Avaliação da expressão de lipídeos em glândulas sebáceas · hiperplasia sebácea, foliculite, esteatocistoma, adenocarcinoma sebáceo, carcinoma sebáceo, bem como as alterações

Objetivo: avaliar a expressão lipídica da GS de

camundongos NOD (diabéticos não-obesos) e

tratados com exercícios físicos de natação e

comparar as colorações específicas de

histoquímica do Sudan (III, IV e Black).

Métodos: foram utilizados 15 camundongos,

sendo 5 da linhagem Balb/C, que pertencem ao

grupo C (controle) e 10 da linhagem NOD

(diabéticos não-obeso). Os animais NOD foram

divididos em 2 grupos com 5 camundongos,

sendo, grupo DNT (diabético não tratado),

grupo DSEN (diabético submetido a exercício

de natação). Os animais foram sacrificados e

coletados a pele do dorso para marcação dos

lipídios das GS através dos métodos Sudan e

análise da sua densidade. Resultados: A

histoquímica com Sudan Black, frente a

amostras de tecidos congeladas, demonstrou

melhor expressão lipídica da GS. Além disso,

permitiu avaliar a recuperação morfológica da

GS no grupo DSEN e uma aparência

morfológica disforme no grupo DNT.

Conclusão: O exercício físico promoveu a

recuperação dos tecidos dos animais diabéticos

e o método histoquímico com Sudan torna-se

viável quando aplicado em material congelado.

ABSTRACT

1 Departamento de Morfologia e Patologia

Básica, Faculdade de Medicina de Jundiaí

(FMJ) Jundiaí, São Paulo, Brasil.2 Instituto de Ciências da Saúde, ICS, da

Universidade Paulista (UNIP), Campus

Jundiaí, Jundiaí, São Paulo, Brasil.3 Serviço de Anatomia Patológica do

Hospital A.C. Camargo Câncer Center, São

Paulo (SP), Brasil.

Correspondência:

Prof. Dr. Clóvis Antonio Lopes Pinto.

Departamento de Morfologia e Patologia,

Faculdade de Medicina de Jundiaí, São Paulo,

Brasil. Rua Francisco Telles, 250, Vila Arens,

Jundiaí – SP, Brasil. CEP. 13202-550, Cx.

Postal 1295. E-mail: [email protected].

RESUMO

Introdução: A glândula sebácea (GS)

secreta uma substância oleosa rica em lipídios,

estando envolvida em diversos processos

inflamatórios, infecciosos e neoplásicos da

pele, podendo estar relacionados com doenças

específicas como o diabetes mellitus. Desta

maneira, a sua marcação torna-se importante

para a identificação da expressão lipídica em

casos de doenças cutâneas envolvendo as GS.

Perspectivas Médicas, 30(1): 5-12, jan/abr. 2019. DOI: 10.6006/perspectmed.02012017.3689632215

ARTIGO ORIGINAL

Avaliação da expressão de lipídeos em glândulas sebáceas de camundongos diabéticos pelo método histoquímico com Sudan III, IV e Black.

Evaluation of lipid expression in sebaceous glands of diabetic mice by the histochemical method with Sudan III, IV and Black.

Palavras-chave: Adipócitos, Diabetes Mellitus Tipo I, Lipídeos, Patologia.

Key-words: Adipocytes, Diabetes, Lipids, Pathology.

1,2Geovane Ribeiro dos Santos , 1,2Jéssyca Cristina Ramos Ferreira ,

1,2Taís Fernanda Leida Corbari1 Raphael Cruz Seabra Prudente ,

1,3*Clóvis Antonio Lopes Pinto ,

5

6

Introduction: Sebaceus glands (SG)

secrete one substance rich in lipids, being

involved in some inflammatory, infectious and

neoplasm process of the skin, being able related

with specifical diseases as diabetes mellitus.

