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AVALIAÇÃO DO PERFIL ANTITROMBÓTICO DAS
DESINTEGRINAS RECOMBINANTES DO VENENO DE
Bothrops jararaca
BARBARA BARBOSA SUCCAR
Rio de Janeiro
2012
BARBARA BARBOSA SUCCAR
Aluna do curso de Tecnologia em Biotecnologia
Matrícula 0913800083
AVALIAÇÃO DO PERFIL ANTITROMBÓTICO DAS
DESINTEGRINAS RECOMBINANTES DO VENENO DE
Bothrops jararaca
Trabalho de Conclusão de
Curso, TCC, apresentado ao Curso
de Graduação em Tecnologia em
biotecnologia, da UEZO como parte
dos requisitos para a obtenção do
grau em Tecnólogo em Biotecnologia
sob a orientação das Professoras
Luciana Wermelinger Serrão e
Russolina Benedeta Zingali.
Rio de Janeiro
Julho de 2012
S942 Succar, Barbara Barbosa
Avaliação do Perfil Antitrombótico das Desintegrinas
Recombinantes do Veneno de Bothrops jararaca /
Barbara Barbosa Succar – 2012.
39 f.; 30 cm.
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação Tecnológica em
Biotecnologia) – Fundação Centro Universitário Estadual da Zona
Oeste, Rio de Janeiro, 2012.
Bibliografia: f 36-39.
1. Hemostasia 2. Desintegrinas 3. Integrinas
4. Agregação Plaquetária 5.Tromboembolia.
I. Título.
CDD 616.145
ii
AVALIAÇÃO DO PERFIL ANTITROMBÓTICO DAS
DESINTEGRINAS RECOMBINANTES DO VENENO DE
Bothrops jararaca
Elaborado por Barbara Barbosa Succar
Aluna do curso de Tecnologia em Biotecnologia da UEZO.
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com grau:______________
Rio de Janeiro, 10 de Julho de 2012.
Anderson Jack Fransen, Prof. Dr.
Membro, Título Acadêmico.
Fábio da Silva de Azevedo Fortes, Prof. Dr.
Presidente, Título Acadêmico.
Luciana Wermelinger Serrão, Profª Drª
Professor Orientador, Título Acadêmico.
Russolina Benedeta Zingali, Profª Drª
Professor Co-orientador, Título Acadêmico
Rio de Janeiro, RJ – Brasil
Julho – 2012
iii
A minha família – que me incentivou;
As minhas orientadoras Professoras
Luciana Wermelinger Serrão e
Russolina Benedeta Zingali que de
forma segura me orientaram durante
o desenvolvimento deste trabalho;
Aos meus professores e colegas que
caminharam a meu lado.
iv
Dedico esse trabalho aos
meus pais, a minha irmã e familiares,
aos meus amigos, minhas
orientadoras, meus professores, e a
todos que me ajudaram durante esta
caminhada.
v
“A percepção do desconhecido
é a mais fascinante das experiências.
O homem que não tem os olhos
abertos para o misterioso passará
pela vida sem ver nada.”
Albert Einstein (1879 – 1955)
vi
Resumo
O sistema hemostático é responsável pela manutenção da fluidez do
sangue e interrupção da sua perda caso haja uma injúria vascular. A ativação
inespecífica do sistema hemostático pode resultar em trombose. Os tratamentos
atuais são eficientes, no entanto estes fármacos possuem uma grande
desvantagem por provocarem sangramentos indesejados. Desta forma, a busca
por tratamentos mais eficientes e seguros torna-se fundamental. As desintegrinas
são peptídeos derivados do veneno de serpentes que apresentam a sequencia
Arg-Gly-Asp (RGD) sendo esta importante para a sua atividade antiplaquetária. O
objetivo deste trabalho é analisar o perfil antiplaquetário e antitrombótico das
desintegrinas recombinantes jararacina (rJARC) e jarastatina (rJAST).
Primeiramente, as desintegrinas foram expressas com um rendimento de 68,9 μg
(rJARC) e 143 μg (rJAST). Em seguida, elas foram purificadas e testadas em
ensaios de agregação plaquetária, apresentando a capacidade de inibir a
agregação induzidas por ADP. Posteriormente, as desintegrinas foram avaliadas
através do modelo de tromboembolia pulmonar induzida por ADP. Neste ensaio, a
rJARC e rJAST foram capazes de prevenir a morte de 46,7% e 30% da
população, respectivamente. Desta forma, foi possível observar que as
desintegrinas recombinantes apresentam atividade antiplaquetária de maneira
semelhante às nativas e que as mesmas possuem ainda um potencial efeito
antitrombótico.
Palavras-chave: Hemostasia, Desintegrinas, Integrinas, Agregação Plaquetária e
Tromboembolia.
vii
Abstract
The haemostatic system is responsible for controlling the blood fluidity, and
bleeding in case of vascular injury. The nonspecific activation of haemostatic
system can result in thrombosis. Several drugs are available to control thrombosis,
although they may lead to unwanted bleeding. This study aimed to test
recombinant disintegrins as alternative molecules to thrombosis treatment.
Disintegrins are x-xx Da peptides naturally obtained from snake venom. They are
characterized by the Arg-Gly-Asp sequence (RGD motif) and by their high levels of
anti-platelet activity. Here, two recombinant disintegrins, jararacin (rJARC) and
jarastatin (rJAST), were super-expressed using E. coli system. After purification,
68.9 µg and 143 µg of rJARC and rJAST were obtained, respectively. Similarly to
natural disintegrins, both rJARC and rJAST at showed inhibitory activity on ADP-
induced platelet aggregation. The disintegrins were further evaluated using a
mouse ADP-induced pulmonary embolism model. rJARC and rJAST prevented
mouse death by 46.7% and 30%, respectively. Overall, the presented results show
the antiplatelet activity of the recombinant disintegrins and their antithrombotic
effect. Therefore, rJARC and rJAST are potential molecules for thrombosis
treatment.
Keywords: Hemostasis, disintegrins, integrins, Platelet Aggregation and
Thromboembolism.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Vasoconstrição e Hemostasia Primária 3
Figura 2. Hemostasia Secundária e Fibrinólise 4
Figura 3. Plaquetas ativadas 5
Figura 4. Modelo de adesão plaquetária à matriz subendotelial em locais de injúria vascular 6
Figura 5. Esquema da agregação plaquetária 7
Figura 6. Gatilhos de trombose arterial e venosa 10
Figura 7. Alvos dos fármacos antiplaquetários 12
Figura 8. Características estruturais das desintegrinas nativas 16
Figura 9. Esquema simplificado do plasmídio pET-32a 19
Figura 10. Esquema de ensaios de agregação plaquetária no agregômetro 22
Figura 11. SDS-PGE 15% referente à expressão das desintegrinas recombinantes 24
Figura 12. Organograma 25
Figura 13. Curva Padrão para quantificação das desintegrinas recombinantes (antes da hidrólise) através da utilização da equação da reta 27
Figura 14. Curva Padrão para quantificação das desintegrinas recombinantes (após hidrólise) através da utilização da equação da reta 27
Figura 15. Agregação plaquetária induzida por ADP (4 - 6 μM) em plaquetas humanas 29
Figura 16. Efeito das Desintegrinas rJARC e rJAST sobre a tromboembolia pulmonar em camundongos 30
Figura 17. Alinhamento da sequência das desintegrinas nativas 31
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação das desintegrinas de acordo com o tamanho 14
Tabela 2. Quantificação das desintegrinas recombinantes 26
Tabela 3. Quantificação referente à segunda expressão das desintegrinas
recombinantes 28
Tabela 4. Comparação entre as quantificações das desintegrinas
recombinantes 28
x
LISTA DE ABREVIATURAS
vWF – Fator de von Willebrand
TXA2 – Tromboxano A2
MEC – Matriz extracelular
TF – Fator tecidual
AVE – Acidente Vascular Encefálico
RGD – Arg-Gly-Asp (Arginina – Glicina – Ácido Aspártico)
IC50 – Representa a concentração de uma droga que seja requerida para a
inibição de 50% in vitro.
