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CATHERINE NATÁLIA PEREIRA
Avaliação da Função da Fibrilina-1 na
Trombogênese Arterial.
Análise Proteômica.
Campinas
2015
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vi
vii
RESUMO
Fibrilina-1 (FBN-1) é um importante componente da rede de microfibrilas da matriz
extracelular (MEC). As microfibrilas estão presentes nas fibras elásticas que são
responsáveis pela resiliência de tecidos como pulmões, pele e grandes vasos. Mutações no
gene da fibrilina-1 estão associadas à Síndrome de Marfan, doença autossômica dominante,
caracterizada por uma desordem do tecido conjuntivo. Pacientes com esta Síndrome
apresentam anomalias no sistema esquelético e trato cardiovascular.
Dados da literatura relacionam a menor quantidade de FBN-1 na MEC com a
atividade exacerbada do TGF-β promovendo a quase totalidade das alterações fenotípicas
encontradas. Estudos preliminares em nosso laboratório com camundongos que possuem
menor quantidade de FBN-1 de um camundongo normal tem demonstrado que necessitam
do dobro do tempo para a formação de trombo em um modelo de trombose arterial. As
plaquetas tem fundamental importância neste processo, quando são ativadas secretam
várias moléculas que determinam a formação dos trombos. Realizamos um estudo
comparativo do proteoma de plaquetas e da artéria aorta de camundongos selvagens e
deficientes em FBN-1, através da técnica de eletroforese bidimensional (2DE) juntamente
com a espectrometria de massas a fim de encontrar diferenças no perfil proteico que
justificassem tais sintomas.
Diversas proteínas plaquetárias foram encontradas apenas no grupo controle, como
endoplasmina, fator de von Willebrand, calpaína, dentre outras; assim como a proteína
vinculina foi encontrada apenas no grupo deficiente em FBN-1. Todas as proteínas
encontradas podem ser de grande interesse para o esclarecimento a respeito do maior tempo
de formação de trombo e os sintomas relacionados à Síndrome de Marfan.
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ix
ABSTRACT
Fibrillin-1 (FBN-1) is an important microfibril network component of extracellular
matrix (ECM). Microfibrils are present in elastic fibers responsible for tissues resiliency,
such as lungs, skin and great vessels. Mutations in fibrillin-1 gene are associated with
Marfan Syndrome, a dominant autosomal disease characterized by connective tissue
disorder. Patients with this syndrome show abnormalities in skeletal system and
cardiovascular tract, aorta dilatation and aneurysms.
Literature data relate less FBN-1 in the ECM with TGF-β heightened activity,
promoting almost all the phenotypic alterations. Preliminary studies in our laboratory
demonstrated that mice containing half amount of FBN-1 presented prolonged thrombosis
time when compared to wild-type mice submitted to an arterial thrombosis model. Platelets
are important in this process, when activated they release several molecules and factors
which determine thrombi formation. We conducted a comparative proteome study of
platelet and aorta from wild-type against FBN-1 deficient mice by two-dimensional
electrophoresis (2DE) coupled with mass spectrometry in order to find some differences in
protein profile that could justify such symptoms.
Several platelet proteins were found only into control group, as endoplasmin, von
Willebrand factor, calpain; as well as vinculin was found only in the FBN-1 deficient
group. All proteins found may have great interest for understanding the prolonged
thrombus formation time, and symptoms related to Marfan Syndrome.
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xi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ………………………………………………………….……..
1.1 Matriz extracelular e Fibras elásticas .........................................................
1.2 Rede de microfibrilas e Fibrilina-1 .............................................................
1.3 Síndrome de Marfan ………………………………………………...........
1.4 Modelo Fotoquímico de Indução de Trombo..............................................
1.5 Plaquetas.......................................................................................................
1.6 Proteômica ………………………………………………………………....
1.7 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida...........................
1.8 Identificação de Proteínas por Espectrometria de Massas............................
1.8.1 Q-ToF (Quadrupolo – Tempo de voo)..............................................
1.9 Limitações e vantagens da 2DE-MS................................................................
2. OBJETIVOS..........................................................................................................
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................
2.2 Objetivos Específicos..................................................................................
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................
3.1 Preparação das Amostras.............................................................................
3.1.1 Animais...........................................................................................
3.1.2 Tratamento com Losartan................................................................
3.1.3 Coleta de sangue de Camundongos................................................
3.1.4 Lavagem de Plaquetas......................................................................
3.1.5 Extrato Proteico de Artéria Aorta...................................................
3.1.6 Coleta de Sangue de Pacientes com Síndrome de Marfan..............
3.1.7 Dosagem de proteínas – Método de Bradford................................
3.2 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida...........................
3.2.1 Isoeletrofocalização - Primeira dimensão…………………….......
3.2.2 SDS-PAGE - Segunda dimensão………...........................……….
3.3 Análise de Imagem 2D................................................................................
3.4 Identificação de Proteínas por Espectrometria de Massas..........................
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................
4.1 Padronização da Técnica 2DE.....................................................................
4.2 Análise Proteômica de Plaquetas - Intra Grupos..........................................
4.2.1 Grupo Controle – Camundongos Selvagens………………..…......
4.2.2 Grupo Controle tratado com Losartan 15 mg...................................
4.2.3 Grupo Controle tratado com Losartan 30 mg...................................
4.2.4 Grupo Deficiente em Fibrilina-1.......................................................
4.2.5 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg........
4.2.6 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg........
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4.3 Análise Proteômica Comparativa de Plaquetas - Inter Grupos.......................
4.3.1 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 15 mg...................
4.3.2 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 30 mg...................
4.3.3 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com
Losartan 15 mg.................................................................................51
4.3.4 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com
Losartan 30 mg.................................................................................
4.3.5 Controle x Deficiente em FBN-1....................................................
4.3.6 Controle x Deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 15 mg......
4.3.7 Controle x Deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 30 mg......
4.3.8 Spots Selecionados - Controle x Deficiente em FBN-1.................
4.4 Análise Proteômica de Aorta………………………………………....…..…...
4.4.1 Grupo Controle................................................................................
4.4.2 Grupo Deficiente em Fibrilina-1......................................................
4.5 Análise Proteômica Comparativa de Aorta....................................................
4.5.1 Grupo Controle x Grupo Deficiente em fibrilina-1.........................
4.5.2 Spots Selecionados..........................................................................
4.6 Análise Proteômica de Plaquetas Humanas...................................................
5. CONCLUSÃO.......................................................................................................
6. PERSPECTIVAS.................................................................................................
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................
8. ANEXO..................................................................................................................
52 53
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“É exatamente disso que a vida é feita: De momentos!
Momentos pelos quais temos que passar,
sendo bons ou não, para o nosso próprio aprendizado, por algum motivo.
Nunca se esquecendo do mais importante: Nada na vida é por acaso”
Chico Xavier
xiv
xv
Aos meus pais, Teresinha e Milton Wonei,
e irmãos, Milton e José Henrique,
pelo amor e apoio em todas as horas.
xvi
xvii
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Teresinha e Milton Wonei, pelo amor, carinho, incentivo, apoio
emocional e financeiro, pois sem vocês não seria quem eu sou hoje nem chegaria onde
cheguei. Ao meu irmão mais velho, Milton César, pelo exemplo, incentivo e por ser minha
fonte inspiradora dês do vestibular até hoje. Ao meu irmão mais novo, José Henrique, pelo
carinho, pelos bons momentos de descontração e exemplo de pessoa, líder e humano.
Ao Prof. Claudio, por ser mais que um professor, um verdadeiro “pai científico”, pela
confiança, por todo conhecimento, pelo exemplo de profissionalismo, paciência e toda
ajuda dês da minha iniciação científica, e apoio emocional nas horas difíceis.
Ao Prof. Camillo, por ter abraçado meu projeto com toda dedicação como se fosse
dele também, pela atenção, colaboração, por todas as dicas em proteômica, pela
prestatividade e dicas de “papers”.
Ao Prof. Daniel Martins, por toda ajuda, auxílio e dicas sobre a técnica de
proteômica. Mesmo com um oceano de distância, tudo via e-mail durante minha iniciação
científica, sem nem nos conhecermos. E ainda até hoje, ao longo do mestrado, por toda
ajuda e correções da dissertação, com toda humildade e disposição.
À Dra. Mariane Flores, pela paciência e por ter me ensinado toda parte prática da
técnica de proteômica, por ter colocado “mãos à obra” em pleno domingo.
À Denise Machado, por me ensinar os primeiros passos num laboratório de pesquisa,
quando entrei na IC sem saber absolutamente nada.
Ao técnico do nosso laboratório, Neto, por estar sempre disposto a nos ajudar, por
correr atrás dos materiais e reagentes com toda disposição, mesmo que em cima da hora e
pelo “papo cabeça” na hora do café.
xviii
Aos colegas de lab, Guilherme, Tallita, Danielle, Camila, Bruna, Gabriela; e as que já
saíram do lab, Talitinha e Izabela, pela ajuda experimental e por tornar os dias de trabalho
mais leves e descontraídos.
À Profa. Cristina, por ser tão atenciosa e disposta a nos ajudar.
À Andreia, da secretaria de pós-graduação, pela paciência e ajuda com os
documentos e serviços burocráticos.
À CnpQ e FAPESP pelo auxílio financeiro.
Ao programa de pós graduação de Biologia Funcional e Molecular do Instituto de
Biologia da UNICAMP.
A toda minha família e amigos que de alguma forma fizeram parte dessa jornada.
xix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.1 Eletromicrografia de tecido rico em fibra elástica (aorta) em desenvolvimento.
A – Visão geral do tecido rico em fibra elástica. B e C – Presença de uma região mais
eletrondensa, a elastina, e a rede de microfibrila. B – Corte longitudinal e C – Corte
transversal (Davis, 1994)........................................................................................................2
Figura 1.2 Estrutura molecular da Fibrilina-1 e LTBPs.........................................................4
Figura 1.3 Perfil de formação de trombos em Camundongos MAGP-/- (em cima) e
camundongos selvagens (em baixo) (Werneck et al., 2008)...................................................8
Figura 1.4 Comparação do tempo de oclusão trombótica após a indução fotoquímica de
trombo na artéria carótida direita de camundongos selvagens e de mg∆/+
, ambos os grupos
foram tratados com losartan e captopril. WT + PLA: selvagem + placebo; WT + LST:
selvagem + losartan 30mg; WT + CAPT: selvagem + captopril 30mg; mg∆/+
+ PLA:
deficiente em fibrilina-1 + placebo; mg∆/+
+ LST: deficiente em fibrilina-1 + losartan 30mg
e mg∆/+
+ CAPT: deficiente em fibrilina-1+ captopril 30mg.................................................9
Figura 1.5 Microscopia eletrônica de varredura de plaquetas discoides não ativadas (A) e
ativadas com ADP (B). Observe as extensões filopodiais finas e a forma irregular das
plaquetas ativadas, x 5000 (Zucker & Nachmias, 1985)......................................................10
Figura 1.6 Perfil bidimensional de um gel da 2DE. Plano cartesiano onde os pontos
representam os spots, que são teoricamente proteínas purificadas da célula ou tecido em
questão...................................................................................................................................15
Figura 1.7 Espectro de massas dos peptídeos trípticos. Cada um dos picos numerados
representa uma proteína. Modificado do original (Cheng & Wei, 2014).............................18
Figura 3.1 Fluxograma do tratamento de camundongos C57BL/6 e Fbn-1 mgΔ/+ com 4
semanas de idade, com Losartan nas concentrações 15 e 30 mg/Kg/dia, por 4
semanas.................................................................................................................................27
Figura 3.2 Esquema experimental de obtenção de Plaquetas. O sangue foi centrifugado a
2300 xg, 10 segundos/mL, obtém-se o PRP. PRP foi centrifugado a 2200 xg por 4 min,
obtendo-se o PPP. Pellet de plaquetas foi congelado a -80ºC……………………..……….28
Figura 3.3 Artéria aorta de camundongos para extração de proteínas e análise do
proteoma................................................................................................................................29
Figura 3.4 Equipamentos utilizados para a primeira dimensão da eletroforese. IGphor (GE-
Healthcare Life Science), à esquerda. Strip holder 18 cm, à direita.....................................31
xx
Figura 3.5 Cuba de eletroforese de duas dimensões, Amersham Biosciences. Corrida da
segunda etapa, segunda dimensão do gel..............................................................................32
Figura 4.1 2D-PAGE do conteúdo plaquetário de camundongos selvagens não tratados.
Coloração por impregnação por Nitrato de Prata. A1 e A2 representam duplicatas da
mesma amostra proteica, assim como B1 e B2, C1 e C2. Padrão de peso molecular à
esquerda, pI no topo..............................................................................................................37
Figura 4.2 Gel de poliacrilamida bidimensional do conteúdo proteico das plaquetas de
camundongos selvagens não tratados. A e B representam duplicatas da mesma amostra.
Coloração por Coomassie Blue-G. Padrão de peso molecular à esquerda, pI no topo da
figura.....................................................................................................................................38
Figura 4.3 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel controle 1, proteínas de plaquetas de
camundongos selvagens não tratados com Losartan.............................................................40
Figura 4.4 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel referência do grupo controle tratado
(Controle 15/1). Proteínas de plaquetas de camundongos selvagens tratados com Losartan
15mg/Kg/dia..........................................................................................................................41
Figura 4.5 Gel de poliacrilamida bidimensional, referência do grupo controle tratado
(Controle 30/1). Proteínas de plaquetas de camundongos selvagens tratados com Losartan
30 mg/Kg/dia.........................................................................................................................43
Figura 4.6 Gel de poliacrilamida bidimensional. Referência do perfil proteico das
plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 não tratados com Losartan (mgΔ/+
1)...........................................................................................................................................44
Figura 4.7 Gel de poliacrilamida bidimensional. Referência do perfil proteico das
plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 15 mg (mgΔ/+
15/1)......................................................................................................................................46
Figura 4.8 Gel de poliacrilamida bidimensional. Padrão do perfil proteico das plaquetas de
camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 30 mg (mgΔ/+
30/1)......................................................................................................................................47
Figura 4.9 Resumo experimental para comparações proteômicas entre os diversos grupos.
O gel referência de cada grupo foi selecionado para comparações entre os demais géis
referências dos outros grupos. ..............................................................................................49
Figura 4.10 Análise proteômica comparativa entre Controle 1, à esquerda, e o grupo
controle tratado com Losartan 15 mg (Controle 15/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes
representam spots semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam
spots presentes em apenas um dos géis.................................................................................50
xxi
Figura 4.11 Análise proteômica comparativa entre Controle 1, à esquerda, e o grupo
controle tratado com Losartan 30 mg (Controle 30/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes
representam spots semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam
spots presentes em apenas um dos géis.................................................................................51
Figura 4.12 Análise proteômica comparativa entre o grupo deficiente em fibrilina-1
(mgΔ/+), à esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg
(mgΔ/+ 15/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes
encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um
dos géis..................................................................................................................................52
Figura 4.13 Análise proteômica comparativa entre o grupo deficiente em fibrilina-1
(mgΔ/+), à esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg
(mgΔ/+ 30/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes
encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um
dos géis..................................................................................................................................53
Figura 4.14 Análise proteômica comparativa entre o grupo controle (Controle 1), à
esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+), à direita,
pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois geis.
Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis...............................54
Figura 4.15 Análise proteômica comparativa entre o grupo controle (Controle 1), à
esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg (mgΔ/+ 15/1), à
direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois
geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis......................55
Figura 4.16 Análise proteômica comparativa entre o grupo controle (Controle 1), à
esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg (mgΔ/+ 30/1), à
direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois
geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis......................56
Figura 4.17 Gel do grupo controle. Setas em preto indicam os spots significantemente
diferentes e selecionados para a espectrometria de massas. ..............................................57
Figura 4.18 Gel do grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+).
Setas em preto indicam os spots significantemente diferentes e selecionados para a
espectrometria de massas......................................................................................................58
Figura 4.19 Spot 1: Endoplasmina e spot 2: Fator de von Willebrand, expressos no grupo
controle (esquerda) e em menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita).........59
Figura 4.20 Sequência de acontecimentos na ativação plaquetária. (A) A adesão
plaquetária na superfície íntima vascular lesionada é mediada pela fixação do fator de von
Willebrand em seu receptor da membrana plaquetária GpIb. (B) As plaquetas se fixam
também na parede do vaso danificado mediante a ligação dos receptores de colágeno
xxii
(COL) ao colágeno subendotelial. Outros estimulantes plaquetários como trombina e
adrenalina se fixam aos seus recptores específicos. (C) Em resposta a esses diferentes
estímulos, plaquetas aderidas se ativam e liberam tromboxano A2 (TXA2) e adenosina
difosfato (ADP), que se fixam aos seus receptores plaquetários respectivos e amplificam o
processo de ativação. (D) A agregação plaquetária é mediada pela ligação de fibrinogênio
(FIB) ao seu receptor nas plaquetas circulantes, que dão lugar a formação de pontes de
fibrinogênio. O receptor FIB se forma mediante o acoplamento de GpIIb/IIIa na membrana
das plaquetas ativadas (Braunwald, 2006)............................................................................62
Figura 4.21 Spot 3: Fator de coagulação X, presente sob transformações pós traducionais
(círculo à esquerda), expressos no grupo controle (esquerda) e em menor quantidade no
grupo deficiente em FBN-1 (direita).....................................................................................64
Figura 4.22 Spot 6: Calpaína subunidade I, expressa no grupo controle (esquerda) e em
menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita). Dados não disponíveis sobre o
spot 7 e sobre o spot sem numeração (à direita, no grupo FBN-1).......................................66
Figura 4.23 Spot 8: Adenilil Ciclase, expressa no grupo controle (esquerda).....................67
Figura 4.24 Spot 9: α-sinucleina 1; spot 10: Proteassoma β6; spot 11: Peroxiredoxina 2;
spot 12: dados não disponíveis. Todos expressos no grupo controle (esquerda)………......68
Figura 4.25 Spot 13: Vinculina, mais expressa no grupo deficiente em FBN-1 (direita),
menos expressa no grupo controle (esquerda)......................................................................71
Figura 4.26 Imagem 3D da proteína Vinculina, muito mais expressa no grupo deficiente
em FBN-1 (direita), em comparação com o grupo controle (esquerda). Imagem obtida pelo
programa Melanie…………………………………………………………………….........72
Figura 4.27 Desenho esquemático do complexo Vinculina-actina-citoesqueleto, associado
com Integrinas. Modificado do original (Mierke, 2009).......................................................73
Figura 4.28 Gel referência do proteoma da artéria aorta de camundongos selvagens, grupo
controle (Controle 1).............................................................................................................76
Figura 4.29 Gel referência do proteoma da artéria aorta camundongos deficientes em
fibrilina-1 (mgΔ/+ 1).............................................................................................................77
Figura 4.30 Análise proteômica comparativa de aorta. Gel do grupo controle, à esquerda,
como o gel do grupo deficiente em FBN-1, à direita. Pontos verdes representam spots
semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em
apenas um dos géis................................................................................................................79
Figura 4.31 Análise proteômica comparativa do extrato proteico de aorta do grupo
controle. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e selecionados
para a espectrometria de massas...........................................................................................80
xxiii
Figura 4.32 Análise proteômica comparativa do extrato proteico de aorta do grupo
deficiente em fibrilina-1. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e
selecionados para a espectrometria de massas......................................................................81
Figura 4.33 Spot 7: Albumina Sérica. Spot 8: Proteína do choque térmico (do inglês Heat
shock cognate 71 kDa protein). Grupo controle à esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à
direita.....................................................................................................................................83
Figura 4.34 Spot 9: Annexin A1. Spot 16: Triose-fosfato isomerase. Grupo controle à
esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à direita....................................................................84
Figura 4.35 Spot 17: Miosina cadeia leve 4. Spot 18: Translationally-controlled tumor
protein. Spot 19: Miosina regulatória cadeia leve 2. Grupo controle à esquerda, grupo
deficiente em FBN-1 à direita...............................................................................................85
Figura 4.36 Gel de poliacrilamida bidimensional do proteoma de plaquetas humanas,
voluntários sem a Síndrome de Marfan................................................................................88
Figura 4.37 Gel de poliacrilamida bidimensional do proteoma de plaquetas humanas,
pacientes com a Síndrome de Marfan...................................................................................89
Figura 4.38 Prévia da análise proteômica comparativa de plaquetas humanas. Voluntários
sem a Síndrome de Marfan à esquerda, pacientes com a Síndrome à direita.......................90
xxiv
xxv
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1 Comparação dos géis do grupo controle, “n=5”. Num matches é o número de
spots encontrados aos pares. A semelhança dos géis está representada pela % matches.