Therefore, this marker becomes important for

identification of the expression of the lipids in

some cases of cutaneous diseases that involved

sebaceous gland. Objective: Evaluate the

expression of the lipids in SG in NOD mouses

(diabetics no fat) and treated with physical

exercises of swimming, comparing the specific

color in sudan histochemistry (III, IV and

black). Metods: It was used 15 mouses, being of

the lineage Balb/c, that belong to C group

(control) and 10 of the Nod lineage (diabetics no

fat). The NOD animals was divided in 2 groups

with 5 mouses: DNT group (diabetic no treated)

and DSSE group (diabetical submitted to

swimming exercise). The animals was

sacrificed, and the skin of the back was collected

to lipid marking of the sebaceous glands

through the sudan method and density analysis.

Results: histochemistry with black sudan in

demonstrate in frozen samples one better

expression of lipids in SG. Besides that, permit

evaluate the morphological recuperation of SG

in DSSE group and one morphological

appearance unsual in DNT group. Conclusion:

Physical exercise promoted the tissue

recuperation in diabetical animals and the

method histochemistry with Sudan becomes

viable when applied in frozen material.

INTRODUÇÃO

A glândula sebácea (GS) é um órgão glandular pequeno alojado na derme e tem como função a secreção de uma substância oleosa rica em lipídios, estando a mesma envolvida nos processos infecciosos e

(1,2)inflamatórios como a acne e queratose pilas e também nas neoplasias como o adenoma sebáceo, sebaceoma e o carcinoma de GS,

sendo o último um tipo raro e agressivo de (3,4)

câncer . O diagnóstico histológico dessas doenças se faz pela identificação de células com

(5)vacúolos de gordura . Trabalhos científicos realizados anteriormente relatam dificuldade

(6)do diagnóstico tanto clínico como histológico .

As neoplasias da pele com diferenciação sebácea são infrequentes e de difícil diagnóstico histológico. Em alguns casos, há a necessidade de confirmar esta diferenciação bem como o número de células sebáceas para determinar a histogênese da lesão cutânea. O método utilizado para o diagnóstico histopatológico é a coloração especifica em histoquímica com

(7-9)Sudan , sendo um corante que marca os (10-11)

lipídios . Desta maneira pode-se explorar esse marcador, visando avaliar sua qualidade na diferenciação sebácea, quando aplicado em amostras a fresco congelado e nas amostras de rotina de laboratório histopatológico que são submetidas a inclusão em parafina e coloração

(12-14)de hematoxilina e eosina (HE) . Pode-se t a m b é m f a z e r u s o d a t é c n i c a d e histomorfometria estática, que nos permite avaliar quantitativamente a estrutura do tecido nos índices estáticos de arquitetura em seus parâmetros como volume, espessura, área e

1 5diametro . Em adição , a t écn ica de histomorfometria e os marcadores da expressão lipídica em histoquímica podem ser utilizados também em situações clínicas específicas que alteram a histofisiologia desta glândula, como hiperplasia sebácea, foliculite, esteatocistoma, adenocarcinoma sebáceo, carcinoma sebáceo, bem como as alterações cutâneas causadas pelo

(16,17,19,20)diabetes mellitus .O diabetes mellitus é um problema de saúde

pública mundial que atinge milhões de pessoas e provoca graves alterações patológicas nos diversos sistemas orgânicos, inclusive o

(21)tegumentar . Na pele já é demonstrado que o diabetes provoca redução no volume dos ácinos glandulares, acúmulo de lipídios nos ácinos e estroma glandular, diminuição dos ductos glandulares, atrofia celular, desorganização

( 1 8 , 1 9 )das b iomembranas , aumento dos componentes fibrilares da matriz extracelular, presença de células inflamatórias e aumento de

(22)algumas enzimas como a catalase .

Avaliação da expressão de lipídeos em glândulas sebáceas... - Geovane Ribeiro dos Santos e cols.


