AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO … · queridas, são exemplos de superação e dedicação. Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA

AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E

DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES

COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS

Orientadora: Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild

Co-Orientadora: Profª. Drª. Adriana Augusto de Rezende

NATAL-RN

2010

ii





NATAL-RN

2010

Dissertação de mestrado

apresentada ao curso de Pós-

graduação como pré-requisito

para obtenção do título de mestre

em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal do Rio

Grande do Norte.

iii

CATALOGAÇÃO NA FONTE

F383a

Ferreira, Diana Quitéria Cabral.

Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da

expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com

aterosclerose tratados com estatinas / Diana Quitéria Cabral

Ferreira. – Natal, 2010.

67f.

Orientadora: Profª Drª Lucia de Fátima Campos Pedrosa

Schwarzschild.

Co-orientadora: Profª Drª Adriana Augusto de Rezende.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Aterosclerose – Dissertação. 2. Selênio – Dissertação.

3. Rosuvastatina – Dissertação. I. Schwarzschild, Lucia de Fátima

Campos Pedrosa. II. Título.

RN-UF/BS-CCS CDU: 616.13-004.6(043.3)

iv

COLABORADORES

Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino

Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF),

Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental.

Profa. Drª. Dulcinéia Saes Parras Abdalla


Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas

Profa. Ms. Karine Cavalcanti Maurício de Sena

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Centro de Ciências da Saúde

(CCS), Departamento de Nutrição.

Drª. Maria Sanali Moura de Oliveira Paiva

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Hospital Universitário Onofre

Lopes (HUOL), Departamento de Medicina Clínica.

Paula Cristina Silveira Dias

Nutricionista, Mestranda do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,

Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

v

FINANCIAMENTOS E BOLSAS CONCEDIDAS

- Edital Universal CNPq: N° do processo – 475781/2008-0

- Edital MCT/CNPq, N° 27/2007: N° do processo - 136201/2008-3

Bolsa de Mestrado (Duração: agosto 2008 a fevereiro 2010).

vi

Diana Quitéria Cabral Ferreira

Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas

em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas

Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas

Banca Examinadora

Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild

Orientadora/Presidente


Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental. Faculdade de Ciências Farmacêuticas

(FCF). Universidade de São Paulo (USP).

Profª. Drª. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas

Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Centro de Ciências da Saúde (CCS).

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Natal, 24 de maio de 2010.

vii

Aos meus queridos pais, Ezilda Barros e João Ferreira,

que são para mim um exemplo de amor, dedicação, respeito e companheirismo.

A minha irmã, Daiane Ferreira, pelo apoio incondicional.

Ao meu grande amor, Felipe,

pelas palavras de força nas horas que mais precisava,

me incentivando e sempre estando ao meu lado.

viii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela bênção que ele me concede a cada dia, pela minha

família e por ter ao meu lado pessoas maravilhosas.

A meus pais, João e Ezilda, por sempre me apoiarem nessa longa, árdua e prazerosa

caminhada que é a pós-graduação.

A minha irmã, Daiane, e meu cunhado Daniel, por representarem pra mim mais que pessoas

queridas, são exemplos de superação e dedicação.

Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras de ânimo nos

momentos que mais precisei.

A professora Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild pelo exemplo profissional

que representa em minha vida, pelas oportunidades concedidas desde a graduação, como

aluna de iniciação científica até hoje com o mestrado.

A professora Adriana Augusto de Rezende, pelo apoio, principalmente pela abertura do

Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL), confiando e acreditando no trabalho.

A professora Karine Cavalcanti Maurício de Sena, pela confiança e por ser para mim um

exemplo de dedicação e amor à profissão.

A mestranda Paula C. S. Dias, pelo apoio nos momentos mais difíceis dessa trajetória.

A professora Silvia Maria Franciscato Cozzolino pela abertura concedida em seu

laboratório, pelo total apoio à nossa pesquisa e por ter aceitado colaborar e enriquecer

nosso trabalho.

A professora Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas pela colaboração, desde o

momento da qualificação, até a disponibilidade de estar na minha banca de apresentação do

mestrado.

ix

As alunas bolsistas, Heliane, Renata, Carol e Patricia, pela dedicação e empenho a cada dia

de coleta e análise dos dados.

Aos amigos do Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), principalmente nas pessoas de

Marcela, Freie, Felipe, Gustavo, Clélio, pela ajuda inestimável para desenvolvimento desse

trabalho, bem como pelos momentos de descontração fora do laboratório.

Aos amigos do Laboratório de Nutrição Experimental da FCF-USP, nas pessoas de

Alexandre, Kaluce, Graziela, Suzana e Janaína, pela ajuda nas análises e também na estadia

em São Paulo, terra até então desconhecida para mim, mas que me encanto e onde pude fazer

verdadeiros amigos.

Aos pacientes, pela imensurável contribuição.

x

RESUMO

FERREIRA, D. Q. C. Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão

gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas. 2010.

67f. [Dissertação] Natal (RN): Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande

do Norte, Natal – RN, 2010.

Este trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do uso da rosuvastatina em pacientes com

aterosclerose, em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como

observar possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes. A

amostra foi constituída de 27 pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença

arterial coronariana submetidos à angioplastia, atendidos no Natal Hospital Center, Natal, RN.

Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina durante 4 meses. Variáveis

antropométricas, como Índice de Massa Corporal (IMC) e Circunferência Abdominal (CA),

foram medidas antes e após o tratamento, bem como o perfil lipídico, glicemia e enzimas

hepáticas (AST e ALT). A dieta dos pacientes também foi analisada utilizando o Recordatório

alimentar de 24 horas. Foram analisadas as concentrações do selênio no plasma e nos

eritrócitos, e também a atividade da enzima Glutationa Peroxidase e a expressão gênica por

PCR em Tempo Real das selenoproteínas GPx1, SelP1 e SelN1. Os pacientes apresentaram

idade média de 61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. Após os quatro meses

de tratamento observou-se redução significativa da CA e, de acordo com o IMC, a maior parte

estava com sobrepeso. A ingestão dos macronutrientes, colesterol, ácidos graxos

polinsaturados, monoinsaturados e saturados foi adequada, porém a de energia e fibras estava

abaixo das recomendações. Com relação a ingestão de selênio foi observada uma alta

prevalência de inadequação. Como esperado, após o tratamento com a rosuvastatina, houve

redução significativa do colesterol total e LDL, bem como da glicemia, o que não foi

observado para o HDL. As concentrações de selênio no plasma e eritrócitos não apresentaram

alterações, se mantendo dentro dos pontos de corte estabelecidos. Foi observado um aumento

significante na atividade enzimática da GPx e na expressão de mRNA do GPX1 e SEPN1,

mas não para o gene SEPP1. Dessa forma, foi verificado que o tratamento com a

rosuvastatina não diminuiu a expressão das selenoproteínas. Mais estudos são necessários

para esclarecer os efeitos da rosuvastatina sobre a expressão gênica de selenoproteínas em

pacientes com aterosclerose.

Palavras-chave: Aterosclerose; Rosuvastatina; Selênio; Selenoproteínas; Expressão gênica.

xi

ABSTRACT

FERREIRA, D. Q. C. Assessment of nutritional status of selenium and gene expression of

selenoproteins in patients with atherosclerosis treated with statins. 2010. 67f.

[Dissertation] Faculty of Pharmaceutical, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal –

RN, 2010.

The aim of this study was to determine the effects of the use of rosuvastatin in patients with

atherosclerosis, in relation to blood parameters of selenium and selenoproteins, and also

observe possible changes in gene expression of selenoproteins in these patients. The sample

consisted of 27 adult and elderly patients with a clinical diagnosis of coronary artery disease

undergoing angioplasty, treated at Natal Hospital Center hospital, Natal, RN. Patients were

treated with rosuvastatin 10 mg/day during four months. Anthropometric variables such as

body mass index (BMI) and Waist circumference (WC) were measured before and after

treatment, as well as lipid profile, blood glucose and liver enzymes (AST and ALT). The diet

of the patients was also analyzed using 24-hour diet recall. We analyzed the concentrations of

selenium in plasma and erythrocytes, and also the activity of Glutathione Peroxidase and gene

expression by Real Time PCR of selenoproteins GPx1, SelP1 and SelN1. Patients had mean

age of 61.0 ± 9.4 years, 59.3% were men and 40.7% were women. After four months of

treatment there was significant reduction of CA and, according to BMI, most were

overweight. The intake of macronutrients, cholesterol, polyunsaturated fatty acids,

monounsaturated and saturated was adequate, but the energy and fiber intake was below

the recommendations. Regarding the selenium intake was observed a high prevalence of

inadequacy. As expected, after treatment with rosuvastatin, a significant reduction in total

cholesterol, LDL and glucose, which was not observed for HDL. Selenium concentrations

in plasma and erythrocytes showed no changes, keeping within the established cutoffs. We

observed a significant increase in GPx enzyme activity and mRNA expression of GPX1 and

SEPN1, but not for gene SEPP1. Thus, it was found that treatment with rosuvastatin did not

reduce the expression of selenoproteins. More studies are needed to clarify the effects of

rosuvastatin on gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis.

Key words: Atherosclerosis; Rosuvastatin; Selenium; Selenoproteins; Gene expression.

xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAS Ácido Acetil Salicílico

ALT Alanina Aminotransferase

AST Aspartato Aminotransferase

CA Circunferência Abdominal

CT Colesterol total

cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar

DM Diabetes mellitus

DNA Ácido Desoxirribonucléico (Deoxyribonucleic Acid)

DP Desvio Padrão

DRIs Ingestão Dietética de Referência (Dietary References Intakes)

EAR Necessidade média estimada (Estimated Average Requirements)

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

GAPDH Gliceraldeído trifosfato desidrogenase

GPx Glutationa Peroxidase

GPX1 Gene da Glutationa Peroxidase 1

HDL Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein)

HMG-CoA redutase 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima A redutase

HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes

IMC Índice de Massa Corporal

LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein)

NHC Natal Hospital Center

PCR Reação de Polimerase em Cadeia

pH Potencial Hidrogeniônico

RDA Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance)

RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)

RT-PCR Reação de Polimerase em Cadeia por transcriptase reversa

Se Selênio

SelP Selenoproteína P

SEPP1 Gene da Selenoproteína P 1

SelN Selenoproteína N

SEPN1 Gene da Selenoproteína N 1

xiii

SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética

TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica

TG Triacilgliceróis

TM Temperatura de Melting

UL Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels)

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

USP Universidade de São Paulo

xiv

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das

estatinas..............................................................................................................

5

FIGURA 2 – Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com

rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.............................................

13

FIGURA 3 - Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com

aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital

Center...............................................................................................................

15

FIGURA 4 - Fluxograma das atividades do estudo com pacientes com aterosclerose

tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital

Center.................................................................................................................

FIGURA 5 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina,

de acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital

Center...............................................................................................................


de acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital

Center.................................................................................................................

16

27

27

FIGURA 7 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de

acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes e colesterol,

atendidos no Natal Hospital Center......................................................................

29

FIGURA 8 - Distribuição da ingestão de Se, bruta (A) e ajustado (B) dos pacientes com

aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center....

30

FIGURA 9 - Percentual de alterações do perfil lipídico dos pacientes com aterosclerose

após o tratamento com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........

33

xv

FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas

de mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com


Center. .......................................................................................................

37

xvi

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a

avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH.................

23

TABELA 2 - Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados

com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.....................................

25

TABELA 3 - Dados antropométricas dos pacientes com aterosclerose tratados com

rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........................................

26

TABELA 4 – Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com


Center.............................................................................................................

TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com


Center...................................................................................................................

TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos dos pacientes com aterosclerose tratados com

rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................................

28

31

32

TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos

no Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de

referência para perfil lipídico e glicemia....................................................

34

TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade

enzimática da Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose

tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................

35

TABELA 9 – Variação da expressão de RNAm dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1 dos

pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no

Natal Hospital Center..............................................................................

36

xvii

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo

o IMC..........................................................................................................

17

QUADRO 2 - Risco de complicações metabólicas relacionadas à obesidade, com base na

Circunferência abdominal.....................................................................................

18

xviii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 2

1.1 Aterosclerose e Estatinas.......................................................................................... 2

1.2 Selênio e Selenoproteínas......................................................................................... 6

2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................. 10

3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 11

3.1 Objetivo Geral........................................................................................................... 11

3.2 Objetivos Específicos................................................................................................ 11

4 CASUÍSTICA E MÉTODOS......................................................................................... 11

4.1 Protocolo Experimental............................................................................................. 11

4.2 Parâmetros Antropométricos..................................................................................... 17

4.3 Análise da Dieta........................................................................................................ 18

4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas...................... 19

4.5 Análise de Selênio..................................................................................................... 20

4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase............................

