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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
Avaliação dos perfis protéicos urinário e Avaliação dos perfis protéicos urinário e Avaliação dos perfis protéicos urinário e Avaliação dos perfis protéicos urinário e plasmático de pacientes gestantes normotensas e plasmático de pacientes gestantes normotensas e plasmático de pacientes gestantes normotensas e plasmático de pacientes gestantes normotensas e
com précom précom précom pré----eclâmpsiaeclâmpsiaeclâmpsiaeclâmpsia
Joyce Pereira TakatsukaJoyce Pereira TakatsukaJoyce Pereira TakatsukaJoyce Pereira Takatsuka
Uberaba - MG 2009
Joyce Pereira Takatsuka
AVALIAÇÃO DOS PERFIS PROTÉICOS URINÁRIO E PLASMÁTICO DE PACIENTES GESTANTES NORMOTENSAS E COM PRÉ-ECLÂMPSIA
Orientadora: Profª. Dra. Roseli Aparecida da Silva Gomes
Julho, 2009
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia – Área de Concentração “Patologia Clínica”, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre.
Cata logação na fon te : B ib l i o teca da Un ivers idade Federa l do T r i ângu lo M ine i ro
T142a Takatsuka, Joyce Pereira
Avaliação dos perfis protéicos urinário e plasmático de pacientes gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia / Joyce Pereira Takatsuka. - - 2009.
114 f. : tab. ; graf. ; fig.
Dissertação (Mestrado em Patologia Clínica) - Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, 2009.
Orientadora: Profª. Drª. Roseli Aparecida da Silva Gomes.
1. Pré-eclâmpsia. 2. Perfil protéico urinário. 3. Perfil protéico plasmático. I. Título. II. Gomes, Roseli Aparecida da Silva.
CDU 618.3-06
DediDediDediDedico esta teseco esta teseco esta teseco esta tese............
À minha família, por todo apoio, confiança e carinho, mesmo à distância... Em especial, aos meus pais, Ricardo e Maria Helena, e minha irmã, Jéssica, pela fonte de amor inesgotável, pela compreensão com minhas ausências prolongadas e por serem sempre o meu porto seguro... Ao meu namorado, Carlos Eduardo, pelo apoio em todos os momentos... Por todas as palavras de carinho e incentivo, quando, por alguns momentos, me faltaram ânimo e confiança... Pela compreensão e pela paciência nos momentos mais difíceis durante a realização deste trabalho... Por fim, a todos que contribuíram, de alguma forma, para tornar possível a realização deste trabalho e a realização de um sonho meu...
AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos
A Deus...
Por me dar saúde e forças para continuar, mesmo quando as dificuldades
pareciam infindáveis... Por me dar oportunidades para crescer espiritualmente e
intelectualmente... E, por colocar em meu caminho pessoas tão especiais e
indispensáveis...
À Professora Roseli...
Pela orientação, pela confiança, pelos ensinamentos transmitidos, pelas preciosas
oportunidades oferecidas e pela amizade construída...
Às gestantes participantes deste estudo...
Pela gentileza em concordar em participar da pesquisa e em ceder suas amostras
biológicas...
Aos professores e funcionários da Disciplina de Bioquímica...
Pelo agradável convívio, por todos os ensinamentos, pelos auxílios e apoios e pela
amizade...
À banca examinadora desta tese...
Pela gentileza de avaliar este trabalho e contribuir de forma tão importante para
sua melhoria...
À Dra Marina Carvalho Paschoini, à Dra. Adriana Vitor Resende e ao Dr. Vilmar de
Paiva Marques...
Pelo auxílio na obtenção das amostras utilizadas neste estudo...
Aos colegas da pós-graduação...
Que compartilharam comigo momentos importantes de aprendizado...
A todos os professores do Curso de Pós-Graduação em Patologia...
Pelos indispensáveis conhecimentos adquiridos durante o curso de mestrado...
Apoio financApoio financApoio financApoio financeiroeiroeiroeiro
O presente trabalho foi desenvolvido com os recursos financeiros da Universidade
Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), da Fundação de Ensino e Pesquisa de Uberaba
(FUNEPU) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
“ Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...”qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...”qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...”qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim...”
(Francisco Cândido Xavier)
ResumoResumoResumoResumo
A pré-eclâmpsia é uma síndrome específica da gestação que leva a uma perfusão sanguínea
reduzida dos órgãos e está relacionada a vasoespasmos e ativação da cascata da
coagulação. Ocorre frequentemente após a vigésima semana de gravidez e é determinada
por aumento da pressão arterial, acompanhado de proteinúria. Os mecanismos responsáveis
pela proteinúria na pré-eclâmpsia ainda estão para serem elucidados. De acordo com outros
estudos já realizados, a urina proveniente de pacientes com pré-eclâmpsia demonstra pouca
seletividade e não difere significativamente de outras formas de doença renal primária,
com presença de proteínas originárias tanto de danos glomerulares quanto tubulares.
Observamos na literatura que o perfil protéico da urina de pacientes com pré-eclâmpsia
ainda não está bem estabelecido e que estudos relacionados às proteínas plasmáticas de
gestantes com a síndrome são raros e não associam proteinemia e proteinúria. Sendo assim,
o objetivo deste estudo foi avaliar os perfis protéicos urinário e plasmático em gestantes
normotensas e com pré-eclâmpsia. Os perfis eletroforéticos foram analisados por SDS-
PAGE, para as amostras de urina, e em fitas de acetato de celulose, para as amostras de
plasma. As dosagens de proteínas totais e albumina plasmática foram realizadas pelos
métodos do Biureto e Verde de Bromocresol, respectivamente. O perfil protéico urinário
das amostras de 24 horas de gestantes pré-eclâmpticas apresentou diferenças importantes
em relação aos perfis das amostras controles e ao padrão de proteinúria glomerular, tendo
as proteínas mais frequentes, massas moleculares de 66 kDa, 56 kDa e 45 kDa, sendo a de
56 kDa a mais importante, quantitativamente. As proteínas de 30 e 40 kDa apresentaram
alta prevalência entre as gestantes com pré-eclâmpsia e não foram visualizadas em
nenhuma amostra controle. Com relação aos perfis eletroforéticos das amostras de urina
com HCl, observamos predomínio de bandas de baixa massa molecular e peptídeos, que se
mostraram constantes entre as amostras de gestantes com pré-eclâmpsia. Isto sugere que
tenha havido hidrólise enzimática com a acidificação do meio. Houve redução significativa
dos níveis de proteínas totais (5,1 ±0,9 versus 6,3 ±0,6 g/dL) e albumina (2,6 ±0,7 g/dL
versus 3,8 ±0,5 g/dL) plasmática entre as gestantes com pré-eclâmpsia. O perfil
eletroforético plasmático revelou redução significativa da fração albumina-α1-globulina
entre as gestantes com pré-eclâmpsia. Não houve correlação entre os níveis de proteinúria
e a dosagem de proteínas totais plasmáticas nas amostras de gestantes com pré-eclâmpsia,
o que sugere que proteínas originárias da unidade feto-placentária possam estar
contribuindo para a proteinúria nesta condição. Desse modo, podemos propor que a
proteinúria da pré-eclâmpsia não pode ser atribuída exclusivamente à albuminúria,
sugerindo que não seja devido a danos puramente glomerulares, e não pode ser a única
responsável pelas alterações protéicas plasmáticas observadas.
PALAVRAS-CHAVES: Pré-eclâmpsia; Perfil protéico urinário; Perfil protéico plasmático.
AbstractAbstractAbstractAbstract
Preeclampsia is a pregnancy specific syndrome that leads to reduced blood perfusion of
organs, is related to vasospasm and activation of the coagulation cascade, occurs after the
twentieth week of pregnancy and is determined by increased blood pressure, accompanied
by proteinuria. Mechanisms responsible for proteinuria in preeclampsia are still to be
elucidated. According to previous studies, urine from patients with preeclampsia
demonstrates little selectivity and does not differ significantly from other forms of primary
renal disease, with presence of proteins from both glomerular and tubular damage. We
observed in literature that urine protein profile from patients with preeclampsia is not yet
well established and that studies related to plasma proteins in pregnant women with the
syndrome are rare and do not associate proteinemia and proteinuria. Therefore, the aim of
this study was to evaluate the plasma and urinary protein profiles in normotensive and
preeclamptic pregnant women. Electrophoretic profiles were analyzed by SDS-PAGE for
urine samples, and strips of cellulose acetate, for plasma samples. Plasma total protein and
albumin dosages were performed by methods of Biuret and Bromocresol Green,
respectively. Protein profile of 24-hours urine samples of preeclamptic women showed
important differences in comparison to the control samples profiles and the glomerular
proteinuria pattern. The most common proteins in this group have molecular masses of 66
kDa, 56 kDa and 45 kDa and the protein of 56 kDa was the most important, quantitatively.
The proteins of 30 and 40 kDa showed a high prevalence among pregnant women with
preeclampsia and were not seen in any control sample. Regarding electrophoretic profiles
of urine samples with HCl, we observed a predominance of low molecular mass proteins
and peptides, which were constant between samples from preeclamptic women. This
suggests that enzymatic hydrolysis occurred with the acidification of the medium. There
was significant reduction in levels of total protein (5.1 ± 0.9 g/dL versus 6.3 ± 0.6 g/dL)
and albumin (2.6 ± 0.7 g/dL versus 3.8 ± 0.5 g/dL) in plasma samples between women
with preeclampsia, in comparison with the normotensive pregnant women. Plasma
electrophoretic profile showed significant reduction in the albumin-α1-globulin fraction in
preeclamptic pregnant women samples. There was no correlation between the proteinuria
and proteinemia of preeclamptic pregnant women, suggesting that proteins originated from
fetal-placental unit in preeclampsia may be contributing significantly to the high
proteinuria in this condition. Thus, we propose that proteinuria in preeclampsia can not be
attributed exclusively to albuminuria, suggesting that it is not purely due to glomerular
damage, and may not be the unique responsible for the plasma changes observed.
KEY WORDS: Preeclampsia; Urine protein profile; Plasma protein profile.
Lista de Símbolos e AbreviaturasLista de Símbolos e AbreviaturasLista de Símbolos e AbreviaturasLista de Símbolos e Abreviaturas
%.............................................. porcentagem
<............................................... menor que
±............................................... mais ou menos
≥............................................... maior ou igual
®.............................................. marca registrada
°C............................................. graus Celsius
µg............................................. micrograma
ABNT...................................... Associação Brasileira de Normas Técnicas
ALT......................................... alanina transferase
AST......................................... aspartato transferase
C.............................................. controle
CEP.......................................... Comitê de Ética em Pesquisa
CPGP....................................... Curso de Pós-Graduação em Patologia
DCB......................................... Departamento de Ciências Biológicas
dL............................................. decilitro
DP............................................ desvio padrão
et al.......................................... e colaboradores
g............................................... grama
HCl.......................................... ácido clorídrico
HELLP..................................... hemólise, elevação de enzimas hepáticas, trombocitopenia
HLA......................................... antígeno leucocitário humano
hs............................................. horas
IgA........................................... imunoglobulina A
IgG........................................... imunoglobulina G
IgM.......................................... imunoglobulina M
kDa.......................................... quilodalton
M............................................. molar
mg............................................ miligrama
mL........................................... mililitro
mm3......................................... milímetros cúbicos
mmHg...................................... milímetros de mercúrio
N.............................................. normal
nm............................................ nanômetro
PAD......................................... pressão arterial diastólica
PAS.......................................... pressão arterial sistólica
PE............................................ pré-eclâmpsia
pH............................................ potencial hidrogeniônico
PIGF........................................ fator de crescimento placentário
Rf............................................. relativo à frente
rpm........................................... rotações por minuto
SAME...................................... serviço de arquivo médico
SDS-PAGE.............................. eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) contendo dodecil sulfato de sódio (SDS)
sFlt-1........................................ receptor solúvel de tirosina quinase
UFTM...................................... Universidade Federal do Triângulo Mineiro
VEGF...................................... fator de crescimento endotelial vascular
α............................................... alfa
β............................................... beta
γ............................................... gama
Lista de TabelasLista de TabelasLista de TabelasLista de Tabelas
Tabela 1. Dados demográficos de gestantes normotensas e pré-eclâmpticas......
37
Tabela 2. Valores médios de proteínas totais e albumina das amostras de plasma das gestantes com pré-eclâmpsia e controles............................................
49
Tabela 3. Valores médios de percentis estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas....................................
51
Tabela 4. Concentrações médias estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas.......................................................
51
Lista de FigurasLista de FigurasLista de FigurasLista de Figuras
Figura 1. Representação esquemática do útero humano em três situações: não-gravídico, em uma gestação complicada pela pré-eclâmpsia e em uma gestação normal......................................................................................................................
20
Figura 2. Endoteliose glomerular............................................................................
21
Figura 3. Sistema de filtração glomerular renal......................................................
24
Figura 4. Perfil eletroforético das proteínas do soro sanguíneo humano................
32
Figura 5. Esquema demonstrando o perfil urinário protéico das amostras de 24 horas de gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia.............................................
45
Figura 6. Esquema demonstrando o perfil protéico urinário das amostras de 6 horas de gestantes normotensas e com pré-eclâmpsia.............................................
48
Figura 7. Concentração de proteínas totais plasmática no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia e no grupo de gestantes normotensas........................................
50
Figura 8. Concentração de albumina plasmática no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia e no grupo de gestantes normotensas......................................................
50
Figura 9. Percentis das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas e gestantes normotensas.................................................
53
Figura 10. Concentrações das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas e gestantes normotensas..................................
54
Figura 11. Correlação entre as concentrações de proteínas totais na urina e no plasma de gestantes com pré-eclâmpsia...................................................................
55
SumárioSumárioSumárioSumário
1. Introdução........................................................................................................ 16
1.1. Desordens hipertensivas da gestação....................................................... 16
1.2. Pré-eclâmpsia........................................................................................... 17
1.3. Proteinúria................................................................................................ 23
1.4. Proteinúria na pré-eclâmpsia.................................................................... 26
1.5. Proteínas plasmáticas na pré-eclâmpsia................................................... 32
2. Justificativa...................................................................................................... 34
3. Objetivos.......................................................................................................... 35
3.1. Objetivo geral........................................................................................... 35
3.2. Objetivos específicos............................................................................... 35
4. Materiais e métodos........................................................................................ 36
4.1. Obtenção e processamento das amostras................................................. 36
4.2. Avaliação do perfil protéico das amostras de urina................................. 38
4.3. Determinação da concentração de proteínas totais das amostras de
plasma...................................................................................................................
39
4.4. Determinação da concentração de albumina das amostras de plasma..... 40
4.5. Avaliação do perfil protéico das amostras de plasma.............................. 41
4.6. Análise estatística dos resultados............................................................. 41
5. Resultados........................................................................................................ 43
5.1. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 24 horas.............. 43
5.2. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 6 horas................ 46
5.3. Determinação da concentração de proteínas totais e albumina
plasmáticas............................................................................................................