Dados obtidos pelo programa Melanie.................................................................................40
Tabela 4.2 Comparação dos géis do grupo controle tratado com Losartan 15 mg, “n=4”.
Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança
dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie........42
Tabela 4.3 Comparação dos géis do grupo controle tratado com Losartan 30 mg, “n=5”.
Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança
dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie........43
Tabela 4.4 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1, “n=3”. Num matches é
o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança dos géis
comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo
Melanie..................................................................................................................................45
Tabela 4.5 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan
15 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A
semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo
Melanie..................................................................................................................................46
Tabela 4.6 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan
30 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados aos pares nos dois géis
comparados. A semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados
obtidos pelo Melanie.............................................................................................................48
Tabela 4.7 Resumo dos dados das comparações inter grupos. Num matches representa o
número de spots pareados. A semelhança entre cada gel é representada por %
matches..................................................................................................................................56
Tabela 4.8 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de plaquetas. Dados obtidos por
espectrometria de Massas......................................................................................................59
Tabela 4.9 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a Endoplasmina, spot 1, em
relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-
1.............................................................................................................................................60
Tabela 4.10 Dados obtidos pelo Melanie sobre o Fator de Von Willebrand, spot 2, em
relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-
1.............................................................................................................................................61
xxvi
Tabela 4.11 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a proteína Vinculina, spot 13, em
relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-1.…......72
Tabela 4.12. Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do grupo controle, “n=4”.
Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. % matches é a
semelhança dos géis. Dados obtidos pelo Melanie...............................................................76
Tabela 4.13 Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do deficiente em fibrilina-1,
“n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A
semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo
Melanie..................................................................................................................................78
Tabela 4.14 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de aorta. Dados obtidos por
espectrometria de massas.………………………………………………………………….82
1
1. Introdução
1.1 Matriz extracelular e Fibras elásticas
A matriz extracelular é um biopolímero complexo, exclusiva dos animais, que une as
células, confere resistência e flexibilidade aos tecidos e permite a comunicação intercelular,
desempenhando papéis na organogênese e na hemostase (Hubmacher & Apte, 2013). É
constituída por colágenos, fibras elásticas, proteoglicanas e glicoproteínas (Craft et al.,
2010).
As fibras elásticas são importantes componentes da matriz extracelular de estruturas
ou órgãos que estão submetidos ao constante estresse mecânico, tais como pulmão, pele e
grandes vasos. Através da análise ultra-estrutural, é possível identificar dois componentes
bem distintos: uma rede de microfibrilas com diâmetro de aproximadamente 12 nm
entremeada por uma substância mais elétron-densa e amorfa formada pela elastina (Figura
1.1) (Baldwin et al., 2013).
A fibra elástica madura se constitui a partir da deposição de tropoelastina, molécula
que tem como principal característica a presença de domínios hidrofóbicos alternados por
domínios de reações cruzadas (cross-link) ricos em lisina e tem massa molecular de
aproximadamente 70 kDa. Na matriz extracelular, a tropoelastina se auto agrega num
processo denominado coacervação, onde domínios hidrofóbicos de diferentes moléculas se
alinham, formando o agregado, que por sua vez são covalentemente ligados através da ação
de enzimas do tipo lisil oxidases sobre os resíduos de lisina dos domínios de reações
cruzadas, formando a elastina (Halper & Kjaer, 2014).
Há algum tempo, muitos pesquisadores tem demonstrado a importância de moléculas
da matriz extracelular não só como parte de um arcabouço estrutural, mas também na
2
determinação do destino das células circunvizinhas através da regulação da ação de fatores
de crescimento que influenciam os mais diferentes processos celulares, desde a
diferenciação até a proliferação (Halper, 2014).
Figura 1.1 Eletromicrografia de tecido rico em fibra elástica (aorta) em desenvolvimento.
A – Visão geral do tecido rico em fibra elástica. B e C – Presença de uma região mais
eletrondensa, a elastina, e a rede de microfibrila. B – Corte longitudinal e C – Corte
transversal (Davis, 1994).
1.2 Rede de microfibrilas e Fibrilina-1
As microfibrilas são constituídas por vários componentes dos quais se destacam as
fibrilinas, que são os componentes majoritários, e outras moléculas como as MAGPs
(“Microfibril-Associated GlycoProtein), fibulinas, entre outras (Lannoy et al., 2014).
As microfibrilas são filamentos que apresentam de 10 a 12 nm de diâmetro, que em
análises por microscopia eletrônica de extratos obtidos de tecidos ricos em microfibrilas é
possível identificar uma estrutura semelhante a um colar de “contas” com periodicidade de
3
aproximadamente 54 nm, enquanto que o comprimento do monômero de fibrilina é de
aproximadamente 160 nm (Lin et al., 2002).
As fibras elásticas e as microfibrilas são organizadas em tecidos específicos e estão
dispostas de acordo com as exigências mecânicas e a função do sistema de órgãos
individuais. Na pele, as microfibrilas estão dispostas desde a membrana basal da derme até
a derme reticular, a qual permanece paralelamente com as fibras elásticas e confere
elasticidade e resiliência à pele. Na aorta, as microfibrilas se associam com a elastina na
camada média para formar as lâminas concêntricas que separam a camada muscular lisa.
Nos olhos, as microfibrilas exercem função de ancoragem, fazendo a ligação entre o
cristalino e o corpo ciliar (Shinaoka et al., 2013) (Hanlon et al., 2015).
As fibrilinas são glicoproteínas de alto peso molecular, aproximadamente 340 kDa
(Ramirez & Sakai, 2011). Até o momento, foram caracterizadas três membros das
fibrilinas: 1, 2 e 3 (figura 1.2). Onde a principal diferença entre elas é estrutural. A fibrilina-
1 apresenta um domínio rico em prolina no éxon 10, enquanto que na fibrilina-2 este
domínio é rico em glicina e na fibrilina-3 alternam-se domínios ricos em prolina ou glicina.
Ambas as fibrilinas 1 e 2 apresentam em seu éxon 37 um sítio de ligação de integrina, RGD
(“arginina-glicina-ácido aspártico”), enquanto na fibrilina 2 há um sítio adicional no éxon
24 (Werneck et al., 2004).
Estas isoformas apresentam distribuições distintas, mas que algumas vezes coincidem
em determinados momentos nos tecidos durante o desenvolvimento e na fase adulta, sendo
que a isoforma mais encontrada em humanos adultos é a fibrilina-1, enquanto que a
fibrilina-2 aparece mais abundantemente nos estágios de desenvolvimento embrionário. A
fibrilina-1 apresenta 47 domínios EGF-like, sendo que 43 deles são do tipo que ligam
4
cálcio, que é importante por manter o correto enovelamento destes domínios e apresentam
também 7 domínios TB-like. Fibrilina-3 é o membro da família que foi menos estudado e
pouco se sabe sobre sua função (Handford, Downing, Reinhardt, & Sakai, 2000) (Kielty B.
C. A. Y. M. et al., 2005).
Figura 1.2 Estrutura molecular da Fibrilina-1 e LTBPs.
A molécula de fibrilina-1 apresenta alto grau de homologia com as LTBPs, proteínas
que pertencem a mesma família e que ligam TGF (LTBP – do inglês Latent TGF-β Binding
Protein) (Pereira et al., 1993). Citocinas da família do TGF-β são sintetizados e secretados
por quase todas as células para a matriz extracelular como um grande complexo latente,
formado por duas moléculas de TGF-β ligadas ao peptídeo que confere latência ao TGF-β
(LAP- Latency associated peptide) e a uma das isoformas de LTBP (LTBP 1, 3 e 4)
(Zilberberg et al., 2013). A similaridade estrutural entre LTBP e fibrilina-1 sugere que
FBN-1 poderia proporcionar um sítio de ligação para o complexo latente de TGF-β. Sendo
5
assim, FBN-1 participaria do controle da sinalização dessa citocina, estabilizando o
complexo latente, mantendo o TGF-β na sua forma inativa (Hayes et al., 2014).
1.3 Síndrome de Marfan
Indivíduos que apresentam mutações no gene da fibrilina-1 e consequentemente
menor quantidade desta molécula na matriz extracelular apresentam a Síndrome de Marfan,
doença hereditária autossômica dominante, caracterizada por uma desordem sistêmica do
tecido conjuntivo (Judge, D. P., 2006). Tem como principais manifestações clínicas as
dilatações, aneurismas e rompimentos na aorta proximal, representando assim as principais
causas de óbitos desses pacientes. Além de deslocamento do cristalino, comprometimentos
pulmonares e crescimento exacerbado dos ossos, dígitos e membros. Dados
epidemiológicos demonstram a incidência de 2 a 3 casos a cada 10.000 nascimentos e tem
um impacto significativo na diminuição da expectativa de vida destes pacientes (Kumar &
Agarwal, 2014).
Não há nenhum método de diagnóstico molecular rápido e eficiente, porém a
identificação precoce de pessoas portadoras desta doença é bastante importante. Nos
Estados Unidos, o número de óbitos resultantes desta doença foi reduzido com a cirurgia de
reconstrução do tronco aórtico, evitando assim a principal causa de morte, o que faz com
que os pacientes diagnosticados tenham expectativa de vida de uma pessoa normal (Judge
& Dietz, 2008) (Caruana, Sheppard, & Li, 2014).
A patogênese da Síndrome de Marfan foi inicialmente explicada pela menor
quantidade e maior fragmentação das fibras na pele e na aorta (Judge & Dietz, 2008).
6
Sakai e colaboradores (Sakai et al., 1986) foram os pioneiros em identificar a
fibrilina-1 como o principal componente das microfibrilas presente em todos os tecidos
acometidos nos pacientes com Síndrome de Marfan.
O gene da fibrilina-1 contem 65 éxons (235 kb) que codificam uma glicoproteina de
aproximadamente 340 kDa. A maioria das mutações identificadas em pacientes com a
Síndrome ocorre em um dos 47 domínios EGF-like, muitas delas alterando o espaçamento
entre os resíduos de cisteína presentes nestes domínios, que são importantes no correto
dobramento da cadeia ou alterando resíduos importantes na interação com cálcio
(Reinhardt, Ono, & Sakai, 1997). Estas perturbações levam ao aumento da degradação
proteolítica da molécula podendo culminar com a menor quantidade depositada na matriz
extracelular (Beene et al., 2013).
Atualmente, acredita-se que a haplo-insuficiência, ou seja, metade da produção da
molécula normal é crítica para a expressão clínica da doença (Judge & Biery, 2004). Há
evidências que as microfibrilas tem papel crítico na regulação de citocinas, que são
moléculas que afetam o desenvolvimento de tecidos, bem como a homeostase, regulando a
atividade celular, como proliferação, migração, capacidade de síntese e apoptose (F.
Ramirez & Rifkin, 2003).
Alterações na estrutura da fibrilina-1 ou na sua quantidade poderiam aumentar os
níveis de TGF-β ativos, influenciando nas alterações fenotípicas da Síndrome de Marfan.
Dados da literatura dão suporte à hipótese de que mutações no gene da fibrilina-1 levam a
atividade exacerbada de TGF-β. Esta atividade exacerbada, quando estabelecida em
camundongos por mutação no gene da fibrilina-1, leva ao aparecimento de determinados
sinais clínicos encontrados na Síndrome de Marfan, como os rompimentos e aneurismas
7
aórticos. O tratamento de camundongos modelos de síndrome de Marfan com antagonistas
do TGF β, como o anti hipertensivo Losartan, bloqueador dos receptores AT1 de
angiotensina II, leva a prevenção destes sintomas (Habashi et al., 2006) (Franken et al.,
2015).
1.4 Modelo Fotoquímico de Indução de Trombo
A trombose arterial é a causa mais comum de morte no mundo moderno, sendo
causada principalmente pela ruptura ou instabilidade de uma placa aterosclerótica que
forma um coágulo local, impedindo o fluxo sanguíneo e resultando em infarto do miocárdio
ou em acidente vascular cerebral. Eventos trombóticos são mais graves quando ocorrem nas
artérias coronária ou carótida, as quais são propensas a doenças ateroscleróticas. Vários
fatores podem contribuir para que ocorra a trombose arterial, são os chamados fatores de
risco como a diabete mellitus, o tabagismo, a hipertensão e a hiperlipidemia (Owens &
Mackman, 2010).
Werneck e colaboradores (Werneck et al., 2008) demonstraram a importância da
MAGP-1, componente estrutural das microfibrilas, no processo de formação de trombos em
um modelo fotoquímico de trombose arterial em camundongos.
Neste modelo, camundongos tem a formação de trombos disparada por uma lesão do
endotélio provocada por espécies reativas de oxigênio formadas in situ, resultantes da
excitação do corante Rosa de Bengala pela luz laser. O fluxo sanguíneo é medido desde a
injeção do corante na veia caudal lateral até o momento em que o trombo leva a oclusão do
vaso (tempo de oclusão). O tempo de oclusão nos camundongos deficientes em MAGP-1
foi de 99 min enquanto que os animais selvagens, este tempo foi de 57 min (figura 1.3).
8
Aparentemente, MAGP-1 participa no processo por interagir com moléculas que fazem
parte do trombo, como fibrinogênio e fator de von Willebrand (Werneck et al., 2008).
Figura 1.3 Perfil de formação de trombos em Camundongos MAGP-/- (em cima) e
camundongos selvagens (em baixo) (Werneck et al., 2008).
Estendo esse modelo de formação de trombos em camundongos deficientes em
FBN-1, nosso grupo demonstrou que o tempo de oclusão (formação de trombos) em
camundongos deficientes em fibrilina-1 (mgΔ/-) é mais que o dobro do que em
camundongo selvagem, 124 minutos e 58 minutos, respectivamente (figura 1.4). Já com o
tratamento de Losartan, nosso grupo também demonstrou que os animais deficientes em
FBN-1 restabelecem o tempo normal de formação do trombo, adquirido com a dose de 30
mg/Kg/dia de Losartan (dados ainda não publicados).
9
WT +
LST
WT +
CAPT
mg/+
+ L
ST
mg/+
+ C
APT
0
50
100
mg/++ PLA
WT+PLA
Tem
po /
min
Figura 1.4 Comparação do tempo de oclusão trombótica após a indução fotoquímica de
trombo na artéria carótida direita de camundongos selvagens e de mg∆/+
, ambos os grupos
foram tratados com losartan e captopril. WT + PLA: selvagem + placebo; WT + LST:
selvagem + losartan 30mg; WT + CAPT: selvagem + captopril 30mg; mg∆/+
+ PLA:
deficiente em fibrilina-1 + placebo; mg∆/+
+ LST: deficiente em fibrilina-1 + losartan 30mg
e mg∆/+
+ CAPT: deficiente em fibrilina-1+ captopril 30mg.
1.5 Plaquetas
As plaquetas são componentes cruciais para que ocorra a hemostase, sua principal
função é a formação de coágulos, ou trombos, por isso também são chamadas de
trombócitos. Classificadas como corpúsculos citoplasmáticos anucleados, são originadas a
partir da maturação de megacariócitos produzidos na medula óssea (Clemetson, 2012).
No organismo humano, 70% das plaquetas estão na circulação, enquanto 30% estão
no baço. A concentração normal pode variar de 150.000 e 400.000 u/µL de sangue.
Possuem uma forma discoide complexa e tem a propriedade de modificar sua morfologia
quando ativadas (figura 1.5). Sua estrutura é formada por uma membrana bilaminar que
contem várias invaginações com um sistema canalicular aberto e ligado intracelularmente a
um sistema tubular denso, formando uma rede de interconexão através da célula (complexo
A B C
10
membrânico) para facilitar a secreção dos grânulos de armazenamento, conhecidos como
grânulos-α, que contém fator IV plaquetário, PDGF (“platelet-derived growth factor”),
fibrinogênio, fibronectina, inibidor I do ativador de plasminogênio (PAI I), fatores V, VIII
e Fator de von Willebrand; e corpos densos, que contem histamina, epinefrina, serotonina,
ADP, cálcio (Smith & Murphy, 2014).
B
Figura 1.5 Microscopia eletrônica de varredura de plaquetas discoides não ativadas (A) e
ativadas com ADP (B). Observe as extensões filopodiais finas e a forma irregular das
plaquetas ativadas, x 5000 (Zucker & Nachmias, 1985).
Quando o sistema vascular é de alguma forma lesionado, as plaquetas interagem com
os componentes da matriz extracelular expostos na parede do vaso sanguíneo, modificam
sua estrutura e liberam seu conteúdo, assim os receptores de adesão das plaquetas se ligam
11
ao fator de von Willebrand (vFW) e ao colágeno, moléculas estas que regulam a adesão
plaquetária com o objetivo de formar um agregado de plaquetas que se ligará ao
fibrinogênio para formar o "plug" hemostático (Broos, De Meyer, Feys, Vanhoorelbeke, &
Deckmyn, 2012).
Possui um citoesqueleto composto de filamentos cruzados de actina, ligados a
superfície interna da dupla membrana lipídica. Uma de suas funções é regular a forma da
plaqueta em repouso/ativada e interagir com os receptores transmembrânicos, que são as
glicoproteínas receptoras: GP Ib-V-IX, receptor para FvW; GP IIb-IIIa, as mais abundantes
que reconhece as quatro moléculas de adesão, fibrinogênio, fibronectina, vitronectina, e
FvW; GP Ia, IIa e GP VI, receptores de colágeno. A ativação plaquetária através da cascata
de fosforilação proteica intracelular leva a sua contração e liberação do conteúdo das
organelas plaquetárias (Smith & Murphy, 2014).
As plaquetas estão envolvidas em inúmeras patologias importantes, como a
trombose arterial, e por isso esses fragmentos citoplasmáticos são vistos como possível alvo
terapêutico para o desenvolvimento de novos antitrombóticos (Patel, Hartwig, & Jr, 2005).
Dados da literatura sugerem que microfibrilas ricas em fibrilina são importantes
suportes físicos para a adesão e agregação de plaquetas demonstrando ter função
trombogênica em condições dinâmicas in vitro. Considerando a distribuição destas
microfibrilas na parede dos vasos, principalmente dos grandes vasos como a aorta, a FBN-1
pode ser importante, juntamente com outras moléculas da região sub-endotelial, na
modulação da resposta das plaquetas diante da lesão do vaso sanguíneo (Ross et al., 1998).
12
1.6 Proteômica
Os diversos projetos de sequenciamento genômico têm lançado novas percepções
sobre os mecanismos de funcionamento celular responsáveis pela regulação da fisiologia
dos organismos sequenciados através de uma descrição mais detalhada do genoma e
também da descoberta de novos genes.. A determinação dos níveis de mRNA codificados
por esses genes e das proteínas, em diferentes condições é de extrema importância, visto
que as informações genéticas ainda não são suficientes quando estudadas isoladamente
(Gregorich & Ge, 2014).
A fim de descrever todo o perfil proteico codificado por esses genes, os
pesquisadores cunharam o termo Proteoma, como sendo o complemento proteico do
genoma (Wasinger et al., 1995), o conjunto de proteínas e variantes de proteínas que podem
ser encontrados numa célula específica quando esta está sujeita a um certo estímulo. A
análise do proteoma é cada vez mais importante e informativa para a compreensão da
função da sequência genômica (O’Brien & Palsson, 2015). Sendo assim, a proteômica visa
o estudo das várias propriedades das proteínas como sua sequência, atividade e estrutura.
Permite determinar quais proteínas são condicionalmente expressas, seus níveis de
expressão, sua distribuição dentro de uma célula e a ocorrência de modificações pós
traducionais. Com isso, a proteômica assume um papel cada vez maior nas pesquisas sobre
os mecanismos de regulação celular e suas interações em sistemas biológicos (Richards &
Coon, 2015).
