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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
Programa de Pós-Graduação em Ciências em Saúde
AVALIAÇÃO in vitro DA POTENCIAL
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS DE
DIFERENTES ESPÉCIES DE ANNONACEAE
RAFAEL LAURINDO MORALES
Sinop, Mato Grosso Fevereiro de 2019
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RAFAEL LAURINDO MORALES
AVALIAÇÃO in vitro DA POTENCIAL
ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS DE
DIFERENTES ESPÉCIES DE ANNONACEAE
Orientadora: Profa Dra. Carla Regina Andrighetti
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências em Saúde da Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop, como requisito
para a obtenção do título de Mestre em Ciências em Saúde. Área de
concentração: Atividade Farmacológica e toxicológica de produtos naturais e sintéticos.
Sinop, Mato Grosso
Fevereiro de 2019
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AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus por sempre ter iluminado meus passos e me auxiliado nas escolhas
difíceis que tive que fazer, afinal... escolhas nem sempre são agradáveis, mas precisamos
fazê-las. Agradeço a minha família, em especial a minha mãe Braulia e ao meu pai Matias,
pelo incentivo e pela compreensão, pois sem este incentivo, nada seria possível.
Agradeço a todos aqueles que colaboraram para a realização deste trabalho, em
especial à minha orientadora, Professora Dra Carla Regina Andrighetti, saiba que sempre
terei um carinho imenso pela senhora, pois sempre teve muita paciência e nunca mediu
esforços para me ensinar durante todos esses quase 8 anos de convivência.
À professora Dra Stela Regina Ferrarini pelo apoio e cooperação na formulação das
nanoestruturas utilizadas neste trabalho. Ao Dr. Rogério Bicudo, pesquisador da Embrapa,
pela cooperação com as análises qualitativas das amostras, a Professora Dra Roberta
Bronzoni por permitir que este trabalho fosse realizado em seu laboratório e a minha amiga
e colega de laboratório Cris... tenho muito a agradecer, principalmente por sua paciência
logo que iniciei meus primeiros passos no maravilhoso caminho da cultura de células.
Agradeço também a Eriana, técnica do Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular, por
todo o apoio e por todas as conversas. Aos meus colegas do PPGCS, em especial Emília
Tomazeli, Karla Guedes, Felipe Finger, Patrícia Comiran e Renata Ragi, gostaria de dizer
obrigado e desejar muito sucesso daqui em diante!
Aos meus amigos Jessyca Liberatto e Luiz Henrique Bachega por aguentarem as
minhas reclamações, principalmente nesta reta final... Adorei conhecê-los e espero levar a
amizade de vocês por muito tempo e aos meus queridos amigos Débora Valério e Altamir dos
Santos Arruda, gostaria de dizer muito obrigado... obrigado por serem exemplos de
determinação... Agradeço e sou feliz em poder considerá-los como amigos!
Agradeço também as Agências de fomento, FAPEMAT, CNPq, pela concessão da
bolsa de mestrado e pelo auxílio financeiro, e a UFMT por possibilitarem o desenvolvimento
deste trabalho.
Enfim... à todos, obrigado!
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RESUMO
MORALES, R.L. Avaliação in vitro da potencial atividade antiviral de extratos de diferentes
espécies de Annonaceae.
Os vírus são considerados patógenos de grande importância clínica para os humanos em virtude do amplo espectro de doenças que podem causar, o Herpes Simplex Virus tipo 1
(HSV-1), por exemplo, pode ser associado a lesões orofaciais e genitais, enquanto arbovírus tais como os vírus da dengue (DENV) e mayaro (MAYV) estão intimamente relacionados a doenças febris, que podem evoluir para casos mais severos. Os produtos naturais,
principalmente os derivados vegetais, são considerados fontes promissoras de novos compostos que podem ser utilizados pela indústria farmacêutica para o desenvolvimento de
novos medicamentos, entre eles os antivirais. Estudos químicos e farmacológicos de espécies vegetais da família Annonaceae têm mostrado o acúmulo metabólitos secundários com importantes atividades farmacológicas.. Este trabalho objetivou avaliar a atividade antiviral
contra HSV-1 cepa KOS e contra os vírus DENV-1 e MAYV isolados de amostras clínicas, de extratos n-hexânicos, acetato de etila e metanólicos de folhas e ramos de Fusaea longifolia
Aubl. Saff., Guatteria punctata Aubl. R.A.Howard., Xylopia benthamii R.E.Fr., Duguetia sp e Xylopia cf frutescens, cujos extratos n-hexânicos, acetato de etila e metanólicos dos frutos também foram avaliados; avaliar o efeito antiviral de subfrações do extrato acetato de etila
dos ramos de F. longifolia (RAE) e de formulações em nanoestruturas deste extrato. O extrato RAE foi incorporado na nanocápsula polimérica de núcleo lipídico (LNC), na nanocápsula
LNC, carregada positivamente, formulada com polímero Eudragit RL (LNC+), empregando a deposição interfacial de polímeros pré-formados, e ao lipossoma (LP), através da evaporação em fase reversa. A avaliação da atividade antiviral foi realizada através do ensaio do MTT
utilizando concentrações abaixo da Concentração Citotóxica a 50% (CC50) previamente determinadas através da avaliação da citotoxicidade, frente às células Vero-E6, através do
mesmo ensaio. Nanoestruturas brancas foram utilizadas para eliminar a interferência dos nanocarreadores e o aciclovir (15µM), como controle positivo para o HSV-1. A Concentração Efetiva a 50% (CE50) e o índice de seletividade (IS=CC50/CE50) foram calculados para
aqueles materiais que inibiram mais que 50% da replicação viral. Todos os extratos foram ineficazes contra DENV-1 e o MAYV. Os extratos GFAE, XfFM, XfRM, XfFlM, FAE e
RAE foram considerados os mais promissores frente ao HSV-1 apresentando um índice de seletividade (IS)= 14,73; 7,41; 15,05; 16,70; 14,28 e 10,63, respectivamente. Enquanto que os extratos de Xylopia benthamii e Duguetia sp. não foram considerados ativos. Das subfrações
do extrato acetato de etila dos ramos de F. longifolia avaliadas frente ao HSV-1, apenas F5 apresentou potencial antiviral com IS = 15,97 e efeito virucida, sendo que esta subfração
mostrou-se 47,41 % mais seletiva que o extrato de origem (RAE). Análises cromatográficas, por UPLC-MS/MS, de RAE e F5 revelaram a presença de quercetina–3-β-D-glicosídeo; taxifolina; quercetina e luteolina em FRAE e de quercetina–3-β-D-glicosídeo em F5. FRAE
apresentou efeito virucida e foi eficiente no pós-tratamento, com IS = 8,35 e 3,38, respectivamente. Dos nanossistemas avaliados, apenas as nanocápsulas LNC+ potencializaram
o efeito de FRAE, enquanto que quando incorporado em LP não foi capaz de inibir a replicação do HSV-1. Dentre as espécies de Annonaceae estudadas a Fusaea longifolia apresentou a atividade antiviral mais promissora Novos estudos serão realizados a fim de
avaliar em quais etapas do ciclo de replicação viral do HSV-1 as amostras RAE, F5 e LNC+
agem.
Palavras – chave: Annonaceae; Atividade antiviral; Nanoestruturas.
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ABSTRACT
MORALES, R.L. In vitro evaluation of the antiviral activity of extracts from different
species of Annonaceae
Viruses are considered pathogens of great clinical importance to humans because of the various diseases that can cause, the Herpes Simplex virus type 1 (HSV-1), for example, are
associated with orofacial and genital lesions, while arboviruses such as dengue viruses (DENV) and mayaro (MAYV) are related to febrile diseases, which may progress to more severe cases. Natural products, mainly plant derivatives, are considered promising sources of
new compounds that can be used by the pharmaceutical industry to develop new drugs, including antivirals. Chemical and pharmacological studies of Annonaceae have shown
accumulation secondary metabolites with important pharmacological activities, such as antiviral. This work aimed to evaluate the antivirals activities against HSV-1 (strain KOS) and against DENV-1 and MAYV viruses isolated from clinical samples, of n-hexane, ethyl acetate
and methanolic extracts from leaves and branches of Fusaea longifolia Aubl. Saff., Guatteria punctata (Aubl.) R.A.Howard., Xylopia benthamii R.E.Fr., Duguetia sp and Xylopia (cf)
frutescens, whose n-hexane extracts, ethyl acetate and methanolic extracts flowers were also evaluated; evaluate the antiviral effect of subfractions source ethyl acetate extract of the branches of F. longifolia (RAE) and of formulations whose extract was incorporated. The
RAE extract was incorporated in the lipid core polymeric nanocapsule (LNC), in the positively charged LNC nanocapsule formulated with Eudragit RL polymer (LNC+),
employing the interfacial deposition of preformed polymers, and in the liposome (LP), through reverse phase evaporation. The evaluation of antiviral activity was performed by the MTT assay, using concentrations below the Cytotoxic Concentration 50 %(CC50) previously
determined by cytotoxicity evaluation, against Vero E6 cells, through the same assay. White nanostructures were used to eliminate interference from nanocarriers and aciclovir (15μM) as
a positive control. The Effective Concentration 50 % (EC50) and selectivity index (IS = CC50 / EC50) were calculated for those materials that inhibited more than 50% of viral replication. All extracts were ineffective against DENV-1 and MAYV. The extracts GFAE, XfFM,
XfRM, XfFlM, FAE and RAE were considered promising with a IS = 14.73; 7.41; 15.05; 16,70; 14.28 and 10.63, respectively. Xylopia benthamii and Duguetia sp. extracts weren't
considered promising because they presented IS <5. Only F5 subfract presented antiviral potential with CC50> 1000 μg.mL-1; an EC 50 = 63.78 ± 2.73 and IS = 15.97. F5 subfract was 47.41% more selective than RAE. UPLC-MS/MS chromatographic analyzes of the RAE and
F5 subfract revealed the presence of quercetin-3-β-D-glucoside; taxifolin; quercetin and luteolin in RAE and quercetin-3-β-D-glucoside in the F5 subfract. RAE presented virucidal
effect and was efficient in posttreatment, with IS = 8.35 and 3.38, respectively. Of the nanosystems evaluated, only the LNC+ nanocapsules potentiated the effect of RAE, whereas when incorporated in LP it was not able to inhibit the replication of HSV-1. Among the
species of Annonaceae studied, only Fusaea longifolia presented the most promising antiviral activity. New studies will be carried out to evaluate in which stages of the replication cycle of
HSV-1 the RAE, F5 and LNC+ samples act. Key-words: Annonaceae; Antiviral activity; Nanostructures.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura básica representativa do vírus Herpes Simplex virus – 1 (HSV-1). ......... 16
Figura 2 - Estrutura básica em 3D do vírus Herpes simplex virus. .......................................... 16
Figura 3 - Ciclo de replicação viral do Herpes Simplex vírus.................................................. 18
Figura 4 - Estrutura química do Aciclovir (2-amino-9-(2-hidroxietoximetil)-3H-purin-6-ona).
.................................................................................................................................................. 23
Figura 5 - Estrutura do genoma do flavivírus e da partícula viral. ........................................... 25
Figura 6 - Esquema geral da maturação dos flavivírus............................................................. 26
Figura 7 - Diagrama esquemático do genoma do vírus Mayaro e de suas proteínas formadas
pelo processo de tradução. ........................................................................................................ 29
Figura 8 - Tapete celular confluente de células VERO E6....................................................... 38
Figura 9 - Fluxograma para o teste de Citotoxicidade das amostras pelo ensaio de viabilidade
do MTT. .................................................................................................................................... 41
Figura 10 - Esquema para avaliação da potencial atividade antiviral pelo método de redução
de placas de lise – (Pré-Tratamento). ....................................................................................... 42
Figura 11 - Avaliação do Potencial Antiviral pelo Método de Redução de Placas de Lise -
Pós-tratamento .......................................................................................................................... 43
Figura 12. Esquema representativo para a Avaliação do potencial virucida das amostras frente
ao HSV-1. ................................................................................................................................. 44
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação em subfamílias dos membros da família Herpesviridae que
apresentam importância clínica para o Homem........................................................................ 15
Tabela 2. Designações adotadas para os extratos de Fusaea longifolia (Aubl.) Saff; Xylopia
benthamii R.E. Fr.; Guatteria punctata (Aubl.) R.A. Howard; Duguetia sp. e Xylopia cf.
frutescens. ................................................................................................................................. 37
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ABREVIAÇÕES
ACV – Aciclovir HSV-2 – Herpes simples virus tipo 2
ACV – MP – Aciclovir monofosfatado HSVE – Encefalite induzida por Herpes simples virus
ACV-TP – Aciclovir trifosfatado ICPo – Proteína Celular Infectada
ARN – Necrose de retina IFI-16 – Proteína induzível de interferon-16
ATB – Antibiótico e antifúngico IS- Índice de seletividade
CC50 – Concentração citotóxica 50 IST’s – Infecções sexualmente transmissíveis
CE50 – Concentração Eficiente 50 L-15 – Meio Leibovitz
CMC – Carboximetilcelulose LAT – Transcrito associado a latência
CMV – Citometagalovirus MTT – sal metiltetrazólio
CNMT – Herbário Centro-Norte-Mato-Grossense
NF-κB – Fator nuclear κB
DNA – Ácido desoxirribonucleico Npcv – numero de placas do controle viral
DNApol – Polimerase do ácido
desoxirribonucleico Npmt – número de placas do material teste
dOcc – Densidade óptica do controle
celular OMS – Organização Mundial da Saúde
dOmt – Densidade óptica do material teste PBS – Tampão fosfato salino estéril
EBV – Epstein-bar virus PCR – Reação em cadeia da Polimerase
FDA- Food and Drug’s Administration PDI – Índice de polidispersão
gD – Glicoproteína D PML – Proteína promielocítica leucêmica
HCV – vírus da Hepatite C RNA – Ácido ribonucleico
HHV-6 – Herpes vírus humano tipo 6 SFB – Soro fetal bonivo
HHV-7 – Herpes vírus humano tipo 7 TK – Timidina Quinase
HHV-8 – Herpes vírus humano tipo 8 UFP – Unidades formadoras de placas
HIV – Vírus da Imunodeficiência humana VZV – Varicela-zoster virus
HSK – Ceratite Estromal herpética ζ- potencial zeta
HSV-1 – Herpes simplex virus tipo 1
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 13 1.1. VÍRUS HERPÉTICOS .................................................................................................. 15
1.1.1. FAMÍLIA Herpeviridae ......................................................................................... 15
1.1.2. HERPES SIMPLEX VIRUS -1 (HSV-1): ASPECTOS BIOLÓGICOS E ESTRUTURAIS ................................................................................................................... 15
1.1.3. α-HERPESVIRUS: CICLO DE REPLICAÇÃO VIRAL ...................................... 18 1.1.4. PATOGÊNESE E SINTOMATOLOGIA ................................................................. 20 1.1.5. MORBIDADE E MORTABILADE .......................................................................... 20
1.1.6. AGRAVOS E COINFECÇÕES: CORRELAÇÃO HSV-HIV .................................. 21 1.1.7. TERAPIA ANTI-HERPÉTICA ................................................................................. 22
1.2. DENGUE VÍRUS .......................................................................................................... 24 1.3. VÍRUS MAYARO......................................................................................................... 27 1.4. PRODUTOS NATURAIS COMO FONTES DE NOVOS COMPOSTOS BIOATIVOS
30 1.4.1. PRODUTOS NATURAIS E NOVOS ATIVOS ANTIVIRAIS ............................... 30
1.4.2. FAMILIA ANNONACEAE ...................................................................................... 32 2. OBJETIVO ....................................................................................................................... 35 2.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 35
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO ............................................................................................. 35 3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 36
3.1. LOCAL DA PESQUISA ............................................................................................... 36 3.2. AMOSTRAS.................................................................................................................. 36 3.3. MATERIAL VEGETAL ............................................................................................... 36
3.3.1. COLETA E IDENTIFICAÇÃO ................................................................................ 36 3.3.2. PREPARO DOS EXTRATOS................................................................................... 37
3.4. ENSAIOS ANTIVIRAIS............................................................................................... 38 3.4.1. PREPARO DAS SOLUÇÕES ESTOQUES ............................................................. 38 3.4.2. CÉLULAS.................................................................................................................. 38
3.4.3. VÍRUS E PREPARO DOS ESTOQUES VIRAIS .................................................... 38 3.4.4. TITULAÇÃO VIRAL................................................................................................ 39
3.4.6. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DAS AMOSTRAS PELO ENSAIO DE VIABILIDADE DO MTT (SAL TETRAZÓLIO) ................................................................... 40 3.5. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL ........................................................... 42
3.5.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL PELO MÉTODO DE REDUÇÃO DE PLACAS DE LISE (PRÉ-TRATAMENTO) ..................................................................... 42
3.5.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL PELO MÉTODO DE REDUÇÃO DE PLACAS DE LISE (PÓS-TRATAMENTO) ..................................................................... 43 3.5.3. ATIVIDADE VIRUCIDA ......................................................................................... 44
3.6. AVALIAÇÃO CROMATOGRÁFICA POR UPLC-MS/MS E IDENTIFICAÇÃO DE FLAVONOIDES PRESENTES NO EXTRATO RAE E NA FRAÇÃO F-5. ........................ 45
3.7. DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS NANOESTRUTURADOS ......................... 45 3.7.1. SUSPENSÃO DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS DE NÚCLEO LIPÍDICO 45 3.7.2. LIPOSSOMAS........................................................................................................... 46
3.7.3. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS .................................................................................................................. 46
12
3.7.4. DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DA PARTÍCULA POR DIFRATOMETRIA
DE LASER ............................................................................................................................... 46 3.7.5. DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DA PARTÍCULA POR ESPECTROSCOPIA
DE CORRELAÇÃO DE FÓTONS .......................................................................................... 47 3.7.6. ANÁLISE DO PH E POTENCIAL ZETA (ζ) .......................................................... 47 3.7.7. ESTABILIDADE FÍSICO-QUÍMICA DAS FORMULAÇÕES .............................. 47
13
1. INTRODUÇÃO
A resistência a medicamentos tais como, antibióticos e antivirais é considerada um sério
problema de Saúde Pública. A busca por novos compostos bioativos de fontes naturais, como
plantas, bactérias, fungos e, até mesmo animais, que possam substituir os medicamentos disponíveis
na atualidade, tornam-se alternativas promissoras para contornar este problema (MEDJELDI et al.,
2018).