49
5.4. Avaliação do perfil protéico plasmático.................................................. 51
5.5. Correlação entre proteínas totais no plasma e na urina............................ 55
6. Discussão.......................................................................................................... 56
7. Conclusões........................................................................................................ 67
Referências........................................................................................................... 69
Apêndices............................................................................................................. 79
Anexos.................................................................................................................. 94
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Desordens hipertensivas da gestação
As desordens hipertensivas da gestação são classificadas em quatro grupos 1
(critérios de “Report of the National High Blood Pressure Education Program Working 2
Group on High Blood Pressure in Pregnancy”, 2000), conforme descrito abaixo: 3
(1) Hipertensão arterial crônica, quando o aumento da pressão arterial é observado 4
antes ou durante as vinte primeiras semanas da gestação, ou quando não há remissão da 5
hipertensão após o parto. A hipertensão é definida quando a pressão arterial sistólica (PAS) 6
se encontra ≥140 mmHg ou a pressão diastólica (PAD) ≥ 90 mmHg; 7
(2) Pré-eclâmpsia/eclâmpsia, quando há elevação da pressão arterial e aparecimento 8
de proteinúria (excreção urinária maior que 300 mg/24 hs) após a vigésima semana de 9
gravidez. A eclâmpsia é definida pela ocorrência de convulsões em uma mulher com pré-10
eclâmpsia que não podem ser atribuídas à outra causa; 11
(3) Pré-eclâmpsia sobreposta à hipertensão arterial crônica, quando a gestante é 12
hipertensa, mas não apresenta proteinúria nas primeiras vinte semanas de gestação, após as 13
quais a excreção de proteínas na urina aumenta e chega a 300 mg/dia ou quando a gestante 14
é hipertensa e apresenta proteinúria, mas ocorre elevação repentina da pressão arterial ou 15
da proteinúria, ou ela passa a apresentar trombocitopenia (<100.000 células/mm3) ou 16
elevação das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato 17
aminotransferase (AST); 18
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
17
(4) Hipertensão gestacional, quando a elevação da pressão arterial ocorre após a 1
metade da gestação, sem a presença de proteinúria. 2
As desordens hipertensivas da gestação são a segunda causa de morte materna, após 3
o embolismo, nos Estados Unidos, chegando a causar 15% destas mortes. Elas ocorrem em 4
cerca de 6 a 8% das gestações, e contribuem significativamente com os índices de 5
natimortos e de morbi-mortalidade neonatal, de acordo com o “American College of 6
Obstetricians and Gynecologists” (1996). 7
No Brasil, Gaio et al. (2001), em um estudo com 4892 gestantes, demonstraram 8
uma frequência de 7,5% de desordens hipertensivas da gestação, sendo 4,0% hipertensão 9
crônica, 2,3% causadas por pré-eclâmpsia/eclâmpsia, 0,7% hipertensão gestacional e 0,5% 10
pré-eclâmpsia/eclâmpsia sobreposta à hipertensão prévia. Laurenti, Jorge e Gotlieb (2006) 11
encontraram uma frequência de 67,1% de mortes maternas por causas obstétricas diretas, 12
sendo 37% destas causadas por pré-eclâmpsia-eclâmpsia. 13
1.2. Pré-eclâmpsia
A pré-eclâmpsia afeta de 2 a 3% das gestações em todo o mundo e é responsável 14
por cerca de 60.000 mortes maternas anualmente, principalmente nos países pobres 15
(Organização Mundial de Saúde, 2005). Trata-se de uma síndrome específica da gestação 16
que leva a uma perfusão sanguínea reduzida dos órgãos e está relacionada a vasoespasmos 17
e ativação da cascata da coagulação. Ocorre frequentemente após a vigésima semana de 18
gravidez e é determinada por aumento da pressão arterial (PAS ≥ 140 mmHg ou PAD ≥ 90 19
mmHg) acompanhado de proteinúria (≥ 300 mg/24 hs) (Report of the National High Blood 20
Pressure Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy, 2000.21
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
18
Esta síndrome sempre representa perigo para o binômio materno-fetal. Para o feto, 1
a pré-eclâmpsia pode resultar em restrição do crescimento e parto prematuro. Já para a 2
mãe, as complicações que podem ocorrer são diversas: falência renal, síndrome HELLP 3
(hemólise, alterações de enzimas hepáticas e trombocitopenia), infarto ou morte (revisto 4
por IRMINGER-FINGER, JASTROW e IRION, 2008). 5
A pré-eclâmpsia pode ter outras manifestações maternas, como cefaléia, sonolência, 6
taquicardia e náuseas e pode evoluir com vasoespasmo cerebral importante, com 7
conseqüente crise convulsiva, o que caracteriza a eclâmpsia, podendo ocasionar seqüelas 8
neurológicas maternas, ou até a morte (revisto por BROWN, 1995). 9
Assim, é recomendado às gestantes que se submetam a uma triagem para 10
determinação de proteína urinária e avaliação da pressão arterial a cada visita pré-natal, 11
pois o intervalo entre a detecção da hipertensão e proteinúria e o subseqüente 12
desenvolvimento de complicações potencialmente letais pode ser extremamente curto 13
(SIBAI, 2003; SIBAI, CARITIS e HAUTH, 2003). 14
A pré-eclâmpsia é mais comum em pacientes que possuem mães ou irmãs que 15
tiveram a doença, o que sugere uma suscetibilidade genética (BROWN, 1995), e é mais 16
freqüente em primigestas. Sendo assim, uma mulher que teve sua primeira gestação sem 17
nenhuma intercorrência, tem poucas chances de desenvolver pré-eclâmpsia em uma 18
segunda gestação. Entretanto, a chance de desenvolver a doença pode se reverter e chegar a 19
10-15% caso haja troca de parceiro (NEED, 1975). Condições que diminuem o fluxo 20
sanguíneo placentário, também podem aumentar o risco de desenvolvimento da pré-21
eclâmpsia, como hipertensão crônica e diabetes. As gestações gemelares, neoplasias 22
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
19
trofoblásticas e gestações com isoimunizações aumentam a massa placentária e o risco de 1
desenvolver pré-eclâmpsia, provavelmente devido à diminuição relativa do fluxo 2
sanguíneo placentário (NEME, 1991). 3
Tem sido sugerido que a pré-eclâmpsia é uma doença de dois estágios, sendo o 4
primeiro, assintomático e caracterizado por desenvolvimento placentário anormal durante o 5
primeiro trimestre, e resultando em insuficiência placentária e na liberação de excessivas 6
quantidades de materiais placentários na circulação materna; e o segundo, sintomático, 7
quando a gestante desenvolve a hipertensão característica, prejuízo renal e proteinúria, e 8
está em risco de desenvolver a síndrome HELLP, eclâmpsia e outros danos em órgãos 9
diversos (ROBERTS, 2000). 10
A exata etiologia da pré-eclâmpsia ainda não é conhecida, sendo chamada de 11
doença das teorias, entre as quais estão: (1) perfusão uteroplacentária reduzida, (2) 12
anormalidades imunológicas e (3) desordens genéticas (LINDHEIMER e KATZ, 1981). 13
Entretanto, é bastante provável que a síndrome seja ocasionada pela placenta (BROSENS 14
et al., 1972; NAICKER et al., 2003), baseado no fato de que a única forma de acabar 15
definitivamente com os sintomas da pré-eclâmpsia é através da retirada da placenta, e de 16
que mulheres com gestações molares frequentemente desenvolvem pré-eclâmpsia grave. 17
A vasculatura uterina sofre profundas modificações fisiológicas para proporcionar 18
um aumento no fluxo sanguíneo para manter a gestação. No desenvolvimento placentário 19
normal, o citotrofoblasto invade as arteríolas espiraladas maternas e as remodelam 20
completamente em vasos de grande capacitância com baixa resistência (GERRETSEN et 21
al., 1981). Análises de placentas provenientes de gestações complicadas pela pré-22
eclâmpsia, geralmente revelam infartos placentários e estreitamento de artérias e arteríolas, 23
com uma diminuição característica de invasão endovascular pelo citotrofoblasto e um 24
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
20
remodelamento inadequado das arteríolas espiraladas uterinas (Figura 1), o que resulta em 1
vasos menos distensíveis e incapazes de nutrir adequadamente a placenta, tornando-a 2
isquêmica (DE WOLF, BROSENS e ROBERTSON, 1982; LIM et al., 1997; MOHAUPT, 3
2007).4
A placentação inadequada leva a isquemia placentária seguida por liberação 5
sistêmica de produtos citotóxicos, os quais danificam o endotélio vascular materno (ZHOU 6
et al., 2002; RODGERS, TAYLOR e ROBERTS, 1988; AHMED et al., 2000). A lesão 7
celular endotelial vascular reduz a síntese de agentes vasodilatadores, aumenta 8
Figura 1. Representação esquemática do útero humano em três situações: (a) não-gravídico, (b) em uma gestação complicada pela pré-eclâmpsia e (c) em uma gestação normal. Na gestação normal há invasão completa do citotrofoblasto e diferenciação das artérias espiraladas maternas. Na gestação pré-eclâmptica, a invasão do citotrofoblasto é superficial e limitada a regiões mais externas da decídua basal. As artérias espiraladas não sofrem diferenciação devido à invasão. Fonte: adaptado de MOHAUPT, 2007.
a b c
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
21
responsividade aos vasoconstrictores, diminui a síntese de anticoagulantes endógenos e 1
aumenta a síntese de pró-coagulantes, causando isquemia cerebral e disfunção renal e 2
hepática (CARON et al., 1991). A existência de uma lesão celular endotelial generalizada é 3
evidenciada por alterações morfológicas típicas (como o edema difuso do citoplasma da 4
célula endotelial) que caracterizam a endoteliose glomerular, lesão histológica 5
característica da pré-eclâmpsia (SPARGO et al., 1959; STILLMAN e KARUMANCHI, 6
2007) (Figura 2). 7
Uma participação imunológica para a gênese da pré-eclâmpsia tem sido especulada 8
por muitos anos e baseia-se em estudos anatomopatológicos de biópsias de leitos 9
placentários de gestantes normais comparadas às gestantes com pré-eclâmpsia (DEKKER, 10
ROBILLARD e HULSEY, 1998). A placenta é um órgão de origem fetal e, como tal, 11
possui determinantes genéticos tanto maternos quanto paternos (GREGG, 2004). Estudos 12
sugerem que respostas imunológicas desencadeadas por antígenos fetais na circulação 13
Figura 2. Endoteliose glomerular: (A) oclusão de capilares glomerulares devido ao edema das células endoteliais; (B) seta indica um único capilar não ocluso no tufo glomerular neste caso grave de oclusão de capilares; e (C) edema celular envolvendo mesângio e células endoteliais, levando a perda de fenestrações endoteliais e a oclusão de lumens de capilares. Fonte: STILLMAN e KARUMANCHI, 2007.
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
22
sanguínea poderiam interferir na invasão trofoblástica e na placentação, resultando em 1
disfunção endotelial e insuficiência placentária (SCHNEIDER, LANDAU e MÖRTL, 2
2001). Outros estudos sugerem que diferenças na expressão de HLA (antígeno leucocitário 3
humano) podem estar associadas à pré-eclâmpsia e eclâmpsia (O’BRIEN et al., 2000). 4
A presença de polimorfismos genéticos para alguns genes tem sido associada ao 5
desenvolvimento de pré-eclâmpsia (CHEN et al., 1996; CURNOW, PHAM e AUGUST, 6
2000; SPINA, ALEANDRI e MORINI, 2000; KOBASHI et al., 2000) e acredita-se que o 7
polimorfismo possa agir como modificador de doença e modificador de resposta a agentes 8
vasoativos endógenos ou exógenos, como os fármacos (SCHNEIDER, LANDAU e 9
MÖRTL, 2001). 10
Irminger-Finger, Jastrow e Irion (2008) descrevem a patogênese da pré-eclâmpsia 11
como pouco entendida e a resumem conforme descrito a seguir. 12
Fatores genéticos e imunológicos causam placentação anormal associada 13
com obstrução funcional ou mecânica das arteríolas espiraladas, o que 14
leva a diminuição da perfusão uteroplacentária. Isto ocasiona um 15
desequilíbrio entre fatores vasoconstrictores e vasodilatadores resultando 16
em vasoconstricção arterial, resultando em hipertensão arterial sistêmica 17
e coagulação intravascular disseminada, responsáveis pela proteinúria, 18
convulsões, testes funcionais hepáticos alterados e isquemia. 19
Uma adaptação importante que ocorre no organismo materno, e que o prepara para 20
a gestação, é a redução da pressão arterial como resultado da diminuição da resistência 21
periférica secundária a uma vasodilatação. Na pré-eclâmpsia, um desarranjo em fatores 22
vasoativos derivados do endotélio resulta no predomínio de substâncias vasoconstrictoras 23
(endotelina, tromboxano A2) sobre as vasodilatadoras (óxido nítrico, prostaciclina). A 24
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
23
hipertensão, definida como aferições repetidas maiores ou iguais a 140/90 mmHg, resulta 1
então, de uma vasoconstricção anormal (HLADUNEWICH, KARUMANCHI e 2
LAFAYETTE, 2007). 3
Gestantes saudáveis exibem uma importante hiperfiltração glomerular, devido à 4
diminuição da pressão oncótica plasmática nos capilares glomerulares. Nas gestantes com 5
pré-eclâmpsia, níveis variáveis de insuficiência renal, com diminuição da taxa de filtração 6
glomerular, estão associados com a endoteliose glomerular (HLADUNEWICH, 7
KARUMANCHI e LAFAYETTE, 2007). 8
A pré-eclâmpsia é diferenciada da hipertensão gestacional pela presença de 9
proteinúria na gestação. Excreção significativa de proteína é definida com valores ≥ 300 10
mg em uma amostra de urina coletada em 24 horas ou 1+ ou mais em teste urinário com 11
tiras reativas de 2 amostras ocasionais que foram coletadas com intervalo de tempo de pelo 12
menos 4 horas (BROWN et al., 2001). 13
1.3. Proteinúria
A unidade funcional do rim é o néfron, formado pelos seguintes elementos: o 14
corpúsculo renal, representado pelo glomérulo e pela cápsula de Bowman; o túbulo 15
proximal; a alça de Henle; o túbulo distal; e uma porção do ducto coletor. O glomérulo é 16
responsável pela formação de um ultrafiltrado a partir do plasma e é formado por uma rede 17
de capilares especializados (tufo glomerular), nutridos pela arteríola aferente e drenados 18
pela arteríola eferente. Esta rede capilar projeta-se dentro de uma câmara que está 19
delimitada por uma cápsula (cápsula de Bowman) que, por sua vez, possui uma abertura 20
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
24
comunicando a câmara diretamente com o túbulo contornado proximal (RIELLA, de 1
MOURA e RIELLA, 2003; TRYGGVASON e WARTIVAARA, 2005.) (Figura 3). 2
A parede do capilar glomerular está formada por três camadas: (1) células 3
endoteliais ou lâmina fenestrada, porção mais interna; (2) membrana basal, constituída 4
basicamente por colágeno e glicoproteínas; e (3) células epiteliais (podócitos), camada 5
mais externa (revisto por RIELLA, de MOURA e RIELLA, 2003) (Figura 3). 6
Apesar de ter uma resistência à passagem de água extremamente baixa, a barreira 7
de filtração glomerular restringe eficientemente a passagem de proteínas do sangue para o 8
espaço de Bowman, com base no seu tamanho, carga elétrica e conformação molecular. 9
Moléculas grandes e carregadas negativamente são menos filtradas que as pequenas e sem 10
carga ou carregadas positivamente. Apesar disso, em condições fisiológicas, proteínas de 11
baixa massa molecular e uma pequena quantidade de albumina atravessam a barreira de 12
Figura 3. Sistema de filtração glomerular renal. Cada rim humano contém cerca de 1.000.000 de glomérulos. As arteríolas aferentes dão origem aos capilares glomerulares, cujas paredes constituem a barreira de filtração glomerular. A barreira de filtração glomerular é composta por células endoteliais fenestradas, membrana basal glomerular e podócitos, com as projeções de seus pés formando interdigitações. Fonte: adaptado de TRYGGVASON e WARTIOVAARA, 2005.