As informações geradas pela proteômica são complementares aos dados de genoma e
transcriptoma por focar no produto final do genoma, que é a proteína. Ainda tem-se
observado que em muitos casos não existe uma correlação direta entre a expressão do
13
mRNA e o nível proteico, sendo necessária sua avaliação experimental (O’Brien & Palsson,
2015).
As diferentes aplicações da proteômica tornaram-se possíveis através da integração e
do avanço de diferentes técnicas de química analítica e da bioinformática, que permitiu
gerenciar, analisar e integrar os diversos dados.
A combinação da eletroforese em duas dimensões em gel de poliacrilamida (2D-
PAGE) - também conhecida como eletrofores bidimensional (2DE) – com a identificação
de proteínas por espectrometria de massas (MS) foi a metodologia fundadora e carro-chefe
da proteômica por anos. A 2DE permite a separação de milhares de proteínas de uma
amostra em um único gel, enquanto que a MS e a identificação dos genes que as produzem
(Cole & Clench, 2015).
1.7 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida
A 2DE é uma técnica sensível para o processo de separação de misturas complexas de
proteínas, um dos métodos fundamentais da proteômica. Está baseada na separação através
do ponto isoelétrico das proteínas e sua massa molecular (Westermeier, 2014).
O primeiro passo, a primeira dimensão, é a separação das proteínas pelo seu ponto
isoelétrico (pI) através da focalização isoelétrica (IEF). Ao longo de uma tira de gel de
poliacrilamida contendo um gradiente de pH é aplicado um potencial elétrico, tornando
uma extremidade mais positiva e a outra mais negativa. Dessa forma, quando uma mistura
proteica é aplicada nesse gel, cada proteína irá migrar até alcançar a região de pH igual ao
seu pI. O pI pode então ser definido como o valor de pH específico no qual a proteína
14
permanece em uma posição estacionária, onde sua carga total é zero (Westermeier & Görg,
2011).
O segundo passo, é a solubilização das proteínas contidas no gel da primeira
dimensão em tampão contendo SDS e a sua separação por eletroforese do tipo SDS-PAGE,
baseada na massa molecular das proteínas, consistindo assim a segunda dimensão
(O’Farrell, 1975). Assim, separa-se as proteínas de peso molecular idêntico que diferem no
valor de seus pI, ou proteínas com valores de pI semelhantes mas que apresentam pesos
moleculares distintos (Reed & Densmore, 2013).
O resultado final dessas duas separações é um perfil de pontos ou spots, que podem
ser visualizados por técnicas de coloração pós-eletroforéticas, como prata amoniacal, prata
coloidal ou Coomassie Blue. Cada spot representa, teoricamente, uma proteína e cujo
volume é proporcional à sua quantidade. Esse perfil bidimensional (2D) segue um sistema
cartesiano no qual tem-se o pI no eixo X e massa molecular no eixo Y (figura 1.6). A alta
resolução da 2DE resulta do fato da primeira e segunda dimensões serem baseadas em
parâmetros independentes (pI e massa molecular das proteínas) (Reed & Densmore, 2013).
É possível analisar as imagens dos géis 2DE através de programas especializados,
capazes de digitalizar essas imagens. Tais programas permitem a detecção dos spots e sua
quantificação relativa, bem como estimativas sobre pI e massa molecular de cada spot,
indispensáveis para o armazenamento dos dados coletados e análises comparativas de géis
2D.
Esta técnica permite a separação de milhares de proteínas simultaneamente,
possibilitando a verificação de alterações dos níveis de expressão das proteínas envolvidas
com um determinado fenômeno biológico. Estas informações adicionam uma visão ampla a
15
respeito de mudanças e conjuntos de proteínas que podem estar atuando em um
determinado evento biológico. Através da 2DE é possível ainda visualizar algumas
modificações pós-traducionais através da mobilidade eletroforética alterada de alguns
conjuntos de proteínas (Dowsey et al., 2010).
Figura 1.6 Perfil bidimensional de um gel da 2DE. Plano cartesiano onde os pontos
representam os spots, que são teoricamente proteínas purificadas da célula ou tecido em
questão.
Apesar das conhecidas limitações que apresenta; tais como a exclusão de proteínas
muito pequenas (< 6000 Da), muito grandes (250000 Da), muito ácidas (pI < 3.5), muito
básicas (PI > 9) e muito hidrofóbicas (Gygi et al, 2010); a 2DE ainda figura como uma das
técnicas disponíveis e amplamente utilizadas em estudos relacionados à análise quantitativa
16
de misturas complexas de proteínas expressas entre duas ou mais amostras (Polunina et al.,
2014) (Anderson, 2014).
Porém, uma das mais severas limitações dos estudos de proteoma utilizando a
eletroforese bidimensional ainda é a dificuldade de detecção de proteínas de baixa
abundância, o que pode reduzir as chances de identificação de proteínas regulatórias,
geralmente pouco expressas, e que em muitos casos são consideradas como a parte mais
interessante do estudo de um proteoma (Santucci, Bruschi, Ghiggeri, & Candiano, 2014).
Ao longo dos anos, a 2DE foi sofrendo gradativos avanços a fim de contornar essas
limitações, dentre os quais a introdução dos géis com gradientes de pH imobilizados para a
IEF, em substituição aos sistemas de pH formados por anfólitos carreadores. Além disso,
outro grande obstáculo enfrentado, em especial nas separações de proteínas de membranas,
tem sido as dificuldades na solubilização dessas moléculas para as etapas da eletroforese
em função de sua natureza hidrofóbica, o que compromete a separação e a resolução final
da 2DE (Magdeldin et al., 2014). Porém, com o progresso na área proteômica, novos
reagentes têm sido introduzidos para o aperfeiçoamento na preparação das amostras, nas
solubilizações das proteínas de membrana, entre eles agentes caotrópicos, detergentes e
agentes redutores, além de novas estratégias para o processo de separação com o objetivo
de minimizar a perda de proteínas e a baixa resolução da segunda dimensão (Martins de
Souza et al., 2008).
Com os avanços das técnicas de imagem, introduziu-se a eletroforese em gel de
imagem diferencial bidimensional (2D-DIGE), desenvolvida para aumentar a sensibilidade
e reprodutibilidade da 2DE tradicional (May et al, 2012). Nessa técnica pode-se utilizar até
três amostras proteicas distintas, marcadas com fluoróforos antes que a corrida
17
eletroforética seja realizada simultaneamente num mesmo gel. Sendo assim, as variações
gel-a-gel devido às limitações da 2DE clássica são facilmente corrigidas, minimizando o
erro das corridas e otimizando o tempo de trabalho (Magdeldin et al., 2014). As proteínas
em cada amostra são covalentemente marcadas com diferentes corantes fluorescentes de
cianina (Cy) que não tem qualquer efeito sobre a migração relativa de proteínas durante a
eletroforese. As proteínas que são comuns entre as amostras aparecem como spots com uma
proporção fixa de sinais de fluorescência, enquanto que as proteínas que diferem entre as
amostras têm diferentes proporções de fluorescência (Minden, 2012).
Com um sistema de imagem apropriado, a 2D-DIGE é capaz de detectar com
segurança amostras que contenham o mínimo de 0,2 fmol de proteína (1 femtomole =
0,000001 nanomole) e diferenças proteicas de até aproximadamente 15%, ao longo de um
intervalo de concentração de mais ou menos 20.000 fold. A técnica combinada com análise
de imagem digital melhora a avaliação estatística da variação do proteoma, levando de 2 a 3
dias para ser concluída (Minden, 2012).
2D-DIGE permite a quantificação precisa de alterações no proteoma, incluindo
modificações pós-traducionais e expressão de isoformas de uma proteína. Apesar dos
recentes avanços em MS e as limitações ainda não solucionados de 2DE (proteínas
hidrofóbicas, de alto peso molecular e com pIs extremos), DIGE ainda é um dos métodos
mais abrangentes para estudar variações em proteínas intactas (Arentz et al, 2014).
1.8 Identificação das Proteínas por Espectrometria de Massas
Após a separação das proteínas pela 2DE e a detecção dos spots, é necessário realizar
uma análise mais detalhada de cada um destes spots, que consiste em identificar o gene
18
responsável por sua produção. Para isso, destaca-se a técnica de espectrometria de massas
(MS).
A análise dos spots detectados é realizada de forma que a proteína contida em cada
spot extraído do gel 2DE é submetida a um processo de digestão “in gel” com tripsina,
obtendo-se assim os seus peptídeos.
No espectrômetro de massas, os peptídeos são ionizados, separados segundo suas
razões massa/carga (m/z) e então detectados. Em diferentes tipos de espectrômetros de
massa os processos de ionização e separação ocorrem por diferentes princípios físicos.
Todos os instrumentos geram espectros de massa que são tipicamente representados como
um gráfico de duas dimensões contendo valores de m/z no eixo x e intensidade relativa dos
picos no eixo y, representando a abundância relativa das proteínas na amostra (figura 1.7)
(Walther & Mann, 2010).
Figura 1.7 Espectro de massas dos peptídeos trípticos. Cada um dos picos numerados
representa uma proteína. Modificado do original (Cheng & Wei, 2014).
19
Cada peptídeo é representado como um conjunto de isótopos, podendo ser observados
pelos espectros gerados em instrumentos de alta resolução, consequência do fato de que
1.1% dos carbonos naturalmente existentes são do tipo pesado, 13C. Como os peptídeos
contêm grandes quantidades de átomos de carbono, uma porção significativa dos peptídeos
irão conter 13C (e um valor de massa aumentado em 1 unidade de massa comparado ao íon
contendo apenas 12C), ou dois 13C (e um valor de massa aumentado em 2 unidades de
massa comparado ao íon contendo apenas 12C), e assim por diante. A escala do eixo x do
espectro é definida pelo usuário e tipicamente ajustado entre 500 e 3000 Da, a região de
massa mais utilizada para análise de peptídeos por MS (Walther & Mann, 2010)
Existem diversos tipos de espectrômetros de massas, como o SIMS (Espectrômetro
de Massa por Ionização Secundária), o TIMS (Espectrômetro de Massa de Ionização
Térmica), o LA-ICP-MS (espectrômetro de massa por ionização acoplada por plasma com
ablação a laser), e os mais utilizados em proteômica que são MALDI-ToF (“Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight”, Ionização e dessorção a laser
assistida por matriz - Tempo de voo), Q-Tof (“Quadrupole – Time of Flight”, Quadrupolo –
Tempo de voo), Orbitrap e Triplo-Quadrupolos. Listados abaixo estão os utilizados por este
trabalho.
1.8.1 Q-ToF (Quadrupolo – Tempo de voo)
A complexidade do genoma pode gerar proteínas que contenham peptídeos
semelhantes, dificultando sua identificação precisa por PMF, visto que essa “impressão
digital” pode ser encontrada em mais de uma proteína. Isso eventualmente acontece nas
análises do proteoma de mamíferos para algumas proteínas. Nestes casos, mais dados da
20
proteína são necessários para a sua identificação. Assim, equipamentos híbridos
(conhecidos como MS/MS), que contém mais de um analisador em série, tornaram-se
máquinas poderosas na resolução de dados das moléculas analisadas. Estes espectrômetros
permitem selecionar no espectro de massas peptídeos para que estes sejam fragmentados
numa câmara de colisão. Os fragmentos, dos mais diferentes tamanhos, desde o peptídeo
até um simples aminoácido têm as massas medidas e então a sequência de aminoácidos do
peptídeo é resolvida, gerando um dado muito mais robusto à identificação da proteína
(Gevaert & Vandekerckhove, 2000).
Um dos equipamentos utilizado em estudos de proteoma é o Q-ToF, onde os
espectros podem ser adquiridos em modo MS/MS. Na primeira análise ocorre a obtenção
do PMF e na segunda análise é medida a massa de fragmentos dos peptídeos selecionados,
gerando a sua sequência de aminoácidos. Diferentemente dos espectrômetros de massa do
tipo MALDI-ToF, no Q-ToF a ionização das moléculas de peptídeos ocorre por
eletronebulização (ESI – electrospray ionization). Na análise por ESI a amostra de
peptídeos é dissolvida em um solvente volátil. O ESI pode encontrar-se prontamente
acoplado a um sistema de separação por cromatografia líquida. A amostra então passa por
um estreito tubo capilar metálico, ao qual é aplicada uma voltagem, sendo gerado um
aerossol de analito e solvente. Com a evaporação do solvente originam-se íons, sob pressão
atmosférica. Os íons são subsequentemente submetidos a alto vácuo, acelerados através de
um campo elétrico para o analisador de massas do espectrômetro e separados de acordo
com sua razão m/z. Seu analisador chamado de quadrupolo/ToF encontra-se acoplado ao
sistema de ESI. Basicamente o Q-ToF é capaz de gerar espectros de fragmentos de íons
através de determinados íons precursores selecionados. Assim, íons que possuem certa
21
relação m/z são selecionados em um primeiro analisador de massas, fragmentados em uma
célula de colisão e as massas do fragmento de íon são “lidas” por um analisador do tipo
ToF. Dessa forma, os peptídeos são fragmentados e à medida que eles passam pelas
câmaras de colisão de íons, as sequências das proteínas são obtidas (Aebersold & Goodlett,
2001). O desenvolvimento de analisadores de massa em sequência (tandem) levou a um
grande aumento na resolução e sensibilidade do método, tornando-o uma ferramenta
obrigatória nas análises estruturais e químicas de peptídeos e proteínas. Os espectrômetros
de massas atuais permitem selecionar uma só molécula ionizada, fragmentá-la e através da
análise das massas dos fragmentos conhecer a estrutura da molécula original, permitindo
determinar, por exemplo, a sequência de aminoácidos de um peptídeo ou uma alteração
química específica em algum resíduo de aminoácido (Patterson & Aebersold, 2003).
1.9 Limitações e vantagens da 2DE-MS
As limitações da 2DE guiaram o desenvolvimento de metodologias comumente
conhecida como Shotgun Proteomics. Estudar um proteoma de interesse por Shotgun
consiste basicamente em analisar o proteoma por sistemas que integram cromatografia
líquida (LC) e MS em tandem (LC-MS/MS) (Martins-De-Souza, 2014). Atualmente a
metodologia de Shotgun tem diversas vertentes, sendo a mais amplamente usada chamada
bottom-up proteomics (Nogueira & Domont, 2014). Nesta, a quantificação de proteínas se
dá pela marcação com isótopos estáveis ou label-free, que são métodos mais precisos do
que a quantificação dos volumes dos spots de géis 2DE (Martins-de-Souza et al, 2010). Por
outro lado, entre as desvantagens de bottom-up proteomics está a falta de informação direta
em proteínas intactas, suprida pela 2DE. A detecção de proteínas hidrofóbicas e com baixa
22
concentração, dependendo do tipo de preparação da amostra e aquisição MS, também
podem ser limitantes (Martins-de-souza, 2014).
O princípio básico bottom-up shotgun proteomics consiste em digerir todo proteoma
de interesse e fraciona-lo num sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC),
acoplado a um espectrômetro de massas (LC-MS). Os dados resultantes são analisados
através de algoritmos que reconstroem as sequências proteicas com base nas massas de
todos os peptídeos medidos e fragmentados. Esta técnica tem se desenvolvido nos últimos
10 anos, hoje em dia um experimento LC-MS é capaz de revelar de 3000 a 7000 proteínas
em uma hora, o que só seria possível com semanas de trabalho se utilizada a 2DE-MS
clássica (Martins-de-souza, 2014).
A taxa de produção de dados na proteômica, bem como a complexidade deste
conjunto de informações, tem aumentado gradativamente à medida que novas técnicas e
abordagens surgem e se desenvolvem. Ao mesmo tempo, a descoberta de diversas
modificações proteicas sob determinadas condições tem-se mostrado algo bastante
promissor para se elucidar patogenias, visando o desenvolvimento de novos diagnósticos e
tratamentos terapêuticos. Dessa forma a proteômica clínica surge com o objetivo de se
obter diagnósticos mais precoces e precisos, melhores estratégias terapêuticas e melhor
avaliação de prognósticos. Com o objetivo final de identificar novos alvos terapêuticos,
drogas e vacinas (Hanash, 2004).
23
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
O objetivo geral deste projeto, nosso desafio científico, é estudar a função da
fibrilina-1 no processo de formação de trombo arterial.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1 Análise proteômica comparativa de plaquetas provenientes de
camundongos selvagens e deficientes fibrilina-1.
As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos extremamente especializados e possuem
grande capacidade de armazenar diferentes substâncias importantes para o processo de
trombogênese em seus compartimentos (Patel et al., 2005) (Mitsios et al., 2010) (Carisey &
Ballestrem, 2011). Considerando os nossos dados preliminares e a possível influência da
excessiva ativação do TGF-β nos animais mgΔ/+, será realizada a análise proteômica do
conteúdo das plaquetas provenientes de diferentes grupos experimentais de camundongos,
através de géis 2DE e espectrometria de massas. O objetivo é verificar quantitativamente o
conteúdo das plaquetas obtidas de animais selvagens e compará-lo ao conteúdo das
plaquetas obtidas dos animais deficientes em fibrilina-1, procurando alterações que possam
estar relacionadas ao maior tempo de formação dos trombos em nosso modelo de estudo.
2.2.2 Verificar a influência do Losartan no perfil proteico dos géis 2DE de
plaquetas de camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1.
Levando em consideração nossos resultados preliminares, do qual o tratamento com
Losartan restabelece o tempo de oclusão nos animais deficientes em FBN-1, estenderemos
24
as análises proteômicas comparativas aos géis de plaquetas dos animais deficientes em
FBN-1 tratados e não tratados com Losartan. O objetivo é verificar se o perfil proteico com
o tratamento de Losartan se assemelha ao perfil controle, ou seja, identificar possíveis
proteínas que o Losartan possa influenciar direta ou indiretamente, responsáveis pelo
restabelecimento do tempo de formação de trombo.
2.2.3 Análise proteômica comparativa do extrato proteico da artéria aorta de
camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1.
Na Síndrome de Marfan, uma das regiões mais afetadas do sistema vascular é a aorta,
levando a dilatações ou aneurismas que quase sempre são fatais. Pilop e colaboradores
(Pilop et al., 2009) fizeram um estudo do proteoma da aorta média de pacientes com e sem
a Síndrome de Marfan, a fim de obter informações moleculares sobre os mecanismos que
levam à dilatação da aorta.
A partir desse trabalho, resolvemos analisar o extrato proteico das aortas dos nossos
camundongos deficientes em FBN-1, modelo para a Síndrome de Marfan, buscando
alterações no perfil proteico que justifiquem tais sintomas clínicos e/ou fatores que possam
justificar o maior tempo de formação de trombo nesses animais.
2.2.4 Análise proteômica de plaquetas de pacientes portadores da Síndrome de
Marfan.
O diagnóstico para a Síndrome de Marfan ainda é feito de forma clínica,
majoritariamente, levando em conta aspectos físicos do paciente. Em 1986, na reunião
25
Internacional de Distúrbios Hereditários do Tecido Conjuntivo, estabeleceu-se uma série de
critérios em relação ao diagnóstico da doença (D. P. Judge, 2006).
Não há publicado na literatura científica nenhum estudo sobre o proteoma de
plaquetas de pacientes com Síndrome de Marfan, nem do proteoma do plasma sanguíneo
dos mesmos. Sendo assim, nosso objetivo é verificar alterações no conteúdo plaquetário
desses pacientes e tentar estabelecer um padrão, um marcador molecular para o diagnóstico
dessa doença, que ainda é feito de forma clínica.
26
3. Material e Métodos
3.1 Preparação das Amostras
3.1.1 Animais
Utilizou-se camundongos selvagens da linhagem C57BL/6 com idade entre 8-12
semanas, obtidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB), da
Universidade Estadual de Campinas, SP. E camundongos Deficientes em FBN-1 (Fbn-1
mg∆/+) com idade entre 8-12 semanas, matriz obtida da Profa. Dra. Lygia Pereira Castro,
ICB, USP, São Paulo, mantida em cruzamentos em nosso biotério (Departamento de
Bioquímica da Unicamp). Os camundongos deficientes em fibrilina-1 são heterozigotos,
seguindo o modelo mgΔ, onde os éxons 19-24 do gene Fbn1 foram substituídos através de
recombinação homóloga por um cassete de expressão do gene de resistência a neomicina.
