Avaliação de DSA (anticorpo doador específico)

Igen - Instituto de ImunogenéticaAssociação Fundo de Incentivo à Pesquisa

São Paulo, SP, Brasil

Renato de Marco17.04.18

Estrutura do HLA

KLEIN J, SATO A:. The HLA system. First of two parts. N Eng J Med 2000; 343;10: 702-9.

HLA - Nomenclatura

HLA A* 01:01:01:01Locus

Nível sorológico –Grupo de alelos

Alelo

AleloSubstituição silenciosa

Variantes intron

Polimorfismo HLANumbers of HLA Alleles

HLA Class I Alleles 12,893

HLA Class II Alleles 4,802

HLA Alleles 17,695

HLA Class I

Gene A B C E F G

Alleles 4,081 4,950 3,685 27 30 58Proteins 2,853 3,582 2,550 8 5 18

Nulls 191 148 137 1 0 3HLA Class II

Gene DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB

Alleles 7 2,440 94 1,178 64 5 963 6 7 13Proteins 2 1,751 35 779 26 0 655 0 4 7

Nulls 0 66 3 31 0 0 22 0 0 0HLA Class II - DRB Alleles

Gene DRB1 DRB2 DRB3 DRB4 DRB5 DRB6 DRB7 DRB8 DRB9

Alleles 2,146 1 152 74 55 3 2 1 6Proteins 1,548 0 125 57 49 0 0 0 0Nulls 52 0 5 9 3 0 0 0 0

IMGT/HLA Database (04/2018)

Grupo de Alelos (nível sorológico)

HLA A: 21

HLA B: 43

HLA C: 15

HLA DR: 17

HLA DQ: 7 DQB1 e 6 DQA1

HLA DP: 18 DPB1 e 4 DPA1

Correspondente Sorológico

B*14 B64, B65

B*15 B62; B63; B70 (B71; B72); B75; B76; B77

B*40 B60, B61

B*50:02 B45

DRB1*01 DR1, DR103

DRB1*03 DR17, D18

C*03 Cw9, Cw10

DQB1*03 DQ7, DQ8, DQ9

Como um indivíduo forma anticorpos anti-HLA?

Gestação

Transfusão

Transplante

Hipersensibilizados (PRA >80%)

Não Hipersensibilizados (PRA < 80%)

Teste Exato de Fisher

N 493 3.737

TX prévio 199 (40,4%) 266 (7,1%)P<0.0001OR:8,9IC 95%:7,1 – 11,1

Mulheres com gestação prévia

1 a 2 gestações 107( 21,7%)

≥ 3 gestações: 169 (34,3%)

Gestação ≥ 1: 492 (13,2%)

Gestação ≥ 3; 502 (13,4%)

P<0.0001OR:1,8IC 95%:1,4 – 2,3P<0.0001OR:3,4IC 95%:2,7 – 4,2

TransfusõesSanguíneas

N: 1 a 4 = 274 (55,6%)

N ≥ 5=136 (27,6%)

N: 1 a 4 = 1521 (40.7%)

N ≥ 5= 560 (15,0%)

P<0.0001OR: 1,8IC 95%:1,5 - 2,2

P<0.0001OR:2,16IC 95%:1,7 – 2,7

FATORES ASSOCIADOS À CONDIÇÃO DE HIPERSENSIBILIZADOS

Metodologias de Uso Corrente para Detecção de Anticorpos Anti-HLA

ALTA SENSIBILIDADE

BAIXA SENSIBILIDADE

LUMINEX SA-IgBeads recobertas por antígenos HLA purificados

Definição da especificidade dos anticorpos

CDC

CDC-AGH

CITOMETRIA DE FLUXO

Crossmatch (XM) contra o doador

HLA doador +

Crossmatch Virtual

Diferença entre os kits

Mixed PRA Fenótipo Single Antigen

FI=1x FI=4x

FI=1x

FI=2x

MFI=4/3=1,33x

FI=5x

FI=6x

MFI=15/3=5x• MFI= Valor médio da leitura, pelo luminex, da fluorescência emitida pelo conjugado.