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
25
filtração glomerular, mas são, em grande parte, reabsorvidas pelas células tubulares. 1
Aumento na excreção de proteínas na urina pode ser decorrente de aumento de sua 2
filtração, por alterações na permeabilidade seletiva glomerular, ou de defeitos em sua 3
captação tubular. Diversos estudos experimentais mostraram que as alterações de 4
seletividade são resultados de uma combinação de perda de restrição por carga e por 5
tamanho (revisto por D’AMICO e BAZZI, 2003). 6
Normalmente, são filtrados 180 litros de plasma a cada dia pelos glomérulos, 7
contendo 70 gramas/litro de proteína. No entanto, graças a um eficiente mecanismo de 8
reabsorção, efetuado principalmente pelos túbulos proximais, menos de 150 mg de 9
proteína são excretados por dia na urina. Destes, de 30 a 50 mg são de uma mucoproteína 10
(Tamm-Horsfall) de alta massa molecular, e o restante se constitui de globulinas e muito 11
pouca albumina (menos que 30 mg/dia). A presença de proteínas na urina em quantidades 12
superiores aos 150 mg/dia considerados normais, caracteriza a proteinúria (revisto por 13
RIELLA, PASCHALY e ZUNINO, 2003). 14
De acordo com a disfunção renal que ocorre, a proteinúria patológica pode ser 15
dividida em três categorias: glomerulares, tubulares e por hiperfluxo (revisto por 16
BARRATT e TOPHAM, 2007). 17
Na proteinúria glomerular, há dano da parede capilar glomerular, permitindo a 18
passagem de proteínas de alta massa molecular em quantidades que superam a capacidade 19
de reabsorção tubular. Em casos de proteinúria glomerular intensa, a albumina constitui de 20
60 a 90% da proteinúria total e quantidades menores das quatro maiores frações de 21
globulinas também são excretadas (KASISKE e KEANE, 2000). Considera-se, de modo 22
geral, que proteinúrias acima de 1,0 g/dia, muito provavelmente, têm origem glomerular 23
(RIELLA, PASCHALY e ZUNINO, 2003). 24
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
26
Disfunções ou lesões tubulares proximais podem impedir a reabsorção normal de 1
proteínas, resultando no aparecimento de proteínas, principalmente de baixa massa 2
molecular, na urina. Além disso, proteínas derivadas de células epiteliais tubulares lesadas 3
também podem ser excretadas pelos rins, caracterizando proteinúria. A este tipo, dá-se o 4
nome de proteinúria tubular, a qual não excede 1 a 2 g/dia (KASISKE e KEANE, 2000). 5
Quando proteínas, normais ou anormais, de baixa massa molecular são produzidas 6
em maior quantidade, são filtradas livremente pelos glomérulos, entretanto sua quantidade 7
ultrapassa a capacidade de reabsorção tubular. Tem-se, então, a proteinúria por hiperfluxo 8
ou extravasamento. Neste caso, tanto a barreira de filtração quanto o túbulo renal estão 9
intactos. (KASISKE e KEANE, 2000; ROSE, 2001; BASTOS, 1998). 10
1.4. Proteinúria na pré-eclâmpsia
Alterações hemodinâmicas na gestação levam a um aumento significativo no fluxo 11
sanguíneo renal e na taxa de filtração glomerular, o que é acompanhado por um aumento 12
na excreção urinária de proteínas, sendo considerado dentro da faixa de normalidade 13
valores <300 mg/dia para gestantes (KUO, KOUMANTAKIS e GALLERY, 1992). 14
É recomendado que o diagnóstico de pré-eclâmpsia seja baseado na coleta de 15
amostra de urina de 24 horas, sempre que possível, ou como alternativa, que seja baseado 16
na taxa proteína/creatinina urinária (“Report of the National High Blood Pressure 17
Education Program Working Group on High Blood Pressure in Pregnancy”, 2000). 18
Entretanto, Soni et al. (2009) mostraram ausência de diferenças estatisticamente 19
significativas quando compararam amostras de urina de 24 horas com amostras de 2 e 4 20
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
27
horas, sugerindo a possibilidade do uso de outros tipos de amostras de urina para a 1
avaliação da proteinúria. 2
A proteinúria tem sido proposta e estudada como um indicador da gravidade de pré-3
eclâmpsia e como preditora de seus sintomas (HOFMEYR e BELFORT, 2009), apesar de 4
alguns autores não considerarem-na tão eficiente (THANGARATINAM et al., 2009). 5
A proteinúria tem servido ainda para classificar a pré-eclâmpsia, sendo que valores 6
≥ 2 g/dia denotam uma gravidade mais elevada da doença e aumentam a certeza no 7
diagnóstico (“Report of the National High Blood Pressure Education Program Working 8
Group on High Blood Pressure in Pregnancy”, 2000), enquanto valores ≥ 5 g/dia são 9
indicativos de diagnóstico de pré-eclâmpsia grave (American College of Obstetrics and 10
Gynecology, 1996). 11
Os mecanismos responsáveis pela proteinúria na pré-eclâmpsia ainda estão para 12
serem elucidados. Sabe-se que ocorrem alterações hemodinâmicas nesta doença que 13
impedem o aumento da taxa de filtração glomerular que ocorre em gestações normais 14
(BROWN, 1995), mas parece pouco provável que apenas essas alterações sejam 15
responsáveis pelo aumento da excreção protéica urinária característica da síndrome. 16
Geralmente, a urina proveniente de pacientes com pré-eclâmpsia demonstra pouca 17
seletividade e não difere significativamente de outras formas de doença renal primária 18
(SIMANOWITZ e MACGREGOR, 1974). Proteínas de tamanhos intermediários, 19
originadas de danos glomerulares, como a albumina, têm sido identificadas sozinhas ou em 20
combinação com proteínas de origem tubular, tais como a β2-microglobulina, refletindo o 21
dano tubular que também ocorre na pré-eclâmpsia grave (WINKLER et al., 1988; QUASS 22
et al., 1987). 23
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
28
Na pré-eclâmpsia, ocorrem diversas alterações em componentes do glomérulo. 1
Biópsias renais têm demonstrado uma endoteliose característica das células endoteliais 2
glomerulares, o que pode afetar a filtração glomerular de proteínas (HOLT, MANGOS e 3
BROWN, 2007). Lafayette et al. (1998) notaram um espessamento significativo da 4
membrana basal glomerular, decorrente de depósitos fibrinóides, e uma diminuição de 5
fenestrações endoteliais expostas, em um estudo de biópsia renal de pacientes pré-6
eclâmpticas, e sugeriram que estes seriam os motivos da diminuição da taxa de filtração 7
glomerular encontrada nesta doença. Naicker et al. (1997) além de também encontrarem o 8
espessamento da membrana basal dos glomérulos na pré-eclâmpsia, reportaram uma 9
redução no número de sítios aniônicos nesta membrana basal, o que poderia contribuir para 10
a proteinúria aumentada. Os podócitos, células que formam a camada final da barreira 11
glomerular, são fontes de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), e estudos 12
experimentais demonstraram que a redução ou o bloqueio do VEGF derivado de podócitos, 13
em animais, resulta em disfunção endotelial e proteinúria semelhante à vista na pré-14
eclâmpsia (MAYNARD et al., 2003). 15
Recentemente foi demonstrado que níveis séricos do receptor solúvel de tirosina 16
quinase (sFlt-1), do VEGF e do fator de crescimento placentário (PIGF) estão alterados na 17
pré-eclâmpsia (MAYNARD et al., 2003; LEVINE et al., 2004). Níveis séricos aumentados 18
de sFlt-1 , os quais reduzem os níveis de PIGF livres, parecem preceder o aparecimento 19
dos sintomas da doença por cinco semanas (LEVINE et al., 2004; THADHANI et al., 20
2004). Ao contrário, as concentrações séricas de VEGF encontram-se diminuídas ao longo 21
da gestação, e não predizem precisamente a pré-eclâmpsia (LEVINE et al., 2004). A 22
significância dos fatores angiogênicos VEGF, sFlt-1 e PIGF na regulação da fisiologia 23
vascular glomerular do rim humano merece uma atenção aumentada. sFlt-1 administrado 24
exogenamente a roedoras prenhas levaram a hipertensão, proteinúria e endoteliose 25
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
29
glomerular (SUGIMOTO et al., 2003). Similarmente, neutralização de níveis fisiológicos 1
de VEGF, um fator de sobrevivência mitogênico, importante para o endotélio vascular 2
glomerular, levou a um aumento da apoptose, diminuição do reparo do capilar glomerular, 3
e acentuada proteinúria em modelo animal de nefrite mesangioproliferativa (OSTENDORF 4
et al., 1999). 5
Se estes fatores angiogênicos atuam diretamente sobre a membrana basal 6
glomerular, levando a alterações funcionais que poderiam ser importantes para explicar a 7
presença da proteinúria nesta doença multissistêmica, isto ainda está para ser esclarecido. 8
Sabe-se que existe uma forte correlação entre a intensidade da proteinúria e uma 9
diminuição de proteoglicanos na membrana basal glomerular (KHEDUN et al., 2002). O 10
proteoglicano sulfato de heparan é considerado o principal responsável pela seletividade de 11
carga da membrana basal glomerular, e sua diminuição resulta em uma redução da carga 12
aniônica desta membrana. A excreção urinária de heparan sulfato está significativamente 13
aumentada em mulheres negras africanas com pré-eclâmpsia, existindo uma forte 14
correlação entre a intensidade da proteinúria e a diminuição de carga da membrana basal, 15
induzindo a mudanças estruturais na barreira de filtração, o que poderia ser o mecanismo 16
responsável pela proteinúria na pré-eclâmpsia (KHEDUN et al., 2002). 17
Existem, também, evidências de que possa haver alguma disfunção tubular na pré-18
eclâmpsia. Estudos avaliando a excreção de substâncias normalmente reabsorvidas por 19
células do túbulo proximal demonstraram diminuição do clearance destas substâncias em 20
gestações que evoluíram com hipertensão (GALLERY e GYORY, 1979) ou pré-eclâmpsia 21
(SAUDAN, FARREL e BROWN, 1998). Além disso, marcadores de lesão tubular, como a 22
N-acetil-β-D-glucosamiminidase urinária, já foram relatados em maiores concentrações 23
entre pré-eclâmpticas do que em gestantes normotensas (MADIAS e HARRINGTON, 24
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
30
1978). Yamamoto et al. (1992) referiram, através de um estudo com imunoblot, que pelo 1
menos 12% das proteínas urinárias na pré-eclâmpsia eram de origem tubular, enquanto que 2
15% tinham origem puramente glomerular, de acordo com suas massas moleculares. 3
De acordo com Jeyabalan e Conrad (2007), o aumento da excreção urinária de 4
proteínas da pré-eclâmpsia é decorrente de alterações na seletividade, no tamanho e/ou 5
carga da barreira de filtração glomerular, o que possivelmente aumenta a pressão capilar 6
glomerular e compromete a reabsorção tubular proximal. 7
Diversos estudos têm estudado a proteinúria da pré-eclâmpsia no intuito de 8
encontrar proteínas potencialmente preditoras da doença. Pesquisas voltadas à investigação 9
do potencial valor da medida da concentração de albumina urinária, como um método para 10
detectar pacientes com probabilidade de desenvolver pré-eclâmpsia, mostraram resultados 11
contraditórios (IRGENS-MOLLER, HEMMINGSEN e HOLM, 1986; RODRIGUEZ et 12
al., 1988; KONSTANTIN-HANSEN, HESSELDAHL e PEDERSEN, 1992; DAS et al., 13
1996; WAUGH et al., 2003). Este fato foi atribuído à variedade de métodos utilizados na 14
seleção de pacientes, bem como nos critérios de inclusão das pacientes nos vários grupos 15
de estudo. Um estudo que avaliou a presença de microalbuminúria e excreção urinária de 16
cálcio em 88 gestantes demonstrou que 83% das pacientes que apresentaram altos níveis de 17
microalbuminúria e baixa excreção de cálcio, desenvolveram pré-eclâmpsia subseqüente 18
(RODRIGUEZ et al., 1988). Por outro lado, outros pesquisadores mostraram que pacientes 19
que desenvolveram pré-eclâmpsia com proteinúria clinicamente detectável não 20
apresentaram microalbuminúria prévia (KONSTANTIN-HANSEN, HESSELDAHL, 21
PEDERSEN, 1992; LOPEZ-ESPINOZA et al., 1986). 22
Li, Chu e Zhou, em 1995, demonstraram que a excreção urinária de albumina, IgA 23
(imuglobulina A) e IgG (imunoglobulina G), mas não IgM (imunoglobulina M), estava 24
Introdução
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
31
significativamente aumentada em gestantes hipertensas, quando comparadas a gestantes 1
normais em diferentes idades gestacionais, e que a excreção dessas proteínas se 2
correlacionava positivamente com a pressão arterial média. Ao contrário, os resultados de 3
um estudo avaliando o padrão protéico da urina de pacientes no terceiro trimestre de 4
gravidez, realizado para diferenciar a genuína pré-eclâmpsia da pré-eclâmpsia sobreposta à 5
glomerulopatias pré-existentes, mostrou que 47% das pacientes apresentavam um padrão 6
protéico misto, independente da gravidade da doença (KALTENBACH et al., 1983). 7
O padrão protéico urinário também foi estudado, através de eletroforese em gel de 8
poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), comparando homens e 9
mulheres não-grávidas e sadios, mulheres grávidas sem intercorrências no curso da 10
gravidez e pacientes grávidas hipertensas, e o dado mais marcante observado foi a redução 11
ou desaparecimento de uma banda protéica de 105 kDa, correspondente à proteína Tamm-12
Horsfall, na maioria das pacientes grávidas hipertensas (RATH et al., 1988). Shinagawa e 13
Saitoh (1983) fizeram análises imunológicas das proteínas urinárias de pacientes com pré-14
eclâmpsia e observaram que muitos tipos de proteínas podem ser detectados na urina além 15
da albumina, e sugerem que “proteinúria” seja o termo mais adequado que “albuminúria”, 16
para se referir à excreção protéica urinária da pré-eclâmpsia. Entre as proteínas mais 17
freqüentemente detectadas na urina das pacientes encontravam-se albumina, transferrina, 18
IgG, inibidor de alfa-1-antitripsina, IgA e IgM, sendo que após o parto algumas dessas 19
proteínas desapareciam prontamente da urina, como o inibidor de alfa-1-antitripsina e IgA. 20
Outro estudo mostrou grandes quantidades de IgM, fibronectina, IgG e β2-microglobulina 21
em urinas de pacientes com pré-eclâmpsia (YAMAMOTO et al., 1992).22
Introdução
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1.5. Proteínas plasmáticas na pré-eclâmpsia
Em um indivíduo adulto, a concentração de proteínas totais no plasma varia de 6,0 1
a 8,0 g/dL. Consistem de uma mistura complexa de proteínas simples, lipoproteínas e 2
glicoproteínas, sendo que a maioria delas tem síntese hepática. Já as γ-globulinas são 3
sintetizadas nos plasmócitos e algumas proteínas podem ser sintetizadas em células 4
endoteliais (revisto por GRAS, 1983). 5
As proteínas totais do plasma podem ser separadas, identificadas e quantificadas 6
por diversos métodos, incluindo métodos de cromatografia, eletroforese e 7
espectrofotometria. Em laboratórios clínicos, emprega-se geralmente a espectrofotometria 8
e a eletroforese em fita de acetato de celulose em tampão pH 8,6. Este método 9
eletroforético permite a separação das proteínas do soro em cinco frações: albumina, α1-10
globulinas, α2-globulinas, β-globulinas e γ-globulinas (Figura 4). Com exceção da fração 11
albumina, todas as outras frações são compostas de diferentes proteínas, com pontos 12
isoelétricos semelhantes. Quando a eletroforese é feita utilizando-se plasma, nota-se uma 13
fração adicional entre as frações β e γ, correspondente ao fibrinogênio (revisto por GRAS, 14
1983).15
Figura 4. Perfil eletroforético das proteínas do soro sanguíneo humano. Fonte: HIAL et al., 2008.