Esse problema é ainda maior quando se trata doenças desprovidas de terapias especificas, tais
como a dengue e a febre mayaro, que seguem protocolos terapêuticos meramente paliativos
(CHEN, TANG., 2016; LAVAL et al., 2016) ou para doenças cujo tratamento disponível não é mais
eficaz, em virtude da existência de cepas resistentes ao medicamento, como acontece com o Herpes
Simplex Virus e sua resistência ao aciclovir (BENEKRI et al., 2018).
Os vírus herpéticos são considerados patógenos de grande importância clínica, pois são
capazes de estabelecer um amplo espectro de infecções no homem. Dentre estes, o Herpes simplex
Virus tipos 1 e 2 (HSV-1 e o HSV-2) são os mais expressivos (DEETHAE et al., 2018). Infecções
por estes vírus são altamente prevalentes em todo o mundo; são considerados dois dos patógenos
sexualmente transmissíveis de maior importância, pois aumentam a predisposição para aquisição do
Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). O HSV-1 normalmente está associado à infecções
orofaciais, entretanto, existem relatos descritos para infecções genitais desencadeadas por este
sorotipo, enquanto que o HSV-2 é considerado exclusivamente sexual (BHATTA et al., 2017).
O espectro clínico das manifestações podem variar, desta forma os pacientes infectados
podem apresentar desde formas brandas, caracterizadas por lesões localizadas, até formas mais
severas como complicações neurológicas decorrentes de encefalites herpéticas que comprometem
áreas cerebrais associadas ao comportamento e a cognição (RAMAKRISHNA et al., 2017).
Normalmente, o curso clínico da doença é facilmente controlado utilizando os protocolos
terapêuticos disponíveis. No entanto, esta situação se agrava quando o paciente em questão
apresenta uma condição de imunodeficiência aliada a infecção por uma cepa resistente aos
medicamentos atuais (ROLLENHAGEM et al., 2014; OKONKO; COOKEY, 2015).
Os vírus mayaro (MAYV) e dengue (DENV), inseridos na famílias Togaviridae e
Flaviviridae, respectivamente, são responsáveis por doenças febris, normalmente brandas, que
podem apresentar complicações clínicas severas, tais como as neurológicas (DUFFYET et al, 2009;
GOEIJENBIER et al., 2016; ESPOSITO; DA-FONSECA, 2017; ACOSTA-AMPUDIA et al.,
2018). Estas doenças são desprovidas de terapias medicamentosas direcionadas ao vírus, desta
forma, o tratamento aplicado é apenas de suporte (CHEN, TANG., 2016; LAVAL et al., 2016).
14
A utilização de produtos naturais para finalidades medicinais de tratamento, cura e
prevenção de doenças, é uma das práticas medicinais mais antigas da humanidade, que nos dias de
hoje continuam sendo utilizadas (OWEN et al., 2017). A rica biodiversidade faz do Brasil um país
privilegiado, apresentando mais de 56.000 espécies de plantas que corresponde aproximadamente a
19% da flora mundial. Muitas dessas espécies ainda não tiveram seu potencial farmacológico
explorado, tornando a flora uma importante ferramenta na busca por novos ativos que possam ser
utilizados como fármacos ou como protótipos para a síntese de novos fármacos (GIULIETTI et al.,
2005; BARREIRO; BOLZANI, 2009; YEUNG, HEINRICH, ATANASOV, 2018).
O interesse pelos produtos naturais continua aumentando, visto que estes configuram-se
como fontes inesgotáveis de compostos como, alcaloides, flavonoides, cumarinas, terpenos,
antraquinonas, acetogeninas, esteroides, saponinas, glicosídeos cardioativos, dentre outros. Estes
compostos apresentam amplo espectro de atividades biológicas, dentre elas antibacteriana, antiviral,
antifúngica, anti-inflamatória, antineoplásica, tripanomicida e antiplasmódica (MEDJELDI et al.,
2018).
Fármacos antivirais obtidos a partir de fontes naturais podem atuar em diversas etapas da
replicação viral, desde adsorção na célula hospedeira até na etapa de liberação de novas partículas
virais. A triagem antiviral de extratos de plantas ou de fontes animais tem fornecido resultados
promissores que justificam a pesquisa de novos compostos com potencial atividade antiviral a partir
de tais fontes (TEIXEIRA et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2017).
A resistência demonstrada por micro-organismos frente aos medicamentos disponíveis na
atualidade tornou-se motivo de alarde para a saúde pública e é considerada um sério problema
mundial. Por este motivo a pesquisa objetivando a identificação de novos compostos com
propriedades terapêuticas vêm crescendo exaustivamente, principalmente pesquisas com produtos
naturais, visto que estes apresentam uma vasta composição de compostos biologicamente ativos,
dentre eles compostos fenólicos, tais como flavonoides, que são metabólitos secundários
normalmente associados a atividade antiviral de produtos naturais (OZÇELIK, KARTAL, ORHAN,
2010). Sendo assim, este trabalho objetivou avaliar a potencial atividade antiviral de extratos
obtidos a partir das folhas e dos ramos das espécies: Fusaea longifolia (Aubl.) Saff., Guatteria
punctata (Aubl.) R.A.Howard., Xylopia benthamii R.E.Fr., Duguetia sp., bem como as folhas,
ramos finos e frutos de Xylopia (cf) frutescens Aubl. contra o Herpes Simplex virus tipo 1 (HSV-
1), vírus da dengue sorotipo 1 (DENV-1) e vírus Mayaro (MAYV), além de avaliar o
comportamento dos extratos promissores ao serem incorporados a diferentes sistemas
nanoestrutururados.
15
1.1. VÍRUS HERPÉTICOS
1.1.1. FAMÍLIA Herpeviridae
Existem mais de 100 espécies de vírus herpéticos, alocados dentro da família Herpeviridae,
até então descritos (ROIZMAN et al., 2007), destes, oito apresentam importância médica para o
homem em virtude do amplo espectro de manifestações clínicas; são eles: Herpes Simplex Virus -1
(HSV-1); Herpes Simplex virus - 2 (HSV-2); Varicela-zoster virus (VZV); Citomegalovírus
(CMV); Herpesvírus humano – 6 (HHV-6) e 7 (HHV-7); Epstein-bar vírus (EBV) e Herpesvírus
humano – 8 (HHV-8).
Estes vírus apresentam genoma DNA e são subdivididos em três subfamílias de acordo com
propriedades biológicas e padrões moleculares em: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e
Gammaherpesvirinae como representado na Tabela 1.
Tabela 1 - Classificação em subfamílias dos membros da família Herpesviridae que apresentam importância clínica para o Homem.
Alphaherpesvirinae Betaherpesvirinae Gammaherpesvirinae
HSV-1 CMV EBV HSV-2 HHV-6 HHV-8
VZV HHV-7 Fonte: International Committee on Taxonomy of Viruses - 2018 (com adaptações)
Os Alphaherpesvirinae (α-Herpesvírus) são agrupados nesta subfamília por apresentarem
características comuns, visto que apresentam ciclo de replicação curto, crescimento rápido em
sistemas de cultura e latência primária, porém não exclusiva, em gânglios sensoriais (THELLMAN,
2017), diferente dos Betaherpesvirinae (β-Herpesvírus) que apresentam ciclo de replicação longo
associados a crescimento lento em sistemas de cultura. Além disso, os β-Herpesvírus são indutores
de citomegalia e sua latência ocorre normalmente em glândulas excretoras, principalmente renais
(KONDO et al., 2003).
Já os Gamaherpesvirinae (γ-Hespervírus) são agrupados em uma terceira subfamília por
apresentarem latência em células do sistema imunológico, especificamente linfócitos B. As
infecções por α-Herpesvírus são as mais recorrentes e assumem maior importância clínica daquelas
causadas pelos demais herpesvírus. São vírus que apresentam tropismo por células de origem
ectodérmica, tais como células da pele, mucosa e dos olhos (CHIARELLI; RAU; SCOTEGAGNA,
2008).
1.1.2. HERPES SIMPLEX VIRUS -1 (HSV-1): ASPECTOS BIOLÓGICOS E
ESTRUTURAIS
A estrutura básica deste vírus (Figura 1 e Figura 2) é composta por quatro elementos
fundamentais: o “núcleo” composto por um genoma de DNA e por proteínas de ligação ao DNA.
Este genoma viral é cercado por uma estrutura icosaédrica: o capsídeo. Apresentam ainda o
16
envelope o qual é constituído por uma camada externa derivada da membrana do hospedeiro que
apresenta glicoproteínas virais únicas. Entre o envelope e o capsídeo, observa-se o tegumento
(MIRANDA-SAKSENA et al., 2018) composto por proteínas fundamentais para a replicação do
genoma viral bem como auxiliam na montagem do novo vírion (DIEFENBACH et al., 2015).
Figura 1 - Estrutura básica representativa do vírus Herpes Simplex Virus – 1 (HSV-1).
Fonte: GOGINENI et al., 2015 com adaptações
Figura 2 - Estrutura básica em 3D do vírus Herpes simplex virus. (A) Vírion completo apresentando
a camada pleomórfica de proteínas tegumentares que envolvem o capsídeo do HSV-1. (B) Capsídeo viral.
Fonte: ROCHAT; HECKSEL; CHIU, 2014. com adaptações.
Os HSV (1 e 2) são constituídos por genoma de DNA com aproximadamente 152.250 a
154.750 pares de bases (dependendo do tipo de HSV) e 90 unidades de transcrição que codificam
74 proteínas virais (DAI;CALIGLURI, 2018) dentre elas as proteínas do capsídeo VP5, VP19c,
VP23 e VP26 e as proteínas tegumentares pUL17, pUL25 e pUL36 (DAI; ZHOU, 2018). Estes
vírus são alphaherpesvírus neurotrópicos (BELLO-MORALES et al., 2018), alocados na família
17
Herpesviridae, são geneticamente distintos, porém colineares e partilham aproximadamente 83% de
homologia genômica (LEVIN; WEINBERG; SCHMID, 2017).
O HSV-1 é constituído por um genoma de DNA de dupla fita. Existem várias proteínas que
são essenciais para sua propagação, dentre elas a proteína US11, glicoproteína D (gD) e complexo
modulador de fusão gH/gL. A proteína US11 é expressa nos estágios finais de infecção e tem papel
fundamental para driblar o sistema imunológico do hospedeiro, permitindo que as proteínas virais
continuem sendo traduzidas durante os últimos estágios da replicação viral. US11 forma um
complexo trimérico com PACT e PKR bloqueando as alterações conformacionais na PKR, inibindo
sua ativação. Assim, o US11 inibe a ativação da PKR via interação direta em um gene independente
do RNA ou via RNA-dependente para permitir a replicação de HSV (DZANANOVIC,
MCKENNA; PATEL., 2018). A glicoproteína D de ligação ao receptor (gD), o complexo
modulador de fusão gH / gL e o efetor de fusão gB são essenciais para a entrada do vírion (BELLO-
MORALES et al., 2018).
O HSV-1 e o HSV-2, assim como os demais vírus de DNA, transcrevem e replicam seus
genomas utilizando toda a maquinaria celular em prol de sua replicação, porém, este processo
intracelular pode ser influenciado por diversos fatores celulares. Para que não haja esta
interferência, estes vírus induzem a expressão da proteína celular infectada (ICP0), esta proteína
promove a degradação de fatores que interfeririam durante o processo de replicação viral, tais como
Proteína Promielocítica Leucêmica (PML), Sp100, ATRX e Proteína induzível de Interferon – 16
(IFI16) (MERKI; ORZALLI; KNIPE, 2018).
A maturação e a saída da partícula viral pode ser dividida, didaticamente, em quatro etapas:
(1) Montagem do capsídeo e empacotamento do DNA no núcleo; (2) envolvimento primário do
envelope nuclear; (3) tegumentação e envolvimento secundário no citoplasma e (4) exocitose de
partículas virais na membrana plasmática ou transmissão célula-célula via junções celulares.
As expressões gênicas de HSV-1 e HSV-2 são inibidas durante a fase de latência, e os vírus
podem escapar do sistema imunológico através da produção de um fragmento de RNA conhecido
como LAT (Latency Associated Transcript) que permanece associado ao material genético de
células nervosas durante o estado de latência (DEETHAE et al., 2018). O promotor LAT é
considerado o único produto gênico viral que é altamente detectável durante a latência viral
(KAWAMURA et al., 2018) sendo fundamental para bloquear a apoptose de células infectadas,
garantindo que o vírus permaneça intacto (WATSON et al., 2018).
Os α-herpesvírus apresentam uma característica essencial durante a infecção primária
relacionada à latência em neurônios sensoriais, com potencial de reativação em locais recorrentes
(LEVIN; WEINBERG; SCHMID, 2017). Durante a reativação, as partículas virais do HSV podem
retornar a pele e mucosa causando lesões semelhantes àquelas observadas na primo-infecção, assim
18
estabelecendo quadros clínicos conhecidos como herpes genital recorrente ou herpes oral
recorrente. O curso clínico das lesões em casos recorrentes é mais curto quando comparado com as
lesões iniciais e costumam ser menos dolorosas (LEVIN; WEINBERG; SCHMID, 2017).
1.1.3. α-HERPESVIRUS: CICLO DE REPLICAÇÃO VIRAL
O ciclo de replicação viral (Figura 3) inicia-se pela (1) adsorção das partículas víricas à
superfície celular. Esta adesão é mediada pela interação de uma série de glicoproteínas virais com
proteoglicanos presentes na membrana plasmática da célula alvo. As glicoproteínas virais
envolvidas no processo de adsorção podem diferir de acordo com o vírus. A adesão do HSV-1 e do
HSV-2 é mediada pela glicoproteína C e pela glicoproteína B (SPEAR; LONGNECKER, 2003).
Figura 3 - Ciclo de replicação viral do Herpes simplex vírus - fusão, entrada, desnudamento,
nucleação, replicação, montagem e saída de novas partículas virais.