PMN – Polimorfonucleares
IL-8 – interleucina 8
fMLP – N-formyl-Met-Leu-Phe
E. coli – Escherichia coli
rJARC – jararacina recombinante
rJAST – jarastatina recombinante
IPTG – Isopropyl-Thio-2-D-Galactopyranoside
PRP – Plasma rico em plaquetas
PPP – Plasma pobre em plaquetas
ELISA – Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay
ADP – Adenosina difosfato
xi
SUMÁRIO
Resumo vi
Abstract vii
Lista de Figuras viii
Lista de Tabelas ix
Lista de Abreviaturas x
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Sistema Circulatório 1
1.2. Hemostasia 1
1.2.1. Hemostasia Primária 2
1.2.2. Hemostasia Secundária e Fibrinólise 3
1.3. Plaquetas 4
1.3.1. Integrinas 7
1.3.2. Receptores para ADP 8
1.4. Trombose 9
1.4.1. Trombose Arterial 9
1.4.2. Trombose Venosa 10
1.4.3. Terapia 11
1.5. Desintegrinas 13
2. OBJETIVOS 17
2.1. Objetivos Gerais 17
2.2. Objetivos Específicos 17
3. METODOLOGIA 18
3.1. Expressão das Desintegrinas 18
3.2. Purificação das Desintegrinas 19
3.3. Quantificação das amostras 20
3.4 . Eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE) 21
3.5. Ensaio de agregação plaquetária com plaqueta humana 21
3.6. Animais 22
3.7. Ensaio de tromboembolia pulmonar induzida por ADP 22
3.8. Análise estatística 23
4. RESULTADOS 24
xii
4.1. Expressão, Purificação e Quantificação das Desintegrinas 24
4.2. Efeito das Desintegrinas sobre a Agregação Plaquetária 29
4.3. Atividade Antitrombótica das Desintegrinas no Modelo de
Tromboembolia Pulmonar Induzida por ADP 30
5. DISCUSSÃO 31
6. CONCLUSÃO 34
7. PERSPECTIVAS 35
Referências Bibliográficas 36
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. SISTEMA CIRCULATÓRIO
Sistema é um conjunto de órgãos relacionados que desempenham uma
função comum. O sistema circulatório contribui para a homeostase dos outros
sistemas do corpo, transportando e distribuindo o sangue por todo o corpo, para
entregar materiais como: o oxigênio, nutrientes e hormônios e recolher os
resíduos. Esse transporte é realizado pelos vasos sanguíneos, que formam rotas
circulatórias fechadas para o sangue fluir do coração aos órgãos do corpo e
retornar ao coração (TORTORA and GRABOWSKI, 2006).
Existem cinco tipos de vasos sanguíneos: artérias, arteríolas, capilares,
vênulas e veias. As artérias são os vasos que transportam o sangue do coração
para os tecidos. Duas grandes artérias emergem do coração e se ramificam em
tamanhos menores até se dividirem em arteríolas. As arteríolas no interior de um
tecido ramificam-se em numerosos vasos microscópicos chamados capilares. Os
grupos de capilares reúnem-se para formar pequenas veias chamadas vênulas,
estas se fundem para formar vasos progressivamente maiores chamados veias.
As veias são os vasos sanguíneos que transportam o sangue dos tecidos de volta
ao coração (TORTORA and GRABOWSKI, 2006).
O sangue é o único tecido conjuntivo líquido composto de duas porções, o
plasma (55%) e as células e fragmentos celulares (45%). Tem três funções
gerais: transporte (O2, nutrientes, hormônios e resíduos metabólicos), regulação
(pH variando de 7,35 a 7,45, temperatura em torno de 38˚ C e pressão osmótica)
e proteção (coagulação, glóbulos brancos e proteínas de defesa) (TORTORA and
GRABOWSKI, 2006).
1.2. HEMOSTASIA
Hemostasia é um processo dinâmico em que a coagulação do sangue é
iniciada, e terminada de forma rápida e bem regulada. A coagulação do sangue (a
2
cessação da perda do sangue de um vaso danificado) é parte de uma máquina
importante do mecanismo de defesa (RIDDEL JÚNIOR et al., 2007).
O sistema hemostático é responsável pela manutenção da fluidez
sanguínea através dos vasos (veias e artérias), e interrupção da perda sanguínea
caso haja uma injúria vascular. Sendo assim, são necessários mecanismos de
controle que promovam o equilíbrio entre os eventos pró-coagulante e
anticoagulante. Além disso, o sistema fibrinolítico também colabora para o
equilíbrio através do restabelecimento da perfusão no local onde houve formação
de coágulo sanguíneo (HOFFBRAND et al., 2006; RIDDEL JÚNIOR et al., 2007).
O processo hemostático envolve eventos como a vasoconstrição que
resulta em redução da perda sanguínea, ativação plaquetária e fatores de
coagulação do sangue que resulta na formação de um tampão hemostático
insolúvel, seguido da fibrinólise que dissolve o tampão hemostático após o reparo
vascular (SAJEVIC et al., 2011). A resposta hemostática inicia com a exposição
do subendotélio que promoverá a adesão de plaquetas às proteínas matriciais
expostas no local da injúria. Após o evento da adesão, as plaquetas são ativadas,
recrutam assim mais plaquetas e promove um agregado, chamado “tampão
hemostático primário”. As plaquetas agregadas estimulam a ativação de fatores
de coagulação do plasma, esses fatores de coagulação promovem a formação de
fibrina, tornando o coágulo insolúvel (RIDDEL JÚNIOR et al., 2007; SCHNEIDER
and SOBEL, 2007).
1.2.1. Hemostasia Primária
Quando a integridade da parede vascular é interrompida, ocorre a ativação
do sistema hemostático. Este fenômeno envolve diversas interações entre
componentes endoteliais e subendoteliais, plaquetas e outras células sangüíneas
periféricas e proteínas pró-coagulantes circulantes. As plaquetas desempenham
um papel essencial nestas interações, pois participam diretamente da primeira
fase da hemostasia, contribuindo com seus receptores de membrana que facilitam
e amplificam a atividade localizada dos fatores da coagulação sanguínea
(HOFFBRAND et.al., 2006) (Figura 1).
3
Figura 1: Vasoconstrição e Hemostasia Primária. A. Representação do mecanismo de
vasoconstrição, que é uma ação reflexa após injúria vascular. B. Após a injúria vascular ocorre
adesão das plaquetas no local da injúria, seguida de Shape change (mudança conformacional) e
liberação dos grânulos, a liberação de ADP e TXA2 promove recrutamento de outras plaquetas,
formando então o tampão hemostático (Adaptado de KUMAR et al., 2006).
1.2.2. Hemostasia Secundária e Fibrinólise
Simultaneamente ao processo de hemostasia primária, os fatores de
coagulação do sangue são ativados, levando a formação do coágulo de fibrina. A
coagulação sanguínea é iniciada quando fator VII de coagulação (FVII) entra em
contato com fator tecidual (TF) em células fora da vasculatura, como resultado de
uma lesão dos vasos sanguíneos, e sofre ativação (FVIIa). O complexo FVIIa / TF
posteriormente ativa pequenas quantidades de FIX e FX para FIXa e FXa.
(SAJEVIC et al., 2011; SCHNEIDER and SOBEL, 2007). O complexo FVa / FXa
em seguida ativa a protrombina em trombina na superfície das plaquetas. A
trombina cliva fibrinogênio e assim permite a sua polimerização. Também ativa
FXIII para FXIIIa, que é uma transglutaminase, e estabiliza o coágulo de fibrina
por ligação cruzada de moléculas de fibrina (SAJEVIC et al., 2011; SCHNEIDER
and SOBEL, 2007) (Figura 2).
Uma vez que o coágulo de fibrina e plaquetas é formado sobre a lesão do
vaso área, o processo de coagulação é atenuado para evitar oclusão trombótica
em áreas circundantes normais da vasculatura. O processo de coagulação é
regulado para baixo por: (a) antitrombina-III (AT-III), que inibe a trombina e outros
fatores de coagulação do sangue que pertencem a serinoproteinases (FIXa, FXa
e FXIa), (b) proteínas C e S, que inativam FVa e FVIIIa, e (c) inibidor via TF
4
(TFPI), o qual se liga e inibe FXa livre e também FXa e FVIIa associado no
complexo TF / FVIIa / FXa. Finalmente, após cura da ferida, a fibrinólise remove o
coágulo de sangue sistema. A enzima de fibrina-degradantes principal no sangue
é plasmina, que é formado a partir do plasminogenio por proteólise específica por
proteinases da serina endógenos, ativador plasminogenio tecidual (t-PA) e
uroquinase (u-PA) (SAJEVIC et al., 2011) (figura 2).
Figura 2: Hemostasia Secundária e Fibrinólise. A. Esquema representativo do processo de hemostasia secundária. Podemos observar a contribuição do fator tecidual e da ativação plaquetária para a ativação da trombina e formação da rede de fibrina (representada em azul). B. Esquema representativo do trombo estabilizado. Este esquema mostra células vermelhas e brancas do sangue aprosionadas na rede de fibrina, além de indicar o bloqueador da cascata de
coagulação (trombomodulina) e um ativador da fibrinólise (t-PA) (Adaptado de KUMAR et.al., 2006).