Albumina------------54-59% α1-globulinas-------04-07% α2-globulinas-------08-09% β-globulinas--------12-14% γ-globulinas---------11-18%
Introdução
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Devido às inter-relações existentes entre as proteínas plasmáticas e proteínas de 1
outros tecidos, alguns pesquisadores estudaram as proteínas plasmáticas de mulheres 2
gestantes hígidas e gestantes com diagnóstico de pré-eclâmpsia. O volume de sangue 3
circulante está significativamente aumentado durante a gestação normal, sendo que o 4
volume plasmático se expande mais que o celular (BERLIN et al., 1953; CATON et al., 5
1951). A concentração de proteínas sanguíneas na gestação normal diminui até 26ª semana 6
e se mantém baixa até o 3° trimestre, enquanto que a concentração de albumina diminui 7
progressivamente até a 36ª semana e a de globulinas aumenta (BLEKTA et al., 1970). 8
Bagga e Dutt Mullick (1966) descreveram que a diminuição de proteínas totais e albumina 9
sérica foi constatada por diversas pesquisas, apesar das discrepâncias encontradas nos 10
resultados das análises seriadas de proteínas totais séricas durante o curso da gestação. 11
Estudos demonstraram que concentrações de proteínas totais e de albumina estão 12
também reduzidas no sangue de pacientes com pré-eclâmpsia (BLEKTA et al., 1970; 13
FREIS e KENNY, 1948; MACGILLIVRAY e TOVEY, 1957, BAGGA e DUTT 14
MULLICK, 1966). Além disso, a redução do volume sanguíneo circulante e da quantidade 15
absoluta de proteínas pode ocorrer, inclusive, antes do aparecimento dos sintomas clínicos 16
da pré-eclâmpsia (BLEKTA et al., 1970). 17
Justificativa
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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2. JUSTIFICATIVA
A pré-eclampsia é uma desordem hipertensiva comum da gestação, tem alta 1
prevalência em todo o mundo e pode levar à morte materna e/ou fetal. Ainda não possui 2
uma etiologia conhecida e fisiopatologia bem definida. 3
Estudando a literatura, observamos que os mecanismos que levam á proteinúria e o 4
perfil protéico urinário na pré-eclâmpsia ainda não estão completamente estabelecidos. 5
Além disso, a proteinúria, como ocorre na síndrome nefrótica, é acompanhada por 6
alterações significativas no perfil protéico plasmático e estudos relativos às proteínas 7
plasmáticas na pré-eclâmpsia são raros e não associam proteinúria e proteinemia. 8
Sendo a proteinúria um parâmetro importante para o diagnóstico e 9
acompanhamento de pacientes com pré-eclâmpsia, propusemos uma análise do perfil 10
protéico urinário de gestantes pré-eclâmpticas e normotensas, com o intuito de conhecer o 11
padrão de proteínas excretadas nesta doença e tentar relacioná-lo com a provável disfunção 12
renal que possa estar ocorrendo. 13
Uma avaliação quantitativa e qualitativa das proteínas do plasma é também de 14
interesse quando avaliamos pacientes que apresentam proteinúria tão significativa quanto a 15
que pode ser observada na pré-eclâmpsia. Diante das poucas informações existentes na 16
literatura sobre parâmetros plasmáticos na pré-eclâmpsia, propusemos também uma análise 17
do perfil protéico plasmático destas gestantes, para verificar quais alterações a proteinúria 18
pode estar desencadeando nas proteínas plasmáticas de pacientes com pré-eclâmpsia.19
Objetivos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O objetivo deste estudo é avaliar os perfis protéicos urinário e plasmático em
pacientes gestantes com pré-eclâmpsia e normotensas.
3.2. Objetivos específicos
1. Analisar os perfis eletroforéticos urinários de cada paciente do estudo e as
diferenças existentes entre os grupos;
2. Comparar os níveis plasmáticos de proteínas totais e albumina entre as gestantes
com pré-eclâmpsia e as normotensas;
3. Correlacionar os níveis de proteínas totais plasmáticas e a excreção urinária de
proteínas das pacientes com pré-eclâmpsia;
4. Analisar os perfis eletroforéticos plasmáticos de cada paciente e compará-los entre
os grupos.
Materiais e Métodos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
Esta pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Bioquímica e 1
Biofísica do Departamento de Ciências Biológicas (DCB) da Universidade Federal do 2
Triângulo Mineiro (UFTM). 3
Todos os procedimentos realizados durante a realização deste estudo foram 4
analisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFTM (CEP-UFTM/ N°: 5
309/2002) (Anexo A). As pacientes foram informadas sobre o estudo, concordaram em 6
participar e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo B). 7
Esta dissertação foi escrita de acordo com as normas da Associação Brasileira de 8
Normas Técnicas (ABNT) e com o Roteiro para Confecção de Teses do Curso de Pós-9
Graduação em Patologia (CPGP) da UFTM. 10
4.1. Obtenção e Processamento das Amostras
Este estudo foi realizado com amostras provenientes de 14 gestantes com pré-11
eclâmpsia internadas na enfermaria de Obstetrícia do Departamento Materno-Infantil da 12
UFTM e amostras de 11 gestantes normotensas acompanhadas no Ambulatório Maria da 13
Glória da UFTM. 14
As gestantes com pré-eclâmpsia foram selecionadas com base no seu diagnóstico, 15
ou seja, desenvolvimento de hipertensão arterial (pressão arterial ≥140/90 mmHg) e 16
proteinúria (≥ 300 mg/24 horas) após 20 semanas de gestação (segundo critérios do 17
Materiais e Métodos
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“Report of the National High Blood Pressure Education Program Working Group on High 1
Blood Pressure in Pregnancy”, 2000). 2
Em ambos os grupos, os critérios de exclusão foram: presença de doenças crônicas, 3
infecção urinária, comprometimento da função renal, avaliado através de dosagem de 4
clearance de creatinina, e estar em uso de medicamentos. 5
Os dados demográficos de nossas pacientes foram obtidos por meio de seus 6
prontuários no Serviço de Arquivo Médico (SAME) do Hospital de Clínicas da UFTM, e 7
constam no Apêndice A. As características demográficas de ambos os grupos de pacientes 8
estão sumarizados na Tabela 1 e foram reportados por meio de médias ± desvios padrões 9
ou percentuais. 10
Tabela 1. Dados demográficos de gestantes normotensas e pré-eclâmpticas
Característica Gestantes normotensas (n=11)
Gestantes pré-eclâmpticas (n=14)
Idade materna (anos) * 27,4 ± 4,9 21,1 ± 5,8 Idade Gestacional (semanas) * 34,0 ± 2,3 31,0 ± 2,1 Número de gestações Primigestas Duas ou mais gestações
3 (27,3%) 8 (72,7%)
9 (64,3%) 5 (35,7%)
Pressão Arterial Sistólica (mmHg) **
112,7 ± 9,0 152,1 ± 10,5
Pressão Arterial Diastólica (mmHg) **
71,8 ± 7,5 104,3 ± 5,1
Proteinúria (mg/24 hs) ** 122,2 ± 23,4 3.366,4 ± 3,3 *Diferença estatística significativa entre os grupos (p<0,05); **Diferença estatística altamente significativa entre os grupos (p<0,0001);
Foram coletadas amostras de urina de 24 horas sem conservante e amostras de 6 11
horas com conservante, para prevenir crescimento microbiano, consecutivamente, por 12
Materiais e Métodos
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38
micções espontâneas, e mantidas em banho de gelo. O frasco para coleta da amostra de 1
urina de 6 horas continha 10 mL de HCl 6N, o que manteve o pH da maioria das nossas 2
amostras abaixo de 4,0. As amostras foram filtradas em papel de filtro Whatman SS 50 e 3
congeladas a -20°C até o momento dos procedimentos laboratoriais. 4
Uma amostra de urina de um paciente do sexo masculino com proteinúria 5
significativa do tipo glomerular foi coletada e processada sob as mesmas condições, e 6
utilizada como padrão de proteinúria glomerular. 7
As pacientes do estudo foram submetidas à punção venosa (20 mL) em tubo, 8
contendo 0,1 mL de uma solução de citrato de sódio (0,05 M). Em seguida o sangue foi 9
centrifugado a 3000 rpm, durante 10 minutos, a 4°C. Os sobrenadantes foram separados e 10
mantidos congelados a -20°C até o momento do uso. 11
4.2. Avaliação do perfil protéico das amostras de urina
Realizou-se a avaliação do perfil protéico das amostras de urina por meio de 12
eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), de 13
acordo com o método descrito por Laemmli (1970). Foram realizadas eletroforeses em géis 14
com 10% de acrilamida:bisacrilamida e corados pelo método da prata amoniacal (TUÑON 15
e JOHANSON, 1984), conforme descrito no Anexo C. Em todas as canaletas aplicou-se a 16
mesma quantidade de proteínas (20 µg), tanto para as amostras provenientes de pré-17
eclâmpsia quanto para as controles. Os padrões de massa molecular utilizados foram: 18
anidrase carbônica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa) e albumina bovina (66 kDa). 19
Materiais e Métodos
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39
Determinou-se a massa molecular das bandas protéicas mais intensas e bem 1
definidas de cada amostra de urina a partir da corrida eletroforética. Para isso, mediu-se a 2
distância correspondente à migração do tampão da amostra, demarcada pelo azul de 3
bromofenol, e as distâncias correspondentes à migração das bandas dos padrões de massa 4
molecular e das amostras, sendo a medição realizada no meio da banda protéica. Calculou-5
se o quociente de cada valor obtido para a migração das bandas protéicas pela medida da 6
frente de migração do tampão de amostra, para a obtenção do Rf (relativo à frente). Os 7
quocientes obtidos para os padrões de massa molecular foram utilizados para a confecção 8
de um gráfico em papel semilog, com os valores de massa molecular no eixo das ordenadas 9
e os valores de Rf no eixo das abscissas. Em seguida, por interpolação gráfica, encontrou-10
se o valor da massa molecular aparente de cada banda protéica investigada, a partir de seus 11
valores de Rf, conforme descrito por Zwaan (1967). 12
4.3. Determinação da concentração de proteínas totais das amostras de plasma
Determinou-se a concentração de proteínas totais das amostras de plasma por meio 13
do método do Biureto (GORNALL, BARDAWILL e DAVID, 1949), utilizando o conjunto 14
de reagentes comercial da Labtest Diagnóstica®. 15
Quanto ao procedimento técnico, utilizou-se tubos de ensaio em número 16
dependente da quantidade de amostras, incluindo dois tubos: um para a dosagem do padrão 17
e outro, para a leitura do branco. Em todos os tubos, adicionou-se 2,5 mL do reagente de 18
Biureto. Ao tubo branco, acrescentou-se 0,05 mL de água destilada e deionizada, ao tubo 19
padrão, 0,05 mL do reagente padrão e aos tubos testes, 0,05 mL das amostras. 20
Materiais e Métodos
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40
Após agitar os tubos e deixá-los em repouso durante 15 minutos, as absorbâncias 1
dos testes e do padrão foram lidas em 545 nm em espectrofotômetro (Micronal B582), 2
acertando o zero com o branco. 3
A concentração de proteínas totais das amostras foi determinada a partir dos 4
cálculos:5
(1) Proteínas totais (g/dL) = Fator de calibração x Absorbância do teste
(2) Fator de calibração = Concentração do padrão Absorbância do padrão
4.4. Determinação da concentração de albumina das amostras de plasma
Determinou-se a concentração de albumina das amostras de plasma por meio do 6
método do Verde de Bromocresol (SMITH, DESAUTELS e DOWNEY, 1954), utilizando 7
o conjunto de reagentes comercial da Analisa®. 8
Quanto ao procedimento técnico, utilizou-se tubos de ensaio em número 9
dependente da quantidade de amostras, incluindo dois tubos: um para a dosagem do padrão 10
e outro, para a leitura do branco. Em todos os tubos, adicionou-se 2,0 mL do reagente de 11
cor (Verde de Bromocresol). Ao tubo padrão, acrescentou-se 0,02 mL do reagente padrão e 12
aos tubos testes, 0,02 mL das amostras. 13
Após agitar os tubos e deixá-los em repouso durante um minuto, as absorbâncias 14
dos testes e do padrão foram lidas em 630 nm em espectrofotômetro (Micronal B582), 15
acertando o zero com o branco. 16
Materiais e Métodos
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41
A concentração de albumina plasmática foi determinada a partir dos cálculos: 1
(1) Albumina (g/dL) = Fator de calibração x Absorbância do teste
(2) Fator de calibração = Concentração do padrão Absorbância do padrão
4.5. Avaliação do perfil protéico das amostras de plasma
