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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS HÍDRICOS
CLÁUDIA CRISTINA SANT’ ANA DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO, PADRÕES METABÓLICOS
E CAPACIDADE FOTOSSINTÉTICA DE Microcystis panniformis
Komárek et al. (CYANOBACTERIA) E Ankistrodesmus gracilis
(Reisch) Korsikov (CHLOROPHYTA) EM FONTES DE
NITROGÊNIO INORGÂNICAS E ORGÂNICAS
OURO PRETO 2007
ii
CLÁUDIA CRISTINA SANT’ ANA DE ALMEIDA
AVALIAÇÃO DO CRESCIMENTO, PADRÕES METABÓLICOS
E CAPACIDADE FOTOSSINTÉTICA DE Microcystis panniformis
Komárek et al. (CYANOBACTERIA) E Ankistrodesmus gracilis
(Reisch) Korsikov (CHLOROPHYTA) EM FONTES DE
NITROGÊNIO INORGÂNICAS E ORGÂNICAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Hídricos da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Ambiental.
ORIENTADORA: Prof. Drª. ALESSANDRA GIANI Laboratório de Ficologia – ICB/UFMG
OURO PRETO 2007
A447a Almeida, Cláudia Cristina Sant’Ana de. Avaliação do crescimento, padrões metabólicos e capacidade fotossintética de Microcystis panniformis Komárek et al. (Cyanobacteria) e Ankistrodesmus gracilis (Reisch) Korsikov (Chlorophyta) em fontes de nitrogênio inorgânicas e orgânicas [manuscrito] / Cláudia Cristina Sant’Ana de Almeida. - 2007. xiii, 62f. : il., color; graf.; tabs. Orientadora: Profª. Drª. Alessandra Giani. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Pós - graduação em Recursos Hídricos. Área de concentração: Engenharia Ambiental.
1. Nitrogênio - Teses. 2. Fotossíntese - Teses. 3. Metabolismo - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 581.132
Catalogação: [email protected]
iii
iv
Dedico esta dissertação
a minha mãe, meus irmãos,
ao meu pai sempre presente e a
todos os amigos pelo amor, apoio e compreensão.
v
AGRADECIMENTOS Primeiramente, à Deus pela proteção e por ter colocado as pessoas certas na hora certa em meu caminho; À minha mãe e meus irmãos pelo amor e incentivo constante; À querida Drª. Alessandra Giani por ter me recebido em seu laboratório além de toda orientação, confiança, apoio, incentivo e amizade; Aos professores Drª. Eneida Eskinazi e Dr. Marcel Giovanni Costa França por aceitarem participar da minha banca; Ao prof. David Bird (UQAM, Canadá) pela ajuda nas análises de modelos não lineares utilizados para o estudo do desempenho fotossintético; Aos amigos do laboratório de Ficologia da UFMG pela excelente recepção: Baptista, Björn, Bruna, Camila, Cléber, Daniel, Elenice, Fernando, Gabriela, Iola e Juliana pelo apoio, ótimo convívio e amizade; Aos colegas que entraram no laboratório de Ficologia no fim da minha dissertação Felipe, Jeniffer e Rafael pela ajuda, principalmente à Jeniffer pelo auxílio no monitoramento dos meus experimentos quando eu estava em congresso; Ao Cléber pela paciência e boa vontade em ensinar muito sobre fluorimetria PAM, além de esclarecer tantas dúvidas em vários assuntos, e no auxílio para tirar as fotinhas; À Gabriela pela ajuda nas técnicas de clorofila a e proteína; à Iola na técnica de carboidrato; e ao Daniel pela ajuda no teste Elisa de microcistina; À Lelê por ensinar e ajudar nas culturas de algas, além de explicar com paciência as atividades de rotina do laboratório; Aos colegas Camila, Cléber, Daniel, Gabriela, Juliana, por momentos inesquecíveis vividos nas coletas; Ao Elídio pelas aventuras “inexplicáveis” nas viagens de coleta; À Furnas Centrais Hidroelétricas S. A. e à Fundação Gorceix (UFOP) pelo apoio financeiro; Aos funcionários de Furnas Marquinhos, Tiba e Toninho pelas coletas e passeios maravilhosos no reservatório; Ao pessoal dos laboratórios de Interações Microrganismo-Planta, e Fisiologia Vegetal pelo empréstimo de equipamentos, e à Socorro pela ajuda nas leituras de clorofila a; Às minhas amigas Denise, Grazielle e Luciana pela confiança e amizade, mesmo pela distância; e aos amigos Cláudia Beatriz, Gérson e Vívian da UFOP; A todos meus familiares pela confiança e por sempre acreditarem no meu potencial.
vi
SUMÁRIO
Lista de tabelas..............................................................................................................viii
Lista de figuras................................................................................................................ix
Resumo.............................................................................................................................x
Abstract...........................................................................................................................xii
1 – INTRODUÇÃO..........................................................................................................1 1.1 – Fitoplâncton.............................................................................................................1 1.2 – Eutrofização e formas de nitrogênio........................................................................1 1.3 – Microcistina.............................................................................................................6 2 – OBJETIVOS...............................................................................................................9 3 – METODOLOGIA.....................................................................................................10 3.1 – Culturas de microalga e cianobactéria...................................................................10 3.2 – Descrição das espécies...........................................................................................10 3.3 – Condições experimentais.......................................................................................11 3.4 – Descrição dos experimentos..................................................................................13 3.4.1 – Curvas de crescimento............................................................................13 3.4.2 – Conteúdo de carboidratos, proteínas e microcistinas..............................13
3.4.3 – Medidas de fluorescência........................................................................14 3.5 – Análises de clorofila a, carboidratos, proteínas e microcistinas.............................17 3.5.1 – Clorofila a................................................................................................17 3.5.2 – Carboidratos.............................................................................................18 3.5.3 – Proteínas...................................................................................................18 3.5.4 – Microcistinas............................................................................................19
vii
3.6 – Métodos estatísticos................................................................................................19 4 – RESULTADOS........................................................................................................21 4.1 – Curvas de crescimento...........................................................................................21 4.2 – Concentrações de clorofila a, carboidratos, proteínas e microcistinas..................26 4.3 – Medidas de fluorescência.......................................................................................29 5 – DISCUSSÃO............................................................................................................40 5.1 – Crescimento e composição bioquímica.................................................................40 5.2 – Produção de microcistinas.....................................................................................46 5.3 – Eficiência Fotossintética........................................................................................48 6 – CONCLUSÕES........................................................................................................51 7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................52 8 – ANEXO....................................................................................................................62
viii
LISTA DE TABELAS Tabela 1: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final e taxa de crescimento (dia-1) de Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de curva de crescimento...............................................25 Tabela 2: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final e taxa de crescimento (dia-1) de Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de curva de crescimento...............................................25 Tabela 3: Concentrações de clorofila a, carboidratos e proteínas (pg.célula-1) para Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia.................................................................................................................................27 Tabela 4: Concentrações de clorofila a, carboidratos e proteínas (pg.célula-1) para Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia.................................................................................................................................27 Tabela 5: Concentrações de microcistinas (fg.célula-1) para Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia............................................28 Tabela 6: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de carboidratos e proteínas..............................................................................................28 Tabela 7: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de carboidratos, proteínas e microcistinas................................................28 Tabela 8: Resultados da resposta das duas espécies quando crescendo sob diversas fontes nitrogenadas. A significância do efeito dos tratamentos foi verificada através de teste de verossimilhança (teste global) e das comparações por teste t entre os tratamentos dois a dois. Os parâmetros estão expressos como estimativas mais ou menos o erro padrão. **** indica P<0,0001, *** indica P<0,0005. As unidades são: ETR (µmol elétrons.m-2.s-1); α (µmol elétrons/µmol PAR fótons); β (µmol elétrons/µmol fótons)..............................................................................................................................38 Tabela 9: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de medida de fluorescência e concentração de clorofila a..............................................39 Tabela 10: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de medida de fluorescência e concentração de clorofila a........................39 Tabela 11: Meio WC (Guillard & Lorenzen, 1972)........................................................62
ix
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Foto da clorófita Ankistrodesmus gracilis no aumento de 1000x....................12 Figura 2: Fotos da cianobactéria Microcystis panniformis no aumento de 1000x (A) e de 200x com nanquim (B)....................................................................................................12 Figura 3: Curvas de crescimento de Ankistrodesmus gracilis com média e desvio-padrão, n=3 para todos os tratamentos. A = nitrato, B = amônio, C = arginina, D = glicina, E = uréia com níquel, F = uréia..........................................................................23 Figura 4: Curvas de crescimento de Microcystis panniformis com média e desvio-padrão, n=3 para todos os tratamentos. A = nitrato, B = amônio, C = arginina, D = glicina, E = uréia com níquel, F = uréia..........................................................................24 Figura 5: Curvas da taxa de transporte de elétrons obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Ankistrodesmus gracilis......................................32 Figura 6: Curvas da taxa de transporte de elétrons obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Microcystis panniformis......................................33 Figura 7: Curvas de rendimento quântico efetivo obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Ankistrodesmus gracilis......................................34 Figura 8: Curvas de rendimento quântico efetivo obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Microcystis panniformis......................................35 Figura 9: Rendimento quântico potencial (média e desvio-padrão) obtido em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Ankistrodesmus gracilis.........36 Figura 10: Rendimento quântico potencial (média e desvio-padrão) obtido em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Microcystis panniformis.........37
x
RESUMO
O fitoplâncton, constituído principalmente de algas e de cianobactérias, é de
extrema importância nos ecossistemas aquáticos, pois além de servir de alimento para
os animais aquáticos, produz oxigênio. As cianobactérias estão se tornando um grupo
muito importante principalmente nos sistemas eutrofizados. Muitas hipóteses têm
tentado explicar a dominância das cianobactérias, e várias enfatizam a importância de
fontes nitrogenadas para seu sucesso.
Neste estudo foi avaliado o efeito de fontes nitrogenadas inorgânicas (nitrato e
amônio) e orgânicas (arginina, glicina e uréia com e sem níquel) sobre o crescimento,
composição bioquímica e capacidade fotossintética para a clorofícea Ankistrodesmus
gracilis e para a cianobactéria Microcystis panniformis, além da concentração da
cianotoxina microcistina para a última.
O estudo foi conduzido em culturas do tipo “batch” usando o meio WC
com as diferentes fontes nitrogenadas alternadamente. As culturas foram mantidas a
uma temperatura de 20ºC e luminosidade de 75 μmol de fótons.m-2.s-1 em um ciclo de
luz-escuro de 12:12h. A curva de crescimento foi obtida por experimentos com duração
de quinze dias, e amostras para contagem foram retiradas a cada dois dias. A
composição bioquímica (carboidratos e proteínas) e as concentrações de clorofila a e de
microcistinas foram medidas ao final de experimentos de sete dias (fase de crescimento
exponencial). A avaliação da capacidade fotossintética também foi medida ao final de
sete dias.
Os resultados mostraram que ambas as espécies tiveram maiores taxas de
crescimento em amônio do que nitrato. Nas fontes orgânicas, os valores foram variáveis
entre as espécies. A densidade celular final foi maior em nitrato do que em amônio com
concentrações semelhantes e elevadas nas fontes orgânicas. A concentração de clorofila
a teve pouca variação, com dados mais elevados em glicina para as duas espécies. Em
geral, os maiores teores de carboidratos ocorreram nas fontes orgânicas para A. gracilis
e M. panniformis enquanto as maiores concentrações de proteínas foram em fontes
inorgânicas, exceto para A. gracilis em amônio. A concentração de microcistinas em M.
xi
panniformis foi superior nos tratamentos de amônio e uréia com e sem níquel. Nas duas
espécies, a capacidade fotossintética foi superior em nitrato do que amônio e em glicina
em comparação com a arginina. Em relação aos tratamentos de uréia com e sem níquel,
não foi possível perceber alguma diferença entre os dois, mas uréia em geral mostrou
valores mais baixos de taxa de crescimento, clorofila a, proteínas e desempenho
fotossintético.
Nossos resultados sugerem que as fontes de nitrogênio orgânico foram capazes
de permitir o crescimento tanto da clorófita como da cianobactéria. Para a clorófita o
nitrato permitiu uma maior produção de proteínas em relação a clorofila a e
carboidratos que todas as outras fontes. A cianobactéria, quando crescendo em fontes
inorgânicas também mostrou maior produção relativa de proteínas em relação a
clorofila a e a carboidratos quando comparada com as fontes orgânicas.
xii
ABSTRACT
The phytoplankton, constituted mainly of planktonic algae and cyanobacteria, is
extremely important in the aquatic ecosystems since, besides being a food source for
aquatic animals, it also produces oxygen. The cyanobacteria are becoming an important
group mostly in eutrophic systems. Several hypotheses tried to explain the dominance
of cyanobacteria and many emphasize the importance of the type of the nitrogen sources
for their success.
In this study we evaluated the effect of inorganic (nitrate and ammonium) and
organic (arginine, glycine and urea) nitrogen sources on the growth, biochemical
composition and photosynthetic capacity for the chlorophycean Ankistrodesmus gracilis
and the cyanobacteria Microcystis panniformis, as well as the concentration of the
cyanotoxin microcystin for the latter.
The study was run in batch cultures on a WC medium with different nitrogen
sources, one at a time. The cultures were maintained at a temperature of 20ºC and light
intensity of 75 μmol de fótons.m-2.s-1 on a light/dark cycle of 12:12h. A growth curve
was obtained through 15 days experiments and samples were taken at a two days
interval. The biochemical composition (carbohydrate and protein) and the concentration
of chlorophyll a and microcystin were measured at the end of seven days experiments
(exponential growth phase). The measurement of the photosynthetic capacity was also
measured after seven days.