4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas.....................................................

21

22

4.8 Análise Estatística..................................................................................................... 24

5 RESULTADOS.................................................................................................................

6 DISCUSSÃO....................................................................................................................

25

38

7 CONCLUSÕES............................................................................................................... 43

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 44

ANEXOS..............................................................................................................................

58

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS





Orientadora: Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild

Co-Orientadora: Profª. Drª. Adriana Augusto de Rezende

NATAL-RN

2010

ii





NATAL-RN

2010

Dissertação de mestrado

apresentada ao curso de Pós-

graduação como pré-requisito

para obtenção do título de mestre

em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal do Rio

Grande do Norte.

iii

COLABORADORES



Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental.

Profa. Drª. Dulcinéia Saes Parras Abdalla


Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas

Profa. Ms. Karine Cavalcanti Maurício de Sena

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Centro de Ciências da Saúde

(CCS), Departamento de Nutrição.

Drª. Maria Sanali Moura de Oliveira Paiva

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Hospital Universitário Onofre

Lopes (HUOL), Departamento de Medicina Clínica.

Paula Cristina Silveira Dias

Nutricionista, Mestranda do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,

Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

iv

FINANCIAMENTOS E BOLSAS CONCEDIDAS

- Edital Universal CNPq: N° do processo – 475781/2008-0

- Edital MCT/CNPq, N° 27/2007: N° do processo - 136201/2008-3

Bolsa de Mestrado (Duração: agosto 2008 a fevereiro 2010).

v

Diana Quitéria Cabral Ferreira

Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas

em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas

Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas

Banca Examinadora

Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild

Orientadora/Presidente


Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental. Faculdade de Ciências Farmacêuticas

(FCF). Universidade de São Paulo (USP).

Profª. Drª. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas

Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Centro de Ciências da Saúde (CCS).

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Natal, 24 de maio de 2010.

vi

Aos meus queridos pais, Ezilda Barros e João Ferreira,

que são para mim um exemplo de amor, dedicação, respeito e companheirismo.

A minha irmã, Daiane Ferreira, pelo apoio incondicional.

Ao meu grande amor, Felipe,

pelas palavras de força nas horas que mais precisava,

me incentivando e sempre estando ao meu lado.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela bênção que ele me concede a cada dia, pela minha

família e por ter ao meu lado pessoas maravilhosas.

A meus pais, João e Ezilda, por sempre me apoiarem nessa longa, árdua e prazerosa

caminhada que é a pós-graduação.

A minha irmã, Daiane, e meu cunhado Daniel, por representarem pra mim mais que pessoas

queridas, são exemplos de superação e dedicação.

Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras de ânimo nos

momentos que mais precisei.

A professora Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild pelo exemplo profissional

que representa em minha vida, pelas oportunidades concedidas desde a graduação, como

aluna de iniciação científica até hoje com o mestrado.

A professora Adriana Augusto de Rezende, pelo apoio, principalmente pela abertura do

Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL), confiando e acreditando no trabalho.

A professora Karine Cavalcanti Maurício de Sena, pela confiança e por ser para mim um

exemplo de dedicação e amor à profissão.

A mestranda Paula C. S. Dias, pelo apoio nos momentos mais difíceis dessa trajetória.

A professora Silvia Maria Franciscato Cozzolino pela abertura concedida em seu

laboratório, pelo total apoio à nossa pesquisa e por ter aceitado colaborar e enriquecer

nosso trabalho.

A professora Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas pela colaboração, desde o

momento da qualificação, até a disponibilidade de estar na minha banca de apresentação do

mestrado.

viii

As alunas bolsistas, Heliane, Renata, Carol e Patricia, pela dedicação e empenho a cada dia

de coleta e análise dos dados.

Aos amigos do Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), principalmente nas pessoas de

Marcela, Freie, Felipe, Gustavo, Clélio, pela ajuda inestimável para desenvolvimento desse

trabalho, bem como pelos momentos de descontração fora do laboratório.

Aos amigos do Laboratório de Nutrição Experimental da FCF-USP, nas pessoas de

Alexandre, Kaluce, Graziela, Suzana e Janaína, pela ajuda nas análises e também na estadia

em São Paulo, terra até então desconhecida para mim, mas que me encanto e onde pude fazer

verdadeiros amigos.

Aos pacientes, pela imensurável contribuição.

ix

RESUMO

FERREIRA, D. Q. C. Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão

gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas. 2010.

67f. [Dissertação] Natal (RN): Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande

do Norte, Natal – RN, 2010.

Este trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do uso da rosuvastatina em pacientes com

aterosclerose, em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como

observar possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes. A

amostra foi constituída de 27 pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença

arterial coronariana submetidos à angioplastia, atendidos no Natal Hospital Center, Natal, RN.

Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina durante 4 meses. Variáveis

antropométricas, como Índice de Massa Corporal (IMC) e Circunferência Abdominal (CA),

foram medidas antes e após o tratamento, bem como o perfil lipídico, glicemia e enzimas

hepáticas (AST e ALT). A dieta dos pacientes também foi analisada utilizando o Recordatório

alimentar de 24 horas. Foram analisadas as concentrações do selênio no plasma e nos

eritrócitos, e também a atividade da enzima Glutationa Peroxidase e a expressão gênica por

PCR em Tempo Real das selenoproteínas GPx1, SelP1 e SelN1. Os pacientes apresentaram

idade média de 61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. Após os quatro meses

de tratamento observou-se redução significativa da CA e, de acordo com o IMC, a maior parte

estava com sobrepeso. A ingestão dos macronutrientes, colesterol, ácidos graxos

polinsaturados, monoinsaturados e saturados foi adequada, porém a de energia e fibras estava

abaixo das recomendações. Com relação a ingestão de selênio foi observada uma alta

prevalência de inadequação. Como esperado, após o tratamento com a rosuvastatina, houve

redução significativa do colesterol total e LDL, bem como da glicemia, o que não foi

observado para o HDL. As concentrações de selênio no plasma e eritrócitos não apresentaram

alterações, se mantendo dentro dos pontos de corte estabelecidos. Foi observado um aumento

significante na atividade enzimática da GPx e na expressão de mRNA do GPX1 e SEPN1,

mas não para o gene SEPP1. Dessa forma, foi verificado que o tratamento com a

rosuvastatina não diminuiu a expressão das selenoproteínas. Mais estudos são necessários

para esclarecer os efeitos da rosuvastatina sobre a expressão gênica de selenoproteínas em

pacientes com aterosclerose.

Palavras-chave: Aterosclerose; Rosuvastatina; Selênio; Selenoproteínas; Expressão gênica.

x

ABSTRACT

FERREIRA, D. Q. C. Assessment of nutritional status of selenium and gene expression of

selenoproteins in patients with atherosclerosis treated with statins. 2010. 67f.

[Dissertation] Faculty of Pharmaceutical, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal –

RN, 2010.

The aim of this study was to determine the effects of the use of rosuvastatin in patients with

atherosclerosis, in relation to blood parameters of selenium and selenoproteins, and also

observe possible changes in gene expression of selenoproteins in these patients. The sample

consisted of 27 adult and elderly patients with a clinical diagnosis of coronary artery disease

undergoing angioplasty, treated at Natal Hospital Center hospital, Natal, RN. Patients were

treated with rosuvastatin 10 mg/day during four months. Anthropometric variables such as

body mass index (BMI) and Waist circumference (WC) were measured before and after

treatment, as well as lipid profile, blood glucose and liver enzymes (AST and ALT). The diet

of the patients was also analyzed using 24-hour diet recall. We analyzed the concentrations of

selenium in plasma and erythrocytes, and also the activity of Glutathione Peroxidase and gene

expression by Real Time PCR of selenoproteins GPx1, SelP1 and SelN1. Patients had mean

age of 61.0 ± 9.4 years, 59.3% were men and 40.7% were women. After four months of

treatment there was significant reduction of CA and, according to BMI, most were

overweight. The intake of macronutrients, cholesterol, polyunsaturated fatty acids,

monounsaturated and saturated was adequate, but the energy and fiber intake was below

the recommendations. Regarding the selenium intake was observed a high prevalence of

inadequacy. As expected, after treatment with rosuvastatin, a significant reduction in total

cholesterol, LDL and glucose, which was not observed for HDL. Selenium concentrations

in plasma and erythrocytes showed no changes, keeping within the established cutoffs. We

observed a significant increase in GPx enzyme activity and mRNA expression of GPX1 and

SEPN1, but not for gene SEPP1. Thus, it was found that treatment with rosuvastatin did not

reduce the expression of selenoproteins. More studies are needed to clarify the effects of

rosuvastatin on gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis.

Key words: Atherosclerosis; Rosuvastatin; Selenium; Selenoproteins; Gene expression.

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAS Ácido Acetil Salicílico

ALT Alanina Aminotransferase

AST Aspartato Aminotransferase

CA Circunferência Abdominal

CT Colesterol total

cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar

DM Diabetes mellitus

DNA Ácido Desoxirribonucléico (Deoxyribonucleic Acid)

DP Desvio Padrão

DRIs Ingestão Dietética de Referência (Dietary References Intakes)

EAR Necessidade média estimada (Estimated Average Requirements)

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

GAPDH Gliceraldeído trifosfato desidrogenase

GPx Glutationa Peroxidase

GPX1 Gene da Glutationa Peroxidase 1

HDL Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein)

HMG-CoA redutase 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima A redutase

HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes

IMC Índice de Massa Corporal

LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein)

NHC Natal Hospital Center

PCR Reação de Polimerase em Cadeia

pH Potencial Hidrogeniônico

RDA Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance)

RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)

RT-PCR Reação de Polimerase em Cadeia por transcriptase reversa

Se Selênio

SelP Selenoproteína P

SEPP1 Gene da Selenoproteína P 1

SelN Selenoproteína N

SEPN1 Gene da Selenoproteína N 1

xii

SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética

TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica

TG Triacilgliceróis

TM Temperatura de Melting

UL Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels)

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

USP Universidade de São Paulo

xiii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das

estatinas..............................................................................................................

5

FIGURA 2 – Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com

rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.............................................

13

FIGURA 3 - Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com


Center...............................................................................................................

15

FIGURA 4 - Fluxograma das atividades do estudo com pacientes com aterosclerose

tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital

Center.................................................................................................................


de acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital

Center...............................................................................................................


de acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital

Center.................................................................................................................

16

27

27

FIGURA 7 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de


atendidos no Natal Hospital Center......................................................................

29


aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center....

30

FIGURA 9 - Percentual de alterações do perfil lipídico dos pacientes com aterosclerose

após o tratamento com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........

33

xiv

FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas

de mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com


Center. .......................................................................................................

37

xv

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a

avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH.................

23

TABELA 2 - Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados

com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.....................................

25

TABELA 3 - Dados antropométricas dos pacientes com aterosclerose tratados com

rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........................................

26

TABELA 4 – Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com


Center.............................................................................................................

TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com


Center...................................................................................................................


rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................................

28

31

32

TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos

no Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de

referência para perfil lipídico e glicemia....................................................

34

TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade

enzimática da Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose

tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................

35

TABELA 9 – Variação da expressão de RNAm dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1 dos

pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no

Natal Hospital Center..............................................................................

36

xvi

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo

o IMC..........................................................................................................

17


Circunferência abdominal.....................................................................................

18

xvii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 2

1.1 Aterosclerose e Estatinas.......................................................................................... 2

1.2 Selênio e Selenoproteínas......................................................................................... 6

2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................. 10

3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 11

3.1 Objetivo Geral........................................................................................................... 11

3.2 Objetivos Específicos................................................................................................ 11

4 CASUÍSTICA E MÉTODOS......................................................................................... 11

4.1 Protocolo Experimental............................................................................................. 11

4.2 Parâmetros Antropométricos..................................................................................... 17

4.3 Análise da Dieta........................................................................................................ 18

4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas...................... 19

4.5 Análise de Selênio..................................................................................................... 20

4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase............................

4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas.....................................................

21

22

4.8 Análise Estatística..................................................................................................... 24

5 RESULTADOS.................................................................................................................

6 DISCUSSÃO....................................................................................................................

25

38

7 CONCLUSÕES............................................................................................................... 43

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 44

ANEXOS..............................................................................................................................