5

5

5

6

6

6

Leitura no Luminex

LUMINEX SINGLE ANTIGEN

Exemplo de Single I

- Paciente não forma anticorpos contra HLA próprio

- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs A, B, C

- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população

Exemplo de Single II

- Paciente não forma antircorpos contra HLA próprio

- Contem todos dos grupos de alelos descritos para os HLAs DRB1, DRB3/45, DQB1, DQA1, DPB1 e DPA1

- Cada grupo de alelos é representado por 1 ou mais alelos - mais frequente na população

Problemas no Luminex

• Reações Falso-Negativas

– Interferência do complemento presente no soro do receptor nadetecção dos anticorpos anti-HLA

– Pré-tratamento do soro com: Aquecimento, DTT ou EDTA

Anti-A2Média de MFIA2=1.170

AQUECIMENTO DO SORO

Anti-A2 Aq 1 min.

Média de MFIA2=15.010

INIBIÇÃO DE REATIVIDADE PELO COMPLEMENTO

Problemas no Luminex• Reações Falso-Positivas

– Presença de antígenos HLA desnaturados aderidos à bead

– Experiência do analista para identificar

– Não correlacionam com prova cruzada real positiva

– Diferença de resultados entre diferentes fabricantes

• Desnaturar antígeno HLA do kit – experimental

• Absorção / Eluição - experimental

Presença de anticorpos contra antígeno HLA desnaturado

Doador: HLA-A*02,31; B*14(B65),49; DRB1*01,13

LINFÓCITOS T LINFÓCITOS BControle Negativo Cut-off MCF = 212 Cut-off MCF = 238

Soro da Paciente MCF = 174 (Neg) MCF = 208 (Neg)

Single Antigen Padrão

Single Antigen Antígeno HLA Desnaturado

Reação falso-Positiva

Variação entre laboratórios nos Estados Unidos

A adoção de um procedimento operacional padrão, reduziu o coeficiente de variação entre os laboratório de ~62% para ~25%

0%

25%

50%

75%

100%

lotes 08 e 09 Lote 8 Lote 9 lote 10

% C

V

LSA-Ig Classe I LSA-Ig Classe II

Variação entre laboratórios no BrasilAmostras nº 64, 65, 66 do controle de qualidade da ABH - 2015

14 laboratórios enviaram os dados de MFI de LSA classe I:8 Laboratórios utilizaram lote 086 Laboratórios utilizaram lote 09

13 laboratórios enviaram os dados de MFI de LSA classe II: Todos utilizaram lote 010Só foram incluídas na análise beads com média de MFI > 500

33,3% 32,7% 34,0%

20,7%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

LSA-Ig I lote7 LSA-Ig II lote 9

% C

V

Variação intra-laboratório dos resultados de LSA-Ig

3 diferentes soros testados 5 vezes, em diferentes dias e por diferentes técnicos, com o mesmo lote de beads e o mesmo conjugado. Das beads com média MFI > 500, calculamos:

Avaliação no IGEN

9,0%5,4%

NEG POSPresença de Anticorpos Anti-HLA – relação com Soro negativo

nMFI: cut-off # para # objetivos

NEG POSPresença de Anticorpos Anti-HLA – relação entre fabricantes

Cutoff = 300 MFI (variação encontrada no soro controle negativo) – dados do Igen

Cutoff = 1000 a 1500 MFICutoff = 1400 MFI – acurácia de 90% para anticorpos contra HLA classe I e II

nMFI: cut-off # para # objetivos

Crossmatch Virtual Positivo por CDCPOSNEG

Crossmatch Virtual Positivo por CFPOSNEG

Qual a relação MFI x CDC ?

MFI = 11.761 (Sensibilidade de 89,9% e especificidade de 94,7%)

Qual a relação MFI x Citometria de Fluxo ?

-5000

0

5000

10000

15000

20000

-200 -100 0 100 200 300 400 500 600>

MFI

DSA

HLA

-A,

B

MCF - Cutoff

Citometria de Fluxo - Linfócitos TMFI do DSA AB mais alto x Delta (MCF - cutoff)

Correlação: 0,93

1500 MFI

Cutoff MFI ≥ 1500VPN: 98,7%VPP: 92,0%Acurácia: 97,5%

nMFI: cut-off # para # objetivos

Anticorpos Clinicamente Relevantes

POSNEG ? ? ? ? ?