A avaliação do perfil protéico das amostras de plasma foi realizada através de 2
eletroforeses em fitas de acetato de celulose coradas pelo Ponceau S (KOROTZER, 3
BERGQUIST e SEARCY, 1961), conforme descrito no Anexo D. Estas fitas foram 4
submetidas à determinação de absorbância em 520 nm em densitômetro digital (CELM – 5
DS35) e os resultados foram expressos em porcentagens para cada fração protéica. As 6
concentrações absolutas de cada fração foram calculadas com base nos valores obtidos 7
para dosagem de proteínas plasmáticas totais de cada paciente. 8
4.6. Análise Estatística dos Resultados
Os resultados foram analisados estatisticamente construindo planilhas eletrônicas 9
no programa Microsoft Excel® (Redmond, WA) e realizando cálculos e construindo 10
gráficos no programa BioEstat 5.0. 11
Para analisar a normalidade das variáveis, utilizou-se o teste de Lilliefors. 12
Para verificar diferenças entre os grupos de gestantes normotensas e pré-13
eclâmpticas em relação a seus dados demográficos (idade materna, idade gestacional, 14
Materiais e Métodos
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42
pressão arterial e proteinúria de 24 horas) utilizou-se o teste de Mann-Whitney, devido à 1
distribuição não-normal destes dados. Realizou-se também cálculo de frequência de 2
primigestas em cada grupo de gestantes. 3
Quanto aos perfis eletroforéticos das amostras de urina, realizou-se análise 4
descritiva das bandas protéicas observadas em cada amostra de ambos os grupos de 5
pacientes. 6
Para verificar diferenças entre os grupos de pacientes do estudo quanto às dosagens 7
plasmáticas realizadas (proteinemia e albuminemia), utilizou-se o teste t student, devido à 8
normalidade na distribuição dos dados obtidos. 9
Para correlacionar a excreção urinária de proteínas e a dosagem de proteínas 10
plasmáticas de cada paciente com pré-eclâmpsia, utilizou-se o teste de correlação linear de 11
Spearman, devido à distribuição não-normal dos dados. 12
Quanto aos perfis eletroforéticos das amostras de plasma, comparou-se os dois 13
grupos de pacientes quanto aos percentis e às concentrações de cada fração protéica 14
plasmática. Para tal, utilizou-se o teste de Mann-Whitney, para amostras com distribuição 15
não-normal, e o teste t student, para amostras com distribuição normal. 16
O nível de significância para todos os testes foi de α=0,05. 17
Resultados
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43
5. RESULTADOS
5.1. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 24 horas
A avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 24 horas por meio de 1
eletroforeses em géis de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi 2
possível em dez amostras de gestantes com pré-eclâmpsia e nove amostras de gestantes 3
normotensas, devido à visível contaminação microbiana nas demais amostras coletadas. 4
A seguir, encontram-se esquemas demonstrando os padrões protéicos urinários 5
obtidos por meio de SDS-PAGE das amostras de 24 horas (Figuras 5A e 5B) das gestantes 6
com pré-eclâmpsia e das gestantes controles. Nos esquemas, observamos marcações 7
referentes às bandas mais intensas e bem definidas de cada amostra utilizada no estudo, de 8
acordo com sua massa molecular estimada, e sua frequência entre as amostras de cada 9
grupo. 10
As imagens das eletroforeses constam no Apêndice B, mostrando todos os perfis 11
eletroforéticos das amostras de urina de 24 horas das gestantes com pré-eclâmpsia, das 12
normotensas e os padrões de massa molecular utilizados. 13
Quanto às amostras provenientes de gestantes com pré-eclâmpsia, em apenas uma 14
amostra analisada por SDS-PAGE verificou-se ausência de bandas protéicas. Em todas as 15
outras amostras analisadas, verificou-se a presença de bandas, que variaram em número, 16
intensidade de coloração e distância de migração, havendo bandas distribuídas por toda a 17
extensão do gel. As proteínas mais frequentes neste grupo foram aquelas com massa 18
molecular em torno de 66 kDa (80%), 56 kDa (80%) e 45 kDa (70%). Apesar da proteína 19
Resultados
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44
de 66 kDa estar presente em 80% das amostras analisadas, do ponto de vista quantitativo, 1
ela constituiu o principal componente protéico do perfil em apenas 20% das amostras, 2
enquanto que a de 56 kDa predominou em 60% dos perfis eletroforéticos. A proteína de 45 3
kDa foi o componente predominante em apenas uma das amostras. Outras proteínas 4
também se mostraram constantes entre estas amostras, como aquelas de massas 5
moleculares de cerca de 40 kDa (60%), 38 kDa (60%) e 30 kDa (50%), sendo que em 6
nenhuma amostra estas bandas foram as preponderantes do perfil protéico. 7
Em relação às amostras de 24 horas das gestantes controles, verificamos ausência 8
de bandas protéicas em apenas duas amostras, sendo que as outras apresentaram bandas 9
que também variaram em número, intensidade de coloração e distância de migração, 10
havendo bandas distribuídas por toda a extensão do gel. As proteínas mais frequentes entre 11
essas amostras foram as de cerca de 50 kDa, 45 kDa, 38 kDa e 33 kDa, que apresentaram 12
frequência de 55,5% cada uma dentro do grupo. A proteína de cerca de 66 kDa, massa 13
molecular similar à albumina, também esteve presente entre os perfis observados neste 14
grupo, apresentando frequência de 33,3% (3 amostras), sendo que em duas destas amostras 15
esta banda protéica representava o principal componente. Entre as outras bandas protéicas, 16
não foi observada a constância de uma banda predominante. 17
Comparando os perfis entre os grupos de gestantes, observamos que os perfis 18
eletroforéticos das gestantes com pré-eclâmpsia apresentam um número maior de bandas e 19
que estas se coraram mais intensamente. Além disso, as bandas de 40 e 30 kDa estavam 20
presentes em 60% e 50% das amostras do grupo de gestantes com pré-eclâmpsia, 21
respectivamente, e não foram visualizadas em nenhuma amostra do grupo controle. 22
Resultados
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45
Amostras Massa Molecular Aparente 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14
Frequência no grupo
95 kDa 90 kDa 20% 85 kDa 20% 80 kDa 30% 75 kDa 10% 66 kDa 80% 60 kDa 20% 56 kDa 80% 54 kDa 50 kDa 30% 48 kDa 40% 45 kDa 70% 42 kDa 30% 40 kDa 60% 38 kDa 60% 33 kDa 30% 30 kDa 50% 27 kDa 30% 24 kDa 20% 22 kDa 10% 20 kDa 30% 19 kDa 20%
Amostras Massa Molecular Aparente 15 16 17 18 19 20 22 23 24
Frequência no grupo
95 kDa 11,1% 90 kDa 85 kDa 11,1% 80 kDa 22,2% 75 kDa 66 kDa 33,3% 60 kDa 33,3% 56 kDa 44,4% 54 kDa 22,2% 50 kDa 55,5% 48 kDa 22,2% 45 kDa 55,5% 42 kDa 22,2% 40 kDa 38 kDa 55,5% 33 kDa 55,5% 30 kDa 27 kDa 22,2% 24 kDa 22 kDa 22,2% 20 kDa 11,1% 19 kDa 11,1%
Figura 5. Esquema demonstrando o perfil urinário protéico das amostras de 24 horas de gestantes com pré-eclâmpsia (A) e
normotensas (B), segundo a massa molecular das bandas, e demonstrando a frequência de cada banda no grupo
A
B
Resultados
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46
5.2. Avaliação do perfil protéico urinário das amostras de 6 horas
Avaliamos, por meio de SDS-PAGEs, o perfil protéico urinário das amostras de 6 1
horas em todas as 14 amostras de gestantes com pré-eclâmpsia e as 11 amostras de 2
gestantes controles. 3
A seguir, encontram-se esquemas demonstrando os padrões protéicos urinários 4
obtidos por meio de SDS-PAGE das amostras de 6 horas colhidas com HCl 6N (Figuras 5
6A e 6B) das gestantes com pré-eclâmpsia e das controles. Nos esquemas observamos 6
marcações referentes às bandas mais intensas e bem definidas de cada amostra utilizada no 7
estudo, de acordo com sua massa molecular estimada, e sua frequência entre as amostras 8
de cada grupo. 9
As imagens das eletroforeses constam no Apêndice C, mostrando todos os perfis 10
eletroforéticos das amostras de urina de 6 horas das gestantes com pré-eclâmpsia, das 11
normotensas e os padrões de massa molecular utilizados. 12
Quanto às amostras provenientes de pacientes com pré-eclâmpsia, em todos os 13
perfis eletroforéticos verificou-se a presença de bandas protéicas, que variaram, em 14
número, intensidade de coloração e distância de migração, havendo bandas distribuídas por 15
toda a extensão do gel. As proteínas mais frequentes foram aquelas com massas 16
moleculares em torno de 16 kDa (78,6%), 10 kDa (71,4%) e 2,0 kD (71,4%). Bandas com 17
massas moleculares estimadas em 50 kDa, 45 kDa, 37 kDa e 12,5 kDa foram encontradas 18
na frequência de 50% cada uma dentro do grupo. Cinco pacientes pré-eclâmpticas (35,7%) 19
apresentaram proteínas com massas moleculares ≥ 60 kDa, sendo que apenas uma (7,1%) 20
apresentou uma banda com massa molecular semelhante à albumina. 21
Resultados
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47
Em relação às amostras controles, visualizou-se a presença de bandas protéicas em 1
36,4% das amostras, sendo a banda de 2,0 kDa a mais frequente no grupo. Uma proteína de 2
massa molecular de 20 kDa estava presente em 27,3% destas amostras, sendo a segunda 3
banda mais frequente no grupo. Proteínas com massas moleculares de 50 e 45 kDa, apesar 4
de frequentes entre as gestantes com pré-eclâmpsia, não foram visualizadas entre os perfis 5
das gestantes normotensas. A banda protéica de 12,5 kDa foi visualizada em apenas 2 6
gestantes controle (18,2%) apesar de sua alta frequência (50%) entre as pré-eclâmpticas. 7
Comparando-se os perfis eletroforéticos obtidos com as amostras urinárias de 24 8
horas com os perfis obtidos com as amostras de 6 horas com conservante, observou-se 9
expressivas diferenças nos padrões de bandas exibidos. Nos perfis das amostras de 6 horas 10
com HCl, há predomínio de bandas com massas moleculares mais baixas e peptídeos, além 11
do desaparecimento de algumas bandas e surgimento de outras. 12
Resultados
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Figura 6. Esquema demonstrando o perfil urinário protéico das amostras de gestantes com pré-eclâmpsia (A) e normotensas (B), segundo a massa molecular das bandas, e demonstrando a frequência de cada banda no grupo
Amostras Massa Molecular Aparente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Frequência no grupo
75 kDa 7,1% 66 kDa 7,1% 60 kDa 35,7% 50 kDa 50% 45 kDa 50% 37 kDa 50% 27 kDa 35,7% 22 kDa 35,7% 20 kDa 35,7% 16 kDa 78,6%
12,5 kDa 50% 10 kDa 71,4% 8,4 kDa 42,9% 7,5 kDa 28,6% 3,0 kDa 42,9% 2,0 kDa 71,4%
Amostras Massa Molecular Aparente 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Frequência no grupo
75 kDa 66 kDa 9,1% 60 kDa 50 kDa 45 kDa 37 kDa 9,1% 27 kDa 22 kDa 20 kDa 27,3% 16 kDa 9,1%
12,5 kDa 18,2% 10 kDa 9,1% 8,4 kDa 7,5 kDa 3,0 kDa 2,0 kDa 36,4%
A
B
Resultados
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5.3. Determinação da concentração de proteínas totais e albumina plasmáticas
Na Tabela 2, encontram-se os valores médios obtidos para proteínas totais e 1
albumina das amostras de plasma de pacientes com pré-eclâmpsia e normotensas. Os 2
valores obtidos para cada amostra constam no Apêndice D. 3
Verificamos que a média das concentrações de proteínas totais e albumina 4
plasmáticas no grupo de pré-eclâmpticas foi de 5,1 (±0,9) g/dL e 2,6 (±0,7) g/dL, 5
respectivamente. As gestantes normotensas mantiveram médias de 6,3 (±0,6) g/dL para 6
proteínas totais plasmáticas e 3,8 (±0,5) g/dL para albumina. 7
Proteínas totais* (g/dL)
Albumina* (g/dL)
Pré-eclâmpsia 5,1 ± 0,9 2,6 ± 0,7 Controle 6,3 ± 0,6 3,8 ± 0,5
Ao comparar estes parâmetros plasmáticos entre os grupos, verificou-se diferenças 8
estatisticamente significantes. O grupo controle apresentou níveis mais elevados tanto para 9
proteínas totais (p=0,0006) quanto para albumina plasmática (p=0,0001), conforme 10
evidenciado nas Figuras 7 e 8. 11
Tabela 2. Valores médios de proteínas totais e albumina das amostras de plasma das gestantes com pré-eclâmpsia e controles.
*Diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p<0,05)
Resultados
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50
Figura 7. Concentração de proteínas totais plasmática no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia (PE) e no grupo de gestantes normotensas (C).