A infecção pelo vírus começa com a entrada na célula que envolve a fusão do envelope viral com a membrana
plasmática do hospedeiro, no entanto a entrada do vírus pode ocorrer por mecanismos de endo citose (I), levando à
liberação do capsídeo no citoplasma da célula infectada (II). O caps ídeo é então transportado retrogradamente ao núcleo
através dos microtúbulos. O genoma viral é liberado no núcleo (III). A transcrição de genes virais e a replicação do
genoma ocorrem no núcleo, bem como a formação do procapsídeo e a encapsidação do DNA (IV). Os capsídeos saem
do núcleo por um mecanismo de envolvimento primário e de desempacotamento (V). Os capsídeos são então
transportados anterogradamente ao ponto de montagem do virion (VI). Os vírions são então liberados da célula pela
fusão das vesículas celulares com a membrana plasmática (VIII). Fonte: MORDEHAI; HAGEN; GRUNEWALD,
2014., com adaptações.
Após a adsorção, as partículas virais precisam atingir o interior das células. Esta etapa é
conhecida como (2) fusão do invólucro viral com a membrana celular e é mediada por múltiplos
receptores de superfície. A capacidade de interagir com mais de um tipo de receptor tornam o
tropismo viral pouco específico e conferem ao vírus a habilidade de infectar mais de um tipo celular
(SPEAR; LONGNECKER, 2003). Como resultado, o nucleocapsídeo entra no citoplasma da célula
19
e mediante a interiorização, o nucleocapsídeo inicia a (3) etapa de desnudamento e migração. A
perda do invólucro libera a capsídeo e este migra por todo o citoplasma celular em direção ao
núcleo. O genoma viral é liberado da capsídeo e entra no núcleo através de poros nucleares
Algumas proteínas virais tegumentares, tais como VP16 e UL41, também migram para o núcleo e lá
promovem alteração do microambiente favorecendo a eficiência da replicação do genoma viral. A
proteína tegumentar VP16 regula a (4) transcrição dos genes virais, enquanto que UL41 deprime a
expressão de proteínas do hospedeiro.
A etapa de (4) transcrição do genoma viral pode ser dividida em três fases que dependem
dos genes α, β e γ. Os genes α detêm as proteínas reguladoras de transcrição de genes β e γ, desta
forma, as α-proteínas são determinantes para a replicação do genoma viral. Os genes β estão
relacionados com a expressão de enzimas necessárias para a replicação do genoma viral, desta
forma, são os principais alvos para terapias antivirais, enquanto os genes γ alocam informações
necessárias para a codificação de mRNA que codificam proteínas estruturais importantes durante a
montagem da nova partícula viral (MA et al., 2016).
Uma vez sintetizado o genoma viral, ocorre a (5) encapsidação. Nesta etapa a pró-cápside
adquire as proteínas tegumentares e sai do núcleo por gemulação. No citoplasma, esta estrutura se
associa com as proteínas virais, tais como VP16, oriundas do complexo de Golgi e adquiri um novo
invólucro. Finalmente, esta membrana vesicular se funde com a membrana citoplasmática e o vírion
definitivo abandona a célula por gemulação. A replicação deste vírus é bastante rápida, ocorre
dentro de 15 horas para o HSV, e letal para a célula hospedeira, levando-a a morte por lise celular.
Os α-herpesvírus são considerados dermoneurotrópicos ou seja, apresentam uma
característica comum de estabelecer latência em gânglios sensoriais, principalmente nos gânglios do
nervo trigêmeo (BAUER et al., 2017), para posterior reativação. Durante a latência, estes vírus
permanecem silenciados no interior de células nervosas sem provocar qualquer tipo de
sintomatologia. As células hospedeiras infectadas com os α-herpesvírus, durante a latência, não se
dividem. Desta forma, a infecção torna-se crônica.
Alguns fatores são considerados propícios para a reativação das infecções permitindo que as
áreas inervadas pelos neurônios sensoriais possam desenvolver novamente as lesões
(KAWAMURA et al., 2018), tais como fatores ambientais ligados à exposição à radiação UV e a
ambientes extremos de calor ou frio, fatores intrínsecos do hospedeiro, tais como fadiga, estresse
psicológico, imunodeficiência, e fatores externos ligados ao uso de medicamentos, como
corticoterapia.
20
1.1.4. PATOGÊNESE E SINTOMATOLOGIA
A primo-infecção pelo HSV-1 é caracterizada por gengivite, estomatite e faringite, enquanto
as reativações são responsáveis por lesões labiais e ulcerações intraorais, boca ou pele facial externa
(ZUPIN et al., 2018). Estas lesões são bolhosas e, tipicamente, desconfortáveis (XU; CHE; LI,
2016). Infecções oculares com deterioração da córnea e risco de cegueira também podem ser
observadas (CABREIRA-ÁGUA et al., 2018; LEE; GHIASI, 2018).
Após a infecção, iniciam-se formações de máculas e pápulas e o ciclo de replicação do vírus
torna-se intenso. As lesões iniciais evoluem para pústulas e rompem após 2 dias, expondo, desta
forma, as lesões à fatores externos. Após 96 horas, as lesões já apresentam-se com crostas (LEVIN;
WEINBERG; SCHMID., 2016). Durante a fase lítica, o vírus expressa uma grande quantidade de
proteínas virais necessárias para a manutenção da infecção e para a montagem de novas partículas
víricas (DAI; CALIGLURI, 2018).
As infecções primárias apresentam um curso clínico que pode variar entre 10 e 17 dias.
Febre, mal-estar e cefaleia podem estar presentes na fase inicial (LEVIN; WEINBERG; SCHMID,
2016). Além das infecções na pele, este vírus apresenta a capacidade de infectar as terminações
nervosas sensoriais que inervam a pele e a mucosa, onde permanecem em estágio latente, podendo,
posteriormente, estabelecer novas infecções viabilizadas por sua reativação (LEVIN; WEINBERG;
SCHMID, 2016).
Normalmente, as reativações da infecção por este vírus é assintomática em
aproximadamente 65% dos casos reportados e a frequência desses episódios declina com o tempo
(SCHIFFER et al., 2011). A transmissão deste vírus, tanto em pacientes imunocompetentes ou
imunocomprometidos, se dá pelo contato, seja pelo beijo ou por relações sexuais, sendo os
indivíduos assintomáticos, os mais significativos para a transmissão (LEVIN; WEINBERG;
SCHMID, 2016). Infecções no sistema nervoso central (Encefalites Herpéticas) e infecções
neonatais também compõem o espectro de manifestações clínicas destes vírus.
1.1.5. MORBIDADE E MORTABILADE
A existência de lesões mucocutâneas atípicas e crônicas aliadas a reações inflamatórias que
acometam o aparelho respiratório, principalmente traqueia e esôfago, podem complicar os cuidados
com o paciente. O comprometimento de múltiplos órgãos é raro para as infecções por HSV, assim
como encefalites (LEVIN; WEINBERG; SCHMID, 2017). Infecções que acometem o sistema
nervoso, como a encefalite, são consideradas as formas mais graves da doença e normalmente são
associadas etiologicamente ao HSV-1. A taxa de mortalidade entre os pacientes com crises
encefálicas, quando não tratados farmacologicamente, excede 70% e aqueles que sobrevivem
21
desenvolvem sequelas. A recuperação da função neurológica é possível, porém, apenas 2,5% dos
pacientes tratados atingem tal feito. Além do cérebro, os HSV podem acometer todas as áreas
anatômicas do sistema nervoso, causando diversas manifestações clínicas, como meningites,
mielites e radiculites (DA-FONSECA, 1999). Além de facilitar a coinfecção pelo vírus HIV, a
infecção pelo HSV-1 também aumenta a probabilidade de contrair o vírus Linfotrópico de Células T
(HTLV) (MA et al., 2016).
1.1.6. AGRAVOS E COINFECÇÕES: CORRELAÇÃO HSV-HIV
A soroprevalência mundial das infecções pelos Herpes Simplex vírus (HSV) não sofreu
alterações significativas (QUENELLE et al., 2018) e na atualidade ainda são considerados
mundialmente endêmicos (KALOGEROPOULOS et al., 2017), acometendo 98% da população
mundial (FATAHZADEH; SCHWARZ, 2007). Por mais que a prevalência seja alta, a maioria dos
casos são assintomáticos e os quadros clínicos são verificados em apenas um terço dos indivíduos
(SALEH; BERMUDEZ, 2018).
De todas as infecções de origem viral em todo o mundo, as infecções herpéticas causadas
pelo HSV-1 e pelo HSV-2 são as mais comuns. Essas infeções são consideradas infecções
sexualmente transmissíveis (IST’s) e são consideradas motivos de alarde, na atualidade, em virtude
de sua correlação com a aquisição oportunista do HIV (OKONKO; COOKEY, 2015). Neste
contexto, infecções herpéticas são consideradas potentes co-fatores de transmissão do HIV
(ROLLENHAGEN et al., 2014; CHARPENTIER et al., 2013).
Infecções herpéticas são consideradas altamente prevalentes em, praticamente, todo o
mundo. A prevalência destas infecções chega a ultrapassar índices de 90% em algumas situações.
Existem fortes correlações associando o HSV ao HIV. Os vírus HSV-1 e HSV-2 podem ser
transmitidos sexualmente e, normalmente, são encontrados na condição de coinfecção em pacientes
soropositivos para o HIV (QIU et al., 2012). O vírus da Imunodeficiência Humana é considerado
um dos mais preocupantes no âmbito da saúde pública; sua progressão e gravidade dependem da
condição imunológica de cada indivíduo (YAMSUWAN et al., 2012).
Nos últimos anos, a epidemia global de infecções pelo Herpes Simplex Virus tipos 1 e 2 e
pelo HIV-1 demostraram uma intensa e complexa correlação entre estes patógenos, apresentando,
desta forma, sinergia (BARNABAS; CELUM, 2012). Existem duas explicações plausíveis que
justificam a correlação HSV-HIV. Inicialmente, as lesões induzidas pelo HSV funcionam como
porta de entrada para o HIV, facilitando a infecção por este vírus. A segunda explicação é embasada
nos padrões fisiopatológicos da infecção genital pelo HSV. A resposta inflamatória desenvolvida
contra o HSV aumenta excessivamente o recrutamento de linfócitos T ativados no local das
22
ulcerações, contribuindo, desta forma, com o aumento da suscetibilidade ao HIV-1, já que este
apresenta tropismo por componentes do sistema imunológico, mais especificamente linfócitos T
(KEET et al., 1990). Também existem evidências indicando que as infecções herpéticas aumentam
o recrutamento excessivo de macrófagos e induzem a replicação do HIV nestas células em nível
genital (BALZARINI et al., 2013).
1.1.7. TERAPIA ANTI-HERPÉTICA
Os ativos antivirais disponíveis na atualidade compõem medicamentos que interferem
diretamente nos estágios da replicação viral, tais como adsorção da partícula viral à superfície
celular, penetração da partícula e replicação do DNA-viral para montagem de novas partículas
víricas. Existem uma infinidade de vírus e todos partilham de similares mecanismos de replicação,
desta forma, identificar e conhecer as características de cada agente infeccioso é fundamental para a
escolha de um esquema farmacoterapêutico (BATISTA, 2011).
O diagnóstico etiológico é fundamental para otimizar a terapia antiviral em pacientes com
infecções pelo HSV, principalmente naqueles que apresentam lesões cutâneas inexplicáveis e que
não respondem ao tratamento, uma vez que existem cepas virais dotadas de resistência a
medicamentos atualmente disponíveis (LEVIN; WEINBERG; SCHMID, 2016). Este problema se
intensifica quando o paciente apresenta imunossupressão, o qual apresenta maior chance para
adquirir e desenvolver infecções por cepas resistentes aos antivirais disponíveis, tais como o
aciclovir (ACV) (LEVIN; WEINBERG; SCHMID, 2017). Esta resistência pode ser avaliada por
testes fenotípicos, na presença ou ausência de um agente terapêutico (LEVIN; WEINBERG;
SCHMID, 2016).
Nucleosídeos modificados, tais como Aciclovir, Valaciclovir e Famciclovir compõem uma
das principais classes de medicamentos antivirais disponíveis na atualidade. São considerados
ativos chaves empregados contra vírus de DNA. Entretanto, esses compostos sofrem limitações de
uso, principalmente no que tange a resistência de certas cepas virais (BESSIERES et al., 2018;
LEVIN; WEINBERG; SCHMID, 2017). Também conhecido como [9-(2-hidroxietoximetil)
guanina], o Aciclovir (Figura 4) tornou-se o padrão farmacoterapêutico adotado para o tratamento
das infecções pelo HSV. É comercializado como cápsulas (200 mg), comprimidos (200, 400 e 800
mg) e pomada (GANDHI; JANA; SEN, 2014).
23
Figura 4 - Estrutura química do Aciclovir (2-amino-9-(2-hidroxietoximetil)-3H-purin-6-ona).
Fonte: KARIM-NEZHAD et al., 2018.
Este análogo de nucleosídeo é fosforilado pela enzima Timidina Quinase (TK) do vírus para
formar o ACV-MP. Quinases celulares convertem a forma monofosfatada do ACV à ACV-TP
(BENZEKRI et al., 2018). O ACV-TP interrompe a atividade da DNA-pol, pois ao ser incorporado
no DNA viral induz a finalização precoce da fase de alongamento do DNA refletindo em inibição
direta da replicação do genoma viral (INAGAKI et al., 2018). Em outras palavras, o aciclovir e
outros análogos à ele relacionados funcionam inibindo duas enzimas fundamentais, a DNA-pol e a
Helicase, ambas específicas do vírus resultando em redução da replicação viral (BYRNE;
GANTTT; COOMBS, 2018). A grande problemática envolvendo este mecanismo anti-herpético
correlaciona-se ao desenvolvimento de mutantes que expressam resistência a partir da mutação
pontual no gene codificador para TK viral (gene UL23) (BENEKRI et al., 2018).
A duração do tratamento pode variar, pois é determinado pela gravidade da doença e por
respostas individuais do paciente frente ao medicamento de escolha, já que a forma farmacêutica
influencia na resposta terapêutica. Além disso, o local das lesões também auxiliam na tomada de
decisões acerca do medicamento e da forma farmacêutica que será utilizada no tratamento. As
medicações tópicas são eficientes para reduzir o tempo de excreção do vírus e aceleram a formação
de crostas em áreas lesionas, no entanto, quando comparada com as orais e endovenosas, mostra-se
menos eficiente. Alternativas como tratamento a laser também podem ser empregadas. A terapia
laser (LT) empregando ondas no comprimento infravermelho é capaz de reduzir a recorrência de
HSV-1 e a duração das feridas herpéticas (ZUPIN et al., 2018).
Além dos fármacos que bloqueiam diretamente a ação da TK viral, a terapêutica ainda
dispõem de algumas alternativas, tais como o Foscarnet, o Cidofovir e o Pritelivir, este último ainda
em teste. O Foscarnet e cidofovir, são utilizados para o tratamento de infecções por
Citomegalovírus (CMV). Estes, ao contrário de outros agentes antivirais utilizados contra o
herpesvírus, têm mecanismos de ação envolvendo inibição enzimática, mais especificamente para a
DNA polimerase viral, enquanto o pretelivir é um inibidor não nucleosídico que bloqueia a função
da helicase viral (QUENELLE et al., 2018). Estirpes resistentes são consideradas agentes potenciais
24
para pneumonia, encefalite herpética, esofagite e infecções mucocutâneas em
imunocomprometidos.
1.2. DENGUE VÍRUS
1.3.
Os vírus da dengue (DENV) são arbovírus transmitidos pelos mosquitos Aedes aegypti e
Aedes albopictus, agrupados em cinco sorotipos virais DENV-1 DENV-2, DENV-3, DENV-4 e
DENV-5 (NORAZHARUDDIN; LAI, 2018) pertencentes ao gênero Flaviviridae, no qual estão
inseridos inúmeros vírus de importância clínica para o homem tais como o vírus do oeste do Nilo e
Zika (AHMAD; POH, 2019). Esta família comporta uma série de vírus considerados patógenos
emergentes e reemergentes (BORBA et al., 2019)
Estes vírus são capazes de desenvolver doenças com perfis clínicos distintos, caracterizadas
pelo acesso febril brando ou intenso, sendo clinicamente diferenciadas como febre do dengue ou
febre hemorrágica do dengue (NORAZHARUDDIN; LAI, 2018). São endêmicos, em regiões
tropicais e subtropicais, encontrados em mais de 125 países espalhados pela Ásia, Pacífico
Ocidental, Mediterrâneo Oriental, África e Américas (AHMAD; POH, 2019; CHEN et al., 2019), o
que contribuiu para o aumento da incidência em taxas alarmante por todo o mundo com uma
estimativa de 50 a 390 milhões de infecções a cada ano (NORAZHARUDDIN; LAI, 2018) e de
25.000 mortes por ano (AHMAD; POH, 2019).