Dessa forma, nossos animais heterozigotos não apresentam alterações fenotípicas, enquanto
que os homozigotos sobrevivem por algumas poucas semanas após o nascimento e morrem
devido às alterações cardiovasculares (Pereira et al., 1999) (Pereira et al., 1997).
Os camundongos foram mantidos em temperatura de 22± 1°C em ciclo de claro-
escuro de 12h, com livre acesso à água e à ração, utilizadondo dieta padrão (Nuvilab
CR1®).
Este trabalho está de acordo com os Princípios Éticos de Pesquisa com Animais,
aprovado pelo Comitê Institucional de Ética em Pesquisas com Animais, protocolo número
1774-1 (anexo I).
27
3.1.2 Tratamento com Losartan
Considerando que os animais deficientes em FBN-1 apresentam uma excessiva
ativação de TGF-β e que o tratamento com o Losartan leva à diminuição dessa ativação,
camundongos selvagens C57BL/6 (grupo controle) e deficientes em fibrilina-1 (Fbn1
mg∆/+) com 4 semanas de idade foram tratados com o fármaco Losartan, gentilmente
cedido pelo Dr. J. E. Krieger, do INCOR em São Paulo, SP, pelo período de 4 semanas.
Este fármaco foi administrado via oral por gavagem nas concentrações 15 mg/kg/dia e 30
mg/kg/dia (Figura 3.1), de acordo com Habashi (Habashi et al., 2006).
Figura 3.1 Fluxograma do tratamento de camundongos C57BL/6 e Fbn-1 mgΔ/+ com 4
semanas de idade, com Losartan nas concentrações 15 e 30 mg/Kg/dia, por 4 semanas.
3.1.3 Coleta de sangue de Camundongos
Os animais com 8 semanas de idade, pesando de 20 a 25 g, tratados e não tratados
com Losartan, foram anestesiados com uma mistura de Ketamina (Agener 10%, 1,2 mL/Kg
- Dopalen) e Xilasina (Anesedan Vetbrands, 0,8 mL/Kg – Agener União), utilizando
seringa U-100 (29G x 13mm) intramuscular.
28
O sangue foi coletado do coração por punção cardíaca, utilizando agulha 26G (13 x
0,45 mm) numa seringa (1,0 mL/cc) contendo anticoagulante ACD-A (BD Vacutainer) na
proporção de 1:6 (Gibbins & Mahaut-smith, 2004).
O sangue recém coletado foi colocado em eppendorf de 2,0 mL (Zufferey, Fontana,
Reny, & Nolli, 2012) e centrifugado a 2300 xg, 10 segundos por mL de sangue (Centrifuge
eppendorf 5810R) (O’Neill et al., 2002), obtendo-se dessa forma o plasma rico em
plaquetas (PRP) (Figura 3.2).
O PRP foi coletado em eppendorf cônico e centrifugado a 2200 xg, 4 minutos/mL,
obtendo-se o pellet de plaquetas. O sobrenadante (plasma pobre em plaquetas - PPP) foi
retirado e congelado a -80ºC.
Figura 3.2 Esquema experimental de obtenção de Plaquetas. O sangue foi centrifugado a
2300 xg, 10 segundos/mL, obtém-se o PRP. PRP foi centrifugado a 2200 xg por 4 min,
obtendo-se o PPP. Pellet de plaquetas foi congelado a -80ºC.
3.1.4 Lavagem de Plaquetas
As plaquetas são ressuspendidas em tampão Tyrode (NaCl, KCl, NaHCO3,
NaH2PO4, MgCl2 . 6 H2O, CaCl2 . 6 H2O, HEPES, D(+) glicose) contendo heparina (10
U/mL), prostaglandina (0,5 µM) e Apyrase (0,02 U/mL) (O’Neill et al., 2002) (Gibbins &
Mahaut-smith, 2004).
29
O ressuspendido foi incubado por 10 minutos no banho a 37º C e centrifugado a
1900 xg (2 minutos para 0,5 – 1,0 mL; 3 minutos para 2,0 – 3,0 mL). O pellet agora
formado foi congelado a -80º C (Gibbins & Mahaut-smith, 2004).
Para o uso, as plaquetas foram retiradas do freezer e deixadas à temperatura
ambiente por 5 minutos. Em seguida, foram ressuspendidas em 100 µL de tampão simples
Tiouréia (uréia 7M; tiouréia 2M; DTT 70 mM; chaps 4%) e incubadas por uma hora à
temperatura ambiente, para lise.
3.1.5 Extrato Proteico de Artéria Aorta
A artéria aorta proveniente de camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1
foram retiradas e dissecadas após a coleta de sangue (Figura 3.3). Aproximadamente 1 mg
de aorta foi incubado em Tampão simples Tiouréia (uréia 7M; tiouréia 2M; DTT 70 mM;
chaps 4%) por 2 horas em banho de gelo para extração proteica (Pilop et al., 2009) (Liao et
al., 2008) (Martins-de-Souza et al., 2009).
Figura 3.3 Artéria aorta de camundongos para extração de proteínas e análise do proteoma.
30
3.1.6 Coleta de Sangue de Pacientes com Síndrome de Marfan
O sangue de pacientes com Síndrome de Marfan foi coletado por enfermeiras do
Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, cedido voluntariamente e em
colaboração com a Prof. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, da Faculdade de Ciências
Médicas da Unicamp.
Em nosso laboratório, o sangue recém coletado foi centrifugado a 250 xg, 16 min/15
mL (Centrifuge eppendprf 5810R) para se obter o plasma rico em plaquetas (PRP). O PRP
foi transferido para um eppendorf cônico e centrifugado a 2200 xg por 16 min/10 mL
(Gibbins & Mahaut-smith, 2004). O sobrenadante, plasma pobre em plaquetas, foi retirado
e congelado a -80ºC e o pellet de plaquetas foi lavado como descrito na sessão 3.4.
3.1.7 Dosagem de proteínas – Método de Bradford
As amostras do extrato proteico plaquetário e das aortas foram quantificadas pelo
método de Bradford. Utilizou-se a curva padrão de BSA (BSA 0,5 mg/mL; 0,25 mg/mL;
0,125 mg/mL; 0,065 mg/mL), em triplicata, em placa de 96 poços e a leitura da absorbância
foi realizada a 595nm no leitor de ELISA modelo Synergy 2 (Biotek), em reagente de
Bradford de acordo com o manual do fabricante.
3.2 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida – 2D-PAGE
Toda técnica de 2D-PAGE foi realizada em colaboração com o Prof. Dr. José Camillo
Novello do Instituto de Biologia da Unicamp, em seu laboratório na Genônica e
Proteômica, inicialmente com ajuda e treinamento da Dra. Mariane Flores Nascimento
31
(Flores-Nascimento et al., 2012) e do Dr. Daniel Martins de Souza (Martins-de-Souza,
2012).
3.2.1 Isoeletrofocalização - Primeira dimensão
Aproximadamente 500 µg de proteína total foi aplicada em strips de pH 4-7 18 cm
(para plaquetas) e pH 3-10 18 cm (para aorta) (GE healthcare), em Tampão Tiouréia (uréia
7M, tiouréia 2M, DTT 70 mM, Chaps 4%, BPB, anfólito 2%), num volume final de 350 µL
(Martins-De-Souza et al., 2010).
A corrida foi realizada utilizando o equipamento IGphor (GE- Healthcare Life
Science) (Figura 3.4) nos parâmetro: 12 horas de hidratação, 1 hora 200 V, 1 hora 500 V, 1
hora 1000 V, e 8000 V até que se acumule 70000 V (Healthcare, n.d.).
Figura 3.4 Equipamentos utilizados para a primeira dimensão da eletroforese. IGphor (GE-
Healthcare Life Science), à esquerda. Strip holder 18 cm, à direita.
3.2.2 SDS-PAGE - Segunda dimensão
As strips são incubadas sob agitação em Tampão de Equilíbrio (uréia 6 M, Tris HCl
pH 8,8, glicerol 30%, SDS 2%, DTT 0,25%/IAA 0,62%) e encaixadas em gel de
poliacrilamida 12,5%. A corrida foi realizada nos parâmetros: 60 V, 400 mA por 1 hora;
32
600 V, 35 mA por gel em cuba acoplada a fonte Electrophoresis Power supply- EPS601-
Amersham Biosciences (Healthcare, n.d.) (Maguire & Fitzgerald, 2003). Padrão de peso
molecular utilizado - Precision Plus Protein – Dual Color Standard, Bio-Rad (Figura 3.5).
Figura 3.5 Cuba de eletroforese de duas dimensões, Amersham Biosciences. Corrida da
segunda etapa, segunda dimensão do gel.
Terminada a corrida, o gel é deixado overnight em fixador (ácido fosfórico 2%,
etanol 30%) e em seguida é corado com Coomassie Blue-G (USB 32812 100GM) (ácido
fosfórico 10%, sulfato de amônio 10%, metanol 20%, traços de Coomassie Blue-G), por no
mínimo 48 horas (Michele, Freson, & Geet, 2014) (Liebler, n.d.) (Becker, 2007).
3.3 Análise de Imagem 2D
Géis corados foram digitalizados (Image Quant 150), analisados e comparados pelo
programa Melanie 5.0 (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Swiss Institute of
Bioinformatics, Geneva, Switzerland), seguindo o manual do usuário impresso e também o
obtido na internet (Melanie 7.0 2D Gel Analysis Software, n.d.), a fim de encontrarmos
diferenças na quantidade de algumas proteínas na comparação entre os grupos de estudo
(Winkler et al., 2008) (Rosengren et al., 2003).
33
Todos os géis obtidos foram submetidos a ajustes de imagem para melhor
visualização dos spots e redução da interferência do backgroud na quantificação dos spots.
Este procedimento permite maior precisão na identificação do volume total e relativo dos
spots, auxiliando nas análises comparativas entre géis de diferentes amostras.
Estas imagens processadas foram usadas para a análise e determinação das massas
moleculares e pontos isoelétricos (pI) aparentes dos spots contidos nos géis. A
quantificação dos spots foi realizada analisando-se o volume (área x intensidade) de cada
spot e normalizando-se os valores encontrados de volume de cada spot dividido pela soma
do volume de todos os spots contidos no gel, gerando assim uma relação de porcentagem de
cada spot em relação à totalidade (Melanie 7.0 2D Gel Analysis Software, n.d.). Dessa
forma foi possível compararmos os diferentes géis e verificar diferenças na expressão de
proteínas através da análise das imagens dos mesmos.
3.4 Identificação de Proteínas por Espectrometria de Massas
Spots apresentando diferenças significativas de expressão foram retirados
manualmente do gel, submetidos à digestão in gel com tripsina e submetidos à
espectrometria de massas, em colaboração com a Profa. Dra. Adriana Paes Leme,
Laboratório de Espectrometria de Massas do Laboratório Nacional de Biociências - LNBio
- CNPEM/ SINCROTRON (Q-Tof Ultima acoplado ao UPLC nanoAccquity, Waters)
(Aragão et al., 2012).
Para análise proteica, uma alíquota de 4,5 µL de proteínas resultante da digestão
peptídica foi separada pela columa C18 (100 mm6100 mm) RP-nanoUPLC (nanoAcquity,
Waters) acoplada ao espectrômetro de massas Q-Tof Premier (Waters) com uma fonte de
34
nanoelectrospray num fluxo de 0,6 mL/min. O gradiente foi de 2-90% de acetonitrila em
0,1% de ácido fórmico por 10 minutos. A voltagem do nanoelectrospray foi estabelacida
em 3,5 kV, voltagem de cone de 30 V e a temperatura da fonte foi 100 µC. O instrumento
foi operado no modo “Top-Three”, no qual um espectro é adquirido seguido por MS/MS
dos três picos detectados mais intensos. Após a fragmentação MS/MS, o íon foi colocado
na lista de exclusão por 60 segundos e para análise dos peptídeos clivados endógenos, foi
usada a exclusão em tempo real (Aragão et al., 2012).
Os espectros foram adquiridos usando o programa MassLynx v.4.1 e os dados brutos
foram convertidos num formato de lista de pico (mgf) sem somar os scans pelo programa
Mascot Distiller v.2.3.2.0, 2009 (Matrix Science Ldt.) contra Human_Uniprot012014
release22_01_2014; 88479 sequences; 35079223 residues (para plaquetas humanas) e
IPImouse_v3.86; 58667 sequences; 26399545 residues (para camundongos), usando o
equipamento Mascot v.2.3.01 (Matrix Science Ltd.), com carbamidometilação como
modificação fixas, oxidação de metionina como modificação variável, uma clivagem de
tripsina perdida e tolerância de 0,1 Da para ambos os íons precursores e fragmentos
(Aragão et al., 2012).
35
4. Resultados e Discussão
4.1 Padronização da Técnica 2DE
A princípio, realizou-se géis de poliacrilamida bidimensionais (2D-PAGE) com strips
na primeira dimensão de pH 3-10, para se ter uma visão geral e mais ampla das proteínas
contidas nas amostra do conteúdo plaquetário. Toda padronização da técnica foi realizada
com plaquetas de camundongos selvagens devido à facilidade de obtenção dos animais,
sem se prender ao tratamento com Losartan, ao mesmo tempo em que se padronizava a
coleta de sangue dos mesmos.
De acordo com a segunda dimensão, foi possível observar spots (proteínas) mais
concentrados entre as porções ácida (+) e neutra do gel. Dados da literatura mostram
diversas análises proteômica de plaquetas utilizando-se strips de pH 4-7 muito bem
estabelecidas, onde compreende-se a grande maioria de spots nessa faixa de pH (García et
al., 2004).
A partir dos resultados preliminares dos géis de pH 3-10, reforçados pelos dados da
literatura, decidimos utilizar strips de pH 4-7. Dessa forma, reduzimos o intervalo de pH,
onde esperaríamos encontrar spots amplamente espalhados pelo gel, como um “zoom” na
região compreendida entre pH 4-7.
É de extrema importância padronizar a técnica e os géis, a fim de se obter géis
reprodutíveis, ou seja, o mais similar possível entre eles. Dados da literatura e do manual do
usuário do programa Melanie sugerem que uma porcentagem de semelhança superior à
85% entre géis de mesma natureza (mesmo grupo), com um “n” de no mínimo 3 géis por
grupo é o ideal (Melanie 7.0 2D Gel Analysis Software, n.d.) (Cagney & McRedmond,
36
2008). Assim, minimizando os erros de manipulação das amostras e da técnica, as
diferenças encontradas serão devido às limitações e variações da própria técnica.
Inicialmente, coramos os géis por impregnação de Nitrato de Prata (AgNO3) (figura
4.1). Essa técnica de impregnação combina alta sensibilidade, numa baixa faixa de
nanogramas de peptídeos (1-10 ns/spot), enquanto que utiliza equipamentos e produtos
químicos muito simples e baratos (Wray et al., 1981). A técnica foi escolhida levando-se
em conta a necessidade de consistência e sensibilidade que ela proporciona ao detectar
peptídeos. É o método colorimétrico mais sensível existente, porém de difícil quantificação visto
que a intensidade da coloração é saturável, depende do tempo de revelação, e não oferece grande
linearidade entre a intensidade do spot e a quantidade de uma determinada proteína, tornando difícil
uma comparação mais precisa, especialmente entre diferentes géis (RABILLOUD, 1999). Sendo
assim, é uma técnica de difícil reprodutibilidade, ainda mais quando se utilizam vários
grupos experimentais que necessitam alta reprodutibilidade.
Como podemos observar na figura 4.1, todos os géis são do mesmo grupo
experimental (camundongos selvagem - grupo controle), mas é nítida a baixa
reprodutibilidade e a diferença entre eles. Observam-se muitas manchas e baixa
similaridade que dificulta a análise proteômica e a detecção de spots pelo programa
Melanie. Por isso, abortamos a impregnação por AgNO3 e definimos a coloração por
Coomassie Blue-G coloidal (figura 4.2) como definitiva (O’Farrell, 1975). É um método de
coloração mais demorado (48 horas no mínimo), porém é mais fiel e reprodutível, como
pode ser observado já nos primeiros géis realizados (figura 4.2).
37
pI4,0____________________________7,0
Figura 4.1 2D-PAGE do conteúdo plaquetário de camundongos selvagens não tratados.
Coloração por impregnação por Nitrato de Prata. A1 e A2 representam duplicatas da
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
38
mesma amostra proteica, assim como B1 e B2, C1 e C2. Padrão de peso molecular à
esquerda, pI no topo.
Definiu-se a quantidade de 500 µg de proteínas total para cada gel de poliacrilamida
12,5%, a partir de dados publicados na literatura científica e manuais dos fabricantes dos
reagentes utilizados. Estabeleceu-se o acúmulo de 70.000 volts para a corrida da primeira
dimensão, sendo suficiente para a isofocalização das proteínas em seus respectivos pontos
isoelétricos. (Rabilloud, 2002)
pI 4,0_________________________7,0 pI 4,0_______________________7,0
Figura 4.2 Gel de poliacrilamida bidimensional do conteúdo proteico das plaquetas de
camundongos selvagens não tratados. A e B representam duplicatas da mesma amostra.
Coloração por Coomassie Blue-G. Padrão de peso molecular à esquerda, pI no topo da
figura.
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
39
4.2 Análise Proteômica de Plaquetas - Intra Grupos
As primeiras análises e comparações dentro dos mesmos grupos, apresentadas e
discutidas a seguir, foram realizadas com o objetivo de verificar se os géis estão
padronizados e são reprodutíveis dentro de cada grupo experimental. Tomou-se o máximo
de cuidado com variações na manipulação da técnica para minimizar desvios no perfil
proteico apresentados nos géis.
4.2.1 Grupo Controle – Camundongos Selvagens
Assim que todos os parâmetros foram estabelecidos e após os géis terem apresentado
alta similaridade, pode-se considera-los reprodutíveis (quando apresentam taxa de
semelhança superior a 85% devidamente analisados no programa Melanie).
Os géis das proteínas de plaquetas de camundongos selvagens não tratados com
Losartan servem como o gel referência (padrão) para todas as análises comparativas pelo
programa Melanie. A figura 4.3 mostra o gel referência do grupo controle (controle 1) –
proteínas de plaquetas de camundongos selvagens – ou seja, o melhor gel realizado, com o
maior número de spots e melhor qualidade.
Foram realizados cinco géis desse grupo (n=5). Todos com porcentagem de
semelhança superior a 85% (chegando a 92,53%) comparados com o gel referência do
grupo e número de spots em torno de 155 (tabela 4.1). Dessa forma, fechamos o grupo com
um número bom de géis reprodutíveis e padronizados. As poucas diferenças encontradas
podem ser devido às limitações e pequenas variações da técnica, ou ainda fragmentos
proteicos, degradados durante o manuseio na preparação da amostra.
40
pI 4,0______________________________________________________________7,0
Figura 4.3 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel controle 1, proteínas de plaquetas de
camundongos selvagens não tratados com Losartan.
Tabela 4.1 Comparação dos géis do grupo controle, “n=5”. Num matches é o número de
spots encontrados aos pares. A semelhança dos géis está representada pela % matches.
Dados obtidos pelo programa Melanie.
Gel Ref x Gel 2 Num
matches
% matches
Controle 1 x Controle 2 151 92,35
Controle 1 x Controle 3 155 92,53
Controle 1 x Controle 4 150 91,41
Controle 1 x Controle 5 152 91,01
41
4.2.2 Grupo Controle tratado com Losartan 15 mg
A fim de verificar se o fármaco Losartan influencia no resultado dos géis e nas
análises proteômicas, atuando como falso positivo, realizamos géis do conteúdo proteico
das plaquetas do grupo controle (animais selvagens) tratados com Losartan nas
concentrações 15 e 30 mg/Kg/dia durante quatro semanas. A figura 4.4 mostra o gel padrão
do grupo controle tratado com Losartan na dosagem 15 mg (Controle 15/1).
pI 4,0______________________________________________________________7,0
Figura 4.4 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel referência do grupo controle tratado
(Controle 15/1). Proteínas de plaquetas de camundongos selvagens tratados com Losartan
15mg/Kg/dia.