1.3. PLAQUETAS
As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos de formato discóide,
derivadas da fragmentação de uma célula precursora chamada de megacariócito,
na medula óssea. Cada megacariócito origina de 1000 a 5000 plaquetas. A
contagem normal de plaquetas varia de 150 x 109 a 400 x 109 / L de sangue
humano, e a sobrevida média é de 7 a 10 dias (HOFFBRAND et al., 2006).
Vários mecanismos impedem plaquetas circulantes de aderirem à matriz
subendotelial, dentre eles a integridade do endotélio e a síntese de óxido nítrico
(NO) (NUYTTENS et al., 2011). Entretanto, quando recrutadas devido à
exposição de moléculas do subendotélio, principalmente colágeno e fator de von
Willebrand (vWF), as plaquetas sofrem uma drástica mudança morfológica e
funcional (NIESWANDT and WATSON, 2003; DENIS and WAGNER, 2007).
5
Quando expostas a agonistas como ADP, serotonina, trombina ou colágeno são
ativadas, mudando da forma discóide para a forma esférica, com extensa emissão
de pseudópodos (processo chamado de “shape change”) que auxilia a adesão ao
local da lesão vascular (ANDREWS and BERNDT, 2004; HOFFBRAND et al.,
2006). As mudanças morfológicas também são acompanhadas pela redistribuição
de fosfolipídios de membrana, tornando a membrana fosfolipídica carregada
negativamente, formando uma superfície pró-coagulante (SOLUM, 1999) (Figura
3).
Figura 3: Plaquetas ativadas. A imagem de microscopia eletrônica de varredura mostra ativação plaquetária. As plaquetas ativadas emitem inúmeros pseudopodes que auxilia a adesão ao local da injúria vascular (http://www.nanowerk.com).
A adesão das plaquetas ao subendotélio pode acontecer diretamente ou
através de moléculas de adesão presentes nas membranas das plaquetas.
Glicoproteínas adesivas localizadas na membrana das plaquetas são capazes de
interagir com moléculas da matriz subendotelial promovendo adesão plaquetária.
Os eventos subsequentes são a ativação de receptores do tipo integrinas que
promovem a interação entre as plaquetas via interação com fibrinogênio
(agregação) além de promover melhor aderência plaquetária às proteínas da
matriz subendotelial. A ativação das plaquetas promove ainda a secreção de
substâncias presentes nos grânulos citoplasmáticos, contribuindo ainda mais para
a ativação e agregação plaquetária. Como resultado, o “tampão” plaquetário é
6
formado na área danificada como uma primeira defesa no processo hemostático
(SOLUM, 1999) (Figura 4).
As plaquetas ativadas secretam de seus grânulos várias moléculas (ADP,
ATP, Tromboxano A2 e epinefrina) que amplificam o processo recrutando mais
plaquetas para o local da injúria, promovendo o crescimento e estabilidade do
trombo inicial (SACHS and NIESWANDT, 2007). O recrutamento de novas
plaquetas para o local da injúria é realizado principalmente através da agregação
plaquetária. Esse processo é mediado pela glicoproteína IIb, que quando
ativada se liga a substratos (fibrinogênio) formando uma ponte com a interação
com outra glicoproteína IIbde outra plaqueta promovendo a agregação entre
elas e sua imobilização. Porém, a integrina IIb3 não é apenas uma molécula de
ancoragem, mas também sinaliza quando seu substrato encontra-se ligado
(SACHS and NIESWANDT, 2007) (Figura 5).
Figura 4. Modelo de adesão plaquetária à matriz subendotelial em locais de injúria vascular. O contato inicial entre as plaquetas e a matriz extracelular (MEC) é predominantemente mediado por interações Glicoproteínas – Fator de von Willebrand (GPIba – vWF). Essa interação é essencial na circulação arterial (alto fluxo sanguíneo), mas pode não ser necessária na circulação venosa (baixo fluxo sanguíneo). Em uma segunda etapa, as interações GPVI-colágeno iniciam a ativação celular seguido de mudança conformacional das suas integrinas para um estado de alta afinidade, além da liberação de agonistas (ADP, ATP, e TXA2). A sinalização mediada GPIb pode ampliar a via ativação. Em paralelo, o fator tecidual exposto (TF) desencadeia a formação de trombina no local, além de juntamente com a GPVI, mediar à ativação celular. Dependendo da natureza da lesão, uma das duas vias de ativação pode prevalecer. Por fim, a firme adesão de
plaquetas ao colágeno através (diretamente) e b (indiretamente, via vWF outros ligantes) resulta na sustentação da sinalização GPVI, maior secreção e atividade pró-coagulante.
Neste processo, as integrinas e b têm papéis parcialmente redundantes. A secreção de ADP, ATP, e TXA2 ampliam ativação das integrinas em plaquetas aderidas e medeia o crescimento do trombo ativando as plaquetas adicionais. Este regime não exclui o envolvimento de outras interações receptor-ligante (Adaptado de SACHS and NIESWANDT, 2007).
7
Figura 5: Esquema da agregação plaquetária. A agregação plaquetária tem sido vista como a
interação entre as integrinas IIb3 (GPIIbIIIa) e o fibrinogênio em suspensão. Neste modelo, a indução da ativação da plaqueta por um agonista solúvel gera uma mudança conformacional no domínio extracelular da integrina, levando a um aumento da afinidade pelo fibrinogênio. Uma molécula de fibrinogênio dimérica interage com dois receptores do tipo GPIIbIIIa em plaquetas adjacentes, levando à agregação plaquetária (Adaptado do JACKSON and SCHOENWAELDER, 2003).
1.3.1. Integrinas
As integrinas representam uma grande família de receptores
transmembrana, estando envolvidas em diversos eventos biológicos. São
glicoproteínas heterodiméricas, compostas por uma subunidade (120-180 KDa)
associada a uma subunidade (90-110 KDa) (CALVETE, 1999).
As integrinas são receptores celulares que promovem comunicação do
meio extracelular com o citoesqueleto, promovendo sinalização transmembrana
bidirecional, ou seja, do meio extracelular para o intracelular (“Outside-in”) e do
meio intracelular para o extracelular (“Inside-out”). Portanto, quando a ligação é
extracelular desencadeia sinalização intracelular, e modificações intracelulares
modulam sua afinidade extracelular (PAYRASTRE et al., 2000; ANDREWS and
BERNDT, 2004; CALVETE, 1999).
A integrina predominante na superfície das plaquetas é a IIb3
(GPIIbIIIa), que medeia à agregação plaquetária se ligando ao fibrinogênio
8
circulante no plasma, além de ser o principal receptor para adesão plaquetária
com a matriz extracelular in vivo (NIESWANDT et al., 2009).
A importância da integrina IIb3 na hemostasia e na trombose já está bem
documentada em humanos e em animais experimentais. A mudança da integrina
IIb3 de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade é
considerado uma via comum de ativação plaquetária (NIESWANDT et al., 2009).
A regulação deste processo, e a interação com seus ligantes representam alvos
em potencial para agentes antitrombóticos que tem sido estudado intensivamente
nas últimas décadas.
Já é conhecido que a ativação plaquetária pode ocorrer pela ação de
agonistas, que se liga a receptores específicos. Esses agonistas podem ser
secretados pela própria plaqueta ou serem formados no local da injúria.
Dentre os receptores que participam da ativação plaquetária, daremos
ênfase para os receptores de ADP, que será utilizado neste trabalho com a
finalidade de avaliar a agregação plaquetária in vitro.
1.3.2. Receptores para ADP
ADP e seus análogos se ligam a receptores P2, que são expressos
ubiquamente em todo o corpo humano, incluindo sobre as plaquetas, em células
musculares lisas, e em células endotelial. Receptores P2 são divididos em
receptores P2X e P2Y. Receptores P2X são receptores de canais iônicos e P2Y
são receptores purinérgicos acoplados a proteína G. As plaquetas expressam
receptores P2X1, P2Y1, e P2Y12 (ANDREWS and BERNDT, 2004; JOO, 2012).
A ligação do ADP ao receptor P2X1 resulta em rápido influxo de cálcio
extracelular, levando a alteração da forma das plaquetas, mas sem a ativação
plaquetária. O complexo receptor de ADP P2Y1-Gq estimulado ativa a fosfolipase
C (PLC) e induz um transiente aumento de concentração de cálcio intracelular
resultando em fraca mudança na forma das plaquetas e, a agregação de
plaquetas transiente (JOO, 2012). Agregação plaquetária estável e firme requer
ligação de ADP ao receptor P2Y12 e ativação de receptores GPIIb / IIIa da
membrana das plaquetas. A ativação do receptor acoplado Gi-P2Y12 libera a
9
subunidades da proteína Gi, αGi e βγ. A subunidade αGi diminui o nível de ADP
cíclico (cAMP) de plaquetas, através da inibição da adenilato ciclase. Esta
diminuição na produção de cAMP conduz, por sua vez, a uma redução na
ativação da proteína quinase C (PKC) e, após processos de transdução de sinais
complexos, ativação de GP IIb / IIIa. A subunidade βγ ativa o fosfatidilinositol 3-
quinase (PI-3K), que regula a proteína quinase Akt e contribui para a ativação de
GP IIb / IIIa (ANDREWS and BERNDT, 2004; NIESWANDT et al., 2009; JOO,
2012).