A imunidade conferida após uma infecção é vitalícia para o sorotipo envolvido, entretanto
há um período temporário de imunidade cruzada (NORAZHARUDDIN; LAI, 2018). Mesmo que
haja imunidade cruzada temporária, infecções subsequentes com outros sorotipos destes vírus
apresentam maior probabilidade para desencadearem respostas clínicas mias graves (LUO et al.,
2019). A febre do dengue é uma doença autolimitada caracterizada apenas pela febre, no entanto,
alguns pacientes podem desenvolver a forma mais grave da doença, a febre hemorrágica da dengue,
que é fatal (AWAIDY; KHAMIS, 2019)
1.3.1. ASPECTOS ESTRUTURAIS E CICLO DE REPLICAÇÃO
Todos os flavivirus, incluindo o DENV, apresentam o mesmo perfil estrutural (AHMAD;
POH, 2019). O DENV é um vírus com cápside de estrutura icosaédrica, genoma de RNA sentido
positivo e envelope herdado da membrana celular do hospedeiro durante a saída do vírion
potencialmente infectante (Figura 5). Apresentam três proteínas estruturais, a proteína da cápside
(proteína C), a proteína da membrana (proteína M) e a proteína do envelope (proteína E). A proteína
25
C é responsável por encapsular o genoma viral formando o nucleocapsídeo, que é envolto por uma
bicamada lipídica derivada da célula hospedeira. No espaço existente entre o nucleocapsídeo e a
membrana existe uma série de cópias das proteínas M e E (AHMAD; POH, 2019;
NORAZHARUDDIN; LAI, 2018).
Figura 5 - Estrutura do genoma do flavivírus e da partícula viral.
(a) Representa genoma dos flavivírus que consiste em apenas um quadro de leitura que codifica
uma única poliproteína viral que será clivada para a produção de três proteínas estruturais e pelo
menos sete proteínas não estruturais e (b) representa a estrutura geral dos vírions. Fonte: Plevka et
al., 2014 (com adaptações).
As regiões conhecidas como zonas não traduzidas (5’ -UTR e a 3’ -UTR) por mais que não
participem ativamente da produção da poliproteína viral carregam consigo informações
fundamentais para regulação do processo de transcrição. A zona 5’ -UTR é responsável por aturar
como promotor para síntese de RNA e além disso medeia a ciclização de interações RNA-RNA de
longo alcance. Já a região 3’ -UTR controla as respostas antivirais do hospedeiro (BORBA et al.,
2019; KHETARPAL; KHANNA, 2016).
O processo de penetração da partícula viral se dá a partir do processo de endocitose mediada
por receptores de fusão que permitem alterações na conformação da superfície do flavivírus
mediada por dissociação do dímero protéico E, que interage com receptores de fusão DII. O dímero
26
protéico E, forma um trímero com a proteína DII, o que permite a liberação do genoma viral no
citoplasma da célula infectada (MORRONE; LOK, 2019). Por tratar-se de um vírus de RNA, o
genoma do vírus atua como um RNA mensageiro, carregando consigo a informação para a
produção de uma única poliproteína. Este mRNA é traduzido no retículo endoplasmático rugoso e
então processado em três proteínas estruturais (C, prM e E), sendo a prM a precursora da proteína
de membrana ativada no complexo de golgi (Figura 6), e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) (NORAZHARUDDIN; LAI, 2018).
Figura 6 - Esquema geral da maturação dos flavivírus.
Partículas imaturas se formam a partir do brotamento do reticulo endoplasmático. Os vírions são
expostos a um ambiente com pH 5,5 à medida que são transportados do RE para o complexo de
Golgi. A alteração do pH induz a ruptura da estrutura imatura levando à formação do centro de
nucleação da estrutura madura. A estrutura madura se espalha gradualmente pela superfície da
partícula. Uma vez que a cápside esteja na conformação madura, a protease celular furina pode
clivar a proteína prM em fragmentos pr e M. Quando as partículas são libertadas os fragmentos pr
dissociam-se das partículas, deixando vírions infecciosos maduros. Fonte: Plevka et al., 2014 (com
adaptações).
Os vírus imaturos são formados a partir do brotamento do complexo RNA-capsídeo, na
membrana do retículo endoplasmático, revestidos com prM e proteínas E. A prM necessita de
clivagem para ativação em proteína M, que compõem o vírion maduro, e esta ativação é mediada
pela furina no complexo de golgi. Quanto as partículas virais são exocitadas para o ambiente
extracelular, o pH neutro do ambiente viabiliza a finalização do processo de maturação do vírion
(MORRONE; LOK, 2019).
27
1.3.2. TRATAMENTO E DIAGNÓSTICO
Apesar do amplo desenvolvimento da indústria farmacêutica, a prática clínica ainda é
desprovida de terapias antivirais específicos contra os vírus da dengue (BRASIL, 2015; EYERET et
al, 2016; WHO, 2016). Os tratamentos atuais seguem protocolos terapêuticos meramente paliativos
(CHEN, TANG., 2016; LAVAL et al., 2016) adotados apenas para o manejo sintomatológico. Estes
protocolos são fundamentados no uso de antitérmicos e analgésicos, como o acetaminofeno e a
dipirona (CHEN, TANG., 2016; LAVAL et al., 2016; ZAMMARCHI et al., 2015; CHOWDHURY,
et al. 2012) bem como antieméticos. Neste contexto, o desenvolvimento de terapias para o dengue
é, portanto, urgentemente necessário (MORRONE; LOK, 2019).
O diagnóstico da infecção por DENV não pode ser fundamentado apenas em perfis clínicos,
visto que uma série de indivíduos pode ser assintomática ou apresentar sinais e sintomas
semelhantes aos de outras doenças, desta forma o diagnóstico necessita ser realizado com base em
técnicas sorológicas que permitem a distinção do sorotipo associado à infecção. DENV-2 e DENV-
3, por exemplo, normalmente são associados a doenças mais graves, enquanto o DENV-4 é
responsável por doenças mais brandas (TSAI et al., 2019).
Apesar do grande número de compostos candidatos que tem apresentado atividade antiviral
contra os vírus DENV em ensaios in vitro, poucos são avaliados em ensaios clínicos (CHAN; OOI,
2015; TEIXEIRA et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2017). Por mais que exista uma vacina
recombinada e atenuada (Dengvaxia®) do DENV aprovada para a prevenção da doença causada
pelos quatro sorotipos do vírus, há necessidade de se avaliar o real impacto de seu uso, pois, a
eficácia efetiva de uma vacina para o DENV depende da proteção imunológica induzida para os
quatro sorotipos virais (HOLBROOK, 2017).
1.4. VÍRUS MAYARO
O vírus mayaro (MAYV) é um arbovírus pertencente a família Togaviridae, é um vírus com
genoma de RNA de polaridade positiva com genoma de aproximadamente 12 kb inserido no
complexo antigênico da vírus da floresta Semliki (KANTOR et al., 2019). Seu vírion é envelopado
e esférico, sendo a sua transmissão mediada por artrópodes, o que os tornam, assim como os demais
arbovírus que acometem o homem, vírus zoonóticos (YUE et al., 2019). Além desse vírus, outros
545 vírus capazes de desenvolver doença no homem também são considerados arbovírus e estão
distribuídos nos gêneros Alphavirus, Orthobunyavirus, vírusovirus, Nairovirus, Flavivirus,
Vesicuvirus, Efemerovirus, Thogotovirus, Asfavirus, Coltivirus e Orbivirus (COSTA et al., 2018).
28
A transmissão é mediada principalmente por mosquitos do gênero Haemagogus (KANTOR
et al., 2019; ESPOSITO, DA-FONSECA., 2017) e normalmente é associada a exposição
ocupacional (MAIA et al., 2019). Embora espécies de Haemagogus sp. sejam consideradas as
principais no que tange a competência vetorial para a transmissão do MAYV, já foram descritos
estudos que comprovam que outros mosquitos também exibem a competência vetorial para o
MAYV, tais como espécies do gênero Aedes sp. (MAVIAN et al., 2017).
A incubação do vírus pode variar de 3 até 11 dias de acordo com a condição imunológica do
hospedeiro e a alta viremia pode ser observada 5 dias após a infecção (ESPOSITO, DA-
FONSECA., 2017). As infecções pelo MAYV apresentam sintomatologias inespecíficas e
autolimitadas caracterizadas por febre, mialgia, dores de cabeça erupções cutâneas (YUE et al.,
2019; MAVIAN et al., 2017), no entanto, existem relatos que descrevem os sintomas como
persistentes até um ano após a infecção, sintomas semelhantes aos observados nas infecções pelo
vírus chikungunya (KANTOR et al.,2019; ESPOSITO, DA-FONSECA., 2017). Normalmente, nos
casos duradouros, a artralgia torna-se intensa e prolongada (MAVIAN et al.,2017).
1.4.1. ASPECTOS ESTRUTURAIS
O vírus mayaro (MAYV), inserido na família Togaviridae, é um vírus com genoma de RNA
de polaridade positiva com genoma de aproximadamente 12 kb que carrega consigo informações
necessárias para a codificação de quatro proteínas não estruturais: nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4, além de
cinco proteínas estruturais: C, E3, E2, 6k e E1 (Figura 7).
O genoma desse vírus apresenta duas regiões abertas de leitura, denominadas Open reading
frames (ORF ). A ORF-5’ codifica as proteínas não estruturais, enquanto a ORF-3’ codifica aquelas
proteínas associadas à estrutura do vírion (ACOSTA-AMPUDIA et al., 2018).
29
Figura 7 - Diagrama esquemático do genoma do vírus Mayaro e de suas proteínas formadas pelo
processo de tradução
Fonte: Acosta-ampudia et al., 2019 com adaptações.
As proteínas associadas à estrutura do vírion são produzidas após a tradução do transcrito no
sentido negativo, uma característica comum da família Togaviridae. Após a produção das proteínas,
o genoma viral é complexado a proteína C e às proteínas do envelope através do aparelho de Golgi.
O vírion imaturo migra para a membrana e adquire seu envelope, liberando novas partículas
infecciosas (ESPOSITO, DA-FONSECA., 2017).
1.4.2. TRATAMENTO E DIAGNÓSTICO
Assim como a maioria dos das infecções por arbovírus, o diagnóstico da infecção pelo
MAYV é eficiente durante a fase aguda da doença, pois neste período a viremia encontra-se
elevada e o isolamento do vírus pelas técnicas de isolamento viral ou a identificação do RNA viral
por técnicas moleculares tornam-se possíveis. Esse vírus apresenta dois genótipos até então
descritos, que divergem geneticamente em 17% em nível de nucleotídeos (KANTOR et al., 2019) o
D e o L, sendo este último o genótipo isolado no Brasil.
Testes sorológicos convencionais, tais como fixação do completo e inibição da
hemaglutinina, não são indicados para diagnóstico, visto que gerar falso-positivos em função da
reatividade cruzada existente entre os vírus do complexo da floresta Semliki (Bebaru, Chikungunya,
Mayaro, Getah, Floresta Semliki, Ross River, O'nyong-nyong e Uma) (ESPOSITO, DA-
30
FONSECA., 2017), o que dificulta o diagnóstico por testes dependentes de anticorpos (ACOSTA-
AMPUDIA et al., 2018).
Assim como relatado para as infecções pelos vírus da dengue (DENV 1-4), as infecções pelo
MAYV são desprovidas de terapias medicamentosas específicas para o controle da replicação viral,
bem como não há substâncias capazes de conferir efeito profilático e nem de agir diretamente sobre
a partícula viral. O manejo farmacoterapêutico adotado é direcionado aos sintomas (ACOSTA-
AMPUDIA et al., 2018) e é fundamentado no uso de anti-inflamatórios não esteróides, analgésicos
e antitérmicos com o intuito de controlar a inflamação, dor e a febre, respectivamente.
Pacientes que desenvolvem artralgia podem receber a cloroquina, uma droga antimalárica,
como alternativa de tratamento para redução das dores articulares (ACOSTA-AMPUDIA et al.,
2018). Vacinas ainda não são comercializadas para controlar esta infecção, no entanto existem duas
em fase pré-clínica, a primeira com a partícula viral inativa e a segunda com o vírus atenuado
(ESPOSITO, DA-FONSECA., 2017).
1.5. PRODUTOS NATURAIS COMO FONTES DE NOVOS COMPOSTOS
BIOATIVOS
1.5.1. PRODUTOS NATURAIS E NOVOS ATIVOS ANTIVIRAIS
Pesquisas objetivando a análise do potencial antiviral de produtos naturais, tais com plantas,
organismos marinhos, metabólitos de bactérias e fungos são fundamentais para a identificação de
novos compostos biologicamente ativos (QIN et al., 2018) que possam ser utilizados diretamente na
terapêutica ou como protótipos, para a indústria farmacêutica, no desenvolvimento tecnológico de
novos medicamentos (BUTLER; ROBERTSON; COOPER, 2014; KARAGOZ et al., 2018). Ao
longo da história, os produtos naturais vêm sendo utilizados para diversas funções, tendo na
finalidade terapêutica, seu uso mais expressivo (JI et al., 2018).
Os produtos naturais são considerados fontes promissoras e inesgotáveis de compostos
estruturalmente complexos, dotados de um vasto potencial farmacológico (XIE et al., 2015),
conhecidos como metabólitos secundários, que podem apresentar atividade antioxidante,
antimicrobiana, antitumoral, antiviral, entre outras (QIN et al., 2018).
Nesta situação, estudos de bioprospecção tornam-se fundamentais e de grande importância
econômica em virtude do seu potencial de mercado (XIE et al., 2015), visto que proporcionam
adequações de manejo e conservação da biodiversidade brasileira com consequente
desenvolvimento e fortalecimento tecnológico da indústria (OUYANG et al., 2014), principalmente
31
a farmacêutica, que teve seu desenvolvimento enraizado na química de produtos naturais
(KARAGOZ et al., 2018).
Os metabólitos secundários são compostos orgânicos de baixo peso molecular classificados
dentro de diferentes grupos de substâncias, tais como flavonoides, taninos, terpenos, cumarinas,
antraquinonas, alcaloides, acetogeninas e saponinas (LI; ZHANG; LIU, 2018).
Os avanços das metodologias analíticas, principalmente as instrumentais, aliadas a
farmacologia experimental colaboraram para o desenvolvimento de métodos que permitiram o
aumento expressivo dos estudos com produtos naturais, cuja consequência refletiu diretamente no
aumento de novos fármacos, derivadas de produtos naturais, no mercado farmacêutico. De todo o
arsenal terapêutico disponível na atualidade, 64% foram desenvolvidos a partir de fontes naturais
(NEWMAN; CRAGG, 2016), destes, 6% são comercializados como fitoterápicos, 31% como
semissintéticos e, aproximadamente 23% são sintéticos cuja estrutura foi desenvolvida baseando-se
em um composto orgânico natural como modelo protótipo (DEMAIN, 2009). A ziconotida,
derivada de uma substância conhecida como ω-conotoxina, um potente fármaco analgésico, a
trabectedina, antitumoral isolado de Ecteinascidia turbinata, potentes antitumorais como vincristina
e vimblastina (Catharanthus roseus) são exemplos de medicamentos de origens naturais e que estão
disponíveis no mercado farmacêutico.
Bactérias, fungos, parasitas e vírus, agentes de doenças infecciosas, estão em constante
evolução. Este processo evolutivo é natural e garante a seleção de cepas resistentes aos
medicamentos disponíveis, visto que mutações pontuais fornecem mecanismos de escape para
driblar a farmacodinâmica dos ativos essenciais utilizados no manejo terapêutico. Este fato torna a
busca por novos agentes terapêuticos, dentre eles os antivirais, necessária (WRIGHT, 2014). Novos
ativos antivirais estão sendo desenvolvidos a partir de produtos naturais, como é o caso do
alisporivir-82 e do composto SCY-635, derivados da ciclosporina A81, um peptídeo fúngico
avaliado pela Novartis para o tratamento de infecções pelo vírus da Hepatite C (HCV) (BUTLER;
ROBERTSON; COOPER, 2014).