58

1

1. Introdução

1.1 Aterosclerose e Estatinas

A aterosclerose é uma doença inflamatória, progressiva e caracterizada pelo acúmulo

de lípides e componente fibroso em grandes artérias. O processo crônico da aterosclerose

envolve o endotélio arterial culminando com complicações aterotrombóticas, podendo ser

causado por uma resposta inflamatória e estresse oxidativo desencadeados por partículas de

lipoproteína de baixa densidade (LDL) oxidada devido a presença de radicais livres (PAI et

al., 2004; STEPHENS; KHANOLKAR; BAIN, 2009).

Atualmente a doença arterial coronariana (DAC) e o acidente vascular cerebral

(AVC), principais manifestações clínicas da aterosclerose, constituem as maiores causas de

morbidade e mortalidade no mundo ocidental (NISSEN et al., 2006). Projeções da

Organização Mundial da Saúde para 2020 indicam que estas doenças continuarão aumentando

em países do leste europeu e em nações em desenvolvimento, consolidando a perspectiva de

maior causa de morte no mundo (WHO, 2004). No Brasil, as doenças cardiovasculares

representam a principal causa de morte nos indivíduos acima de 40 anos (BRASIL, 2006),

além do mais, seu tratamento representa um grande ônus financeiro (RIBEIRO et al., 2005).

A doença aterosclerótica se manifesta em nível das artérias coronárias como angina de

peito e infarto do miocárdio; nas artérias carótidas e cerebrais como acidente vascular

cerebral; nas artérias dos membros inferiores como a claudicação intermitente, caracterizada

como dor com a marcha que alivia com o repouso; e como lesões cutâneas, levando ao risco

de amputação nos casos mais graves se não tratado (PALINSKI; NAPOLI, 2002).

Dentre os fatores de risco para doenças cardiovasculares estão a idade,

hipercolesterolemia, diabetes mellitus, tabagismo, hipertensão arterial sistêmica,

hipertrigliceridemia, obesidade e história familiar de cardiopatia isquêmica; além da qualidade

da dieta e estilo de vida (RODRÍGUEZ-MORÁN et al., 2008; SARAÇ et al., 2007; SBC,

2007; STEPHENS et al., 2004).

O papel das dislipidemias na gênese da aterosclerose coronariana está bem

estabelecido. A hipercolesterolemia é um dos mais importantes fatores de risco para o

desenvolvimento das doenças cardiovasculares, principalmente a aterosclerose. O colesterol

plasmático está distribuído entre três classes de lipoproteínas, incluindo a lipoproteína de

baixa densidade (LDL), a lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e a de alta

densidade (HDL). O risco para as doenças cardiovasculares (DCV) está possivelmente

correlacionado com a LDL colesterol (LDL), desde que essa partícula esteja inversamente

2

associada com a HDL (SHOJI et al., 2009). As concentrações elevadas do colesterol total e

LDL, diminuição da HDL e aumento nos teores de triacilgliceróis, também predispõem à

doença coronariana. (SEMAN et al., 1999; ROMALDINI et al., 2004). Apesar disso, alguns

mecanismo fisiopatológicos de desenvolvimento das DCV ainda permanecem parcialmente

elucidados. Atualmente, vem aumentando o interesse no desenvolvimento de marcadores

alternativos, como os marcadores plasmáticos de estresse oxidativo, que podem ter um papel

importante na predição de risco cardiovascular (STEPHENS; KHANOLKAR; BAIN, 2009).

A utilização do oxigênio nos sistema biológico leva a formação de espécies reativas de

oxigênio (ERO’s), que podem causar danos à biomoléculas (DNA, lipídeos e proteínas). O

estresse oxidativo é descrito como um desequilíbrio entre agentes pró-oxidantes e

componentes antioxidantes, o que pode ser conseqüência de uma inadequada ingestão de

nutrientes (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). Os desequilíbrios da peroxidação lipídica das

estruturas celulares nas doenças cardiovasculares ocorrem devido ao aumento na produção de

radicais livres e deficiência nos mecanismos de defesa antioxidantes (STEPHENS;

KHANOLKAR; BAIN, 2009; SOLIMAN, 2008).

A oxidação da LDL na parede arterial pode levar a formação de aldeídos altamente

reativos, principalmente malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal, que reagem com

proteínas da matriz extracelular na parede arterial. A ativação da resposta imune contra

componentes da matriz extracelular na placa aterosclerótica pode ser considerada fundamental

no desenvolvimento da aterosclerose e suas complicações, pois promove a instabilidade da

capa fibrosa da lesão aterosclerótica. Os macrófagos e os linfócitos produzem citocinas pró-

inflamatórias, como fator de necrose tumoral-alfa (FNT-α), interferon-gama (IFN-γ),

interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) que mantêm o estímulo quimiotático para as

células do sistema imune e inibem a síntese de colágeno pelas células musculares lisas

(ORTIZ-MUÑOZ et al., 2009; DUNÉR et al., 2009).

Segundo Artwohl et al. (2009), as altas concentrações de ácidos graxos saturados

circulantes, oriundos da dieta, induz à apoptose de células musculares lisas do sistema

vascular, contribuindo para a progressão prematura da aterosclerose, ou mesmo para a

instabilidade da placa aterosclerótica. Por outro lado, existe o efeito protetor de alguns tipos

de gorduras, como é o caso dos ácidos graxos monoinsaturados e polinsaturados, que

contribuem para a prevenção do aparecimento de trombos e arritmias cardíacas (CALDER,

2008; ERKKILA et al., 2008).

Os nutrientes antioxidantes, a exemplo das vitaminas E e C, os carotenóides e alguns

minerais, como o selênio, cobre e zinco, são capazes de seqüestrar as ERO’s e impedir sua

3

ação oxidativa sobre as membranas (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). A vitamina E atua

de forma protetora na doença cardiovascular, devido aos mecanismos de inibição da oxidação

da LDL e na diminuição da adesão de monócitos e plaquetas ao endotélio (JIALAL; GRUND,

1992). A vitamina C, por sua vez, age transferindo elétrons para radicais de tocoferol em

membranas ou lipídeos, evitando também a oxidação da LDL (KNEKT; RITZ; PEREIRA,

2004). O cobre e o zinco são minerais essenciais na defesa antioxidante do corpo,

principalmente por serem incorporados na enzima CuZn superóxido dismutase (CuZn-SOD),

enquanto o selênio participa da estrutura da enzima glutationa peroxidase (GPx) (KOSAR et

al., 2006).

As células também possuem um sistema de defesa contra as ERO’s, representado

pelas enzimas antioxidantes, que apresentam substratos específicos e diferentes estruturas e

localização. Dentre as principais enzimas antioxidantes estão a superóxido dismutase (SOD),

a catalase e a glutationa peroxidase (GPx) (NIKI et al., 2005).

No tratamento da aterosclerose preconiza-se uma abordagem multifatorial e

simultânea em relação a todos os fatores de risco, priorizando-se inicialmente a mudança do

estilo de vida, incluindo a terapia nutricional, a atividade física, a abstenção do tabagismo,

associadas ou não ao tratamento farmacológico específico (SBC, 2007).

A angioplastia com balão tem recebido ultimamente maior atenção no tratamento do paciente

com doença arterial oclusiva periférica, pelo fato de ser um procedimento relativamente de

baixo risco, pouco invasivo e com possibilidade de repetição. O desenvolvimento dos

sistemas de guias e cateteres representa um avanço importante na técnica da angioplastia

transluminal percutânea, tornando o procedimento possível em situações anatômicas

desfavoráveis, quer seja pela configuração da lesão ou do calibre do vaso afetado (OSTERNE

et al, 1999; PEREIRA; GRUDTNER, 2003).

Os benefícios da terapia com hipolipemiantes em pacientes com hipercolesterolemias

e fatores de risco para DAC são bem documentados, principalmente em indivíduos idosos

(KJEKSHUS et al., 2007; STOCKL et al., 2008). Recomenda-se também o uso de inibidores

da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A Redutase (HMG-CoA redutase), uma das

enzimas chave na síntese intracelular do colesterol, que apresentam efeitos na função

vasomotora do endotélio, na inflamação e na trombose. Além da redução do colesterol sérico,

as estatinas têm ação reguladora na função endotelial, aumenta a estabilidade de placas

ateroscleróticas, diminuem o estresse oxidativo, a inflamação e a resposta trombogênica

(KINLAY, 2005; CAMPO; CARVALHO, 2007).

4

As estatinas são os fármacos mais utilizados nas hiperlipidemias em nível de

prevenção primária e secundária, com o propósito de diminuir as concentrações de

lipoproteínas plasmáticas ricas em colesterol e reduzir os riscos de DAC. As formas

comerciais mais usadas são: lovastatina (Mevacor®), pravastatina (Pravachol

®), sinvastatina

(Zocor®), fluvastatina (Lescol

®), atorvastatina (Lipitor

®) e rosuvastatina (Crestor

®) (CAMPO;

CARVALHO, 2007).

As estatinas atuando como inibidores da enzima HMG-CoA redutase, agem

consequentemente impedindo a conversão da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-

CoA) em ácido mevalônico e inibindo os primeiros passos da biossíntese de colesterol na via

do Mevalonato (Figura 1). O próximo produto dessa cascata é o isopentenil pirofosfato (IPP),

o qual serve de substrato para a isopentenil transferase Sec tRNA (selenocisteína tRNA), que

está relacionada com a expressão gênica das selenoproteínas (CARLSON et al., 2004;

MOOSMANN; BEHL, 2004a).

De acordo com Moosmann e Behl (2004b), a inibição da isopentilação da Sec tRNA

resulta na redução significativa das selenoproteínas. Esse efeito pode explicar os efeitos

adversos das estatinas sobre o sistema imune, neuromuscular e hormonal (hormônios

tireoidianos).

5

IPP – Isopentenil pirofosfato.

FONTE: Adaptado de Moosmann e Behl (2004a).

FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das estatinas.

De uma maneira geral, as estatinas são fármacos bem tolerados pelo organismo, no

entanto é possível observar alguns efeitos indesejáveis discretos, como distúrbios

gastrintestinais, aumento das concentrações plasmáticas das enzimas hepáticas, insônia,

miosite e rabdomiólise (THOMPSON; CLARKSON; KARAS, 2003). Esses efeitos adversos

durante o tratamento com estatinas são raros e dependentes da dose. No entanto, para

identificar possíveis efeitos adversos recomenda-se a dosagem das concentrações basais de

creatinofosfoquinase (CK) e de transaminases (especialmente de ALT) e a repetição na

primeira reavaliação ou a cada aumento de dose (LINARELLI; POTT JÚNIOR, 2008; SBC,

2007).

6

Takarada et al. (2009) identificaram que o efeito protetor do tratamento com estatinas

deve-se ao fato destes fármacos aumentarem a capa fibrosa sobre a placa aterosclerótica

coronariana, o que produz uma baixa vulnerabilidade da placa e evita o infarto agudo do

miocárdio.

Nissen et al. (2006) observaram que uma terapia de alta potência com estatina

utilizando 40mg/dia de rosuvastatina, alcançou a redução da LDL e o aumento na

concentração de HDL, resultando em regressão significativa da aterosclerose. Pacientes

idosos que fizeram uso de rosuvastatina apresentaram redução no número de internações

oriundas de complicações cardiovasculares; porém não houve redução sobre o número de

mortes (KJEKSHUS et al., 2007).

1.2 Selênio e Selenoproteínas

O selênio (Se) como essencial para humanos tem sido pesquisado quanto à sua

participação em compostos essenciais para homeostase corporal (REILLY, 2006), cuja

demanda corporal aumenta, principalmente, devido seu papel importante no sistema

antioxidante (HAMBIDGE, 2003). O selênio está envolvido em diversas atividades

metabólicas, via selenoproteínas, que são essenciais para a proteção contra os danos

oxidativos e na regulação do sistema imunológico, atuando na diminuição da resposta do NF-

kB ao mecanismo de pró-inflamação da célula endotelial (ZHANG et al., 2002; SHRIMALI

et al., 2008). Altas concentrações de selênio melhoram as funções das células do sistema

imune inato e adaptativo (HOFFMANN et al., 2007).