7

Como tratamento do diabetes, existe inúmeras alternativas como aplicação diária da insulina e monitorização do nível glicêmico, dieta alimentar, uso de droga terapêutica e a

(23)prática regular de atividade física . A prática do exercício físico é um

(24,25)importante auxiliar no controle da glicemia . A atividade física regular gera o aumento do gasto energético, além de ajudar na perda de

(26,27)peso . O gasto de energia gerado pela prática do exercício auxilia no controle da glicemia porque promove o consumo pelo

(27)organismo da glicose . O exercício físico além de promover a diminuição da glicemia, melhora a sensibilidade à insulina, estimula a queima de calorias, ajuda a liberar hormônios dentre eles

(22)os de estrógeno , cortisol e testosterona, entre

(25,27)outros benefício . O objetivo do presente estudo foi avaliar

a eficácia da técnica de coloração específica de histoquímica com Sudans III, IV e Black, na identificação de células sebáceas e sua expressão l ipídica. Avaliar também a m o r f o l o g i a e d e n s i d a d e d a s G S e m camundongos sadios, diabéticos espontâneos não-obeso e após tratamento com exercício físico de natação.

MÉTODO

Planejamento ExperimentalUtilizou-se 15 camundongos sendo 10 da

linhagem NOD (diabéticos não-obeso) e 5 da linhagem Balb/C. Os animais foram divididos nos seguintes grupos:

G1 (grupo C): 5 camundongos Balb/C controle sadios;

G2: (grupo DNT): 5 camundongos NOD não tratados;

G3: (grupo DSEN): 5 camundongos NOD submetido a exercício de natação.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Jundiai, Brasil (Protocolo 351/2011).

TratamentosOs animais do Grupo DSEN foram tratados

com treinamento físico através da natação e com duração média de 30 minutos, cinco vezes por semana em um período máximo de 21

(23)dias .

Realizou-se monitoramento diário para avaliar os níveis de glicosuria (mg/dL) e os níveis de proteína (mg/dL) na urina dos animais. A urina foi coletada diariamente através de compressão manual na região da bexiga urinária, desprezando-se a primeira gota. Em seguida o concentrado de urina foi analisado com uso da fita reagente (MultistiK 10 SG Bayer) e usou como referência a tabela fornecida pelo fabricante para as mensurações

(16)dos níveis dos elementos citados acima .Os animais foram considerados diabéticos

quando apresentaram valores superiores a 300 ( 1 6 )mg/dL . Para confirmar e garantir a

credibilidade dos valores que indicam que os animais apresentam um estado hiperglicêmico, os mesmos foram submetidos semanalmente a análise dos níveis de glicose no sangue com o aparelho Accu-Chek Performa, (Roche®, NY, USA) utilizando a fita reagente (Performa,

(16)Roche®, NY, USA) .

Coleta (Procedimentos cirúrgicos)Após 21 dias do início do experimento, os

a n i m a i s f o r a m a n e s t e s i a d o s c o m cetamina/xilazina (1:1), na dosagem de 6,8 mg/kg de xilazina e 130 mg/kg de cetamina por peso corpóreo, para a retirada de amostras de p e l e d a re g i ã o d o d o r s o . A p ó s e s t e procedimento, os animais foram eutanásiados com aumento da dosagem de anestésico.

Técnicas HistológicasAs amostras coletadas foram divididas em

dois fragmentos para diferentes técnicas histológicas de fixação do tecido. Ambos os

(7)fragmentos foram corados em HE , e com coloração especifica de histoquímica do Sudan III, IV e Black, para analisar a expressão

(8,11,13,14)lipídica das GS .

O primeiro fragmento foi submetido a uma solução de PBS (solução salina tamponada) para pré-fixação. Em seguida, realizou-se a inclusão da amostra com uso de Tissue Tek OCT (Optimal Cutting Temperature), as amostras

(7)foram congeladas com nitrogênio líquido e mantidas em Biofreezer à -80ºC, o qual, permitiu obter cortes histológico de 08 µm de

(28)espessura no criostato para análise . O segundo fragmento foi fixado em formol a

10% tamponado com fosfato de sódio bibásico anidro e fosfato de sódio monobásico anidro.