Os compostos de fontes naturais vegetais, principalmente flavonoides e derivados
peptídicos, apresentam propriedades antivirais satisfatórias (DEMAIN, 2009). Estes metabólitos são
capazes de interferir em uma ou mais etapas do ciclo de replicação viral ou são capazes de exercer
função virucida direta, desta forma, estes compostos tornam-se atrativos na busca e identificação de
novos candidatos para o uso clínico. O mecanismo antiviral associado aos produtos naturais, de
modo geral, é fundamentado em seu potencial antioxidante, anti-inflamatório, associados a inibição
da adsorção e da penetração da partícula viral, bloqueio da síntese viral de DNA ou RNA, inibição
da síntese de proteínas virais, bem como inibição da montagem de novos virions (LAMY et al.,
2015).
32
Inúmeros estudos têm relatado a atividade antiviral de extratos vegetais contra vírus que
infectam o homem, tais como a atividade anti-herpética (HSV-1) para extratos de Callistemon
rigidus (CAO et al., 2017); ação frente ao influenza-vírus de extratos de Embelia ribes Burm. f.
(HOSSAN et al., 2018); contra o Vírus da Hepatite C de extratos de Nymphaea alba (REHMAN et
al., 2018); contra o vírus da dengue (DENV-2) de extratos de Taraxacum officinale e Urtica dioica
(FLORES-OCELOTI et al., 2018); contra o vírus da febre mayaro (MAYV) de extratos de Salacia
crassifolia (Celastraceae) (FERREIRA et al., 2018).
1.5.2. FAMILIA ANNONACEAE
A família Annonaceae constitui um grupo da ordem Magnoliales, composto por cerca de
130 gêneros e 2300 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais (MOGHADAMTOUSI
et al., 2015; QUEIROZ et al., 2014; MOREIRA et al., 2013; ENDRESS; ARMOSTRONG, 2011;
XU et al., 2010), condições que são encontradas no Brasil (FONTES et al., 2013). As espécies que
compõem esta família, apresentam padrões anatômicos comuns, o que dificulta sua identificação
(FECHINE et al., 2002) e são consideradas de importância econômica por conta de seus frutos
comestíveis e de seus potenciais medicinais (MOURA et al., 2016).
Estas espécies apresentam, fitoquimicamente, compostos bioativos potentes, tais como
alcaloides, flavonoides, terpenos e acetogeninas (HERNANDEZ; DE LA CRUZ-CHACON;
GONZALEZ-ESQUINCA, 2012; TAVARES et al., 2005), sendo este último grupo de metabólitos,
considerado uma classe especial e restrita às espécies da família Annonaceae, o que as tornam
únicas dentre as outras famílias que constituem a ordem Magnoliales
(AMINIMOGHADAMFAROUJ; NEMATOLLAHI; WIART, 2011).
A maioria das atividades biológicas observadas para as espécies desta família são
correlacionadas diretamente aos flavonoides, alcaloides, principalmente os aporfínicos, e as
acetogeninas. Essas classes de metabólitos secundários são comumente encontrados em todos os
gêneros que compõem esta família (DA SILVA et al., 2009; CAROLLO et al., 2006). As
acetogeninas são consideradas metabólitos únicos, derivados de ácidos graxos de cadeia longa e
biogenicamente oriundos da via dos policetídeos (SUN et al., 2014).
De todos os gêneros e espécies descritos para esta família, 27 gêneros e, aproximadamente,
290 espécies são encontradas no Brasil, principalmente no bioma Cerrado. Muitas das espécies
fornecem frutas exóticas de grande importância econômica (FORMAGIO et al., 2015; COELHO et
al., 2011). O potencial biológico destas espécies vêm sendo exaustivamente avaliados em diversos
modelos experimentais e os resultados descrevem inúmeras atividades biológicas, tais como a
atividade antimicrobiana (COSTA et al., 2010) , antioxidante (PINHO et al., 2014), antitumoral
(FONTES et al., 2013; COELHO et al., 2011; MATOS et al., 2006), anticolinesterásica, anti-
33
inflamatória, hipoglicemiante (FORMAGIO et al., 2015) antimalárica (FISCHER et al., 2004), anti-
herpética (BUZZINI et al., 2008), antiespasmódica (CORREIA et al., 2015), dentre outras. Além
das atividades potencialmente terapêuticas, a literatura descreve o potencial inseticida de extratos
obtidos a partir de espécies desta família, como a Duguetia lanceolata, o que aumenta seu valor
econômico (ALVES et al., 2016).
Por mais que hajam estudos para avaliar o potencial biológico de espécies de Annonaceae,
grande parte destes apresentam como objeto de pesquisa exemplares pertencentes aos gêneros
Annona, Duguetia, Xylopia, Guatteria e Fusaea.
O gênero Duguetia é composto por cerca de 93 espécies até então descritas. Destas, 89
espécies são distribuídas em regiões tropicais e neotropicais e quatro são encontradas na África. O
gênero Duguetia é considerado o terceiro maior gênero da família Annonaceae, ficando atrás apenas
dos gêneros Guatteria e Annona, que são compostos por 265 e 150 espécies, respectivamente. As
espécies pertencentes a este gênero são empregadas, popularmente, no tratamento de crises
reumáticas e cólicas renais (SILVA; VIEIRA; CHEN-CHEN, 2013).
Estudos descrevem a atividade antitumoral, tripanocida, antiplasmodial e antiprotozoárias
para espécie deste gênero, tais como para a Duguetia furfuracea (A. St.-Hil.) Benth. & Hook. f.
(SILVA; VIEIRA; CHEN-CHEN, 2013; DA SILVA et al., 2009). Para esta espécie, conhecida
popularmente como “araticum-seco”, também já foram descritas atividade anti-inflamatória e
antirreumática (DOS SANTOS et al., 2018). O potencial antimalárico também já foi descrito para a
espécie Duguetia hadrantha (MUHAMMAD et al., 2001), o antitumoral para Duguetia
gardneriana (RODRIGUES et al., 2015), e o potencial antimicrobiano para Duguetia lanceolata,
Duguetia gardneriana e Duguetia moricandiana (SOUSA et al., 2012).
O gênero Xylopia é composto por espécies encontradas na América do Sul, América Central,
África e em algumas regiões da Ásia (FERRAZ et al., 2013). É considerado um dos maiores
gêneros da família Annonaceae, com cerca de 150 espécies dentre árvores de 5 a 30 m de altura, até
arbustos de 1,5 a 3 m de altura (YAPI et al., 2014; MOREIRA et al., 2013), sendo algumas de
importância nutricional e medicinal (MOURA et al., 2016).
A maioria das espécies deste gênero apresentam atividades biológicas associadas aos seus
óleos essenciais, visto que são consideradas plantas aromáticas (BAKARNGA-VIA et al., 2014). As
espécies deste gênero são utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenças intestinais,
halitose (FERRAZ et al., 2013), infecções da pele, infertilidade (BAKARNGA-VIA et al., 2014;
CHOUMESSI et al., 2012) e doenças que acometem o sistema nervoso (BINEY et al., 2016).
Propriedades antitumorais já foram descritas para a espécie Xylopia langsdorffiana
(MOURA et al., 2016) e para a espécie Xylopia laevigata (QUINTANS et al., 2013), efeito
34
analgésico (WOODE et al., 2012), antioxidante (MOUKETE et al., 2015), antimalárico
(BAKARNGA-VIA et al., 2014), antidiabético (MOHAMMED et al., 2016), bem como o
antimicrobiano (WOUATSA; MISRA; KUMAR, 2014; FLEISCHER et al., 2008) já foram descrito
para extratos da espécie Xylopia aethiopica. Atividade antimicrobiana também já foi descrita para a
espécie Xylopia parviflora (WOGUEM et al., 2014). Propriedades antitumorais foram descritas para
Xylopia frutescens (FERRAZ et al., 2013), bem como seu efeito antiespasmódico e antiviral frente
ao vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) (DE SOUZA et al., 2015). O efeito leishmanicida e
imunomodulador foi descrito para Xylopia discreta (LOPEZ; CUCA; DELGADO, 2009).
O gênero Guatteria é considerado o maior e mais antigo gênero da família Annonaceae
(FONTES et al., 2013; MONTENEGRO et al., 2003). Espécies desta família estão distribuídas
através de regiões neotropicais que vão desde o sudeste mexicano até o sul do Brasil. No Brasil,
foram descritas 15 espécies endêmicas deste gênero. Cerca de 385 espécies deste gênero podem ser
encontradas no domínio amazônico (COSTA et al., 2016). São popularmente conhecidas como
“Envireiras” em virtude de suas cascas extremamente rígidas (COSTA et al., 2018).
Óleos essenciais obtidos das folhas de Guatteria pogonopus e de Guatteria friesiana
apresentam atividade antumoral (FONTES et al., 2013; BRITTO et al., 2012). Guatteria hispida, G.
blepharophylla, G. boliviana e G. friesiana apresentam potentes efeitos citotóxicos (FONTES et al.,
2013). Alcaloides aporfínicos de Guatteria amplifolia e Guatteria dumetorum demonstraram
potente atividade contra espécies do gênero Leishmania (CORREIA et al., 2006; MONTENEGRO
et al., 2003). Extratos alcaloídicos de Guatteria latifolia também demonstraram potente ação contra
espécies deste parasito (FERREIRA et al., 2017). A atividade antiparasitária também foi verificada
para a espécie Guatteria recurvisepala, que demonstrou atividade antiplasmodial contra o
Plasmodium falciparum (MUNIGUNTI et al., 2011). Extratos de Guatteria gaumeri também
mostraram-se eficientes no tratamento da hipercolesterolemia familiar (CHOMORRO et al., 1998).
Propriedades antimicrobianas já foram descritas para extratos de Guatteria hispida (COSTA et al.,
2010).
Pouco se sabe sobre o gênero Fusaea. Quatro espécies deste gênero, dentre elas a espécie
Fusaea longifolia Aubl. Saff são encontradas na região amazônica e destas já foram isolados e
identificados alcaloides aporfínicos e oxaaporfínicos, sendo fuseína e a liriodenina encontradas em
maior concentração (TAVARES et al., 2005). Esta espécie é popularmente conhecida como
araticum, ata ou envira e pode ser encontrada na região Centro-Oeste e Norte do Brasil.
Como anteriormente descrito, a família Annonaceae é composta por uma série de espécies
potencialmente ativas, algumas nem sequer tiveram seus potenciais biológicos avaliados. Neste
contexto, o estudo do potencial bioativo frente aos vírus Herpes simplex vírus, Mayaro e Dengue de
35
extratos de diferentes espécies desta família representam passos iniciais para posterior isolamento e
identificação de compostos potencialmente ativos.
2. OBJETIVO
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a potencial atividade antiviral de extratos obtidos a partir de folhas e ramos de
diferentes espécies de Annonaceae frente ao Herpes Simplex Virus (cepa KOS), vírus da Dengue
sorotipo 1 (DENV-1) e vírus Mayaro (MAYV).
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO
➢ Realizar a triagem inicial dos extratos das folhas e dos ramos de Fusaea longifolia Aubl.
Saff., Guatteria punctata (Aubl.) R.A.Howard., Xylopia benthamii R.E.Fr., Xylopia cf.
frutescens Aubl. e Duguetia sp. para determinar quais foram promissores na inibição da
replicação viral dos vírus HSV-1, DENV-1 e MAYV, empregando o ensaio
colorimétrico com o sal de tetrazólio (MTT), através do tratamento simultâneo.
➢ Avaliar a citotoxicidade para àqueles extratos considerados ativos na triagem, através do
ensaio colorimétrico com o sal de tetrazólio (MTT).
➢ Confirmar a potencial atividade antiviral do extrato acetato de etila dos ramos de F.
longifolia, considerado promissor na triagem inicial, frente ao vírus HSV-1, através do
ensaio de redução de placas de lise.
➢ Realizar a triagem inicial das frações obtidas cromatograficamente, a partir do extrato
acetato de etila dos ramos de F. longifolia, frente ao vírus HSV-1 através do ensaio
colorimétrico com o sal de tetrazólio (MTT) através do tratamento simultâneo.
➢ Determinar se o extrato acetato de etila dos ramos de F. longifolia apresenta efeitos
diretos sobre a partícula viral do HSV-1 (atividade virucida) e se confere efeito
profilático.
➢ Incorporar o extrato acetato de etila dos ramos de F. longifolia à diferentes sistemas
nanoestruturados e avaliar a eficiência destes sistemas frente ao vírus HSV-1 através do
ensaio colorimétrico com o sal de tetrazólio (MTT).
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. LOCAL DA PESQUISA
As avaliações propostas para este trabalho foram experimentalmente executadas na
Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Campus Universitário de Sinop (CUS - Sinop) no
Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular (LIBM), no Laboratório de Farmacognosia, no
Laboratório de Pesquisas Integradas em Química (LIPeq) e na Embrapa Agrossilvipastoril (Sinop –
MT).
3.2. AMOSTRAS
Os testes desenvolvidos neste trabalho foram feitos com extratos hexânicos, acetato de etila
e metanólicos das folhas e dos ramos finos de Fusaea longifolia (Aubl.) Saff; Xylopia benthamii
R.E. Fr.; Guatteria punctata (Aubl.) R.A. Howard; Duguetia sp. e com extratos hexânicos, acetato
de etila e metanólicos das folhas, ramos finos e frutos de Xylopia cf. frutescens.
3.3. MATERIAL VEGETAL
3.3.1. COLETA E IDENTIFICAÇÃO
As folhas, ramos finos de F. longifolia; X. benthamii; G. punctata; Duguetia sp, bem como
as folhas, ramos finos e flores de X. cf. frutescens, foram coletados na região de transição dos
biomas Cerrado-Amazônia, na região Médio-Norte do Estado de Mato Grosso. A identificação
botânica das plantas foi realizada pela pesquisadora Msc. Aline Fernandes Pontes, do Instituto de
Ciências Naturais, Humanas e Sociais (ICNHS), da UFMT/CUS/Sinop-MT. O material florífero e
herborizado foi depositado, na forma de exsicatas, no Herbário Centro-Norte-Mato-Grossense
(CNMT) da UFMT/CUS/Sinop-MT sob o número de tombo 6118 (F. longifolia), 4482 (G.
punctata); 6120 (X. benthamii). As demais espécies ainda estão em processo de confirmação
botânica.
A coleta das espécies vegetais foi devidamente cadastrada no Sistema Nacional de gestão do
Patrimônio genético e do Conhecimento Tradicional associado (SISGEN) no registro A9AD5FF
sob responsabilidade da Professora Dra. Carla Regina Andrighetti – UFMT/SINOP.
37
3.3.2. PREPARO DOS EXTRATOS
Foram preparados extratos hexânicos, acetato de etila e metanólicos das folhas e dos ramos
finos de F. longifolia; X. benthamii; G. punctata; Duguetia sp. e extratos hexânicos, acetato de etila
e metanólicos das folhas, ramos finos e frutos de Xylopia cf. frutescens empregando a maceração,
como metodologia extrativa, utilizando como solvente extrator o hexano e, sucessivamente, acetato
de etila e depois metanol. Os extratos brutos foram obtidos após evaporação do solvente sob pressão
reduzida 40º C. Todas as tabelas e gráficos apresentados neste trabalho seguiram as designações
descritas na tabela 2. Tabel a 2. Des ignações adotadas para os extratos de Fusaea longi folia ( Aubl .) Saf f ( Annonaceae); Xylopi a benthamii R.E. Fr. (Annonaceae) ; G uatt eria punct at a (Aubl.) R.A. Howard (Annonaceae) ; Duguet ia sp. ( Annonaceae) e Xylopia cf. frutescens .
Tabela 2 - Designações adotadas para os extratos de Fusaea longifolia (Aubl.) Saff;
Xylopia benthamii R.E. Fr.; Guatteria punctata (Aubl.) R.A. Howard; Duguetia sp. e
Xylopia cf. frutescens.