O alimento mais rico em selênio é a castanha do Brasil, conhecida com castanha do

Pará, que tem em média 55 μg de Se/castanha (FREITAS et al., 2008). O selênio está

associado a proteínas nos tecidos, por conseguinte os outros alimentos que mais contribuem

para o aporte de Se são os peixes, o fígado e as carnes (BURK; HILL; MOTLEY, 2003). Os

produtos de laticínios e ovos possuem baixas concentrações de selênio, mas podem ser fontes

significativas nos países em que seu consumo é alto. Os grãos e as sementes, entretanto,

variam no conteúdo de selênio de acordo com o solo em que foram cultivadas. Frutas e

hortaliças, em geral, apresentam baixos teores de selênio e fornecem menos de 8% do aporte

de Se na dieta (COMBS JUNIOR, 2001), podendo estar presente na forma de selênio

elementar, selenito e selenato em associação com outros elementos (REILLY, 2006).

7

Um estudo nacional avaliou o consumo diário médio de selênio em diferentes grupos

etários e cidades do Brasil. O maior consumo ocorreu em crianças da cidade de Macapá (AP)

(107μg de Se/dia), seguido de adultos de Manaus (AM) (98μg de Se/dia) devido ao consumo

de castanha do Brasil. Crianças residentes em São Paulo (SP) apresentaram concentrações

médias diárias mais baixas (26,3μg de Se/dia) (MAIHARA et al., 2004).

A biodisponibilidade e a toxicidade do Se consumido dependem da sua forma

química, sendo os compostos orgânicos mais biodisponíveis e menos tóxicos do que os

inorgânicos, como selenito e selenato (TINGGI, 2003).

Para Finley (2006), a absorção de todas as formas de Se é relativamente alta (70 a

95%), mas pode variar dependendo da fonte e do indivíduo. O autor comparou a

biodisponibilidade de Se em cereais, carnes, peixes e outros produtos e verificou que o Se foi

mais biodisponível em alimentos de origem vegetal. Analisando alimentos consumidos no

Brasil, Ferreira et al. (2002) verificaram que as frutas, legumes e tubérculos apresentaram

baixos teores de Se, enquanto que valores superiores foram encontrados nos peixes (11 a 80

μg.100 g-1), fígado (44 μg.100 g-1), gema de ovo de galinha (23 a 55 μg.100 g-1) e no feijão

preto, cuja concentração de Se variou de 0,5 a 23,9 μg.100 g-1

A Ingestão Dietética de Referência (Dietary Reference Intakes - DRIs) engloba 4

valores de referência de ingestão de nutrientes e que devem ser utilizados para planejar e

avaliar dietas para pessoas saudáveis. Na avaliação em grupo é utilizada a Necessidade média

estimada (Estimated Average Requirements- EAR) que orresponde a um valor de ingestão

diária de um nutriente que se estima que supra a necessidade de metade (50%) dos indivíduos

saudáveis de um determinado grupo de mesmo gênero e estágio de vida. A EAR para o

mineral selênio é 45 μg/dia.

Na Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance - RDA) para o

Se é de 55 μg/dia, para homens e mulheres adultos. A RDA é utilizada na avaliação individual

e considera que 97% dos indivíduos têm suas necessidades supridas, ela é baseada na

quantidade necessária de selênio para maximizar a atividade da enzima GPx, enquanto que o

valor do Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels -UL) de 400

μg/dia foi fixado considerando o risco de selenose (NRC, 2000).

A deficiência grave do selênio pode causar uma doença conhecida como Doença de

Keshan, uma forma de cardiomiopatia, identificada inicialmente no nordeste da China. Essa

deficiência pode estar relacionada com doenças, como câncer, doenças cardiovasculares e

problemas hepáticos (SAITO et al., 2003; HATFIELD; BARRY; GLADYSHEV, 2006). O

Se tem sido objeto de pesquisas sobre o possível efeito anticarcinogênico (WHANGER,

8

2004), segundo este autor, doses de 100-200 μg de Se/dia inibiriam danos genéticos e o

desenvolvimento de câncer em humanos. Entretanto, para Silvera e Rohan (2007) não há

evidência consistente da associação entre baixas concentrações de Se e aumento no risco de

alguns tipos de câncer. A deficiência de selênio pode levar a redução significativa na

atividade das selenoproteínas, incluindo as enzimas GPx, DIOs e TRs (LU; HOLMGREN,

2009; RENKO et al., 2009).

Como análogo dos aminoácidos sulfurados, a forma orgânica de selênio está presente

como um produto direto da incorporação de Se em proteínas em substituição ao enxofre

(selenometionina e selenocisteína-Sec), mas pode também ser incorporado de maneira

inespecífica em proteínas como selenometionina (KRYUKOV et al., 2003). Tais mecanismos

diferem das metaloproteínas ou quelatos, nos quais ocorre simplesmente uma complexação

com grupos funcionais das proteínas (SUZUKI, 2005).

Baixos níveis de selênio foram associados à ocorrência de aterosclerose (GONZÁLEZ et al.,

2006). Em estudo de observação de aproximadamente mil homens, com idades entre 55 e 74

anos, baixos níveis de selênio sérico foram associados a DCV e AVC (VIRTAMO et al.,

1985)

As selenoproteínas incorporam o selênio na estrutura do resíduo de selenocisteína, que

é ionizado inteiramente em pH fisiológico e atua como um catalisador redox muito eficiente.

Existem no mínimo 25 selenoproteínas identificadas; a selenoproteoma humana consiste de

17 famílias de selenoproteínas, formadas de vários genes, porém com funções biológicas

semelhantes. Muitas dessas selenoproteínas são enzimas, porém algumas ainda não foram

caracterizadas quanto as suas funções fisiológicas (KRYUKOV et al., 2003; PAPP;

HOLMGREN; KHANNA, 2010). De acordo com Castellano et al. (2005) e Papp et al.(2007),

apenas 12 selenoproteínas foram caracterizadas quanto as funções no organismo, dessas,

cinco são GPx, três são deiodinases da iodotironina (DIOs), três são tioredoxina redutases

(TRs) e uma selefosfatase sintetase 2 (SPS2). As demais selenoproteínas foram registradas de

acordo com o seu tamanho (Sep 15 – selenoproteína com 15kDa) ou conforme a sequência do

alfabeto: SelH, SelI, SelK, SelM, SelN, SelO, SelP/SepP, SelR, SelS, SelT, SelV e SelW.

As selenoproteínas com papel antioxidante possuem a capacidade de remover os

radicais livres, por exemplo, peróxidos de hidrogênio, hidroperóxidos e ERO’s, os quais, em

desequilíbrio, oxidam os lipídeos da membrana, causando danos a sua estrutura (peroxidação

lipídica), o que pode resultar na aterosclerose (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).

A glutationas peroxidases (GPx) são enzimas da família das selenoproteínas capazes

de reduzir o peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroperóxidos orgânicos a água (H2O) e

9

alcoóis correspondentes, utilizando a glutationa reduzida como co-substrato (HAMANISHI et

al., 2004).

Até o momento seis tipos de glutationas peroxidases foram descritas em humanos:

GPx1 – citosólica, GPx2 – gastrointestinal, GPx3 – plasmática, GPx4 – fosfolipídeo

hidroeroxidase, Gpx5 – epididimal e GPx6 – olfatória. A glutationa citosólica (GPx1) é

expressa em vários tecidos, principalmente em eritrócitos, rins e fígado, e sua deficiência

pode estar envolvida na disfunção endotelial e anormalidades cardíacas, sendo dessa forma

considerada uma selenoproteína protetora dos vasos evitando o estresse oxidativo e posterior

aterogênese. O gene que codifica a GPx1 (GPX1) localiza-se no cromossomo 3 (3p21.2) e

possui dois exons (FORGIONE et al., 2002a; FORGIONE et al., 2002b).

Há ainda a GPx2 expressa principalmente no trato gastrointestinal, a GPx3

(extracelular) que é secretada por glicoproteínas e está presente principalmente no plasma,

mas também é expressa em rins, coração, pulmões e placenta; enquanto a fosfolipídeo

hidroperóxido GPx (GPx4) possui atuação específica na peroxidação dos fosfolipídeos

(IMAI; NAKAGAWA, 2003), e pode estar envolvido no controle da morte celular por

apoptose (NOMURA et al., 2001). A Gpx5 e GPx6 não possuem selenocisteína ou selênio, a

GPx5 está expressa principalmente no epidídimo. A GPx6 ainda não está bem caracterizada

quanto as funções e relações com doenças, porém sabe-se que participa da detoxificação do

peróxido de hidrogênio e sua expressão está restrita ao tecido olfatório de embriões e adultos

(KRYUKOV et al., 2003; REEVES; HOFFMANN, 2009).

A Selenoproteína P (SelP) possui dez átomos de selênio por molécula, tem ação

antioxidante e é a principal selenoproteína presente no plasma. Essa selenoproteína,

juntamente com a GPx3 extracelular, contêm mais de 90% do selênio plasmático, e serve

como proteína de transporte e distribuição corporal ( ARTEEL; SIES, 2001; BURK; HILL;

MOTLEY, 2003; HILL et al., 2003; BURK; HILL, 2009). O gene SEPP1 localiza-se no

braço curto do cromossomo 5 (5p12) (REDERSTORFF; KROL; LESCURE, 2006).

A Selenoproteína N (SelN) está envolvida na fisiologia muscular, de forma que

algumas formas de miopatias, caracterizadas por hipotonia, fraqueza, rigidez espinhal,

distrofias musculares estão ligadas ao gene da SelN (SEPN1) (REDERSTORFF; KROL;

LESCURE, 2006). Os mecanismos moleculares que envolvidos nas miopatias, dependentes

da SelN, ainda não foram esclarecidos, provavelmente pela falta da caracterização funcional.

Essa selenoproteína está distribuída por todo o organismo e é expressa principalmente na

membrana do Retículo Endoplasmático (RE) celular (PETIT et al., 2003; LESCURE et al.,

2008). O gene SEPN1 está localizado no cromossomo 1 (1p35.36). Assim, uma das hipóteses

10

é de que a SelN esteja envolvida na maturação de outras proteínas relacionadas ao

desenvolvimento do tecido muscular (MOGHADASZADEH; BEGGS, 2006; PAPP et al.,

2007).

Considerando a importância da nteração fármaco-nutrientes em terapias

medicamentosas crônicas, este estudo propõe-se a verificar os efeitos do uso da rosuvastatina

no estado nutricional de selênio, em parâmetros enzimáticos e na expressão gênica de

selenoproteínas.

2. Justificativa

A aterosclerose é uma doença de importância mundial, tendo em vista sua alta

prevalência e complicações, que são responsáveis por elevados índices de morbi- mortalidade

em todo o mundo. Sabe-se que é uma doença inflamatória crônica, com evolução lenta, cujas

lesões iniciais podem começar na infância e evoluírem gradualmente por toda a vida,

principalmente com a exposição a fatores de risco. No tratamento da aterosclerose, as

estatinas são os principais fármacos de escolha, por inibirem a biossíntese do colesterol e

apresentarem efeitos na função vasomotora do endotélio, inflamação e trombose. Alguns

trabalhos apontam para o fato das estatinas interferirem na síntese das selenoproteínas,

sugerindo que muitos dos efeitos colaterais das mesmas poderiam acontecer em decorrência

deste fato, especialmente as miopatias.

O selênio é um importante agente antioxidante, sendo o único a exercer funções

biológicas através da incorporação em proteínas (selenoproteínas) e no aminoácido cisteína.

As selenoproteínas possuem diferentes funções no organismo, como ação antioxidante (por

exemplo, GPx e SelP), maturação celular (SelN - miócitos), regulação hormonal (TRs), entre

outras.

O presente estudo torna-se relevante, pois traz informações importantes sobre o efeito

das estatinas na expressão gênica de determinadas selenoproteínas (GPx, SelP e SelN) e sobre

a atividade de enzimas antioxidantes (GPx) dependentes de selênio.

11

3. Objetivos

Objetivo Geral

Verificar os efeitos do uso de estatinas (rosuvastatina) em pacientes com aterosclerose,

em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como observar

possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes.

Objetivos específicos

Caracterizar os pacientes quanto aos parâmetros antropométricos e

bioquímicos, tais como o perfil lipídico, glicemia e enzimas hepáticas;

Determinar as concentrações de selênio plasmático e eritrocitário;

Avaliar a atividade enzimática da Glutationa Peroxidase;

Estudar a expressão do mRNA das selenoproteínas: GPx 1, Selenoproteína P1

e, Selenoproteína N1 em leucócitos totais de sangue periférico;

Avaliar a dieta (ingestão de calorias, proteínas, lipídeos, carboidratos e

selênio), e estabelecer correlações com os parâmetros de selênio, atividade da

enzima Glutationa Peroxidase e expressão gênica das selenoproteínas.