Plaquetas ativadas por outros agonistas (incluindo colágeno, vWF, ou
trombina) secretam ADP que estão presentes nos grânulos densos, e este ADP,
por sua vez, atua em seus receptores, estabilizando a agregação plaquetária
(ANDREWS and BERNDT, 2004).
1.4. TROMBOSE
A trombose pode ser ocasionada pela ativação inespecífica do sistema
hemostático, podendo ocasionar a oclusão de vasos. A trombose arterial é
responsável pela maioria dos casos de infarto do miocárdio e por
aproximadamente 80% dos Acidentes Vasculares Encefálicos (AVE). Ambos,
infarto e AVE são as maiores causas de morte nos países desenvolvidos, já a
trombose venosa, representada pelo tromboembolismo venoso, é a terceira causa
de morte associada a doenças cardiovasculares (MACKMAN, 2008).
1.4.1. Trombose Arterial
O fator que desencadeia a trombose arterial é a ruptura de placas de
aterosclerose, que se desenvolve pelo acúmulo de lipídeos na parede das
artérias. Quando ocorre a ruptura de uma placa, o endotélio vascular é lesionado,
recrutando as plaquetas, através da interação destas com o colágeno e com fator
de von Willebrand, para o sítio da lesão (MACKMAN, 2008) (Figura 6 - A).
10
As plaquetas aderidas ao sítio da lesão se ativam, passando a secretar o
conteúdo de seus grânulos que recrutam mais plaquetas favorecendo a
agregação plaquetária e crescimento do trombo. As plaquetas ativadas
proporcionam a ativação da cascata de coagulação, que após uma sequência de
eventos culmina na formação de fibrina (DENIS and WAGNER, 2007).
Figura 6. Gatilhos de trombose arterial e venosa. A. Luz da artéria. O gatilho primário de trombose arterial é a ruptura de uma placa aterosclerótica. Trata-se de ruptura do endotélio e liberação de componentes da placa no lúmen do vaso sanguíneo. B. Luz da veia. Em contrapartida, na trombose venosa, o endotélio permaneça intacto, mas pode ser convertido de uma superfície com propriedades anticoagulantes para um com propriedades pró-coagulantes (Adaptado de MACKMAN, 2008).
1.4.2. Trombose Venosa
A trombose venosa profunda ocorre principalmente como resultado de
alterações na composição dos fatores de coagulação, diminuição ou estase do
fluxo sanguíneo e lesões vasculares, levando a um quadro de
hipercoagulabilidade, estes componentes compõem a tríade de Virchow
(HOFFBRAND et al., 2006; MACKMAN, 2008). Exposições ambientais e
interações genéticas são fatores de risco para o tromboembolismo, assim como
obesidade, câncer, grandes cirurgias, entre outros (HEIT, 2007; CUSHMAN,
2007).
11
A trombose venosa profunda e o embolismo venoso são conhecidos como
tromboembolismo, ocorrendo na maioria das vezes na grande veia da perna (veia
safena). O embolismo pulmonar é uma complicação da trombose venosa
profunda que pode ocorrer caso o trombo desprenda-se e migre junto com o fluxo
sanguíneo até ocluir um vaso pulmonar de menor calibre, provocando isquemia
tecidual. O trombo que é formado na veia é rico em fibrina e células vermelhas do
sangue, sendo esse conhecido como trombo vermelho (MACKMAN, 2008) (Figura
6 - B).
1.4.3. Terapia
A fisiopatologia da trombose arterial difere da trombose venosa, refletindo
assim em tratamentos distintos para cada patologia. De maneira geral, a
trombose arterial é tratada com fármacos antiplaquetários, enquanto a trombose
venosa é tratada com fármacos que tem os fatores da coagulação como alvo. Os
fármacos antitrombóticos disponíveis são eficientes na redução e prevenção da
trombose arterial e venosa, porém o principal efeito colateral desses fármacos é a
hemorragia, a qual limita o uso desses medicamentos (MACKMAN, 2008).
Os fármacos antiplaquetários mais utilizados no tratamento e prevenção da
trombose arterial são: a aspirina (inibidor da síntese de TXA2), clopidogrel
(antagonista do receptor de ADP), os inibidores do receptor PAR- 1 E5555 e SCH
530348 (inibe ativação plaquetária pela ação da trombina), e inibidores da
integrina αIIbβ3 como abciximab e eptifibatide (inibem a agregação plaquetária)
(MEADOWS and BHATT, 2007) (Figura 7).
12
Figura 7: Alvos dos fármacos antiplaquetários. As plaquetas possuem uma grande variedade de receptores que medeiam sua ativação (verde) e sua adesão na parede dos vasos (vermelho), e sua agregação com outras plaquetas (azul). Os ligantes para vários receptores estão representados e os fármacos e seus alvos estão indicados na figura (TXA2, PAR-1, receptor de ADP e a integrina αIIbβ3) (MACKMAN, 2008).
Os fármacos anticoagulantes reduzem a atividade de várias proteases na
cascata de coagulação através de inibição direta, inibição de modificações pós-
traducionais ou pelo aumento da atividade anticoagulante. Os principais
anticoagulantes são: antagonistas de vitamina K (Varfarina), heparina e heparina
de baixo peso, além dos inibidores diretos dos Fatores Xa e IIa (MACKMAN,
2008).
O tratamento com agentes inibidores de agregação plaquetária, como a
aspirina e agentes anticoagulantes como a heparina e a warfarina demonstram
um avanço no tratamento de doenças tromboembólicas, no entanto estas
substâncias possuem limitações consideráveis (MACKMAN, 2008). A
necessidade de monitoramento laboratorial contínuo no tratamento, com heparina
13
ou warfarina, é considerado desvantajoso, juntamente com o risco de provocar
hemorragias. Diante das limitações desses fármacos, diversos antitrombóticos
são constantemente estudados, contribuindo para a expansão do conhecimento
sobre a fisiopatologia da agregação das plaquetas e ativação da coagulação
(MACKMAN, 2008).
1.5. DESINTEGRINAS
O termo desintegrina foi utilizado pela primeira vez, em 1990, para
denominar um grupo de peptídeos provenientes dos venenos de serpentes da
família Viperidae com habilidade de inibir a agregação plaquetária, em seguida
foram isolados em venenos de outras famílias, como Atractaspididae, Elapidae e
Colubridae (McLane et al., 2004). A maioria das desintegrinas interage com
integrinas de maneira dose dependente através de uma alça com a sequência
Arg-Gly-Asp (RGD), apresentando um papel importante na interação do peptídeo
com as integrinas (MARCINKIEWICZ et al., 1997). Dados suportam a hipótese
que as desintegrinas de venenos de serpentes Viperidae são sintetizadas como
PII e PIII Metaloproteinases / desintegrinas, e após clivagem da molécula
precursora elas são liberadas para o veneno. Recentemente, tem sido
considerada a possibilidade de algumas desintegrinas serem codificadas por
precursores sem o domínio das Metaloproteinases, sendo liberados diretamente
como peptídeos no veneno (CALVETE et al., 2003).
As desintegrinas derivadas de venenos são divididas em cinco grupos,
baseados no número de aminoácidos e no número de pontes dissulfeto. O
primeiro grupo é composto por pequenas desintegrinas, que contém 41-51
resíduos de aminoácidos e 4 pontes dissulfeto. O segundo grupo é formado por
desintegrinas média, com aproximadamente 70 resíduos de aminoácidos e 6
pontes dissulfeto, entre elas jararacina e jarastatina. O terceiro grupo é composto
por desintegrinas grandes, contendo 84 resíduos de aminoácidos e 7 pontes
dissulfeto. As Metaloproteinases PIII com domínio desintegrina possuem em torno
de 100 resíduos de aminoácidos, sendo 16 resíduos de cisteína, e oito pontes
dissulfeto, constituindo o quarto grupo, e finalmente o quinto grupo, que é
composto por desintegrinas diméricas contendo subunidades de
14
aproximadamente 67 resíduos de aminoácidos, sendo 10 cisteínas, e quatro
pontes dissulfeto (CALVETE et al., 2003) (Tabela 1).