The results showed that both species had higher growth rates in ammonium than
in nitrate. On the organic sources results were different between the two species. Final
cellular density was higher in nitrate than in ammonium and showed similar and high
concentration in the organic nitrogen sources. Chlorophyll concentration showed little
variation, with higher values on glycine for both species. In general higher content of
carbohydrate were found on organic sources for both A. gracilis and M. panniformis,
and higher protein concentration on inorganic sources, except for A. gracilis in
ammonium. The microcystin concentration was higher on the ammonium and urea
treatments (with or without nickel). For both species, the photosynthetic capacity was
xiii
superior in nitrate than ammonium and on glycine than arginine. About the urea
treatment with and without nickel, it was not possible to observe any difference between
them, but generally urea showed lower growth rates, chlorophyll and protein content,
and photosynthetic performance.
Our results suggest that the organic nitrogen sources were able to allow growth
of both the chlorophycean and the cyanobacteria. For the chlorophycean nitrate allowed
higher production of protein relative to chlorophyll and carbohydrate than all other
sources. The cyanobacteria when growing on inorganic sources also showed higher
protein to chlorophyll and to carbohydrate ratios when compared to the organic sources.
1
1 - Introdução
1.1 – Fitoplâncton
Em todos os corpos de água, pequenas células fotossintetizantes e minúsculos
animais ocorrem como plâncton suspenso. As algas e as cianobactérias, que juntas
constituem o fitoplâncton, são o início da cadeia alimentar para os organismos
heterotróficos que vivem nos oceanos e nos corpos de água doce. As algas são
elementos crucialmente importantes dos ecossistemas aquáticos, produzindo oxigênio e
servindo como alimento para os animais aquáticos.
As cianobactérias são um grupo muito importante em sistemas aquáticos, tanto
em corpos de água tropicais como temperados. São organismos procariotos
fotoautotróficos de grande sucesso evolutivo desde tempos antigos, e possuem então
características tanto de algas como de bactérias. As cianobactérias ocorrem nos mais
diversos tipos de ambientes, podendo ser terrestres, de água doce, salobra ou marinha,
além de habitats extremos como fontes termais, neve e deserto (Sant’Anna et al., 2006).
A grande maioria das cerca de 2.400 espécies de cianobactérias é de água doce.
1.2 – Eutrofização e formas de nitrogênio
Os ambientes aquáticos que recebem grandes quantidades de nutrientes
nitrogenados e fosfatados através de esgotos domésticos ou industriais e de fertilizantes
agrícolas tornam-se eutrofizados, o que favorece o crescimento acelerado do
fitoplâncton em geral, especialmente de cianobactérias. Além dos desequilíbrios
ecológicos, as florações de cianobactérias podem causar vários problemas como gosto e
odor desagradáveis à água até a produção de toxinas.
Esse processo tem levado à mudanças na comunidade fitoplanctônica com o
aumento da biomassa de algas e, principalmente, de cianobactérias. Algumas hipóteses
tentam explicar a dominância de cianobactérias em ambientes aquáticos como:
2
pouca luz: sugere que as cianobactérias têm vantagens competitivas em baixas
intensidades luminosas.
alto pH/baixo CO2: sugere que as cianobactérias podem competir com as algas
em águas com alto pH ou baixa concentração de CO2.
flutuabilidade: sugere que as cianobactérias possuem uma vantagem competitiva
por serem capazes de regularem a sua flutuabilidade e sua posição na coluna de
água,
temperatura da água elevada: sugere que as cianobactérias são favorecidas a
altas temperaturas da água.
herbivoria pelo zooplâncton: sugere que as cianobactérias apresentam uma
resistência à herbivoria pelo zooplâncton.
estratégia de armazenamento: sugere que as cianobactérias podem estocar
nutrientes (nitrogênio e fósforo), o que levaria a uma vantagem competitiva em
ambientes com nutrientes escassos.
elementos traços: sugere que as cianobactérias possuem maiores requerimentos
de elementos traços (como ferro) do que o fitoplâncton eucarioto.
razão do nitrogênio total/fósforo total (NT/PT): sugere que as cianobactérias são
favorecidas a baixas razões de nitrogênio total e fósforo total, pois elas seriam
melhores competidoras para o nitrogênio do que outras espécies planctônicas.
nitrogênio inorgânico: sugere que o amônio favorece o crescimento de
cianobactérias não fixadoras de nitrogênio, enquanto o nitrato favorece o
crescimento do fitoplâncton eucarioto. A escassez de nitrogênio pode favorecer o
crescimento de espécies de cianobactérias fixadoras de nitrogênio.
Mas o sucesso desses organismos não é devido à apenas uma característica e sim
a vários fatores ambientais em conjunto (Shapiro, 1990; Blomqvist et al., 1994;
Hyenstrand et al., 1998).
A razão NT/PT poderia predizer a ocorrência de florações de cianobactérias, e a
dominância de espécies fixadoras e não fixadoras de nitrogênio (Smith et al., 1995).
Outros autores sugerem que a mudança na razão NT/TP poderia influenciar na
incidência de florações tóxicas e na produção de toxinas (Kotak et al., 2000; Downing
et al., 2001), além de determinar a presença ou ausência de cianobactérias fixadoras de
nitrogênio (Berman, 2001).
3
A sucessão sazonal do fitoplâncton é uma conseqüência, dentre outros fatores,
da concentração de nutrientes disponíveis no ambiente, pelas suas amplas variações no
tempo e no espaço. A disponibilidade de diferentes formas de nitrogênio pode afetar
significantemente a abundância de diferentes espécies e a composição de comunidades
fitoplanctônicas. O crescimento do fitoplâncton pode ser limitado, saturado ou até
inibido pela disponibilidade de alguns nutrientes.
O nitrogênio é um dos elementos mais importantes para os seres vivos, pois
participa do metabolismo sendo essencial para síntese de proteínas, ácidos nucléicos e
etc. Apesar de apresentar-se em quantidades predominantes no protoplasma, este
elemento encontra-se muito escasso nas águas doces em geral, o que significa que os
organismos têm que ser adaptados para sua obtenção do meio. Por essa característica, o
nitrogênio juntamente com o fósforo, constitui um dos mais importantes fatores
limitantes à vida dos microrganismos de água doce. O nitrogênio e o fósforo são os
nutrientes que regulam o estado trófico de ambientes aquáticos e a biomassa
fitoplanctônica é positivamente correlacionada com a produção primária em cursos de
água (Dodds, 2006). Pelo fato do nitrogênio ser um fator limitante ao crescimento, o seu
incremento no meio aquático pode resultar no aumento da proliferação de
microrganismos.
Alguns estudos têm mostrado que, embora o fósforo seja importante para o
aumento da biomassa de fitoplâncton num ecossistema aquático, o aumento de
nitrogênio parece ter uma forte correlação com o aparecimento de cianobactérias,
principalmente de espécies potencialmente tóxicas (Lee et al., 2000; Giani et al., 2005;
Rolland et al., 2005). Para Rolland et al. (2005), o nitrogênio total e a luz climática
estão associados a mudanças na toxicidade de células específicas e o fósforo total não
influencia na concentração celular da hepatotoxina microcistina (Lee et al., 2000). A
concentração celular dessa toxina parece ter correlação positiva com a assimilação de
nitrato e com o conteúdo de nitrogênio celular e correlação negativa com a taxa de
fixação de carbono, assimilação de fósforo e fósforo celular (Downing et al., 2005).
O nitrogênio está presente sob as formas inorgânicas como íons de nitrato e
amônio, e formas orgânicas como componentes da uréia, aminoácidos livres e
peptídeos, sendo os mais assimilados pelos consumidores primários o nitrato e o amônio
(Syrett, 1981; Wetzel, 1983; Reynolds, 1984).
4
A assimilação de nitrato pelo fitoplâncton requer um maior gasto de energia pela
célula, pois este deve ser reduzido a nitrito e a amônio antes de ser incorporado (Syrett,
1981; Yin et al., 1998; Herrero et al., 2001). O nitrato é forma inorgânica mais oxidada
(estado de oxidação +5) e o amônio é a forma mais reduzida (estado de oxidação –3), o
que significa que são necessários oito elétrons para reduzir o nitrato a amônio (Syrett,
1981). Para o fitoplâncton, comumente ocorrem maiores taxas de crescimento quando a
fonte nitrogenada é o amônio mesmo em diferentes intensidades luminosas (Wetzel,
1983; Blomqvist et al., 1994; Présing et al., 2001; von Ruckert & Giani, 2004). As
cianobactérias parecem apresentar uma maior capacidade competitiva para o amônio,
comparado com as algas eucariontes, principalmente em condições de nitrogênio
limitante (Hyenstrand et al., 1998).
Geralmente, a presença de amônio pode inibir a assimilação de outras fontes
nitrogenadas como nitrato (Ullrich, 1987; Dortch, 1990; Armstrong, 1999; Sharada et
al., 2005) ou histidina (Hellio et al., 2004) em muitos organismos fotossintetizantes.
Nesses casos, o amônio exerce uma ação negativa sobre a ação da enzima nitrato
redutase (Syrett, 1981) e histidase (Hellio et al., 2004). De acordo com Ullrich (1987)
existem três maneiras em que o amônio pode se tornar inibitório: (1) repressão da
formação de novos transportadores de nitrato e da enzima nitrato redutase, (2) inibição
do transportador e/ou da enzima nitrato redutase pelo amônio ou por um de seus
produtos metabólicos e (3) inibição física do mecanismo de captação de nitrato pela
redução do potencial negativo de membrana e alteração do pH. O amônio também pode
inibir a assimilação de uréia (Dortch & Postel, 1989), e o ferro também pode limitar a
assimilação de nitrato e o tamanho celular (Armstrong, 1999). O cálcio está envolvido
na captação de nitrato pelas cianobactérias (Hyenstrand et al., 2000). De acordo com
Bode et al. (1997), as taxas de captação do nitrato são maiores na luz que no escuro, o
que permite que o acúmulo de nitrato intracelular ocorra próximo da superfície onde há
maiores níveis de irradiação. Em geral, o amônio é mais facilmente obtido no escuro
que o nitrato (Dortch & Postel, 1989). Captações de amônio e uréia são pouco
dependentes da luz e de nitrato são muito dependentes da luz, mas amônio e nitrato são
fotoinibidos no mesmo grau.
5
Algumas espécies fitoplanctônicas apresentam um melhor crescimento com o
nitrato como fonte nitrogenada devido à toxicidade da amônia (Wetzel, 1983)
proveniente do amônio em ambientes eutrofizados que apresentam altos valores de pH.
Seja qual for a forma de assimilação do nitrogênio, a sua utilização consiste em
quatro processos básicos: primeiro, cada forma tem que ser transportada para dentro da
célula com um possível armazenamento (exceto para o amônio), segundo, cada forma
tem que ser convertida a amônio (se necessário), terceiro, o amônio é incorporado em
aminoácidos, e quarto, ocorre o metabolismo de suas células e divisão celular
(Hyenstrand et al., 1998). Quando o nitrato é assimilado, ocorre (1) entrada de nitrato
para dentro da célula mediada por sistema de transporte ativo, (2) redução de nitrato a
amônio catalizada pela ferrodoxina dependente de nitrato redutase e nitrito redutase
(Herrero et al., 2001), e (3) incorporação de amônio ao esqueleto de carbono via
glutamina sintetase dependente de ATP (GS) e glutamato sintase dependente de
ferrodoxina (GOGAT) de acordo com Lara et al. (1981).
O uso de fontes orgânicas de nutrientes pelo fitoplâncton como, por exemplo,
uréia e aminoácidos, tem chamado interesse de vários pesquisadores (Syrett, 1987;
Chang, 1995; Peiers & Paerl, 1997; John & Flynn, 1999; Berman, 2001; Popels &
Hutchins, 2002; Persson et al., 2003; Pustizzi et al., 2004; Taylor et al., 2006), e está
sendo discutido como um dos fatores para explicar a ocorrência de florações de
cianobactérias. A uréia é muito utilizada pelo fitoplâncton como fonte de nitrogênio,
freqüentemente em preferência ao nitrato (Berg et al., 1997; Berman & Chava, 1999;
Berman, 2001; Kana et al., 2004). Existem duas enzimas capazes de metabolizar a
uréia, a urease e a adenosina trifosfato (ATP) uréia amidolase que utiliza uma molécula
de ATP. Algumas espécies do fitoplâncton requerem níquel para assimilarem a uréia,
principalmente quando a enzima utilizada é a urease (Syrett, 1981; Dyhrman &
Anderson, 2003).
Berman e Chava (1999) compararam o crescimento de três espécies de
cianobactérias (Aphanizomenon ovalisporum, Microcystis sp. e Synechococcus sp.), de
uma diatomácea (Cyclotella sp.) e de uma clorófita (Pediastrum sp.) em fontes
nitrogenadas inorgânicas, nitrato e amônio, e orgânicas como a uréia, além de
hipoxantina, guanina, ornitina, glicosamina e lisina.
6
O crescimento da Chrysophyta Aureococcus anophagefferens foi estudado
comparando-se a assimilação de nitrato e uréia (Kana et al., 2004), além de ácido
glutâmico (Pustizzi et al., 2004). Outros trabalhos compararam o desenvolvimento em
nitrato, amônio, uréia e glutamato (Taylor et al., 2006) e mais outras fontes orgânicas
como lisina e ácido glutâmico (Berg et al., 1997). A capacidade da alga A.
anophagefferens sobreviver no escuro pode permitir a ocorrência de florações de
inverno sob o gelo em regiões temperadas (Popels & Hutchins, 2002).
A uréia pode ser um substrato de nitrogênio preferido por muitas espécies do
fitoplâncton por estocar a célula com nitrogênio e carbono orgânico, que pode ser um
benefício quando outras variáveis como intensidade luminosa reduzida ou baixa
temperatura limitam o crescimento (Berg et al., 1997).
1.3 – Microcistinas
As toxinas sintetizadas pelas cianobactérias constituem um grupo quimicamente
heterogêneo com diferentes propriedades toxicológicas. De acordo com sua ação
farmacológica, as cianotoxinas podem ser caracterizadas como hepatotoxinas,
neurotoxinas e dermatotoxinas (Brasil, 2003).
As hepatotoxinas incluem as microcistinas, as nodularinas e a
cilindrospermopsina. As microcistinas são as cianotoxinas mais comumente detectadas
que promovem toxicidade em mamíferos, peixes, plantas e invertebrados (Codd et al.,
1999). Essas toxinas têm a estrutura de heptapepitídeos cíclicos constituídos de cinco
aminoácidos constantes e dois aminoácidos variáveis. Quando os aminoácidos variáveis
são leucina e arginina, a microcistina é indicada como MC-LR, e se a leucina for
substituída por outra arginina, a toxina é conhecida como MC-RR. As microcistinas
apenas são liberadas para o ambiente externo por meio do rompimento da parede celular
seja por senescência das células ou sob a ação de algicidas e são essencialmente
intracelulares.
As espécies identificadas como produtoras dessas hepatotoxinas estão incluídas
nos gêneros Microcystis (Luukkainen et al., 1994), Anabaena (Sivonen et al., 1992),
Oscillatoria (Meriluoto et al., 1989), Planktothrix (Luukkainen et al., 1993; Keil et al.,
7
2002) e Nostoc (Sivonen, 1990), além de Aphanocapsa (Domingos et al., 1999) e
Radiocystis (Vieira et al., 2003).
Os fatores que controlam a produção de microcistinas a nível celular, ainda não
são bem conhecidos (Wicks & Thiel, 1990; Kotak et al., 1995). Mas os fatores
ambientais podem afetar as concentrações de microcistinas de duas maneiras: pela
regulação da abundância de cepas produtoras de microcistinas dentro da população, e
pela regulação da produção de microcistinas pelas cepas tóxicas (Wiedner et al., 2003).
Vários estudos têm investigado a produção de microcistinas com alguns fatores como:
temperatura (Rapala et al., 1997; Rapala & Sivonen, 1998), concentração de nutrientes,
como nitrogênio (Sivonen, 1990; Orr et al., 1998; Long et al., 2001; Giani et al., 2005) e
fósforo (Oh et al., 2000) e até a razão entre fósforo e nitrogênio (Lee et al., 2000; Vezie
et al., 2002). Outros fatores também foram verificados em afetar a produção de
microcistinas como: radiação fotossinteticamente ativa (Sivonen, 1990; Utkilen &
Gjolme, 1992; Wiedner et al., 2003), ferro (Utkilen & Gjolme, 1995) e pH (Jähnichen et
al., 2001).
De acordo com alguns autores, a concentração intracelular de microcistinas foi
mais relacionada com o nitrogênio do que com o fósforo (Giani et al., 2005; Rolland et
al., 2005). Para os autores, o nitrogênio total teve forte correlação com a toxicidade
celular específica enquanto os níveis de fósforo total não tiveram importância.
As microcistinas podem causar intoxicações agudas ou crônicas, pois penetram
nos hepatócitos e interagem irreversivelmente com as enzimas celulares fosfatases
(MacKintosh et al., 1990), o que provoca e desestruturação das células do fígado e até o
surgimento de tumores hepáticos (Falconer, 1991; Sant’Anna et al., 2006). Essas
hepatotoxinas chegam aos hepatócitos por meio de receptores dos ácidos biliares
(Falconer, 1991) e promovem uma desorganização do citoesqueleto dos hepatócitos.
Como conseqüência, o fígado perde sua arquitetura e desenvolve graves lesões internas
como uma hemorragia intra-hepática (Carmichael, 1994).
Teixeira et al. (1993) descreveram uma correlação entre a ocorrência de
florações de cianobactérias no reservatório de Itaparica, na Bahia, e a possível
intoxicação de 2.000 pessoas com 88 mortes pelo consumo de água do reservatório
entre março e abril de 1988.
8
O primeiro caso confirmado de mortes humanas causadas por cianotoxinas
ocorreu em 1996, quando 130 pacientes renais crônicos desenvolveram uma grave
hepatotoxicose após sessões de hemodiálise em uma clínica de Caruaru (PE). Desses,
23 pacientes morreram nas duas primeiras semanas com sintomas neurológicos ou
deficiência hepática, e mais 37 pacientes morreram seguidas cinco semanas de efeitos
hepatotóxicos ou de complicações como sangramento gastrintestinal ou efeitos
cardiovasculares (Haider et al., 2003). As análises confirmaram a presença de
microcistinas e cilindrospermopsina no carvão ativado utilizado no sistema de
purificação da água da clínica e de microcistinas em amostras de sangue e fígado dos
pacientes intoxicados (Carmichael et al., 1996 apud Brasil, 2003; Azevedo, 1996 apud
Brasil, 2003).
Com este incidente, a Funasa em colaboração com a Organização Panamericana
da Saúde, revisaram a Portaria 36/MS/90 que definia as normas e os padrões de
potabilidade da água para consumo humano no Brasil sem qualquer citação em relação
às cianobactérias e cianotoxinas. Com a homologação da Portaria 1469 de 29/12/00 e
modificada pela Portaria 518 de 25/03/04, a Secretaria de Vigilância Sanitária passou a
exigir dos órgãos competentes o monitoramento da ocorrência de cianobactérias e de
algumas cianotoxinas no fornecimento de água, tanto na água bruta do manancial
utilizado para a captação de água, como na água tratada para consumo (Brasil, 2004).
9
2 – Objetivos
Este trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento em culturas
monoespecíficas de uma espécie de cianobactéria (Microcystis panniformis Komárek et
al.) e outra espécie de clorofícea (Ankistrodesmus gracilis (Reinsch) Korsikov) em
fontes nitrogenadas inorgânicas (nitrato e amônio) e orgânicas (uréia com e sem níquel,
arginina e glicina). No presente trabalho, foram estudadas as possíveis variações na taxa
de crescimento, composição bioquímica (teores de carboidratos e proteínas) e produção
de microcistinas em todas as fontes nitrogenadas analisadas.
Além disso, foi avaliada a capacidade fotossintética para cada nutriente nas
espécies fitoplanctônicas pela metodologia de fluorimetria PAM.
10
3 - Metodologia
3.1 – Culturas de microalga e cianobactéria
Os experimentos foram desenvolvidos com duas culturas monoespecíficas, uma
de microalga e outra de cianobactéria. As espécies escolhidas Ankistrodesmus gracilis
(Chlorophyta) e Microcystis panniformis (Cyanobacteria) fazem parte do banco de
culturas do Laboratório de Ficologia do Departamento de Botânica da UFMG e foram
isoladas da Lagoa da Pampulha e do Reservatório de Furnas (ambos em MG).
3.2 – Descrição das espécies
O gênero Ankistrodesmus agrupa espécies de células raramente solitárias,
geralmente reunidas em colônias sob a forma de tufos (menos organizados) ou de feixes
frouxos (mais organizados). Não existe mucilagem para manter as células juntas, elas se
torcem espiraladamente umas sobre as outras para formar o feixe. As células podem ser
lunadas, fusiformes, mais longas que o próprio diâmetro. Esse gênero inclui onze
espécies que já foram coletadas em quase todas as regiões do mundo, o que o
caracteriza como um dos gêneros mais comuns em coletas de plâncton (Bicudo &
Menezes, 2006).
A microalga Ankistrodesmus gracilis (Fig. 1) pertence à classe Chlorophyceae,
ordem Chloroccocales e família Oocystaceae. Forma colônias de 4 a 8 células. As
células são lunadas a fusiformis e arcuadas, afilando gradualmente em direção ao ápice,
nem sempre dispostas no mesmo plano, têm diâmetro de 2,0 a 6,0 µm. O cloroplasto é
único, parietal, laminado, levemente azulado, sem pirenóide. Em relação à disposição
colonial das células, Sant’ Anna (1984) comenta que as colônias se desfazem facilmente
antes da reprodução ou devido a condições desfavoráveis em cultura, com a presença de
células isoladas. Esse fato foi notório ao longo de todos os experimentos realizados
nesse trabalho.
11
Microcystis é um gênero colonial, tipicamente planctônico capaz de formar
florações em corpos d’água eutrofizados. As colônias podem ser microscópicas ou
macroscópicas, esféricas, irregulares ou alongadas e às vezes formadas por subcolônias.
O envelope mucilaginoso é incolor e pode ser amplo ou estreito, difluente ou firme,
homogêneo ou com protuberâncias. As células são esféricas com aerótopos e estão
arranjadas irregularmente no interior da colônia ou subcolônia. A divisão celular ocorre
por fissão binária em três planos. São conhecidas mundialmente cerca de 25 espécies de
Microcystis, todas de ambientes aquáticos (Bicudo & Menezes, 2006). Muitas espécies
são produtoras da hepatotoxina microcistina. De acordo com Sant’Anna & Azevedo
(2000) apud Bicudo & Menezes (2006), Microcystis é o gênero com mais ampla
distribuição em território brasileiro e que apresenta a maior incidência de florações em
reservatórios de abastecimento público.
A cianobactéria Microcystis panniformis (Fig. 2) pertence à classe
Cyanophyceae, ordem Chroococcales e à família Microcystaceae. Esta espécie de
cianobactéria foi primeiramente descrita por Komárek et al. (2002) apud Sant’Anna et
al. (2004) e antes dessa descrição, M. panniformis foi provavelmente identificada como
M. aeruginosa. A característica principal dessa espécie é a distribuição densa de células
por todo o envelope mucilaginoso, além de apresentar colônias micro ou macroscópicas
irregulares e células esféricas com 3,0 a 4,0 µm de diâmetro (Sant’Anna et al., 2004).
3.3 – Condições experimentais
O crescimento das culturas do tipo batch foi realizado em meio WC (Guillard &
Lorenzen, 1972). O meio continha apenas uma das fontes nitrogenadas na mesma
concentração de 14 mgN/L (Anexo 1). A única exceção foi em relação ao amônio, pois
com o possível risco de toxicidade deste composto nitrogenado (von Ruckert & Giani,
2004), a sua concentração foi reduzida em 50%. Esta redução não afetou o resultado dos
experimentos, pois testes preliminares realizados no laboratório comprovaram que ainda
há muito amônio disponível no meio após o encerramento dos experimentos (von
Ruckert & Giani, 2004). As formas nitrogenadas utilizadas foram: amônio (NH4Cl),
nitrato (NaNO3), uréia (NH2CONH2), uréia com níquel (sob a forma de NiSO4),
12
arginina (C6H14N4O2) ou glicina (C2H5NO2). O pH do meio de cultura sempre foi
ajustado em 7,2 + 0,02. As culturas foram mantidas a uma temperatura de 20ºC e
luminosidade de 75 μmol de fótons.m-2.s-1 em um ciclo de luz-escuro de 12:12h.
Figura 1: Foto da clorófita Ankistrodesmus gracilis no aumento de 1000x.
10 μm
A B
100 μm20 μm
Figura 2: Fotos da cianobactéria Microcystis panniformis no aumento de 1000x (A) e de 200x com nanquim (B).
Os erlenmeyers foram agitados manualmente todos os dias e trocados de lugar
fazendo um rodízio na câmara de germinação de modo que todos os frascos das culturas
recebessem a mesma quantidade de luz durante os experimentos.
Para a preparação dos meios de cultura utilizados nos experimentos, foi utilizada
água deionizada e reagentes P.A. de boa qualidade. Todos os recipientes e os meios de
cultura foram esterilizados em autoclave.
13
3.4 – Descrição dos experimentos
3.4.1 – Curvas de crescimento
As condições experimentais foram mantidas e controladas em estufa incubadora
da marca Technal. O inóculo inicial foi de aproximadamente 10 mL para A. gracilis e
de 25 mL para M. panniformis, sendo que a concentração de células variou entre as
espécies e para cada tratamento (ver tabelas 1 e 2 nos resultados). Os experimentos
foram realizados em triplicata, em erlenmeyers de 250 mL contendo 120 mL de meio,
em todos os tratamentos. Os experimentos para estimar as curvas de crescimento
tiveram duração de quinze dias.
Amostras, de aproximadamente, 2 mL foram coletadas a cada dois dias, sempre
no mesmo horário, e fixadas com lugol acético, para contagem posterior das células. As
contagens das células foram feitas em microscópio Leica DMLS em hemocitômetro tipo
Fuchs-Rosenthal, com um mínimo de 400 células contadas por amostra (10% de
precisão dentro de um limite de confiança de 95%). As amostras de M. panniformis
foram previamente expostas ao ultra-som em disruptor de células ultrasônico marca
Microson, por 30 segundos para quebrar as colônias e melhorar a precisão na
quantificação das células.
As taxas de crescimento para cada amostra foram calculadas pela regressão
linear da fase exponencial (programa Excel, Microsoft Office 2003) das curvas de
crescimento, referentes ao período de crescimento exponencial. O µ foi obtido sendo
igual ao coeficiente de inclinação da equação da reta (a) onde x é o tempo do
experimento em dias e y é o ln da concentração celular, de acordo com a equação: y =
ax + b.
3.4.2 – Conteúdo de carboidratos, proteínas e microcistinas
Para a mensuração das concentrações de carboidratos, proteínas e microcistinas,
os experimentos com duração de sete dias foram montados em triplicata em
14
erlenmeyers de 500 mL contendo 200 mL de meio. O inóculo inicial foi variável entre
as espécies e similar entre os tratamentos, sendo que a concentração celular variou entre
os tratamentos (ver tabelas 6 e 7 nos resultados).
As condições experimentais foram controladas e mantidas como descrito no item
3.4.1. As amostras para contagem foram obtidas no início e no fim de cada
experimento, fixadas com lugol acético e contadas em hemocitômetro de Fuchs-
Rosenthal como descrito acima. O procedimento de contagem foi como descrito no
tópico 3.4.1.
Para estimar as concentrações de carboidratos, proteínas e microcistinas, as
amostras das espécies em estudo foram filtradas em filtros de fibra de vidro (S&S GF
50-A com diâmetro de 25 mm, poros de 1,2 μm), pré-incinerados a 400°C, por duas
horas (metodologia descrita em APHA, 1976). Após a filtração, os filtros foram
mantidos congelados (-20ºC) para análises posteriores.
3.4.3 – Medidas de fluorescência
Fluorimetria PAM (pequena revisão)
O excesso de energia luminosa incidente no aparato fotossintético que não é
utilizado fotoquimicamente deve ser dissipado para que as condições fisiológicas da
célula não sejam afetadas. As mudanças na conversão de energia fotoquímica podem ser
monitoradas através de medidas de emissão de fluorescência e perda de calor
(Schreiber, 2003). A emissão de fluorescência é principalmente devida às moléculas de
clorofila a do fotossistema II (PSII), o que permite avaliar a capacidade fotossintética e
as condições fisiológicas do vegetal (Schreiber, 2003), em conseqüência do efeito dos
diferentes fatores ambientais sobre a fotossíntese (Bolhàr-Nordenkampf, 1989). Essa
emissão representa apenas 1 a 5% da energia de luz absorvida (Berges et al., 1996;
Maxwell & Johnson, 2000).
A fluorimetria PAM (“Pulse Amplitude Modulation”) é uma técnica
fluorimétrica muito utilizada atualmente. Com esse método, avaliam-se as condições do
metabolismo fotossintético como rendimento quântico potencial (ΦM ou Fv/Fm), o
15
rendimento quântico efetivo (Φ’M ou ΔF/F’m) e a taxa de transporte de elétrons (ETR)
entre o PSII e o PSI (Schreiber, 1986). As análises de fluorescência são baseadas no fato
que todos os centros de reação do PSII podem ser fechados por pulsos de saturação da
luz, que rapidamente eliminam as reações fotoquímicas (Schreiber et al., 1995).
O aumento da fluorescência é uma conseqüência da redução do primeiro aceptor
de elétrons entre o PSII e PSI, a quinona A (QA). O flash de luz a alta intensidade e de
curta duração fecha os centros de reação do PSII, e durante esse flash, a fluorescência é
equivalente ao que poderia ser obtido na ausência de fotoquímica (fluorescência
máxima). Comparando esse valor com a fluorescência na ausência de luz actínica
(fluorescência mínima), tem-se a eficiência da fotoquímica e do desempenho do PSII
(Maxwell & Johnson, 2000).
O rendimento quântico efetivo mede a proporção de luz absorvida pela clorofila
a associada ao PSII que é utilizada nas reações fotossintéticas (Maxwell & Johnson,
2000), ou seja, é a capacidade do vegetal em converter a energia luminosa em energia
química. De acordo com Juneau et al. (2002), através de medidas do rendimento
quântico efetivo do PSII, pode se avaliar as respostas do fitoplâncton em diferentes
condições ambientais.
O rendimento quântico potencial é uma medida intrínseca (ou máxima) da
eficiência do PSII, se todos os centros de reação estão abertos, e o fluxo de elétrons pelo
PSII é indicativo da taxa total de fotossíntese (Maxwell & Johnson, 2000).
No trabalho realizado por Parkhill et al. (2001), a fluorimetria PAM foi utilizada
para avaliar o estresse nutricional sobre o rendimento quântico potencial da diatomácea
Thalassiosira pseudonana.
A fluorimetria PAM foi utilizada por Figueredo (2007) para avaliar a variação
nos parâmetros de fluorescência das espécies fitoplanctônicas Microcystis wesenbergii,
Monoraphidium contortum e Coelastrum sphaericum submetidas ao efeito de
substâncias alelopáticas produzidas por Cylindrospermopsis raciborskii.
Capacidade fotossintética e conteúdo de clorofila a
Os experimentos com duração de sete dias foram mantidos e controlados em
estufa incubadora da marca Technal.O inóculo inicial foi de aproximadamente 10 mL
16
para A. gracilis e de 25 mL para M. panniformis, em triplicata, em erlenmeyers de
capacidade de 250 mL contendo 120 mL de meio em todos os tratamentos. Os volumes
utilizados correspondem às concentrações celulares como apresentado nas tabelas 9 e 10
nos resultados.
Foram coletadas amostras, de aproximadamente, 2 mL a cada dois dias, no
mesmo horário, e fixadas com lugol acético, para que as células fossem contadas
posteriormente. O procedimento de contagem foi igual ao descrito no tópico 3.4.1.
Para avaliar a eficiência fotossintética foi utilizado um equipamento de
fluorimetria PAM, normalmente usado em plantas terrestres (Mini-PAM – Waltz,
Alemanha). Para uso em fitoplâncton, o procedimento de análise foi adaptado, sendo
que as culturas foram concentradas em filtros de fibra de vidro (S&S GF 50-A com
diâmetro de 47 mm, poros de 1,2 μm) por filtração. O volume filtrado foi adequado de
acordo com a concentração celular da cultura, sendo o suficiente para produzir uma
coloração esverdeada no filtro, mas o número de células foi sempre registrado no fim de
cada experimento, para eventuais correções. Após a filtração, os filtros foram mantidos
umedecidos, para evitar um estresse osmótico e dessecação das células. O filtro foi
cortado ao meio e as duas partes foram envolvidas em uma fina camada de filme de
PVC. Uma das metades foi utilizada para realizar as medidas de rendimento quântico
efetivo (Φ’M) e taxa relativa de transporte de elétrons (ETR), sob condição de luz
ambiente (Maxwell & Johnson, 2000). A um nível basal de fluorescência (F’) registrado
pelo fluorímetro, um pulso de saturação (PS) muito intenso é aplicado na amostra o que
provoca o fechamento completo do PSII. A partir desse momento, a energia capturada
pelo PSII não é mais usada nas reações fotoquímicas sendo emitida como fluorescência
máxima (F’m). Com os valores de F’ e F’m, calcula-se o rendimento quântico efetivo
(Φ’M) do PSII pela equação:
Φ’M = (ΔF/F’m) = (F’m – F’)/F’m
As taxas de transporte de elétrons (ETR) entre o PSII e o PSI foram calculadas
multiplicando-se cada Φ’M obtido pela intensidade da radiação fotossinteticamente ativa
(PAS) correspondente (Wilhelm et al., 2004):
ETR = Φ’M · PAR · 0,5
17
Deve-se multiplicar pelo fator 0,5 porque cerca de 50% da energia luminosa
absorvida são distribuídos para o PSII e os outros 50% para o PSI (Schreiber et al.,
1995, Maxwell & Johnson, 2000).
As condições do metabolismo fotossintético foram avaliadas sob valores
crescentes de luz actínica (9 intensidades de PAR entre 0 e 1.400 μmol de fótons.m-2.s-
1). Após o registro do nível basal de fluorescência (F’), por meio de uma exposição de
cada valor de PAR por 30 segundos, um pulso de saturação de 6.000 μmol de fótons.m-
2.s-1 foi aplicado durante 0,8 s para se determinar a fluorescência máxima (F’m). O Φ’M
e a ETR foram calculados sob os 9 níveis de luz.
A outra metade do filtro foi mantida no escuro por 20 minutos, para a medida de
rendimento quântico potencial (ΦM). Essa medida foi realizada quando todos os centros
de reação do PSII encontravam-se abertos. Nesse momento foi medida uma
fluorescência basal mínima (F0), emitida principalmente pelos pigmentos antena
(Krause & Weis, 1991) e após esse registro, um pulso de luz muito intenso foi emitido
saturando todos os centros de reação e inibindo a dissipação pela via fotoquímica
(Shreiber, 1986). Um valor máximo da fluorescência (Fm) foi registrado em
conseqüência da dissipação da excitação excessiva das moléculas de clorofila a na
forma de fluorescência e de calor. O rendimento quântico potencial foi calculado como:
ΦM = (Fv/Fm) = (Fm – F0)/Fm
No fim dos experimentos, sub-amostras das culturas foram filtradas em filtros de
fibra de vidro (S&S GF 50-A com diâmetro de 47 mm, poros de 1,2 μm) para posterior
análise de clorofila a.
3.5 – Análises de clorofila a, carboidratos, proteínas e microcistinas
3.5.1 – Clorofila a
Para a análise de clorofila a, um volume conhecido variável foi filtrado em
duplicata em filtros de fibra de vidro (GF 50/A com diâmetro de 47 mm), que foram
18
mantidos congelados (-20oC) e no escuro. A extração da clorofila a foi realizada em
local de baixa luminosidade com etanol 90% a 80°C durante 5 minutos. Após isso, as
amostras foram envoltas em papel alumínio e guardadas na geladeira por 24 horas para
completar o processo de extração. Após esse período, as amostras foram centrifugadas
por 10 minutos a 3.500 rpm em centrifugador Excelsa 2 marca Fanem. A concentração
de clorofila a foi determinada por espectrofotometria com leituras a 665 nm para
clorofila a e a 750 nm para correção da turbidez, em espectrofotômetro Thermo
Spectronic Genesys 10 uv.
3.5.2 – Carboidratos
O conteúdo de carboidratos solúveis foi determinado pelo método
espectrofotométrico do fenol-ácido sulfúrico (Herbert et al., 1971), tendo a glicose-
anidra como padrão. As amostras foram maceradas em água destilada deionizada, onde
foi adicionado reagente fenol e ácido sulfúrico PA (H2SO4). Após alguns minutos, as
amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 2.000 rpm. O sobrenadante foi removido
para a leitura a 490 nm em espectrofotômetro UV – Visible Recording
Spectrophotometer UV – 160A marca Shimadzu. Os padrões e os brancos receberam o
mesmo tratamento das amostras. Esse método tem como princípio a deidratação de
compostos derivados de açúcares pelo H2SO4, e o composto resultante forma com o
fenol um complexo de coloração marrom lido a 490 nm.
3.5.3 – Proteínas
A análise do teor protéico seguiu o método espectrofotométrico do micro-biureto
(Itzhaki & Gill, 1964) tendo como padrão a albumina bovina. Esse método é baseado na
medida da absorção ultravioleta de complexos formados entre as proteínas e o cobre,
em soluções fortemente alcalinas de sulfato de cobre. As amostras foram maceradas em
hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 N e expostas ao ultra-som em disruptor de células
ultrasônico marca Microson, em três intervalos de 30 segundos com pausa de 30
19
segundos. Em seguida, as amostras foram extraídas a, aproximadamente, 100ºC por 10
minutos e centrifugadas a 2.000 rpm, em centrifugador Excelsa 2 marca Fanem, por 15
minutos. Essa etapa foi repetida duas vezes, e após a centrifugação, alíquotas em
replicata foram removidas para tubos de ensaio, onde foram realizadas as seguintes
reações:
A – extrato + NaOH 30 %
B – extrato + reagente Biureto
Os padrões e os brancos receberam o mesmo tratamento das amostras. A leitura
foi feita a 310 nm em espectrofotômetro UV – Visible Recording Spectrophotometer
UV – 160A marca Shimadzu. A concentração final foi obtida pela diferença (B – A).
3.5.4 – Microcistinas
A extração de microcistinas foi realizada em metanol 75%. Os filtros foram
expostos ao ultra-som em disruptor de células ultrasônico durante um minuto e
centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm em centrífuga Thermo-Jouan BR4i. O
sobrenadante foi removido para análise posterior. Adicionou-se metanol 75% no
precipitado e o processo de extração foi executado novamente.
A análise de microcistinas foi realizada pelo método Elisa, através de um kit da
marca Beacon. O método se baseia em reações sucessivas entre enzimas, anticorpos e
microcistinas. A reação final ocorre através da adição de um substrato que desenvolve
uma cor inversamente proporcional à quantidade de microcistina presente na amostra.
As leituras finais para os cálculos da concentração de microcistinas nas amostras foram
realizadas em leitor Elisa marca Bio – Tech ELx 800, a 450 nm de comprimento de
onda.
3.6 – Métodos Estatísticos
As análises estatísticas dos valores de taxa intrínseca de crescimento, clorofila a,
carboidratos, proteínas, microcistinas e rendimento quântico potencial foram feitas pelo
20
teste de Shapiro-Wilk para testar a normalidade dos dados quando P≥0,05, e pelo teste
de Brown-Forsythe para testar a não homogeneidade de variâncias. A análise de
variância (ANOVA - one way) foi utilizada para testar as diferenças entre os
tratamentos em cada experimento, e quando as diferenças significativas foram
detectadas, foi aplicado o teste de Tukey para se especificar as diferenças entre os
tratamentos. As diferenças foram consideradas significativas quando P≤0,05.
As análises estatísticas das curvas obtidas foram realizadas apenas para os dados
de ETR, uma vez que seus valores são fortemente dependentes dos valores de Φ’M. O
efeito da fonte nitrogenada sobre a taxa de transporte de elétrons entre o PSII e o PSI foi
analisado por meio de modelos não lineares de efeitos mistos (nonlinear mixed effects
modelling) que permitem comparar diferentes partes (α, ETR máximo e β) das curvas
obtidas (para detalhes, ver Figueredo, 2007). O pacote 'nlme' (Pinheiro & Bates, 2000),
implementado no programa estatístico R 2.1.1 para Windows foi usado nos cálculos dos
efeitos não lineares mistos, e a função 'nls' do R foi usada na modelagem não-linear
desconsiderando grupos (Venables & Ripley, 2002). Existiam três possíveis diferenças
entre os tratamentos: nos coeficientes α, ETR máx ou β. Se a fotoinibição não fosse
evidente pela inspeção visual, então β não era estimado. Os valores dos coeficientes são
expressos nos resultados como a média estatística, seguida pelo valor do erro-padrão
após um sinal indicando adição ou subtração (±). O efeito do tratamento é descrito
como a diferença de valores do coeficiente entre o controle e os tratamentos, mais ou
menos o erro-padrão da diferença.
21
4 – Resultados 4.1 – Curvas de Crescimento
As curvas de crescimento, com as respectivas taxas intrínsecas de crescimento,
para cada tratamento de nitrogênio inorgânico e orgânico estão representadas nas
figuras 3 e 4.
Dentre as fontes de nitrogênio inorgânico, tanto a microalga como a
cianobactéria apresentaram uma maior taxa intrínseca de crescimento para o amônio do
que para o nitrato (Fig. 3 e 4, Tabela 1 e 2). A taxa de crescimento para a clorófita
Ankistrodesmus gracilis em amônio foi de 0,264 dia-1 (Fig. 3B, Tabela 1) e de 0,221 dia-
1 para nitrato (Fig. 3A, Tabela 1). A cianobactéria Microcystis panniformis também
apresentou uma maior taxa de crescimento em amônio de 0,286 dia-1 (Fig. 4B, Tabela 2)
em comparação com o nitrato de 0,239 dia-1 (Fig. 4A, Tabela 2).
Comparando-se as fontes de nitrogênio orgânico, percebe-se uma similaridade
entre as taxas de crescimento entre os aminoácidos arginina e glicina e também entre os
tratamentos de uréia com níquel e uréia para A. gracilis (Fig. 3, Tabela 1). As taxas de
crescimento foram, entretanto, superiores nos tratamentos com aminoácidos, igual a
0,285 dia-1 em glicina (Fig. 3D, Tabela 1) e 0,276 dia-1 em arginina (Fig. 3C, Tabela 1).
A taxa de crescimento em uréia com níquel e uréia foi de 0,185 dia-1 (Fig. 3E, Tabela 1)
e de 0,181 dia-1 (Fig. 3F, Tabela 1), respectivamente (ANOVA, DF = 5, Estatística F =
216,16, P<0,0001).
Para M. panniformis essa tendência não foi observada (Fig. 4, Tabela 2). A
cianobactéria apresentou uma taxa de crescimento de 0,240 dia-1 em arginina (Fig. 4C,
Tabela 2), de 0,205 dia-1 em uréia (Fig. 4F, Tabela 2), de 0,193 dia-1 em uréia com
níquel (Fig. 4E, Tabela 2) e de 0,185 dia-1 em glicina (Fig. 4D, Tabela 2), (ANOVA, DF
= 5, Estatística F = 25,64, P<0,0006).
Os dados de densidade celular inicial e final estão apresentados na tabela 1 para
A. gracilis e na tabela 2 para M. panniformis.
Comparando-se as fontes de nitrogênio inorgânico, tem-se uma maior densidade
celular final para nitrato do que para amônio tanto para A. gracilis (Tabela 1) como para
22
M. panniformis (Tabela 2). O aumento da concentração celular da clorofícea foi de 21
vezes em nitrato e de 16 vezes em amônio e da cianobactéria foi de 27 vezes em nitrato
e de 7 vezes em amônio.
Em relação às fontes de nitrogênio orgânico, observa-se pouca diferença entre os
aminoácidos e a uréia para A. gracilis (Tabela 1). As maiores densidades celulares finais
foram em glicina e uréia, seguidas por uréia com níquel e arginina. Porém, o inóculo
inicial nos tratamentos de uréia, com e sem níquel, foi superior aos tratamentos com
aminoácidos. Apesar disso, a concentração celular foi aumentada em 16 vezes em uréia
com níquel e 18 vezes em uréia, enquanto o aumento em arginina e glicina foi de 21
vezes.
Para M. panniformis, houve uma similaridade dos valores de densidade celular
final entre os aminoácidos arginina e glicina e também entre os valores de uréia, sendo
que as densidades em uréia com níquel e uréia foram superiores às densidades em
arginina e glicina (Tabela 2). O inóculo inicial em uréia com níquel foi mais elevado
que os demais, e a concentração celular aumentou em 16 vezes. Em uréia sem níquel,
houve um aumento de 23 vezes, que foi o maior aumento dentre as fontes orgânicas.
Com relação aos os aminoácidos, o aumento foi de 17 vezes em arginina e de 15 vezes
em glicina.
23
12
13
14
15
16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
12
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0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
A B
µ = 0,221 dia-1 µ = 0,264 dia-1
12
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0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
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16
0 2 4 6 8 10 12 14 16dias
ln (c
els.m
L-1)
C D
µ = 0,276 dia-1 µ = 0,285 dia-1
12
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0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
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0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
E F
µ = 0,185 dia-1 µ = 0,181 dia-1
Figura 3: Curvas de crescimento de Ankistrodesmus gracilis com média e desvio-padrão, n=3 para todos os tratamentos. A = nitrato, B = amônio, C = arginina, D = glicina, E = uréia com níquel, F = uréia.
24
12
13
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16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
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16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
A B
µ = 0,239 dia-1 µ = 0,286 dia-1
12
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15
16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
12
13
14
15
16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
C D
µ = 0,240 dia-1 µ = 0,185 dia-1
12
13
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0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
12
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15
16
0 2 4 6 8 10 12 14 16
dias
ln (c
els.m
L-1)
E F
µ = 0,193 dia-1 µ = 0,205 dia-1
Figura 4: Curvas de crescimento de Microcystis panniformis com média e desvio-padrão, n=3 para todos os tratamentos. A = nitrato, B = amônio, C = arginina, D = glicina, E = uréia com níquel, F = uréia.
25
Tabela 1: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final e taxa de crescimento (dia-1) de Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de curva de crescimento.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréia(n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3)
inicial 3,84 x 105 1,94 x 105 3,48 x 105 4,36 x 105 5,54 x 105 5,05 x 105
final 8,25 x 106 (ab) 3,13 x 106 (c) 7,19 x 106 (b) 9,29 x 106 (a) 8,97 x 106 (a) 9,18 x 106 (a)
µ 0,221 (c) 0,264 (b) 0,276 (ab) 0,285 (a) 0,185 (d) 0,181 (d)
as letras entre parênteses indicam diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos para cada variável. Tabela 2: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final e taxa de crescimento (dia-1) de Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de curva de crescimento.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréia(n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3)
inicial 3,41 x 105 4,62 x 105 4,40 x 105 4,55 x 105 6,09 x 105 3,50 x 105
final 9,37 x 106 (a) 3,38 x 106 (c) 7,48 x 106 (b) 7,00 x 106 (b) 9,54 x 106 (a) 8,17 x 106 (ab)
µ 0,239 (b) 0,286 (a) 0,240 (b) 0,185 (c) 0,193 (c) 0,205 (bc)
as letras entre parênteses indicam diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos para cada variável.
26
4.2 – Concentrações de clorofila a, carboidratos, proteínas e microcistinas
A concentração de clorofila a nos tratamentos de nitrogênio inorgânico foram
similares em A. gracilis (Tabela 3). Nas fontes de nitrogênio orgânico, a maior
concentração de clorofila a foi em glicina (Tabela 3), que se mostrou diferente aos
outros tratamentos orgânicos e similar aos tratamentos em nitrogênio inorgânico
(ANOVA, DF = 5, Estatística F = 30,58, P<0,0001).
M. panniformis também apresentou valores semelhantes de clorofila a entre
nitrato e amônio (Tabela 4). Glicina foi o tratamento em que a cianobactéria apresentou
a maior concentração de clorofila a (Tabela 4) sendo diferente de todos os outros
tratamentos (ANOVA, DF = 5, Estatística F = 11,48, P<0,0003).
A concentração de carboidratos foi similar em amônio e nitrato para A. gracilis
(Tabela 3). Dentre as fontes de nitrogênio orgânico, a maior concentração foi em uréia
com níquel, seguida por glicina e uréia, e mais baixa em arginina (Tabela 3). De
maneira geral, a concentração de carboidratos foi superior em nitrogênio orgânico em
relação ao nitrogênio inorgânico (ANOVA, DF = 5, Estatística F = 32,60, P<0,0001).
Para M. panniformis, a concentração de carboidratos foi semelhante em nitrato e
em amônio (Tabela 4). A concentração de carboidratos foi similar em todos os
tratamentos de nitrogênio orgânico (Tabela 4). Como em A. gracilis, a concentração de
carboidratos foi superior em nitrogênio orgânico do que em nitrogênio inorgânico para
M. panniformis (ANOVA, DF = 5, Estatística F = 6,51, P<0,0038).
A concentração de proteínas foi superior em nitrato do que em amônio para A.
gracilis (Tabela 3). Dentre as fontes orgânicas, houve semelhança na concentração de
proteínas entre arginina e glicina e o mesmo pode ser observado para uréia com níquel e
uréia (Tabela 3), mas os teores de proteínas em aminoácidos foram superiores nos
tratamentos com uréia. (ANOVA, DF = 5, Estatística F = 55,24, P<0,0001).
M. panniformis apresentou maiores concentrações de proteínas em nitrogênio
inorgânico do que nitrogênio orgânico (Tabela 4). Entre as fontes de nitrogênio
inorgânico, não houve diferença entre nitrato e amônio, e entre as de nitrogênio
orgânico, a concentração foi maior em glicina e arginina, seguida pelos tratamentos com
uréia (ANOVA, DF = 5, Estatística F = 35,35, P<0,0001).
27
Com relação às fontes inorgânicas, o teor de microcistinas foi maior em amônio
do que em nitrato (Tabela 5). Dentre as fontes de nitrogênio orgânico, houve
similaridade na síntese de microcistinas nos tratamentos com aminoácidos e também
entre os tratamentos com uréia (ANOVA, DF = 5, Estatística F = 20,55, P<0,0001). O
conteúdo de microcistinas intracelulares em amônio foi similar com os tratamentos de
uréia com e sem níquel, e a concentração de microcistinas em nitrato foi semelhante à
encontrada nos aminoácidos (Tabela 5).
Tabela 3: Concentrações de clorofila a, carboidratos e proteínas (pg.célula-1) para Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréiaclorofila a 1,64 + 0,05 (ab) 1,62 + 0,04 (ab) 1,27 + 0,05 (d) 1,68 + 0,04 (a) 1,52 + 0,07 (bc) 1,48 + 0,04 (c)
(n = 3)
carboidratos 6,31 + 1,18 (c) 7,23 + 0,92 (c) 7,31 + 0,15 (c) 13,41 + 1,43 (b) 17,00 + 1,67 (a) 13,02 + 1,73 (b)
(n = 3)
proteínas 23,94 + 2,40 (a) 5,21 + 1,21 (c) 14,89 + 1,87 (b) 19,86 + 0,97 (ab) 7,88 + 1,36 (c) 5,38 + 0,42 (c)
(n = 2) as letras entre parênteses indicam diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos para cada variável. Tabela 4: Concentrações de clorofila a, carboidratos e proteínas (pg.célula-1) para Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréiaclorofila a 0,22 + 0,01 (b) 0,22 + 0,02 (b) 0,22 + 0,02 (b) 0,32 + 0,03 (a) 0,25 + 0,02 (b) 0,20 + 0,02 (b)
(n = 3)
carboidratos 5,57 + 0,61 (b) 4,89 + 0,83 (b) 9,06 + 0,90 (ab) 12,26 + 1,16 (a) 11,16 + 2,38 (a) 7,91 + 0,93 (ab)
(n = 3)
proteínas 47,05 + 4,19 (a) 41,65 + 3,89 (a) 33,68 + 4,90 (b) 34,67 + 1,62 (b) 13,63 + 1,72 (c) 21,49 + 4,06 (c)
(n=3) as letras entre parênteses indicam diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos para cada variável.
28
Tabela 5: Concentrações de microcistinas (fg.célula-1) para Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréiamicrocistinas 8,41 + 1,85 (bc) 14,23 + 0,62 (a) 4,89 + 1,55 (c) 8,55 + 1,13 (bc) 11,73 + 1,14 (ab) 13,55 + 1,42 (a)
(n = 3) as letras entre parênteses indicam diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos para cada variável.
Os dados de densidade celular inicial e final nos experimentos de carboidratos,
proteínas e microcistinas estão apresentados na tabela 6 para A. gracilis e na tabela 7
para M. panniformis. Esses dados não retratam tão bem as densidades celulares iniciais
e finais como visto no tópico 4.1, pois se referem aos experimentos de curta duração, de
apenas sete dias, onde as espécies ainda estão na fase de crescimento exponencial. Eles
são utilizados apenas para se referir na concentração de células no início dos
experimentos e na concentração final para o cálculo das concentrações de carboidratos,
proteínas e microcistinas.
Tabela 6: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de carboidratos e proteínas.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréia(n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3)
inicial 9,92 x 104 1,42 x 105 2,26 x 105 1,23 x 105 8,76 x 104 7,19 x 104
final 3,35 x 106 2,24 x 106 3,06 x 106 3,02 x 106 1,61 x 106 1,74 x 106
Tabela 7: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de carboidratos, proteínas e microcistinas.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréia(n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3)
inicial 1,20 x 106 3,08 x 105 3,25 x 105 1,85 x 106 2,47 x 105 5,53 x 105
final 3,34 x 106 1,19 x 106 2,77 x 106 2,70 x 106 1,38 x 106 2,48 x 106
29
4.3 – Medidas de Fluorescência
As curvas de saturação da ETR estão representadas nas Fig. 5 e 6 para A.
gracilis e para M. panniformis, respectivamente.
Houve uma maior eficiência fotossintética para A. gracilis em nitrato do que em
amônio em todas as intensidades luminosas (Fig. 5). A cianobactéria M. panniformis
também apresentou a mesma tendência de melhor rendimento em nitrato,
principalmente em PAR superior a 300 µmol.m-2.s-1 (Fig. 6).
Analisando-se as ETRs nas fontes de nitrogênio orgânico, observa-se que a
clorófita A. gracilis apresentou maior eficiência fotossintética quando crescendo em
glicina em comparação com a arginina (Fig. 5), principalmente em PAR acima de 400
µmol.m-2.s-1. Neste caso, percebe-se ainda que a arginina provocou um efeito inibitório
na ETR da clorófita em PAR mais elevada. Em relação à uréia com e sem adição de
níquel, houve pouca diferença com uma ligeira superioridade de uréia com níquel em
PAR superior a 800 µmol.m-2.s-1 (Fig. 5).
A espécie M. panniformis apresentou pouca diferença entre as curvas de ETR
quando crescendo em arginina ou glicina. Percebe-se uma melhor eficiência
fotossintética em glicina do que arginina (Fig. 6), principalmente em PAR acima de 500
µmol.m-2.s-1. Não houve diferença entre os tratamentos de uréia com e sem níquel (Fig.
6).
As curvas de rendimento quântico efetivo (Φ’M) mostram uma melhor
capacidade de conversão de energia luminosa em energia química quando A. gracilis
estava crescendo em nitrato do que amônio (Fig. 7). Também houve valores mais
elevados de Φ’M em glicina do que arginina e não houve diferenças entre os tratamentos
de uréia com e sem níquel (Fig. 7).
M. panniformis apresentou pouca diferença nas curvas de rendimento quântico
efetivo, com uma ligeira superioridade de nitrato em relação ao amônio, e de glicina em
relação à arginina (Fig. 8). Não houve diferenças entre uréia com e sem níquel (Fig. 8).
Os dados de rendimento quântico potencial (ΦM) estão apresentados nas Fig. 9 e
10, para A. gracilis e para M. panniformis, respectivamente. O rendimento quântico
potencial para A. gracilis foi superior em nitrato em relação ao amônio e em glicina em
30
comparação à arginina (Fig. 9), com diferenças estatísticas. A diferença entre uréia com
e sem níquel não foi diferente, mas houve um rendimento quântico potencial
ligeiramente maior em uréia com níquel (Fig. 9).
M. panniformis apresentou maior rendimento quântico potencial em nitrato do
que em amônio (Fig. 10), com valores significativamente diferentes. Os valores de
rendimento quântico potencial em nitrogênio orgânico não foram estatisticamente
diferentes, mas a arginina foi um pouco superior à glicina, e a uréia sem níquel um
pouco superior à uréia com níquel (Fig. 10).
Na tabela 8 estão apresentados os coeficientes da curva fotossintética, calculados
pelo modelo não linear e as estatísticas correspondentes. O modelo foi significativo para
todas as curvas (L ratio, P≤0,0001). No caso das estimativas de ETR máx, observamos
diferenças significativas entre todos os tratamentos dois a dois, com exceção dos
tratamentos nitrato e amônio para M. panniformis, que não tiveram diferenças para a
estimativa deste parâmetro. Com relação ao parâmetro α, inclinação da curva, só
mostrou valores significativamente diferentes para as duas espécies quando crescendo
nas fontes nitrato e amônio. O parâmetro β, que indica uma eventual inibição em PAR
mais elevado, só mostrou haver diferenças significativas para A. gracilis crescendo em
glicina e arginina e para M. panniformis crescendo em nitrato e amônio. Para uma
análise comparativa, de estudo da melhor eficiência fotossintética (maior ETR máx) os
experimentos com as diversas fontes nitrogenadas deveriam ter sido realizados no
mesmo dia. Mas podemos comparar as ETRs máx entre A. gracilis e M. panniformis,
crescendo na mesma fonte nitrogenada. Em nitrato, a clorofícea mostrou maior ETR
máx, enquanto em amônio, o maior valor foi observado para M. panniformis. A. gracilis
apresentou maior ETR máx nos dois aminoácidos (arginina e glicina) em comparação
com a cianobactéria. Em relação à uréia, não houve diferença entre os valores para
ambas as espécies, mas A. gracilis apresentou maior ETR máx em uréia com níquel
(Tabela 8).
Os dados de densidade celular inicial e final nos experimentos de medida de
fluorescência e concentração de clorofila a estão apresentados na tabela 9 para A.
gracilis e na tabela 10 para M. panniformis. Como descrito anteriormente, esses dados
31
foram utilizados apenas para se referir na concentração de células no início dos
experimentos e na concentração final para o cálculo da concentração de clorofila a.
32
0
15
30
45
60
0 200 400 600 800 1000 1200
PAR (µmol.m-2.s-1)
ETR
(µm
ol.m-2
.s-1
)
nitratoamônio
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
ETR
(µm
ol.m-2
.s-1
)
arginina
glicina
0
20
40
60
80
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
ETR
(µm
ol.m-2
.s-1
)
uréia com níquel
uréia
Figura 5: Curvas da taxa de transporte de elétrons obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Ankistrodesmus gracilis.
33
0
10
20
30
40
0 200 400 600 800 1000 1200
PAR (µmol.m-2.s-1)
ETR
(µm
ol.m-2
.s-1
)
nitratoamônio
0
10
20
30
40
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
ETR
(µm
ol.m-2
.s-1
)
arginina
glicina
0
20
40
60
80
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
ETR
(µm
ol.m-2
.s-1
)
uréia com níquel
uréia
Figura 6: Curvas da taxa de transporte de elétrons obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Microcystis panniformis.
34
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 200 400 600 800 1000 1200
PAR (µmol.m-2.s-1)
' M
nitratoamônio
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
' M
arginina
glicina
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
' M
uréia com níquel
uréia
Figura 7: Curvas de rendimento quântico efetivo obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Ankistrodesmus gracilis.
35
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 200 400 600 800 1000 1200
PAR (µmol.m-2.s-1)
' M
nitratoamônio
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
' M
arginina
glicina
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
PAR (µmol.m-2.s-1)
' M
uréia com níquel
uréia
Figura 8: Curvas de rendimento quântico efetivo obtidas em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Microcystis panniformis.
36
0,580
0,590
0,600
0,610
0,620
0,630
0,640
0,650
nitrato amônio
M
0,500
0,520
0,540
0,560
0,580
0,600
0,620
0,640
arginina glicina
M
0,500
0,520
0,540
0,560
0,580
0,600
0,620
0,640
uréia com níquel uréia
M
Figura 9: Rendimento quântico potencial (média e desvio-padrão) obtido em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Ankistrodesmus gracilis.
37
Figura 10: Rendimento quântico potencial (média e desvio-padrão) obtido em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia para Microcystis panniformis.
MM
M
0,390
0,400
0,410
0,420
0,430
0,440
0,450
0,460
nitrato amônio
0,320
0,325
0,330
0,335
0,340
0,345
0,350
uréia com níquel uréia
0,180
0,190
0,200
0,210
0,220
0,230
0,240
arginina glicina
38
Tabela 8: Resultados da resposta das duas espécies quando crescendo sob diversas fontes nitrogenadas. A significância do efeito dos tratamentos foi verificada através de teste de verossimilhança (teste global) e das comparações por teste t entre os tratamentos dois a dois. Os parâmetros estão expressos como estimativas mais ou menos o erro padrão. **** indica P<0,0001, *** indica P<0,0005. As unidades são: ETR (µmol elétrons.m-2.s-1); α (µmol elétrons/µmol PAR fótons); β (µmol elétrons/µmol fótons).
ETR máx ETR máx α α β βTratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 1 Tratamento 2 Tratamento 1 Tratamento 2
A. gracilis A. gracilis L-ratio = 147 48,0 + 3,7 15,0 + 1,4 0,20 + 0,030 0,11 + 0,019nitrato amônio **** **** ****
A. gracilis A. gracilis L-ratio = 139 89,9 + 3,7 55,9 + 0,7 0,27 + 0,023 0,26 + 0,015 0,0036 + 0,0034 0,016 + 0,0023glicina arginina **** **** ****
A. gracilis A. gracilis L-ratio = 63 75,4 + 2,4 64,84 + 2,1 0,20 + 0,005 0,19 + 0,003uréia uréia com níquel **** ****
M. panniformis M. panniformis L-ratio = 95 32,9 + 2,2 31,9 + 1,6 0,22 + 0,0063 0,12 + 0,0039 0,0045 + 0,0013 0,0054 + 0,0008nitrato amônio **** **** ***
M. panniformis M. panniformis L-ratio = 67 37,8 + 3,1 25,6 + 2,7 0,09 + 0,009 0,09 + 0,007glicina arginina **** ****
M. panniformis M. panniformis L-ratio = 39,9 75,1 + 6,3 42,8 + 8,6 0,12 + 0,014 0,13 + 0,018uréia uréia com níquel **** ****
Tratamento 1 Tratamento 2Teste global do
efeito de
39
Tabela 9: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Ankistrodesmus gracilis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de medida de fluorescência e concentração de clorofila a.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréia(n=2) (n=2) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3)
inicial 5,85 x 105 9,64 x 104 3,53 x 105 4,31 x 105 4,58 x 105 4,53 x 105
final 3,67 x 106 1,80 x 106 4,39 x 106 4,96 x 106 3,24 x 106 3,49 x 106
Tabela 10: Densidade celular média (células.mL-1) inicial e final de Microcystis panniformis em nitrato, amônio, arginina, glicina, uréia com níquel e uréia nos experimentos de medida de fluorescência e concentração de clorofila a.
nitrato amônio arginina glicina uréia com níquel uréia(n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3)
inicial 2,82 x 105 2,07 x 105 5,20 x 105 5,14 x 105 1,49 x 106 1,80 x 106
final 1,57 x 106 1,39 x 106 4,57 x 106 3,54 x 106 4,85 x 106 5,57 x 106
40
5 – Discussão
5.1 – Crescimento e composição bioquímica
Os resultados indicaram que a microalga Ankistrodesmus gracilis e a
cianobactéria Microcystis panniformis foram capazes de crescer, de realizar fotossíntese
e de sintetizar clorofila a, carboidratos, proteínas e microcistinas tanto em fontes
nitrogenadas inorgânicas quanto orgânicas. Isso demonstra que tanto algas eucariontes
como cianobactérias não dependem pelo seu crescimento de fontes de nutrientes
exclusivamente inorgânicas.
Em trabalho realizado com as fontes nitrogenadas: nitrato, amônio, arginina e
glicina em plantas terrestres, foi também verificado que as espécies testadas obtiveram o
nitrogênio de todos os compostos testados (Persson et al., 2003).
Considerando-se as fontes nitrogenadas inorgânicas, ambas as espécies
apresentaram um crescimento mais rápido em amônio, mas os meios contendo nitrato
suportaram as maiores densidades celulares. O crescimento do fitoplâncton pode ser
mais lento em nitrato, pois esse quando absorvido deve ser reduzido a amônio com
maior gasto energético (Syrett, 1981; Yin et al., 1998; Herrero et al., 2001). Esses dados
também foram observados pelo estudo realizado com M. viridis (von Ruckert & Giani,
2004). Outros autores também citam o amônio como fonte de nitrogênio preferida pelo
fitoplâncton pela sua rápida assimilação (Wetzel, 1983; Blomqvist et al., 1994; Présing
et al., 2001). O trabalho com as algas Emiliana huxleyi e Thalassiosira pseudonana com
oito aminoácidos como fonte de nitrogênio orgânico e com o amônio resultou em um
melhor crescimento de ambas as espécies na presença de amônio (Ietswaart et al.,
1994). Resultados contrários foram obtidos por Hyestrand et al. (2000) em que a maior
densidade celular foi obtida em amônio do que nitrato para a clorófita Scenedesmus,
mas os mesmos autores verificaram uma densidade celular significantemente maior em
nitrato do que amônio para a cianobactéria Synechococcus. Oliveira (1999) observou
que, para duas espécies de clorófitas estudadas Ankistrodesmus gracilis e Scenedesmus
quadricauda, as maiores densidades celulares foram obtidas quando as espécies
41
cresciam em nitrato do que em amônio. Por outro lado, a taxa de crescimento da
Raphidophyceae Heterosigma carterae foi maior em nitrato do que amônio
contrariando os nossos resultados (Chang, 1995).
Em relação às fontes nitrogenadas orgânicas, estes padrões de densidades
celulares e taxas de crescimento não foram tão similares para as duas espécies. O
crescimento para A. gracilis foi maior nos aminoácidos do que nos dois tratamentos
com a uréia e para M. panniformis foi um pouco maior em arginina do que nos outros
tratamentos. As duas espécies apresentaram densidades celulares finais elevadas em
todos os tratamentos de nitrogênio orgânico, algumas vezes até superior à densidade
final em nitrato, como foi o caso da espécie A. gracilis em glicina e uréia. Isso foi
semelhante ao encontrado por Kana et al. (2004), em que a Chrysophyta Aureococcus
anophagefferens apresentou densidade celular maior em uréia do que em nitrato. Por
outro lado, Berman & Chava (1999) obtiveram melhor crescimento na uréia comparado
às outras fontes nitrogenadas orgânicas como hipoxantina, guanina, ornitina,
glicosamina e lisina e fontes nitrogenadas inorgânicas como nitrato e amônio para as
cianobactérias Aphanizomenon ovalisporum, Microcystis sp. e Synechococcus sp. além
da clorófita Pediastrum sp. e da diatomácea Cyclotella sp. Alguns autores indicam a
uréia como um bom substrato para o fitoplâncton, às vezes em preferência ao nitrato
(Berman, 2001), pois permitiria o estoque celular tanto de nitrogênio orgânico como de
carbono, sendo um benefício principalmente quando outras variáveis como intensidade
luminosa ou temperatura baixa limitam o crescimento (Berg et al., 1997). É possível
que no nosso estudo não observamos esta preferência pela uréia, já que as condições de
luz e temperatura não estavam limitantes. Outros experimentos, diminuindo estas
variáveis, poderiam fornecer resultados diferentes.
De maneira geral no nosso estudo, o crescimento nos tratamentos com a uréia
nunca foi superior ao observado nos tratamentos com nitrogênio inorgânico. Em
trabalho realizado com a Chrysophyta A. anophagefferens, a alga apresentou taxa de
crescimento semelhante em nitrato e uréia (Pustizzi et al., 2004). O crescimento da
mesma alga na uréia parece não ser mais rápido do que no nitrato (Berg et al., 1997).
Em outro estudo, realizado com a mesma alga, foi observado que as taxas de
crescimento foram elevadas em altas e baixas concentrações de nitrato, e apenas em
baixas concentrações de amônio, uréia e glutamato (Taylor et al., 2006). Segundo os
42
autores as últimas três fontes nitrogenadas foram letais em concentrações maiores,
podendo ser tóxicas para a espécie testada.
Comparando-se os dados obtidos entre os tratamentos de uréia com níquel e
apenas uréia, não foi possível detectar diferenças estatísticas entre os tratamentos. As
duas enzimas capazes de hidrolisar a uréia a amônio são a adenosina trifosfato (ATP)
uréia amidolase e a urease. As espécies de algas que utilizam a enzima urease para
assimilarem a uréia necessitam de níquel (Dyhrman & Anderson, 2003; Syrett, 1981) já
que essa enzima requer um cofator níquel enquanto a outra não. Provavelmente, as
espécies estudadas A. gracilis e M. panniformis metabolizam a uréia com a ação da
enzima ATP uréia amidolase, pois ambas as espécies cresceram de maneira muito
semelhante nos tratamentos de uréia com níquel e apenas uréia, não tendo nenhuma
exigência na adição de níquel para a utilização da uréia. O estudo dos dinoflagelados
Alexandrium fundyense e Alexandrium catenella em uréia como fonte de nitrogênio,
demonstrou que as duas espécies só foram capazes de crescer em uréia quando níquel
foi adicionado no meio de cultura (Dyhrman & Anderson, 2003). Para os autores, as
espécies estudadas apresentam um metabolismo de uréia níquel dependente, pois
metabolizam a uréia pela ação da enzima urease. De acordo com Palenik & Henson
(1997), o crescimento de Emiliana huxleyi utilizando hipoxantina como fonte
nitrogenada é dependente de níquel, provavelmente porque esta espécie utiliza a enzima
urease.
A composição bioquímica de culturas de algas pode apresentar variações entre
as fases de crescimento, pois cada fase reflete a idade da cultura além de algumas
limitações ou inibições. Desta maneira, as amostras filtradas para as análises de
clorofila a, carboidratos e proteínas foram obtidas na fase exponencial de crescimento
para as duas espécies em todos os tratamentos, no sétimo dia de experimento. Volkman
et al. (1989) sugerem a utilização da fase exponencial para retirada de amostras para
análise da composição bioquímica de culturas de microalgas. Para os autores, tal
procedimento garante a obtenção de células saudáveis, já que deficiências nutricionais
pelo esgotamento de nutrientes do meio podem induzir em variações metabólicas. A
fase estacionária, por ser mais deficiente em nutrientes, tende a ter menor número de
células saudáveis do que a fase exponencial.
43
A concentração de clorofila a foi semelhante nos tratamentos de nitrogênio
inorgânico para as duas espécies estudadas. Isso demonstra que a utilização de nitrato
ou amônio não afetou a produção de clorofila a. Resultado contrário foi obtido por
Gobler et al. (2006) e Almeida (2002) que encontraram maiores níveis de clorofila a em
nitrato do que amônio.
Dentre as fontes de nitrogênio orgânico, a maior concentração de clorofila a foi
encontrada em glicina para as duas espécies. M. panniformis apresentou concentrações
mais baixas de clorofila a em arginina, uréia com níquel e uréia, e semelhantes às
encontradas em nitrato e amônio. A. gracilis apresentou a menor concentração de
clorofila a em arginina e valores um pouco superiores nos tratamentos de uréia. Esses
resultados concordam em parte com o estudo realizado por Bode et al. (2001). Os
autores encontraram uma correlação significativa entre o nitrogênio orgânico e os níveis
de clorofila a. Em nosso trabalho essa correlação só pode ser feita no tratamento com
glicina para as duas espécies.
A alga Aureococcus anophagefferens apresentou níveis semelhantes de clorofila
a tanto em nitrato como em uréia (Kana et al., 2004). O mesmo resultado pode ser
percebido nas duas espécies em estudo no nosso trabalho, principalmente em M.
panniformis que obteve níveis de clorofila a estatisticamente iguais nesses tratamentos.
Um estudo realizado com Synechococcus sp. demonstrou que um crescimento
mais rápido da cianobactéria resultou em menores concentrações de clorofila a (DeYoe
et al., 2007). Isso foi percebido em nossos resultados se comparando os aminoácidos
arginina e glicina para M. panniformis. O crescimento da cianobactéria foi mais rápido
em arginina, mas a maior concentração de clorofila a foi em glicina. O mesmo não pode
ser afirmado com relação à A. gracilis, pois as taxas de crescimento nos tratamentos
com os aminoácidos não foram estatisticamente diferentes, mesmo que alga tenha
apresentado maior concentração de clorofila a em glicina.
Para Gobler & Sañudo-Wilhelmy (2001), em estudo realizado com a alga
Aureococcus anophagefferens, a densidade celular teve correlação positiva com a
concentração de clorofila a. Em nossos resultados, isso só foi observado para A. gracilis
quando a fonte nitrogenada foi a glicina. A clorófita apresentou a maior concentração de
clorofila a em glicina, onde foi observada a maior densidade celular final. O mesmo não
pode ser dito para a cianobactéria M. panniformis, pois mesmo tendo apresentado o
44
maior nível de clorofila a em glicina, a densidade celular final nesse tratamento foi
inferior em comparação com os tratamentos em nitrato, uréia com níquel e uréia.
Como já mencionado, não houve diferenças nos níveis de clorofila a entre os
tratamentos de uréia com níquel e apenas níquel, o que sugere mais uma vez que as duas
espécies estudadas utilizam a enzima ATP uréia amidolase não dependente de níquel
para o metabolismo da uréia.
Sabe-se que o fitoplâncton pode “estocar” nutrientes na célula, mesmo quando
estes se encontram em concentrações elevadas no ambiente (Reynolds, 1984). Tal
processo, conhecido como “luxury consumption”, tem sido registrado como uma
estratégia adaptativa a uma possível limitação futura de nutrientes. O nitrogênio pode
ser estocado na forma de metabólitos como proteínas, carboidratos e pigmentos.
Em relação à concentração de proteínas, verifica-se que as maiores
concentrações foram obtidas em nitrato, e nos aminoácidos arginina e glicina para A.
gracilis. A maior concentração de proteínas em nitrato do que amônio reflete uma
relação negativa entre o acúmulo de proteína e a taxa de crescimento. O menor
crescimento em nitrato do que amônio também foi verificado para M. panniformis, mas
em ambos os tratamentos foram verificadas concentrações bastante similares de
proteínas. O crescimento do fitoplâncton mais lento em nitrato do que em amônio é
devido ao fato de que o nitrato quando absorvido, é acumulado nas células ou reduzido
a compostos intermediários e incorporado dentro de proteínas e clorofila a (von Ruckert
& Giani, 2004). No estudo realizado por Oliveira (1999) foi verificado que a síntese
protéica da clorófita Scenedesmus quadricauda foi reduzida apesar de ter apresentado a
maior taxa de crescimento. Para o autor, a síntese protéica reduzida a uma razão de N:P
0,4 expressa uma condição limitante de nitrogênio. Rhee (1978) verificou que, para
Scenedesmus sp., o nitrogênio em excesso é acumulado principalmente sob a forma de
proteínas, representando mais que 70 % do conteúdo total de nitrogênio celular.
As duas espécies estudadas apresentaram as menores concentrações de proteínas
nos tratamentos com uréia com níquel e apenas com uréia. Isso pode ser devido ao fato
de que a uréia foi a forma de nitrogênio menos eficiente para a produção de proteínas,
embora alguns autores tenham demonstrado uma preferência da uréia pelo fitoplâncton
em comparação a outras fontes nitrogenadas, inclusive o nitrato (Berg et al., 1997;
Berman & Chava, 1999; Berman, 2001; Gobler & Sañudo-Wilhelmy, 2001). Os valores
45
intermediários de proteínas nos tratamentos em aminoácidos foram verificados para
ambas as espécies.
De acordo com o estudo realizado por Oliveira (1999), as maiores concentrações
de proteínas foram obtidas nas culturas onde se obteve as menores densidades celulares.
Em nosso trabalho, essa afirmação somente é verdadeira considerando-se os
experimentos realizados em uréia com níquel e uréia para A. gracilis e M. panniformis.
Em ambos os casos, as menores concentrações de proteínas foram obtidas nos
tratamentos com uréia onde as duas espécies atingiram as maiores densidades celulares.
O mesmo não pode ser dito em relação ao nitrato, onde tanto a concentração de
proteínas quanto a densidade celular foram elevadas nas duas espécies.
O nitrogênio absorvido a partir do amônio pode ser estocado sob várias formas,
dentre as quais se verifica uma estocagem sob a forma de proteínas (Lewis & Hanisak,
1996). Em nosso estudo, isso foi observado apenas para a espécie M. panniformis que
apresentou valores de proteínas elevados, semelhante ao encontrado para o nitrato. Já
para A. gracilis, a concentração de proteínas em amônio foi a mais baixa dentre todos os
tratamentos.
Em relação aos carboidratos, as maiores concentrações ocorreram nas fontes
nitrogenadas orgânicas para A. gracilis, principalmente em glicina, uréia com níquel e
uréia. M. panniformis apresentou as maiores concentrações de carboidratos em
nitrogênio orgânico do que inorgânico. Para ambas as espécies foi possível observar
uma maior síntese de carboidratos em glicina do que em arginina e em uréia com níquel
em comparação com a uréia.
Em condições de nitrogênio limitante, verifica-se baixa concentração de
proteínas e alta concentração de carboidratos (Smit, 1997; Oliveira, 1999; Boëchat,
2000). Como em nosso trabalho todas as fontes nitrogenadas não eram limitantes e foi
estabelecida a mesma concentração de nitrogênio em todos os tratamentos, pode-se
constatar que a concentração de proteínas foi superior à concentração de carboidratos
em todos os tratamentos para M. panniformis. Essa afirmação só não foi verdadeira para
A. gracilis nos tratamentos de amônio e das uréias. Talvez para a clorófita estas duas
fontes de nitrogênio não sejam ideais para o seu crescimento, fazendo com que a alga
nestas condições sintetizasse mais carboidratos do que proteínas.
46
De maneira geral, foi verificada uma maior síntese protéica nos tratamentos de
nitrogênio inorgânico, exceto para A. gracilis em amônio, em comparação com os
tratamentos de nitrogênio orgânico. Contrariamente, é possível afirmar que a maior
síntese de carboidratos ocorreu nos tratamentos de nitrogênio orgânico. Essa diferença
metabólica entre fontes nitrogenadas orgânicas e inorgânicas pode ser devido ao fato de
que o fitoplâncton prefira estocar nitrogênio para uma utilização mais tardia, sob a
forma de proteína quando crescendo em fontes nitrogenadas inorgânicas. Mas sob
fontes orgânicas, é possível que haja alguma dificuldade no armazenamento de
proteínas e o metabolismo do fitoplâncton seja mais direcionado na síntese de
metabólitos para um consumo mais rápido na forma de carboidratos (Handa, 1969).
Esse maior acúmulo relativo de carboidratos com relação a proteínas é também
observado em condições de limitação de nitrogênio ou outros nutrientes (Konopka &
Schnur, 1981; Chu et al., 2007).
De maneira geral, não houve diferenças significativas nas concentrações de
proteínas e carboidratos entre os dois tratamentos com a uréia, com e sem níquel. Este
fato confirma mais uma vez que o metabolismo da uréia pelas espécies estudadas é
realizado pela enzima ATP uréia amidolase não dependente de níquel.
5.2 – Produção de microcistinas
Os dados de microcistinas mostraram que as maiores concentrações da toxina
foram encontradas nos tratamentos de amônio e de uréia com e sem níquel. O mesmo
foi encontrado em estudo realizado com a Raphidophyceae Heterosigma carterae que
exibiu sinais de toxicidade em concentrações elevadas de amônio e uréia (Chang, 1995).
Isso não foi observado para os dinoflagelados Alexandrium fundyense e A. catenella, e
para a cianobactéria Planktothrix crescidos em uréia (Pomati et al., 2001; Dyhrman &
Anderson, 2003). De acordo com os autores, as células crescidas em uréia apresentaram
os menores conteúdos de toxina.
Para John & Flynn (1999), em estudo com o dinoflagelado Alexandrium
fundyense, a arginina foi um precursor para a síntese de toxina, e o crescimento nessa
fonte nitrogenada aumenta a toxicidade da cultura. Nossa toxina, por outro lado, não é
47
um alcalóide, como as toxinas encontradas em dinoflagelados marinhos (saxitoxina,
anatoxina e anatoxina-a), mas um heptapeptideo (Carmichael, 1994) que embora rico
em nitrogênio perfaz uma via de biosíntese diferente. Em nosso trabalho, a
cianobactéria foi capaz de sintetizar microcistinas em todos os tratamentos estudados,
mas M. panniformis em arginina produziu a menor concentração de microcistinas em
comparação com as outras fontes nitrogenadas. Para Sivonen (1990), o efeito mais
aparente na produção de toxina em Oscillatoria agardhii foi o aumento na concentração
de nitrato em baixa intensidade luminosa. O mesmo não foi verificado em nosso
trabalho, já que a concentração de microcistinas em nitrato foi baixa, maior apenas do
que em arginina.
Comparando-se na literatura os dados de taxa de crescimento e concentração de
microcistinas, percebe-se que os maiores valores foram em amônio. Essa relação
positiva entre a taxa de crescimento e a concentração de microcistinas também foi
verificada em outros trabalhos (Oh et al., 2000; Long et al., 2001; Lyck, 2004; Dowing
et al., 2005). Mas, em nosso trabalho, M. panniformis apresentou alta taxa de
crescimento em arginina, onde sintetizou a menor concentração de microcistinas.
Analisando-se os dados de microcistinas e clorofila a, não há como predizer
alguma relação entre esses dois constituintes celulares, já que a concentração de
clorofila a em M. panniformis foi estatisticamente semelhante em praticamente todos os
tratamentos, exceto em glicina, que apresentou a maior concentração de clorofila a.
Resultados diferentes foram encontrados em culturas de M. aeruginosa, que apresentou
relação positiva entre concentração de microcistinas e concentração de clorofila a (Lee
et al., 2000; Dowing et al., 2005).
Em relação ao conteúdo de microcistinas e proteínas celulares totais, há uma
relação positiva apenas em amônio, em que M. panniformis apresentou concentrações
elevadas dos dois constituintes. Dowing et al. (2005) também verificaram uma relação
positiva entre proteínas e microcistinas em culturas de M. aeruginosa. Diferentemente
do encontrado em nosso trabalho, o teor de microcistinas e proteínas em cultura de M.
aeruginosa foi menor em amônio (Amé & Wunderlin, 2005). Para os autores, o amônio
produziu um efeito negativo em ambos os níveis de microcistinas e proteínas, e poderia
causar algum efeito tóxico na espécie estudada.
48
Os níveis de irradiação também poderiam afetar na produção de microcistinas.
De acordo com Wiedner et al. (2003), o aumento na irradiação tem efeito positivo na
produção de microcistinas intracelulares até a taxa máxima de crescimento. Em maiores
irradiações, a produção de microcistinas foi inibida e o conteúdo da toxina intracelular
diminuiu. A intensidade luminosa que utilizamos nos nossos experimentos foi acima do
valor máximo utilizado por Wiedner et al. (2003): 75 μmol de fótons.m-2.s-1, contra os
40 μmol de fótons.m-2.s-1 utilizados por estes autores, mas parece não ter tido nenhum
efeito inibitório na produção de microcistinas na nossa cepa. Sivonen (1990) também
encontrou maiores concentrações de microcistinas por unidade de peso seco em
menores irradiações.
5.3 – Eficiência fotossintética
Com relação às medidas de fotossíntese realizadas com o fluorímetro, os
resultados indicaram que o filtro contendo as células fitoplanctônicas funcionou como
uma folha artificial, uma vez que houve a possibilidade de utilização da técnica de
fluorimetria PAM. A repetição das medidas em um mesmo tratamento destacou a
sensibilidade da técnica utilizada e permitiu a diferenciação entre os tratamentos. Desta
maneira, a fluorimetria PAM pode ser eficiente no estudo de modificações na atividade
fotossintética do fitoplâncton em resposta às condições ambientais ou aos fatores de
estresse (Figueredo et al., in prep.). A fotossíntese é influenciada pelo estresse
nutricional (Parkhill et al., 2001) e a eficiência do PSII pode ser usada para detectar, por
exemplo, a limitação de nutrientes (Kromkamp & Peene, 1999). Em estudo realizado
por Berges et al. (1996), a escassez de nitrogênio afetou o número de centros de reação
apenas do PSII enquanto alguma alteração nos centros de reação do PSI só foi
observada em células com limitação de ferro. O declínio do rendimento quântico
potencial é um bom indicador de dano fotoinibitório causado pela luz em condições de
estresse ambiental, e um aumento da fluorescência mínima é uma característica de
destruição de centros de reação do PSII (Bolhàr-Nordenkampf, 1989).
Os métodos que utilizam a fluorescência PAM são bastante úteis para se medir
as taxas fotossintéticas e de acordo com Genty et al. (1989), as medidas de
49
fluorescência de plantas são muito relacionadas às medidas do metabolismo
fotossintético por carbono (método de 14C) e por trocas gasosas (produção de oxigênio).
O estudo realizado por Parkhill et al. (2001) comparou a eficiência da fluorimetria PAM
e de uma metodologia fluorimétrica convencional (onde é utilizado o inibidor DCMU
para fechar os centros de reação e o registro de Fm é feito em um fluorímetro
convencional). Para os autores, houve uma forte correlação positiva entre os dados
produzidos pelos dois métodos e mostraram que as respostas do rendimento quântico
potencial em conseqüência das condições nutricionais podem ser obtidas por ambas as
técnicas sem nenhuma vantagem de uma em relação à outra.
Schreiber et al. (1995) realizaram medidas de fluorescência na alga verde
Ankistrodesmus braunii e concluíram que as medidas de rendimento quântico efetivo
são uma medida da eficiência do PSII não apenas de folhas e cloroplastos isolados, mas
sim de alga verde unicelular como o caso da espécie estudada. Figueredo (2007)
utilizou a fluorimetria PAM para verificar o efeito do inibidor DCMU em três
concentrações diferentes nas taxas fotossintéticas de algas verdes. Segundo o autor, essa
técnica permitiu detectar diferenças na capacidade fotossintética entre os tratamentos e
entre estes e o controle.
Os resultados obtidos permitiram observar que ambas as espécies tiveram
tendências semelhantes na capacidade fotossintética dentre as fontes nitrogenadas
estudadas. Em relação às fontes inorgânicas, houve uma maior taxa de transporte de
elétrons (ETR), isto é, eficiência fotossintética, em nitrato do que em amônio tanto para
A. gracilis quanto para M. panniformis. Segundo Berges et al. (1996), a limitação de
nitrogênio afeta a fotossíntese pela redução da eficiência de energia absorvida devido à
perda de clorofila a e aumentos na atividade de pigmentos não-fotoquimicamente
ativos. Os autores ainda afirmam que a limitação de nitrogênio afeta a conversão de
energia fotoquímica pela redução na síntese protéica (proteínas do cloroplasto e dos
centros de reação dos PSI e PSII). Esse fato foi confirmado em A. gracilis que
apresentou maior capacidade fotossintética em nitrato, e maior concentração de proteína
no mesmo tratamento em comparação com o amônio. Não foi possível fazer a mesma
análise para a cianobactéria M. panniformis que apresentou resultados similares de
concentração de proteínas.
50
Dentre as fontes de nitrogênio orgânico, as duas espécies apresentaram maiores
capacidades fotossintéticas em glicina do que em arginina. No caso da clorófita A.
gracilis, pode-se observar queda na ETR em PAR mais elevada em arginina. Nesta
condição de crescimento, a alga poderia estar mais sensível a níveis aumentados de luz,
devido à mudanças no seu metabolismo como a perda de pigmentos acessórios ou
aumento na atividade de pigmentos não-fotoquimicamente ativos (Berges et al., 1996).
O efeito inibitório do cobre ao PSII, por medidas de ETR, foi avaliado em Chlorella
vulgaris, Selenastrum capricornutum e Chlamydomonas reinhardtii usando a
fluorimetria PAM (Juneau et al., 2002). De acordo com os autores houve efeitos
inibitórios variáveis entre as espécies, mas o cobre em altas concentrações inibiu
completamente o transporte de elétrons pelo PSII.
Em relação aos tratamentos com uréia, não foram observadas diferenças nas
capacidades fotossintéticas entre uréia com níquel e apenas uréia para A. gracilis e M.
panniformis. Esse resultado reforça mais uma vez que as espécies estudadas não exigem
a adição de níquel para o crescimento e realização fotossintética em uréia, e que elas
metabolizam a uréia pela ação de uma enzima que não necessita de níquel, a ATP uréia
amidolase.
Segundo Gillor et al. (2003), os dados de fluorescência reforçam uma
preferência dos microrganismos fotossintéticos pelas fontes de nitrogênio inorgânico,
embora muitos deles tenham a capacidade de utilizar uma variedade de fontes orgânicas
para o crescimento. Em nosso estudo, não é possível fazer uma comparação nas
capacidades fotossintéticas entre os tratamentos inorgânicos e orgânicos, pois esses
experimentos não foram montados ao mesmo tempo, e as condições experimentais não
foram exatamente as mesmas entre os tratamentos.
51
6 - Conclusões
De maneira geral, as duas espécies estudadas, Ankistrodesmus gracilis e
Microcystis panniformis, foram capazes de crescer em todas as fontes nitrogenadas
inorgânicas e orgânicas pesquisadas.
A taxa de crescimento de ambas as espécies foi superior no amônio do que no
nitrato e teve variações dentre as fontes orgânicas. A densidade celular final foi bem
superior no nitrato do que no amônio, e em relação às fontes orgânicas, variou pouco
sendo os valores mais próximos do nitrato.
A concentração de clorofila a foi superior em glicina nas duas espécies, e teve
pouca variação nos outros tratamentos.
As concentrações de carboidratos e proteínas tiveram tendências semelhantes
para a microalga e para a cianobactéria. Em síntese, o conteúdo de carboidratos foi
superior nas fontes orgânicas, enquanto o conteúdo de proteínas foi superior nas fontes
inorgânicas, exceto para A. gracilis em amônio.
A cianobactéria M. panniformis foi capaz de sintetizar microcistinas em todas as
fontes de nitrogênio. A concentração intracelular dessa toxina variou consideravelmente
entre os tratamentos, com valores mais elevados em amônio e uréia, com e sem níquel.
A partir dos nossos resultados, parece que os três parâmetros estudados são
sensíveis para medir a capacidade fotossintética, com melhores análises de ETR e de
rendimento quântico efetivo. As medidas de rendimento quântico potencial foram
menos sensíveis devido à maior sobreposição dos resultados em conseqüência do
elevado desvio-padrão entre os dados.
Em relação a todos os parâmetros estudados neste trabalho, ficou evidenciada a
semelhança entre os dados nos tratamentos de uréia com e sem níquel. Desse modo,
conclui-se que as espécies de microalga e de cianobactéria estudadas não necessitam de
níquel na utilização da uréia, e que ambas as espécies parecem metabolizar a uréia pela
ação de uma enzima não dependente de níquel, a ATP uréia amidolase. O uso da uréia
pelas espécies estudadas e nas nossas condições experimentais não se mostrou
vantajoso, ao contrário do que tinha sido encontrado anteriormente por outros autores.
52
7 – Referências Bibliográficas Almeida, L. M. R. 2002. Crescimento, absorção de nitrogênio e competição de duas
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8 – Anexo Tabela 11: Meio WC (Guillard & Lorenzen, 1972).
Nutrientes Concentração (mg/L)Macronutrientes
CaCl2 .2H2O 36,76MgSO4 .7H2O 39,97
KH2PO4 8,71NaSiO3 .9H2O 28,42FeCl3 .6H2O 3,15
NaHCO3 12,60fonte nitrogenada*
MicronutrientesNa2EDTA 4,36
CuSO4 .5H2O 0,01ZnSO4 .7H2O 0,022CoCl2 .6H2O 0,01MnCl2 .4H2O 0,18
Na2MO4 .2H2O 0,006H3BO3 1,00
NiSO4 . 6H2O** 0,198
VitaminasTiamina 0,10Biotina 0,0005
Cianocobalamina 0,0005
*Fonte nitrogenadaNaNO3 85,01NH4CL 27,00
C6H14N4O2 43,50C2H5NO2 75,00
NH2CONH2 30,00
(*) apenas uma das fontes utilizada em cada tratamento. (**) apenas adicionado em um dos tratamentos (ver texto).