Trabalho de Mestrado Igen-HRim – DSA A,B,DR (XM CDC Neg)

Impacto desta política sobre a sobrevida do rim de doador falecido

Em pacientes sensibilizados (PRA ≥ 10%)

AntesDepois

anos

P<0.001

01/08/2009 a 31/12/2016, N=81001/01/2002 a 31/12/2007, N= 92Data da revisão: 15/02/2017

Em pacientes não sensibilizados (PRA < 10%)

AntesDepois

anos

01/08/2009 a 31/12/2016, N=306201/01/2002 a 31/12/2007, N= 723Data da revisão: 15/02/2017

Equipe e Transplante: Hospital do Rim & Hosp. São PauloLaboratório de Histocompatilidade: IGEN – AFIP, SP

Em 01/08/2009 foi implantada a política de contra-indicar o transplante em receptores com anticorpos contra antígenos HLA-A, B ou DR do doador falecido com MFI > 1500 no teste Luminex-Single Antigen, mesmo que o crossmatch por CDC seja negativo. Este corte foi baseado em estudo retrospectivo em transplantes do Hosp. Rim anteriores a 2008.

DSA (MFI=1,140)

Eplet 76ESN/TerEp #216 (Bw6)

Foi realizada prova cruzada por citometria de fluxo (Flow XM) com células B39 do doador

Gebel HM, Bray RA. Am J Transplant. 2014 Sep;14(9):1964-75

Flow T-Cell XM: 205 MCF (Cut Off - 180 MCF)Flow B-Cell XM : 312 MCF (Cut Off - 271 MCF)

POSITIVO FRACO

Epítopos compartilhados levam a “diluição” do anticorpo nas beads e consequentemente uma diminuição nos valores do MFI

SATURAÇÃO DO TESTE

PRA LUMINEX (IgG) Single AntigenSORO DE 24.11.15

CLASSE ISORO PURO

CLASSE IISORO PURO

CLASSE IISORO DILUÍDO 1:1024

VALORES DE MFI DOS ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA O DOADOR

HLA A*23 – MFI = 587HLA B*08 – MFI = 962HLA B*18 – MFI = 858

HLA DQB1*02 – MFI = 8872

HLA DQB1*06 – MFI = 18277HLA DQB1*06 – MFI = 3102

PRA LUMINEX (IgG) Single AntigenSORO DE 04.01.16

CLASSE ISORO PURO

CLASSE IISORO PURO

CLASSE IISORO DILUÍDO 1:1024

VALORES DE MFI DOS ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA O DOADOR

HLA A*23 – MFI = 443HLA B*08 – MFI = 645HLA B*18 – MFI = 459

HLA DQB1*02 – MFI = 3529

HLA DQB1*06 – MFI = 19565HLA DQB1*06 – MFI = 332

PRA LUMINEX (IgG) Single AntigenSORO DE 01.04.16

CLASSE ISORO PURO

CLASSE IISORO PURO

CLASSE IISORO DILUÍDO 1:1024

VALORES DE MFI DOS ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA O DOADOR HLA B*08 – MFI = 324

HLA DQB1*02 – MFI = 985

HLA DQB1*06 – MFI = 12801NEGATIVO

RESULTADO DOS EXAMES PRÉ-TRANSPLANTE:

RESULTADO DOS EXAMES PÓS-TRANSPLANTE:

XAnticorpos do Receptor

HLA A,B,DR: cutoff = 1.500 MFI

HLA C,DQ,DP: cutoff = 5.000 MFI

Antígeno HLA (MM) do doador

Tipificação HLA

HLA-A,B,C,DRB1*,DRB3/4/5, DQ, DP

Prova Cruzada VirtualPredição de Prova Cruzada Real Negativa

Definição das especificidades dos anticorpos: Luminex-SA

HLA-A,B,C,DRB1,DRB3/4/5,DQ

HLA-A,B,DRB1,DRB3/4/5

PROVA CRUZADA VIRTUAL X PROVA CRUZADA REAL

Virtual XM

XM CDC T ou BTotal

Negativo Positivo

Negativo 284 (95,3%) 14 298Positivo 141 154 295

- XM virtual considerando HLA-A,B,DR

- Soro mais recente: Nem sempre com PRA

Lista Rim

Virtual XM

RetrospectivoXM CDC T or B

TotalNegativo Positivo

Negativo 654 (100%) 0 654Positivo 300 83 383

Lista Pâncreas/Rim

- XM virtual considerando HLA-A,B,C,DR,DQ,DP

- Soro mais recente: Sempre com resultado de PRA

Ausência de DSA contra HLA desse loco!