Tabela 1: Classificação das desintegrinas de acordo com o tamanho.
Grupo Nº de Aminoácidos Nº de Pontes Dissulfeto
Pequenas 41 - 51 4
Médias ~ 70 6
Grandes 84 7
Metaloproteinases - PIII 100 8
Diméricas ~ 67 (cada subunidade) 4
As desintegrinas interagem com as integrinas na superfície celular
influenciando os processos de sinalização celular, apoptoses, hemóstase,
angiogênese ou câncer, dentre outros (McLANE et al., 2004; DELLA-CASA et al.,
2011). O bloqueio seletivo das integrinas pelas desintegrinas levou à utilização
destas moléculas com a finalidade de desenvolvimento de terapias para
numerosas condições patológicas, incluindo isquemia coronariana aguda e
trombose (ligação com a integrina IIb3), metástase tumoral, osteoporose
(ligação com a integrinav3), infecções bacterianas e doenças vasculares
(ligação com a integrina v1), inflamação e doenças autoimunes (ligação com as
integrinas 41, 71 e 91), e angiogênese tumoral (ligação com as integrinas
11 e v3). As integrinas que estão relacionadas com as patologias citadas
anteriormente são alvos da ação de diferentes desintegrinas (DELLA-CASA et al.,
2011).
As atividades biológicas das desintegrinas dependem do pareamento
adequado de suas cisteínas, as quais determinam à conformação da alça
responsável pela interação com as integrinas. Este domínio peptídico é composto
por um tri-peptídeo presente em uma alça formada pela ligação de dois resíduos
de cisteína, como, por exemplo, o domínio RGD. Algumas desintegrinas podem
apresentar diferentes sequências tripeptídicas de reconhecimento, na maioria das
vezes conservando o ácido aspártico, sendo suas seqüências representadas por
R/K/M/W/VGD, MLD, MVD ou K/RTS (SCARBOROUGH et al., 1993). Desta
forma, dependendo da seqüência deste tri-peptídeo a molécula apresenta
15
atividades biológicas distintas por interagir de maneira diferente com diversas
integrinas. (SCARBOROUGH et al., 1993; DELLA-CASA et al., 2011).
A literatura demonstra, através de testes com moléculas que apresentaram
substituições dos resíduos posicionados tanto na região N-terminal quanto na
região C-terminal, ao redor da sequência RGD, que esses resíduos também
apresentam grande importância para determinar a especificidade do
reconhecimento das integrinas (RAHMAN et al.; 1998).
Os aminoácidos na posição N-terminal à alça RGD também mostraram um
papel importante na especificidade de interação com a integrina para
desintegrinas monoméricas (RGD) e diméricas (MLD) (RAHMAN et al., 1998).
A literatura descreve uma série de desintegrinas, como por exemplo, as
desintegrinas jarastatina e jararacina, que foram isoladas e identificadas do
veneno da serpente Bothrops jararaca (SCARBOROUGH et al., 1993;
WERMELINGER et al., 2009) (Figura 8). A jararacina, dentre outras dez
desintegrinas, foi isolada por Scarborough e colaboradores, sendo capaz de inibir
a agregação plaquetária de plaquetas humanas induzida por ADP (IC50 177 nM),
trombina e colágeno, além de bloquear a interação do fibrinogênio e da
vitronectina com suas integrinas IIb3 e v3, apresentando um IC50 de 12 e 5
nM, respectivamente (SCARBOROUGH et al., 1993). A jarastatina foi identificada
e purificada por nosso grupo, e mostrou ser uma desintegrina altamente
homóloga à jararacina, capaz de inibir a agregação plaquetária em plaquetas de
coelho induzidas com ADP (IC50 800 nM), trombina (IC50 2,2 μM) e colágeno (IC50
3,0 μM) (WERMELINGER, 2009). Neste mesmo trabalho foi demonstrado que a
jarastatina inibe a migração de neutrófilos induzida por carragenina in vivo, assim
como a quimiotaxia in vitro de polimorfonucleares (PMN) humanos em direção a
IL-8 e fMLP, além de promover um rearranjo no citoesqueleto de actina em
neutrófilos humanos imediatamente após o estímulo com a jarastatina. Estes
dados sugerem que a jarastatina inibe a adesão e a migração de neutrófilos pela
interação com as integrinas de superfície celular, assim como é capaz de ativá-las
e gerar o rearranjo do citoesqueleto de actina (WERMELINGER, 2009).
Desta forma, um estudo maior sobre as ações destas desintegrinas nos
processos de agregação plaquetária e trombose são necessários para avaliar o
16
potencial terapêutico. As desintegrinas jarastatina e a jararacina recombinantes
serão analisadas neste trabalho.
Figura 8: Características estruturais das desintegrinas nativas: A estrutura secundária de jarastatina (à esquerda) e jararacina (à direita), os motivos RGD foram destacados na caixa pontilhada. Os aminoácidos do motivo RGD estão demonstrados em amarelo (R), rosa (G) e vermelho (D). (modificado de WERMELINGER et al., 2009).
17
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVOS GERAIS
A alta incidência de trombose ainda permanece como a principal causa de
morte nas sociedades ocidentais, apesar dos tratamentos antitrombóticos
disponíveis. Isto pode ser observado através do crescimento contínuo de artigos
científicos publicados sobre o estudo de trombose (MACKMAN, 2008). A busca
por novas drogas com atividade antitrombótica e que apresentem menores efeitos
colaterais é uma constante na área da pesquisa.
Assim, este trabalho tem como objetivo verificar a atividade antitrombótica
das desintegrinas jarastatina e jararacina recombinantes através de ensaios de
agregação plaquetária e modelo de tromboembolia pulmonar.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Análise in vitro e in vivo do perfil antiplaquetário e antitrombótico das
desintegrinas jararacina e jarastatina recombinantes.
Expressar as desintegrinas em modelo heterólogo (E. coli);
Purificar e isolar as desintegrinas recombinantes utilizando técnicas
cromatográficas;
Avaliar a expressão e a purificação através gel de SDS-PAGE;
Avaliar a atividade antiplaquetária das desintegrinas, utilizando ADP
como agonista;
Utilizar o modelo de tromboembolia induzida por ADP para avaliar o
potencial efeito antitrombótico.
18
3. METODOLOGIA
3.1. EXPRESSÃO DAS DESINTEGRINAS
O cDNA foi identificado a partir de uma glândula de veneno, de serpente
Bothrops jararaca, clonado e seqüenciado. A região da proteína madura de
codificação foi amplificada por PCR com oligonucleotídeos sintetizados. O produto
de amplificação foi inserido no plasmídeo pET32a para expressar jarastatina
recombinante (rJAST) e jararacina recombinante (rJARC) em células de E. coli
BL21 (DE3). Este plasmidio contém uma thioredoxina-tag que contribui para a
formação de pontes dissulfeto, e para facilitar a purificação na coluna de níquel
(cromatografia de afinidade - His-Trap) (Figura 9). Depois de amplificado esses
plasmídeos foram inseridos em E. coli Origami ™. Esse processo foi realizado por
nosso grupo em parceria com o Professor Rodolpho M Albano do Departamento
de Bioquímica da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ).
As bactérias E. Coli transformadas foram inoculadas em 100 mL de Meio
Luria Bertani (Meio LB), contendo 100 g / mL Ampicilina e 5 g / mL de
Tetraciclina, e mantidas sob agitação (200 rpm) a 37º C por aproximadamente 24
horas. Após este período, uma alíquota de 2 mL foi transferida para 1 L de Meio
LB, onde cresceu por aproximadamente 3 horas a 37º C, até alcançar D.O.600nm =
0,6-0,8.
A expressão da proteína recombinante foi induzida pela adição de 1 mL de
Isopropyl-Thio-2-D-Galactopyranoside (IPTG) 0,5 mM e incubado continuamente
por 18 horas sob agitação (200 rpm) a 37ºC.
19
Figura 9: Esquema simplificado do plasmídio pET-32a. O pET-32 é utilizado para a clonagem e
expressão de sequências peptídicas fundidas com Trx-Tag (proteína tiorredoxina), e sítios de proteínas de fusão contendo também sequências His-Tag cliváveis, para a detecção e purificação (Grünecker et al, 2010).
3.2. PURIFICAÇÃO DAS DESINTEGRINAS
As células foram coletadas por centrifugação a 14000 rpm (centrífuga
HITACHI – rotor 29 / R14A) por 20 min., e ressuspensas em 30 mL tampão
(fosfato de sódio 20 mM, NaCl 0.5M imidazol 20 mM), para serem lisadas por
sonicação na presença de pérolas de vidro. Todo o volume foi coletado e
transferido para um tubo cônico de 50 mL, foi adicionado Microesferas de vidro (3
– 4 mm) e o tubo cônico foi mantido em gelo por 5 min., seguido por sonicação
em banho de gelo por 5 min., este ciclo foi repetido 5 vezes. O extrato celular foi
submetido à centrifugação (14000 rpm em 20 min) e a fração solúvel foi coletada.