4.Casuística e Métodos

4.1 Protocolo Experimental

Trata-se de um estudo longitudinal quase-experimental. A amostra foi composta por

pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença arterial coronariana

submetidos à angioplastia, atendidos no Serviço de Hemodinâmica do Natal Hospital Center

(NHC), localizado em Natal, Rio Grande do Norte (RN), no período de junho de 2008 a

janeiro de 2009.

Para o cálculo da amostra foi utilizado o método proposto por Zar (1999) com poder

de 80% com base na variável ―Colesterol plasmático total‖, uma vez que existem estudos

consistentes com amostras robustas demonstrando os valores médios e variações desta

medida, a partir dos quais a representatividade de resposta seria obtida com uma amostra

mínima de 16 pacientes.

12

A pesquisa é um desdobramento do projeto ―Efeito da Suplementação com minerais

antioxidantes em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas‖. O referido projeto foi

aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo, Faculdade de

Ciências Farmacêuticas (FCF/USP) sob o número CAAE 0009.0.294.018-06 e no Comitê de

Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), sob n° de registro 026/06

– Adendo (Anexo A).

Todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido –

TCLE. Foram incluídos na pesquisa pacientes adultos e idosos de ambos os gêneros com

diagnóstico de aterosclerose coronariana por angiografia, com estenose ≥ 60% em uma ou

mais artérias, associado ao diagnóstico de angina estável. Foram considerados como critérios

de não-inclusão a presença de complicações cardíacas graves ou outras doenças como as

hematológicas, auto-imunes, hepatopatias, insuficiência renal, neoplasias, infecções

associadas, pós-operatório, uso de antiácidos, antibióticos, suplementos vitamínico-minerais,

etilismo e tabagismo.

Foram abordados durante o estudo 76 pacientes, porém a amostra final do estudo foi

composta por 27 pacientes (Figura 2).

13

FIGURA 2 - Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com

rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.

Após a seleção dos pacientes foi preenchida uma ficha de avaliação individual para

obtenção de dados pessoais e clínicos. Em seguida, foi realizada a primeira avaliação

antropométrica (Índice de Massa Corpórea e Circunferência Abdominal), dietética (calorias,

macronutrientes, colesterol e selênio) e a coleta de 20mL de sangue total, com o paciente em

jejum de 12 horas (Figura 3), para posterior análise do perfil lipídico (Colesterol Total, LDL,

HDL, Triacilgliceróis), glicemia, enzimas hepáticas (Aspartato Aminotransferase - AST e

Alanina Aminotransferase – ALT); selênio no plasma e eritrócitos; atividade enzimática da

glutationa peroxidase (GPx); e análise da expressão do mRNA das selenoproteínas (glutationa

peroxidase 1, selenoproteína P1 e N1) (Figura 3).

14

Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina do Laboratório

Astra|Zeneca (Crestor) durante 4 meses, com retornos mensais para avaliação da intervenção,

período em que foram feitas as análises antes de iniciar o tratamento - tempo Inicial (T0) e

após o tratamento – tempo Final(T1), conforme Figura 4.

15

FIGURA 3 – Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos

no Natal Hospital Center.

HDL: Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein); ALT: Alanina Aminotransferase; AST: Aspartato

Aminotransferase.

16

FIGURA 4 – Fluxograma das atividades do estudo coms pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.

17

4.2 Parâmetros Antropométricos

4.2.1 Índice de Massa Corporal (IMC)

A avaliação antropométrica foi feita por meio do Índice de Massa Corpórea (IMC),

que corresponde à razão do peso pela altura ao quadrado (Peso/Altura²), recomendado pela

Organização Mundial de Saúde (World Health Organizations - WHO, 1998). Para

mensuração do peso, foi utilizada balança digital Tanita®, modelo MEA-03140, com

capacidade para 150 kg e precisão de 100 gramas, estando os indivíduos descalços e com o

mínimo possível de roupa e adereços.

A estatura foi aferida em centímetros, com auxílio de estadiômetro (marca: WCS)

medindo 216cm com plataforma. Os indivíduos foram medidos descalços em posição

ortostática, com os olhos no plano Frankfört, com as costas e a parte posterior dos joelhos

encostados à parede. O estado nutricional antropométrico dos pacientes foi diagnosticado

conforme Quadro 1.

FONTE: WHO (1998).

QUADRO 1 – Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo o

IMC.

4.2.2 Circunferência Abdominal (CA)

A Circunferência abdominal foi mensurada com precisão de 0,1cm, sendo utilizada

uma fita métrica extensível e inelástica com 200cm de comprimento posicionada na menor

curvatura localizada entre o último arco costal e a crista ilíaca, estando o indivíduo ereto com

os braços ao longo do corpo e os pés unidos. Essa medida foi realizada duas vezes para cada

paciente. A classificação foi realizada segundo pontos de corte preconizados pela

Organização Mundial de Saúde (World Health Organizations - WHO, 1998) (Quadro 2).

18

FONTE: WHO (1998).


Circunferência abdominal.

4.3 Análise da Dieta

Foi utilizado o método de Recordatório de 24 horas (R24h) para avaliar a ingestão

dietética atual, que consiste no registro da informação sobre a ingestão alimentar (alimentos e

bebidas) do dia anterior. Esse instrumento foi aplicado cinco vezes e em dias diferentes,

incluindo um dia de final de semana, com o intuito de registrar o consumo habitual dos

pacientes (Figura 4).

Para auxiliar na aplicação do R24h, foi utilizado um álbum fotográfico com uma

compilação de imagens de utensílios, alimentos e preparações com diferentes medidas

caseiras para melhor identificar as porções consumidas pelos pacientes (ZABOTTO; VIANA;

GIL, 1996; ANDRADE; MORAIS, 2004). A definição dos tamanhos das porções foi baseada

nas medidas fornecidas por Tomita e Cardoso (2000), Pinheiro et al. (2004) e Araújo e Guerra

(2007). Os alimentos que não foram encontradas as medidas foram pesados em balança digital

eletrônica, no Laboratório de Técnica Dietética do Departamento de Nutrição da UFRN.

A dieta foi avaliada quanto a energia, macronutrientes, colesterol e selênio utilizando-

se o Software Virtual Nutri Plus® (PHILIPPI, 2008) e os resultados apresentados como a

média dos cinco R24h. Os alimentos/preparações de interesse foram adicionados ao banco de

dados, sendo o cálculo nutricional realizado com o auxílio de Tabelas de Composição de

Alimentos (Tabela Brasileira de Composição de Alimentos – TACO, 2006 e United States

Department of Agriculture – USDA, 2003).

A adequação da ingestão dietética foi baseada nas recomendações dietéticas da SBC

(2007) para macronutrientes, fibras e colesterol (Anexo B), enquanto que para o Se, como não

há recomendação específica para indivíduos com aterosclerose, foi utilizada a EAR (Estimate

Average Requirement) (IOM, 2000).

Para estimar a distribuição da ingestão alimentar habitual do grupo foram aplicados

testes estatísticos para se obter a variância intra e interpessoal a partir da aplicação de análise

19

de variância (One-Way ANOVA) (SLATER; MARCHIONI; FISBERG, 2004). Em seguida

os nutrientes foram ajustados pela energia, segundo Willett, Howe e Kushi (1997). A

prevalência de ingestão inadequada de Se foi obtida utilizando-se o EAR como ponto de corte

(IOM, 2000).

4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas

As análises bioquímicas foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas do

HUOL, UFRN- RN. O soro dos pacientes foi separado com centrifugação a 3.500rpm durante

15 minutos a 4°C, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha). As análises foram

realizadas por meio do aparelho Analisador Imunoquímico da marca Olympus®, modelo

AU400e (Olympus America Inc., Melville, EUA), utilizando-se o kit do Laboratório

Olympus®.

O perfil lipídico foi avaliado pela concentração no soro de colesterol total, lipotroteína

de alta densidade (High Density Lipoprotein – HDL) e triacilgliceróis. Também foi

determinada a concentração da lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein –

LDL, que foi que foi calculada pela equação de Friedewald (SBC, 2007). Para identificação

de dislipidemias foram utilizados os valores de referência preconizados pela Sociedade

Brasileira de Cardiologia (2001).

Nas determinações das glicemias de jejum e Aspartato Aminotransferase (AST),

também conhecida como Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGO) e Alanina

Aminotransferase (ALT) ou Transaminase Glutâmica Pirúvica (TGP) foram considerados

para avaliação os valores sugeridos pelo Laboratório Olympus® (Anexo C).

4.5 Análise de Selênio

A análise do selênio foi realizada no Laboratório de Nutrição e Minerais, Faculdade de

Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo (USP). Todo material utilizado para

análise de minerais foi desmineralizado em banho de ácido nítrico (HNO3) à 20%, por no

mínimo 12 horas e enxaguadas dez vezes com água deionizada ou água ultrapura (Milli-Q®

),

logo após colocados em estufa de aço inoxidável até que não apresentassem resíduos de água,

em seguida armazenados em sacos plástico. Esses procedimentos visaram reduzir a

contaminação por minerais. Todos os reagentes utilizados nas análises apresentaram um grau

de pureza analítica (P.A.). A água utilizada no preparo de soluções e diluição das amostras foi

a ultrapura (Milli-Q®).

20

A amostra foi preparada a partir de 6,0mL de sangue total coletado em tubo com

EDTA. O plasma foi separado após centrifugação a 3.500rpm, a 4°C, durante 15 minutos,

utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha). e armazenado à -80°C para posterior

análise. Em seguida foram realizadas 3 lavagens com solução salina (NaCl) a 0,9% com

rotação 10.000rpm a 4°C, durante 10 minutos, utilizando-se a centrífuga IEC MultiRF®

(Thermo Electron Corporation, EUA). Os eritrócitos foram armazenados a -80°C até o

momento da análise.

A análise do selênio foi realizada por espectrofotometria de absorção atômica (marca

HITACHI, modelo Z-5000; Japão) com geração de hidretos acoplados à cela de quartzo, de

acordo com a padronização de Gonzaga (2002). Na fase 1 do experimento foi acrescido 10mL

de ácido nítrico 68% (PA Merck®) às amostras de 250μL de plasma ou eritrócito, em

triplicata, e no branco, para digestão overnight. No dia seguinte, foi realizada a digestão das

amostras em bloco digestor a uma temperatura de 150°C, até que as amostras obtivessem

coloração clara. Após a digestão, as amostras foram acrescidas de 5mL de ácido clorídrico

(HCl) 1,2N e, posteriormente, aquecidas até a redução do Se (VI) em Se (IV). Foi preparada

uma solução de borohidreto de sódio (NaBH4), utilizada como reagente redutor no processo

de determinação do selênio. A curva de calibração foi feita a partir de diluição de uma solução

de trabalho com concentração conhecida. Os resultados das leituras em triplicatas foram

expressos em microgramas por litro (μg/L), considerando o coeficiente de variação inferior a

10% entre as triplicatas.

Para controle da exatidão e reprodutibilidade do método de análise de selênio no

plasma e eritrócitos, utilizou-se o material de referência certificado Seronorm Trace Elements

Serum®, preparados de acordo com as recomendações do fabricante o em água ultrapura e

observando-se os valores da curva de calibração.

Foi determinada a concentração de hemoglobina no eritrócito com a finalidade de

expressar os resultados em termos de massa de selênio e GPx / massa de hemoglobina. Essa

análise foi realizada no Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), Centro de Ciências da

Saúde, UFRN-RN.

Para as análises da concentração de hemoglobina no eritrócito foram utilizados kits da

Labtest® (Brasil). Uma alíquota de 300μL de eritrócitos lavados foi diluída com água

ultrapura (Milli-Q), na proporção de 1:3 (lisado). Em tubos de ensaio foram pipetados 5 mL

de solução de Drabkin, previamente preparado conforme instruções do fabricante, em seguida

foi acrescido 20L do lisado, em triplicata. O método utilizado foi o da cianometaemoglobina

(VAN ASSENDELFT, 1972). Os tubos foram homogeneizados em agitador mecânico e as

21

leituras realizadas por espectofotometria, utilizando um espectofotômetro UV visível

(HITACHI, modelo U1100) em 540nm. Os resultados foram expressos em g/dL.

4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase

As análises foram feitas no Laboratorio Multidisciplina – LABMULT do Programa de

Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – PPgCF, no Centro de Ciências da Saúde, Centro

de Ciências da Saúde, UFRN-RN. Para a análise da atividade da enzima Glutationa

Peroxidase (GPx), as amostras foram preparadas a partir de 5mL de sangue total coletado em

tubo com anticoagulante EDTA, com 3 lavagens com solução salina a 0,9%, rotação de

4.500rpm, a 4°C, durante 10 minutos, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha).