Figura 8. Concentração de albumina plasmática no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia (PE) e no grupo de gestantes normotensas (C).
p=0,0006
p=0,0001
Resultados
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51
5.4. Avaliação do perfil protéico plasmático
As eletroforeses em fitas de acetato de celulose das amostras de plasma não 1
apresentaram alterações visuais relevantes entre os grupos, conforme verificado no 2
Apêndice E. Analisamos as frações albumina e α1-globulinas conjuntamente devido ao fato 3
de não ter havido separação efetiva destas frações. 4
A análise densitométrica permitiu a estimativa dos percentis de cada fração protéica 5
plasmática e o cálculo de suas concentrações absolutas com base na concentração de 6
proteínas totais plasmáticas de cada paciente, verificadas no Apêndice F. Os valores 7
médios para os percentis e para as concentrações das frações protéicas de ambos os grupos 8
são mostrados nas Tabelas 3 e 4. 9
Frações protéicas plasmáticas (%)
Albumina e
α1* α2* β γ
Pré-eclâmpsia 53,0 ± 3,8 13,8 ± 3,1 16,6 ± 2,0 16,7 ± 3,1 Controle 56,4 ± 3,3 11,4 ± 1,7 15,6 ± 2,2 16,6 ± 2,4
Frações protéicas plasmáticas (g/dL)
Albumina
e α1* α2 β* γ*
Pré-eclâmpsia 2,72 ± 0,59
0,69 ± 0,18
0,84 ± 0,15 0,85 ± 0,2
Controle 3,59 ± 0,44 0,73 ± 0,18 0,98 ± 0,11 1,05 ± 0,19
Tabela 3. Valores médios de percentis estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas.
Tabela 4. Concentrações médias estimados das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas e normotensas.
*Diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p<0,05)
*Diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p<0,05)
Resultados
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52
Ao compararmos os percentis entre os grupos, verificamos que houve diferença 1
significativa apenas na fração de albumina-α1-globulinas (p=0,0231) e de α2-globulinas 2
(p=0,032) (Figura 9), sendo que o grupo de pré-eclâmpsia apresentou percentis mais baixos 3
para albumina-α1-globulinas e mais elevados para α2-globulinas. Os percentis médios das 4
demais frações protéicas plasmáticas não diferiram significativamente entre os grupos 5
(Figura 9). 6
Ao compararmos as concentrações absolutas entre os grupos, verificamos que 7
houve diferença significativa nas frações albumina-α1-globulinas (p=0,0008), β-globulinas 8
(p=0,0016) e γ-globulinas (p=0,019) (Figura 10), sendo que o grupo controle manteve 9
níveis mais elevados das três frações. As demais frações protéicas plasmáticas não 10
diferiram significativamente entre os grupos de pacientes (Figura 10). 11
Resultados
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
53
Figura 9. Percentis das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas (PE) e gestantes normotensas (C). Em A, albumina e α1-globulinas, em B, α2-globulinas, em C, β-globulinas e em D, γ-globulinas.
p=0,5470
C
A
p=0,0248 p=0,032
B
D
p=0,9563
Resultados
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54
p=0,0005
A
p=0,36
B
p=0,0016
C
p=0,019
D
Figura 10. Concentrações das frações protéicas das amostras de plasma no grupo de gestantes pré-eclâmpticas (PE) e gestantes normotensas (C). Em A, albumina e α1-globulinas, em B, α2-globulinas, em C, β-globulinas e em D, γ-globulinas.
Resultados
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55
5.5. Correlação entre proteínas totais no plasma e na urina
Não houve correlação entre as concentrações de proteínas totais no plasma e na 1
urina das pacientes com pré-eclâmpsia (p=0,71) (Figura 11). 2
Figura 11. Correlação entre as concentrações de proteínas totais na urina e no plasma de gestantes com pré-eclâmpsia.
Discussão
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56
6. DISCUSSÃO
A pré-eclâmpsia é uma complicação que pode ocorrer na segunda metade da 1
gestação, durante o parto ou logo após ele, caracterizada por hipertensão, quantidades 2
anormais de proteínas na urina, e outros distúrbios sistêmicos. É uma condição 3
potencialmente letal para a mãe, o feto ou ambos, inclusive nos países desenvolvidos, 4
apesar de ser mais raro (REDMAN e SARGENT, 2005). A pré-eclâmpsia não pode ser 5
prevenida, tendo como fatores de risco: gestação prévia complicada por pré-eclâmpsia, 6
história familiar de pré-eclâmpsia, primiparidade, obesidade, gestações múltiplas e doenças 7
crônicas, tais como hipertensão e diabetes (DUCKITT e HARRINGTON, 2005). 8
Entre as pacientes participantes do nosso estudo, verificamos uma diferença 9
significativa na idade materna entre os grupos com pré-eclâmpsia e sem a doença, sendo as 10
gestantes saudáveis as que se mantiveram em uma média de idade mais alta (27,4 ± 4,9 11
anos versus 21,1 ± 5,8 anos). Estudos já demonstraram que mulheres nos extremos de 12
idade são mais susceptíveis à pré-eclâmpsia (LYELL, LAMBERT-MESSERLIAN e 13
GIUDICE, 2003). Sibai, em 1990, relatou que mulheres abaixo de 21 anos ou acima de 35 14
apresentam um maior risco para a doença. Apesar da média de idade do grupo de pacientes 15
com pré-eclâmpsia do nosso estudo ter sido de 21,1 anos, 71,4% destas gestantes 16
apresentavam menos de 21 anos no momento do estudo, enquanto que no grupo controle 17
todas as pacientes tinham idade superior a esta. 18
Em nossos resultados, a frequência de primigestas foi maior no grupo de pré-19
eclâmpsia (64,3% versus 27,3%) e diversos estudos já relataram uma associação entre 20
primiparidade e susceptibilidade à pré-eclâmpsia (LYELL, LAMBERT-MESSERLIAN e 21
GIUDICE, 2003; REDMAN e SARGENT, 2005; IRMINGER-FINGER, JASTROW e 22
Discussão
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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IRION, 2008). De acordo com Chesley (1984), aproximadamente três quartos das 1
mulheres com pré-eclâmpsia estão em sua primeira gestação. 2
A média de idade gestacional entre os grupos diferiu-se de forma significativa, 3
sendo que no grupo com pré-eclâmpsia esta média (31,0 ± 2,1 semanas) apresentou-se 4
mais baixa que no grupo controle (34,0 ± 2,3 semanas). A idade gestacional das pacientes 5
com pré-eclâmpsia não reflete o tempo de doença, pois o diagnóstico pode ser realizado 6
durante uma consulta de rotina pré-natal ou quando a paciente procura o serviço de saúde 7
devido a algum sintoma, sendo então compreensível, a média de idade gestacional mais 8
baixa no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia. 9
Os dados a respeito da pressão arterial e proteinúria de 24 horas das pacientes nos 10
mostram diferenças estatísticas altamente significantes entre os grupos, com médias mais 11
elevadas destes parâmetros entre as gestantes com pré-eclâmpsia, o que evidencia que o 12
quadro clínico das pacientes estava bem caracterizado. 13
As eletroforeses das amostras de urina de 24 horas de todas as pacientes incluídas 14
no estudo foram analisadas visualmente e verificou-se nítidas diferenças nos padrões 15
protéicos urinários entre os grupos de gestantes. Além disso, verificamos diferenças 16
relevantes entre os padrões protéicos presentes nas amostras de urina de pacientes pré-17
eclâmpticas e na amostra de urina de um paciente com proteinúria do tipo glomerular 18
(dado não mostrado). Verificamos também que algumas bandas apresentaram constância 19
entre as amostras dos grupos de pacientes. 20
Analisando as eletroforeses das amostras de urina de 24 horas, verificamos que 21
diversas bandas são comuns entre as gestantes com pré-eclâmpsia e as gestantes controles, 22
mas diferem do ponto de vista quantitativo, sendo que no grupo de pré-eclâmpticas estas 23
bandas são mais abundantes. Este resultado poderia complementar a conclusão obtida por 24
Discussão
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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Redman e Sargent (2003) de que a pré-eclâmpsia seria apenas a exacerbação de alterações 1
que ocorrem em gestações normais, com sobreposição de diversas características. 2
Entretanto, algumas bandas, como as de massas moleculares de cerca de 40 kDa e de 30 3
kDa, foram frequentes entre as gestantes com pré-eclâmpsia, e não foram observadas em 4
nenhuma amostra controle. Da mesma forma que algumas bandas apresentaram frequência 5
mais elevada entre as gestantes controles do que entre as pré-eclâmpticas, instigando à 6
busca de marcadores urinários para a doença. 7
Raidt et al. (1984), em um estudo baseado em SDS-PAGE de amostras urinárias, 8
biópsia renal e seguimento clínico de pacientes com hipertensão gestacional e gestantes 9
controles, relatou que o perfil apresentado por diversas pacientes com hipertensão 10
gestacional era característico de proteinúria glomerular. A pré-eclâmpsia tem sido 11
considerada como uma das principais causas de doença glomerular no mundo todo (revisto 12
por HLADUNEWICH, 2005), e de acordo com Kasiske e Keane (2000), a albumina 13
constitui de 60 a 90% da proteinúria total quando há dano glomerular. Entretanto no nosso 14
estudo não verificamos, através dos perfis eletroforéticos das amostras de 24 horas das 15
gestantes, características que nos levassem a supor uma causa puramente glomerular para a 16
proteinúria de todas as gestantes com pré-eclâmpsia. Justificado pelas nítidas divergências 17
entre a maioria dos perfis protéicos das amostras de gestantes pré-eclâmpticas e o perfil 18
característico de proteinúria glomerular (dado não mostrado) e, também, pela baixa 19
frequência de perfis demonstrando uma proteinúria tipicamente glomerular. Em nossos 20
resultados, apesar de termos encontrado em 8 das 10 pacientes com pré-eclâmpsia uma 21
banda protéica com massa molecular similar à massa da albumina, em apenas 2 delas esta 22
banda era a mais intensa e abundante do perfil, havendo, nos outros casos, prevalência de 23
outros tipos de proteínas. Sendo assim, nossos resultados concordam com a sugestão feita 24
Discussão
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por Shinagawa e Saitoh, em 1983, de que o termo “proteinúria” seja mais adequado que 1
“albuminúria” para descrever esta condição da pré-eclâmpsia. 2
Em outros estudos, em que se realizou dosagem de albumina urinária por métodos 3
como ELISA, aglutinação do látex, imunoturbidimetria e radioimunoensaio, relatou-se um 4
aumento na concentração urinária de albumina entre as pacientes com pré-eclâmpsia, 5
quando comparadas a gestantes sem intercorrências (LI, CHU e ZHOU, 1995; HAYASHI 6
et al., 2002; POON et al., 2008; BROWN et al., 1994). Mostrou-se, inclusive, aumento de 7
excreção de albumina na pré-eclâmpsia grave mesmo na ausência de aumento da excreção 8
de proteínas totais (BROWN et al., 1994). 9
A SDS-PAGE tem se mostrado uma técnica bastante útil para a diferenciação entre 10
a proteinúria glomerular e tubular em gestantes hipertensas (BOESKEN, KOPF e 11
SCHOLLMEYER, 1973; PESCE, BOREISHA e POLLAK, 1972), entretanto, poucos 12
estudos reportam os padrões protéicos urinários fisiológicos em gestações normais 13
(NESSELHUT et al., 1989; KUROKAWA et al., 1985). Nesselhut et al. (1989) 14
descreveram o perfil das gestantes controles com presença de albumina, de proteínas de 15
massas moleculares diversas entre 20 e 200 kDa e de uma banda de 105 kDa de forte 16
intensidade, muito semelhante aos perfis de indivíduos de ambos os sexos e não-gestantes. 17
Entre os perfis das gestantes controles do nosso estudo, verificamos a presença de bandas 18
protéicas que se distribuíram por toda a extensão do gel, identificadas com massas 19
moleculares de 19 a 95 kDa e em 33,3% destas amostras, observamos a presença de bandas 20
com massas moleculares similares à albumina. 21
Yamamoto et al. (1992) relataram que em urinas de pacientes com pré-eclâmpsia 22
grave foi observado a presença de um perfil protéico misto, com bandas protéicas de 23
massas moleculares variadas, o que concorda com nossos resultados, já que encontramos 24
perfis diversos e bandas com massas moleculares que variaram de 19 a 90 kDa. Através de 25
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imunoblot, Yamamoto et al. (1992) identificaram a presença de grandes quantidade de 1
imunoglobulina G (IgG) (150 kDa), imunoglobulina M (IgM) (970 kDa), fibronectina (440 2
kDa) e β2-microglobulina (11,8 kDa) nas amostras de urina das gestantes pré-eclâmpticas. 3
Outras proteínas também já foram identificadas em amostras de urina de gestantes com 4
pré-eclâmpsia como: albumina (69 kDa), transferrina (79,5 kDa), inibidor de inter-α-5
tripsina (180 kDa), α1-antitripsina (500 kDa), imunoglobulina A (IgA) (150-350 kDa), α2-6
HS-glicoproteína (39 kDa), α1-glicoproteína ácida (44 kDa), Gc-globulina (58 kDa), α1-7
anti-quimiotripsina (52 kDa), hemopexina (70 kDa), ceruloplasmina (132 kDa), pré-8
albumina (54 kDa), haptoglobulina (65 kDa), anti-trombina III (58 kDa) e α2-9
macroglobulina (725 kDa) (SHINAGAWA e SAITOH, 1983). Comparando-se as massas 10
moleculares destas proteínas com as massas moleculares das bandas identificadas nos 11
perfis eletroforéticos das amostras de urina de 24 horas das pacientes pré-eclâmpticas do 12
nosso estudo, verificamos que entre as bandas mais frequentes entre estas amostras estão: 13
uma de cerca de 66 kDa, similar à massa molecular da albumina, uma de 56 kDa, que se 14
aproxima das massas moleculares da pré-albumina, da anti-trombina III, da α1-anti-15
quimiotripsina e da Gc-globulina e uma de 45 kDa, que se aproxima da massa molecular 16
da α1-glicoproteína ácida, todas relatadas por Shinagawa e Saitoh (1983). Entretanto, como 17
não realizamos métodos para identificação das proteínas contidas nas bandas protéicas, não 18
podemos afirmar que se tratam das mesmas proteínas. 19
A baixa frequência de visualização da banda de massa molecular similar à albumina 20
entre as amostras de 24 horas das gestantes com pré-eclâmpsia como a principal banda do 21
perfil (20%) foi um dado que nos surpreendeu, pois a disfunção glomerular é considerada 22
uma característica da doença e é a principal causa de proteinúria patológica (STONE, 23
1989). Observamos ainda que parece não haver relação entre a intensidade da proteinúria e 24
aparecimento de albuminúria, já que as pacientes com níveis mais altos de proteinúria de 25
Discussão
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24 horas não foram as mesmas que demonstraram predomínio de albumina em seu perfil 1
eletroforético. Frente a esses dados, supomos que a proteinúria da pré-eclâmpsia não possa 2
ser atribuída à excreção significativa de albumina, o que, de qualquer forma, acabaria por 3
levar a uma diminuição plasmática desta proteína no grupo de gestantes com a doença em 4
relação ao grupo controle, conforme observado em nossos resultados. 5
A grande maioria dos estudos encontrados na literatura, a respeito da excreção 6