42
Foram feitos quatro géis desse grupo tratado (n=4; Controle 15/1, 15/2, 15/3, 15/4),
todos reprodutíveis e com porcentagem de semelhança superior a 85% comparados
(chegando a 95,15%) com o gel referência do grupo. Em número de spots encontrados aos
pares encontramos em torno de 150 – 160 pares (tabela 4.2).
Tabela 4.2 Comparação dos géis do grupo controle tratado com Losartan 15 mg, “n=4”.
Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança
dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie.
Gel Ref x Gel 2 Num
matches
% matches
Controle 15/1 x Controle 15/2 167 95,15
Controle 15/1 x Controle 15/3 148 91,35
Controle 15/1 x Controle 15/4 154 92,77
4.2.3 Grupo Controle tratado com Losartan 30 mg
Da mesma forma que o grupo anterior, a fim de verificar se o fármaco Losartan
influencia no resultado dos géis e nas análises proteômicas, realizamos géis das proteínas
das plaquetas do grupo controle (animais selvagem) tratados com Losartan na concentração
30 mg/Kg/dia durante quatro semanas (Figura 4.5).
Neste grupo, foram realizados cinco géis (n=5, Controle 30/1, 30/2, 30/3, 30/4, 30/5),
todos reprodutíveis e com porcentagem de semelhança superior a 85%, comparados com o
gel referência do grupo (Controle 30/1). Em número de spots, encontramos em torno de 140
– 180 pares (tabela 4.3).
43
pI 4,0_______________________________________________________________7,0
Figura 4.5 Gel de poliacrilamida bidimensional, referência do grupo controle tratado
(Controle 30/1). Proteínas de plaquetas de camundongos selvagens tratados com Losartan
30 mg/Kg/dia.
Tabela 4.3 Comparação dos géis do grupo controle tratado com Losartan 30 mg, “n=5”.
Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança
dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie.
Gel Ref x Gel 2 Num matches % matches
Controle 30/1 x Controle 30/2 147 88,00
Controle 30/1 x Controle 30/3 185 98,66
Controle 30/1 x Controle 30/4 139 85,40
Controle 30/1 x Controle 30/5 143 85,88
44
4.2.4 Grupo Deficiente em Fibrilina-1
Finalmente, realizamos três géis (n=3, mgΔ/+ 1, mgΔ/+ 2 e mgΔ/+ 3) do extrato
proteico das plaquetas do grupo Deficiente em fibrilina-1. Todos os géis apresentaram no
mínimo 89% de semelhança, comparado com o gel referência desse grupo (Figura 4.6).
Foram encontrados em torno de 139 spots aos pares (tabela 4.4).
pI 4,0______________________________________________________________7,0
Figura 4.6 Gel de poliacrilamida bidimensional. Referência do perfil proteico das
plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 não tratados com Losartan (mgΔ/+ 1).
45
Tabela 4.4 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1, “n=3”. Num matches é
o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança dos géis
comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie.
Gel Ref x Gel 2 Num
matches
% matches
mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 2 139 89,00
mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 3 130 93,00
4.2.5 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg
Da mesma forma que anteriormente, com intuito de verificar a influência do
Losartan, realizamos géis bidimensionais do extrato proteico das plaquetas de
camundongos deficientes em fibrilina-1, tratados com Losartan 15 (figura 4.7) e 30
mg/Kg/dia durante quatro semanas.
Realizamos quatro géis do grupo tratado com 15 mg (n=4, mgΔ/+ 15/1, mgΔ/+ 15/2,
mgΔ/+ 15/3 e mgΔ/+ 15/4) e a porcentagem de semelhança entre eles foi em torno de 90%.
O número de spots variou de 130 a 160 (tabela 4.5). Como posto anteriormente, diferenças
devido às limitações da técnica e da preparação da amostra são comuns de acontecer e
deve-se levar em conta, com cautela, ao avaliar esses dados.
46
pI 4,0_______________________________________________________________7,0
Figura 4.7 Gel de poliacrilamida bidimensional. Referência do perfil proteico das
plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 15 mg (mgΔ/+
15/1).
Tabela 4.5 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan
15 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A
semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo
Melanie.
Gel Ref x Gel 2 Num
matches
% matches
mgΔ/+ 15/1 x mgΔ/+ 15/2 144 90,28
mgΔ/+ 15/1 x mgΔ/+ 15/3 165 92,17
mgΔ/+ 15/1 x mgΔ/+ 15/4 132 86,00
47
4.2.6 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg
Segundo dados preliminares do nosso grupo, o tratamento com o Losartan na
dosagem 30 mg/Kg/dia é o responsável pelo reestabelecimento do tempo normal de
formação de trombo, no modelo fotoquímico em camundongos deficientes em FBN-1.
Realizamos quatro géis do grupo tratado com Losartan 30 mg (n=4, mgΔ/+ 30/1,
mgΔ/+ 30/2, mgΔ/+ 30/3 e mgΔ/+ 30/4), onde a porcentagem de semelhança foi superior a
85% (figura 4.8). O número encontrado de spots pareados variou de 170 a 180 (tabela 4.6).
pI 4,0______________________________________________________________7,0
Figura 4.8 Gel de poliacrilamida bidimensional. Padrão do perfil proteico das plaquetas de
camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 30 mg (mgΔ/+ 30/1).
48
Tabela 4.6 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan
30 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados aos pares nos dois géis
comparados. A semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados
obtidos pelo Melanie.
Gel Ref x Gel 2 Num
matches
% matches
mgΔ/+ 30/1 x mgΔ/+ 30/2 171 86,36
mgΔ/+ 30/1 x mgΔ/+ 30/3 187 86,57
mgΔ/+ 30/1 x mgΔ/+ 30/4 171 87,46
4.3 Análise Proteômica Comparativa de Plaquetas - Inter Grupos
As primeiras análises e comparações dentro dos mesmos grupos foram realizadas
com o objetivo de padronização e reprodutibilidade. Dessa forma, quando compararmos os
géis referências entre grupos distintos, as diferenças no perfil proteico poderiam ser mais
fiéis e prováveis de ser verdadeiras.
Dentro de cada grupo escolheu-se o melhor gel, aquele que representaria com maior
qualidade e fidelidade o perfil proteico do grupo estudado. Este é considerado o gel
referência do grupo, onde será comparado com os géis referência dos outros grupos. A
figura 4.9 mostra o esquema, um resumo utilizado para as comparações entre os grupos de
natureza diferente.
Ao todo foram realizadas sete comparações inter grupos:
1) Grupo controle (Controle 1) X grupo controle tratado com Losartan 15 mg (Controle
15/1)
2) Grupo controle (Controle 1) X grupo controle tratado com Losartan 30 mg (Controle
30/1)
49
3) Grupo deficiente em FBN-1 (Nocaute 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com
Losartan 15 mg (mgΔ/+ 15/1)
4) Grupo deficiente em FBN-1 (mgΔ/+ 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com
Losartan 30 mg (mgΔ/+ 30/1)
5) Grupo controle (Controle 1) X grupo deficiente em FBN-1 (mgΔ/+ 1)
6) Grupo controle (Controle 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 15
mg (mgΔ/+ 15/1)
7) Grupo controle (Controle 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 30
mg (mgΔ/+ 30/1)
Figura 4.9 Resumo experimental para comparações proteômicas entre os diversos grupos.
O gel referência de cada grupo foi selecionado para comparações entre os demais géis
referências dos outros grupos.
4.3.1 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 15 mg
A figura 4.10 ilustra a comparação proteômica do gel referência do grupo controle
com o gel referência do grupo controle tratado com Losartan 15 mg. Os pontos verdes em
cima dos spots representam os pontos proteicos semelhantes, encontrados aos pares nos
dois géis comparados pelo programa Melanie. Os pontos em vermelho representam spots
encontrados em apenas um dos géis e ausente no outro, ou seja, não está em pares. A
porcentagem de semelhança dessa comparação foi de 92,21%, compreendendo um total de
50
160 spots pareados, ou seja, presentes aos pares (pontos verdes). Sendo considerados géis
semelhantes.
Não encontramos nenhuma diferença significativa a ponto de afirmar que o Losartan
estaria influenciando o perfil proteico do gel. É possível que o Losartan na dosagem 15 mg
não influencie no resultado das análises proteômicas no grupo tratado. Diferenças
encontradas podem ser ligadas às limitação da própria técnica e sua manipulação.
Figura 4.10 Análise proteômica comparativa entre Controle 1, à esquerda, e o grupo
controle tratado com Losartan 15 mg (Controle 15/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes
representam spots semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam
spots presentes em apenas um dos géis.
4.3.2 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 30 mg
A figura 4.11 ilustra a comparação proteômica do gel do grupo controle com o gel do
grupo controle tratado com Losartan 30 mg/Kg/dia, pelo programa Melanie. A
porcentagem de semelhança foi de 90,80%, compreendendo um total de 163 spots
semelhantes pareados, ou seja, presentes em ambos os géis (pontos verdes).
51
Figura 4.11 Análise proteômica comparativa entre Controle 1, à esquerda, e o grupo
controle tratado com Losartan 30 mg (Controle 30/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes
representam spots semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam
spots presentes em apenas um dos géis.
Como no grupo anterior, não encontramos nenhuma diferença significativa a ponto de
afirmar que o Losartan estaria influenciando o perfil proteico do gel, sendo considerados
géis semelhantes. Diferenças encontradas podem ser ligadas ao manuseio das amostras e da
própria técnica.
4.3.3 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com Losartan
15 mg
A figura 4.12 ilustra a comparação proteômica do gel referência do grupo deficiente
em FBN-1 com o gel do grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 15 mg. A
porcentagem de semelhança foi de 89,37%, compreendendo um total de 143 spots
pareados, presentes em ambos os géis (pontos verdes).
52
Figura 4.12 Análise proteômica comparativa entre o grupo deficiente em fibrilina-1
(mgΔ/+), à esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg
(mgΔ/+ 15/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes
encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um
dos géis.
Não encontramos nenhuma diferença significativa a ponto de afirmar que o Losartan
na dosagem 15 mg estaria influenciando o perfil proteico do gel. Sendo assim, é possível
que o Losartan não influencie no resultado das análises proteômicas no grupo tratado.
Diferenças encontradas podem ser ligadas às limitação da própria técnica.
4.3.4 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com Losartan
30 mg/Kg/dia
A figura 4.13 ilustra a comparação proteômica do gel do grupo deficiente em FBN-1
com o gel do grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 30. A porcentagem de
semelhança foi de 89,49%, compreendendo um total de 132 spots pareados, presentes em
ambos os géis.
53
Não encontramos nenhuma diferença significativa a ponto de afirmar que o Losartan
na dosagem 30 mg/Kg/dia estaria influenciando diretamente o perfil proteico do gel. É
possível que o Losartan não esteja revertendo o perfil proteico encontrado no grupo
controle, embora seja essa dosagem responsável pelo reestabelecimento do tempo normal
de formação de trombos, segundo dados do nosso grupo. Diferenças encontradas podem ser
ligadas ao manuseio e preparação das amostras.
Figura 4.13 Análise proteômica comparativa entre o grupo deficiente em fibrilina-1
(mgΔ/+), à esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg
(mgΔ/+ 30/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes
encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um
dos géis.
4.3.5 Controle x Deficiente em FBN-1
Finalmente, a figura 4.14 mostra a comparação do perfil proteico do grupo controle e
do grupo deficiente em FBN-1. A comparação pelo programa Melanie nos indica uma
porcentagem de semelhança de apenas 80,6%, inferior ao considerado pela literatura como
gel semelhante, e 123 spots pareados. Foi encontrado um perfil proteico significantemente
54
diferente - spots em menor ou maior quantidade - como mostrado nas setas em preto das
figuras 4.15 e 4.16.
Figura 4.14 Análise proteômica comparativa entre o grupo controle (Controle 1), à
esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+), à direita,
pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois geis.
Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis.
4.3.6 Controle x Deficiente em FBN-1 tratados com Losartan 15 mg
A figura 4.15 mostra a comparação do perfil proteico do grupo controle e do grupo
deficiente em FBN-1 tratado com 15 mg. A comparação pelo programa Melanie nos indica
uma porcentagem de semelhança de apenas 79,12%, inferior ao considerado pela literatura
como gel semelhante, e 125 spots pareados. Tal comparação se assemelha à anterior,
sugerindo que o Losartan não é capaz de reverter o perfil proteico controle.
55
Figura 4.15 Análise proteômica comparativa entre o grupo controle (Controle 1), à
esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg (mgΔ/+ 15/1), à
direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois
geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis.
4.3.7 Controle x Deficiente em FBN-1 tratados com Losartan 30 mg
A figura 4.16 mostra a comparação do perfil proteico do grupo controle e do grupo
deficiente em FBN-1 tratado com 30 mg. A comparação pelo programa Melanie nos indica
uma porcentagem de semelhança de apenas 79,61%, inferior ao considerado como gel
semelhante, e 123 spots pareados. Tal comparação se assemelha à anterior, sugerindo que o
Losartan não é capaz de reverter o perfil proteico controle.
56
Figura 4.16 Análise proteômica comparativa entre o grupo controle (Controle 1), à
esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg (mgΔ/+ 30/1), à
direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois
geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis.
A tabela 4.7 resume os dados das comparações entre os grupos.
Tabela 4.7 Resumo dos dados das comparações inter grupos. Num matches representa o
número de spots pareados. A semelhança entre cada gel é representada por % matches.
Gel Ref 1 Gel Ref 2 Num
matches
%
matches
Controle 1 Controle 15/1 160 92,21
Controle 1 Controle 30/1 163 90,80
mgΔ/+ mgΔ/+ 15/1 143 89,37
mgΔ/+ mgΔ/+ 30/1 132 89,49
Controle 1 mgΔ/+ 123 80,60
Controle 1 mgΔ/+ 15/1 125 79,12
Controle 1 mgΔ/+ 30/1 123 79,61
4.3.8 Spots Selecionados - Controle x Deficiente em FBN-1
Com base nas análises comparativas da sessão 4.3.5, ilustradas pelas figuras 4.17 e
4.18, selecionamos alguns spots para serem caracterizados por Espectrometria de Massas,
em colaboração com a Doutora Adriana Paes Leme, do Centro de Biologia Molecular
Estrutural- LNLS. A identificação das proteínas com quantidades diferentes entre os grupos
57
controle e mgΔ/+ é de extrema importância para a correlação de suas funções com o maior
tempo de formação de trombos em camundongos deficientes em fibrilina-1. A tabela 4.8
resume as proteínas caracterizadas por espectrometria de massas deses dois grupos
comparados.
pI 4,0_______________________________________________________________7,0
Figura 4.17 Gel do grupo controle. Setas em preto indicam os spots significantemente
diferentes e selecionados para a espectrometria de massas.
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
58
pI 4,0_______________________________________________________________7,0
Figura 4.18 Gel do grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+).
Setas em preto indicam os spots significantemente diferentes e selecionados para a
espectrometria de massas.
Como ilustrado na figura 4.19, encontramos maior quantidade da proteína
representada pelo spot 1 no grupo controle, e em menor quantidade no grupo fibrilina-1.
Dados da análise pelo programa Melanie indicam uma área de 15,31 mm2, um volume de
259,56 (intensidade de pixels) e uma porcentagem de volume 1,40% para o spot no gel do
grupo controle, contra uma área de 3,15 mm2, um volume 20,45 (intensidade de pixels) e
uma porcentagem de volume de 0,17% para o mesmo spot no grupo deficiente em fibrilina-
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
59
1 (tabela 4.9). Sua identificação pela espectrometria de massas revelou ser a proteína
Endoplasmina, também chamada de 94kDa glucose-regulated protein or GRP94 (1).
Tabela 4.8 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de plaquetas. Dados obtidos por
espectrometria de Massas.
Spot Proteína Massa Molecular
Teórica (kDa) pI Teórico
Cobertura da
Sequência (%)
Num de
peptídeos Score
Expressão
1 Endoplasmina 92,7 5 34 100(52) 1810 WT
2 Fator de von
Willebrand 322,66 5,31 10 72(44) 1426 WT
3 Fator X de
Coagulação 55,4 5,5 8 5(3) 88 WT
4, 5, 7,
12 dados não disponíveis . . . . . .
6 Calpaína sub I 28,55 5,41 27 30(13) 337 WT
8 Adenilil Ciclase 51,87 7.16 25 54(39) 1568 WT
9 α-sinucleina 1 14,47 4,74 61 54(42) 2145 WT
10 Proteassoma sub β6 25,59 4,97 22 12(7) 208 WT
11 Peroxiredoxina 2 21,93 5,2 39 9(5) 1113 WT
13 Vinculina 117,215 5,77 50 146(99) 3995 FBN-1
Figura 4.19 Spot 1: Endoplasmina e spot 2: Fator de von Willebrand, expressos no grupo
controle (esquerda) e em menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita).
A1 A2
60
A Endoplasmina é considerada uma proteína do choque térmico (do inglês “heat
shock 90kDa protein), constituinte do retículo endoplasmático, ligante de Ca2+
. Faz parte de
um grupo de proteínas induzidas pelo choque térmico. Os membros mais importantes desse
grupo constituem uma classe de proteínas envolvidas no dobramento e desdobramento de
outras proteínas. Sua expressão é aumentada quando as células são expostas a elevadas
temperaturas ou outros tipos de estresse (Maio., 1999).
Greening e colaboradores realizaram um estudo comparativo entre o proteoma de
membrana e citoesqueleto de plaquetas humanas contra as proteínas do plasma. Essa
relação nos dá uma base para identificação e classificação das proteínas que são
seletivamente adquiridas do plasma pelas plaquetas, como a endoplasmina, albumina
sérica, L-lactase desidrogenase, fibrinogênio, multimerina 1; das proteínas que são
endógenas às plaquetas, como actina, actinina, filamina, tropomiosina, trombospondina-1,
etc (Greening & Simpson, 2010). Sendo assim, a endoplasmina pode estar sendo menos
expressa ou ainda pode estar sendo adquirida do plasma no grupo deficiente em FBN-1 de
forma menos eficiente que no grupo controle (onde apresentaria uma aquisição normal),
talvez por alguma deficiência nos componentes que a transportam para dentro da plaqueta.
Seu papel em plaquetas parece não estar muito bem elucidado até o presente momento.
Tabela 4.9 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a Endoplasmina, spot 1, em
relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-1.
Grupo Área Volume %
Volume
Controle 15,31 259,56 1,40
mgΔ/+ 3,15 20,45 0,17
61
A proteína representada pelo spot 2 (figura 4.19) está mais expressa no grupo
controle e em menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1. Foi identificada como o
Fator de von Willebrand. Dados da análise pelo Melanie indicam uma área de 4,25 mm2,
um volume de 66,36 (intensidade de pixels) e uma porcentagem de volume 0,35% para o
spot no gel do grupo controle, contra uma área de 6,9 mm2, um volume 24,32 (intensidade
de pixels) e uma porcentagem de volume de 0,20% para o mesmo spot no grupo deficiente
em fibrilina-1 (tabela 4.10).
Tabela 4.10 Dados obtidos pelo Melanie sobre o Fator de Von Willebrand, spot 2, em
relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-1.
Grupo Área Volume %
Volume
Controle 4,25 66,36 0,35
mgΔ/+ 6,9 24,32 0,20
A presença de múltiplos spots de uma mesma proteína no gel, como é o caso do Fator
de von Willebrand (4 isoformas no gel) pode indicar a presença de modificações pós-
traducionais, ocorrência de variações alélicas de uma mesma proteína, variação
isoenzimática ou eventos provenientes do splicing alternativo (Gion et al., 2005)
Fator de von Willebrand é uma proteína multimérica de 2813 aminoácidos. Passa por
extensivas modificações pós-traducionais incluindo a remoção de sequências propeptídeos,
dímeros e eventuais geração de multímeros. Recentes estudos sobre sua estrutura indicam
que enquanto o domínio A para plaquetas e colágeno forma estruturas globulares, uma série
de domínios repetitivos na direção C-termial proporcionando flexibilidade e aumento de
seu comprimento em condições de estresse no vaso sanguíneo (Lillicrap, 2013).