Solvente extrator
F. longifolia
Fo
lha
s FH n-Hexano
FAE Acetato de Etila
FM Metanol
Ra
mo
s
RH n-Hexano
RAE Acetato de Etila
RM Metanol
X. benthamii Fo
lha
s XFH n-Hexano
XbFAE Acetato de Etila
XbFM Metanol
Ra
mo
s XbRH n-Hexano
XbRAE Acetato de Etila
XbRM Metanol
X. cf. frutescens
Fo
lha
s XfFH n-Hexano
XfFAE Acetato de Etila
XfFM Metanol
Ra
mo
s XfRH n-Hexano
XfRAE Acetato de Etila
XfRM Metanol
Fru
tos
XfFrH n-Hexano
XfFrAE Acetato de Etila
XfFrM Metanol
G. punctata Fo
lha
s GFH n-Hexano
GFAE Acetato de Etila
GFM Metanol
Ra
mo
s GRH n-Hexano
GRAE Acetato de Etila
GRM Metanol
Duguetia sp.
Fo
lha
s DFH n-Hexano
DFAE Acetato de Etila
DFM Metanol
Ra
mo
s DRH n-Hexano
DRAE Acetato de Etila
DRM Metanol
38
3.4. ENSAIOS ANTIVIRAIS
3.4.1. PREPARO DAS SOLUÇÕES ESTOQUES
Os extratos foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 10 mg.mL-1 e
armazenados a -20°C até o uso. Para os ensaios, as amostras foram novamente diluídas no momento
do uso em meio de cultura Leibovitz (L-15) + 1% de antibiótico e antifúngico (ATB). A
concentração final de DMSO não excedeu 1% do volume final.
3.4.2. CÉLULAS
Células VERO-E6 (Figura 5) foram cultivadas em meio Leibovitz (L-15) suplementado com
5% de soro fetal bovino (SFB), 100 U/mL penicillina G, 100 µg/mL estreptomicina e 25 µg/mL
anfotericina B e incubadas, em estufa, a 37ºC.
Figura 8 - Tapete celular confluente de células VERO E6 cultivadas em meio L-15 enriquecido
com 5% de SFB e 1% de ATB visualizado em microscopia óptica – aumento de 40X.
Fonte: Arquivos pessoais.
3.4.3. VÍRUS E PREPARO DOS ESTOQUES VIRAIS
Para o presente estudo, foi utilizado o vírus Herpes Simplex Virus tipo 1 (HSV-1) cepa
KOS, gentilmente cedido pela Professora Dra. Cláudia Maria de Oliveira Simões do Laboratório de
Virologia Aplicada da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). O DENV-1 e MAYV foram
isolados de amostras clínicas no Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular, Universidade
Federal de Mato Grosso, Sinop, Brasil (Sinop) e foram gentilmente cedidos pela Professora Dra.
Roberta Vieira de Morais Bronzoni.
As suspensões virais foram inoculadas em frascos de cultura de 75 cm2 contendo
monocamadas de células VERO-E6 com 100% de confluência, para o HSV-1, e com
aproximadamente 85 % de confluência para os vírus DENV-1 e MAYV, para obtenção dos
estoques virais. As células VERO-E6 foram cultivadas em meio L-15 + 5% SFB + 1% ATB 24
horas anterior à infecção. O meio de cultura foi aspirado e as monocamadas celulares lavadas três
vezes com tampão fosfato estéril (PBS) (pH 7,2) e infectadas com 150 µL da suspensão viral
39
diluída em 900 µL de L-15+1% ATB. As garrafas de cultura foram incubadas por 1 hora, com
agitação a cada 15 minutos, a 37ºC. Em seguida, adicionou-se 15 mL de meio L-15 + 1% ATB, na
garrafa infectada com o HSV-1, e 15 mL de meio L-15 + 1% ATB + 1% SFB nas garrafas que
foram infectadas com o DENV-1 e com o MAYV. As garrafas foram novamente incubadas por 2
dias para o HSV-1 e por 5 dias para o DENV-1 e MAYV, a 37ºC. Após destruição total das
monocamadas celulares, as garrafas foram congeladas e descongeladas três vezes e, após este
processo, os sobrenadantes foram coletados separadamente em tubos, centrifugados por 5 minutos
(1500 rpm) sob refrigeração (-4ºC), aliquotados em microtubos estéreis (300 µL) e armazenados a -
80 ºC até o uso.
3.4.4. TITULAÇÃO VIRAL
Os títulos das suspensões virais foram determinados pelo método de placas de lise em
células VERO-E6 e expressos em unidades formadoras de placas por mililitros (UFP/mL)
(BURLESON et al. 1992). Suspensões celulares de células VERO-E6, na densidade de 1,8x105
células.mL-1, foram cultivadas em placas de 24 cavidades, em meio L-15 suplementado com 5% de
SFB e 1% de ATB e incubadas a 37ºC. Após confluência, essas células foram infectadas com 400
μL de diluições decimais seriadas dos estoques virais (diluições 10-1 à 10-7) em meio L-15 + 1% de
ATB (três réplicas para cada diluição). As placas foram incubadas durante 1 hora, com agitação
ocasional a cada 15 minutos para que as suspensões virais se dispersassem homogeneamente sob os
tapetes celulares. Após 1 hora, as suspensões foram removidas de cada cavidade e, a cada uma,
foram adicionados 1000 μL de carboximetilcelulose (CMC) 1% para o HSV-1 e 2 % para o DENV-
1 e MAYV, em meio L-15 (2X) suplementados com 1% de ATB. As placas foram incubadas por 3
ou 5 dias, respectivamente para o HSV-1 cepa KOS e para o Mayaro e Dengue. Transcorrido este
tempo, o meio foi retirado e as células, fixadas e coradas com 500 μL de Cristal Violeta por 60
minutos, a temperatura ambiente, em agitador mecânico. O corante, então, foi aspirado das
cavidades e a placa foi colocada para secar a temperatura ambiente. A quantificação foi realizada
através da visualização das placas de lise empregando microscópio invertido e a lupa. Para calcular
o título viral, considerou-se a última diluição a apresentar placas de lise. O título viral foi calculado
através da fórmula:
𝑇𝑣=𝑁𝑝 .1/d .1/v
Onde TV = Título Viral, Np = Número de placas formadas na última diluição que apresentar
placas de lise, d= última diluição viral que apresentar placas e v= volume da diluição viral utilizada
para infectar a monocamada celular.
40
3.4.5. TRIAGEM DO POTENCIAL ANTIVIRAL DAS AMOSTRAS POR
TRATAMENTO SIMULTÂNEO EM MICROPLACAS PELO ENSAIO DE
VIABILIDADE DO MTT (SAL TETRAZÓLIO1).
As células VERO E6 foram tratadas com concentrações decrescentes da amostras e a
viabilidade celular após infecção e tratamento foi determinada pelo ensaio do MTT como
previamente descrito (KARIMI et al., 2017), com breves modificações. Para isso, uma placa de 96
poços foi plaqueada com 100 μL de uma suspensão celular VERO E6 (1,8x105 células/mL) por
cavidade e incubada por 24 horas até confluência. Após este período, diluições seriadas das
amostras foram preparadas em meio L-15 + 1 % de ATB. Para o teste, utilizou-se a multiplicidade
de infecção (MOI) 1,00. O meio foi removido da placa com auxílio de bomba à vácuo e cada poço
recebeu 100 µL do L-15 + amostra e 100 µL da suspensão viral MOI 1. A placa foi incubada por 4
dias para o HSV-1 e por 6 dias para DENV-1 e MAYV e foram monitoradas diariamente.
Transcorrido este tempo o meio foi aspirado cuidadosamente e, cada cavidade, foi tratada com 50
μL de MTT (1 mg/mL). Após a adição do MTT as placas foram incubadas por 4 horas a 37ºC. Após
este tempo, 100 μL de DMSO foram adicionados a cada cavidade e as placas foram agitadas por 10
min em agitador automático e submetidas a avaliação espectrofotométrica a 495ηm. Os valores de
inibição foram expressos com base na seguinte fórmula:
3.4.6. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DAS AMOSTRAS PELO ENSAIO DE
VIABILIDADE DO MTT (SAL TETRAZÓLIO)
As células VERO-E6 foram tratadas com diferentes concentrações dos extratos e a
viabilidade celular, determinada pelo ensaio do MTT como previamente descrito (KARIMI et al.,
2017). As porcentagens de viabilidade celular foram calculadas em relação ao controle celular. Os
valores da concentração de cada extrato capaz de reduzir em 50 % a viabilidade celular em relação
aos controles celulares (CC50) foram calculados por análise de regressão. Para isso, seguiu-se as
etapas descritas na Figura 6.
1 - O método colorimétrico com o Sal tetrazólio permite quantificar, espectrofotometricamente, a viabilidade celular,
desta forma, pode ser utilizado como um indicador direto de citotoxicidade. O método é fundamentado na conversão do
sal amarelo tetrazólio à cristais de formazan por células metabolicamente ativas e esta conversão é diretamente
proporcional ao número de células viáveis (DA SILVEIRA, 2016).
41
Figura 9 - Fluxograma para o teste de Citotoxicidade das amostras pelo ensaio de viabilidade do MTT.
As células foram cultivadas em garrafas de cultura (2) até confluência. Com o auxilio de “scrapers” foram removidas e
transferidas para tubo falcon (3 e 4). A concentração de celulas da suspensão celular foi ajustada (4). Após ajuste, 100
µL foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada até confluência (5). O meio foi removido e aos poços foram
adicionados 200 µL das amostras diluídas em meio (6). Quatro dias depois do tratamento, proced eu-se o ensaio
colorimétrico do MTT.
Uma placa de 96 poços foi plaqueada com 100 μL de uma suspensão celular VERO E6
(1,8x105 células/mL) por cavidade A placa foi incubada por 24 horas a 37°C para formação de
monocamadas confluentes (5). Depois de 24 horas, o meio de cultivo foi substituído por 200 μL de
L-15 + 1% de ATB contendo diferentes concentrações do extrato (6). A placa foi incubada por 4
dias a 37°C. O tempo de 6 dias não foi adotado pois os testes de citotoxicidade foram feitos apenas
para as amostras ativas contra o HSV-1. Transcorrido o tempo, o meio foi aspirado cuidadosamente
e, a cada cavidade, adicionou-se 50 μL de MTT (1 mg/mL) (7). Após a adição do MTT a placa foi
incubada por 4 horas a 37ºC. Após este tempo, 100 μL de DMSO foram adicionados a cada
cavidade e a placa, agitada por 10 min em agitador automático. A avaliação foi feita utilizando
espectrofotometria no comprimento de onda de 495 ηm. A absorbância é diretamente proporcional
a viabilidade celular, sendo esta expressa com base em comparações com o controle celular
utilizando a seguinte fórmula:
𝑉(%)= (𝑑𝑂𝑚𝑡/𝑑𝑂𝑐𝑐) 𝑥 100
Onde V(%) = viabilidade celular em percentagem, dOmt= densidade óptica do material
testado e dOcc = densidade óptica do controle celular. Os valores de CC50 foram obtidos por análise
de regressão linear dos percentuais referentes as diferentes concentrações avaliadas.
42
3.5. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIVIRAL
As etapas metodológicas descritas daqui em diante foram aplicadas apenas frente ao HSV-1
em virtude dos resultados obtidos a partir dos estudos de triagem.
3.5.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL PELO MÉTODO DE REDUÇÃO
DE PLACAS DE LISE (PRÉ-TRATAMENTO)
A técnica de pré-tratamento para avaliação do potencial antiviral foi realizada conforme
representado na Figura 7.
Figura 10 - Esquema para avaliação da potencial atividade antiviral pelo método de redução de placas de lise – (Pré-Tratamento).
As células foram cultivadas em garrafas de cultura até confluência. Com o auxílio de “scrapers” foram removidas e
transferidas para tubo falcon. A concentração de células na suspensão foi ajustada e a cada poço, foram adicionados
1000 µL da suspensão celular e a placa foi incubada até confluência. O pré -tratamento foi feito removendo o
sobrenadante dos poços e adicionando nestes 400 µL da amostra de interesse diluída em meio. Após tratamento, o
sobrenadante foi removido e os poços foram infectados. A placa foi incubada após remoção do sobrenadante da
infecção e adição de CMC 1,0 % em meio L-15. Fonte: Autoria própria.
Células VERO E6 (1,8x105 células/mL) foram cultivadas em placas de 24 cavidades em
meio L-15 suplementado com 5% de SFB + 1 % de ATB e então incubadas a 37°C. Após 24 horas,
o meio foi removido por aspiração e a cada cavidade adicionou-se 400 μL de L-15+1% de ATB
contendo diluições dos extratos, levando em consideração CC50 previamente determinada para cada
amostra pelo ensaio de viabilidade celular pelo MTT. As amostras permaneceram em contato com
as monocamadas celulares por três horas a 37ºC. Após este período, o meio foi cuidadosamente
aspirado de cada poço. A infecção dos poços previamente tratados foi feita a partir da adição de 400
μL de meio L-15 + 1% ATB contendo aproximadamente 100 UFP.mL-1 de HSV-1. Células não
43
tratadas com as amostras foram infectadas como controle da infecção (CV). As placas foram
incubadas a 37ºC por 3 dias. Após incubação, o meio foi removido e as células, fixadas e coradas
com 500 μL de Cristal Violeta em temperatura ambiente com agitação por 60 minutos. O corante,
então, foi aspirado das cavidades e a placa foi colocada para secar a temperatura ambiente. A
quantificação foi realizada através da visualização das placas de lise empregando microscópio
invertido e a lupa. A porcentagem de inibição da replicação viral foi calculada empregando a
seguinte fórmula:
%𝑖𝑟𝑣=[1− (𝑁𝑝𝑚𝑡/𝑁𝑝𝑐𝑣)] 𝑥 100
Onde %𝑖𝑟𝑣 = percentagem de inibição da infecção viral, Npmt = Número de placas em
células tratadas com material teste, Npcv = Numero de placas em células infectadas mas não
tratadas.
A partir destes dados foi possível calcular a concentração efetiva a 50% (CE50) para as
amostras avaliadas por análise de regressão linear. A partir dos valores de CC50 e CE50 de cada
amostra foi possível mensurar o índice de seletividade (𝐼𝑆= 𝐶𝐶50/𝐶𝐸50) de cada uma.
3.5.2. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL PELO MÉTODO DE REDUÇÃO
DE PLACAS DE LISE (PÓS-TRATAMENTO)
Células VERO-E6 (1,8x105 células/mL em placas de 24 cavidades) foram infectadas com
400 μL de uma suspensão viral contendo aproximadamente 100 UFP.mL-1 por 1h, com agitação
periódica a cada 15 minutos. Posteriormente, removeu-se a suspensão viral e as monocamadas
celulares foram tratadas com diferentes concentrações dos extratos diluídos em uma solução de
CMC 1% dissolvida em meio L-15 (2X) com 1% de ATB e somente com meio para o controle viral
e celular (Figura 8).
Figura 11 - Avaliação do Potencial Antiviral pelo Método de Redução de Placas de Lise - Pós-tratamento
44
As células foram cultivadas em garrafas de cultura até confluência. Com o auxílio de “scrappers” foram removidas e
transferidas para tubo falcon. A concentração celular da suspensão celular foi ajustada e a cada poço, foram adicionados
1000 µL da suspensão celular e a placa foi incubada até confluência. O sobrenadante foi removido e os po ços foram
infectados. A placa foi incubada após remoção do sobrenadante da infecção e adição das amostras diluídas em CMC 1,0
% em meio L-15. Fonte: Autoria própria.
As células foram incubadas por 3 dias. Após este período, removeu-se o meio e as células
foram fixadas e coradas com 500 μL de Cristal Violeta em temperatura ambiente sob agitação por
60 minutos. O corante, então, foi aspirado das cavidades e a placa foi colocada para secar a
temperatura ambiente. A quantificação foi realizada através da visualização das placas de lise
empregando microscópio invertido e a lupa. A CE50 e o IS foram calculados como descrito
anteriormente.