protéica total urinária na pré-eclâmpsia ou na hipertensão induzida pela gestação, foi 7
realizada com amostras de urina de 24 horas, ao passo de que o nosso trabalho utilizou-se 8
tanto de amostras colhidas durante 24 horas quanto de amostras colhidas durante 6 horas 9
com conservante. A coleta de urina de 24 horas deve apresentar resultados mais fidedignos 10
a respeito da real proteinúria das gestantes, devido às variações circadianas na excreção de 11
proteínas, especialmente a albumina (KOOPMAN et al., 1985; DOUMA, et al., 1995). Por 12
outro lado, a amostra colhida com conservante durante um período de 6 horas apresenta a 13
vantagem de impedir o crescimento de agentes microbianos, cujos metabolismos, além da 14
presença do microorganismo por si só, poderiam interferir no perfil protéico das amostras 15
de urina. 16
Um estudo realizado na Índia (SONI et al., 2009) concluiu que a proteinúria 17
analisada em amostras de urina de 2 e 4 horas poderiam ser usadas para uma avaliação 18
inicial da pré-eclâmpsia, visto que análises estatísticas não mostraram diferenças 19
significantes nas médias de excreção protéica nem entre amostras de 2 horas versus 20
amostras de 24 horas e nem entre amostras de 4 horas versus amostras de 24 horas. Sendo 21
assim, nossas amostras também podem ser consideradas adequadas para analisar a 22
proteinúria da pré-eclâmpsia, tanto no aspecto quantitativo, quanto no aspecto qualitativo, 23
já que estudos eletroforéticos da urina de pacientes pré-eclâmpticas já foram realizados 24
inclusive em amostras randômicas (LI, CHU e ZHOU, 1995). 25
Discussão
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Nossos resultados demonstraram diferenças interessantes entre os perfis observados 1
nas amostras coletadas com e sem conservante (HCl). Observamos nos perfis das amostras 2
com HCl das gestantes, uma prevalência de bandas de baixa massa molecular e, inclusive, 3
o desaparecimento de bandas, como ocorreu com a maioria das amostras de gestantes 4
controles. Além disso, peptídeos de massa molecular muito baixa foram visualizados com 5
mais frequência nas amostras com HCl. Estas observações nos levam a supor que tenha 6
ocorrido hidrólise de proteínas nestas amostras, o que tornaria a análise do perfil protéico 7
urinário equivocada. A presença de bandas de baixas massas moleculares constantes entre 8
as amostras de gestantes com pré-eclâmpsia nos leva a propor que esteja ocorrendo 9
hidrólise enzimática nestas amostras, e formação de fragmentos comuns, o que torna 10
necessário a presença de substrato(s) e enzima(s) comuns nas amostras. Uma provável 11
enzima que poderia estar atuando neste caso seria a uropepsina, uma protease ácida da 12
classe das aspartil-proteases, já identificada em urina de gestantes com pré-eclâmpsia 13
(RESENDE et al., 2008). Estando a urina acidificada, a enzima encontraria as condições 14
ideais para sua ação, clivando seu(s) substrato(s) e liberando os fragmentos de proteínas, 15
identificados nos perfis eletroforéticos em grande quantidade. A ausência de bandas 16
protéicas em um perfil eletroforético obtido a partir de uma amostra sem conservante de 17
gestante com pré-eclâmpsia e o consequente aparecimento de bandas no perfil proveniente 18
da amostra com HCl da mesma gestante, nos sugeriu a possibilidade do(s) substrato(s) ser 19
alguma(s) proteína(s) de alta massa molecular (acima de 100 kDa) que não pôde(puderam) 20
ser(em) visualizada(s) em nossa metodologia. Entretanto, a confirmação a respeito da ação 21
desta enzima nas amostras de urina de gestantes com pré-eclâmpsia e a identificação do(s) 22
seu(s) substrato(s) só será possível com estudos utilizando inibidores enzimáticos e ensaios 23
específicos para o(s) substrato(s). 24
Discussão
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Em nossos resultados, verificamos uma significativa diferença entre os valores de 1
proteínas totais e albumina no plasma de pacientes com pré-eclâmpsia e gestantes 2
normotensas, sendo as primeiras, possuidoras de níveis mais baixos de ambos os 3
parâmetros. Verificamos que as médias de proteínas totais e albumina plasmáticas do 4
grupo controle se mantiveram dentro dos limites de valores de referência definidos para as 5
populações, enquanto que as médias do grupo de pacientes com pré-eclâmpsia 6
classificariam este grupo como hipoproteinêmicas e hipoalbuminêmicas. Nossos achados 7
concordam em parte com a literatura, pois diversos outros estudos relatam a redução dos 8
níveis plasmáticos de proteínas totais e/ou albumina em diferentes fases da gestação 9
normal ou pré-eclâmptica, enquanto só notamos esta redução entre as gestantes com pré-10
eclâmpsia. 11
Bagga e Dutt Mullick, em 1966, encontraram níveis reduzidos de proteínas e 12
albumina plasmáticas em gestantes controles e níveis ainda menores em pacientes com pré-13
eclâmpsia. Freis e Kenny (1948) encontraram aumento de volume sanguíneo circulante e 14
de quantidade absoluta de proteínas plasmáticas na gestação normal, enquanto que na pré-15
eclâmpsia não houve variação de volume plasmático e a quantidade de proteínas 16
plasmáticas foi até menor do que a encontrada em amostras de mulheres não-gestantes. 17
Blekta et al. (1970) demonstraram que tanto a quantidade absoluta quanto a concentração 18
de proteínas séricas estava significativamente reduzida em pacientes com pré-eclâmpsia e 19
que esta redução era devido a reduções tanto de globulinas quanto de albumina séricas, 20
enquanto que na gestação normal ocorria diminuição de albumina e aumento de globulinas, 21
com manutenção dos níveis de proteínas séricas. Este mesmo estudo relata a diminuição de 22
volume circulante na pré-eclâmpsia. Brod (1962) utilizou-se destes achados para explicar 23
os desenvolvimentos dos sintomas da pré-eclâmpsia. 24
Discussão
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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O organismo se protege de uma hipovolemia através da retenção de sal e 1
água. O edema pode então aparecer concomitante ao aumento da pressão 2
arterial e proteinúria. Este estado leva a respostas protetoras 3
hemodinâmicas e humorais que levam ao quadro clínico da toxemia da 4
gestação (BROD, 1962). 5
A diminuição de proteínas totais e albumina plasmáticas encontrada entre as 6
gestantes com pré-eclâmpsia do nosso estudo era esperada devido às perdas protéicas 7
urinárias a que estas pacientes estão expostas, e não poderiam ser atribuídas ao edema 8
gestacional, já que gestantes com pré-eclâmpsia apresentam diminuição do volume 9
sanguíneo circulante. Entretanto, a diminuição de albumina plasmática foi bastante 10
significativa, enquanto a visualização de bandas intensas de massas moleculares similares à 11
albumina não foi tão expressiva no nosso grupo de estudo. Este fato, aliado a ausência de 12
correlação observada entre a proteinúria de 24 horas e a proteinemia, nos leva a supor que 13
proteínas originadas da unidade feto-placentária na pré-eclâmpsia possam estar 14
contribuindo significativamente para a elevada proteinúria nesta condição. 15
MacGillivray e Tovey (1957), por meio de eletroforese de proteínas séricas em 16
papel corada por azocarmine B, relataram um decréscimo da fração albumina do início 17
para o sétimo mês de gestação normal, a partir do qual os valores não se alteraram mais. 18
As frações de α1-globulinas, α2-globulinas e β-globulinas se elevaram gradualmente 19
durante a gestação normal. Já a fração de γ-globulinas apresentou um discreto aumento 20
durante os três primeiros meses de gestação e reduziu-se à metade durante as últimas seis 21
semanas. Ainda neste estudo, verificou-se que na pré-eclâmpsia, a fração albumina 22
continua a decair durante os últimos três meses de gestação, ao invés de se estabilizar 23
como na gestação sem intercorrências, e que a fração de γ-globulinas se mostrou diminuída 24
em relação aos valores obtidos para as gestantes normotensas. Em nossos resultados, 25
observamos uma diminuição significativa da fração albumina-α1-globulinas tanto em 26
Discussão
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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relação aos percentis quanto em valores absolutos. Entretanto, não conseguimos 1
estabelecer uma relação entre as gestantes com uma diminuição mais expressiva desta 2
fração e o aparecimento da banda de massa molecular similar à albumina em seu perfil 3
eletroforético. Observamos nos valores percentuais, aumento significativo da fração de α2-4
globulinas no grupo de pré-eclâmpticas, o que, inicialmente, nos levou a supor que se a 5
proteinúria desta síndrome fosse devido a proteínas provenientes da unidade feto-6
placentária, elas chegariam aos rins através do plasma e migrariam na eletroforese de 7
proteínas plasmáticas junto à fração de α2-globulinas. Entretanto, este aumento foi apenas 8
relativo. Além disso, os valores absolutos das frações protéicas plasmáticas nos mostram 9
diminuição das frações de β e γ-globulinas no grupo de gestantes com pré-eclâmpsia, o que 10
nos leva a questionar uma ação imunológica humoral nesta doença. 11
Testes com potencial para identificar gestantes com chance de desenvolver pré-12
eclâmpsia poderiam melhorar consideravelmente o manejo das pacientes, já que 13
permitiriam um acompanhamento clínico mais acurado para as mulheres em risco. 14
Diversos estudos têm buscado marcadores bioquímicos para a pré-eclâmpsia 15
(BLUMENSTEIN et al., 2009; EL-BARADIE, MAHMOUD e MAKHLOUF, 2009; 16
BUHIMSCHI et al., 2008) e alguns se apóiam na possibilidade da intensidade da 17
proteinúria se relacionar às complicações da doença (HOFMEYR e BELFORT, 2009). 18
Estudos como o nosso podem contribuir para o conhecimento de marcadores diagnósticos 19
ou indicadores de prognóstico para a pré-eclâmpsia. 20
Observamos neste estudo a variabilidade de proteínas excretadas na urina de 21
gestantes com pré-eclâmpsia e atentamos para a constância de algumas bandas protéicas 22
visualizadas. Uma análise mais extensa e detalhada dos perfis protéicos urinários de 23
gestantes pré-eclâmpticas pode levar à identificação de proteínas com potencial para 24
Discussão
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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predizer a doença em um estágio mais precoce da gestação. Ressaltamos que, a partir dos 1
resultados deste trabalho, estas análises devem ser realizadas com amostras coletadas in 2
natura para prevenir alterações no perfil eletroforético. Enquanto que outras pesquisas 3
devem ser realizadas com amostras urinárias acidificadas para a identificação da(s) 4
enzima(s) que levam à hidrólise observada no nosso estudo e para a busca do(s) seu(s) 5
substrato(s), que também pode ser um candidato a marcador bioquímico da doença. 6
Nossos resultados nos permitem propor que a proteinúria observada na pré-7
eclâmpsia não pode ser atribuída exclusivamente à albuminúria, não devendo, portanto, ser 8
causada apenas por dano glomerular renal em todos os casos de pré-eclâmpsia. Da mesma 9
forma, a proteinúria da pré-eclâmpsia não parece ser a única responsável pelas alterações 10
protéicas plasmáticas observadas. 11
Conclusões
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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7. CONCLUSÕES
• Há nítidas diferenças, quantitativas e qualitativas, entre o perfil protéico urinário de
gestantes com pré-eclâmpsia e normotensas através de SDS-PAGE, além de
diferenças importantes entre os perfis das gestantes com pré-eclâmpsia e o padrão
de proteinúria glomerular.
• Apesar de existirem proteínas comuns entre os perfis eletroforéticos das amostras
de gestantes com pré-eclâmpsia e normotensas, observamos importantes diferenças
quantitativas, sendo as bandas das amostras provenientes de pré-eclâmpticas as
mais abundantes.
• Proteínas de 30 kDa e 40 kDa foram visualizadas com alta frequência entre as
amostras de gestantes com pré-eclâmpsia e se mostraram ausentes em todos os
perfis das gestantes controles.
• A proteinúria da pré-eclâmpsia não é decorrente exclusivamente de albuminúria,
sugerindo que a perda protéica urinária nesta síndrome não seja sempre devido a
danos puramente glomerulares.
• O grupo de gestantes com pré-eclâmpsia apresentou níveis significativamente mais
baixos de albumina e proteínas totais plasmáticas, em relação ao grupo controle.
• A diminuição relativa e absoluta de albumina plasmática detectada através de
eletroforeses em acetato de celulose nas gestantes com pré-eclâmpsia não pode ser
atribuída exclusivamente à proteinúria.
Conclusões
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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• Não houve correlação entre a excreção urinária de proteínas e a concentração de
proteínas plasmáticas na pré-eclâmpsia, o que reforça a idéia de que as proteínas
presentes nas amostras de urina das gestantes com pré-eclâmpsia possam ser, ao
menos em parte, originárias da unidade feto-placentária.
• Há expressivas diferenças entre o perfil protéico urinário observado em amostras de
24 horas sem conservante e amostras de 6 horas coletadas com HCl como
conservante.
• A acidificação do meio parece induzir hidrólise de proteínas, evidenciado pela
prevalência de bandas protéicas com baixa molecular e a grande quantidade de
peptídeos observada.
• A hidrólise protéica que ocorreu nas amostras acidificadas parece ser do tipo
enzimática, devido à formação de fragmentos com tamanhos constantes. Sendo
assim, supõe-se que haja substrato(s) e enzima(s) comuns entre as amostras de
urina de gestantes com pré-eclâmpsia.
Referências
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
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Apêndices
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APÊNDICES
APÊNDICE A. Dados demográficos das gestantes com pré-eclâmpsia e normotensas.
APÊNDICE B. Eletroforeses em géis de poliacrilamida a 10% contendo dodecil
sulfato de sódio das amostras de urina de 24 horas, sem conservante, de gestantes
normotensas e com pré-eclâmpsia.
APÊNDICE C. Eletroforeses em géis de poliacrilamida a 10% contendo dodecil
sulfato de sódio das amostras de urina de 6 horas, com HCl, de gestantes normotensas e
com pré-eclâmpsia.
APÊNDICE D. Valores de proteínas totais e albumina das amostras de plasma das
pacientes com pré-eclâmpsia e controles.
APÊNDICE E. Eletroforeses em fitas de acetato de celulose e suas leituras
densitométricas das amostras de pacientes com pré-eclâmpsia e controles.
APÊNDICE F. Níveis (relativos e absolutos) das frações protéicas plasmáticas de
gestantes com pré-eclâmpsia e gestantes controles.