62
FvW é sintetizado nas células endoteliais (armazenado nos corpos de Weibel–Palade)
e nos megacariócitos, precursores das plaquetas (armazenado nos grânulos-α das
plaquetas). É secretado para o plasma e para a matriz extracelular. No plasma, os
multímeros do FvW são submetidos à clivagem por uma metaloprotease denominada
ADAMTS-13 (disintegrin-like and metalloprotease with trombospondin type 1 motifs),
limitando a formação do trombo plaquetário (Bryckaert et al., 2014).
Tem duas funções principais: mediar a adesão das plaquetas ao subendotélio
lesionado, funcionando como uma ponte entre receptores da plaqueta (glicoproteína Ib e
glicoproteína IIb/IIIa) e o subendotélio lesionado. E formar um complexo com o fator VIII,
protegendo-o contra degradação e inativação, mantendo os níveis plasmáticos do fator VIII
(uma proteína pro-coagulante) numa taxa ideal. Para que ocorra a adesão às plaquetas é
necessário a presença de grandes multímeros do FvW (Bryckaert et al., 2014).
Figura 4.20 Sequência de acontecimentos na ativação plaquetária. (A) A adesão
plaquetária na superfície íntima vascular lesionada é mediada pela fixação do fator de von
Willebrand em seu receptor da membrana plaquetária GpIb. (B) As plaquetas se fixam também na parede do vaso danificado mediante a ligação dos receptores de colágeno
63
(COL) ao colágeno subendotelial. Outros estimulantes plaquetários como trombina e
adrenalina se fixam aos seus recptores específicos. (C) Em resposta a esses diferentes
estímulos, plaquetas aderidas se ativam e liberam tromboxano A2 (TXA2) e adenosina
difosfato (ADP), que se fixam aos seus receptores plaquetários respectivos e amplificam o
processo de ativação. (D) A agregação plaquetária é mediada pela ligação de fibrinogênio
(FIB) ao seu receptor nas plaquetas circulantes, que dão lugar a formação de pontes de
fibrinogênio. O receptor FIB se forma mediante o acoplamento de GpIIb/IIIa na membrana
das plaquetas ativadas (Braunwald, 2006).
Já é claro que a interação entre FvW/GPIb - IX - V é a ligação ao receptor
predominante que inicia a adesão de plaquetas. A liberação do FvW dos grânulos-α requer
ativação das plaquetas. Onde houver injúria vascular, plaquetas são recrutadas aos
componentes da matriz extracelular subendoteliais, via receptores específicos de plaquetas
envolvidos na adesão e agregação (figura 4.20). Interação e a sinalização entre FvW/GpIb-
IX-V induz ativação plaquetária, convertendo a maioria das integrinas aIIbb3 em receptores
de alta afinidade para os domínios C4 do FvW. Esse passo é essencial para adesão estável e
para a subsequente reorganização do citoesqueleto levando as plaquetas a se espalharem ao
FvW (Casari et al., 2013).
Deficiências quantitativas ou qualitativas no fator de von Willebrand estão associados
com hemostasia anormal que pode ser manifestado através de sangramentos ou
complicações trombóticas. Diversos estudos epidemiológicos revelam que o aumento nos
níveis de FvW pré-dispõe as complicações aterotrombóticas (Casari et al., 2013).
Sendo assim, diante de toda informação já conhecida sobre o FvW, fica claro que a
menor ocorrência dessa proteína no grupo deficiente em FBN-1 pode estar relacionada com
o maior tempo de oclusão, nesse grupo. Sendo a ligação das plaquetas ao FvW um dos
primeiros e principais eventos para adesão, as plaquetas se fixariam com mais dificuldade
no vaso lesionado, indo de acordo com o mostrado pelo nosso grupo, onde há formação e
64
desprendimento do trombo por um longo período, ate que finalmente, cerca do dobro do
tempo normal, ocorre oclusão total, que pode estar sendo compensada pela ligação ao
colágeno.
O spot número 3 (figura 4.21) foi identificado como o Fator de Coagulação X,
também chamado de Fator de Stuart-Prower. Embora o programa Melanie não tenha
disponíveis os dados de área e volume, esse fator aparece nos géis do grupo controle e em
menor quantidade nos géis do grupo deficiente em FBN-1.
Figura 4.21 Spot 3: Fator de coagulação X, presente sob isoformas ou transformações pós
traducionais (círculo à esquerda), expressos no grupo controle (esquerda) e em menor
quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita).
O fator de coagulação X está presente nas vias intrínseca e extrínseca da coagulação
sanguínea. Quando ativado forma um complexo com o fator V ativado, plaquetas e cálcio,
B1 B2
65
que ativa o fator de coagulação II (protrombina) e leva a formação de trombina. A trombina
por sua vez, desencadeia a formação de fibrina, a partir do fibrinogênio (Ernest Beutler, et
al., 2000).
Essa proteína pode ser de extrema importância para nosso estudo, sua ausência no
grupo FBN-1 poderia ser um dos responsáveis pelo maior tempo de formação de trombo e
trombos menos estáveis, em comparação com camundongos selvagens, já que a cascata de
coagulação nos animais deficientes em FBN-1 estaria parcialmente comprometida.
O spot número 6 foi identificado sendo a proteína Calpaína I (figura 4.22). Segundo
as análises do Melanie, essa proteína está em menor quantidade no grupo deficiente em
FBN-1. No grupo controle sua área é de 5,6 mm2, volume 20,93 (intensidade de pixels) e
porcentagem de volume de 0,11%.
As calpaínas representam uma família bem conservada de proteases de cisteína
dependentes de cálcio. A atividade da calpaína in vivo é altamente regulada pelas
calpastatinas. As calpastatinas inibem especificamente as calpaínas, não inibindo outras
proteases de cisteína, através de suas interações com vários sítios das calpaínas (Pasquet et
al, 1996).
Nas plaquetas, as proteases dependentes de Ca2+
(Calpaína I e II) fragmentam a
proteína ligadora de actina e talina, contribuindo para a reorganização do citoesqueleto
necessária para agregação plaquetária (Dachary-Prigent J et al, 1995). Adicionalmente, as
calpaínas participam da expressão da atividade de procoagulantes e na formação de
microvesículas que secretam fosfatidil serina (PS). O desprendimento dessas
microvesículas está relacionado com perturbações do citoesqueleto da membrana
plaquetária, especialmente a hidrólise de proteínas ligadoras de actina (ABP) mediada por
66
calpaína e a ruptura da associação dos filamentos de actina com a superfície da membrana
(Fujimoto T, Fujimura K, 1991). Sendo assim, a reorganização do citoesqueleto para a
seguinte agregação plaquetária pode estar em parte prejudicada pela menor quantidade de
Calpaína no grupo deficiente em FBN-1.
Figura 4.22 Spot 6: Calpaína subunidade I, expressa no grupo controle (esquerda) e em
menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita). Dados não disponíveis sobre o
spot 7 e sobre o spot sem numeração (à direita, no grupo FBN-1).
O spot 8 foi identificado como a proteína Adenilil ciclase, presente no grupo controle.
Apesar de aparecer pequenos vestígios no grupo deficiente em FBN-1, não é suficiente para
que o programa Melanie reconheça como um ponto proteico, como ilustrado na figura 4.23.
C1 C2
67
Esse spot tem uma área de 6,7 mm2, volume 47,29 (intensidade de pixels) e porcentagem de
volume de 0,25%. Esses mesmos dados são nulos para o grupo FBN-1, pois o Melanie não
o reconhece como proteína.
Figura 4.23 Spot 8: Adenilil Ciclase, expressa no grupo controle (esquerda).
O spot número 9 (figura 4.24) é a proteína α-sinucleina 1, presente no grupo controle
e em menor quantidade no grupo FBN-1, como mostrado na figura 4.24. No gel, dados da
análise pelo Melanie indicam uma área de 7,6 mm2, volume 48,01 (intensidade de pixels) e
porcentagem de volume 0,26% no grupo controle. Enquanto esses mesmos dados são nulos
para o grupo FBN-1. Da mesma forma, os spots de número 10, 11 e 12 também estão
presentes apenas no grupo controle e ausentes no grupo FBN-1. Embora apareçam
D1 D2
68
pequenos vestígios no gel do grupo FBN-1, os parâmetros estabelecidos e padronizados não
são suficientes para que se enquadre como pontos proteicos.
Figura 4.24 Spot 9: α-sinucleina 1; spot 10: Proteassoma β6; spot 11: Peroxiredoxina 2;
spot 12: dados não disponíveis. Todos expressos no grupo controle (esquerda).
A α-sinucleína é uma proteína de 140 aminoácidos e é altamente conservada entre as
espécies de vertebrados. Ela não possui uma sequência de sinal, sugerindo que é uma
proteína intranuclear. Muitos estudos sugerem que o mau dobramento da proteína α-
sinucleína está associado com diversas doenças neurodegenerativas, como na degeneração
E1 E2
F1 F2
69
seletiva dos neurônios na doença de Parkinson e demência do corpo de Lewy (Cooper et
al., 2007).
Entretanto, em plaquetas, Reheman et al. (Reheman et al., 2010) sugere que a α-
sinucleína inibe a liberação de grânulos-α in vitro. O autor postula que camundongos
deficientes em multimerina1 e α-sinucleína apresentam adesão plaquetária diminuída e
formação de trombo deficiente em locais de vaso com injúria (a formação de trombo foi
reestabelecida com a transfusão de multimerina 1). Isso ocorre devido a deficiência de
multimerina 1, uma proteína de adesão armazenada em plaquetas e células endoteliais, que
dão suporte à adesão plaquetária e também se ligam ao colágeno aumentando a adesão
plaquetária ao colágeno dependente do fator de von Willenbrand, assim como ao aumento
dos grânulos-α decorrentes da deficiência de α-sinucleína (Reheman et al., 2010). Dados do
nosso grupo, em relação à formação de trombos menos estáveis no grupo deficiente em
FBN-1, grupo que não apresenta α-sinucleína, parecem ir de acordo com o proposto por
Reheman.
O spot 10 foi identificado como o Proteossoma subunidade β6 (figura 4.24). Dados
do Melanie mostram que sua área corresponde a 6,15 mm2, volume 22,79 (intensidade de
pixels) e porcentagem de volume de 0,12% no grupo controle, no grupo FBN-1 não foi
detectado.
O proteossoma é um complexo proteico capaz de degradar praticamente qualquer
proteína. O proteossoma 26S é constituído por um complexo catalítico central denominado
20S, preso nas suas duas extremidades laterais a complexos regulatórios 19S. O complexo
20S, por sua vez é formado por 2 anéis alfa e 2 anéis beta na sequência alfa-beta-beta-alfa,
cada um formado por 7 subunidades distintas, sendo os anéis alfa estruturais e os beta
70
catalíticos. Diferentes subunidades beta realizam diferentes clivagens proteicas
(Ciechanover, 1998)
Klockenbusch (Klockenbusch et al., 2014) em análises proteômicas encontrou quase
todos os membros do proteossoma 26S e alguns componentes do imunoproteossoma, como
o β5i. Seus estudos bioquímicos confirmaram a atividade catalítica da subunidade 20S,
assim como seus componentes foram montados dentro do complexo proteossômico em
plaquetas. Também verificou que plaquetas contém toda maquinaria necessária para gerar
os peptídeos do MHC I. Sugerindo novas funções para plaquetas, particularmente em
relação à inflamação e imunidade, além de sua função hemostática (Klockenbusch et al.,
2014).
Mas não apenas isso, inibidores de proteossoma demonstraram ser capazes de inibir a
agregação plaquetária (Avcu et al., 2007).
Perturbações farmacológicos ou genéticas na atividade do proteossoma, em
megacariócitos humanos e de camundongos, inibem a formação de pro-plaquetas (um
estágio precursor das plaquetas). A inibição farmacológica foi revertida em megacariócitos
quando tratados com bortezomib, in vitro. Quando a inibição da atividade foi mantida, no
caso da deleção genética de Psmcl (uma subunidade essencial do proteossomo 26S),
megacariócitos não formaram plaquetas e os camundongos com tal deleção tiveram
trombocitopenia (redução do número de plaquetas no sangue) severa e morreram dias após
o nascimento. Esses dados sugerem que o proteossoma esteja envolvido na trombopoiese e
estágios finais da formação de plaquetas (Shi et al., 2014)
Identificamos a Peroxirredoxina 2, representada pelo spot 11 (figura 4.24), com área
7,31 mm2, volume 75,54 (intensidade de volume) e porcentagem de volume 0,4%, de
71
acordo com o Melanie, no grupo controle. Peroxirredoxinas são uma classe de tiol
peroxidases que degradam hidroperóxidos de água. São sensíveis à oxidação, e é suposto
que elas também atuam como sensores redox. O acúmulo de peroxirredoxina oxidadas pode
indicar rompimento da homeostase celular redox (Poynton & Hampton, 2014).
Finalmente, encontramos a Vinculina (Vcl), representada pelo spot 13, mais expressa
no grupo deficiente em FBN-1 (figura 4.25).
Figura 4.25 Spot 13: Vinculina, mais expressa no grupo deficiente em FBN-1 (direita),
menos expressa no grupo controle (esquerda).
A análise pelo Melanie indica que no gel do grupo controle a Vinculina tem área 5,03
mm2, volume 46,12 (intensidade de pixels) e porcentagem de volume 0,25%. Enquanto que
no gel do grupo deficiente em FBN-1, sua área corresponde a 10,84 mm2, volume 198,40
(intensidade de pixels) e porcentagem de volume de 1,6% (tabela 4.11). A figura 4.26 foi
retirada das análises do programa Melanie e ilustra a imagem 3D do spot da Vinculina nos
G1 G2
72
géis dos dois grupos estudados para termos uma ideia da proporção da quantidade da
proteína presente em cada grupo.
Tabela 4.11 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a proteína Vinculina, spot 13, em
relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-1.
Grupo Área Volume %
Volume
Controle 5,03 46,12 0,25
mgΔ/+ 10,84 198,40 1,6
Figura 4.26 Imagem 3D da proteína Vinculina, mais expressa no grupo deficiente em
FBN-1 (direita), em comparação com o grupo controle (esquerda). Imagem obtida pelo
programa Melanie.
A função da Vinculina em plaquetas ainda é desconhecida (Mitsios et al., 2010).
Nachmias sugere que em plaquetas, assim como em células nucleadas, a Vinculina serve
como uma proteína de ligação entre a actina filamentosa do citoesqueleto e a matriz
extracelular, pelo menos em parte. Tal conexão entre o meio exterior e o interior parece
necessária para plaquetas, conhecida como capacidade de exercer tensão sobre as
73
superfícies. Em reposta a uma superfície apropriada, a Vinculina se liga nas terminações de
cada feixe de actina numa estreita relação de aderência com a membrana de cada plaqueta
(Nachmias & Golla, 1991) (Koteliansky et al.,1984).
Em células nucleadas, Vinculina atua como uma proteína reguladora da transmissão
da força contrátil e das funções mecânicas da célula. Tem a capacidade de perceber as
propriedades mecânicas do meio extracelular, estabelecendo uma conexão física entre meio
externo e o citoesqueleto, promovendo rigidez mecânica e transmissão da força contrátil.
Sendo considerada assim, uma proteína mecano-regulatória e mecano-acopladora. Interage
com Integrinas, através da Talina ou da Paxilina para receber estímulos da matriz extra
celular, assim como se conecta a Actomiosina e Actina do citoesqueleto (figura 4.27)
(Mierke, 2009) (Zemljic-harpf et al., 2010).
Figura 4.27 Desenho esquemático do complexo Vinculina-actina-citoesqueleto, associado
com Integrinas. Modificado do original (Mierke, 2009).
74
Mitsios e colaboradores (Mitsios et al., 2010) sugere que a Vinculina tenha funções
diferentes em células nucleadas e em plaquetas. Em seus estudos ele demonstra que Vcl
não é essencial para a formação de trombo em resposta à injúria na artéria carótida, nem
para polimerização e reorganização de actina, nem para retração do coágulo de fibrina, nem
para secreção de grânulos-α, nem desenvolve uma superfície pro-coagulante (Mitsios et al.,
2010).
Acreditamos que o excesso de Vinculina pode estar relacionado com a formação de
trombos menos estáveis e mais embolizáveis. Alta concentração de Vcl poderia não
permitir a organização precisa e exata do complexo intracelular para fixação de integrinas
(talina, paxilina) e a posterior resposta extracelular. Vinculina em excesso poderia
“sequestrar” as proteínas necessárias para o complexo, formando complexos incompletos e
menos eficientes.
A validação da proteína Vinculina por immunoblotting ainda está em andamento para
futura publicação dos resultados encontrados.
4.4 Análise Proteômica de Aorta
A técnica 2D-PAGE foi muito bem padronizada para plaquetas. Expandimos essa
mesma técnica para analisarmos o extrato proteico de artérias aorta de camundongos
selvagens (grupo controle) e camundongos deficientes em fibrilina-1. Aproveitamos
praticamente os mesmo parâmetros utilizados para plaquetas. Pequenos ajustes foram
necessários em relação à preparação da amostra e a corrida da primeira dimensão. (Pilop et
al., 2009) (Liao et al., 2008).
75
Decidimos avaliar o conteúdo proteico desse material em busca de possíveis proteínas
ausentes, com modificações pós-traducionais ou até mesmo com expressão diferenciada,
que poderiam estar influenciando na instabilidade de fixação do trombo na parede do vaso
em animais deficientes em FBN-1. Talvez o conteúdo da própria parede do vaso esteja
comprometido nesses animais com características da Síndrome de Marfan, e não somente o
conteúdo das plaquetas. Poderiam até se somar as diferenças do conteúdo plaquetário e da
parede do vaso, como um efeito sinérgico, contribuindo ambos para a instabilidade da
formação do trombo e o maior tempo de oclusão.
4.4.1. Grupo Controle
Foram realizados quatro géis do extrato proteico de aortas de camundongos selvagem
(n=4, Controle 1, 2, 3 e 4). Todos apresentaram porcentagem de semelhança superior a
85% (chegando a 90%) comparados com o gel referência do grupo (figura 4.28). Foi
encontrado um número de spots em torno de 130 (tabela 4.12). Dessa forma, fechamos o
grupo com um número bom de géis reprodutíveis e padronizados. As poucas diferenças
encontradas podem ser devido às pequenas variações da técnica, ou ainda fragmentos
proteicos, degradados durante o manuseio na preparação da amostra.
76
pI 3,0_____________________________________________________________10,0
Figura 4.28 Gel referência do proteoma da artéria aorta de camundongos selvagens, grupo
controle (Controle 1).
Tabela 4.12. Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do grupo controle, “n=4”.
Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. % matches é a
semelhança dos géis. Dados obtidos pelo Melanie.
Gel Ref x Gel 2
(código)
Num
matches
% matches
Controle 1 x Controle 2 136 94,11
Controle 1 x Controle 3 130 90,96
Controle 1 x Controle 4 130 91,23
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
77
4.4.2. Grupo Deficiente em Fibrilina-1
Foram realizados quatro géis do extrato proteico de aorta de camundongos deficientes
em fibrilina-1 (n=4, mgΔ/+ 1, mgΔ/+ 2, mgΔ/+ 3 e mgΔ/+ 4), todos reprodutíveis e
padronizados, com porcentagem de semelhança superior a 85%, quando comparados ao gel
referência do grupo (mgΔ/+ 1, figura 4.29) e número de spots encontrados foi em torno de
154 (tabela 4.13).
pI 3,0_____________________________________________________________10,0
Figura 4.29 Gel referência do proteoma da artéria aorta camundongos deficientes em
fibrilina-1 (mgΔ/+ 1).
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
78
Tabela 4.13 Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do deficiente em fibrilina-1,
“n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A
semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo
Melanie.
Gel Ref x Gel 2
(código)
Num
matches
% matches
mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 2 156 86,67
mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 3 154 85,40
mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 4 150 85,00
4.5 Análise Proteômica Comparativa de Aorta
Como feito para plaquetas, dentro de cada grupo já padronizado e reprodutível,
escolhemos o melhor gel para ser o gel referência e assim compará-lo com os outros géis
referência a fim de encontrar spots com maior ou menor quantidade no proteoma das
aortas.