8

Em seguida, foi submetido as técnicas de rotina através da desidratação e inclusão em parafina. Realizou-se cortes histológicos com 4 µm de

(7)espessura no micrótomo para análise .

Análise Microscópica As lâminas devidamente prontas foram

analisadas e fotografadas no microscópio de luz com sistema de captura de imagens, onde todas as observações de analise foram realizadas com objetivas planacromáticas. Estas lâminas foram utilizadas para a quantificação tridimensional dos tecidos, onde foi possível avaliar a densidade das glândulas sebáceas, utilizando o programa cellSens software de imagem digital de microscopia para aplicações em pesquisa. Foram realizadas medidas de área da GS.

Análise Estereologica e EstatísticaOs valores obtidos foram submetidos ao

teste de variância (Anova) pelo software BioEstat 5.3. Quando houve diferença entre os

grupos estudados, utilizou-se o teste Tukey com (29)

mínimo 5% de significância (p<0.05) .

RESULTADOS

Comparação da morfologia da GS entre os grupos de animais

Nas amostras a fresco que foram congeladas e submetidas ao Sudan, notou-se na derme a presença de células sebáceas. Devido à característica do Sudan em marcar as regiões lipídicas do tecido como um todo, o mesmo não possibilitou a identificação definida do conteúdo intracelular, por exemplo, os núcleos (fig. 1A, 1B, 1C).

Não foi possível avaliar as amostras inclusa em parafina e corada com o método de histoquímica do Sudan, já que essas amostras ao serem submetidas à técnica de rotina laboratorial, no qual tem como objetivo expelir água e gordura para permitir a entrada da parafina, impossibilita que o corante seja eficaz na marcação dos lipídios expelidos (fig. 1D, 1E, 1F).

Figura 1: Fotomicrografias de cortes dos tecidos congelados e parafinizados, de camundongos sadios, paracomparação da coloração específica para lipídios. A: Coloração Sudan III em tecido congelado. B: ColoraçãoSudan IV em tecido congelado. C: Coloração Sudan Black em tecido congelado. D: Coloração Sudan III em tecido parafinizado. E: Coloração Sudan IV em tecido parafinizado. F: Coloração Sudan Black em tecido parafinizado. A, B, C, D, E e F: GS (circulo preto).



9

Comparação da expressão lipídica da GS

entre as técnicas histológicas utilizadas

As amostras a fresco que foram congeladas

e submetidas à marcação com Sudan, permitiu

boa expressão de lipídios e consequentemente

boa definição das GS. As colorações específicas

em histoquímica para marcação da expressão

lipídica apresentou-se de forma leve na cor

amarelo-alaranjado com Sudan III, moderada

de tom vermelho com Sudan IV e forte de cor

preto com Sudan Black, sendo o último de

melhor representatividade na expressão das GS

dos grupos experimentais estudados (fig. 2A,

2B, 2C). Optamos em prosseguir com as

avaliações dos grupos experimentais com as

amostras submetidas ao Sudan Black, devido a

boa expressão lipídica apresentada pelo

corante.

Figura 2: Fotomicrografias de cortes dos tecidos congelados de camundongo do Grupo C, apresentando manchas de gorduras e expressão lipídicas intracitoplasmáticas em células sebáceas com Sudan III(A), IV(B) e Black(C): GS (circulo preto).



10

No grupo C, nas amostras a fresco que

foram congeladas e submetidas ao Sudan,

notou-se na derme GS de formato alveolar e a

presença de células sebáceas (fig. 3A).

No grupo DNT, observamos as GS com

orientação irregular na derme além de

fragmentada e com característica morfológica

disforme. A coloração do Sudan marcou as

regiões com presença de lipídios, permitindo a

localização da GS (fig. 3B).