Em seguida, a fração solúvel foi aplicada em uma coluna de afinidade His-Trap™
FF (GE Healthcare) com capacidade de eluição de 1 mL/ minuto. Para as
lavagens da coluna foi utilizada uma bomba peristaltica P-1 (GE Healthcare). Para
purificação das desintegrinas foram utilizados 20 mL de tampão A (fosfato de
sódio 20 mM, NaCl 0,5 M imidazol 20 mM) para a lavagem da coluna seguido de
10 mL de tampão B (fosfato de sódio 20 mM, NaCl 500 mM imidazol 0,5 M) para a
eluição das desintegrinas. A amostra eluida na coluna His-trap foi dialisada em
membrana de 4 KDa (Spectra) em tampão Tris-HCl 20 mM pH 7,4 por 24 horas
sob refrigeração, em seguida foi concentrada em Amicon (Millipore) com
membrana de 10 KDa, pois as desintegrinas recombinantes com a proteína de
20
fusão possuem peso teórico em torno de 25 KDa. As amostras concentradas
foram quantificadas, em seguida foram submetidas à hidrólise através da ação da
enzima Enteroquinase (1U de enzima / 50 μg de desintegrina) para remoção do
tag de Histidina. A reação foi mantida por 16 horas a 20º C em solução Tris-HCl
pH 7,4. Após o processo de hidrólise, as desintegrinas foram separadas das
“caudas” e das enzimas através de Amicon (Millipore) com membrana de 10 KDa,
onde o ultrafiltrado possui as desintegrinas (Após hidrólise a rJARC possui peso
molecular de 7738 Da e a rJAST possui peso molecular de 7752 Da), estes foram
concentrados em Speed-Vac e quantificados. A pureza das amostras foi
confirmada por eletroforese SDS-PAGE 18% e 15%.
3.3. QUANTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS
A concentração das proteínas foi determinada por espectofotometria utilizando
o da molécula. O foi calculado utilizando o programa Peptide property
Calculator. Os valores de encontrado foram 23.870 (rJARC) e 25.150 (rJAST)
para proteína de fusão e 1.440 (rJARC) e 2.720 (rJAST) para os peptídeos
hidrolisados. O cálculo foi realizado dividindo o valor encontrado na
espectrofotometria Abs280 nm pelo valor do da molécula.
Também foi utilizado “BCA TM Assay Kit” (2D Quant Kit – Amersham
Biosciences), neste método a reação que conduz à formação de cor BCA é
fortemente influenciada por quatro resíduos de aminoácidos (cisteína ou cistina,
tirosina e triptofano) na sequência de aminoácidos de proteínas.
Para a quantificação com BCA TM Assay Kit, foi feito uma curva padrão com
oito pontos de concentração entre 2000 µg/ mL – 0 µg/ mL de BSA (Albumina
Bovina Sérica). Em uma placa de 96 poços, foi aplicado 25 µL de cada solução
padrão (BSA) e 25 µL de cada amostra (todos em duplicata), em seguida foi
aplicado 200 µL de solução reagente. A reação foi mantida por 30 minutos a 37ºC
protegida da luz, em seguida foi realizada a leitura em DO562 nm. Os valores
referentes à curva de BSA foram plotados em uma tabela do Microsoft Excel para
21
aquisição do gráfico e da equação da reta, esta foi utilizada para calcular as
concentrações das amostras.
3.4. ELETROFORESE EM GEL DESNATURANTE (SDS-PAGE)
A eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada utilizando um Mini-
PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As amostras de
diversas etapas foram analisadas por SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis) (LAEMMLI, 1970). As proteínas foram
desnaturadas por fervura a 100°C por 5 min em um tampão de amostra (Tris HCL
0,5M pH 6,8, Glicerol, Bromofenol Blue 0,05% e SDS 10%). O gel de corrida foi
preparado na concentração de 18% e 15% e o gel de empilhamento na
concentração de 4%. O gel correu por 2 h a 120 V e 50 mA. Para a revelação do
gel utilizou-se Coomassie blue G. Os géis foram digitalizados utilizando um
scanner (Amershan).
3.5 ENSAIO DE AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA COM PLAQUETA HUMANA
Sangue humano foi coletado em tubos de vácuo com citrato de sódio (9:1
v/v). O plasma rico em plaquetas (PRP) foi preparado por centrifugação, a 800
rpm por 10 minutos. O plasma pobre em plaquetas (PPP) foi preparado por
centrifugação, a 3500 rpm por 10 minutos. A agregação plaquetária foi monitorada
por método turbidimétrico de Born e Cross utilizando-se um agregômetro Chrono-
log (Havertown, PA, USA). PRP (350 μL) foi incubado a 37° C por 1 minuto. A
agregação plaquetária foi induzida por ADP (4 – 6 μM). As desintegrinas foram
adicionadas em concentrações crescentes, 1 minuto antes da adição do agente
agregante (Figura 10). Para todos os testes uma curva inicial com o agonista foi
realizada. A concentração do indutor escolhida para análise foi aquela que
provocou 80-90 % de agregação plaquetária (WERMELINGER, 2010).
22
Figura 10: Ensaios de agregação plaquetária no agregômetro (A) e seu registro experimental (B). A: plaquetas normais (acima), deficientes ou tratadas com antagonistas plaquetários (abaixo) são testadas com agonistas, como ADP, resultando em diferentes registros; B: registro experimental de um ensaio no agregômetro utilizando plaquetas normais, mostrando o início do experimento (1), após a adição do agonista, quando ocorre a mudança de forma da plaqueta (shape change) com posterior secreção dos grânulos (2) e, finalmente ,a agregação plaquetária, quando ocorre a ligação plaqueta/plaqueta (3) (Castro et al, 2006).
3.6. ANIMAIS
Os experimentos envolvendo animais foram realizados utilizando-se
camundongos BALB-C (ambos os sexos) com aproximadamente 8 semanas de
vida, pesando entre 20 e 25 g. Todos os experimentos envolvendo animais foram
realizados de acordo com as normas do COBEA (Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal), e do Committee on Animal Research and Ethics
(CARE), e aprovados pelo comitê de ética do Centro de Ciências da Saúde da
UFRJ (IBqM 004).
3.7. ENSAIO DE TROMBOEMBOLIA PULMONAR INDUZIDA POR ADP
A atividade antitrombótica foi determinada utilizando camundongos BALB-c
(ambos os sexos) com aproximadamente 8 semanas de vida, pesando entre 20-
25 g. Eventos trombóticos foram induzidos por injeção intravenosa de uma
23
suspensão de ADP (0,5 mg / g de animal), a taxa de mortalidade foi determinada
15 minutos após a indução da trombose contando o número dos animais que
sobreviveram em um grupo de cinco animais. Os animais foram tratados com as
desintegrinas recombinantes (5 mg/ Kg de animal) por via intravenosa, 5 minutos
antes da indução da tromboembolia e posteriormente a sobrevivência dos grupos
foi quantificada (FRATTANI, 2009).
3.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foi utilizado o software Graph Pad Prism 5 for Windows. Os resultados
foram expressos em média ± SD e sua análise estatística obtida através da
determinação da analise da variância, seguida do teste de Bonferroni, com
mudanças consideradas significativas, sendo p-valor menor ou igual a 0,1 e 0,01.
24
4. RESULTADOS
4.1. EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DAS DESINTEGRINAS.
As bactérias recombinantes adquiridas foram inoculadas e o extrato solúvel
originado da lise bacteriana foi coletado. As amostras referentes à expressão,
jararacina recombinante (rJARC) e jarastatina recombinante (rJAST), foram
submetidas inicialmente a um gel de SDS-PAGE 18 %, no entanto o gel não
apresentou definição satisfatória, motivo pelo qual utilizamos posteriormente um
SDS-PAGE de 15%, o qual mostrou uma melhor separação e definição. O gel foi
corado com Coomassie Brilliant Blue G-250 para obter uma melhor resolução
confirmando a expressão das desintegrinas (Figura 11).
(A) (B)
Figura 11 (A) rJARC e (B) rJAST: SDS-PGE 15% referente à expressão das desintegrinas recombinantes. SDS-PAGE 15% corado com Coomassie Brilliant Blue G-250. Em 1 observamos o padrão de peso molecular e 2 corresponde à fração solúvel do extrato lisado da E. coli. As setas
em vermelho apontam à banda correspondente a proteína de fusão.