4.5.1 Grupo Controle x Grupo Deficiente em Fibrilina-1
A figura 4.30 ilustra a comparação proteômica do gel referência do grupo controle
com o gel referência do grupo deficiente em fibrilina-1. Os pontos verdes em cima dos
spots representam os pontos proteicos semelhantes, presentes nos dois géis comparados
pelo programa Melanie. Os pontos em vermelho representam spots encontrados em apenas
um dos géis e ausente no outro. A porcentagem de semelhança dessa comparação foi de
71,38%, compreendendo um total de 116 spots presentes aos pares (pontos verdes).
79
F ig ura 4 .2 7
Figura 4.30 Análise proteômica comparativa de aorta. Gel do grupo controle, à esquerda,
como o gel do grupo deficiente em FBN-1, à direita. Pontos verdes representam spots
semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em
apenas um dos géis.
Foi encontrado um perfil proteico significantemente diferente. Apesar da grande
quantidade de spots diferentes, representados pelos pontos vermelhos, alguns spots nos
chamaram mais atenção e foram selecionados para a identificação por espectrometria de
massas. Esses spots selecionados estão ilustrados nas figuras 4.31 e 4.32, pelas setas
numeradas.
80
pI 3,0______________________________________________________________10,0
Figura 4.31 Análise proteômica comparativa do extrato proteico de aorta do grupo
controle. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e selecionados
para a espectrometria de massas.
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
81
pI3,0_______________________________________________________________10,0
Figura 4.32 Análise proteômica comparativa do extrato proteico de aorta do grupo
deficiente em fibrilina-1. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e
selecionados para a espectrometria de massas.
4.5.2. Spots Selecionados
Com base nas análises comparativas da sessão 4.5.1, ilustradas pelas figuras 4.31 e
4.32, selecionamos alguns spots para serem identificados por Espectrometria de Massas, em
colaboração com a Doutora Adriana Paes Leme, Centro de Biologia Molecular Estrutural-
LNLS, resumidos na tabela 4.15.
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
82
Tabela 4.14 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de aorta. Dados obtidos por
espectrometria de massas.
O spot 8 foi identificado como a proteína do choque térmico (“Heat shock cognate 71
kDa”) e a análise pelo Melanie mostra área de 3,64 mm2, volume 20,80 (intensidade de
pixels) e porcentagem de volume de 0,16% para o grupo controle; em contrapartida para o
grupo deficiente em FBN-1, área 10,78 mm2, volume 291,74 (intensidade de pixels) e
porcentagem de volume de 1,3% (figura 4.33).
O spot 9 foi identificado pela espectrometria de massa como a proteína Anexina
(figura 4.34), presente no grupo deficiente em fibrilina-1. A análise pelo Melanie indicou
uma área 8,09 mm2, volume 66,69 (intensidade de pixels) porcentagem de volume 0,31%.
No grupo controle, o programa não identificou um spot semelhante.
Spot
Proteína
Massa
Molecular
Teórica (kDa)
pI Teórico
Cobertura
da Sequência
(%)
Num
peptídeos
Score
Expressão
7 Albumina 70700 5.75 18% 18 (8) 418 FBN-1
8 Proteína choque térmico 71 68964 5.37 19% 20(16) 743 FBN-1
9 Anexina a1 38995 6.97 14% 8 (4) 127 FBN-1
15 Queratina I, citoesqueletal 10 57178 5.00 3% 3(2) 159 FBN-1
16 Triose-fosfato isomerase 18100 5.39 8% 1(1) 86 FBN-1
17 Miosina cadeia leve 4
(Fragmento) 21233 4.96 23% 5(2) 109
Wt
18 Proteína de tumor controlada
traducionalmente 19564 4.76 8% 1(1) 113
Wt
19 Miosina regulatóriacadeia
leve 2 19609 4.76 16% 3(2) 68
Wt
27 Hemoglobina β-1 15944 7.12 15% 2(2) 122 Wt
28 Queratina I, citoesqueletal 10 57178 5.00 2% 1(1) 75 FBN-1
83
Figura 4.33 Spot 7: Albumina Sérica. Spot 8: Proteína do choque térmico (do inglês Heat
shock cognate 71 kDa protein). Grupo controle à esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à
direita.
Anexina é o nome comum de um grupo de proteínas celulares, descritas na década de
1980. Ligam-se a membrana fosfolipídicas e são dependentes de cálcio. Nos seres
humanos, as anexinas estão localizadas dentro da célula. No entanto, algumas anexinas
(anexina A1, anexina A2 e anexina A5) também podem ser encontradas fora do ambiente
celular, como por exemplo, no sangue (2).
A1 A2
84
Figura 4.34 Spot 9: Annexin A1. Spot 16: Triose-fosfato isomerase. Grupo controle à
esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à direita.
O spot 16 (figura 4.34) foi identificado como a Triose-fosfato isomerase. Dados do
Melanie indicam uma área de 13,9 mm2, volume de 68,07 (intensidade de pixels) e
porcentagem de volume de 0,32% no grupo deficiente em FBN-1. No grupo controle não
foi encontrado um spot semelhante.
A triose-fosfato isomerase é uma enzima que cataliza a interconversão reversível
de diidroxiacetona fosfato e D-gliceraldeido-3-fosfato. Esta enzima desempenha um papel
importante na glicólise, sendo essencial para uma produção eficiente de energia. É
encontrada em todos os organismos em que se fez rastreio de enzimas,
B1 B2
C1 C2
85
incluindo mamíferos, insetos, e também em fungos, plantas e bactérias (Marzzoco &
Torres, 2007).
O spot 17 (figura 4.35) foi identificado como Miosina cadeia leve. O programa
Melanie indicou área 12,29 mm2, volume 115,161 (intensidade de pixels) e porcentagem de
volume 0,8%. Essa proteína está presente no grupo controle e em menor quantidade no
grupo deficiente em FBN-1.
Figura 4.35 Spot 17: Miosina cadeia leve 4. Spot 18: Translationally-controlled tumor
protein. Spot 19: Miosina regulatória cadeia leve 2. Grupo controle à esquerda, grupo
deficiente em FBN-1 à direita.
A miosina é uma ATPase que se movimenta ao longo da actina responsável
pela contração muscular. Ela é uma enzima mecanoquímica, isto é, converte a energia
química em mecânica e por isso é também chamada de proteína motora. Nos movimentos
D1 D2
86
gerados por esses elementos, a miosina é o motor, os filamentos de actina são os trilhos e o
ATP, o combustível. Estudos de seqüência de DNA mostram mais de 10 classes
de genes para miosina. Entretanto, três são os mais conhecidos: miosina I, miosina II, e
miosina V. A estrutura molecular de todas mostra uma "cabeça", onde se encontra o sítio de
ligação com ATP e com a actina, sendo o local de geração de força; um "pescoço", que
regula a atividade da "cabeça" ligando-se à calmodulina outra proteína reguladora
semelhante; uma "cauda" que contém sítios de ligação que determina se a molécula vai se
ligar à membrana plasmática ou a outras caudas para formar um filamento grosso
(Marzzoco & Torres, 2007).
Miosina e tropomiosina promovem afinidade pela actina. Em células não musculares,
miosina II é regulada pela fosforilação da cadeia leve regulatória pela miosina quinase
cadeia leve e Rho quinase. Estudos comparando a regulação dependente de tropomiosina da
isoforma II de miosina de células musculares estriadas e lisas e as respectivas isoformas
teciduais de tropomiosina mostram que ambas influenciam na regulação dos filamentos de
actina (Barua et al., 2014).
O spot 19 foi identificado como a proteína regulatória de miosina cadeia leve (figura
4.35). As análises do Melanie mostram área 10,78 mm2, volume de 74,84 (intensidade de
pixels) e porcentagem de volume de 0,58%. As cadeias leves são suas menores subunidades
que se ligam próximo às cabeças das cadeias pesadas de miosina. As cadeias leves de
miosina possuem peso molecular de aproximadamente 20 kDa e geralmente há um par
essencial e um par regulador de cadeias leves associado a cada cadeia pesada. Muitas
cadeias leves de miosina que se ligam ao cálcio são consideradas proteínas semelhantes à
calmodulina.
87
Ainda são necessárias mais análises e mais estudo para correlacionar essas proteínas
com os dados apresentados pelo nosso grupo, a fim de encontrar uma relação com o maior
tempo de oclusão dos trombos em camundongos deficientes em FBN-1.
A respeito dos spots 10, 11, 12, 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 não foram
encontrados dados relevantes, podendo ser fragmentos proteicos degradados em
decorrência da preparação ou obtenção da amostra.
4.6 Análise Proteômica de Plaquetas Humanas
Extendemos as análises para plaquetas humanas em colaboração com a Prof. Dra.
Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, para
obtenção de plaquetas de pacientes com Síndrome de Marfan.
Não há dados publicados sobre o assunto ainda, portanto nosso estudo pioneiro pode
ser de grande interesse a respeito de possíveis padrões e marcadores moleculares para a
doença, já que o diagnóstico ainda é feito de forma clínica. Poderemos esclarecer detalhes
fisiológicos e celulares que podem estar relacionados com os dados encontrados em
camundongos.
A comparação de plaquetas humanas ainda está em andamento. Como prévia, temos
na figura 4.36 o gel bidimensional de plaquetas de voluntários sem a Síndrome de Marfan,
enquanto que na figura 4.37 temos um gel do proteoma de plaquetas de um paciente com a
Síndrome.
Em nossas primeiras análises, o programa Melanie identificou 102 spots semelhantes
entre os dois grupos, e porcentagem de semelhança de 54,83%, bem abaixo do padrão
estabelecido para géis semelhantes (figura 4.38).
88
pI 4,0_____________________________________________________________7,0
Figura 4.36 Gel de poliacrilamida bidimensional do proteoma de plaquetas humanas,
voluntários sem a Síndrome de Marfan.
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
89
pI 4,0______________________________________________________________7,0
Figura 4.37 Gel de poliacrilamida bidimensional do proteoma de plaquetas humanas,
pacientes com a Síndrome de Marfan.
kD
250
150
100
75
50
37
25
20
15
10
90
F Figura 4.38 Prévia da análise proteômica comparativa de plaquetas humanas. Voluntários
sem a Síndrome de Marfan à esquerda, pacientes com a Síndrome à direita.
Pretendemos dar continuidade aos estudos de plaquetas humanas nesse contexto,
assim como obter mais voluntários para confecção do maior número de géis possíveis, e
tentar encontrar semelhanças entre os pacientes com a Síndrome que possa se enquadrar
como um marcador para a doença e compará-los com o grupo controle (sem a síndrome).
Mesmo assim, nossas primeiras análises já revelam uma grande concentração de
proteínas presentes apenas no grupo controle (sem a síndrome) em pontos vermelho à
esquerda da figura 4.38. Mais géis e mais análises ainda são necessários.
91
5. Conclusão
A técnica de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida foi padronizada e
reprodutível usando as amostras do extrato proteico de plaquetas e de aorta de
camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1, tratados e não tratados com Losartan.
O Losartan não interfere no proteoma de plaquetas, nem restabelece o perfil proteico
selvagem.
Encontramos diferenças significativas no proteoma do grupo controle e do deficiente
em FBN-1, como por exemplo: Endoplasmina, Fator de von Willebrand, Fator de
Coagulação X, Calpaína I, α-sinucleína, Proteossoma e Vinculina, esta última mais
expressa em camundongos deficientes em FBN-1. Todas de alguma forma poderiam ser
relacionadas com o maior tempo de formação de trombo.
Encontramos diferenças no perfil proteico de Aorta dos mesmo grupos, como por
exemplo a Proteína do choque térmico, anexina, miosina, miosina regulatória, dentre
outras.
Embora ainda em andamento, foram encontradas diferenças no proteoma de Pacientes
com Síndrome de Marfan em comparação com voluntários sem a síndrome.
92
6. Perspectivas
O estudo inédito do proteoma de plaquetas em camundongos modelo para a Síndrome de
Marfan revelou interessantes alvos moleculares, possivelmente envolvidos no maior tempo de
formação de trombo. Entretanto, embora sejam de fundamental importância, somente as
informações parciais sobre a função das proteínas não nos contextualizam em uma visão fisiológica
dinâmica dos processos celulares. Assim, o desenvolvimento de novos trabalhos que envolvam
análises mais abrangentes deve ser realizado. Assim como a validação dessas proteínas por
Immunoblotting, como o caso para a proteína Vinculina, em andamento.
Estudos mais detalhados correlacionando a função das proteínas encontradas assim
como suas interações são necessários para melhor esclarecimento sobre os sintomas
presentes em camundongos FBN-1.
Estudos do proteoma de aorta de camundongos deficientes em FBN-1 ainda estão em
andamento e pretendemos acrescentar a essas análises o tratamento com o Losartan. Essas
análises podem ser de grande importância para o entendimento dos sintomas apresentados
até o presente momento pelo nosso grupo.
As comparações de plaquetas humanas de pacientes Síndrome de Marfan ainda estão
em andamento e podem ser de grande importância para o esclarecimento dos sintomas
encontrados. Pretendemos estabelecer algum marcador ou padrão molecular que auxilie no
diagnóstico da doença, já que ainda é feito basicamente de forma clínica.
93
7. Referências
Aebersold, R. ., & Goodlett, D. R. . (2001). Mass Spectrometry in Proteomics. Chem. Rev.,
101, 269−295.
Aebersold, R., & Mann, M. (2003). Mass spectrometry-based proteomics. Nature,
422(6928), 198–207. http://doi.org/10.1038/nature01511
Anderson, L. (2014). Six decades searching for meaning in the proteome. J Proteomics,
31;107:24-.
Aragão, A. Z. B., Belloni, M., Simabuco, F. M., Zanetti, M. R., Yokoo, S., Domingues, R.
R., … Paes Leme, A. F. (2012). Novel processed form of syndecan-1 shed from SCC-
9 cells plays a role in cell migration. PloS One, 7(8), e43521.
http://doi.org/10.1371/journal.pone.0043521
Arentz, G. ., Weiland, F. ., Oehler, M. K. ., & Hoffmann, P. . (2014). State of Art of 2D
DIGE. Proteomics Clin Appl., 15.
Avcu F; Ural AU; Cetin T; Nevruz O; (2007). Effects of bortezomib on platelet aggregation
and ATP release in human platelets, in vitro. Thrombosis Research, (121(4)), 567–71.
Baldwin, A. K., Simpson, A., Steer, R., Cain, S. a, & Kielty, C. M. (2013). Elastic fibres in
health and disease. Expert Reviews in Molecular Medicine, 15(August), e8.
http://doi.org/10.1017/erm.2013.9
Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., & Hitchcock-degregori, S. E. (2014). Regulation of
Nonmuscle Myosin II by Tropomyosin. Biochemistry, 53, 4015−4024.
Becker, R. C. (2007). Platelets from genome to proteome and beyond. Journal of
Thrombosis and Thrombolysis, 23(3), 245–8. http://doi.org/10.1007/s11239-006-9008-
5
Beene, L. C., Wang, L. W., Hubmacher, D., Keene, D. R., Reinhardt, D. P., Annis, D. S.,
… Apte, S. S. (2013). Nonselective assembly of fibrillin 1 and fibrillin 2 in the rodent
ocular zonule and in cultured cells: implications for Marfan syndrome. Investigative
Ophthalmology & Visual Science, 54(13), 8337–44. http://doi.org/10.1167/iovs.13-
13121
Braunwald, E. (2006). Tratado de Cardiología (7a edição, p. 2087). Madrid: Elsevier.
Broos, K., De Meyer, S. F., Feys, H. B., Vanhoorelbeke, K., & Deckmyn, H. (2012). Blood
platelet biochemistry. Thrombosis Research, 129(3), 245–9.
http://doi.org/10.1016/j.thromres.2011.11.002
94
Bryckaert, M., Rosa, J.-P., Denis, C. V, & Lenting, P. J. (2014). Of von Willebrand factor
and platelets. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS.
http://doi.org/10.1007/s00018-014-1743-8
Cagney, G., & McRedmond, J. (2008). A central resource for platelet proteomics.
Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 28(7), 1214–5.
http://doi.org/10.1161/ATVBAHA.108.167452
Carisey, A., & Ballestrem, C. (2011). Vinculin, an adapter protein in control of cell
adhesion signalling. European Journal of Cell Biology, 90(2-3), 157–63.
http://doi.org/10.1016/j.ejcb.2010.06.007
Caruana, M., Sheppard, M. N., & Li, W. (2014). Aneurysmal dilatation of the aortic sinuses
of Valsalva — beyond Marfan syndrome: a single centre experience and review of the
literature. Frontiers of Medicine, 8(4), 419–426. http://doi.org/10.1007/s11684-014-
0383-6
Casari, C., Lenting, P. J., Wohner, N., Christophe, O. D., & Denis, C. V. (2013). Clearance
of von Willebrand factor. Journal of Thrombosis and Haemostasis : JTH, 11 Suppl 1,
202–11. http://doi.org/10.1111/jth.12226
Cheng, X.-D., & Wei, M.-G. (2014). Profiling the metabolism of astragaloside IV by ultra
performance liquid chromatography coupled with quadrupole/time-of-flight mass
spectrometry. Molecules (Basel, Switzerland), 19(11), 18881–96.
http://doi.org/10.3390/molecules191118881
Ciechanover, A. (1998). The ubiquitin – proteasome pathway : on protein death and cell
life, 17(24), 7151–7160.
Clemetson, K. J. (2012). Platelets and primary haemostasis. Thrombosis Research, 129(3),
220–4. http://doi.org/10.1016/j.thromres.2011.11.036
Cole, L. M. ., & Clench, M. R. . (2015). Mass spectrometry imaging for the proteomic
study of clinical tissue. Proteomics Clin Appl.
Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Kathryn, J., Bhullar, B., …
Bonini, N. M. (2007). Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues
neuron loss in Parkinson’s models. National Institutes of Health, 313(5785), 324–328.
Craft, C. S., Zou, W., Watkins, M., Grimston, S., Brodt, M. D., Broekelmann, T. J., …
Mecham, R. P. (2010). Microfibril-associated glycoprotein-1, an extracellular matrix
regulator of bone remodeling. The Journal of Biological Chemistry, 285(31), 23858–
67. http://doi.org/10.1074/jbc.M110.113019
95
Dachary-Prigent J, Pasquet JM, Freyssinet JM, N. A. (1995). Calcium involvement in
aminophospholipid exposure and microparticle formation during platelet activation: a
study using Ca2+-ATPase inhibitors. Biochemistry, 12(34(36)), 11625–34.
Davis, E. C. (1994). Immunolocalization of microfibril and microfibril-associated proteins
in the subendothelial matrix of the developing mouse aorta, 736, 727–736.
Dowsey, A. W., Morris, J. S., Gutstein, H. B., & Yang, G. (2010). Informatics and
Statistics for Analysing 2-D Gel Electrophoresis. NIH Public Access, 604(7), 1–15.
http://doi.org/10.1007/978-1-60761-444-9
Ernest Beutler, Marshall A. Lichtman, Barry S. Coller, T. J. K. (2000). Hematology 6a
edição (pp. 983 – 999).
Flores-Nascimento, M. C., Paes-Leme, A. F., Mazetto, B. M., Zanella, J. L., De Paula, E.
V, & Annichino-Bizzacchi, J. M. (2012). Inflammatory, immune and lipid
transportation proteins are differentially expressed in spontaneous and proximal deep
vein thrombosis patients. Thrombosis Research, 130(5), e246–50.
http://doi.org/10.1016/j.thromres.2012.08.306
Franck, J., Arafah, K., Elayed, M., Bonnel, D., Vergara, D., Jacquet, A., … Salzet, M.
(2009). MALDI imaging mass spectrometry: state of the art technology in clinical
proteomics. Molecular & Cellular Proteomics : MCP, 8(9), 2023–33.
http://doi.org/10.1074/mcp.R800016-MCP200
Fujimoto T, Fujimura K, K. A. (1991). Functional Ca2+ channel produced by purified
platelet membrane glycoprotein IIB-IIIA complex incorporated into planar
phospholipid bilayer. Thrombosis and Haemostasis Haemost, 1(66(5)), 598–603.