A falta da tipificação HLA de um loci do doador ≠

RECOMENDAÇÕES GERAIS DA ASHI E EFI SOBRE XM VIRTUAL

Paciente tenha pelo menos 2 painéis pré-TxSoro deve ser testado, no PRA, com uma técnica no mínimo com a

mesma sensibilidade da prova cruzada.Soro testado nos últimos 3 meses antes do TxE também 14 dias após eventos de sensibilização

XM real seja realizado retrospectivamenteTodo o processo seja documentadoEquipe de Tx esteja de acordo com o protocolo do XM virtualEquipe tenha ciência de possíveis erros de tipificação HLA

ESTRATIFICANDO RISCO DO TX

Um resultado negativo de C1q não indica ausência de subclasse de IgG fortemente fixadora de complemento

C1qScreen

Transplantation. 2014

Single classe: LSA-C1q (pos, neg) vs MFI LSA-Ig

Resultados – Igen (ABTO 2015)

LSA-IgLSA-C1q

NEG POS

MFI < 10.900 297 (99,7%) 1 298

MFI ≥ 10.900 4 86 (95,6%) 90

Sensibilidade 98,8%Especificidade 98,7%Acurácia 98,7%

Sensibilidade 97,8%Especificidade 97,3%Acurácia 97,4%

LSA-IgLSA-C1q

NEG POS

MFI < 14.613 325 (99,7%) 1 326

MFI ≥ 14.613 9 45 (83,3%) 54

LSA-C1q vs XM T CDC-AGH

Resultados – Igen (ABTO 2015)

Sensibilidade 85,3%Especificidade 69,1%

Acurácia 79,1%

p<0,0001

LSA-C1qclasse I

XM CDC - T

NEG POS

NEG 29 (74,4%) 10 39

POS 13 58 (81,7%) 71

DIAGNOSTIVO DE RMA Critérios de banff 2017

Fenótipo 1

Fenótipo 2

1 – anticorpos classe I e II presentes no pre-tx2 – acontece nos primeiro meses pos-tx3 – em geral, boa resposta ao tratamento

1 – Ocorre após o primeiro ano2 – dnDSA3 – associados a anticorpos HLA classe II4 – frequentemente com componente de TCMR5 – Histórico de não aderência

DEFINIÇÃO DE NDDSA Anticorpo detectado somente após o transplante.

Cuidado na avaliação! Uso de um alto valor de cutoff (MFI) Efeito “dilucional” dos anticorpos que reconhecem o

mesmo epítopo pode levar a uma falsa interpretação que o anticorpo não

estava presente no pre-tx.

Células B de memória se tornam ativadas após o transplante, o DSA ressurgente pode ser interpretado erroneamente como dnDSA.

DNDSA dnDSA, um importante fator de risco perda de enxerto e ocorre em

15-25% dos receptores de transplante renal em 5 anos após o transplante1

A não-adesão à medicação imunossupressora emergiu como a causa primária da formação de dnDSA,

dnDSA pode ser uma conseqüência de imunossupressão insuficiente, seja iniciado pelo paciente (não-adesão à medicação) ou iniciado pelo médico (protocolos de minimização)

Imunossupressão prescrita está em regime sub-ótimo para o perfil de risco imunológico do paciente.

1 Wiebe C, Pochinco D, Blydt-Hansen TD, et al. Class II HLA epitope matching-a strategy to minimize de novo donor-specificantibody development and improve outcomes. Am J Transplant. 2013;13:3114–3122

J Am Soc Nephrol 28, 2017

MONITORAMENTO PÓS-TX

O monitoramento rotineiro de DSA pós-transplante ainda não é amplamente adotado

O curso natural do dnDSA e sua correlação com a função do enxerto e a histopatologia ainda não foram totalmente elucidados em grandes estudos clínicos.

Existem diferenças de opinião em relação à utilidade clínica da rotina de monitoramento e manejo de DSA pós-transplante de pacientes com dnDSA, especialmente na ausência de disfunção do enxerto

Realização de biópsia na descoberta do dnDSA.

Se não houver rejeição concomitante na biópsia no início do dnDSA: aumento do nível de imunossupressão

Em que caso seria fortemente recomendada:

Suspeita de rejeição humoral (para diagnóstico de AMR)

Em que casos seria interessante:

Pacientes com DSA pré-tx

Suspeita de não aderência a medicação

Mudança de esquema de imunossupressão, ou minimização da imunossupressão.

Após episódios de TCMR

AVALIAÇÃO DE DSA PÓS-TX

Agradecimento

Instituto de Imunogenética – Igen/AFIPDiretora: Maria Gerbase de Lima