caso bons procedimentos estatísticos não forem usados, tais

como aleatorização;

e) superestimar a computação: o pesquisador deve usar de bom senso e

seu conhecimento sobre o processo para chegar a conclusões

apropriadas dos seus dados.

42

Conclusões


Conclusões

43

5 CONCLUSÕES

Otimização de condições em processo descontínuo

A otimização das condições visando obter maior produção de etanol e maior

viabilidade em processo descontínuo foi obtida, com sucesso, através da

metodologia de superfície de resposta (MSR), sendo que os resultados previstos

pelo modelo foram confirmados experimentalmente. As melhores condições obtidas

através da MSR foram: 200 g.L-1 de sacarose, 40 g.L-1 de inóculo a 30 °C,

resultando em 82,7 g.L-1 de etanol e 90% de viabilidade após 4 horas de

fermentação em meio sintético em processo descontínuo.

Comparação entre os tipos de alimentação

Utilizando-se concentrações de inóculo, sacarose e temperatura resultante do

tratamento estatístico, comparou-se o processo descontínuo com o descontínuo

alimentado com vazão constante e por pulsos. A alimentação por 5 pulsos de

volumes decrescentes de sacarose, permitiu obter maior viabilidade, produtividade e

rendimento.

Efeito da temperatura, concentração de sacarose no processo alimentado por pulsos Quando se elevou a temperatura, observou-se que só foi possível produzir

etanol com valores elevados de viabilidade em temperaturas elevadas quando a

sacarose adicionada foi reduzida para 150 g.L-1 a 37 °C e 100 g.L-1 a 40 °C.

Comparação das linhagens 63M e BG1

A linhagem 63M foi comparada em temperaturas elevadas com a BG1,

linhagem utilizada nas destilarias brasileiras, e observou-se que a linhagem 63M foi

melhor por produzir maiores quantidades de etanol, maiores produtividades e

rendimentos, independente da quantidade de sacarose.


Conclusões

44

Efeito do tamanho do inóculo a 37 °C

Um estudo de variação de inóculo a 37 °C foi realizado e obtive-se que a

redução do inóculo para 20 g.L-1 permitiu alongar o tempo de fermentação de 3

horas para 6 horas, sem ganhos em viabilidade.

Reativação da levedura entre os ciclos de fermentação

O melhor tratamento de reativação foi quando se utilizou água destilada

enriquecida com 50 g.L-1 de sacarose e 10 g.L-1 de extrato de levedura.

Ciclos sucessivos de fermentação a 37 °C

Oito ciclos sucessivos de fermentação com reutilização de células da

linhagem 63M foram realizados em meio sintético em processo descontínuo

alimentado por pulsos de sacarose (150 g.L-1) e inóculo de 20 g.L-1 a 37 °C e uma

perda gradual de viabilidade foi observada (até 30% no 8° ciclo), mas uma

regeneração da proteína total foi observada a partir do 5° ciclo e o etanol final

permaneceu constante em todos os ciclos ao redor de 70 g.L-1.

45

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