Apêndices
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APÊNDICE A
Número de identificação
Idade materna (anos)
Primigesta Idade
gestacional (semanas)
PAS (mmHg)
PAD (mmHg)
Proteinúria (mg/24hs)
1 36 Não 32 150 110 840 2 28 Não 31 170 110 1258 3 25 Não 33 160 100 1040 4 19 Sim 30 160 110 6664 5 19 Não 31 150 110 12480 6 19 Sim 33 170 110 3150 7 18 Sim 29 140 100 2415 8 17 Sim 33 150 100 1535 9 19 Não 33 150 110 408 10 15 Sim 33 150 100 1672 11 17 Sim 27 140 100 4340 12 17 Sim 33 140 100 1400 13 20 Sim 29 140 100 2888 14 27 Sim 28 160 100 7040
Média 21,1 31,1 152,1 104,3 3366,4 DP 5,8 2,1 10,5 5,1 3335,6
Dados demográficos das gestantes com pré-eclâmpsia
Apêndices
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Número de identificação
Idade materna (anos)
Primigesta Idade
gestacional (semanas)
PAS (mmHg)
PAD (mmHg)
Proteinúria (mg/24hs)
15 24 Sim 34 130 80 126 16 22 Não 38 110 70 157 17 25 Sim 36 120 80 100 18 34 Não 35 110 70 136 19 24 Sim 33 120 70 125 20 32 Não 32 100 60 98 21 25 Não 36 110 80 115 22 31 Não 33 100 60 84 23 35 Não 32 110 70 131 24 29 Não 30 120 80 151 25 21 Não 36 110 70 ND
Média 27,4 34,1 112,7 71,8 122.3 DP 4,9 2,3 9,0 7,5 23,4
Dados demográficos das gestantes normotensas
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
APÊNDICE B
Eletroforeses em géis de poliacrilamida a 10% contendo dodecil sulfato de sódio, em condições não-redutoras, e coradas pelo método da prata amoniacal. As amostras aplicadas são urinas de 24 horas, sem conservante, provenientes de pacientes com pré-eclâmpsia (4, 7, 8, 12) e gestantes normotensas (18, 23, 24). Amostras de 6 horas, com HCl, das mesmas pacientes foram aplicadas a critério de comparação (4*, 7*, 8*, 12*, 18*, 23*, 24*). Os padrões de massa molecular (MM) utilizados foram: anidrase carbônica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa) e albumina bovina (66 kDa).
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% contendo dodecil sulfato de sódio, em condição não-redutora, e corada pelo método da prata amoniacal. As amostras aplicadas são urinas de 24 horas, sem conservante, provenientes de pacientes com pré-eclâmpsia (5, 6, 9, 10, 13, 14) e gestantes normotensas (15, 16, 17, 19, 20, 22). Os padrões de massa molecular (MM) utilizados foram: anidrase carbônica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa) e albumina bovina (66 kDa).
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
APÊNDICE C
Eletroforeses em géis de poliacrilamida a 10% contendo dodecil sulfato de sódio, em condições não-redutoras, e coradas pelo método da prata amoniacal. As amostras aplicadas são urinas de 6 horas, com HCl, provenientes de pacientes com pré-eclâmpsia (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7) e gestantes normotensas (15, 16, 17, 18, 19, 20). Os padrões de massa molecular (MM) utilizados foram: anidrase carbônica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa) e albumina bovina (66 kDa).
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Eletroforeses em géis de poliacrilamida a 10% contendo dodecil sulfato de sódio, em condições não-redutoras, e coradas pela prata amoniacal. As amostras aplicadas são urinas de 6 horas, com HCl, provenientes de pacientes com pré-eclâmpsia (8, 9, 10, 11, 12 13 e 14) e gestantes normotensas (21, 22, 23, 24 e 25). Os padrões de massa molecular (MM) utilizados foram: anidrase carbônica (29 kDa), ovalbumina (45 kDa) e albumina bovina (66 kDa).
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
APÊNDICE D
AMOSTRAS
PROTEÍNAS TOTAIS (g/dL)
ALBUMINA (g/dL)
1 5,1 2,4 2 5,9 2,5 3 3,9 1,9 4 5,4 2,5 5 5,3 2,5 6 4,8 3 7 6,5 3,4 8 5,2 3,3 9 4,6 2,5 10 4,4 1,7 11 5,3 3 12 6,1 3,5 13 3,1 1,1 14 5,7 3,2
Média 5,1 2,6 Desvio Padrão 0,9 0,7
AMOSTRAS PROTEÍNAS TOTAIS (g/dL)
ALBUMINA (g/dL)
15 5,9 3,3 16 6,1 3,6 17 6,7 3,8 18 6,1 4,9 19 6,1 3,3 20 6,1 3,1 21 5,5 3,4 22 6,2 3,8 23 6,9 4 24 6,4 4 25 7,9 4,3
Média 6,3 3,8 DP 0,6 0,5
Valores de proteínas totais e albumina das amostras de plasma das pacientes com pré-eclâmpsia.
Valores de proteínas totais e albumina das amostras de plasma das pacientes controles.
Apêndices
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APÊNDICE E
Eletroforeses em fitas de acetato de celulose de amostras de pacientes com pré-eclâmpsia (1, 2, 3, 4, 5 e 6)
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Eletroforeses em fitas de acetato de celulose de amostras de pacientes com pré-eclâmpsia (7, 8, 9, 10, 11 e 12)
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Eletroforeses em fitas de acetato de celulose de amostras de pacientes com pré-eclâmpsia (13 e 14) e de
gestantes controles (15, 16, 17 e 18)
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Eletroforeses em fitas de acetato de celulose de amostras de gestantes controles (19, 20, 21, 22, 23 e 24)
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Eletroforese em fita de acetato de celulose de amostra de gestante controle (25)
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
APÊNDICE F
Frações protéicas plasmáticas (%)
Amostras Albumina
e α1 α2 β γ 15 55,9 11,8 16,0 16,3 16 58,9 9,6 16,1 15,4 17 58,2 10,7 15,9 15,2 18 47,8 12,5 17,5 22,2 19 57,5 10,9 15,1 16,5 20 56,3 13,2 17,5 13,0 21 58,2 9,7 16,6 15,5 22 58,5 10,0 14,7 16,8 23 53,6 10,8 16,5 19,1 24 56,9 10,7 16,2 16,2 25 59,0 15,4 9,4 16,2
Média 56,4 11,4 15,6 16,6 DP 3,3 1,7 2,2 2,4
Frações protéicas plasmáticas (%)
Amostras Albumina
e α1 α2 β γ 1 52,5 12,4 19,9 15,2 2 53,4 12,5 14,3 19,8 3 52,5 16,5 14,6 16,4 4 57,2 10,4 17,2 15,2 5 47,6 17,3 17,6 17,5 6 54,0 14,9 16,0 15,1 7 52,8 18,3 17,6 11,3 8 54,1 13,7 15,1 17,1 9 50,1 10,9 15,7 23,3 10 46,3 15,1 18,4 20,2 11 53,7 14,0 17,2 15,1 12 58,4 10,1 14,8 16,7 13 49,2 17,8 20,3 12,7 14 59,7 8,7 14,0 17,6
Média 53,0 13,8 16,6 16,7 DP 3,8 3,1 2,0 3,1
Estimativa de percentis das frações protéicas plasmáticas das gestantes pré-eclâmpticas
Estimativa de percentis das frações protéicas plasmáticas das gestantes controles
Apêndices
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Frações protéicas plasmáticas (g/dL)
Amostras Albumina α2 β γ 15 3,29 0,70 0,94 0,96 16 3,60 0,59 0,98 0,94 17 3,90 0,72 1,06 1,02 18 2,92 0,76 1,07 1,35 19 3,50 0,66 0,92 1,01 20 3,44 0,80 1,07 0,79 21 3,20 0,53 0,91 0,85 22 3,62 0,62 0,91 1,04 23 3,70 0,74 1,14 1,32 24 3,64 0,68 1,04 1,04 25 4,66 1,22 0,74 1,28
Média 3,59 0,73 0,98 1,05 DP 0,44 0,18 0,11 0,19
Frações protéicas plasmáticas (g/dL)
Amostras Albumina
e α1 α2 β γ 1 2,67 0,63 1,01 0,77 2 3,16 0,74 0,84 1,17 3 2,05 0,64 0,57 0,64 4 3,08 0,56 0,93 0,82 5 2,57 0,93 0,95 0,94 6 2,59 0,71 0,77 0,72 7 3,43 1,19 1,14 0,73 8 2,81 0,71 0,78 0,89 9 2,30 0,50 0,72 1,07 10 2,04 0,66 0,81 0,89 11 2,84 0,74 0,91 0,80 12 3,57 0,61 0,90 1,02 13 1,53 0,55 0,63 0,39 14 3,41 0,50 0,80 1,00
Média 2,72 0,69 0,84 0,85 DP 0,59 0,69 0,15 0,20
Estimativa de concentrações das frações protéicas plasmáticas das gestantes controles.
Estimativa de concentrações das frações protéicas plasmáticas das gestantes controles
Anexos
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94
ANEXOS
ANEXO A. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro (CEP-UFTM)
ANEXO B. Termo de consentimento livre e esclarecido
ANEXO C. Metodologia utilizada nas eletroforeses em géis de poliacrilamida
contendo dodecil sulfato de sódio
ANEXO D. Metodologia utilizada nas eletroforeses em fitas de acetato de celulose
ANEXO E. Certificado de apresentação do trabalho intitulado “Urinary Protein Profile in Normotensive Pregnants and Preeclamptic Patients”, na XXXVIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq), realizada no período de 16 a 19 de maio de 2009, em Águas de Lindóia-SP.
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
ANEXO A
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
ANEXO B
Termo de consentimento livre e esclarecido
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
ANEXO C
Metodologia utilizada nas eletroforeses em géis de poliacrilamida contendo dodecil
sulfato de sódio e na coloração pelo método da prata amoniacal
1- Gel de separação (10%): Solução de acrilamida (VETEC) 30%..............................................12,0 mL Tampão Tris-HCl (Nuclear) 0,9 M pH 8,8.......................................15,6 mL H2O Milli-Q........................................................................................6,0 mL SDS (Synth) 2%..................................................................................1,8 mL TEMED (Inlab).....................................................................................24 µL Persulfato de amônio (Synth) 10%......................................................300 µL Obs: Para outras concentrações de gel, variam-se as quantidades de solução de acrilamida e de água. 2- Gel de concentração: Solução de acrilamida 30%................................................................1,75 mL Tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8...........................................................8,0 mL H2O Milli-Q........................................................................................1,45 mL SDS 10%..............................................................................................100 µL TEMED..................................................................................................20 µL Persulfato de amônio 10%....................................................................100 µL 3- Tampão da amostra: Tampão Tris-HCl 1,8 M pH 6,8.............................................................100 µL Glicerol (Synth).........................................................................................1 mL SDS 10%.................................................................................................600 µL Azul de bromofenol (Merck) (0,05% em água deionizada)....................120 µL Diluir as amostras e padrões neste tampão na proporção de: 100 µL da amostra para 50 µL do tampão. 4- Coloração pela prata amoniacal:
a. Após a corrida eletroforética, lavar os géis rapidamente em água Milli-Q; b. Colocar em recipiente contendo solução pré-fixadora 1 durante 4 h em temperatura
ambiente; c. Substituir a solução pré-fixadora 1 pela solução fixadora 2, e manter por 2 h; d. Lavar com água Milli-Q, 3 vezes durante 15 minutos; e. Colocar em solução de glutaraldeído (Nuclear) 25% diluído 1:2 em água Milli-Q,
durante 45 minutos exatamente;
Anexos
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f. Lavar com água Milli-Q, 3 vezes durante 15 minutos; g. Colocar solução de prata amoniacal, mantendo o recipiente em ambiente escuro, até
que a solução fique castanha; h. Lavar com água Milli-Q, 3 vezes durante 15 minutos; i. Revelar com solução reveladora, sob agitação; j. Substituir a solução reveladora pela inativadora, quando as bandas protéicas
estiverem na tonalidade desejada. Soluções utilizadas:
* Solução pré-fixadora 1:
Metanol (Synth).......................................500 mL Ácido acético (VETEC).............................70 mL Água Milli-Q............................................430 mL
* Solução pré-fixadora 2:
Metanol.....................................................100 mL Ácido acético............................................100 mL Água Milli-Q.............................................800 mL
* Solução de prata amoniacal: - Solução 1:
NaOH 0,5 M.................................................5 mL NH4OH (Synth) 14,8 M.............................0,7 mL Água Milli-Q.............................................375 mL
- Solução 2: Nitrato de prata (Cinética Química-CQ)........0,4 g Água Milli-Q................................................20 mL Adicionar a solução 2 lentamente à solução 1, sob agitação. Quando ocorrer precipitação, gotejar NH4OH lentamente até o desaparecimento do precipitado. Proceder desta forma até a adição de toda solução 2.
* Solução reveleadora:
Água Milli-Q.............................................100 mL Formaldeído (Reagen) 37%.......................100 �L Ácido cítrico (QEEL) 2,3 M........................25 �L
Anexos
Joyce Pereira Takatsuka – Tese de Mestrado – Julho de 2009
* Solução inativadora: Água Milli-Q............................................100 mL Ácido acético................................................1 mL
* Solução de secagem do gel:
Deixar o gel durante três horas na solução abaixo: Glicerol.........................................................3 mL
Ácido acético..............................................10 mL Metanol…………………………………...40 mL Agua Milli-Q…………………………….100 mL Colocar para secar entre duas folhas de papel celofane.
Anexos
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ANEXO D
Metodologia utilizada nas eletroforeses em fitas de acetato de celulose
1- Eletroforese: As fitas de acetato celulose (Cellogel) são mergulhadas em tampão contendo 14,1 g de Tris (Nuclear), 22,8 g de Glicina (Synth) e 1,0 g de Cloreto de Sódio (Synth) durante 10 minutos. Retira-se o excesso de tampão enxugando-se as fitas entre folhas de papel de filtro e estende-as sobre a ponte da cuba de eletroforese, atentando-se para deixar o lado permeável da fita voltado para cima. Colocar tampão (o mesmo utilizado na incubação das fitas) na cuba de eletroforese e aplicar as amostras (0,05 ml) próximo à extremidade da fita localizada no pólo negativo da cuba. Ligar a fonte em 200 V e deixar que a corrente flua por um período de 45 minutos. 2- Coloração: Ao término da corrida, colocar as fitas na solução corante (0,5 g de Ponceau S (BDH Chemicals) em 100 mL de ácido tricloroacético a 5%) durante 5 minutos. Descorar com banhos sucessivos de ácido acético a 5% até que as bandas estejam identificáveis. 3- Transparentização: Para transparentizar a fita, mergulhá-la em metanol (Impex) durante 30 segundos e imergí-la para a solução transparentizadora (85% metanol, 14% ácido acético (Reagen) e 1% glicerol (Synth)) durante 60 segundos. Colocar as fita entre placas de vidro e deixá-las secar em banho maria 80°C por alguns segundos, até que o processo de transparentização se conclua em toda a extensão da fita.
Anexos
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ANEXO E
Certificado de Apresentação de Trabalho em Congresso