Os eritrócitos foram armazenados à -80°C até o momento das análises, realizadas em um

prazo máximo de 40 dias após a coleta.

A atividade enzimática da GPx foi mensurada em UV, Espectofotômetro (UV2100S;

Shimadzu Co.®

, Japão), utilizando-se o kit Ransel do Laboratório Randox (Laboratório

Randox, São Francisco, EUA). Este método é baseado em Paglia e Valentine (1967), cujo

princípio se baseia na medida da velocidade de oxidação da Glutationa reduzida (GSH) por

hidroperóxido de cumeno catalisada pela Glutationa Peroxidase (GPx), presente no

hemolisado (amostra do paciente), gerando água e Glutationa oxidase (GSSG). Na presença

da Glutationa Redutase (GR) e nicotinamida-adenina dinucleotídio-fosfato (NADPH) a GSSG

é imediatamente convertida na forma reduzida (GSH), sendo monitorada a 340 nm quando o

NADPH é convertido a NADP+.

Os resultados das leituras foram expressos em unidades por grama de hemoglobina

(U/g Hb). Os valores de referência para a Glutationa Peroxidase são: 27,5 – 73,6 U/g Hb (Kit

Ransel, Laboratório Randox).

4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas

As análises da expressão do mRNA das selenoproteínas (GPX1, selenoproteína P1 e

N1) foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular – LABIOMOL, do Programa de

Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – PPgCF, no Centro de Ciências da Saúde (CCS)

da UFRN – RN.

4.8.1 Extração do RNA total

O RNA total foi obtido a partir de sangue total periférico (4,0mL), colhido em tubo

contendo EDTA, utilizando o kit Qiamp RNA Blood Mini Kit® (Qiagen, Alemanha)

22

imediatamente após a coleta do sangue, através de metodologia descrita pelo fabricante. O

material foi armazenado em freezer a -80C.

O RNA total extraído foi quantificado (A260nm) e teve seu grau de pureza

(A260/A280) avaliado através de espectrofotometria no ultravioleta utilizando o

espectrofotômetro Cirrus 80MB (FEMTO, São Paulo, Brasil) (SAMBROOK e RUSSEL,

2001). A integridade do RNA das amostras foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a

1,0%, na presença de formaldeído a 2,2M e tampão MOPS [MOPS a 20mM (pH 7,0), acetato

de sódio a 8mM e EDTA a 1mM (pH 8,0)] preparado com água tratada com Dietil-

pirocarbonato (DEPC) (SAMBROOK e RUSSEL, 2001).

4.8.2 Análise da Expressão gênica pela PCR em Tempo Real

A síntese do cDNA, a partir do RNA total, foi realizada utilizando-se o kit High

Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems®, de acordo com a

metologia descrita pelo fabricante (Foster City, CA, EUA) em termociclador MyCiclerTM

(Bio Rad®, Hercules, CA, EUA). O cDNA obtido foi armazenado a –20°C até a realização da

PCR em tempo real.

Os cDNAs dos genes GPX1 (número genbank de acesso NM_000581), SEPP1

(número genbank de acesso NM_001085486) e SEPN1 (número genbank de acesso

NM_020451) e do gene de refrência, gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (GAPDH)

(número genbank de acesso NM_002046.3) foram amplificados pela PCR em Tempo Real, no

aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA). Para a amplificação pela

PCR em tempo real dos genes em estudo e do gene de referência foram utilizados iniciadores

e sondas, marcadas com fluoróforo, selecionados com o auxílio do programa Primer Express®

(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com base nas seqüências gênicas disponíveis no

banco de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) e estão descritos na Tabela 1.

23

TABELA 1 – Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a

avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH.

Genes Iniciadores Fragmentos

GPX1 5’ CATCAGGAGAACGCCAAGAAC 3’

3’GCATGAAGTTGGGCTCGAA 5’

5’ FAMTM

GCATGAAGTTGGGCTCGAA 3’

40pb

SEPN1 5’ TCAGTTCACCGGCCACATC 3’

3’CCCCGTAAAGCCACTCCAT 5’

5’ FAMTM

CGTGCCCAACCACAGGTCTCTGAA 3’

38pb

SEPP1

5’ATATATGATAGATGTGGCCGTCTTGT 3’

3’TTTCCACATTTCTTTTCACAGTAAGC 5’

5’ FAMTM

TGGTTTGCCTTTTTCCTTCCTAACTTTCCC 3’

52pb

GAPDH

5’ GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA 3’

5’ CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC 3’

5’VIC® CATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACG TAMRA 3’

44bp

NOTA: FAM TM –fluoróforo 6-carboxifluoresceína; VIC® - fluoróforo disponibilizado pela Applied

Biosystems®. GPX1-gene da Glutationa Peroxidase 1. SEPN1 – gene da selenoproteína N 1. SEPP1 – gene da

selenoproteína P 1.

Nos ensaios de amplificação dos genes GPX1 e SEPN1 utilizou-se iniciadores a 300

nmoles/L e sonda de detecção marcada com FAMTM (6carboxifluoresceína) a 200nmoles/L,

para o gene SEPP1 utilizou-se iniciadores a 450nmoles/L e sonda de detecção marcada com

FAMTM a 200nmoles/L. Para o GAPDH utilizou-se a sonda de detecção (200nmoles/L) 24

marcada com VIC® e os iniciadores a 300nmoles/L. Foi utilizado um volume final de 20 μL

por reação.

A quantidade de cDNA utilizados nos ensaios foi otimizado a partir de uma curva-

padrão, realizada com diferentes concentraçoes de amostras de cDNA. A curva-padrão

permite avalizar a linearidade da amplificação, bem como a eficiência da mesma. A eficiência

de cada ensaio foi considerada adequado quando apresentaram valores entre 90 e 110%

(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).

24

Foram realizadas amplificações conjuntas de cada um dos genes de estudo e do gene de

referência. A medida da expressão do mRNA dos genes GPX1, SEPP1 e SEPN1 foi obtida em

relação ao gene de referência, controle endógeno, pela diferença entre o Ct (cycle threshold)

do gene alvo e o Ct do gene de referência (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001):

Ct = (Ct gene alvo – Ct controle endógeno)

Com o objetivo de avaliar a variação da expressão em função do uso da estatina foi

utilizado o parâmetro Ct que foi calculado para cada indivíduo em função da média do Ct

encontrada para o grupo no tempo T0, através da fórmula:

Ct = (Ct indivíduo – média Ct T0)

Os dados de Ct foram transformados em escala logarítmica (2-Ct) para comparar

dados de expressão entre os grupos estudados.

4.8 Análise Estatística

Os dados foram apresentados com média ± desvio-padrão. Foi utilizado o teste

estatístico de Kolmogorov-Smirnov para verificar o grau de adesão das variáveis quantitativas

à distribuição normal. Para verificar diferenças entre os sujeitos experimentais para as

variáveis antropométricas, bioquímicas, concentrações de selênio plasmático e eritrocitário foi

utilizado Teste t de Student pareado, na comparação dentre os tempos do tratamento (antes -

T0 e após - T1), nas variáveis paramétricas, e Teste de Wilcoxon para as variáveis não–

paramétricas. Também foi calculado o coeficiente de correlação r de Pearson. No estudo o

nível de significância adotado foi de 5%. Para realização das análises foi utilizado o programa

SPSS (Statistics Packet for Social Sciences) for Windows versão 16.0 (Chicago, Illinois –

EUA).

25

5. Resultados

Todas as variáveis métricas apresentaram distribuição normal no tempo inicial do

estudo (T0) (D(26) ≤ 0,89; p ≥ 0,405) e no tempo final (T1) (D(26) ≤ 0,513; p ≥ 0,955),

exceto a expressão do mRNA da selenoproteína P (D(26) = 1,55; p = 0,016).

Durante os quatro meses de acompanhamento nenhum paciente relatou qualquer efeito

adverso oriundo ao tratamento com a rosuvastatina, também não foram registradas

intercorrências clínicas, como internações, mesmo logo após a angioplastia.

5.1 Caracterização da Amostra

A amostra foi composta por 27 pacientes com aterosclerose, com idade média de

61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. A maioria dos pacientes tinha história

de tabagismo e etilismo e afirmou ser hipertensa (81,5%) (Tabela 2).

TABELA 2: Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados com


*Dados expressos em média ± desvio padrão (DP).

Todos os pacientes referiram usar medicamentos, dentre os principais estão os anti-

hipertensivos, como o Captopril (37,0%), Selozok 25 e 100mg (22,2%) e Enalapril (14,8%).

Os antiagregantes plaquetários foram representados principalmente pelo Plaketar®

(Ticlopidona) (33,3%) e Clopidogrel (Plagrel -18,5%; Lopgrel -14,8%; Plavix 7,4%), que

fazem parte da terapia adjunta da angioplastia. O Ácido Acetil Salicílico (AAS®) de 100mg

foi utilizado por 70,4% dos pacientes e as estatinas eram utilizadas por 44,4% dos pacientes,

na forma de sinvastatina (Sinvastatina e Sinvalip®) e atorvastatina (Lipitor

®), os quais foram

substituídos pela rosuvastatina (Crestor®), conforme delineamento do estudo.

26

5.2 Parâmetros Antropométricos

A maioria dos pacientes apresentou IMC e CA elevados, com 48,1% diagnosticados

com sobrepeso, nos dois períodos de avaliação. A prevalência de obesidade antes do

tratamento foi 22,2%, passando para 25,9% após o tratamento com a rosuvastatina, 77,7% dos

pacientes apresentaram CA acima do desejável no T0 e 63,0% no T1. Após os quatro meses

de tratamento foi observada redução estatisticamente significativa da circunferência

abdominal dos pacientes (Tabela 3 e Figuras 5 e 6).

TABELA 3 – Dados antropométricos dos pacientes com aterosclerose tratados com


T0

(n=27)

T1

(n=27)

t26 p

Peso (kg) 68,3 ± 15,0 68,2 ± 14,7 0,231 0,819

IMC (kg/m2) 27,1 ± 4,5 27,1 ± 4,3 0,000 1,000

CA (cm) 97,9 ± 10,5 96,7 ± 10,7 2,148 0,041

Dados expressos em média ± desvio padrão (DP).

T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento. IMC – Índice de Massa Corporal. CA – Circunferência Abdominal.

Teste estatístico: Teste t de Student pareado.

27

* Número de pacientes.

T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento.

FIGURA 5 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de

acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital

Center.

0

10

20

30

40

50

Eutrófico Sobrepeso Obesidade Grau I

Obesidade Grau II

Obesidade Grau III

Fre

qu

en

cia

(%)

T0

T1

87

13 13

3

4

3 3

87

13 13

3

4

3 3

0 0

28

* Número de pacientes.



acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital

Center.

5.3 Análise da Dieta

De acordo com os valores médios os pacientes apresentaram um consumo de energia

inferior ao recomendado, atingindo 86,6%. No entanto a dieta estava adequada quanto a

ingestão de carboidratos e lipídeos, a de proteínas ficou pouco acima do recomendado. Os

pacientes também tiveram um consumo médio de ácidos graxos polinsaturados,

monoinsaturados, saturados e colesterol adequado. Os pacientes apresentaram baixa ingestão

de fibras (Tabela 4).

0

10

20

30

40

50

Sem risco Elevado Muito elevado

Fre

qu

en

cia

(%)

T0

T1

6

10

11

8

10

9

29

TABELA 4 –Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com aterosclerose

tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.

Parâmetros

Recomendaçãoa

Ingestão habitual

(n = 25) b

Calorias (kcal) 1741,01 1507,31 ± 410,01

Carboidratos (%) 50,0 a 60,0 57,6 ± 7,09

Proteínas (%) 12,5 a 17,5 18,7 ± 2,64

Lipídeos (%) 25,0 a 35,0 25,2 ± 5,21

A. G. Polinsaturados (%) ≤ 10,0 7,4 ± 1,42

A. G. Monoinsaturados (%) ≤ 20,0 7,5 ± 1,87

A. G. Saturados (%) ≤ 7,0 6,9 ± 1,28

Colesterol (mg) <200,0 191,8 ± 89,03

Fibras (g) 20,0 a 30,0 15,6 ± 3,87

Dados expressos em média ± desvio padrão (DP).

aSBC (2007).

bn=25, foram retiradas 2 pacientes por apresentarem ingestão energética inferior

500kcal (Willett, Howe e Kushi, 1997).