No grupo DSEN observou boa expressão de

lipídios, bem como da recuperação morfológica

da GS com aspecto semelhante ao grupo C e

com volume bem acentuado da mesma (fig 3C).

Figura 3: Fotomicrografias de cortes dos tecidos congelados de camundongos, apresentando mancha degordura e expressão lipídica em células sebáceas, possibilitando visualizar a diferença GS, quanto a sua d i m e n s ã o , p o r c o l o r a ç ã o h i s t o q u í m i c a c o m S u d a n B l a n c k . A: Grupo C. B: Grupo DNT. C: Grupo DSEN. A, B e C: GS (circulo preto).

Análise Estereológica e Estatística

A média e o desvio padrão dos volumes da

GS observadas nos grupos C, DNT, DSEN

foram 1367.942 ± 291.08; 414.526 ± 137.37;

1949.988 ± 600.23, respectivamente (Figura 4).

A análise estatística demonstra que há diferença

significativa entre o grupo C e DNT, a mesma

confirma a recuperação das GS do grupo DSEN

com os valores apresentados, quando

comparado ao do grupo C. Os valores diferem

e m s i g n i f i c â n c i a , o n d e p < 0 . 0 1 .

Figura 4: Gráfico de variação da área (µm²) das GS dos grupos estudados, com a coloração específica de histoquímica do Sudan Black.



11

DISCUSSÃO

O presente trabalho demonstra uma

diferença entre os métodos de histoquímica dos

Sudans , como re la tado em trabalhos (8,11)

anteriores , sendo o Sudan Black de melhor

expressão lipídica nas GS. Identificamos a

limitação do Sudan frente as amostras de

material de rotina submetido a inclusão em (8,11,13,14)

parafina .

Nas análises da morfologia da pele do

grupo C, notou-se que as GS apresentaram-se

no formato alveolar, com células arredondadas

e acumulo de lipídios no citoplasma.

Com relação ao grupo DNT notou-se

alteração acentuada das GS no que se refere à

atrofia celular e os efeitos deletérios do diabetes

na GS podem estar relacionado com a

hiperglicemia que induz anormalidades

celulares por várias vias metabólicas como a

glicação não-enzimática das proteínas,

ativação da aldose redutase, ativação do

diacilglicerol fosfatil quinase C e diminuição da

hidratação através da inibição da transdução (30,31)

do sinal da insulina .

Nos animais do grupo DSEN, tratados com

exercício de natação, notou-se recuperação

tecidual da GS, ficando com características

morfológicas semelhantes as do Grupo C, em

alguns casos até mais volumosas. Isto foi

demonstrado também na estereologia onde se

notou valores próximos da área da GS entre os

grupos C e DSEN. Este resultado foi possível

pelo fato do exercício físico promover a

circulação sanguínea e oxigenar melhor os (17,30)órgãos do corpo, inclusive a pele . Em

adição, outras pesquisas vêm demonstrando

que o exercício influencia na diminuição da

glicemia sérica ao fazer uso das fontes de

energia que tendem a liberar hormônios, dentre 23,24-eles, o estrógeno, cortisol e a testosterona(

27,31). Estudos mostraram que a insulina em

conjunto com o estrógeno pode promover o

controle dos níveis de glicose e reestruturar os (18,19,31)

tecidos danificados por esta doença .

Assim sendo, o estudo nos possibilitou

observar que há diferença considerável, entre os

Sudans utilizados no método da coloração

específica em histoquímica, para marcar

lipídios em tecidos congelados, sendo o Sudan

Black de melhor expressão lipídica. Com

relação aos grupos experimentais foi possível

notar o quanto o exercício físico se torna viável,

por colaborar promovendo qualidade de vida,

durante o tratamento do diabetes auxiliando na

recuperação dos tec idos das GS dos

camundongos diabéticos.

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