3.5.3. ATIVIDADE VIRUCIDA
Células VERO-E6 (1,8x105 células.mL-1 em placas de 24 cavidades) foram incubadas a
37°C até confluência. 200 μL da suspensão viral (25-100 UFP) foram misturadas em microtubos de
2000 μL com concentrações iguais e inferiores a CC50 dos materiais avaliados. Como controle viral
foram utilizados suspensões virais tratadas apenas com PBS. Os vírus tratados foram incubados por
15 minutos em banho-maria a 37ºC e então, adicionados às monocamadas celulares. Após adição,
as monocamadas foram incubadas a 37ºC por uma hora com agitação periódica a cada 15 minutos.
O sobrenadante foi removido e 1000 μL de uma solução de CMC em L-15, acrescido de 1% de
ATB foram adicionados aos poços. As células foram incubadas por 3 dias. Após este período,
removeu-se o meio e as placas foram fixadas e coradas com 500 μL de Cristal Violeta durante 1
hora sob agitação mecânica em temperatura ambiente. A CE50 e o IS foram calculados como
descrito anteriormente (Figura 9).
Figura 12. Esquema representativo para a Avaliação do potencial virucida das amostras frente ao
HSV-1.
45
As suspensões virais foram tratadas com diferentes concentrações da amostra de interesse, diluídas em meio L-15, e
utilizadas para a infecção dos poços contendo monocamadas confluentes de células VERO E6. A placa foi incubada
após remoção do sobrenadante da infecção e adição de CMC 1% em meio L-15. Fonte: Autoria própria.
3.6. AVALIAÇÃO CROMATOGRÁFICA POR UPLC-MS/MS E
IDENTIFICAÇÃO DE FLAVONOIDES PRESENTES NO EXTRATO RAE E NA
FRAÇÃO F-5.
A identificação dos flavonoides presentes no extrato RAE e na fração F-5, foi desenvolvida
conforme descrito por Duan e colaboradores com modificações. A caracterização destes flavonoides
foi fundamentada a partir do comparativo de picos do tempo de retenção da amostra em análise com
os padrões externos autênticos preparados em metanol. Utilizou-se como padrões externos:
Amentoflavona, Apigenina, Canferol, Luteolina, Miricetina, Quercetina, Quercetina-3-β-d-
glicosídeo, Rutina e Taxifolina (Sigma-Aldrich). A análise procedeu-se empregando
cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-
MS/MS) em equipamento UPLC Agilent 1290 Infinity (Agilent Technologies, USA). Utilizou-se
Coluna Agilent Eclipse AAA (4.6 x 150 mm, 3.5μm) a 25º C com um volume de injeção de 20 μL.
Fase móvel gradiente com água acidificada com ácido fórmico 0.1 % (m/v) e acetonitrila em
condições 05:95 à 95:05 (H2O: ACN). O tempo de corrida adotado foi de 33 minutos com fluxo de
0.5 mL.min-1. A detecção foi obtida por espectrometria de massas realizada num Agilent 6460
Triple Quad com uma fonte de ionização por eletrospray, utilizando gás nitrogênio, nas seguintes
condições: temperatura do gás de 300º C; fluxo 5 L.min-1; pressão do nebulizador 45 psi;
temperatura do gás da bainha 250º C; fluxo 11 L.min-1; tensão capilar -3500 V e intervalo de
varredura de m/z 120-900 unidades.
3.7. DESENVOLVIMENTO DE SISTEMAS NANOESTRUTURADOS
3.7.1. SUSPENSÃO DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS DE NÚCLEO LIPÍDICO
Para o preparo das suspensões de nanocápsulas de núcleo lipídico foi utilizado o método de
deposição interfacial de polímero pré-formado (JAGER, 2009). As suspensões de nanocápsulas
poliméricas de núcleo lipídico foram obtidas através do preparo de duas soluções distintas:
• Solução 1 (fase orgânica): a primeira solução foi preparada dissolvendo 100 mg do
polímero Poli(ε-caprolactona) ou Eudragit RL®, + 40 mg de Monoestearato de Sorbitano, + 10 mg
da amostra de interesse + 160 mg de triglicerídeos de cadeia média em acetona em banho-maria à
37 ºC.
• Solução 2 (fase aquosa): a segunda solução foi preparada dissolvendo 75 mg do
Polissorbato 80 em água ultrapura, à temperatura ambiente sob agitação.
46
Em seguida, a fase orgânica foi vertida na fase aquosa com o auxílio do funil sob agitação
moderada. Após 10 minutos procedeu-se à evaporação do solvente orgânico em evaporador rotativo
sob pressão reduzida para concentração da suspensão e ajuste do volume final, realizado em balão
volumétrico.
3.7.2. LIPOSSOMAS
Os lipossomas foram desenvolvidos pelo método de evaporação em fase reversa descrito por
Mertins (2005). Foram preparadas a:
• Solução 1 (fase aquosa): preparada a partir da dissolução do extrato de interesse na
concentração de 1 mg.mL-1 e 0,25 % (w/v) de polissorbato 80 em tampão fosfato salino pH
7,4.
• Solução 2 (fase orgânica): preparada a partir da suspensão de 1,2 g de fosfatidilcolina de
soja + 0,06 g de colesterol em 40 mL de clorofórmio.
Uma alíquota da solução aquosa (4 mL) foi vertida na fase orgânica e sonicada por 5
minutos para a obtenção da dispersão de micelas invertidas. Com o auxílio do evaporador rotativo,
removeu-se o solvente orgânico à 25 ºC, obtendo-se assim o organogel. Posteriormente o restante
da solução aquosa (96 mL) foi adicionada mantendo o sistema sob agitação por 30 minutos. As
vesículas foram submetidas a extrusão em membrana 0,22 µm. Além dos lipossomas contendo a
amostra de interesse, também foram desenvolvidos lipossomas-branco (sem extratos), tal como
descrito acima.
3.7.3. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS SUSPENSÕES DE
NANOCÁPSULAS
Os nanossistemas foram caracterizados quanto ao diâmetro médio da nanopartículas, índice
de polidispersão (PDI), potencial zeta (ζ) e pH.
3.7.4. DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DA PARTÍCULA POR DIFRATOMETRIA
DE LASER
As formulações foram avaliadas quanto ao diâmetro médio de esfera equivalente (d4.3) e
distribuição de tamanho de partícula (Span) por difração de laser empregando o equipamento
Mastersizer® 2000 (Malvern Intruments, Reino Unido). As análises foram realizadas a 25 °C a
partir de um pequeno volume da amostra (suficiente para obscuração do aparelho entre 2 e 8) foram
efetuadas em aproximadamente 100 mL de água destilada como meio dispersante.
47
3.7.5. DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DA PARTÍCULA POR ESPECTROSCOPIA
DE CORRELAÇÃO DE FÓTONS
O diâmetro cumulante médio (Z-average) e o índice de polidispersão (PDI), resultantes da
aplicação do método dos cumulantes, foram medidos num ângulo de detecção de 173° (25°C), por
análise de espectroscopia de correlação de fótons (Zetasizer® NanoZS modelo ZEN 3600, Malvern
Intruments, Reino Unido) a 25°C. As nanoestruturas foram diluídas 500 vezes (v:v) em água
ultrapura e filtrada (membrana 0,45 μm) e analisadas através de média de 3 repetições.
3.7.6. ANÁLISE DO PH E POTENCIAL ZETA (ζ)
A determinação do pH foi realizada em potenciômetro (Denver® Instrument VB-10, Nova
Iorque) previamente calibrado com padrões pH 4,0 e 7,0 diretamente nas suspensões coloidais. Os
resultados representarão a média de três determinações e o potencial zeta (ζ) foi determinado após
diluição das nanoestruturas 500 vezes em solução de NaCl 10mM.L-1 previamente filtrada através de
membrana 0,45 μm, sendo as medidas efetuadas em triplicata analisando a amostra pela sua
mobilidade eletroforética.
3.7.7. ESTABILIDADE FÍSICO-QUÍMICA DAS FORMULAÇÕES
Para estudar a estabilidade das formulações foram monitorados diâmetro e pH das
formulações nos tempos 0, 15 e 30 dias (após o preparo).
.
48
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73
ARTIG O
AVALIAÇÃO IN VITRO DA POTENCIAL ATIVIDADE ANTIVIRAL DE EXTRATOS
LIVRES E NANOESTRUTURADOS DE Fusaea longifolia (Aubl.) Saff (ANNONACEAE)
Rafael L. Morales,1 Cristiangela S. Santos,3 Roberta V.M. Bronzoni,1Dênia M.S. Valladão,2
Elton B. Ribeiro,3 Stela R. Ferrarini,3 Anderson Barzotto,2 Rogério C. Bicudo,4 Carla R.
Andrighetti 1*
1Programa de Pós-graduação em Ciências em Saúde – PPGCS – Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop – Av. Alexandre Ferronato, 1200, Sinop-MT, Brasil. 2Programa de Pós-graduação em Ciências Ambientais – PPGCAM - Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop – Av. Alexandre Ferronato, 1200, Sinop-MT, Brasil. 3Instituto de Ciências da Saúde – ICS - Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Universitário de Sinop – Av. Alexandre Ferronato, 1200, Sinop-MT, Brasil. 4Embrapa Agrossilvipastoril, Rodovia MT-222, Km 2,5, s/n – Zona Rural, Sinop-MT, Brasil.
Correspondência: [email protected]/[email protected]
Resumo: Estudos químicos e farmacológicos de Annonaceae têm mostrado o acúmulo de
metabólitos secundários com importantes atividades biológicas, tais como antiprotozoária,
citotóxica e antiviral. Este trabalho objetivou avaliar a atividade antiviral dos extratos n-hexânicos,
acetato de etila e metanólicos de folhas e ramos de Fusaea longifolia (Aubl.) Saff., de frações
obtidas por cromatografia em coluna do extrato acetato de etila dos ramos (RAE), bem como de
nanopartículas formuladas a partir deste extrato, contra os vírus Herpes Simplex Virus tipo 1,
Dengue sorotipo 1 e Mayaro. O extrato RAE foi incorporado na nanocápsula polimérica de núcleo
lipídico (LNC), na nanocápsula LNC, carregada positivamente, formulada com polímero Eudragit
RL (LNC+), pela deposição interfacial de polímeros pré-formados, e ao lipossoma (LP), através da
evaporação em fase reversa. A avaliação da atividade antiviral foi realizada por meio do ensaio do
MTT, utilizando concentrações abaixo da Concentração Citotóxica a 50% (CC50) previamente
determinadas pelo teste de citotoxicidade, frente às células Vero-E6, através do mesmo ensaio.
Nanoestruturas brancas foram utilizadas para eliminar a interferência dos nanocarreadores e o
aciclovir (15µM) como controle positivo. A Concentração Efetiva a 50% (CE50) e o índice de
seletividade (IS=CC50/CE50) foram calculados para àqueles materiais que inibiram mais que 50%
da replicação viral. Os extratos acetato de etila das folhas (FAE) e dos ramos (RAE) foram
considerados os mais promissores com IS > 14,28 e > 10,63, respectivamente. Das frações obtidas a
partir do extrato RAE, apenas a fração F5 apresentou potencial antiviral com IS = 15,67. Nenhum
dos extratos foram promissores contra os vírus Dengue sorotipo 1 e o Mayaro. O extrato RAE
apresentou efeito virucida com IS = 8,35. Dos nanossistemas avaliados, apenas as LNC+ foi capaz
de reduzir a concentração efetiva do extrato RAE. Análises cromatográficas, por UPLC-MS/MS,
revelaram a presença de quercetina–3-β-D-glicosídeo; taxifolina; quercetina e luteolina no extrato
RAE e de quercetina–3-β-D-glicosídeo na fração F5.
Palavras-chave: Annonacea, Fusaea longifolia, antiviral, Nanocápsulas de núcleo lipídico.
Conflitos de interesse: Todos os autores não têm nenhum conflito a declarar
74
INTRODUÇÃO
A resistência demonstrada por micro-organismos frente aos medicamentos disponíveis,
como por exemplo, a resistência ao aciclovir pelo Herpes Simplex Virus (OKONKO; COOKEY,
2015; ROLLENHAGEM et al., 2014; MEDJELDI et al., 2018). Assim como, a inexistência de
terapias medicamentosas para algumas infecções virais, tais como as desencadeadas pelos vírus da
dengue (GUARNER, HALE., 2019) e pelo vírus mayaro (CAMINI et al., 2018), tornaram-se
motivos de alarde para a saúde pública, sendo consideradas um sério problema mundial
(DONALISIO et al., 2017; PATTERSON et al., 2016) o que justifica a necessidade da busca de
novos fármacos antivirais.
O uso de produtos naturais para finalidades medicinais é uma das práticas mais antigas da
humanidade (BERNARDINI et al., 2018). A biodiversidade brasileira faz do Brasil um país
promissor no que tange o potencial de seus recursos naturais, principalmente porque muitas das
espécies aqui presentes não tiveram seu potencial farmacológico estudado (VALLI et al., 2018;
DUTRA et al., 2016). Essas espécies podem apresentar atividades biológicas extraordinárias, dentre
elas, antiviral, antibacteriana, antifúngica, antineoplásica e antiparasitária (MENDES et al., 2017;
RODRIGUES et al., 2015; PETRONILHO et al., 2012; BRAGA et al., 2007; SANTOS-PIMENTA
et al., 2003).
Neste contexto, as espécies da família Annonaceae tornam-se interessantes no que tange a
avaliação de potenciais farmacológicos, visto que apresentam em sua constituição fitoquímica
compostos bioativos potentes, tais como alcaloides, flavonoides, terpenos e acetogeninas
(HERNANDEZ; DE-LA CRUZ-CHACON; GONZALEZ-ESQUINCA, 2015; TAVARES et al.,
2005) sendo a maioria das atividades biológicas atribuídas as espécies desta família,
correlacionadas diretamente aos flavonoides, alcaloides e as acetogeninas, sendo esses últimos
metabólitos encontrados unicamente em Annonaceae (DA-SILVA et al., 2009; CAROLLO et al.,
2006).
A espécie Fusaea longifolia Aubl. Saff (Annonaceae) é conhecida popularmente como
envira-preta, envira surucuru e fusáia (Livro Plantas da Amazônia). Esta árvore ocorre na floresta
amazônica (incluindo Colômbia, Venezuela, Bolívia, Peru, Equador, Guianas e Brasil) e pode ser
encontrada no Acre, Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia, Roraima, Maranhão e Mato Grosso
(FLORA DO BRASIL 2020). Estudos fitoquímicos anteriores demonstraram a presença de
alcaloides como a estefolidina, fuseína, liriodenina e O-metilmoscatolina (LEBOEUF et a., 1982;
TAVARES et al., 2005) e dos terpenos, policarpol, sitosterol e estigmasterol (LEBOEUF et a.,
1982). Cavalcante (1991) relatou que para os índios Urubu-Kaapor a fusáia serve como remédio.
Entretanto, até o momento não se dispõem de estudos farmacológicos sobre esta espécie.
75
Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a potencial atividade antiviral de
extratos obtidos a partir das folhas e dos ramos da espécie Fusaea longifolia (Aubl.) Saff. contra os
vírus Herpes Simplex Virus tipo 1 (HSV-1), da Dengue sorotipo 1(DENV-1) e ao Mayaro (MAYV).
Assim como, avaliar o comportamento do extrato mais promissor ao ser incorporado a diferentes
sistemas nanoestrutururados.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal
As folhas e os ramos de Fusaea longifolia (Aubl.) Saff, Annonaceae, foram coletadas na
região de transição dos biomas Cerrado-Amazônia na região Médio-Norte do Estado de Mato
Grosso e o material florífero e herborizado encontra-se depositado sob o número de tombo 6118 no
Herbário Centro-Norte-Mato-Grossense (CNMT) da UFMT/CUS/Sinop-MT, Brasil.
Extração, fracionamento e amostras-estoque
O material vegetal foi seco em estufa de circulação forçada de ar (45ºC) por três dias para as
folhas e cinco dias para os ramos finos. Após a secagem foram submetidos à moagem, utilizando
moinhos de facas e submetidos à extração por maceração utilizando como solvente extrator o
hexano e sucessivamente acetato de etila e metanol (Synth). Os extratos brutos foram obtidos após
evaporação do solvente sob pressão reduzida 40º C em rotaevaporador (Fisatom – M804), sendo
denominados (FH) o extrato n-hexânico , (FAE) acetato de etila e (FM) metanólico das folhas e os
extratos (RH) n-hexânico, (RAE) acetato de etila e (RM) metanólico dos ramos. O extrato RAE,
considerado promissor, foi fracionado em cromatografia em coluna utilizando sílica gel 60, 70-230
mesh (Merck) e como fase móvel misturas binárias de solventes em polaridade crescente (hexano,
diclorometano, acetato de etila e metanol). As frações foram avaliadas por cromatografia em
camada delgada (CCD) (sílica gel 60 F254) e reagrupadas, originando 9 frações (F-1 a F-9).