A Figura 7 apresenta a distribuição dos pacientes de acordo com a adequação de

consumo, onde foi observado que 80,0% dos pacientes estavam com um consumo energético

abaixo do recomendado. Já na avaliação dos macronutrientes, foi encontrado que 44,0%

apresentaram um consumo acima do recomendado para os carboidratos e 76,0% para

proteínas. Quanto ao consumo de lipídeos, a maior parte apresentou-se com consumo

adequado ou abaixo da recomendação (44,0% e 52,0%, respectivamente), o mesmo foi

observado no consumo de ácidos graxos polinsaturados (96,0%); todos os pacientes

apresentaram consumo de gordura monoinsaturada dentro da faixa de recomendação. Já o

consumo de ácidos graxos saturados 44,0% dos pacientes estava com consumo acima da

recomendação, semelhante ao que foi observado no consumo de colesterol, com 48,0% dos

pacientes com ingestão acima da recomendação. Quando foi avaliado o consumo de fibras,

observou-se que todos os pacientes apresentaram consumo abaixo do recomendado.

30



atendidos no Natal Hospital Center.

Observando a ingestão de selênio, ajustada pela variação intrapessoal e energia, foi

identificada uma prevalência de inadequação de 81,9% na população estudada (Figura 8A e

B), que corresponde a proporção de pacientes que estão com um consumo habitual de Se

abaixo da EAR recomendada. É importante observar que essa recomendação é para

indivíduos saudáveis, podendo ocorrer mudanças nas necessidades nutricionais de

micronutrientes em doenças crônicas, como a aterosclerose.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Freq

uên

cia

do

s Pa

cien

tes

(%)

Acima

Adequado

Abaixo

31


aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.

32

Na Tabela 5 são apresentados os alimentos que mais contribuíram para ingestão de

selênio no grupo estudado.

TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com aterosclerose


33

5.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas

Como esperado, observou-se uma redução significativa dos valores de Colesterol

Total e LDL após o tratamento com a rosuvastatina. Também foi observada redução

significativa da Glicemia. Os pacientes não apresentaram alterações nas enzimas hepáticas

(Tabela 6 e Figura 9).



T0

(n=27)

T1

(n=27)

t26 p

Glicose (mg/dL) 123,2 ± 55,6 111,8 ± 47,1 2,658 0,013

Colesterol Total (mg/dL) 186,9 ± 50,0 141,9 ± 37,7 5,146 < 0,001

LDL (mg/dL)1 115,9 ± 43,3 73,5 ± 29,7 5,173 < 0,001

HDL (mg/dL) 38,3 ± 9,8 40,2 ± 12,2 -1,312 0,201

Triacilgliceróis (mg/dL) 186,7 ± 140,8 139,1 ± 58,2 1,831 0,079

ALT (U/dL) 29,6 ± 20,6 28,1 ± 16,8 0,560 0,580

AST (U/dL) 23,8 ± 13,2 21,4 ± 6,8 1,188 0,246

Valores expressos como média ± DP.


1 n = 26 – 1 paciente do gênero masculino com dosagem de triacilgliceróis superior a 400mg/dL, inviabilizando

o cálculo da LDL.

T0: Pré-tratamento. T1: Pós-tratamento. HDL-c: Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein);

LDL: Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein); ALT: Alanina Aminotransferase; AST:

Aspartato Aminotransferase.

34

FIGURA 9 - Percentual de alterações do perfil lipídico dos pacientes com aterosclerose após

o tratamento com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.

35

A Tabela 7 mostra a distribuição dos pacientes, de acordo com a glicemia e o perfil

lipídico, segundo a classificação dos valores de referência. Observa-se que, após a intervenção

com a rosuvastatina (tempo T1), os pacientes apresentaram um perfil lipídico mais

satisfatório, principalmente para o CT, LDL e TG, bem como melhora na normalização da

glicemia.

TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos no

Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de referência para

perfil lipídico e glicemia.

FONTE: SBC (2001).

a n = 26

T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento. HDL: Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein);

LDL: Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein).

36

5.5 Análises bioquímicas de Selênio e da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase

Não foram observadas mudanças significativas nas concentrações de selênio no

plasma e nos eritrócitos após os quatro meses de tratamento com a rosuvastatina (Tabela 8).

As médias das concentrações de selênio plasmático e eritrocitário estão dentro dos pontos de

corte estabelecidos por Ortuño et al. (1997). Estratificando a amostra, observou-se que 40,7%

dos pacientes apresentaram concentração de selênio deficiente no plasma, nos tempos T0 e

T1. Em relação a deficiência do selênio nos eritrócitos houve uma variação de 22,2% a 25,9%

dentre os pacientes.

Foi encontrado um aumento significativo na atividade enzimática da GPx após os

quatro meses de tratamento com a rosuvastatina (Tabela 8). Durante os dois períodos de

avaliação, os valores encontrados estavam dentro da faixa de recomendação preconizada pelo

fabricante do kit (Kit Ransel, Laboratório Randox).

TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade enzimática da

Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose tratados com


T0

(n=27)

T1

(n=27)

t26 p

Selênio dos

eritrócitos (µg/L) 111,9 ± 31,6 119,0 ± 43,6

-1,067 0,296

Selênio do plasma

(µg/L) 63,2 ± 15,7 65,3 ± 15,7

-1,279 0,212

Glutationa Peroxidase

(U/ g Hb) 42,6 ± 12,8 48,0 ± 16,4

-2,452 0,021 Valores expressos como média ± DP.



Valores de referência:

- Selênio (ORTUÑO et al., 1997):

Se plasmático: 60 - 120μg/L; Se eritrocitário: 90 - 190 μg/L

- Atividade enzimática GPx (Kit Ransel, Laboratório Randox): 27,5 – 73,6 U/g Hb

37

5.7 Análise da Expressão gênicas das Selenoproteínas

Na Tabela 9 e Figura 10 são apresentados os resultados da expressão gênica das

selenoproteínas estudadas. Após os 4 meses de tratamento com a rosuvastatina, os pacientes

apresentaram um aumento significativo na expressão gênica da selenoproteína GPx1 (t27 = -

0,24; p = 0,023) e SelN1 (t27 = -0,35; p = 0,002) (Figuras 9 e 10). A expressão gênica da

SelP1 foi similar entre os tempos de tratamento (Z = 1,12; p = 0,259).

TABELA 9 – Variação da expressão de mRNA dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1 dos

pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal

Hospital Center.

Valores expressos como média ± DP.

Teste estatístico: Teste t de Student pareado. a Teste estatístico: Wilcoxon


Ct: CT indivíduo – média Ct grupoT0). GPX1-gene da Glutationa Peroxidase 1. SEPN1 – gene da

selenoproteína N 1. SEPP1 – gene da selenoproteína P 1.

Não foram observadas correlações significativas entre a expressão gênica das

selenoproteínas e a atividade enzimática da GPx, o selênio da dieta e as concentrações de

selênio no plasma e nos eritrócitos (r ≤ 0,342; p ≥ 0,094) (ANEXO D).

38

NOTA: T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento. Teste estatístico: a

Teste t de Student pareado;

b Teste Wilcoxon. Controle endógeno: gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (GAPDH)

FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas de

mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com aterosclerose


a

b

c

39

6. Discussão

A maioria dos indivíduos apresentou alguns hábitos de vida que representavam fatores

de risco para o desenvolvimento da aterosclerose, como histórico de tabagismo e de consumir

bebidas alcoólicas (ARMAGANIJAN; BATLOUNI, 2000). No estudo de Alves et al. (2009),

com pacientes com doença aterosclerótica não coronariana, foi encontrada uma prevalência de

57,3% de ex-fumantes e de 15,6% de ex-etilistas, inferiores aos encontrados no presente

estudo.

É importante ressaltar que a maioria dos pacientes avaliados apresentavam sobrepeso e

obesidade, nos dois momentos de avaliação, além do elevado risco de complicações

metabólicas relacionados a obesidade, com base na circunferência abdominal. A alta

prevalência de sobrepeso e obesidade em indivíduos adultos e idosos vem sendo reportada em

diversos estudos como importantes fatores de risco para de desenvolvimento de doenças

cardiovasculares (SANTOS; SICHIERI, 2005; SARNO; MONTEIRO, 2007; SHISHEHBOR

et al., 2008).

A circunferência abdominal possui vantagem em relação às outras medidas

antropométricas pelo fato de não ser influenciada pela estatura. Essa medida expressa a

obesidade abdominal do paciente que é fortemente associada à resistência insulínica e à

síndrome metabólica (HOLANDA et al., 2006). No estudo IRAS, observou-se que o aumento

do perímetro abdominal foi a variável com maior poder de prever o desenvolvimento futuro

da síndrome metabólica (CIORLIA; GODOY, 2006).

Esses fatores de risco continuam preocupantes no Brasil. Um estudo recente foi

realizado com mais de 48 mil famílias, cujo principal objetivo era estudar a renda familiar, o

consumo de gêneros alimentícios e a composição corporal da população. Conforme este

último parâmetro avaliado, foram apresentadas as taxas de prevalência de obesidade do Brasil

e das capitais. Foi observada em Natal uma prevalência de 10,32% de indivíduos obesos, não

foi relatada a proporção de indivíduos com sobrepeso (LOBATO; COSTA; SICHIERI, 2009).

Com relação a avaliação do consumo alimentar foi observado que 80,0% dos pacientes

apresentaram consumo energético abaixo do recomendado. Na literatura são descritos casos

de sub-relato quando se trata de avaliação do consumo alimentar, tanto na quantidade de

porções quanto dos alimentos em geral (BRIEFEL et al., 1997). A dieta exerce papel

fundamental no tratamento de doenças cardiovasculares (HANKEY; LESLIE, 2001), a terapia

nutricional é reconhecida pela American Heart Association (AHA) e o National Cholesterol

Education Program (NCEP) como método de prevenção e tratamento da doença

40

cardiovascular (AHA, 1993; KRIS-ETHERTON, 2001; EXECUTIVE SUMARY OF...,

2001).

Sobre a contribuição dos macronutrientes no valor energético total (VET) da dieta, foi

observado que os pacientes apresentaram distribuição média de ingestão adequadas, quanto

aos carboidratos, apesar de alguns pacientes referirem o consumo de alimentos integrais

(principalmente a aveia em flocos), a maioria deles ingeriu grandes quantidades de alimentos

refinados (pães e biscoitos), o que contribuiu para a baixa ingestão de fibras. Sabe-se que as

principais fontes de selênio são também fontes de proteínas. Apesar do consumo médio desse

macronutriente ter sido maior que a recomendação, ainda não foi o suficiente para adequar a

ingestão de selênio, o que pode ser atribuído a não inclusão das fontes de selênio de maior

biodisponibilidade.

O desequilíbrio entre os tipos de gordura dietética pode levar a eventos

cardiovasculares, principalmente no que diz respeito ao elevado consumo de gordura saturada

e baixo consumo de gordura monoinsaturada (CLARKE et al., 2009). No nosso estudo os

pacientes apresentaram valores médios de ingestão de gordura mono, poli e saturada

adequados de acordo com a recomendação, porém esses resultados podem ser explicados por

mudanças recentes no hábito alimentar, devido a descoberta da doença e sua relação com os

lipídeos da dieta.

A prevalência de inadequação da ingestão de selênio foi semelhante ao encontrado no

estudo de Alissa et al. (2006), realizado com pacientes com doenças cardiovasculares.

Existem muitas dificuldades para avaliação do consumo alimentar de selênio, pois

existem variações das concentrações desse mineral nos solos de diferentes regiões do Brasil e

limitações de informações nutricionais em tabelas de composição de alimentos brasileiros.

Muitos dos valores de selênio empregados na avaliação do consumo alimentar são referentes a

alimentos oriundos de países com concentrações altas do mineral no solo ou com políticas de

fortificação de alimentos (COZZOLINO, 2007; COMBS, 2001; GONZÁLEZ et al., 2006). A

concentração de selênio em alguns gêneros alimentares consumidos pela população brasileira

já é conhecida, sendo considerados com maior teor do mineral as carnes (aves, peixes e carne

vermelha) e os feijões. Inclusive os feijões se destacaram como fontes predominantes na

população estudada (FERREIRA et al., 2002).