García, A., Prabhakar, S., Brock, C. J., Pearce, A. C., Dwek, R. a, Watson, S. P., …
Zitzmann, N. (2004). Extensive analysis of the human platelet proteome by two-
dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics, 4(3), 656–68.
http://doi.org/10.1002/pmic.200300665
Gevaert, K., & VANDEKERCKHOVE, J. (2000). Protein identification methods in
proteomics Proteomics and 2-DE. Electrophoresis, 21(6), 1145–54.
Gibbins, J. M., & Mahaut-smith, M. P. (2004). Platelets and Megakaryocytes (Vol. 272).
Gion, J.-M., Lalanne, C., Le Provost, G., Ferry-Dumazet, H., Paiva, J., Chaumeil, P., …
Plomion, C. (2005). The proteome of maritime pine wood forming tissue. Proteomics,
5(14), 3731–51. http://doi.org/10.1002/pmic.200401197
96
Greening, D. W., & Simpson., R. J. (2010). A centrifugal ultrafiltration strategy for
isolating the low-molecular weight (<or=25K) component of human plasma proteome.
J Proteomics, 3(73(3)), 637–48.
Gregorich, Z. R. ., & Ge, Y. . (2014). Top-down proteomics in health and disease:
challenges and opportunities. Proteomics, 14 (10), 1195–210.
Gygi, S. P., Corthals, G. L., Zhang, Y., Rochon, Y., & Aebersold, R. (2010). Evaluation of
two-dimensional gel electrophoresis- based proteome analysis technology. Proc Natl
Acad Sci U S A., 97(17), 3–8.
Habashi, J. P., Judge, D. P., Holm, T. M., Cohn, R. D., Bart, L., Cooper, T. K., … Dietz, C.
(2006). Losartan, an AT1 Antagonist, Prevents Aortic Aneurysm in a Mouse Model of
Marfan Syndrome. National Institutes of Health, 312(5770), 117–121.
Halper, J. . (2014). Progress in Heritable Soft Connective Tissue Diseases.
Halper, J. ., & Kjaer, M. . (2014). Basic components of connective tissues and extracellular
matrix: elastin, fibrillin, fibulins, fibrinogen, fibronectin, laminin, tenascins and
thrombospondins. Adv Exp Med Biol., 802, 31–47.
Hanash, S. (2004). Initiatives relevant to clinical proteomics. Molecular & Cellular
Proteomics : MCP, 3(4), 298–301. http://doi.org/10.1074/mcp.R400004-MCP200
Handford, P. A., Downing, A. K., Reinhardt, D. P., & Sakai, L. Y. (2000). Fibrillin : from
domain structure to supramolecular assembly. Matrix Biology, 19, 457–470.
Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., & Burns, A. R. (2015). Corneal stroma
microfibrils. Experimental Eye Research, 132C, 198–207.
http://doi.org/10.1016/j.exer.2015.01.014
Hayes, A. J., Gibson, M. A., Shu, C., & Melrose, J. (2014). Tissue and Cell Confocal
microscopy demonstrates association of LTBP-2 in fibrillin-1 microfibrils and
colocalisation with perlecan in the disc cell pericellular matrix. Tissue and Cell, 46(3),
185–197. http://doi.org/10.1016/j.tice.2014.04.002
Healthcare, G. E. (n.d.). User Manual 2D Electrophoresis Principles and Methods.
Hubmacher, D., & Apte, S. S. . (2013). The biology of the extracellular matrix : novel
insights. National Institutes of Health, 25(1), 65–70.
http://doi.org/10.1097/BOR.0b013e32835b137b.The
Judge, D., & Biery, N. (2004). Evidence for a critical contribution of haploinsufficiency in
the complex pathogenesis of Marfan syndrome. The Journal of Clinical Investigation,
114(2). http://doi.org/10.1172/JCI200420641.172
97
Judge, D. P. (2006). Marfan´s syndrome, 366(9501), 1965–1976.
Judge, D. P., & Dietz, H. C. (2008). Therapy of Marfan syndrome. Annual Review of
Medicine, 59, 43–59. http://doi.org/10.1146/annurev.med.59.103106.103801
Kielty, B. C. A. Y. M., Sherratt, M. J., Marson, À. A., & Baldock, C. (2005). Fibrillin
Microfibrils (Vol. 70, pp. 405–436). http://doi.org/10.1016/S0065-3233(04)70012-1
Klockenbusch, C., Walsh, G. M., Brown, L. M., & Hoffman, M. D. (2014). Global
Proteome Analysis identifies Active Immunoproteasome subunits in Human Platelets.
Koteliansky, V. E., Gneushev, G. N., Glukhova, M. A., & Venyaminov, S. Y. (1984).
Identification and isolation of vinculin from platelets, 165(1), 26–30.
Kumar, A., & Agarwal, S. (2014). Marfan syndrome: An eyesight of syndrome. Meta
Gene, 2, 96–105. http://doi.org/10.1016/j.mgene.2013.10.008
Lannoy, M., Slove, S., & Jacob, M.-P. (2014). The function of elastic fibers in the arteries:
beyond elasticity. Pathologie-Biologie, 62(2), 79–83.
http://doi.org/10.1016/j.patbio.2014.02.011
Liao, M., Liu, Z., Bao, J., Zhao, Z., Hu, J., Feng, X., … Jing, Z. (2008). A proteomic study
of the aortic media in human thoracic aortic dissection: implication for oxidative
stress. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 136(1), 65–72, 72.e1–3.
http://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2007.11.017
Liebler, D. C. (n.d.). Introduction to Proteomics Tools for the New Biology.
Lillicrap, D. (2013). von Willebrand disease: advances in pathogenetic understanding,
diagnosis, and therapy. Blood, (122(23)).
Lin, G., Tiedemann, K., Vollbrandt, T., Peters, H., Batge, B., Brinckmann, J., & Reinhardt,
D. P. (2002). Homo- and heterotypic fibrillin-1 and -2 interactions constitute the basis
for the assembly of microfibrils. The Journal of Biological Chemistry, 277(52),
50795–804. http://doi.org/10.1074/jbc.M210611200
Magdeldin, S., Enany, S., Yoshida, Y., Xu, B., Zhang, Y., Zureena, Z., & Lokamani, I.
(2014). Basics and recent advances of two dimensional- polyacrylamide gel
electrophoresis. Clinical Pro, 1–10.
Maguire, P. B., & Fitzgerald, D. J. (2003). Platelet proteomics. Journal of Thrombosis and
Haemostasis : JTH, 1(7), 1593–601. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12871296
Maio., A. De. (1999). Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams. Shock, 11, 1–12.
98
Martins de Souza, D., Oliveira, B. M., Castro-Dias, E., Winck, F. V, Horiuchi, R. S. O.,
Baldasso, P. a, … Novello, J. C. (2008). The untiring search for the most complete
proteome representation: reviewing the methods. Briefings in Functional Genomics &
Proteomics, 7(4), 312–21. http://doi.org/10.1093/bfgp/eln023
Martins-de-Souza, D. (2012). Brazil: the country of proteomics. Proteomics, 12(17), 2599–
600. http://doi.org/10.1002/pmic.201270114
Martins-de-souza, D. (2014). Proteomics, metabolomics, and protein interactomics in the
characterization of the molecular features of major depressive disorder. Translational
Research, Dialogues in Clinical Neuroscience, 16, 63–73.
Martins-De-Souza, D. (2014). Shotgun Proteomics (p. Methods and Protocols).
Martins-De-Souza, D., Dias-Neto, E., Schmitt, A., Falkai, P., Gormanns, P., Maccarrone,
G., … Gattaz, W. F. (2010). Proteome analysis of schizophrenia brain tissue. The
World Journal of Biological Psychiatry : The Official Journal of the World Federation
of Societies of Biological Psychiatry, 11(2), 110–20.
http://doi.org/10.3109/15622970903490626
Martins-de-Souza, D., Gattaz, W. F., Schmitt, A., Novello, J. C., Marangoni, S., Turck, C.
W., & Dias-Neto, E. (2009). Proteome analysis of schizophrenia patients Wernicke’s
area reveals an energy metabolism dysregulation. BMC Psychiatry, 9, 17.
http://doi.org/10.1186/1471-244X-9-17
Martins-de-Souza, D., Harris, L. W., Guest, P. C., Turck, C. W., & Bahn, S. (2010). The
role of proteomics in depression research. European Archives of Psychiatry and
Clinical Neuroscience, 260(6), 499–506. http://doi.org/10.1007/s00406-009-0093-2
Marzzoco, A., & Torres, B. B. (2007). Bioquímica Básica.
May, C. ., Brosseron, F. ., Chartowski, P. ., Meyer, H. E. ., & Katrin, M. . (2012).
Differential Proteome Analysis Using 2D-DIGE. Quantitative Methods in Proteomics.
Methods in Molecular Biology, 893, 75–82.
Melanie 7.0 2D Gel Analysis Software. (n.d.) (pp. 1–40).
Michele, M. Di, Freson, K., & Geet, C. Van. (2014). Recent advances in platelet
proteomics, 1–21.
Mierke, C. T. (2009). The role of vinculin in the regulation of the mechanical properties of
cells. Cell Biochemistry and Biophysics, 53(3), 115–26. http://doi.org/10.1007/s12013-
009-9047-6
99
Minden, J. S. (2012). Two-Dimensional Difference Gel Electrophoresis. Protein
Electrophoresis. Methods in Molecular Biology, 869, 287–304.
Mitsios, J. V, Prevost, N., Kasirer-Friede, a, Gutierrez, E., Groisman, a, Abrams, C. S., …
Shattil, S. J. (2010). What is vinculin needed for in platelets? Journal of Thrombosis
and Haemostasis : JTH, 8(10), 2294–304. http://doi.org/10.1111/j.1538-
7836.2010.03998.x
Nachmias, V. T., & Golla, R. (1991). Vinculin in Relation to Stress Fibers in Spread
Platelets, 202.
Nogueira, F. C. S. ., & Domont, G. B. . (2014). Survey of shotgun proteomics. Methods
Mol Biol., 1156:3-23.
O’Brien, E., & Palsson, B. (2015). Computing the functional proteome: recent progress and
future prospects for genome-scale models. Curr Opin Biotechnol., 7;34C:125-.
O’Farrell, P. H. (1975). High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins. J
Biol Chem, 250(10), 4007–4021.
O’Neill, E. E., Brock, C. J., von Kriegsheim, A. F., Pearce, A. C., Dwek, R. a, Watson, S.
P., & Hebestreit, H. F. (2002). Towards complete analysis of the platelet proteome.
Proteomics, 2(3), 288–305. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11921445
Owens, a P., & Mackman, N. (2010). Tissue factor and thrombosis: The clot starts here.
Thrombosis and Haemostasis, 104(3), 432–9. http://doi.org/10.1160/TH09-11-0771
Pasquet, J., Dachary-prigent, J., & Nurden, A. T. (1996). Calcium influx is a determining
factor of calpain activation and microparticle formation in platelets. Eur Journal
Biochem, 654, 647–654.
Patel, S. R., Hartwig, J. H., & Jr, J. E. I. (2005). The biogenesis of platelets from
megakaryocyte proplatelets. Review Series, 115(12).
http://doi.org/10.1172/JCI26891.3348
Patterson, S. D., & Aebersold, R. H. (2003). Proteomics: the first decade and beyond.
Nature Genetics, 33 Suppl(march), 311–23. http://doi.org/10.1038/ng1106
Pereira, L. ., Andrikopoulos, K., Tian, J., Lee, S. Y., Keene, D. R., Ono, R., … Ramirez, F.
(1997). Targettin of the gene enconding fibrilin-1 recapitulates the vascular aspect of
Marfan syndrome. Nature, 17.
Pereira, L. ., Lee, S. Y., Gayraud, B., Andrikopoulos, K., Shapiro, S. D., Bunton, T., …
Ramirez, F. (1999). Pathogenetic sequence for aneurysm revealed in mice
100
underexpressing fibrillin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 96(7), 3819–23. Retrieved from
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=22378&tool=pmcentrez&r
endertype=abstract
Pereira, L., D’Alessio, M., Ramirez, F., Lynch, J.R., Sykes, B., Pangilinan, R., A., &
Bonadio, J. (1993). Genomic organization of the sequence coding for fibrillin, the
defective gene product in Marfan syndrome. Human Mol. Genet, 2:961–968.
Pilop, C., Aregger, F., Gorman, R. C., Brunisholz, R., Gerrits, B., Schaffner, T., … Frey, B.
M. (2009). Proteomic analysis in aortic media of patients with Marfan syndrome
reveals increased activity of calpain 2 in aortic aneurysms. Circulation, 120(11), 983–
91. http://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.108.843516
Polunina TA, Varshavskaia IuS, Grigor’eva GV, K. I. (2014). Proteomic methods of
protein separation and analysis. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol., (3):107–14.
Poynton, R. A., & Hampton, M. B. (2014). Peroxiredoxins as biomarkers of oxidative
stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) General Subjects, 1840(2), 906–912.
R; Franken, Hartog, A. den, Radonic, T., Micha, D., Maugeri, A., Dijk, F. van, … Pals, G.
(2015). Beneficial Outcome of Losartan Therapy Depends on Type of FBN1 Mutation
in Marfan Syndrome. Circ Cardiovasc Genet.
RABILLOUD T. (1999). Silver staining of 2-D electrophoresis gels. (pp. 112, 297–305).
Rabilloud, T. (2002). Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old
fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics, 2(1), 3–10. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11788986
Ramirez, F. ., & Sakai, L. Y. . (2011). Biogenesis and function of fibrillin assemblies. Cell
Tissue, 339(1), 71–82. http://doi.org/10.1007/s00441-009-0822-x.Biogenesis
Ramirez, F., & Rifkin, D. B. (2003). Cell signaling events: a view from the matrix. Matrix
Biology, 22(2), 101–107. http://doi.org/10.1016/S0945-053X(03)00002-7
Reed, P. W.; Densmore, A.; Bloch, R. J. (2013). Optimization of Large Gel 2D
Electrophoresis for Proteomic Studies of Skeletal Muscle. Electrophoresis, 33(8), 1–
14. http://doi.org/10.1002/elps.201100642.Optimization
Reheman, A., Tasneem, S., Ni, H., & Hayward, C. P. M. (2010). Mice with deleted
multimerin 1 and alpha-synuclein genes have impaired platelet adhesion and impaired
thrombus formation that is corrected by multimerin 1. Thrombosis Research, 125(5),
e177–83. http://doi.org/10.1016/j.thromres.2010.01.009
101
Reinhardt, D. P., Ono, R. N., & Sakai, L. Y. (1997). Calcium Stabilizes Fibrillin-1 against
Proteolytic Degradation. Journal of Biological Chemistry, 272(2), 1231–1236.
http://doi.org/10.1074/jbc.272.2.1231
Richards, A. L. ., E.;, M. A., & Coon, J. J. . (2015). Proteome sequencing goes deep. Curr
Opin Chem Biol., 24C:11-17.
Rosengren, A. T., Salmi, J. M., Aittokallio, T., Westerholm, J., Lahesmaa, R., Nyman, T. a,
& Nevalainen, O. S. (2003). Comparison of PDQuest and Progenesis software
packages in the analysis of two-dimensional electrophoresis gels. Proteomics, 3(10),
1936–46. http://doi.org/10.1002/pmic.200300544
Ross, J. M., McIntire, L. V, Moake, J. L., Kuo, H. J., Qian, R. Q., Glanville, R. W., …
Rand, J. H. (1998). Fibrillin containing elastic microfibrils support platelet adhesion
under dynamic shear conditions. Thrombosis and Haemostasis, 79(1), 155–61.
Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9459342
Sakai, L. Y., Keene, D. R., & Engvall, E. (1986). Fibrillin, a new 350-kD glycoprotein, is a
component of extracellular microfibrils. The Journal of Cell Biology, 103(6 Pt 1),
2499–509. Retrieved from
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2114568&tool=pmcentrez
&rendertype=abstract
Santucci, L., Bruschi, M., Ghiggeri, G. M., & Candiano, G. (2014). The Latest
Advancements in Proteomic Two-dimensional Gel Electrophoresis Analysis Applied to
Biological Samples (pp. 1243, 103–125).
Shi, D. S., Smith, M. C. P., Campbell, R. A., Zimmerman, P. W., Franks, Z. B., Kraemer,
B. F., … Weyrich, A. S. (2014). Proteasome function is required for platelet
production, 124(9), 3757–3766. http://doi.org/10.1172/JCI75247.to
Shinaoka, A., Momota, R., Shiratsuchi, E., Kosaka, M., Kumagishi, K., Nakahara, R., …
Ohtsuka, A. (2013). Architecture of the Subendothelial Elastic Fibers of Small Blood
Vessels and Variations in Vascular Type and Size. Microscopy and Microanalysis, 19,
406–414.
Smith, B., & Murphy, G. (2014). Stem cells, megakaryocytes, and platelets. Curr Opin
Hematol., 21(5):430–7.
Walther, T. C., & Mann, M. (2010). Mass spectrometry-based proteomics in cell biology.
The Journal of Cell Biology, 190(4), 491–500. http://doi.org/10.1083/jcb.201004052
Wasinger, V. C. ., Cordwell, S. J. ., Cerpa-Poljak, A. ., Yan, J. X. ., Gooley, A. A. .,
Wilkins, M. R. ., … Humphery-Smith, I. . (1995). Progress with gene-product
mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis, 16 (7), 1090–4.
102
Werneck, C. C., Trask, B. C., Broekelmann, T. J., Trask, T. M., Ritty, T. M., Segade, F., &
Mecham, R. P. (2004). Identification of a major microfibril-associated glycoprotein-1-
binding domain in fibrillin-2. The Journal of Biological Chemistry, 279(22), 23045–
51. http://doi.org/10.1074/jbc.M402656200
Werneck, C. C., Vicente, C. P., Weinberg, J. S., Shifren, A., Pierce, R. a, Broekelmann, T.
J., … Mecham, R. P. (2008). Mice lacking the extracellular matrix protein MAGP1
display delayed thrombotic occlusion following vessel injury. Blood, 111(8), 4137–44.
http://doi.org/10.1182/blood-2007-07-101733
Westermeier, R. . (2014). Looking at proteins from two dimensions: a review on five
decades of 2D electrophoresis. Arch Physiol Biochem., 120(5):168–72.
Westermeier, R. ., & Görg, A. . (2011). Two-dimensional electrophoresis in proteomics.
Methods Biochem Anal., 54:411-39.
Winkler, W., Zellner, M., Diestinger, M., Babeluk, R., Marchetti, M., Goll, A., … Oehler,
R. (2008). Biological variation of the platelet proteome in the elderly population and
its implication for biomarker research. Molecular & Cellular Proteomics : MCP, 7(1),
193–203. http://doi.org/10.1074/mcp.M700137-MCP200
Wray, W., Boulikas, T., Wray, V., & Hancock, R. (1981). Silver staining of proteins in
polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. Retrieved from
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269781901792
Zemljic-harpf, A., Manso, A. M., & Ross, R. S. (2010). Vinculin and Talin : Focus on the
Myocardium, 57(8), 849–855. http://doi.org/10.231/JIM.0b013e3181c5e074.Vinculin
Zilberberg;, L., Todorovic;, V., Dabovic;, B., Horiguchi;, M., Couroussé;, T., Sakai;, L. Y.,
& Rifkin;, D. B. (2013). Specificity of latent TGF-ß binding protein (LTBP)
incorporation into matrix: role of fibrillins and fibronectin. J Cell Physiology, 227(12),
3828–3836. http://doi.org/10.1002/jcp.24094.Specificity
Zucker, M. B., & Nachmias, V. T. (1985). Platelet activation. Arteriosclerosis, Thrombosis,
and Vascular Biology, 5(1), 2–18. http://doi.org/10.1161/01.ATV.5.1.2
Zufferey, A., Fontana, P., Reny, J., & Nolli, S. (2012). PLATELET PROTEOMICS. Mass
Spectrometry Reviews, 331–351. http://doi.org/10.1002/mas
Referências eletrônicas consultadas:
(1) (http://www.proteopedia.org/ wiki/index.php/Endoplasmin).
(2) http://www.nlm.nih.gov/mesh/
103
8. Anexo I