Em seguida o extrato solúvel originado da expressão foi aplicado em uma
coluna de afinidade His-Trap™ FF (GE Healthcare) a qual possui uma resina
complexada com níquel, desta forma as proteínas que possuírem a cauda de
histidina (somente a de interesse) ficarão grudadas na resina. Para eluir a
proteína da coluna de níquel, foi utilizado um tampão com Imidazol, que reduz a
afinidade das histidinas ao níquel. A purificação originou 100 mL de amostra
25
eluída para cada litro de meio. Em seguida as proteínas eluídas foram
concentradas em Amicon originando um volume de aproximadamente 4 mL, e
posteriormente quantificadas utilizando espectrofotometria (a concentração é
encontrada dividindo o valor da densidade ótica (Abs 280 nm) pelo da molécula)
(Tabela 2). Posteriormente, as amostras foram clivadas utilizando a enzima
enteroquinase, em seguida foram passadas novamente pela membrana do
Amicon que gerou um ultrafiltrado com as desintegrinas recombinantes e
finalmente, as desintegrinas foram quantificadas para serem usadas nos ensaios
biológicos. Os processos de expressão e purificação ocorreram como
representado na figura 12.
Figura 12: Organograma. Descrição da metodologia utilizada para aquisição das desintegrinas recombinantes.
As etapas de expressão e purificação das desintegrinas foram realizadas
em dois experimentos independentes para a obtenção de quantidades suficientes
para a avaliação da atividade biológica das proteínas recombinantes. O
rendimento das expressões está listado na tabela 2. A segunda expressão
demostrou um melhor rendimento em comparação com a primeira, principalmente
para a expressão da rJAST que aumentou em pelo menos 4 vezes o seu
rendimento (Tabela 2).
26
Tabela 2: Quantificação das desintegrinas recombinantes
Expressão Meio de cultura
Espectrofotometria Antes Hidrólise Após
Hidrólise
1 1 L Abs 280 nm 342 μg rJARC 119 µg rJARC
1 1 L Abs 280 nm 77,54 μg rJAST 33 μg rJAST
2 1 L Abs 280 nm 424,5 μg rJARC ******
2 1 L Abs 280 nm 342,1 μg rJAST ******
A expressão 1 mostra as concentrações obtidas na primeira expressão. A expressão 2 (em destaque) é referente à segunda expressão, podemos observar que conseguimos melhorar o rendimento, no entanto as amostras em destaque também foram quantificadas utilizando “BCA
TM
Assay Kit” (2D Quant Kit – Amersham Biosciences) vide tabela 3.
A metodologia de quantificação da expressão foi realizada inicialmente
utilizando espectrofotometria, no entanto concluímos que nossos resultados
pudessem ser mais precisamente analisados, visto que uma grande quantidade
de interferentes pode levar ao erro nesta metodologia. A captação do resultado
pelo equipamento, no comprimento de onda utilizado, poderia estar sendo
dificultado, pelo fato das desintegrinas não possuírem resíduos de aminoácidos
como Triptofano e Tirosina em sua cadeia.
Optamos então, por quantificar as amostras pela metodologia de BCA
utilizando “BCA TM Assay Kit” (2D Quant Kit – Amersham Biosciences). Neste
método, a reação que conduz à formação de cor BCA é fortemente influenciada
por quatro resíduos de aminoácidos (cisteína ou cistina, tirosina e triptofano), na
sequência de aminoácidos de proteínas. Desta forma, este último método serviria
melhor para as nossas amostras, visto que tanto a jararacina quanto a jarastatina
recombinantes possuem 12 cisteínas, tornando melhor a confiabilidade na
quantificação.
A equação da reta foi utilizada para determinarmos as concentrações de
cada amostra. Os resultados revelaram 236,34 μg/ mL de rJARC e 457,29 μg/ mL
de rJAST, ambas purificadas e ainda com cauda de histidina (Figura 13 e Tabela
3).
27
Figura 13: Curva Padrão para quantificação das desintegrinas recombinantes (antes das hidrólises) através da utilização da equação da reta. Observamos a curva padrão utilizada para determinar a concentração das desintegrinas antes da hidrólise (clivagem da cauda de Histidina).
As amostras correspondentes ao ultrafiltrado foram quantificadas, mas
somente com “BCATM Assay Kit” (2D Quant Kit – Amersham Biosciences),
obtivemos 68,9 µg de rJARC e 143 μg de rJAST (Figura 14 e Tabela 3). Podemos
observar que, as concentrações encontradas são bem diferentes entre os dois
métodos de quantificação como já era esperado, no entanto sabemos que a
quantificação realizada com o “BCATM Assay Kit” (2D Quant Kit – Amersham
Biosciences) possui maior confiabilidade como anteriormente descrito.
Figura 14: Curva Padrão para quantificação das desintegrinas recombinantes através da utilização da equação da reta. Observamos a curva padrão utilizada para determinar a concentração das desintegrinas após processo de hidrólise (clivagem da cauda de Histidina).
28
Tabela 3: Quantificação referente à expressão das desintegrinas recombinantes, antes e após a clivagem.
Meio
LB Método de Quantificação
Antes
Hidrólise
Após
Hidrólise
1 L Espectrofotometria (Abs 280 nm) 424,5 μg
rJARC ******
1 L Espectrofotometria (Abs 280 nm) 342,1 μg
rJAST ******
“BCA TM Assay Kit” (2D Quant Kit –
Amersham Biosciences)
236,34 µg
rJARC
68,9 µg
rJARC
“BCA TM Assay Kit” (2D Quant Kit –
Amersham Biosciences)
457,29 µg
rJAST
143 µg
rJAST
As linhas em destaque correspondem à quantificação feita através de espectrofotometria e as outras linhas correspondem à quantificação das mesmas amostras, utilizando “BCA
TM Assay Kit”.
Com o objetivo de facilitar a visualização e comparação entre os resultados
das quantificações, plotamos uma tabela com os valores tanto da primeira quanto
da segunda expressão (Tabela 4). Nesta é possível observar claramente a
melhora no processo de expressão/quantificação.
Tabela 4: Comparação entre as quantificações das desintegrinas recombinantes
Expressão Meio LB Desintegrina Antes Hidrólise Após Hidrólise
1 1 L rJARC 342 μg 119 µg
2 1 L rJARC 236,34 μg 68,9 μg
1 1 L rJAST 77,54 μg 33 μg
2 1 L rJAST 342,1 μg 143 μg
As linhas sombreadas correspondem à quantificação da primeira expressão, feita através de espectrofotometria e as outras linhas correspondem à quantificação da segunda expressão, utilizando “BCA
TM Assay Kit”.
29
4.2. EFEITO DAS DESINTEGRINAS SOBRE A AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA
As desintegrinas recombinantes foram avaliadas quanto a seus efeitos
sobre a agregação plaquetária, utilizando plaquetas humanas e ADP (4 – 6 μM)
como agonista. No teste foi possível observar que ambas desintegrinas foram
capazes de inibir a agregação plaquetária. Foram utilizadas duas concentrações
distintas das desintegrinas (180 nM e 500 nM), sendo essas escolhidas de acordo
com a atividade das desintegrinas nativas previamente observadas pelo nosso
grupo. As desintegrinas nativas foram capazes de inibir a agregação plaquetária
induzida por ADP (IC50 89,5 nM - JARC e 281,0 nM – JAST) (WERMELINGER et
al., 2009). As duas desintegrinas recombinantes demonstraram uma inibição
similar entre elas nas concentrações utilizadas, porém para distinguir o potencial
de inibição de cada uma será necessário realizar o ensaio com diferentes
concentrações e posterior avaliação do IC50 das desintegrinas recombinantes.
Porém, os dados demonstram que rJARC e rJAST inibiram a agregação
plaquetária induzida por ADP, confirmando que as mesmas estão sendo
expressas com atividade biológica, como mostrado na figura 15. Para a
concentração de 180 nM, rJARC inibiu 53,58% e rJAST inibiu 55,10%, e quando
utilizado 500 nM, rJARC inibiu 62,40% e rJAST inibiu 67,43%.
Figura 15: Agregação plaquetária induzida por ADP (4 - 6 μM) com plaquetas humanas. Atividade inibitória da jararacina recombinante (rJARC) e jarastatina recombinante (rJAST) em duas concentrações distintas. Os dados apresentados foram analisados em três ensaios independentes.
30
4.3. ATIVIDADE ANTITROMBÓTICA DAS DESINTEGRINAS NO MODELO DE TROMBOEMBOLIA PULMONAR INDUZIDO POR ADP
Com o intuito de avaliar a atividade antitrombótica das desintegrinas as
mesmas tiveram as suas atividades testadas no modelo de tromboembolia
pulmonar induzido por ADP. Neste modelo o agonista (ADP) utilizado é capaz de
ativar as plaquetas a promoverem agregação das mesmas que irão viajar através
dos vasos até encontrar vasos de calibre inferior (pulmonares) levando assim a
obstrução do mesmo e posterior, morte tecidual. Para o controle, nós utilizamos
grupos de 5 animais cada para a determinação da sobrevivência desses sem o
tratamento com as desintegrinas, onde todos foram considerados mortos
(caracterizando 0% sobrevivência) 15 minutos após indução da tromboembolia.
Utilizamos também grupos de cinco animais cada para tratamento com rJARC e
rJAST (5 mg/ Kg) 5 minutos antes da indução da tromboembolia, prevenindo
46,7% ± 11,5 e 30% ± 14,2 a população da morte, respectivamente (Figura 16).
Estes resultados demostram ser estatisticamente significativos quando
comparados ao grupo controle, porém uma possível diferença na atividade da
rJAST e da rJARC não foi observada. Nossos resultados corroboram com os
resultados publicados pelo nosso grupo, que demostrou que a jarastatina nativa é
menos ativa que a jararacina nativa no ensaio de agregação plaquetária induzido
por ADP, utilizando plaquetas humanas (WERMELINGER et al., 2009).
Figura 16: Efeito das Desintegrinas rJARC e rJAST sobre a tromboembolia pulmonar em camundongos induzida por ADP. A dose de 5 mg/ kg das desintegrinas, rJARC e rJAST, foram administradas por via intravenosa, em grupos de camundongos com 5 animais cada um, 5 minutos antes da indução do tromboembolia induzida por ADP (0,5 mg/g). A taxa de mortalidade foi determinada 15 minutos após a indução da trombose. Os resultados demonstraram ser estatisticamente significativos com relação ao controle, p < 0,01 * e p < 0,1 **.
31
5. DISCUSSÃO
Muitos fármacos foram desenvolvidos a partir de moléculas presentes em
venenos de serpentes, como é o caso do Captopril, que tem seu princípio ativo
derivado de um inibidor da enzima conversora de angiotensina isolado do veneno
da Bothrops jararaca, e que é amplamente utilizado contra a hipertensão
(FOURNIER et al. 2000). Outro grupo de moléculas, que já serviram como
protótipos para fármacos comercializados no mercado, incluem o Eptifibatide
(Integrilin® - Merck), um peptídeo cíclico baseado em uma proteína encontrada no
veneno da Sistrurus miliarius barbouri e o Aggrastat (Merck) que utilizou a
desintegrina echistatina do veneno de Echis carinatus, ambos são fármacos
antiplaquetários da classe dos inibidores da glicoproteína IIb/IIIa (IIb3)
(KRISTENSEN, et al., 2012 e SIKKA and BINDRA, 2010). Sendo assim, torna-se
claro a importância do estudo de moléculas oriundas de venenos.
Neste trabalho, analisamos a atividade biológica das desintegrinas
recombinantes jararacina e jarastatina clonadas do cDNA identificados a partir da
glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca.
As desintegrinas jararacina e jarastatina nativas apresentam alta homologia
(82%) na sequência primária, ambas foram isoladas do veneno da serpente do
gênero B. Jararaca (Figura 17).
Figura 17: Alinhamento da sequência das desintegrinas nativas: jarastatina – JAST e jararacina - JARC. Os aminoácidos que são idênticos ou conservados nas sequências representam 82% da sequência de aminoácidos. Os aminoácidos que compõem a sequência tripeptídica RGD estão grifados em negrito. As caixas cinza indicam os aminoácidos adjacentes. Os ateriscos indicam os aminoácidos diferenciados (modificado de DELLA-CASA et al., 2011).
Dados anteriores do nosso grupo demonstraram que a comparação da
atividade das desintegrinas jararacina e jarastatina nativas apresentam diferenças
no potencial de inibição. A jararacina apresenta uma maior atividade inibitória na
agregação plaquetária utilizando plaquetas humanas, induzida por ADP e
trombina (IC50 99,5 nM e 23,1 nM, respectivamente) em comparação a atividade
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da jarastatina (IC50 = 281 nM e 89,5 nM, respectivamente) (WERMELINGER et
al., 2009).
Com o intuito de avaliar a atividade antiplaquetária das desintegrinas
recombinantes, expressas e purificadas como descrito anteriormente, nós
utilizamos o ensaio de agregação plaquetária, com plaquetas humanas e ADP (4
– 6 μM) como agonista. Os resultados obtidos corroboram com os dados
publicados por nosso grupo como descrito previamente. Nos testes utilizamos
duas concentrações distintas (180 nM e 500 nM) tanto para rJARC quanto para
rJAST, e ambas inibiram a agregação de forma satisfatória, no entanto será
necessária ainda a avaliação das desintegrinas recombinantes de maneira
concentração-dependente e/ ou tempo-dependente, sendo possível determinar de
maneira mais ampla o potencial antiplaquetário dessas moléculas. Visto que
estudos publicados sobre a Insularina, uma desintegrina RGD com grande
similaridade com as desintegrinas utilizadas neste estudo (95,9% - jararacina e
79,4% - jarastatina), mostra melhor atividade inibitória quando incubada com
plaquetas humanas por 3 minutos, diferente do que foi realizado neste estudo,
onde incubamos as desintegrinas somente por 1 minuto (DELLA-CASA et al.,
2011).
Dados anteriores do nosso grupo demonstraram que em modelo de
tromboembolia induzido por ADP, as desintegrinas nativas não foram capazes de
prevenir de maneira significativa à morte dos animais em relação à sobrevivência
obtida para o grupo controle, onde se utilizou 0,5 mg/ kg de animal, visto que ao
rendimento da purificação das desintegrinas nativas é muito baixo (0,21 % do
veneno) (WERMELINGER, 2010). No atual estudo, as desintegrinas nativas
propiciaram a utilização de uma dose maior das desintegrinas para o tratamento
dos animais para uma melhor avaliação do potencial antitrombótico. O tratamento
com as desintegrinas recombinantes rJAST e rJARC, utilizando uma dose dez
vezes maior que a dose anteriormente usada (5 mg/ Kg) por via intravenosa 5
minutos antes da indução da tromboembolia promoveu a prevenção da morte em
46,7% dos animais tratados com rJARC e 30% dos animais tratados com rJAST.
Sendo esses resultados estatisticamente significativos com relação ao controle.
Possivelmente, as desintegrinas não foram capazes de prevenir a morte de uma
porcentagem maior da população, visto que essas moléculas demonstraram um
33
maior efeito sobre a agregação com plaquetas humanas (dados não
demonstrados). Podemos ainda citar a rápida depuração sofrida pelas
desintegrinas quando utilizadas em ensaios in vivo, com meia-vida de
aproximadamente 15 min, como descrito por McLane e colaboradores (McLANE
et al., 1995). Comparados com a desintegrina triflavina, a qual foi capaz de
prevenir a morte por tromboembolia induzida por ADP em 65 e 78% da população
tratadas com 2 e 4mg/ kg de animal, respectivamente, as desintegrinas avaliadas
neste estudo apresentaram um potencial antitrombótico menor (SHEU et
al.,1994). Outros indutores, como os colágenos e a norepinefrina, também podem
ser usados, assim como o teste em outros modelos de trombose arterial em ratos,
para melhor avaliar o possível perfil antitrombótico destas moléculas (FRATTANI,
2009; GOMES et al.,2010).
34
6. CONCLUSÃO
Os resultados mostraram que as desintegrinas recombinantes foram
expressas com atividade biológica que mimetizam a atividade das desintegrinas
nativas. Além de apresentarem potencial antitrombótico no ensaio de
tromboembolia induzida por ADP. Sendo assim, essas moléculas poderão ser
utilizadas como promissores protótipos para o desenvolvimento de fármacos para
o tratamento e/ ou prevenção da trombose.
35
7. PERSPECTIVAS
O atual trabalho tem como perspectiva aperfeiçoar a expressão, em busca
de um melhor rendimento e desta forma darmos continuidade aos experimentos
de atividade biológica (in vitro e in vivo) das desintegrinas recombinantes. Dentre
os ensaios podemos citar: a agregação plaquetária e adesão plaquetária, na
presença de diferentes concentrações e tempo de incubação. Podendo ainda
avaliar o potencial antitrombótico dessas desintegrinas no modelo de
tromboembolismo venoso por diferentes agonistas e através do modelo de
trombose arterial induzida por FeCl3, o qual mimetiza a formação de trombo in
vivo. Podendo assim melhorar a compreensão do efeito e das vias pela qual
essas desintegrinas desempenham a sua atividade.
36
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