Estudos nacionais identificaram variações no consumo de selênio, o maior consumo

ocorreu em crianças da cidade de Macapá (AP) (107μg de Se/dia), seguido de adultos de

Manaus (AM) (98μg de Se/dia) devido ao consumo de castanha do Brasil. Crianças residentes

em São Paulo (SP) apresentaram concentrações médias diárias mais baixas (26,3μg de Se/dia)

41

(MAIHARA et al., 2004). Outro estudo que utilizou a castanha-do-brasil como

suplementação de selênio, apontou que o consumo do mineral pelos participantes antes da

intervenção era de 94,4 (±23,1)μg/dia (STRUNZ et al., 2008).

Nesse estudo, como esperado, o tratamento com a rosuvastatina (10mg/dia) durante

quatro meses resultou em redução do colesterol total, LDL e Triacilgliceróis, não modificando

o HDL, resultados estes semelhantes aos descritos em estudos anteriores (MOREIRA et al.,

2006; GÓMEZ-GARCÍA et al., 2007; TAKAYAMA et al., 2009). No estudo ASTEROID

(NISSEN et al., 2006), a redução de 53,2% nos valores de LDL foi semelhante aos nosso

resultados. Em estudos clínicos comparativos, a rosuvastatina, administrada em doses de 5 a

10 mg/dia, reduziu as taxas sangüíneas de LDL em níveis significativamente superiores aos

alcançados com estatinas convencionais, como atorvastatina (10 mg/dia), pravastatina (20

mg/dia) e sinvastatina (20 mg/dia). Ao lado dessa maior eficácia em relação à fração mais

aterogênica do colesterol, a rosuvastatina também apresentou efeitos benéficos sobre outros

parâmetros lipídicos, como diminuição dos triacilgliceróis e aumento de HDL (CHENG-LAI,

2003).

Houve uma redução significativa da glicemia que estava elevada tanto em T0 quanto

em T1, comportamento positivo, pois tem sido relatada relação entre a utilização da

rosuvastatina e elevação na glicemia, até mesmo com o desenvolvimento da resistência

insulínica (KOSTAPANOS et al., 2009). A hiperglicemia pode representar um fator de risco

importante para o desenvolvimento das doenças cardiovasculares atribuído ao excesso de

glicose gerando um efeito tóxico no endotélio vascular mediado pelo estresse oxidativo

(SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005).

De acordo com Shchukin et al. (2008), o tratamento com rosuvastatina, em doses

moderadas (10mg/dia), diminui significantemente o estresse oxidativo e a atividade

inflamatória endógena, pela ativação do sistema antioxidante plasmático, o que pode explicar

o aumento da atividade enzimática da GPx durante o presente estudo. A GPx1 é considerada

uma das selenoproteínas mais sensíveis a variações nas concentrações de selênio plasmáticas

e eritrocitárias (SUNDE et al., 2008).

Nesse estudo, para determinar o estado nutricional relativo ao selênio, além da

ingestão do mineral foram analisadas as concentrações no plasma e eritrócitos dos pacientes.

Existem diversos fatores que influenciam as concentrações séricas de selênio, como a idade,

gênero, presença de tabagismo e etilismo, além da dieta, considerada o fator mais influente

(VIEGASRESPO et al., 2000; GALAN et al., 2005; STRANGES et al., 2010).

42

Os pacientes apresentaram concentrações de selênio no plasma e nos eritrócitos dentro

dos pontos de corte estabelecidos, sem alterações após o tratamento com a rosuvastatina, o

que corrobora com outros estudos (GHAYOUR-MOBARHAN et al., 2005; LEONHARDT et

al., 1997). No entanto, esses autores investigaram outras estatinas (sinvastatina, atorvastatina

e fluvastatina). Resultados sobre o efeito da rosuvastatina nas concentrações de selênio no

plasma e eritrócitos em estudos semelhantes ao nosso ainda não são conhecidos. A

concentração de selênio no plasma é um marcador da exposição atual, enquanto a dos

eritrócitos reflete o estado nutricional a longo prazo, devido a sua incorporação na síntese dos

eritrócitos, que tem uma meia-vida de 120 dias (NAVARRO-ALARCON; CABRERA-

VIQUE, 2008). A inadequação na ingestão de selênio na dieta não refletiu sobre os

parâmetros sanguíneos desse mineral.

Na meta-análise publicada por Flores-Mateo et al. (2006), a variação de selênio no

plasma foi na faixa de 52,5 e 106,8 μg L. Em outro estudo com população dinamarquesa as

concentrações foram bem homogêneas, entre 94,4 e 98,7 μg L (RASMUSSEN et al., 2009).

No estudo de Strunz et al. (2008) foi observado uma concentração de 56 (±9) μg L. Como se

observa, os valores encontrados para a maioria dos estudos são consistentes com estado

nutricional adequado do mineral.

Segundo Arnaud et al. (2009), existe a hipótese de que a reposta do selênio plasmático

no tratamento com estatinas pode atingir um platô e então ser regulado pelas alterações nas

concentrações de LDL. A elevação desse mineral no plasma está associado a redução nas

partículas de LDL, lipoproteína mais susceptível a oxidação. Essa relação pode reforçar o

papel antioxidante desse mineral a importância do selênio no sistema antioxidante.

A biossíntese do colesterol é uma das funções da via do mevalonato. Essa via é

também essencial para a síntese das diversas isoprenóides como isopentenil pirofosfato (IPP)

(GRUNLER; ERICSSON; DALLNER, 1994), que é um substrato para formação das

selenoproteínas (MOOSMANN; BEHL, 2004a), uma vez bloqueada esta via a partir da

atuação das estatinas consequentemente espera-se uma redução na síntese do IPP.

Dessa forma, poderia se esperar que os pacientes tratados com a rosuvastatina

apresentassem uma redução da expressão gênica dessas selenoproteínas, porém foi observado

um aumento na expressão dos genes das selenoproteínas GPx1 e SelN, o que não corroborou

com os achados de Kromer e Moosmann (2009), que observaram uma redução na expressão

gênica da GPx1 após tratamento com diferentes estatinas (atorvastatina, cerivastatina e

lovastatina), no entanto, com doses e tempo de tratamento diferentes deste estudo. Evidências

sugerem que ocorre uma redução na síntese das selenoproteínas em situações de estresse

43

oxidativo, como um meio de preservar os recursos celulares (HOLCIK; SONENBERG,

2005), porém a GPx1 é a selenoproteína que se recupera mais rapidamente (PAPP et al.,

2007).

A solubilidade das estatinas tem sido estudada como um fator importante no

desenvolvimento dos efeitos colaterais no tecido muscular. Estudos in vivo (NAKAHARA et

al., 1998; REIJNEVELD et al., 1996) e in vitro (MASTERS et al., 1995; GADBUT;

CARUSO; GALPER, 1995) demonstraram que as estatinas hidrofílicas, como a rosuvastatina

e pravastatina possuem menores efeitos no tecido muscular quando comparadas a estatinas

lipofílicas, como a lovastatina e sinvastatina. Todavia, não se pode inferir a relação entre o

tratamento com a rosuvastatina e as miopatias, já que não houve relato de efeitos colaterais

em nosso estudo.

O aumento da expressão do gene da selenoproteína N pode estar relacionado ao fato

desta ser, preferencialmente, expressa na proliferação de células e durante formação de

tecidos (PETIT et al., 2003), porém não há relatos dessa expressão aumentada em pacientes

com aterosclerose. Também não foram relatados efeitos musculares em decorrência do

tratamento, o que está associado a dose de administração do medicamento e ao tempo de

tratamento, que pode variar de uma semana a quatro meses após o início do tratamento com

estatinas (PASTERNAK et al., 2002).

Em nosso estudo o tratamento com a rosuvastatina não alterou a expressão do SEPP1.

A expressão gênica observada está condizente com as concentrações de selênio plasmático e

eritrocitário, encontradas no estudo, uma vez que uma das funções da SelP1 é o

armazenamento e transporte de selênio (BURK; HILL, 2009). Alguns estudos sugerem que a

expressão do mRNA da selenoproteína P se encontra aumentada em doenças inflamatórias

(MOSTERT et al., 2001). A ausência de alteração da expressão dessa selenoproteína em

nosso estudo pode estar relacionada ao efeito anti-inflamatório atribuído a rosuvastatina

(KINLAY, 2005).

A via de bissíntese do colesterol, bloqueada pelas estatinas, parece não ser a única via

que interfere na síntese das selenoproteínas, pois mesmo com o tratamento com a

rosuvastatina não foi observada redução da expressão gênica das selenoproteínas GPx1,

SelN1 e SelP1. Dessa forma, se fazem necessários mais estudos que elucidem esses

mecanismos de síntese das selenoproteínas frente ao tratamento com a rosuvastatina.

44

7. Conclusões

1. Os pacientes apresentaram uma melhora do estado nutricional avaliado pela

antropometria, principalmente com relação a circunferência abdominal;

2. O consumo de energia foi abaixo das necessidades, embora com distribuição

percentual adequada dos macronutrientes. Com relação ao aspecto qualitativo das

gorduras, observou-se um perfil satisfatório quanto aos ácidos graxos poliinsaturados e

monoinsaturados; e do contrário, proporções críticos de elevado consumo de ácido graxos

saturados e colesterol. A fibra foi o nutriente com total inadequação. O consumo de

selênio apresentou alta prevalência de inadequação;

3. Após tratamento com rosuvastatina foi observado que:

3.1. O colesterol total, LDL e glicemia diminuíram significativamente;

3.2. As concentrações de selênio no plasma e nos eritrócitos não apresentaram

alterações, mantendo-se na faixa de valores considerados normais;

3.3. A atividade enzimática da GPx aumentou significativamente;

3.4. Houve aumento da expressão do mRNA do GPX1 e do SEPN1, enquanto que a

expressão gênica do SEPP1 não sofreu alteração;

4. Diante dessas constatações, especula-se que via de biossíntese do colesterol,

bloqueada pelas estatinas, parece não ser a única via que interfere na síntese das

selenoproteínas, pois mesmo com o tratamento com a rosuvastatina não foi observada

redução da expressão gênica das selenoproteínas GPx1, SelN1 e SelP1. Dessa forma, se

fazem necessários mais estudos que elucidem esses mecanismos de síntese das

selenoproteínas frente ao tratamento com a rosuvastatina.

45

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59

ANEXOS

60

ANEXO A - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes

(HUOL) - Adendo.

61

62

ANEXO B - Recomendações dietéticas para o tratamento das hipercolesterolemias.

63

Anexo B - Recomendações dietéticas para o tratamento das hipercolesterolemias.

Nutrientes Ingestão recomendada

Gordura total

Ácidos graxos saturados

Ácidos graxos polinsaturados

Ácidos graxos monoinsaturados

Carboidratos

Proteínas

Colesterol

Fibras

Calorias

25 a 35% das calorias totais

≤ 7% das calorias totais



50 a 60% das calorias totais

Cerca de 15% das calorias totais

<200 mg/dia

20 a 30 g/dia

Ajustado ao peso desejável FONTE: SBC (2007).

64

ANEXO C - Valores de referência do Perfil lipídico, Glicemia, ALT e AST.

65

Anexo C - Valores de referência do Perfil lipídico para indivíduos >20 anos de idade

Lípides Valores Categoria

CT (mg/dL)

LDL (mg/dL)

HDL (mg/dL)

TG (mg/dL)

<200

200-239

≥ 240

< 100

100-129

130-159

160-189

≥ 190

< 40

>60

< 150

150-200

201-499

≥ 500

Ótimo

Limítrofe

Alto

Ótimo

Desejável

Limítrofe

Alto

Muito alto

Baixo

Alto

Ótimo

Limítrofe

Alto

Muito alto

FONTE: SBC (2001).

CT: Colesterol total; HDL: Lipoproteína de alta densidade; LDL: Lipoproteína de baixa densidade; TG:

Triacilgliceróis.

Anexo C - Valores de referência para Glicemia, ALT e AST.

Valores

Glicemia (mg/dL)

ALT (U/dL)

AST (U/dL)

70 - 99

7-52

13-39

FONTE: Laboratório Olympus®.

ALT: Alanina Aminotransferase; AST: Aspartato Aminotransferase.

66

ANEXO D - Correlação das expressões dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1, dos pacientes

com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.

67

Anexo D - Correlação das expressões dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1, dos pacientes

com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.

Teste estatístico: r de Pearson. a Teste estatístico: rho de Spearman


GPx – enzima glutationa peroxidase. GPX1-gene da Glutationa Peroxidase 1. SEPN1 – gene da

selenoproteína N 1. SEPP1 – gene da selenoproteína P 1.

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AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO … · queridas, são exemplos de superação e dedicação. Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras