AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Helicobacter pylori E

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Helicobacter pylori E

CITOTÓXICA in vitro DE EXTRATOS ORGÂNICOS OBTIDOS DAS

FOLHAS DE Encholirium spectabile E Syzygium cumini.

GABRIELA MEDEIROS ARAÚJO

NATAL/RN Março de 2014

GABRIELA MEDEIROS ARAÚJO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Helicobacter pylori E CITOTÓXICA in vitro

DE EXTRATOS ORGÂNICOS OBTIDOS DAS FOLHAS DE Encholirium

spectabile E Syzygium cumini.

Orientador: Professor Doutor José Veríssimo Fernandes

Coorientadora: Professora Doutora Vânia Sousa Andrade

2014

NATAL – RN

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em

Ciências Biológicas da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como

requisito parcial à obtenção do grau de

Mestre em Ciências Biológicas.

Araújo, Gabriela Medeiros. Avaliação da atividade anti-Helicobacter pylori e citotóxica in vitro deextratos orgânicos obtidos das folhas de Encholirium spectabile ESyzygium cumini / Gabriela Medeiros Araújo. - Natal, 2014. 78f: il.

Coorientadora: Profa. Dra. Vânia Sousa Andrade. Orientador: Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande doNorte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação emCiências Biológicas.

1. Atividade antimicrobiana - Dissertação. 2. Citotoxicidade in vitro -Dissertação. 3. Helicobacter pylori - Dissertação. I. Andrade, VâniaSousa. II. Fernandes, José Veríssimo. III. Universidade Federal do RioGrande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE01 CDU 579.84

Catalogação da Publicação na FonteUniversidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Dedico este trabalho a:

Meus pais,

Edjane Araújo e Jacó Araújo (In memoriam)

Meu companheiro,

Ruy Lima.

Meus tesouros.

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é

senão uma gota de água no mar. Mas o mar

seria menor se lhe faltasse uma gota”.

Madre Teresa de Calcutá

Agradeço:

A Deus, por acompanhar e iluminar minha vida, inclusive a acadêmica,

sempre fortalecendo o que há de melhor em mim;

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (PPgCB) da UFRN

pelo suporte oferecido durante a realização do mestrado;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

pela concessão da bolsa de mestrado;

À Fundação de Apoio à Pesquisa do Rio Grande do Norte (FAPERN), pelo

financiamento deste projeto;

À UFRN e aos professores do PPgCB, Eliza Freire, Gilberto Corso, Hugo

Rocha, Jomar Jardim, Josélio Araújo, José Veríssimo Fernandes, Maria Celeste

de melo, Renato Motta, Umberto Fulco e Vanessa Rachetti.

À secretária do PPgCB, Louise da Mata, pelo suporte oferecido ao longo

desse período;

À professora Vânia Sousa Andrade, pelo acolhimento, ensinamentos,

conselhos e confiança depositados em mim ao longo desses quatro anos de

parceria em pesquisa, minha “mãe científica”;

Ao professor José Veríssimo Fernandes, pela orientação neste mestrado,

estando à disposição para ajudar sempre que necessário e pelas contribuições

durante a correção da dissertação;

Às professoras Manuela Carvalho e Vanessa Rachetti, por terem aceitado o

convite como membros da banca de minha qualificação e pelas correções

apontadas;

Às professoras Natália Saraiva e Vanessa Rachetti, por aceitarem compor

minha banca de defesa e pelas sugestões propostas para a melhoria do

trabalho;

A todos os “colegas-amigos” do Laboratório de Micologia Médica e

Ambiental (LAMEA), Raíza Guerra, Luíza Xavier, Élita Morais, Diego Rebouças,

Leandro Dantas, Jéssica Campos e Nayara Martins, pela amizade, bons

momentos e por me ajudarem em todas as etapas da execução dos ensaios aqui

apresentados, além de tornarem meu mestrado mais extrovertido e animado.

À professora Renata Mendonça, pela supervisão e auxílio nas etapas de

obtenção dos extratos e a todos os componentes do LISCO (Laboratório de

Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos), Anne Natália, Deusielly Avelar,

Gizely Cavalcante, Jéssica Santana, Marcela Pontes, Nara Frutuoso, Rusceli

Diego, Sheeza Duarte, Taiannie Soriano e Vanessa Araújo pela ajuda durante

o processo de extração;

Ao professor Kleber Farias pela colaboração nesse projeto ao realizar o

teste de citotoxicidade;

A todos os funcionários do Departamento de Microbiologia e

Parasitologia da UFRN;

Aos colegas de mestrado, Alessandra, Aline, Daniel, Diego, Jaqueline,

João Gabriel, José Hilário, Larissa, Marana, Marcos, Marília, Michael, Miguel,

Raliny, Sara e Thiago, pelos bons momentos.

A Hélio dos Anjos, pela ajuda na coleta do material vegetal;

Aos membros da Coleção de Cultura de Campylobacter da FIOCRUZ, Sheila

Duque, Ana Luzia Filgueiras, Wagner Esteves, Gabriella Carneiro e Jacqueline

Thomé, pelo treinamento realizado;

Aos meus pais, Edjane e Jacó (In memoriam), pela educação recebida,

pela construção do meu caráter e pelo apoio incondicional em todas as etapas

da minha vida;

Ao meu companheiro, Ruy Lima, por todo suporte, amor e compreensão ao

longo dessa etapa;

A todos que colaboraram, direta ou indiretamente,

com este trabalho, minha sincera gratidão!

RESUMO

A Helicobacter pylori é uma bactéria espiralada, Gram negativa, móvel e

microaeróbia reconhecida como uma das principais causas de gastrite, úlcera, câncer

gástrico e do linfoma de células B de baixo grau de tecido linfoide associado à mucosa

(MALT), se constituindo um microrganismo em destaque na área da microbiologia

médica. Sua importância se deve à dificuldade de tratamento, devido à necessidade do

uso concomitante de vários medicamentos além do crescente surgimento de cepas

resistentes e multirresistentes aos antibióticos empregados na clínica. Com o intuito de

ampliar a gama de opções terapêuticas eficazes e seguras, ultimamente, vem sendo

intensificados estudos químicos sobre plantas medicinais, seja através da obtenção de

extratos, frações, compostos isolados ou óleos essenciais que apresentem algum tipo

de atividade biológica. Diante do exposto, objetivouse avaliar a atividade inibitória de

extratos vegetais oriundos do Syzygium cumini e Encholirium spectabile, plantas com

histórico de ação antiúlceras, e do óleo essencial obtido do S. cumini frente a H. pylori

(ATCC 43504) utilizando a técnica de difusão em disco, para avaliação qualitativa, e a

determinação da concentração inibitória mínima (CIM), através da técnica de

microdiluição em caldo, para análise quantitativa. Também foi avaliada a toxicidade in

vitro dos extratos a partir de ensaio hemolítico, utilizando eritrócitos de carneiro, e em

cultura de células HeLa e VERO, pelo ensaio colorimétrico de viabilidade celular

utilizando o MTT. Os extratos de ambos vegetais empregados nos ensaios

antimicrobianos não inibiram o crescimento bacteriano, em contrapartida o óleo

essencial do S. cumini (SCFO) mostrouse eficaz, exibindo CIM de 205 μg/mL (diluição

equivalente a 0,024% do óleo bruto). Quanto ao ensaio hemolítico, o mesmo óleo ainda

exibiu toxicidade intermediária ao promover 25% de hemólise a 1000 μg/mL. Em relação

à citotoxicidade em cultura de células, o SCFO, a 260 μg/mL, comprometeu a viabilidade

celular de cerca de 80% das células HeLa e 50% das células VERO. Portanto o óleo

obtido das folhas do S. cumini apresenta potencial antibacteriano frente a H. pylori e

potencial citotóxico, sugerindose uma fonte de novas moléculas candidatas a fármacos,

desde que novas etapas de toxicidade in vitro e in vivo assim como caracterização

química sejam avaliadas. Além disso, o desenvolvimento de um sistema de liberação de

fármacos pode resultar em um protótipo a ser utilizado em testes préclínicos.

Palavraschave: Atividade antimicrobiana. Citotoxicidade in vitro. Encholirium

spectabile. Helicobacter pylori. Óleo essencial. Syzygium cumini.

ABSTRACT

Helicobacter pylori is a spiral, Gram negative, mobile, and microaerophilic

bacteria recognized as a major cause of gastritis, ulcer, gastric cancer, and gastric low

grade, Bcell, mucosa–associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma, constituting an

important microorganism in medical microbiology. Its importance comes from the

difficulty of treatment because the requirement of multiple drugs use, besides the

increasing emergence of resistant and multiresistant strains to antibiotics used in the

clinic. In order to expand safe and effective therapeutic options, chemical studies on

medicinal plants by obtaining extracts, fractions, isolated compounds or essential oils

with some biological activity has been intensified. Given the above, the objective was to

evaluate the inhibitory activity of organic extracts derived from Syzygium cumini and

Encholirium spectabile, with antiulcer history, and the essential oil, obtained from S.

cumini, against H. pylori (ATCC 43504) by the disk diffusion method, for qualitative

evaluation, and determination of minimum inhibitory concentration (MIC) using the broth

microdilution method, for quantitative analysis. Also was evaluated the extracts in vitro

toxicity by a hemolytic assay using sheep red blood cells, and VERO and HeLa cells

using the MTT assay to analyze cell viability. The extracts of both plant used in

antimicrobial assays did not inhibit bacterial growth, however the essential oil of S.

cumini (SCFO) proved effective, showing MIC value of 205 μg/mL (0.024 % dilution of

the original oil). In the hemolytic assay, the same oil shows moderate toxicity, by promote

25% hemolysis at 1000 μg/mL. Regarding the cytotoxicity in cell culture, the SCFO, at

260 μg/mL, affected the cell viability around 80% of HeLa and 50% of VERO cells. So

the oil obtained from S. cumini leaves has antimicrobial activity against H. pylori and

cytotoxicity potential, suggesting a source of new molecule drug candidates, since new

stages of toxicity in vitro and in vivo, as well, chemical characterization be evaluated.

Moreover, the development of a prospective drug delivery system can result in a

prototype to be used in preclinical tests.

Keywords: Antimicrobial activity. Encholirium spectabile. Essential oil.

Helicobacter pylori. in vitro cytotoxicity. Syzygium cumini.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 11

LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 12

LISTA DE SIGLAS .................................................................................................... 13

1. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................. 15

1.1. Helicobacter pylori ..................................................................................... 15

1.1.1. BREVE HISTÓRICO .............................................................................. 15

1.1.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E FISIOLÓGICAS ................. 16

1.1.3. PATOGÊNESE ...................................................................................... 17

1.1.4. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS ........................................................ 19

1.1.5. DESENVOLVIMENTO DE DOENÇAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO ... 21

1.1.6. DIAGNÓSTICO DE ROTINA E LABORATORIAL ................................. 24

1.1.7. TRATAMENTO E RESISTÊNCIA .......................................................... 25

1.1.8. EFEITOS COLATERAIS E REFRATARIEDADE ................................... 28

1.2. Terapêutica alternativa .............................................................................. 29

1.2.1. PRODUTOS DE ORIGEM NATURAL ................................................... 29

1.2.2. PLANTAS MEDICINAIS ........................................................................ 31

1.2.3. ÓLEOS ESSENCIAIS ............................................................................ 33

1.3. Syzygium cumini ........................................................................................ 34

1.3.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS ...................................................... 34

1.4. Encholirium spectabile .............................................................................. 36

1.4.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS ...................................................... 36

2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................. 38

3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 39

3.1. Objetivo geral ............................................................................................. 39

3.2. Objetivos específicos ................................................................................ 39

4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 40

4.1. Material vegetal .......................................................................................... 40

4.1.1. Syzygium cumini .................................................................................... 40

4.1.1.1. Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática ............. 40

4.1.1.2. Partição do extrato etanólico ........................................................... 41

4.1.1.3. Obtenção do óleo essencial ............................................................ 41

4.1.1.4. Obtenção do extrato aquoso por decocção .................................... 41

4.1.2. Encholirium spectabile ........................................................................... 42

4.1.2.1. Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática ............. 42

4.1.2.2. Obtenção dos extratos orgânicos em Soxhlet ................................. 42

4.2. Microrganismo e meio de cultura ............................................................. 43

4.2.1. TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO .......................................................... 43

4.2.2. CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)..................................... 45

4.3. Ensaio hemolítico....................................................................................... 47

4.4. Citotoxicidade em cultura de células ....................................................... 48

5. RESULTADOS ................................................................................................... 50

5.1. Rendimento dos extratos e óleo essencial .............................................. 50

5.2. Avaliação anti-Helicobacter pylori dos extratos e óleo essencial ......... 50

5.3. Atividade hemolítica do óleo essencial do S. cumini ............................. 53

5.4. Atividade citotóxica in vitro do óleo essencial do S. cumini ................. 54

6. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 56

7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 66

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 67

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Micrografia eletrônica de varredura da bactéria H. pylori (laranja) no epitélio gástrico, aumento de 5000x (Fonte: Steve Gschmeissner Science Photo Library). ..................................................................................................................... 16

Figura 2. Formação da úlcera gástrica a partir da infecção pela H. pylori. Passagem pela camada de muco, destruição das células epiteliais, migração leucocitária e desenvolvimento de úlcera (Fonte: Somerville, Custom Medical Stock – Science Photo Library). ........................................................................................................... 22

Figura 3. Endoscopia evidenciando: a) parede inflamada do estômago devido a gastrite causada pela H. pylori e b) úlcera gástrica sangrando e adenocarcinoma (ao centro), amostra positiva para H. pylori (Fonte: GASTROLAB / Science Photo Library). ..................................................................................................................... 23

Figura 4. Elementos básicos do metabolismo primário em relação ao metabolismo secundário de plantas (Fonte: Adaptado de García; Carril, 2009). ........................... 30

Figura 5. Syzygium cumini. a) Exemplar localizado no campus central da UFRN; b) Folhas, flores e frutos imaturos e maduros; c) Flores e d) Fruto maduro (Fonte: Arquivo próprio). ........................................................................................................ 35

Figura 6. Encholirium spectabile. a) Exemplar localizado em área rural no município de São José do Seridó/RN; b) Folha; c) Inflorescência seca (Fonte: Arquivo próprio. .................................................................................................................................. 36

Figura 7. Representação da distribuição das diluições, em porcentagem, realizadas na microdiluição em caldo em placa de 96 poços. .................................................... 46

Figura 8. Redução do cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio ao formazam (Adaptado de Opwis et al., 2012). ................................................................................................... 46

Figura 9. Representação da distribuição das concentrações, em μg/mL, na microdiluição em caldo para o óleo essencial do S. cumini. ..................................... 47

Figura 10. Halo inibitório do SCFO, a 25, 50 e 100%, frente o crescimento da H. pylori. ......................................................................................................................... 52

Figura 11. CIM do SCFO (delimitado pelo retângulo vermelho) frente o crescimento da H. pylori pela técnica de microdiluição em caldo. ................................................. 53

Figura 12. Percentual de hemólise induzida por diferentes concentrações do óleo essencial extraído das folhas do S. cumini (SCFO). ................................................. 54

Figura 13. Percentual de viabilidade de células HeLa tratadas com diferentes concentrações do SCFO. .......................................................................................... 55

Figura 14. Percentual de viabilidade de células VERO tratadas com diferentes concentrações do SCFO. .......................................................................................... 55

Figura 15. Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos secundários em plantas (Fonte: GobboNeto e Lopes, 2007). .................................. 58

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Prováveis mecanismos antimicrobianos dos principais grupos químicos orgânicos extraídos de vegetais. ............................................................................... 33

Tabela 2. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas do S. cumini nos discos utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes. ..................... 44

Tabela 3. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas da E. spectabile nos discos utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes. .......... 45

Tabela 4. Rendimento dos extratos do S. cumini e E. spectabile. ............................ 51

Tabela 5. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os extratos vegetais do E. spectabile. ............................................................................ 51

Tabela 6. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os extratos orgânicos e óleo essencial do S. cumini pelo teste de difusão em disco e CIM. ........................................................................................................................... 52

Tabela 7. Avaliação da toxicidade (%) do óleo essencial obtido do S. cumini pelo teste de hemólise. ..................................................................................................... 54

Tabela 8. Viabilidade (%) de células HeLa e VERO tratadas com diferentes concentrações do SCFO. .......................................................................................... 55

13

LISTA DE SIGLAS

ATCC American Type Culture Collection

BHI Brain heart infusion, caldo de infusão de coração e cérebro

CC Controle crescimento

CIM Concentração inibitória mínima

CLSI Clinical and Laboratory Standart Institute

CN Controle negativo

CP Controle positivo

CTT Cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio

DMSO Dimetilsulfóxido

ESFCq Encholirium spectabile folhas clorofórmio extração a quente

ESFE/Af Encholirium spectabile folhas 50% etanol/ 50% água extração a frio

ESFEf Encholirium spectabile folhas etanol extração a frio

ESFHf Encholirium spectabile folhas hexano extração a frio

ESFHq Encholirium spectabile folhas hexano extração a quente

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

IL1 Interleucina1

IL8 Interleucina8

INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde

MALT Mucosa-associated lymphoid tissue

MTT Brometo de 3(4,5dimetiltiazol2il)2,5difenil tetrazólio

NA Não avaliado

PBP Penicillin-binding proteins, proteínas ligantes de penicilinas

PBS Phosphate buffered saline, tampão fosfato salino

SCFAq Syzygium cumini folhas aquoso quente

SCFE/AE Syzygium cumini folhas etanol fração acetato de etila

SCFE/AQ Syzygium cumini folhas etanol fração aquosa

SCFE/C Syzygium cumini folhas etanol fração clorofórmica

SCFE/H Syzygium cumini folhas etanol fração hexânica

SCFE Syzygium cumini folhas etanol

SCFH/E Syzygium cumini folhas hexano aproveitadas com etanol

SCFH Syzygium cumini folhas hexano

14

SCFO Syzygium cumini folhas óleo essencial

TD1 Solução aquosa de Tween 80 a 1% e DMSO a 1%

TNFα Fator de necrose tumoral alfa

TSA Trypticase soy agar, agar triptona de soja

TSB Trypticase soy broth, caldo triptona de soja

15 Araújo, G.M. Avaliação da atividade anti-Helicobacter...

1. REFERENCIAL TEÓRICO

1.1. Helicobacter pylori

1.1.1. BREVE HISTÓRICO

Relatos da ocorrência de uma bactéria na mucosa estomacal datam desde

1893, quando Bizzozero observou a presença de espiroquetas nas células parietais

e glândulas gástricas de cachorros (DOENGES, 1938). Desde então, outros

trabalhos relacionaram lesões gástricas com a presença de uma bactéria espiralada,

até que em 1983, Warren e Marshall, pesquisadores australianos posteriormente

ganhadores de Nobel de Medicina em 2005 (WEYDEN et al., 2005), reuniram 135

espécimes de biópsias gástricas com presença de bacilos curvos em formato de “S”.

Marshall ainda observou que cerca de metade dos pacientes que realizaram os

procedimentos de gastroscopia ou biópsia mostraram colonização bacteriana no

estômago. Em novo trabalho, publicado em 1984, Marshall e Warren realizaram

biópsia gástrica de pacientes que ao exame endoscópico e histopatológico

apresentavam lesões ulcerativas, e conseguiram finalmente cultivar in vitro a

bactéria inicialmente denominada Campylobacter pyloridis (MARSHALL; WARREN,

1984).

A bactéria foi descrita como bacilos curvos ou espiralados, Gram negativos,

com presença de flagelos unipolares, produtores das enzimas catalase, urease,

produtores de sulfeto e microaerófilos (MARSHALL; WARREN, 1984).

Após análises morfológicas ultraestruturais da bactéria, ficou evidenciado que

a membrana da parede celular é regular, apresenta múltiplos flagelos, revestidos

com bainha, os quais são dispostos em uma única extremidade, apresentam bulbo

flagelar e quando agitados em caldo in vitro apresentam glicocálix em abundância.

Todas as características citadas não correspondem àquelas ocorrentes no gênero

Campylobacter. Além disso, a análise dos ácidos graxos, menaquinonas,

características de crescimento in vitro, capacidade enzimática e sequenciamento do

ácido ribonucleico da Campylobacter pylori levaram a uma nova proposta de gênero,

Helicobacter, passando a ser nomeada de Helicobacter pylori (GOODWIN et al.,

1989).


1.1.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E FISIOLÓGICAS

A H. pylori apresentase como uma bactéria complexa devido às condições

adversas que encontra para colonizar o hospedeiro. É descrita como uma

espiroqueta ou bacilo curvo, Gram negativa (figura 1), que não oxida ou fermenta

açúcares, sendo considerada microaeróbia (10% CO2, 5% O2, 85% N2), móvel, não

esporulada e mesófila. Ainda reage positivamente aos testes de urease, catalase e

peroxidase e é produtora de enzimas como mucinase, lipase e arginase. A bactéria

mede em torno de 0,1 a 0,5 μm de largura e 3 μm de comprimento, apresentando

superfície lisa e extremidades arredondadas, com presença de vários flagelos

unipolares. Ainda pode possuir sistema de secreção tipo IV pelo qual injeta, no

citoplasma da célula hospedeira, duas proteínas principais, uma proteína

vacuolizante e uma citotoxina, que atuam no processo infeccioso (KONEMAN et al.,

2012).

Figura 1. Micrografia eletrônica de varredura da bactéria H. pylori (laranja) no epitélio gástrico, aumento de 5000x (Fonte: Steve Gschmeissner Science Photo Library).

Coloniza a mucosa gástrica normalmente e, em alguns casos, pode ser

isolada de área de metaplasia gástrica no duodeno, importante fator na patogênese

da úlcera péptica duodenal. Já a ocorrência em área de metaplasia intestinal é rara

(LADEIRA et al., 2003).


1.1.3. PATOGÊNESE

Para sobreviver ao ambiente gástrico e romper a barreira protetora da

camada de muco, a H. pylori deve ser capaz de inibir a acidez do suco gástrico, ser

móvel, produzir enzimas que ajudem na degradação da camada de muco e aderir à

superfície epitelial. Quando a bactéria é capaz de executar essas etapas é iniciado o

processo inflamatório local, que somado às lesões celulares culmina no

desenvolvimento da gastrite, podendo gerar úlceras ou até o câncer gástrico.

Após ser adquirida através da via oral, a H. pylori chega ao estômago e

rapidamente inicia a produção da urease. A urease é uma enzima com peso

molecular entre 500 e 600 KDa que age catalisando a hidrólise da ureia gerando

amônia e dióxido de carbono [(NH2)2CO + H2O → CO2 + 2NH3] sendo essencial para

o processo inicial de colonização (EATON et al., 1991; WEEKS et al., 2000). A

amônia, quando secretada, interage com os prótons liberados pelas células parietais

presentes nas glândulas gástricas ocasionando, consequentemente, o aumento do

pH nas áreas próximas à membrana externa da bactéria. A maior parte da urease

produzida fica no citoplasma bacteriano ou no espaço periplasmático, enquanto que

pequena quantidade é lançada no espaço extracelular. Desse modo, a ureia deve

entrar na célula para que a enzima possa atuar com maior eficiência (PHADNIS et

al., 1996).

Para controlar a entrada e saída da ureia do citoplasma bacteriano, é

codificada, a partir do gene ureI, uma proteína transmembranar (proteína UreI)

sensível à alterações de pH. À medida que a bactéria encontrase exposta a menor

pH, ocorre maior expressão do gene ureI, com consequente aumento na

permeabilidade à ureia. Logo, a ureia, proveniente dos alimentos em processo de

digestão, é importada para o citoplasma bacteriano onde serve de substrato para a

enzima ali presente. Do mesmo modo, à medida que o pH aumenta, é diminuída a

expressão desse gene com consequente redução da permeabilidade à ureia,

prevenindo acúmulo tóxico de ureia no citoplasma bacteriano, evitando assim a

alcalinização do ambiente intracelular. À medida que se aproxima da camada de

muco, a produção de urease é reduzida para evitar gasto energético, visto que o pH

nesta região é próximo do neutro, condizente com a necessidade bacteriana

(WEEKS et al., 2000).


Quando chega à camada de muco, os flagelos assumem um importante papel

na colonização, que consiste em promover a motilidade da célula bacteriana para

que haja a passagem por essa camada composta por água, eletrólitos e

glicoproteínas (EATON et al., 1992; OTTEMANN; LOWENTHAL, 2002). O formato

helicoidal da célula juntamente com a polarização dos flagelos provê à bactéria

movimentos circulares em torno do próprio eixo, permitindoa penetrar na camada

de muco. Adicionalmente, mucinases e lipases são secretadas promovendo a

degradação dos componentes do muco facilitando o acesso à camada epitelial

(YOSHIYAMA; NAKAZAWA, 2000; LADEIRA et al., 2003).

Outra importante barreira encontrada pela H. pylori é a camada epitelial, na

qual deve se fixar para poder colonizar o ambiente gástrico. A adesão à superfície

estomacal ocorre através da interação entre lectinas da membrana bacteriana e

oligossacarídeos das glicoproteínas de membrana das células epiteliais gástricas.

Particularmente duas proteínas, a BabA e SabA, destacamse com ação de adesina

(BALDWIN et al., 2007).

A ligação da H. pylori na superfície das células epiteliais gástricas (CEG) é

caracterizada pela perda das microvilosidades, formação do suporte de ligação entre

as células, rearranjo dos filamentos de actina do citoesqueleto e fosforilação de

proteínas hospedeiras no local da adesão alterando a superfície do epitélio de

revestimento gástrico (SEGAL et al., 1996).

Algumas cepas de H. pylori (cag+ ou tipo I) apresentam uma ilha de

patogenicidade, denominada cagPAI, que contém como marcador o gene cagA

(citotoxin associated gene A). Essa ilha apresenta alguns genes homólogos aos do

sistema de secreção tipo IV, sendo esses genes codificadores de proteínas

específicas que formam uma estrutura tubular que interage com a membrana da

célula hospedeira, formando uma estrutura similar a um pili. Logo, a H. pylori cag+ é

capaz de secretar proteínas efetoras no citoplasma da célula hospedeira, desde que

possua um receptor específico na superfície desta. Dentre as substâncias que a

bactéria secreta por esse canal, destacamse as proteínas CagA e VacA que são

importantes fatores de virulência da bactéria (ODENBREIT et al., 2000; BOURZAC;

GUILLEMIN, 2005).


Durante a ativação de genes bacterianos no processo de infecção crônica,

pode ser codificada a proteína efetora CagA, citotoxina associada à antígeno, que

atua no citoplasma da célula hospedeira. Esta proteína está principalmente

relacionada à ativação das vias de proliferação celular e inibição das vias que

promovem a apoptose da célula infectada (OLBERMANN et al., 2010).

Outra proteína secretada pela bactéria é a VacA. Também atua

intracelularmente sendo transportada pelo sistema de secreção citado acima. Esta

toxina, expressa em todas as cepas de H. pylori, é uma formadora de poros que

pode causar várias alterações nas células epiteliais. Entre suas ações, destacamse

a vacuolização celular, a despolarização do potencial de membrana, alteração na

permeabilidade da membrana mitocondrial, apoptose, ativação de proteínas

quinases ativadoras de mitógenos, inibição da apresentação de antígenos

(GANGWER et al., 2010). Além disso, ainda inibe a ativação e proliferação de

células T induzindo imunossupressão local (GEBERT et al., 2003).

Tem sido relatada uma regulação complexa entre as proteínas CagA e VacA

a qual permite que haja redução na inflamação da mucosa com consequente

diminuição de danos nas células gástricas epiteliais, facilitando o processo de

colonização crônica no estômago pela bactéria (GANGWER et al., 2010).

1.1.4. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS

Distribuída mundialmente, a infecção pela H. pylori mantem índices variantes

de acordo com os países ou com as populações de um mesmo país. Estimase que

cerca de metade da população mundial seja portadora da bactéria, tornandoa um

agente etiológico de importância pública, em virtude dos índices significantes de

morbidade e mortalidade (AGUILAR et al., 2001). No Brasil, é estimado que 70%

da população seja portadora da bactéria (INCA, 2014). Zhang et al. (2011) sugerem

que dos 50% de portadores da bactéria estimados mundialmente, 10% irão

desenvolver úlceras pépticas e 1% serão acometidos por doenças gástricas

malignas.

A prevalência da infecção está associada às condições socioeconômicas,

sendo maior em países em desenvolvimento e com condições sanitárias restritas

(WHO, 1999). A maior taxa de casos concentrase em adultos, entretanto crianças a


partir de dois anos já foram identificadas como estando colonizadas pela bactéria

(SUERBAUM; MICHETTI, 2002). Já chegou a ser detectada, por métodos de

diagnósticos não invasivos, a ocorrência de infecção em 84% de crianças com 30

meses de idade em uma região do Gambia, na África ocidental (THOMAS et al.,

1999).

No Brasil, alguns índices de infecção por H. pylori, em pacientes adultos

sintomáticos, foram relatados como 90,72% em Belém/PA (VINAGRE et al., 2013);

43,61% em Marília/SP (SUZUKI et al., 2013); 9,68% em São Paulo/SP (MARQUES

et al., 2011), 78,9% em Monte Negro/RO (RIBEIRO et al., 2010). Devese ressaltar

que esses números podem não representar a real prevalência no país, tendo em

vista que o Brasil apresenta grande extensão territorial com diferentes climas, além

de que esse microrganismo não está entre os agentes infecciosos de notificação

compulsória do sistema de saúde nacional.

Em relação ao câncer gástrico, a ocorrência de tumores no Brasil está em

terceiro lugar na incidência entre homens e em quinto entre as mulheres, sendo a

prevalência dos casos em homens, por volta dos 70 anos. A estimativa de novos

casos é de 20.390 para 2014, tendo ocorrido 13.328 casos de morte em 2011 por

essa neoplasia. O câncer gástrico é de causalidade multifatorial, logo esses dados

não refletem a incidência da infecção pela bactéria, mas servem como suporte para

estimativas (INCA, 2014).

Os modos de aquisição da bactéria mais aceitos são através da ingestão de

água ou alimentos contaminados ou pessoapessoa, pelas vias oraloral, fecaloral

ou gástricaoral. A aquisição da bactéria está intimamente relacionada à transmissão

na infância por contato com familiares portadores (MENDALL; NORTHFIELD, 1995;

WEYERMANN et al., 2006). Apesar de também infectar alguns primatas não

humanos e outros animais, ainda não se sabe de transmissão de animais para

humanos (STONE, 1999; SUERBAUM; MICHETTI, 2002). Além disso, também há

risco de transmissão iatrogênica da bactéria, sendo a endoscopia o meio mais

comum, isto quando o equipamento não recebe o procedimento correto de

higienização e esterilização (LANGENBERG et al., 1990; TYTGAT, 1995).


1.1.5. DESENVOLVIMENTO DE DOENÇAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO

A infecção aguda é normalmente assintomática podendo ser associada a dor

epigástrica, distensão abdominal ou inchaço, arrotos, náuseas, flatulências e

halitose (MEURER; BOWER, 2002).

Após o estabelecimento da H. pylori na camada epitelial, são iniciadas

respostas inflamatórias do hospedeiro que, unidas à acidez do suco gástrico e à

amônia produzida pela bactéria, levam ao dano tecidual e consequente ocorrência

das síndromes clínicas (DIOGO FILHO, 2009).

Quando a infecção é associada ao processo inflamatório, à virulência da

bactéria e a fatores do hospedeiro, como, por exemplo, imunodeficiência, doenças

préexistentes e ingestão de bebidas alcoólicas, pode resultar nos quadros clínicos

clássicos de gastrite, úlceras gástricas e duodenais, câncer gástrico e ao linfoma de

células B de baixo grau de tecido linfoide associado à mucosa – MALT (AGUILAR et

al., 2001).

Quanto à reação imunológica, temse inicialmente a resposta de fase aguda

na qual a bactéria libera quimiotaxinas que estimulam a liberação de interleucina8

(IL8) pelas células epiteliais. A IL8 atua como fator próinflamatório ativando os

polimorfonucleares locais. Há também a liberação de interleucina1 (IL1) e do fator

de necrose tumoral alfa (TNFα), estes agem estimulando a produção de enzimas

proteolíticas e produção de espécies reativas de oxigênio pelos polimorfonucleares

(CRABTREE, 1996). Quando essa resposta é eficaz, não há comprometimento à

integridade do órgão e o agente causal é destruído. Entretanto, como a H. pylori

consegue escapar do processo de fagocitose, devido à presença de superóxido

dismutase (GÖTZ et al., 1996), catalase (HAZELL et al., 1991) e arginase (GOBERT

et al., 2001), o único dano gerado é frente o epitélio que fica susceptível à rupturas.

Esta lesão leva à síndrome clínica de gastrite aguda que apresenta duração de

aproximadamente duas semanas (SOBALA et al., 1991).

No caso da inflamação crônica, que é caracterizada pela gastrite de longa

duração ou gastrite crônica, ocorre a infiltração de monócitos e linfócitos no tecido

gástrico lesionado, culminando na resposta de produção de anticorpos. No caso do


estabelecimento da doença, os anticorpos não conseguem agir adequadamente na

neutralização da bactéria, havendo persistência do agente. Assim ocorre processo

semelhante ao referido na reação inflamatória aguda, conduzindo ao quadro de

gastrite crônica. Na presença de fatores de risco, como má alimentação, ingestão de

bebidas alcoólicas, tabagismo, condições de imunossupressão, entre outros, além

de fatores de virulência bacterianos, pode haver evolução para quadros mais graves

(BODGER; CRABTREE, 1998; DIOGO FILHO, 2009).

Quando há interação da ação do ácido clorídrico, enzimas da digestão

gástrica e da resposta imunológica local, o dano é mais intenso e severo, surgindo

as úlceras pépticas. Nessa síndrome, ocorrem danos celulares pela liberação de

mediadores resultantes do processo inflamatório, além da exposição do epitélio,

fragilizado, à acidez do suco gástrico e à pepsina. Como a camada tecidual não

consegue ser reposta, ocorrem erosões na mucosa gástrica (figura 2) que com o

tempo e exposição ao agente tornamse profundas, causando grande desconforto

aos pacientes (LEUNG et al., 1992; DIOGO FILHO, 2009).

Figura 2. Formação da úlcera gástrica a partir da infecção pela H. pylori. Passagem pela camada de muco, destruição das células epiteliais, migração leucocitária e desenvolvimento de úlcera (Fonte: Somerville, Custom Medical Stock – Science Photo Library).

A persistência no processo inflamatório na mucosa gástrica induz danos

oxidativos que, juntamente à produção excessiva de metabólitos reativos de


oxigênio à presença da bactéria, resultam na lesão tecidual e podem ser uma das

causas do câncer gástrico (DAVIES et al., 1994).

De modo geral, o desenvolvimento do câncer (figura 3) em presença da

bactéria evolui a partir da mucosa normal, que após infectada entra em processo de

gastrite crônica até a atrófica, seguida de displasia e neoplasia (LADEIRA et al.,

2003).

Figura 3. Endoscopia evidenciando: a) parede inflamada do estômago devido à gastrite causada pela H. pylori e b) úlcera gástrica sangrando e adenocarcinoma (ao centro), amostra positiva para H. pylori (Fonte: GASTROLAB / Science Photo Library).

Durante a resposta inflamatória crônica, ocorre a produção de espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio pelas células de defesa em resposta às citocinas

liberadas e a produtos bacterianos. Os reativos de oxigênio podem induzir alteração

da expressão de protooncogenes ou gerar produtos genotóxicos capazes de

interagir com alvos moleculares no DNA. De modo geral há comprometimento no

sistema de reparo. Os reativos do nitrogênio podem induzir danos no DNA direta ou

indiretamente, seja inibindo as enzimas do sistema de reparo ou inativando o

processo de apoptose pela nitrosilação de proteínas próapoptóticas, tais como p53

e caspases, permitindo, desta forma, a sobrevivência de células com danos no DNA,

tornandoas potenciais células neoplásicas (IARC, 2014).

Nem todos os casos de câncer de estômago ocorrem em virtude da infecção

pela H. pylori, entretanto, devese atentar que este microrganismo é uma das

a) b)


principais causas desse processo patogênico. Logo, devido a seu destaque

enquanto doença, os esforços, para combater e evitar a disseminação desse

microrganismo, devem ser ampliados.

A H. pylori ainda aparece associada à outra complicação clínica: o linfoma

MALT (Mucosa-associated lymphoid tissue) de células B que é um tipo de neoplasia

de tecido linfoide associado à mucosa constituída por células pequenas e com baixo

grau de malignidade. O linfoma MALT de células B de baixo grau no estômago tem

como principal fator patogênico a infecção pela H. pylori. Tal relação tem sido

proposta visto que a remissão dos casos de linfoma chega a 70% em pacientes

portadores da bactéria e quando há o tratamento antibacteriano em estágio inicial da

neoplasia (ZULLO, 2010). Entre as neoplasias gástricas, esta é diagnosticada em

torno de 3% dos casos (INCA, 2014).

Baseado nisso é importante diagnosticar a infecção bacteriana e realizar o

tratamento imediato para evitar complicações clínicas relacionadas à

poliquimioterapia, que normalmente é longa, onerosa e de baixa eficácia.

1.1.6. DIAGNÓSTICO DE ROTINA E LABORATORIAL

De modo geral, o diagnóstico da rotina para a infecção de gastrite pela H.

pylori é mais fidedigno e considerado “padrão ouro” quando é realizada a coloração

histológica e a cultura microbiológica a partir de biópsia gástrica (THIJS et al., 1996;

CARR et al., 2012).

Para o isolamento laboratorial, a amostra clínica deve ser semeada em ágar

sangue nãoseletivo com base de triptona de soja, infusão de cérebro e coração

(BHI) ou Columbia com adição de 5% de sangue de carneiro desfibrinado e estéril.

O cultivo deve ser mantido em ambiente de microaerofilia (5% de O2, 10% de CO2 e

85% de N2), a 37ºC e pode demorar entre 2 e 5 dias para ser notado crescimento de

colônias. O crescimento é caracterizado por pequenas colônias acinzentadas e

translúcidas. Quanto à coloração pela técnica de Gram, são observados bacilos

curvos e espiralados Gram negativos. As provas bioquímicas da catalase, oxidase e

urease são positivas, sendo esta última de reação intensa (KONEMAN et al., 2012).


Na identificação histológica a especificidade e a sensibilidade são altas, já

que, além da identificação da bactéria ainda é possível avaliar o tipo e a intensidade

da inflamação da mucosa gástrica. O tecido obtido na biópsia pode ser submetido a

diferentes técnicas de coloração para que várias informações sejam coletadas.

Entretanto, é necessário um profissional bem capacitado além de uma coleta de

material correta para evitar erros que venham a prejudicar o diagnóstico (SIQUEIRA

et al., 2007).

Há também o diagnóstico não invasivo que é um modo indireto de detecção

da bactéria. Este tem ganhado adesão como método de detecção da infecção por H.

pylori devido à praticidade, rapidez do resultado, sensibilidade e especificidade

elevada e menor desconforto para o paciente. O mais específico e sensível utilizado

é o teste respiratório da ureia marcada, no qual o paciente ingere ureia marcada

com 13C e se houver a enzima urease no estômago, correlacionando à presença da

H. pylori, ocorre a conversão da ureia em amônia e gás carbônico marcado que ao

ser expirado é detectado em um equipamento (GRAHAM et al., 1987). Seguindo o

mesmo princípio temse o teste de urina com ureia marcada, no qual o paciente

ingere ureia marcada com 15N e este é detectado na urina caso haja presença da

bactéria no paciente. Outro método utilizado é a detecção de um antígeno da H.

pylori (HpSA) em amostras de fezes a partir de um imunoensaio enzimático, o qual

apresenta boa sensibilidade (90%) e especificidade (98%), sendo útil para

acompanhar a erradicação da bactéria após tratamento (ISHIHARA et al., 2000). Há

também as provas sorológicas para a detecção de anticorpos contra a bactéria, mas

esta última técnica apresenta alguns problemas de padronização de níveis basais de

positividade, visto que um paciente curado da infecção continua a produzir

anticorpos (KONEMAN et al., 2012).

1.1.7. TRATAMENTO E RESISTÊNCIA

Uma das principais problemáticas do tratamento da H. pylori vem da

dificuldade da determinação da concentração de antibiótico ativo na mucosa

gástrica. Há uma íntima relação entre a cinética do fármaco e a influência da

variação do pH local. De modo geral, os principais antibióticos utilizados para tratar a

infecção gástrica (amoxicilina, metronidazol e claritromicina) sofrem alteração em

seu tempo de meia vida de acordo com a diminuição ou aumento do pH, que varia


ao longo de 24 horas (ERAH, et al., 1997). Além disso, a concentração do

medicamento varia dependendo da região gástrica, como no antro, corpo e fundo

deste órgão (COOREMAN et al., 1993; MÉGRAUD, 1998).

O mecanismo de ação dos antibióticos empregados na rotina clínica frente a

H. pylori consiste em danificar o DNA, inibir a síntese proteica e de parede celular e

são brevemente descritas a seguir.

O metronidazol, pertencente à classe dos nitroimidazólicos, entra na célula

bacteriana e é reduzido por enzimas gerando produtos tóxicos, como a

hidroxilamina, que atuam danificando o DNA (GOODWIN et al., 1998). Os

macrolídeos, como a claritromicina, agem inibindo a síntese proteica bacteriana ao

se ligarem à subunidade 23S da porção 50S do ribossomo bacteriano, ficando

impedida a transpeptidação e translocações das futuras proteínas bacterianas. Já as

tetraciclinas, impedem a síntese proteica ao se ligarem, reversivelmente, à porção

30S do RNA ribossomal, bloqueando a ligação do RNA transportador. Por sua vez,

os βlactâmicos, como a amoxicilina, atuam ligandose à PBP (Penicillin-Binding

Proteins) interferindo na síntese correta do peptidioglicano, gerando uma parede

celular instável (ANVISA, 2014).

O uso de um supressor de ácido, em associação à terapia de erradicação da

bactéria em estágio inicial, beneficia a cicatrização de úlceras gástricas. Entretanto a

cicatrização adequada pode ser bem sucedida se o tratamento antibiótico, mesmo

sem o emprego do supressor de ácido, for correto e rápido (TREIBER; LAMBERT,

1998).

Para erradicar a bactéria de modo mais eficiente, promovendo inclusive a

redução nos casos de reinfecção, deve ser realizada a administração conjunta de

dois a três fármacos antibacterianos e um agente supressor da acidez gástrica. A

poliquimioterapia, empregada no tratamento dessa doença, é necessária pela

dificuldade de ação de fármacos no lúmen gástrico e pela aquisição de resistência

bacteriana aos antibióticos. Dessa forma, para aumentar a chance de eficácia

terapêutica é realizada a administração de dois ou mais antibióticos, principalmente

metronidazol, claritromicina, amoxicilina ou tetraciclina, associados a um inibidor da

bomba de prótons, como o omeprazol, aumentando as chances de cura e reduzindo


o surgimento de resistência aos antibacterianos (LIND et al., 1999; LOGAN et al.,

1994).

O inibidor da bomba de prótons ligase irreversivelmente à enzima K+H+

ATPase, que é responsável pela secreção de íons H+ pelas células parietais no

estômago gerando a acidez necessária para o processo de digestão gástrica. Desse

modo, com a redução da liberação de ácido pelas glândulas secretoras gástricas

ocorre menor dano à mucosa do estômago, lesionada em reação à presença da H.

pylori e do ácido clorídrico. Além dessa ação, essa classe de fármacos, composta

por omeprazol, lansoprazol, pantoprazol, rabeprazol, esomeprazol, dexlansoprazol e

tenatoprazol, ainda parece promover uma ação antiHelicobacter pylori

provavelmente pela inibição da urease ou ao ligarse a H+K+ATPase bacteriana

(BRAGA et al., 2011).

Entretanto, devese ressaltar que a realização do teste de susceptibilidade é

muito importante para a eficácia terapêutica, visto que mesmo que o tratamento seja

constituído de dois antibióticos e um inibidor da bomba de prótons, há os casos de

resistência bacteriana. Em sua publicação, Street et al. (2001) constataram que a

cura da infecção por H. pylori foi mais adequada quando o antibiótico foi

administrado após a realização do teste de susceptibilidade (99%) do que quando se

administrou inibidor da bomba de prótons com antibióticos de uso padrão

(claritromicina e amoxicilina) sem a avaliação da resistência da cepa (81%).

Casos de resistência ao tratamento realizado para a remissão desse processo

infeccioso existem e são um problema crescente e preocupante, visto a limitação no

grupo de antibióticos de escolha, além da variação de resistência da bactéria

dependendo da localização geográfica, assim como de grupos de populações

afetados (KIM et al., 2001).

Para que a bactéria suporte a elevada concentração de antibióticos e tenha

sucesso na infecção, deve desenvolver mecanismos de resistência que modifiquem

ou substituam os locais de ação dos fármacos os quais geralmente resultam na

interferência da síntese proteica (claritromicina), na síntese de parede celular

(amoxicilina) ou na replicação do DNA (metronidazol). Para tanto, ocorrem

alterações genéticas na bactéria, como mutações em nível cromossomal, aquisição


de plasmídeos de resistência ou ainda por aquisição de DNA exógeno (MÉGRAUD,

1998).

Uma das vias de resistência aos antibióticos, utilizados na rotina médica,

desenvolvida por algumas cepas de H. pylori foi detectada por Fontana et al. (2002)

e consiste na modificação da subunidade 23S do RNA ribossômico impedindo que a

claritromicina, pertencente a classe dos macrolídeos, iniba a síntese proteica

bacteriana. Foi detectado por Goodwin et al. (1998) que mutações na enzima NADP

nitroredutase podem ser responsáveis pela redução da atividade enzimática, que é

necessária para a conversão do metronidazol em sua forma atuante. Também há o

relato da resistência à amoxicilina a partir de uma mudança na PBP1 (penicillin-

binding proteins), impedindo a ligação desse βlactâmico em seu sítio de ação

(OKAMOTO et al., 2002).

Já foi relatada a presença de cepas resistentes à amoxicilina, claritromicina,

metronidazol, tetraciclina e levofloxacina em todos os continentes do planeta, sendo

exceção apenas a levofloxacina nas Américas e claritromicina na África, além da

multirresistência a dois ou mais antibióticos (DE FRANCESCO et al., 2010). Street et

al. (2001) também detectaram, ao realizar o rastreamento da sensibilidade a

antibióticos, resistência a metronidazol, claritromicina, ampicilina e tetraciclina e

ainda foi registrada resistência concomitante a claritromicina e metronidazol.

A administração inadequada dos antibióticos é um dos maiores problemas na

erradicação da bactéria, visto que devido ao tratamento empírico – sem a detecção

de resistência por antibiograma ou métodos moleculares – cepas resistentes são

expostas aos clássicos antibióticos resultando na permanência da doença,

desestimulando o paciente à continuação do tratamento.

1.1.8. EFEITOS COLATERAIS E REFRATARIEDADE

Devido aos efeitos colaterais, como cólicas abdominais, náuseas, vômitos,

diarreia e disgeusia (ANVISA, 2014), decorrentes do uso dos medicamentos

combinados que compõem a terapia, ocorre a refratariedade ao tratamento por parte

de alguns pacientes (BELL et al., 1992). Isto, unido aos casos de recidivas, do

elevado custo dos medicamentos, além da inexistência de vacinas específicas para

o microrganismo, dificulta a redução nos casos de infecção (ZHANG et al., 2011).


A falta de uma terapia eficaz e destituída de efeitos adversos, para infecções

causadas por esse patógeno, é preocupante e reforça a necessidade do

desenvolvimento de novos agentes terapêuticos mais eficazes e menos tóxicos.

Devido à dimensão das lesões gástricas, à ocorrência de resistência aos

antibióticos, à refratariedade ao tratamento atualmente empregado, além dos casos

de recidiva da doença, motivase o estudo em busca de extratos de origem natural,

especialmente fitoterápicos e fitofármacos, como uma opção em potencial para o

desenvolvimento de novas terapias eficazes. O estudo da atividade biológica de

compostos químicos obtidos de vegetais, nativos ou cultivados regionalmente,

valoriza a etnofarmacologia local, providenciando informações úteis à comunidade

científica além do esclarecimento à população sobre a segurança do uso desses

extratos.

1.2. Terapêutica alternativa

Com o advento da química e síntese orgânica, como ferramentas na obtenção

ágil e prática de rotas sintéticas, foi dado enfoque a esse mecanismo de origem de

antimicrobianos na indústria farmacêutica. Entretanto as vias microbianas de

resistência aos fármacos vêm superando a síntese de novos medicamentos eficazes

e de administração segura (FOGLIO et al., 2006).

Diante desse fato, a pesquisa por potenciais antimicrobianos se torna

imperiosa entre os grupos de pesquisa, os quais estão à procura de novos fármacos

de origem natural, como fontes vegetais e animais ou a partir de desenvolvimento

em processos biotecnológicos.

1.2.1. PRODUTOS DE ORIGEM NATURAL

Os seres vivos produzem de modo geral substâncias que são responsáveis

pela defesa do organismo frente situações adversas. Estes compostos são

denominados de metabólitos secundários (figura 4), moléculas orgânicas de ampla

variedade que aparentemente não apresentam função direta em etapas vitais para o

organismo, como processos fotossintéticos, respiratórios, de assimilação de

nutrientes, transporte de solutos ou síntese de proteínas, carboidratos ou lipídeos

(GARCÍA; CARRIL, 2009). Em contrapartida são produzidos para outras finalidades


como mecanismo de defesa contra predação ou parasitismo por microrganismos,

insetos e herbívoros, para produzir odores atrativos a agentes polinizadores, como

também para gerar pigmentos, sendo importantes na manutenção da vida do

organismo prolongando a sobrevivência uma vez que ajudam a aumentar a

qualidade e o tempo de vida (COWAN, 1999).

Figura 4. Elementos básicos do metabolismo primário em relação ao metabolismo secundário de plantas (Fonte: Adaptado de García; Carril, 2009).

Na química de produtos naturais existe um esforço em isolar e identificar

novos compostos obtidos a partir de diferentes fontes com o intuito de descobrir

novas estruturas químicas que apresentem algum tipo de atividade biológica. Entre

os grupos que hoje são fonte de estudo para essa área, destacamse os vegetais

(BARREIRO, 1990), fungos (BRIZUELA et al., 1998, STROBEL et al., 2004) e algas

(ROCHA et al., 2007). Os compostos naturais obtidos podem apresentar uma ou

diversas ações biológicas como, por exemplo, antibacterianos, antivirais,


antifúngicos, inseticidas, antiinflamatórios, antitumorais, reguladores enzimáticos,

de crescimento ou hormonais, além de outras interações em nível celular ou

sistêmico (COWAN, 1999; BAKKALI et al., 2008).

1.2.2. PLANTAS MEDICINAIS

Desde os primórdios da raça humana, buscase o tratamento eficaz de

doenças em produtos naturais, sendo esta atenção preferencial em relação aos

vegetais. Desse modo, a partir de experiências empíricas, foram sendo repassados

entre os povos, ao longo dos anos, dados etnofarmacológicos de partes vegetais.

Essas informações são hoje o dado inicial na busca por novos extratos ou

compostos que apresentem alguma bioatividade, sendo as observações populares

importantes para o direcionamento da pesquisa científica comprobatória (MACIEL et

al., 2002).

Foglio et al. (2006) afirmam que podese considerar como planta medicinal

aquela administrada sob qualquer forma e por alguma via ao homem, exercendo

algum tipo de ação farmacológica. Ainda abordam que é necessário conhecer a

segurança do emprego dessa forma terapêutica, visto a adesão da população em

seu uso para o tratamento de doenças. São definidas ainda como “aquelas que

possuem tradição de uso em uma população ou comunidade e são capazes de

prevenir, aliviar ou curar enfermidades” e que são obtidos, ao final do

processamento, os medicamentos fitoterápicos (CARVALHO et al., 2007).

Em definição estabelecida pela ANVISA, “medicamentos fitoterápicos são

obtidos exclusivamente de matériasprimas ativas vegetais, cuja eficácia e

segurança são validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de

utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências clínicas” e ainda

estabelece que fitoterápicos são extratos de origem vegetal formados pela mistura

de diferentes classes de compostos químicos, enquanto que fitofármaco consiste em

molécula isolada ou uma mistura de uma mesma classe de compostos também de

origem exclusivamente vegetal (RDC 14/2010).

As plantas medicinais são importantes para a pesquisa farmacológica, seja na

obtenção ou desenvolvimento de novos fármacos, tanto para o uso direto do


constituinte vegetal como modelo para síntese de compostos farmacologicamente

ativos (ZHANG, 1998).

Grande parte da população brasileira e mundial ainda procura nos produtos

de origem natural, especialmente nas plantas medicinais, uma fonte de terapia para

remediar condições patogênicas, seja em contexto cultural ou como fitoterápico.

Entretanto ainda são escassos os dados farmacológicos, fitoquímicos ou

toxicológicos sobre a maioria dos vegetais denominados medicinais, sendo

evidenciada, portanto, a importância nos estudos que venham a contribuir para o

conhecimento científico sobre essa fonte terapêutica (FOGLIO et al., 2006). Estima

se que 80% da população mundial faça uso de plantas medicinais como primeiro

recurso no atendimento básico de saúde (WHO, 1999).

O Brasil é conhecido por sua grande biodiversidade exposta em diferentes

domínios fitogeográficos (MMA, 2007). Este fato associado aos diferentes grupos

étnicos e seus conhecimentos empíricos e ao desenvolvimento de pesquisas

direcionadas à validação de novos princípios ativos podem levar ao surgimento de

novas terapias eficazes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006).

Populações locais do Brasil utilizam, na medicina popular, várias plantas,

oriundas do cerrado, da floresta amazônica e da mata atlântica, assim como plantas

exóticas introduzidas como fonte de agentes medicinais naturais para o tratamento

de diversas doenças, como esquistossomose, leishmaniose, infecções fúngicas e

bacterianas (DUARTE, 2006).

Os estudos fitoquímicos têm revelado uma variedade de compostos ainda

desconhecidos na química medicinal. Isto se deve ao desenvolvimento de técnicas

químicas aguçadas de análise de estrutura, fato que otimizou a elucidação de

estruturas complexas que podem possuir potencial farmacológico (CECHINEL

FILHO; YUNES, 1998).

Os vegetais possuem uma elevada capacidade de sintetizar compostos

aromáticos, em sua maioria fenóis e derivados. Os compostos orgânicos mais

associados à ação antibacteriana e sua possível rota de atuação foram revisados

por Cowan (1999) e são descritos brevemente na tabela 1.


Tabela 1. Prováveis mecanismos antimicrobianos dos principais grupos químicos orgânicos extraídos de vegetais.

COMPOSTOS ORGÂNICOS PROVÁVEL MECANISMO DE AÇÃO

Fenóis e polifenóis Inibição enzimática.

Quinonas

Ligação a adesinas de superfície, polipeptídeos

de parede ou enzimas de membrana; pode tornar

acesso bacteriano a substratos indisponível.

Flavonas, flavonoides e

flavonóis

Formação de complexos com proteínas

extracelulares ou com a parede celular

bacteriana; ruptura de membrana quando mais

lipofílicos.

Taninos Inativação de adesinas, enzimas e transporte de

proteínas microbianas.

Cumarinas Ação indireta através do sistema imune.

Terpenoides e óleos essenciais Envolve ruptura de membrana.

Alcaloides Habilidade de intercalar na molécula de DNA.

Lectinas e polipeptídeos

Formação de canais iônicos na membrana

microbiana; inibição competitiva da adesão de

proteínas bacterianas aos receptores de

polissacarídeo do hospedeiro.

1.2.3. ÓLEOS ESSENCIAIS

Os óleos essenciais são metabólitos secundários produzidos por plantas

aromáticas que tem como característica volatilidade, componentes com estrutura

química complexa e cheiro intenso. Na natureza esses óleos agem com função

protetora frente agentes nocivos para o vegetal, como bactérias, fungos, insetos,

vírus e herbívoros ou como atrativo para agentes polinizadores (LIMA et al., 2006;

BAKKALI et al., 2008).

De modo geral, são constituídos da mistura de 20 a 60 componentes com

concentrações variadas, onde geralmente dois ou três compostos destacamse

como majoritários determinando a propriedade biológica do óleo. Essas substâncias

são originárias de dois caminhos biossintéticos distintos gerando um grande grupo


formado por terpenos e terpenoides e outro constituído de compostos alifáticos e

aromáticos (BAKKALI et al., 2008).

Os terpenoides são derivados de um precursor com cinco carbonos, o

difosfato de isopentenil. Os monoterpenos, uma unidade de isopreno, e os

sesquiterpenos, três unidades de isopreno, constituem juntos parte da mistura de

compostos presentes nos óleos essenciais e são conhecidos como componentes

voláteis (CROTEAU et al., 2000).

Devido sua natureza mais apolar são solúveis em lipídeos e solventes

orgânicos apresentando, geralmente, densidade menor que a da água. Podem ser

extraídos de várias partes vegetais como: brotos, flores, folhas, caules, galhos,

sementes, frutas, raízes, madeira ou casca (BAKKALI et al., 2008).

Os óleos essenciais têm sido empregados durante séculos na rotina humana

por suas propriedades antisséptica, bactericida, antiviral, fungicida, analgésica,

sedativa, antiinflamatória, antiespasmódica, além de serem utilizados como

fragrância, tempero ou na preservação de alimentos. Apresentam importância

comercial voltada para as indústrias farmacêutica, agronômica, alimentar, sanitária e

cosmética (NASCIMENTO et al., 2007; BAKKALI et al., 2008).

Em um trabalho realizado por Bergonzelli et al. (2003), foram avaliados

sessenta óleos essenciais comerciais diferentes frente a H. pylori, no qual ficou

demonstrado potencial bactericida em dezesseis deles. Um desses óleos, obtido da

semente de cenoura, foi avaliado in vivo, o qual demonstrou entre 20 e 30% de

redução da infecção pela bactéria, sendo sugerido que, de modo geral, os óleos com

ação antiHelicobacter pylori podem ser usados como aditivos alimentares para

complementar a terapia contra esse patógeno.

1.3. Syzygium cumini

1.3.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS

Pertencente à família Myrtaceae, o Syzygium cumini (L.) Skeels (figura 5),

sinonimizado com Syzygium jambolanum (Lam.) DC., Eugenia jambolana Lam.,

Eugenia cumini (L.) Druce, Myrtus cumini L. ou Calyptranthes oneilli Lundell, é


conhecido popularmente no Brasil como jambolão, jamelão, azeitona preta, azeitona

do nordeste ou ameixaroxa e tem sido utilizado empiricamente para o tratamento de

doenças infecciosas causadas por bactérias, fungos e vírus (CHANDRASEKARAN;

VENKATESALU, 2004), além de diabetes e doenças digestivas (LORENZI; MATOS,

2002; MACIEL et al., 2008).

Figura 5. Syzygium cumini. a) Exemplar localizado no campus central da UFRN; b) Folhas, flores e frutos imaturos e maduros; c) Flores e d) Fruto maduro (Fonte: Arquivo próprio).

Em revisão, Migliato et al. (2006) reportam o uso popular de extratos obtidos

de várias partes do S. cumini frente diabetes, hipertensão, doenças de pele, diarreia,

disenteria, problemas gástricos, irritações na garganta, além de uso como anti

inflamatório, diurético, bactericida, antipirético, anticonvulsivante, antihemorrágico,

entre várias outras implicações clínicas.

É uma planta arbórea com até 10 metros de altura, com folhas simples. Seus

frutos são pequenos de cor roxoescura com uma única semente coberta de polpa

comestível de sabor doce, mas adstringente. É originária da Indomalásia, China e

Antilhas e cultivada em vários países, inclusive no Brasil (LORENZI; MATOS, 2002).


Já foi confirmado efeito antisséptico profilático do extrato hidroalcoólico das

folhas frescas em modelo in vivo de ligação e punção cecal. Essa ação está

associada ao recrutamento de neutrófilos ativados ao local da infecção e diminuição

da resposta inflamatória sistêmica (MACIEL et al., 2008).

Também há registro de efeito antihiperglicemiante, em modelo animal, do

extrato etanólico da semente, o qual foi capaz de reduzir os níveis de glicose do

sangue e de hemoglobina glicada, com consequente aumento de insulina no soro e

também se mostrou capaz de reduzir os níveis de lipoproteína de baixa densidade

(LDL) e triglicerídeos, aumentando os níveis de lipoproteínas de alta densidade

(HDL) (BALIGA et al., 2012).

Além disso, também foi detectada atividade antiinflamatória do extrato

aquoso da folha desse vegetal em modelo de edema de pata em camundongos

(LIMA et al., 2007).

1.4. Encholirium spectabile

1.4.1. ASPECTOS FARMACOBOTÂNICOS

Uma espécie pertencente à família Bromeliaceae, a Encholirium spectabile

Mart. ex Schult. f. (figura 6), conhecida popularmente como macambira de flecha, é

endêmica do Brasil ocorrendo principalmente na Caatinga e no Cerrado

(CARVALHO et al., 2010).

Figura 6. Encholirium spectabile. a) Exemplar localizado em área rural no município de São José do Seridó/RN; b) Folha; c) Inflorescência seca (Fonte: Arquivo próprio).


É uma erva com cerca de 1 metro de altura com escape floral de cerca de 1,7

metros e com inflorescência em espiga de aproximadamente 0,8 metro, as folhas

são verdes e suculentas e é encontrada em solos arenosos e pedregosos ou

afloramentos rochosos.

Carvalho et al. (2010) realizaram um estudo fitoquímico preliminar detectando

um perfil fenólico do extrato etanólico bruto das folhas da E. spectabile, fato que

corrobora os resultados de efeito antiulcerogênico e antioxidante do extrato

avaliados pelo mesmo grupo.

Baseado nos trabalhos citados na literatura, que demonstram a ação

protetora frente úlceras gástricas, e na escassez de pesquisas sobre essa planta

para estudos de bioatividade, é levantada a hipótese de ação antiHelicobacter pylori

desse extrato, já que é uma das principais causas desse quadro clínico gástrico.

Diante dos trabalhos que demonstram o potencial farmacológico e antiúlceras

desses vegetais, fazemse necessárias maiores investigações sobre o potencial anti

Helicobacter pylori de fitoterápicos e fitofármacos obtidos dessas plantas.


2. JUSTIFICATIVA

O uso de plantas medicinais tradicionais para tratamento de infecções é

conhecido e trabalhos científicos nessa área tentam comprovar a eficácia dessa

aplicação milenar (MIGLIATO et al., 2006; MACIEL et al., 2008; CARVALHO et al.,

2010, SÁ et al., 2011). Para tanto averiguar a eficácia e segurança do emprego

desses extratos e óleos em testes laboratoriais minimiza alguns problemas, como

intoxicação ou dosagem inapropriada. Entre os vegetais que podem apresentar

potencial ação antiHelicobacter pylori, foram escolhidos o S. cumini e o E.

spectabile, os quais tiveram extratos orgânicos capazes de inibir o crescimento de

outras bactérias, além de apresentarem ação cicatrizante frente úlceras gástricas.

Quando se fala em microrganismos, devese ressaltar o agravante dos casos de

resistência aos antibióticos de emprego clínico. Enfatizase, portanto, a necessidade

da descoberta e comprovação de atividade antibacteriana de novos extratos, óleos

essenciais, frações ou compostos sintéticos ou naturais, principalmente quando a

bactéria em estudo é a H. pylori, visto a dificuldade de tratamento devido o sítio e a

característica da infecção.


3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Avaliar a atividade antiHelicobacter pylori e de toxicidade in vitro de extratos

orgânicos e óleo essencial obtidos do Syzygium cumini e Encholirium spectabile em

estudo bioguiado.

3.2. Objetivos específicos

Obter extratos orgânicos brutos do S. cumini e E. spectabile;

Obter o óleo essencial do S. cumini;

Avaliar qualitativamente, pelo método de difusão em disco, a ação anti

Helicobacter pylori dos extratos orgânicos e óleo essencial, sendo o dado

inicial para guiar os demais ensaios;

Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) das amostras ativas frente

à bactéria, pela técnica de microdiluição em caldo;

Determinar a citotoxicidade in vitro do óleo essencial do S. cumini em

concentração correspondente à CIM através da atividade hemolítica,

utilizando eritrócitos de carneiro, e de viabilidade em linhagens de células

HeLa e VERO.


4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Material vegetal

Os vegetais escolhidos foram o Syzygium cumini e o Encholirium spectabile,

os quais tiveram as folhas escolhidas como fonte dos extratos a serem obtidos. A

escolha dos vegetais aqui avaliados foi dada de acordo com literatura prévia sobre

atividade antiulcerogênica ou antibacteriana (SHAFI et al., 2002; CARVALHO et al.,

2010; MOHAMED et al., 2013).

4.1.1. Syzygium cumini

Foram coletadas folhas do Syzygium cumini de árvores próximas entre si

localizadas no campus central da UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, no mês de

dezembro de 2012, sendo a coleta realizada no início da manhã, por volta das 6

horas. A exsicata está depositada sob o código 5061 no Herbário da UFRN, sob

cuidados do Professor Doutor Jomar Gomes Jardim.

4.1.1.1. Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática

Todos os procedimentos para a obtenção dos extratos vegetais foram

realizados no Laboratório de Isolamento e Síntese de Compostos Orgânicos

(LISCO) do Instituto de Química da UFRN, sob supervisão da Professora Doutora

Renata Mendonça Araújo.

As folhas do S. cumini foram secas em temperatura ambiente e então

trituradas para seguirem para o processo de maceração estática. O pó rendeu 174

g. À metade da massa obtida foram adicionados 500 mL do solvente hexano (QEEL,

São Paulo, Brasil) enquanto que a outra metade, em outro recipiente, foi solubilizada

em 500 mL de álcool etílico absoluto (QEEL, São Paulo, Brasil), permanecendo em

repouso e em temperatura ambiente por 48 horas, quando foram, então, filtrados

com auxílio de algodão.

O solvente foi removido sob evaporação a vácuo em rotaevaporador (Fisatom

modelo 804, Brasil) e, após ser recuperado, foi misturado novamente ao pó que

permaneceu no recipiente. Esse procedimento foi realizado três vezes a fim de

extrair o máximo possível de componentes. Enquanto isso, os extratos brutos, tanto


etanólico (SCFE) quanto hexânico (SCFH), foram transferidos para vidros, os quais

permaneceram em temperatura ambiente para secagem do solvente residual.

O pó das folhas, que havia passado pela etapa de extração com hexano, foi

depois submetido à extração com etanol (SCFH/E) para avaliar se houve diferença

no rendimento de obtenção de extrato.

4.1.1.2. Partição do extrato etanólico

O extrato etanólico foi fracionado pela técnica de partição. Nesta esperouse

separar os componentes mais apolares daqueles mais polares que compõe o

extrato. Para tanto foram solubilizados 2 g do extrato etanólico em solução aquosa

de metanol a 40%, sendo essa solução misturada a cada solvente por vez,

respeitando a ordem crescente de polaridade: hexano (SCFE/H), clorofórmio

(SCFE/C), acetato de etila (SCFE/AE) e água destilada (SCFE/AQ).

O procedimento foi realizado em um funil de separação e a homogeneização

foi realizada cuidadosamente. Ao final, cada fração gerada teve seu solvente

evaporado sob pressão em rotaevaporador e o solvente residual foi eliminado com

leve aquecimento em uma placa térmica a 50ºC.

4.1.1.3. Obtenção do óleo essencial

As folhas frescas do Syzygium cumini foram cortadas com auxílio de tesoura

em pequenos pedaços, com o intuito de aumentar a superfície de contato para

otimizar o rendimento do óleo essencial (SCFO). Em seguida 100 g de folhas foram

misturados a 250 mL de água destilada e submetidas ao procedimento de

hidrodestilação em aparelho de Clevenger durante 2 horas a partir da fervura da

água. Para a execução foram necessários: manta aquecedora para balões (Edutec,

Paraná, Brasil), dosador e condensador acoplado a um sistema de refrigeração.

4.1.1.4. Obtenção do extrato aquoso por decocção

Folhas frescas picotadas foram submersas em água destilada e submetidas a

aquecimento a 150ºC a fim de se obter o extrato aquoso por decocção desse

vegetal. A mistura filtrada obtida foi submetida à evaporação da água gerando o

extrato aquoso bruto (SCFAq).


4.1.2. Encholirium spectabile

As folhas do Encholirium spectabile foram coletadas em um afloramento

rochoso na zona rural no município de São José do Seridó, Rio Grande do Norte, na

área de caatinga no mês de agosto de 2013. A coleta foi realizada no início da

manhã, por volta das 6 horas. A exsicata está depositada, sob o código 16284, no

Herbário da UFRN, sob cuidados do Professor Doutor Jomar Gomes Jardim.

4.1.2.1. Obtenção dos extratos orgânicos por maceração estática

As folhas do E. spectabile foram secas em estufa a 40ºC e então trituradas

para seguirem ao processo de maceração estática. A partir de 125 g do pó foram

procedidas as extrações com o hexano (ESFHf), em seguida a mesma massa foi

submetida a extração com o etanol (ESFEf) e por fim foi realizada a extração com

solução aquosa de etanol a 50% (ESFE/Af). Em cada etapa, a massa permaneceu

em contato com o solvente em repouso e em temperatura ambiente por 48 horas,

sendo posteriormente filtrado com auxílio de algodão.

Entre cada etapa o solvente foi removido sob evaporação a vácuo em

rotaevaporador e, ao final, os extratos brutos foram transferidos para vidros até a

completa secagem do solvente residual.

4.1.2.2. Obtenção dos extratos orgânicos em Soxhlet

Os extratos brutos hexânico e clorofórmico quentes da E. spectabile foram

obtidos por extração contínua em extrator tipo Soxhlet. Neste sistema, 28 g do pó

das folhas secas da E. spectabile foram colocados em um cilindro poroso, de papel

filtro resistente, na porção interna do Soxhlet, o qual foi acoplado, na porção inferior,

a um balão de fundo redondo contendo o solvente, em uma manta aquecedora, e na

porção superior, a um condensador ligado a um sistema de refrigeração. O solvente

foi aquecido até a fervura branda e evaporou até condensar e cair no cilindro

contendo o pó, solubilizando os componentes com polaridade correspondente. A

solução foi sifonada para o balão ao encher a região em que o cilindro estava

inserido. O solvente foi removido por evaporação, sob pressão, em rotaevaporador,

permanecendo apenas o extrato bruto. A partir da mesma massa vegetal foram


obtidos os extratos hexânico (ESFHq) e clorofórmico (ESFCq). As extrações foram

realizadas mudando o solvente por ordem de polaridade (hexano clorofórmio).

4.2. Microrganismo e meio de cultura

Para análise da ação antimicrobiana foi utilizada a bactéria Helicobacter pylori

ATCC 43504, fornecida, sob o código INCQS 00380 (lote: 1011380), pelo Instituto

Nacional de Controle de Qualidade em Saúde – INCQS – da Fundação Oswaldo

Cruz FIOCRUZ.

Os meios de cultura utilizados nos testes foram o ágar triptona de soja (TSA

Himedia, Índia) acrescido de sangue de carneiro desfibrinado estéril a 5% e o caldo

MuellerHinton (Himedia, Índia) acrescido de soro fetal bovino a 10% (MORGAN et

al., 1987; ZAIDI et al., 2012; CLSI, 2013).

O estoque da bactéria foi mantido em caldo triptona de soja (TSB – Himedia,

Índia) acrescido de glicerol a 20% em freezer a 20°C. A cultura utilizada era

semeada 48 horas antes da realização dos testes.

4.2.1. TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO

Para a análise qualitativa de ação antibacteriana dos extratos, foi executada a

metodologia desenvolvida por Bauer et al. (1966) com algumas modificações. Discos

de papel filtro Whatman nº 1 estéreis com 6 mm de diâmetro foram impregnados

com 10 μL de cada amostra solubilizada em solução aquosa de tween 80 para

síntese a 1% e dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% nas concentrações demonstradas nas

tabelas 2 e 3. Esse material permaneceu em fluxo laminar até secagem total do

solvente. Os óleos foram impregnados nos discos imediatamente antes do teste,

para evitar evaporação dos componentes voláteis dessas amostras.

Os controles negativos (CN) consistiram nos solventes utilizados para diluição

das amostras. Foram adicionados 10 μL de solução aquosa de tween 80 a 1% e

DMSO a 1% ou água destilada, em discos de papel filtro estéreis e submetidos a

fluxo de ar e temperatura constantes nas mesmas condições das amostras testes.

Para o óleo, foram impregnados discos com solução aquosa de tween 80 a 1% e

DMSO a 1% imediatamente antes da execução do teste. O controle positivo (CP)

empregado foi a claritromicina a 15 μg/disco (CLA 15, DME, São Paulo, lote:


2010CLA) como recomendado pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standart Institute),

2013.

Na superfície do ágar sangue foi realizado semeio, com auxílio de swab

estéril, da H. pylori em suspensão ajustada a escala 2 de McFarland em solução

salina. Em seguida, os discos impregnados e secos foram colocados na superfície

do ágar e incubados em atmosfera de microaerofilia a 37ºC durante 48 horas. A

leitura consistiu na mensuração do halo de inibição, em milímetros, do crescimento

bacteriano em volta do disco. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Tabela 2. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas do S. cumini nos discos utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes.

Amostra Concentrações nas diluições (mg/mL) Solvente

100% 50% 25%

SCFH 10 5 2,5 TD1

SCFE 10 5 2,5 TD1

SCFE/H 10 5 2,5 TD1

SCFE/C 10 5 2,5 TD1

SCFE/AE 10 5 2,5 TD1

SCFE/AQ 10 5 2,5 Água destilada

SCFAq 10 5 2,5 Água destilada

SCFO 858 429 214,5 TD1

TD1: Solução aquosa de Tween 80 a 1% e DMSO a 1%.

SCFH: S. cumini folhas hexano; SCFE: S. cumini folhas etanol; SCFE/H: S. cumini folhas

etanol fração hexânica; SCFE/C: S. cumini folhas etanol fração clorofórmica; SCFE/AE: S.

cumini folhas etanol fração acetato de etila; SCFE/AQ: S. cumini folhas etanol fração

aquosa; SCFAq: S. cumini folhas aquoso quente e SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.


Tabela 3. Concentração, em mg/mL, dos extratos das folhas da E. spectabile nos discos utilizados no teste de difusão em disco e seus respectivos solventes.

Amostra Concentrações nas diluições (mg/mL) Solvente

100% 50% 25%

ESFEf 10 NA NA TD1

ESFHf 10 NA NA TD1

ESFE/Af 10 NA NA TD1

ESFCq 10 NA NA TD1

ESFHq 10 NA NA TD1

TD1: Solução aquosa de Tween 80 a 1% e DMSO a 1%.

NA: Não avaliado.

ESFEf: E. spectabile folhas etanol extração a frio; ESFHf: E. spectabile folhas hexano

extração a frio; ESFE/Af: E. spectabile folhas 50% etanol/ 50% água extração a frio, ESFCq:

E. spectabile folhas clorofórmio extração a quente e ESFHq: E. spectabile folhas hexano

extração a quente.

4.2.2. CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

Para a determinação da CIM dos extratos e frações, frente a H. pylori, foi

realizada a microdiluição em caldo em microplaca de 96 poços.

Na técnica, foram pipetados ao poço, da microplaca de 96 poços estéril, o

caldo MuellerHinton acrescido de 10% de soro fetal bovino, a suspensão bacteriana

em solução salina ajustada ao padrão 2 da escala de McFarland e amostrateste,

controle positivo e controle negativo em seus respectivos poços (CLSI, 2013).

A diluição da amostra teve início no primeiro poço da placa, sendo realizada

uma diluição seriada que resultou na variação decrescente de metade da

concentração máxima da amostra até a décima sexta diluição (50%; 25%; 12,5%;

6,25%; 3,125%; 1,562%; 0,781%; 0,391%; 0,195%; 0,098%; 0,049%; 0,024%;

0,012%; 0,006%; 0,003% e 0,002%) como representado na figura 7. No controle

negativo adicionouse a solução aquosa de tween 80 a 1% e DMSO a 1% ao meio

de cultura e o controle positivo consistiu em claritromicina, solubilizada na mesma

solução do controle negativo, distribuída nas concentrações decrescentes de 32

μg/mL; 16 μg/mL; 8 μg/mL; 4 μg/mL; 2 μg/mL; 1 μg/mL; 0,5 μg/mL e 0,25 μg/mL. O


controle de crescimento (CC) foi realizado para mostrar a viabilidade da cepa, sendo

constituído apenas por meio de cultura e microrganismo. O teste foi realizado em

triplicata.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 50 50 50 0,195 0,195 0,195 CC CC CC 32 32 32

B 25 25 25 0,098 0,098 0,098 CC CC CC 16 16 16

C 12,5 12,5 12,5 0,049 0,049 0,049 CC CC CC 8 8 8

D 6,25 6,25 6,25 0,024 0,024 0,024 CC CC CC 4 4 4

E 3,125 3,125 3,125 0,012 0,012 0,012 CN CN CN 2 2 2

F 1,562 1,562 1,562 0,006 0,006 0,006 CN CN CN 1 1 1

G 0,781 0,781 0,781 0,003 0,003 0,003 CN CN CN 0,5 0,5 0,5

H 0,391 0,391 0,391 0,002 0,002 0,002 CN CN CN 0,25 0,25 0,25

├───────────TESTE──────────┤ ├────CP────┤ CN: controle negativo; CP: controle positivo CC: controle crescimento

Figura 7. Representação da distribuição das diluições, em porcentagem, realizadas na microdiluição em caldo em placa de 96 poços.

A placa foi mantida a 37ºC sob condições de microaerofilia durante 48h

sendo, então, submetida à revelação do crescimento, que consiste na adição da

solução aquosa de cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio (CTT) a 0,5% em cada poço,

sendo a placa incubada novamente durante 3h. Esse composto é solúvel em água e

inicialmente não apresenta coloração; quando há metabolismo bacteriano ativo, com

sistema desidrogenase funcional, ocorre a conversão do tetrazólio em um cristal

insolúvel de cor vermelha, compostos de formazam (figura 8). Logo, se houver

atividade metabólica bacteriana, o meio de cultura (amarelo claro) ganha uma

coloração vermelha, caso não haja atividade celular bacteriana, o meio permanece

com sua coloração original (GUNZ, 1949).

Figura 8. Redução do cloreto de 2,3,5trifeniltetrazólio ao formazam (Adaptado de Opwis et al., 2012).


Por se tratar de um estudo bioguiado, a determinação da CIM foi realizada

apenas para o óleo essencial, único que apresentou preliminarmente ação inibitória

frente a H. pylori. Houve uma adequação das concentrações avaliadas, partindo da

maior concentração possível (figura 9).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 420.420 420.420 420.420 1.642,27 1.642,27 1.642,27 CC CC CC 32 32 32

B 210.210 210.210 210.210 821,13 821,13 821,13 CC CC CC 16 16 16

C 105.105 105.105 105.105 410,57 410,57 410,57 CC CC CC 8 8 8

D 52.552,5 52.552,5 52.552,5 205,28 205,28 205,28 CC CC CC 4 4 4

E 26.276,25 26.276,25 26.276,25 102,64 102,64 102,64 CN CN CN 2 2 2

F 13.138,13 13.138,13 13.138,13 51,32 51,32 51,32 CN CN CN 1 1 1

G 6.569,06 6.569,06 6.569,06 25,66 25,66 25,66 CN CN CN 0,5 0,5 0,5

H 3.284,53 3.284,53 3.284,53 12,83 12,83 12,83 CN CN CN 0,25 0,25 0,25

├──────────────TESTE────────────┤ ├──CP──┤

CN: controle negativo;

CP: controle positivo

CC: controle crescimento

Figura 9. Representação da distribuição das concentrações, em μg/mL, na microdiluição em caldo para o óleo essencial do S. cumini.

4.3. Ensaio hemolítico

Empregado para determinar efeitos tóxicos da amostra de interesse a partir

da lise de eritrócitos, o ensaio de toxicidade por hemólise consiste em expor as

hemácias de carneiro à substância teste e avaliar a liberação de hemoglobina no

sobrenadante.

Nesse ensaio, adaptado a partir de Jorgensen et al. (1983) e CostaLotufo et

al (2002), preparouse uma suspensão de células vermelhas de carneiro a 10%.

Inicialmente, 500 μL de sangue de carneiro foram centrifugados a 4000 rpm durante

5 minutos e o sobrenadante, composto de plasma e Buffy coat, foi descartado.

Foram realizadas sucessivas lavagens com tampão fosfato salina (PBS) até a

ausência de hemólise e então foi preparada a suspensão a 10%.

As amostras testes foram diluídas em DMSO e PBS e em seguida misturadas

à suspenção de hemácias em eppendorf, sendo incubadas a 37ºC por 1 hora. As

concentrações avaliadas foram 50 μg/mL, 100 μg/mL, 500 μg/mL e 1000 μg/mL. No

controle positivo, a suspensão foi incubada com o Triton X100 a 1% e o PBS foi

usado como controle negativo. A solução controle tem DSMO nas concentrações de


0,5; 1; 5 e 10% como parâmetro em relação ao teste. Todos os testes foram

realizados em triplicata.

Após a incubação, as amostras foram colocadas em banho de gelo por 5

minutos, seguindose à centrifugação a 4000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante

resultante foi diluído em PBS (1/10) e as amostras tiveram sua absorbância (Abs)

medida em espectrofotômetro com comprimento de onda de 540 nm.

A porcentagem de hemólise foi calculada como se segue:

%ℎ��ó�� = �� − ��

��1%��100

4.4. Citotoxicidade em cultura de células

O ensaio utilizando cultura de células foi realizado no Laboratório de Biologia

Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC) do Departamento de

Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências, UFRN, com colaboração do

Professor Doutor Kleber Juvenal Silva Farias.

Os extratos que se mostraram eficazes frente a H. pylori foram avaliados

quanto a citotoxicidade em células VERO E6, originada de célula epitelial renal de

Cercopithecus aethiops imortalizada pelo vírus SV40, e HeLa, célula epitelial de

cérvice uterina humana transformada por HPV18. A viabilidade celular foi medida

pelo método colorimétrico do MTT, brometo de 3(4,5dimetiltiazol2il)2,5difenil

tetrazólio (Sigma Aldrich, Alemanha) descrito por Mosmann (1983) com

modificações.

O MTT é um sal de tetrazólio amarelado que pode ser reduzido pela succinato

desidrogenase, nas mitocôndrias de células vivas, gerando cristais de formazam

azulados insolúveis em água. Ao ser dissolvido em DMSO, esse produto pode ser

mensurado em absorbância a 540nm. A quantidade de cristais formados é

proporcional ao número de células viáveis (CARMICHAEL et al., 1987; ELAISSI et

al., 2012).

Monocamadas confluentes de células VERO E6 e HeLa contidas em placas

de 96 poços foram expostas às concentrações de 26 μg/mL, 260 μg/mL, 2.600


μg/mL e 26.000 μg/mL da amostra teste, durante três dias a 37°C. Em seguida, 50

µL de meio L15 (Leibovitz) contendo MTT, a uma concentração final de 5 mg/mL,

foram adicionados a cada poço. Após 4 horas de incubação a 37°C, o sobrenadante

foi removido e 100 µL de DMSO foram adicionados a cada poço para solubilizar os

cristais de formazan. Após agitação, a absorbância foi medida a 540 nm. O controle

crescimento consistiu no cultivo das células apenas com meio de cultura. Os ensaios

foram avaliados em triplicata.

A porcentagem de viabilidade celular foi calculada como se segue:

%�� = ��

�� 100

4.5. Análise estatística

Para avaliar a correlação entre a viabilidade das células HeLa e VERO e a

concentração do extrato vegetal foi utilizada a fórmula, acima descrita. Os gráficos

foram plotados utilizando o programa Microsoft® Excel 2010, versão 9.0.2812 com

erro padrão expresso em porcentagem.


5. RESULTADOS

5.1. Rendimento dos extratos e óleo essencial

O processo de extração a partir das folhas secas do S. cumini apresentou

como maior rendimento a obtenção de 11,9% de extrato bruto etanólico e 1,8% de

extrato bruto hexânico como menor porcentagem. A partição do extrato etanólico

revelou que a maior parte do extrato é composta por substâncias fortemente

apolares (4,5% fração hexânica) e fortemente polares (4,8% fração aquosa),

enquanto que as frações de clorofórmio e acetato de etila renderam,

respectivamente, 1,6% e 0,9%. A fração etanólica (10,5%) obtida após a extração

prévia pelo hexano das folhas não apresentou vantagem em relação ao rendimento

se comparado à fração etanólica obtida diretamente das folhas. O extrato aquoso

por decocção rendeu 6,7% (tabela 4).

O óleo rendeu 0,72g a partir de 1000g de folhas frescas, resultando em

0,072% de rendimento. A massa foi determinada em 858 mg a cada 1 mL de óleo

bruto.

A partir das folhas secas do E. spectabile obtevese 1,1% do extrato etanólico

a frio, 0,9% do extrato hexânico a frio, 7,7% do extrato hidroalcoólico a 50% a frio,

1,1% do extrato clorofórmico a quente e 1,4% do extrato hexânico a quente (tabela

4).

5.2. Avaliação anti-Helicobacter pylori dos extratos e óleo essencial

Quanto à ação inibitória frente a H. pylori, os extratos etanólico, hexânico,

hidroalcoólico e clorofórmico obtidos a partir das folhas do E. spectabile não

apresentaram atividade biológica, quando avaliados pelo método de difusão em

disco (tabela 5). O mesmo foi notado para os extratos etanólico, hexânico, aquoso e

particionado obtidos a partir das folhas do S. cumini, os quais não apresentaram

inibição do crescimento em nenhuma das concentrações avaliadas (tabela 6).


Tabela 4. Rendimento dos extratos do S. cumini e E. spectabile.

Amostra Quantidade (g)

de folhas secas

Quantidade (g)

de extrato

Rendimento (%)

SCFH 87,9 1,6 1,8

SCFH/E 87,9 9,2 10,5

SCFE 87,9 10,5 11,9

SCFE/H 87,9 3,9 4,5

SCFE/C 87,9 1,4 1,6

SCFE/AE 87,9 0,8 0,9

SCFE/AQ 87,9 4,3 4,8

SCFAq 50 3,3 6,7

SCFO 1000 0,72 0,072

ESFEf 125 1,3 1,1

ESFHf 125 1,1 0,9

ESFE/Af 125 9,6 7,7

ESFCq 125 1,4 1,1

ESFHq 125 1,8 1,4

SCFH: S. cumini folhas hexano, SCFH/E: S. cumini folhas hexano aproveitadas com etanol,

SCFE: S. cumini folhas etanol; SCFE/H: S. cumini folhas etanol fração hexânica; SCFE/C: S.

cumini folhas etanol fração clorofórmica; SCFE/AE: S. cumini folhas etanol fração acetato de

etila; SCFE/AQ: S. cumini folhas etanol fração aquosa; SCFAq: S. cumini folhas aquoso

quente e SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.

ESFEf: E. spectabile folhas etanol extração a frio; ESFHf: E. spectabile folhas hexano




Tabela 5. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os extratos

vegetais do E. spectabile.

Amostra Teste

CN CP 100% 50% 25%

ESFHf 0 0 0 0 38±1

ESFEf 0 0 0 0 39,3±1,15

ESFE/Af 0 0 0 ;0 38,7±1,15

ESFCq 0 0 0 0 39,7±1,15

ESFHq 0 0 0 0 38,3±1,07

CN: controle negativo (DMSO 1% + tween 80 a 1%)

CP: controle positivo (claritromicina 15 μg/disco)

ESFHf: E. spectabile folhas hexano extração a frio; ESFEf: E. spectabile folhas etanol





O óleo essencial obtido a partir das folhas do S. cumini apresentou atividade

inibitória do crescimento da H. pylori, tendo sido observado halo inibitório com média

de 10,2 mm para a concentração máxima do óleo (8,58 mg/disco), 10 mm para a

concentração de 4,29 mg/disco e 8,85 mm para 2,15 mg/disco (tabela 6). O halo

inibitório da claritromicina (15 μg/disco) ficou em torno de 39 mm (figura 10).

Figura 10. Halo inibitório do SCFO, a 25, 50 e 100%, frente o crescimento da H. pylori.

Tabela 6. Média dos halos de inibição (mm) do crescimento da H. pylori frente os extratos

orgânicos e óleo essencial do S. cumini pelo teste de difusão em disco e CIM.

Amostra Difusão em disco

CN CPdd

CIM (μg/mL)

100% 50% 25% Teste CPMIC

SCFE 0 0 0 0 38±1 NA NA

SCFE/H 0 0 0 0 39,1±1,3 NA NA

SCFE/C 0 0 0 0 38,5±1,1 NA NA

SCFE/AE 0 0 0 0 38±1 NA NA

SCFE/AQ 0 0 0 0 39±1 NA NA

SCFH 0 0 0 0 39,3±1,15 NA NA

SCFAq 0 0 0 0 39,7±1,15 NA NA

SCFO 10,2±0,5 10±0,76 8,85±1,62 0 38,3±1,07 205 0,5

CN: controle negativo (DMSO 1% + tween 80 a 1%);

CPdd: controle positivo (claritromicina 15 μg/disco);

100%

50%

25% CN


CPMIC: controle positivo (solução aquosa de claritromicina);

NA: não avaliado;

SCFE: S. cumini folhas etanólico; SCFE/H: S. cumini folhas etanólico fração hexânica;

SCFE/C: S. cumini folhas etanólico fração clorofórmica; SCFE/AE: S. cumini folhas etanólico

fração acetato de etila; SCFE/AQ: S. cumini folhas etanólico fração aquosa; SCFH: S.

cumini folhas hexânico, SCFAq: S. cumini folhas aquoso quente e SCFO: S. cumini folhas

óleo essencial.

A avaliação da concentração inibitória mínima foi realizada para o óleo

essencial (SCFO) sendo determinada em 205 μg/mL (tabela 6). Em relação à

concentração inicial pura do óleo (858 mg/mL), a atividade inibitória foi detectada até

a diluição correspondente a 0,024% (figura 11).

Figura 11. CIM do SCFO (delimitado pelo retângulo vermelho) frente o crescimento da H.

pylori pela técnica de microdiluição em caldo.

5.3. Atividade hemolítica do óleo essencial do S. cumini

No ensaio da atividade hemolítica utilizando eritrócitos de carneiro constatou

se que o óleo essencial apresentou atividade hemolítica de 25,04%, 20,07%, 0,99%

e 1,82%, respectivamente, para as concentrações de 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 100

μg/mL e 50 μg/mL (tabela 7), os dados estão representados na figura 12. O Triton X

100 a 1% promove a hemólise de todos os eritrócitos, pois atua solubilizando

membranas lipídicas por ser um surfactante nãoiônico, por isso seu emprego como

controle positivo para ensaios hemolíticos (Preté et al., 2002). De acordo com

Nofiani et al. (2011), a ação hemolítica deve ser considerada elevada quando as

porcentagens de hemólise atingem valores maiores que 40% e baixa quando esses

valores são inferiores a 10%.


Tabela 7. Avaliação da toxicidade (%) do óleo essencial obtido do S. cumini pelo teste de hemólise.

Amostra

Concentração (μg/mL)

1000 500 100 50

SCFO 25,04 (±2,74) 20,07 (±13,95) 0,99 (±1,15) 1,82 (±1,25)

TRITON X 100

CP: TritonX 1%

SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.

.

Figura 12. Percentual de hemólise induzida por diferentes concentrações do óleo essencial

extraído das folhas do S. cumini (SCFO).

5.4. Atividade citotóxica in vitro do óleo essencial do S. cumini

No ensaio de viabilidade de células HeLa, tratadas com concentrações

crescentes do SCFO, foi demonstrado que este óleo essencial exibiu atividade

tóxica nas contrações de 260, 2600 e 26000 μg/mL, induzindo porcentagens de

morte celular de 78,1%, 86,0% e 90,1, respectivamente. Contudo, na concentração

de 26 μg/mL o SCFO não afetou a viabilidade dessas células, conforme mostrado na

tabela 8 e figura 13.

Para a linhagem VERO, o óleo também preservou a viabilidade (tabela 8) total

dessas células na concentração de 26 μg/mL e induziu a morte celular em 49,58%,

82,61% e 75,31%, respectivamente, para as concentrações de 260, 2600 e 26000

μg/mL, como demonstrado na tabela 8 e na figura 14.

-20

0

20

40

60

80

100

50 100 500 1000

He

mó

lis

e (

%)

Concentração (μg/mL)

SCFO

TritonX


Tabela 8. Viabilidade (%) de células HeLa e VERO tratadas com diferentes concentrações do SCFO.

Células

Concentração (μg/mL) do SCFO

26 260 2.600 26.000

HeLa 100 21,89 14,04 9,94

VERO 100 50,42 17,39 24,69

SCFO: S. cumini folhas óleo essencial.

Figura 13. Percentual de viabilidade de células HeLa tratadas com diferentes concentrações

do SCFO.

Figura 14. Percentual de viabilidade de células VERO tratadas com diferentes

concentrações do SCFO.

100 100

21,8914,04 9,94

78,11 85,96 90,06

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

CC 26 260 2600 26000

Via

bil

ida

de

cé

lula

s H

eL

a x

m

ort

e c

elu

lar

(%)


Controle crescimento

Morte celular x SCFO

Viabilidade celular x SCFO

100 100

50,42

17,3924,69

49,58 82,61 75,31

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

CC 26 260 2600 26000

Via

bil

ida

de

cé

lula

s V

ER

O x

mo

rte

c

elu

lar

(%)


Controle crescimento

Morte celular x SCFO

Viabilidade celular x SCFO


6. DISCUSSÃO

A infecção pela H. pylori acomete cerca de metade da população mundial e

está estabelecida como principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer

gástrico, tendo sido classificada, em 1994, como carcinógeno classe I pela

Organização Mundial de Saúde (IARC, 2014). Sabendose que a eliminação da

bactéria resulta na redução da incidência de câncer gástrico, é de extrema

importância a resolução rápida e adequada desse processo patológico.

Há recentemente um esforço em relação à descoberta e caracterização de

novos compostos e extratos de fonte natural e que apresentem alguma ação anti

Helicobacter pylori. Isto se deve ao surgimento de várias cepas resistentes (KIM et

al., 2001) e até mesmo para facilitar o acesso ao tratamento pelas populações com

baixa renda e de países em desenvolvimento, uma vez que o custo elevado das

drogas, disponíveis atualmente, tem sido um obstáculo ao tratamento das

populações mais acometidas por essa infecção (SUERBAUM; MICHETTI, 2002).

Dos extratos aqui avaliados do S. cumini e E. spectabile, apenas o óleo

essencial do S. cumini apresentou ação antiHelicobacter pylori. Portanto os extratos

etanólico, hexânico e aquoso obtido a partir das folhas do S. cumini assim como os

extratos etanólico, hexânico, hidroalcoólico e clorofórmico obtidos a partir das folhas

do E. spectabile provavelmente não são constituídos por compostos químicos que

impeçam o crescimento da referida bactéria.

Donatini et al. (2009) relataram a ação antiúlcera e antioxidante do extrato

hidroalcoólico das folhas do S. cumini em modelo animal de indução de úlcera

gástrica com etanol. Apesar de não ter sido analisada ação do extrato hidroalcoólico

do S. cumini frente a H. pylori, ficou comprovado, no presente estudo, que o extrato

etanólico e o extrato aquoso não inibem o crescimento da H. pylori. É possível que

estes extratos possuam ação antioxidante e antiúlcera, assim como o hidroalcoólico,

visto serem formados pela mistura de compostos químicos semelhantes ou de

classes químicas próximas, principalmente quanto à polaridade dos extratos, porém

mais estudos devem ser realizados para maiores informações sobre as propriedades

biológicas dessas amostras.


Quanto ao óleo essencial, foi detectada uma atividade biológica interessante,

uma vez que foi capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano na

concentração de 205 μg/mL, em diluição correspondente a 0,024% da concentração

do óleo puro (858 mg/mL). Deve ser enfatizado que o SCFO se mostrou eficaz

mesmo em uma concentração reduzida se comparada à original, confirmando a

importância em se estudar mais detalhadamente o referido óleo. O limite reduzido do

halo inibitório detectado no teste de difusão em disco (10 mm) provavelmente reflete

a dificuldade de dispersão do óleo no meio de cultura sólido, em virtude de seu

caráter hidrofóbico. Isso evidencia a necessidade da realização de ensaios inibitórios

em caldo, para que a eficiência do óleo seja melhor avaliada, em condições onde a

possibilidade de erros, decorrentes da dificuldade de solubilização, sejam evitados.

Apesar da CIM do SCFO ter sido determinada em 205 μg/mL, que é uma

concentração elevada se comparada à claritromicina (0,05 μg/mL), devese ressaltar

que este controle é o antibiótico de escolha frente a H. pylori, além de ser um

composto puro, portanto é esperada maior eficácia. Como o óleo é uma mistura de

vários componentes, tanto pode haver a uma inibição discreta em consequência da

baixa concentração do principio ativo, como também pode ocorrer o antagonismo

entre as substâncias presentes no extrato, portanto é comum que uma mistura de

compostos químicos resulte em menor atividade, em testes in vitro, quando

comparados a um controle positivo de aplicação definida.

Ação antibacteriana do óleo essencial das folhas do S. cumini já foi relatada

por Mohamed et al. (2013), que detectaram atividade inibitória do crescimento de

outras bactérias Gram negativas: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e

Neisseria gonorrhoeae, além das seguintes cepas Gram positivas: Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus e Enterococus faecalis. Esse fato vem confirmar a eficácia

deste óleo como antimicrobiano. Embora os referidos autores não tenham

determinado a CIM do óleo, no método de difusão em disco foram observados halos

inibitórios entre 12 e 14 mm, enquanto que o SCFO apresentou halo de 10 mm.

A composição química do óleo essencial do S. cumini extraído por Mohamed

et al. (2013) foi descrita como uma mistura complexa de hidrocarbonetos, composta

principalmente por monoterpenos e sesquiterpenos, sendo o componente majoritário

o αpineno (32,32%), seguido do βpineno (12,44%), do transcariofileno (11,19%),


do 1, 3, 6octatrieno (8,41%), do Δ3careno (5,55%), do αcariofileno (4,36%), do α

limoneno (3,42%) e de outros compostos com traços vestigiais. Já Shafi et al. (2002)

caracterizaram o óleo extraído das folhas do S. cumini como pinocarveol (15,1%), α

terpenol (8,9%), mirtenol (8,3%), eucarvona (6,6%), murolol (6,4%), mirtenal (5,8%),

geranilacetona (5,6%), αcardinol (4,6%), pinocarvona (4,4%) demonstrando uma

grande variação dos componentes gerados pelo vegetal. Provavelmente a

concentração e o perfil de constituintes químicos do SCFO deve apresentar

semelhança com alguma caracterização descrita anteriormente, porém dificilmente

será igual, visto que os metabólitos secundários resultam da interação química entre

a planta e o ambiente (figura 15). Desse modo, sua síntese pode ser afetada por

condições climáticas como disponibilidade hídrica, temperatura, altitude, nutrientes

do solo, sazonalidade, radiação ultravioleta, estímulos mecânicos, poluição

atmosférica, entre outros (GOBBONETO; LOPES, 2007).

Figura 15. Principais fatores que podem influenciar o acúmulo de metabólitos secundários em plantas (Fonte: GobboNeto e Lopes, 2007).


A fórmula geral desses hidrocarbonetos é (C5H8)n logo são de difícil

solubilização em água, que é um veículo fundamental nos ensaios antimicrobianos.

Devido esse fato, foi necessário solubilizar o óleo em tween 80 para síntese, um

surfactante e emulsificante não iônico, e em DMSO, um solvente polar, para a

realização dos testes. Entretanto, a concentração desses compostos deve ser

reduzida para evitar resultado falso positivo, tendo ficado, nesse trabalho, definida a

concentração em 1% de cada reagente. Outras concentrações foram testadas, como

2% e 4%, porém inibiram o crescimento da bactéria.

A padronização dos testes de determinação da atividade antibacteriana de

óleos deve ser precisa, entretanto há dificuldade para resolver esta problemática,

principalmente devido sua insolubilidade em água e volatilidade, condições químicas

que dificultam a confirmação de dados (NASCIMENTO et al., 2007). Por isso no

momento da leitura da CIM foi necessário considerar o primeiro poço da triplicata em

que houve crescimento como a concentração mínima, visto que a solubilidade do

óleo variou durante a execução da técnica.

Os óleos essenciais desempenham um importante papel na prevenção de

doenças como disfunção cerebral, câncer, doenças infecciosas, processos

inflamatórios e doenças cardíacas, isso por ser capaz de ligarse a radicais livres por

apresentarem propriedades antioxidantes (KAMATOU; VILJOEN, 2010; MOHAMED

et al., 2013).

Há relato do uso popular S. cumini para tratamento de disenteria, inflamação

e diabetes. Desse mesmo vegetal já foram obtidos o óleo essencial, alcanos e

ácidos orgânicos. O óleo extraído das folhas do S. cumini por Shafi et al. (2002)

apresentou rendimento de 0,04%, quase metade do encontrado neste estudo para o

SCFO (0,0721%). Tal óleo foi eficaz frente Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, tendo se destacado frente os Gram negativos: Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium (SHAFI et al., 2002). No

presente estudo foi constatado que o óleo (SCFO) mostrouse eficaz frente a outro

Gram negativo, reforçando a ação antibacteriana dessa mistura de compostos

químicos complexos.


Óleos essenciais também inibem o crescimento de outros microrganismos

como fungos filamentosos ou leveduriformes como descrito no trabalho de Pinto et

al. (2009), no qual o óleo obtido do Syzygium aromaticum, vegetal pertencente ao

mesmo gênero do S. cumini, foi capaz de inibir o crescimento de treze espécies

fúngicas, sendo cinco do gênero Candida, cinco espécies de dermatófitos e três

espécies de Aspergillus, ressaltando o valor biológico desse fitofármaco.

Outros extratos, que não foram avaliados aqui frente a H. pylori e que foram

obtidos da mesma parte vegetal (folhas) do S. cumini, apresentaram ação inibitória

sobre várias espécies bacterianas. Entre eles destacamse os extratos metanólico e

cloreto de metileno frente E. coli, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, B. subtilis, S.

aureus e E. faecalis (MOHAMED et al., 2013); o extrato hidroalcoólico com CIM

determinadas em 485 mg/mL para Streptococcus mutans, Streptococcus oralis e

Lactobacillus casei, e 242,5 mg/mL para Streptococcus parasanguis e Streptococcus

salivarius (VIEIRA et al., 2012). Ainda, outro extrato hidroalcoólico foi ativo frente as

bactérias E. faecalis, Kocuria rhizophila, N. gonorrhoeae, Shigella flexneri, P.

aeruginosa e S. aureus, sendo eficaz também frente uma cepa resistente de P.

aeruginosa e uma de S. aureus, além de inibir as leveduras Candida albicans e

Candida krusei (OLIVEIRA et al., 2007); outro extrato metanólico e o extrato aquoso

foram eficazes contra Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhi A,

Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Pseudomonas aeruginosa, E. coli,

B. subtilis e S. aureus (GOWRI; VASANTHA, 2010).

Oliveira et al. (2007) ainda relatam que não houve inibição do crescimento da

E. coli e Klebsiella pneumonia, dois bacilos Gram negativos pelo extrato

hidroalcoólico. Estes resultados são coerentes com aqueles obtidos neste estudo

frente a H. pylori, que também é um Gram negativo. Contudo, isso não descarta a

possibilidade de atividade antiHelicobacter pylori do extrato hidroalcoólico. Por outro

lado, Gowri e Vasantha (2010) afirmaram que o extrato aquoso foi eficaz frente

bactérias Gram negativas diferentemente do observado aqui em relação ao SCFAq,

que não inibiu o crescimento da H. pylori.

Em outro estudo realizado por Chandrasekaran e Venkatesalu (2004), foi

demonstrado que os extratos aquoso e metanólico, obtidos da semente do S.

cumini, também apresentaram ação antibacteriana. A CIM do extrato metanólico foi


62,5 μg/mL para o B. subtilis, 125 μg/mL para S. aureus e S. typhimurium, 250

μg/mL para P. aeruginosa, K. pneumoniae e E. coli. As CIMs para o extratos aquoso

foram exatamente o dobro daqueles citados para o metanólico, com exceção da P.

aeruginosa que foi susceptível a 250 μg/mL. Esses resultados mostram que os

extratos aquoso e metanólico, obtidos da semente, possuem ação antibacteriana, ao

contrário do observado no presente estudo para os extrato etanólico, aquoso e

hexânico de folhas, os quais não inibiram o crescimento da H. pylori. A diferente

resposta de bioatividade, detectada entre um extrato originado de folha ou de

semente do mesmo vegetal, pode ser oriunda da variação de compostos particulares

para o desenvolvimento da parte vegetal específica, assim como das condições

ambientais, as quais as plantas estão dependentes.

Outros compostos ou misturas de extratos obtidos a partir de plantas

medicinais já se mostraram eficazes frente a H. pylori como no caso relatado por Xie

et al. (2013) no qual uma mistura de extrato de doze plantas medicinais tradicionais

chinesas inibiu o crescimento da bactéria além de promover a cicatrização de úlcera

gástrica em modelo animal. Estes compostos resultaram em ação semelhante ao

controle positivo, um gastroprotetor, corroborando com o uso convencional. Além

disso, foi comprovada segurança em sua administração, após avaliação de

toxicidade aguda e crônica em ratos, validando sua ação antiúlcera e tornando esse

extrato um possível candidato à medicação alternativa ou complementar para

desordens gastrointestinais.

Outra planta utilizada na medicina tradicional chinesa também se mostrou

promissora frente a H. pylori incluindo uma cepa resistente ao metronidazol. Foram

isolados cinco novos compostos a partir do extrato etanólico das sementes da

Psoralea corylifolia, os quais exibiram CIM de 12,5 e 25 μg/mL. A CIM do

metronidazol foi determinada em 0,5 μg/mL para a cepa sensível e 128 μg/mL para a

cepa resistente, revelando a importância da atividade antiHelicobacter pylori dessas

substâncias de origem vegetal (YIN et al., 2006).

Zaidi et al. (2009), em avaliação da atividade in vitro antiHelicobacter pylori

de 50 extratos naturais de plantas medicinais utilizadas empiricamente para o

tratamento de desordens do trato gastrointestinal no Pasquistão, concluíram que

apenas 5 extratos (Curcuma amada Roxb.; Mallotus philippinenssis Muell.; Myristica


fragrans Houtt. (Aril); Psoralea corylifolia L. e curcumina) possuíam atividade

bactericida potencial, ressaltando ainda a importância de estudos in vivo que

forneçam mais dados sobre a administração segurança desses fitoterápicos.

Já foi isolado um composto, sulforafano de isotiocianato, do broto de brócolis

que teve a eficácia comprovada como potente bacteriostático frente a H. pylori,

inclusive contra cepas resistentes, como bactericida intra e extracelular (FAHEY et

al., 2002) e que em modelo animal in vivo reduziu a colonização bacteriana no

estômago, atenuou a expressão do TNFα e IL1 e reduziu a inflamação da mucosa

gástrica. Em teste em humanos, foram inseridos brotos de brócolis na alimentação

de pacientes acometidos da infecção pela H. pylori durante oito semanas, resultando

ao final na redução da expressão da urease pela bactéria, detectada pelo teste de

ureia respirada, redução na detecção de antígenos da bactéria e de pepsinogênio,

quando comparado ao placebo (alfafa). Yanaka et al. (2009) sugerem que esse

tratamento parece fornecer uma proteção da mucosa gástrica frente o estresse

oxidativo induzido pela H. pylori.

Em relação a E. spectabile não foi detectada inibição do crescimento da H.

pylori a partir dos extratos avaliados neste estudo. Entretanto esse screnning foi

importante para o estudo inicial dessa bromélia, tendo em vista a existência de

poucos relatos de análise fitoquímica ou de potencial biológico desse vegetal.

Apesar de não impedir a proliferação bacteriana, já foi relatada a atividade do extrato

etanólico da E. spectabile contra úlceras gástricas em modelo animal, sugerindose

que esta planta apresenta atividade gastroprotetora, provavelmente a partir dos

compostos fenólicos (CARVALHO et al., 2010). Em outro estudo foi reportada a

detecção de compostos fenólicos totais (64,38 mg/g de amostra) e flavonoides totais

(8,95 mg/g de amostra) no extrato etanólico, o qual mostrou atividade antioxidante

(SANTANA et al., 2011). Até esse momento, apenas um trabalho (SÁ et al., 2012)

utilizando essa espécie vegetal para análise da ação antibacteriana mostrou boa

atividade frente E. coli e Corynebacterium spp., sendo estes dados opostos ao

detectado neste trabalho frente a H. pylori. Apesar de se tratarem de bactérias Gram

negativas, devese ressaltar que existem diferenças entre os gêneros bacterianos

avaliados, e que os componentes dos extratos aqui testados não foram capazes de


inibir a atividade celular da H. pylori, mas esse dado não descarta sua eficácia frente

outras bactérias ou até outros microrganismos.

Quanto à toxicidade determinada pelo ensaio hemolítico foi constatado que o

SCFO a 500 μg/mL apresentou porcentagem de hemólise de 25,04%. Tomandose

como parâmetro os critérios estabelecidos por Nofiani et al. (2011), a toxicidade do

SCFO nessa concentração pode ser considerada intermediária, uma vez que

aqueles autores consideram como toxicidade elevada porcentagens de hemólise

acima de 40% e baixa toxicidade para valores inferiores a 10%. Por outro lado, em

concentrações abaixo de 100 μg/mL (0,99% de hemólise) o óleo do S. cumini

apresenta baixa toxicidade. Como a CIM foi determinada em 205 μg/mL, temse que

a toxicidade hemolítica do SCFO estaria entre 0,99% e 20,07%, as quais

correspondem, respectivamente, as concentrações de 100 e 500 μg/mL. Tal

resultado indica que um possível isolamento do composto ativo do óleo e uma

formulação farmacêutica adequada podem reduzir ainda mais os níveis de

toxicidade apresentados.

Em relação à citotoxicidade em cultura de células foi verificado, para o SCFO,

que em células VERO a viabilidade celular na concentração de 260 μg/mL, próxima

a CIM para a H. pylori, foi de aproximadamente 50%, enquanto que para a linhagem

HeLa, na mesma concentração, a viabilidade ficou em torno de 20%. Considerando

se a menor viabilidade de células HeLa, que são de origem neoplásica, em

comparação a VERO, que são apenas imortalizadas, novos estudos são

necessários para avaliar se esse fenômeno se deve à toxicidade diferente para

células humanas e de macaco, ou se o óleo apresenta uma toxicidade seletiva para

células neoplásicas. Para isso, são necessários novas análises de toxicidade em

células humanas normais e neoplásicas, estudos moleculares visando determinar o

provável mecanismo de ação, além de ensaios in vivo em modelos animais, visando

a comprovação da eficácia e segurança do seu uso préclínico.

Uma vez vencidas todas essas etapas, sendo confirmada a atividade

antineoplásica, esse óleo poderá vir a ser o produto ideal para o tratamento da

infecção pelo H. pylori, caso apresente, concomitantemente, atividade antibacteriana

e antineoplásica, o que seria extremamente desejável. Como a H. pylori está

intimamente relacionada ao desenvolvimento de câncer gástrico, o tratamento com


uma droga com estas duas propriedades seria eficaz em qualquer estágio da

infecção bacteriana.

Trabalhos sobre a toxicidade de fitoterápicos obtidos do S. cumini são

escassos. Barh e Viswanathan (2008) obtiveram o extrato metanólico da pele da

fruta do S. cumini e detectaram efeito inibitório dose e tempodependentes de

células das linhagens HeLa (HPV18+) e SiHa (HPV16+) pelo ensaio do MTT e

ainda em outro ensaio (Hoechst 33342) identificaram características de apoptose em

20,5% para HeLa e 16,1% para SiHa tratadas com esse extrato do S. cumini na

concentração de 80% após 48 horas de exposição, sugerindo essa via como

provável mecanismo de ação do referido fitoterápico. Em outro estudo foi detectado

efeito citotóxico em concentrações variando de 0,04 µg/ml a 3 µg/ml dos óleos

essenciais de outros vegetais, Eugenia caryophyllata, Thymus vulgaris e Zataria

multiflora, pelo ensaio do MTT utilizando as linhagens VERO, HepII, HeLa

(RAHIMIFARD et al., 2009). Todavia, ainda são reduzidos os números de

publicações que forneçam dados a respeito da toxicidade em cultura de células de

fitoterápicos e fitofármacos.

Esse foi o primeiro trabalho a avaliar atividade antiHelicobacter pylori dos

extratos orgânicos obtidos do S. cumini e do E. spectabile e reafirmase a

importância na continuidade de experimentos mais avançados para a avaliação

detalhada do óleo essencial do S. cumini. Dados fitoquímicos são necessários para

a análise do princípio ativo do SCFO de modo a avaliar uma formulação mais

adequada, que aperfeiçoe sua eficácia antimicrobiana e reduza os danos citotóxicos,

para um futuro emprego préclínico.

Além disso, baseado nas informações coletadas no ensaio de toxicidade em

hemácias e células HeLa e VERO, novas abordagens podem ser avaliadas para

incorporar maior conhecimento a este fitofármaco, que seriam avaliações das

atividades antifúngica, antiviral, antimalárica, antineoplásica frente diferentes

linhagens tumorais, além de avaliar a citotoxicidade em células normais originadas

de tecidos diversos, como, por exemplo, em fibroblastos.

Essas informações são úteis à comunidade científica por prover dados

importantes para a possível validação de um fitoterápico assim como trazem a


chance de conhecimento sobre a segurança de seu emprego por populações e

comunidades, que empiricamente utilizam esses extratos vegetais.

Por fim, todos os dados compilados aqui refletem a importância de cada

estudo que comprove a eficácia como atividade biológica e o posterior estudo

avançado de toxicidade permitindo progressos na terapêutica de uma doença de

importância pública mundial.


7. CONCLUSÕES

Os extratos orgânicos obtidos das folhas do S. cumini e E. spectabile,

avaliados neste estudo, não foram capazes de inibir o crescimento da H. pylori nas

concentrações testadas.

O óleo essencial extraído das folhas do S. cumini foi eficaz frente à H. pylori

com CIM de 205 μg/mL, apresentando, no entanto, toxicidade intermediária, quanto

à hemólise, e elevada em relação às linhagens de células HeLa e VERO, ao exibir

redução de viabilidade celular de 80% e 50%, respectivamente.

O SCFO mostrou indícios iniciais de que poderá ser uma possível alternativa

ou complementação para o tratamento de infecção pela H. pylori associado ao

câncer, por induzir a morte de células cancerígenas (HeLa) em proporção superior à

citotoxicidade em células não neoplásicas (VERO). Entretanto novas análises mais

minuciosas se fazem necessárias, como a análise fitoquímica o isolamento do

composto ativo e a elaboração de um sistema de liberação de fármacos, para que

esse fitoterápico possa ter efeitos tóxicos avaliados in vivo, podendo proporcionar

sua utilização, futuramente, em testes préclínicos.


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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-Helicobacter pylori E