Todos as amostras foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich) na
concentração de 10.000 µg.mL-1, armazenadas a -20°C e diluídas em meio de cultura no momento
do uso, não excedendo a concentração de 1% de DMSO.
Avaliação do potencial antiviral
Células e vírus
As células Vero-E6 foram cultivadas em meio Leibovitz- 15 (L-15), suplementado com 5 %
de soro bovino fetal (SFB; Cultilab), com 100 U/mL penicillina G, 100 mg/mL estreptomicina e 25
mg/mL anfotericina B (Gibco) e mantidas a 37 °C.
O vírus HSV-1 cepa KOS foi gentilmente cedido pela Profa. Dra. Cláudia M. O. Simões
(Laboratório de Virologia Aplicada, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Brasil)
e o DENV-1 e MAYV foram isolados de amostras clínicas no Laboratório de Imunologia e
76
Biologia Molecular, Universidade Federal de Mato Grosso, Sinop, Brasil (Sinop). Os estoques
virais foram armazenados a -80 °C e o titulo dos vírus foi determinado pelo método de placas lise
(Burleson et al., 1992) e expresso através do número de unidades formadoras de placas por mL
(PFU.mL-1).
Determinação da citotoxicidade
A citotoxicidade das amostras foram determinadas pelo ensaio do MTT como previamente
descrito por Karimi e colaboradores (2017) com algumas adaptações. As amostras foram avaliados
no intervalo de concentração de 800 a 0,78 µg.mL-1. Os valores da concentração de cada amostra
capaz de reduzir em 50 % a viabilidade celular em relação aos controles celulares (CC 50) foram
calculados por análise de regressão.
Triagem do potencial antiviral das amostras pelo ensaio do MTT
Os testes foram feitos pelo tratamento simultâneo e avaliados pelo ensaio do MTT conforme
descrito por Karimi (2017) com breves modificações. Adicionou-se 100 μL de uma suspensão
celular de Vero-E6 (1,8x105 células.mL-1) por cavidade e a placa foi incubada por 24 horas até
confluência do tapete celular. Amostras foram avaliadas no intervalo de concentração de 100 a 0,78
µg.mL-1 e a multiplicidade de infecção (MOI) adotada para os testes foi igual a 1. O aciclovir (15
µM) foi utilizado como controle positivo para o HSV-1. Os tapetes celulares foram tratados e
infectados simultaneamente e a placa foi incubada por 4 dias, a 37ºC para o HSV-1 e 6 dias para
DENV-1 e MAYV. Após este período, o meio foi aspirado cuidadosamente e as cavidades foram
tratadas com 50 μL de MTT (1 mg.mL-1 em L-15). Após a adição do MTT a placa foi incubada por
4 horas a 37ºC. Então, 100 μL de DMSO foram adicionados a cada cavidade e a placa foi agitada
por 10 minutos em agitador de placas e avaliada em espectrofotômetro a 495ηm. Os valores da
concentração efetiva a 50 % (CE50) foram calculados por análise de regressão.
Avaliação da atividade antiviral pelo método de redução de placas de lise
As amostras consideradas promissoras na etapa de triagem foram avaliadas na condição de
pré-tratamento (1), pós-tratamento (2) e atividade virucida (3), através do método de redução de
placas de lise. As células Vero-E6 (1,8 x 105 células.mL-1) foram cultivadas em placas de 24
cavidades até confluência em meio L-15 suplementado com 5% de SFB e então incubadas a 37°C
até confluência. (1) Pré-tratamento: o meio foi removido e os poços tratados com 400 µL,
contendo diferentes concentrações do extrato em meio L-15, por 3 horas a 37ºC. Após remoção do
sobrenadante, os poços foram infectados com 400 µL da suspensão viral contendo 25-100 PFU de
HSV-1 e incubados durante 1 h, a 37 ºC. Poços não tratados foram utilizados como controles de
infecção (CV). Após remoção das suspensões virais, adicionou-se a cada poço 1 mL de
carboximetilcelulose (CMC; Sigma-Aldrich) 1% em L-15 (2X). (2) Pós – tratamento: Após
77
confluência do tapete, os poços foram infectados com 400 µL da suspensão viral com 25-100 PFU
de HSV-1 e incubados durante 1 h, a 37 ºC. O sobrenadante foi removido e as células foram
tratadas com 1 mL das diferentes concentrações dos extratos diluídos em CMC 1% em L-15 (2X).
Poços não tratados foram utilizados como controles de infecção (CV). (3) Atividade virucida: as
suspensões virais (25-100 PFU) foram previamente tratadas em banho-maria (37ºC) por 15 minutos
com diferentes concentrações das amostras. Após este tempo, as suspensões foram utilizadas como
descrito acima para a infecção. Após remoção do sobrenadante, adicionou-se 1 mL de CMC 1% em
L-15 (2X).
Para todos os testes as placas foram incubadas por 3 dias a 37ºC. Após este período,
removeu-se o meio e as células foram fixadas e coradas com 800 μL de cristal violeta por 1 hora
sob agitação mecânica a temperatura ambiente.
Identificação de flavonoides por UPLC-MS/MS do extrato RAE da subfração F-5.
A identificação dos flavonoides foi desenvolvida conforme descrito por Duan e
colaboradores com modificações. A caracterização destes flavonoides foi fundamentada a partir do
comparativo de picos do tempo de retenção da amostra em análise com os padrões externos
autênticos preparados em metanol. Utilizou-se como padrões externos: Amentoflavona, Apigenina,
Canferol, Luteolina, Miricetina, Quercetina, Quercetina-3-β-d-glicosídeo, Rutina e Taxifolina
(Sigma-Aldrich). A análise procedeu-se empregando cromatografia líquida de ultra eficiência
acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS/MS) em equipamento UPLC Agilent 1290
Infinity (Agilent Technologies, USA). Utilizou-se Coluna Agilent Eclipse AAA (4.6 x 150 mm,
3.5μm) a 25º C com um volume de injeção de 20 μL. Fase móvel gradiente com água acidificada
com ácido fórmico 0.1 % (m/v) e acetonitrila em condições 05:95 à 95:05 (H2O: ACN). O tempo de
corrida adotado foi de 33 minutos com fluxo de 0.5 mL.min-1. A detecção foi obtida por
espectrometria de massas realizada num Agilent 6460 Triple Quad com uma fonte de ionização por
eletrospray, utilizando gás nitrogênio, nas seguintes condições: temperatura do gás de 300º C; fluxo
5 L.min-1; pressão do nebulizador 45 psi; temperatura do gás da bainha 250º C; fluxo 11 L.min-1;
tensão capilar -3500 V e intervalo de varredura de m/z 120-900 unidades.
Desenvolvimento de sistemas nanoestruturados a partir do extrato RAE
As suspensões de nanocápsulas de núcleo lipídico foram preparadas através do método de
deposição interfacial de polímero pré-formado conforme descrito por Jager e colaboradores (2009).
Este método é fundamentado na mistura de duas fases, a orgânica, constituída por 100 mg de Poli(ε-
caprolactona) ou Eudragit RL®, 40 mg de monoestearato de sorbitano, 10 mg do extrato 5 e 160 mg
de triglicerídeos de cadeia média em acetona, que foi vertida sob a fase aquosa sob agitação,
78
constituída por 75 mg de polissorbato 80 em água ultrapura. O solvente orgânico foi removido em
evaporador rotativo sob pressão reduzida.
Os lipossomas foram desenvolvidos pelo método de evaporação em fase reversa descrito por
Mertins e colaboradores (2005). Duas fases foram preparada: a aquosa e a orgânica. A fase aquosa é
constituída pelo extrato 5 (1 mg.mL-1) e polissorbato 80 0,25% em tampão fosfato salino pH 7,4. A
fase orgânica é constituída por 1,2 g de fosfatidilcolina de soja, 0,06 g de colesterol em 40 mL de
clorofórmio. As micelas invertidas foram obtidas após adição de 4 mL da fase aquosa à fase
orgânica e sonicação por 5 minutos. O organogel foi obtido após remoção do solvente orgânico por
evaporação rotativa à 25 ºC. O sistema permaneceu sob agitação e o restante da solução aquosa foi
adicionado anterior a extrusão em membrana 0,22 µm. Além dos lipossomas contendo a amostra de
interesse, também foram desenvolvidos lipossomas-branco (sem extratos), tal como descrito acima.
Caracterização físico-química das nanoestruturas
As suspensões formuladas foram caracterizadas de acordo com o seu ao diâmetro médio das
nanopartículas, índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (mV) e pH. O diâmetro médio
cumulativo (média Z) e o índice de polidispersão foram analisados por espectroscopia de correlação
de fótons (Nanosizer® Nanoseries, Malvern Instruments, Reino Unido) a 25 ° C. O pH foi
determinado em medidor de pH (Gehaka, PGH2000) previamente calibrado com padrões de pH 4,0
e 7,0. O potencial zeta (ξ) foi determinado através da mobilidade eletroforética da amostra em cuba
(modelo ZEN Zetasizer® Nano ZS- 3600, Malvern Instruments, Reino Unido).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores representam a média±desvios padrão de três experimentos independentes. Os
valores de CC50 e CE50 foram determinados por análise de regressão linear a partir das
concentrações de concentração-resposta.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A triagem da atividade antiviral dos extratos de F. longifolia foi realizada através do ensaio
do MTT e os resultados obtidos estão descritos na Tabela 1. Todos os extratos apresentaram baixa
porcentagem de inibição da replicação ou não inibiram os vírus DENV-1 e MAYV.
Tabela 1 – Resultados da triagem do potencial anti-HSV-1, anti-DENV-1 e anti-MAYV dos
extratos de F. longifolia, através do ensaio do MTT pelo tratamento simultâneo.
Vero-E6 HSV-1 DENV-1 MAYV Extrato CC50 (µg.mL
-1) CE50 (µg.mL
-1) IS % Inibição* % Inibição*
F. longifolia
FH - si - 13,48 ± 1,30 si FAE >400,00 28,05 ± 2,11 >14,28 8,00 ± 5,76 23,10 ± 2,01 FM 115,31 ± 2,74 110,99 ± 61,73 1,04 9,52 ± 4,65 si RH - si - 13,55 ± 2,04 21,25 ± 3,94
RAE >400,00 37,60 ± 7,54 10,63 32,06 ± 5,31 42,91 ± 1,37 RM 189,95 ± 24,59 88,60 ± 18,08 2,14 8,86 ± 12,02 si
FH; FAE e FM correspondem aos extratos n-hexânico, acetato de etila e metanol das folhas,
respectivamente. RH, RAE e RM correspondem aos extratos n-hexânico, acetato de etila e metanol
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dos ramos, respectivamente. (*) máxima inibição observada no teste. CC50 = Concentração
Citotóxica 50%, CE50 = Concentração eficiente 50% e IS = CC50/CE50 - Índice de seletividade. si –
amostras que não inibiram a replicação viral e (-) corresponde a teste não realizado por conta da
amostra não ter apresentado resultado satisfatório na triagem.
Os extratos FAE e RAE inibiram a replicação do HSV-1 cepa KOS apresentando um valor
de IS igual a >14,3 e >10,6, respectivamente. Este parâmetro corresponde à razão entre CC50/CE50 e
mensura o quão seletivo é o extrato, desta forma, quanto maior o valor, mais seletivo para o vírus e
menos prejudicial para a célula será o extrato (BELLATO et al., 2017; ALMEIDA et al., 2016;
LOPES et al., 2014). Estes extratos apresentam em sua constituição três classes de metabólitos
secundários em comum, flavonoides, terpenos e alcaloides (MORALES, 2015). Os flavonoides e
seus derivados apresentam inúmeras propriedades bioativas, dentre elas anti-inflamatória (QIAN et
al. 2015), antibacteriana (FARHADI et al., 2019) e são considerados promissores agentes antivirais
(EL-TOUMY et al., 2018). Os efeitos antivirais descritos para espécies vegetais normalmente são
atribuídos aos seus teores de flavonoides (OZÇELIK; KARTAL; ORHAN, 2011), desta forma,
espécies ricas em flavonoides normalmente apresentam maior probabilidade de desenvolverem
efeitos inibitórios sob a replicação viral ou efeitos diretos sob a partícula viral, o que já foi
observado em espécies ricas em quercetina, kaempferol, galangina, procianidina (EL-TOUMY et
al., 2018), liquiritina apiosídeo e isoliquiritina (FUKUCHI et al., 2016), genisteína e coumestrol
(ARGENTA et al., 2015), rutina (ZHANG et al., 2014), houttuynoides (CHEN et al., 2013; CHEN
et al., 2012), quercetina (CHIANG et al., 2003), ao luteoferol (FRITZ et al., 2007) frente ao Herpes
simplex virus tipo 1
Estes compostos são capazes de interferir em uma, ou mais de uma, etapa do ciclo de
replicação viral, mais especificamente nas fases iniciais do ciclo. Além disso, estes podem
apresentar mecanismos de ação direta sob o vírion. Aos flavonoides, atribuem-se as alterações nas
glicoproteínas, tais como a gD do envelope do HSV-1, o que reduz sua potencial infectividade
(TERLIZZI et al., 2016), visto que esta proteína é essencial para a entrada do vírion na célula
(BELLO-MORALES et al., 2018).
O fracionamento cromatográfico do extrato RAE resultou em nove frações: F-1 a F-9
(MORALES, 2015). As três primeiras frações não foram avaliadas por insuficiência de massa e as
demais foram avaliadas frente ao HSV-1 cepa KOS, através do ensaio do MTT, sendo os resultados
apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Resultado da avaliação do potencial anti-HSV-1 cepa KOS das frações obtidas por
fracionamento cromatográfico do extrato RAE, através do ensaio de MTT, pelo tratamento
simultâneo
Vero E6
HSV-1
Subsfração CC50 (µg.mL-1
) CE50 (µg.mL-1
) IS % Inibição*
F-4 - - 40,71 ± 2,78
80
F-5 >1000,00 63,78 ± 2,73 >15,67
F-6 Si
F-7 Si
F-8 Si
F-9 - - - 43,53 ± 9,87
(*) máxima inibição observada no teste. CC50 = Concentração Citotóxica 50%, CE50 - Concentração
eficiente 50% e IS = Índice de seletividade. Si = amostras que não inibiram a replicação viral e (-)
corresponde a teste não realizado por conta da amostra não ter apresentado resultado satisfatório na triagem.
Apenas a fração F-5 exibiu um potencial antiviral satisfatório com IS > 15,67 e pôde ser
observado um aumento de seletividade de 47,41 % quando comparado com o seu extrato de origem.
Avaliações fitoquímicas por CCD utilizando como revelador uma solução de difenilborato de
aminoetanol a 1% (p/v) em metanol, seguido de uma solução de macrogol 400 a 5% (p/v) em
metanol (Wagner e Bladt, 1995) indicaram a presença de flavonoides na fração F-5. Para confirmar
a presença de flavonoides no extrato RAE e na fração F-5 os mesmos foram analisados por
cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (UPLC-
MS/MS).
A partir da análise do extrato RAE observou-se a formação dos íons m/z 300 (m/z 463 →
m/z 300); 285 (m/z 303,25 → m/z 285); 120,90 (m/z 301,24 → m/z 120,90); 239 (m/z 285,24 →
m/z 239), fragmentos iônicos que indicam a protonação de flavonoides, correspondendo a
fragmentos descritos para a quercetina–3-β-D-glicosídeo (PATIAS, 2017), taxifolina (SOUZA,
2017), quercetina (PATIAS, 2017) e luteolina (SOUZA, 2017), respectivamente (Figura 1). Vale
ressaltar que o fragmento m/z 300 (m/z 463 → m/z 300) correspondente a quercetina–3-β-D-
glicosídeo também foi identificado na fração F-5 (Figura 2).
Figura 1 - Resultado da análise cromatográfica por UPLC–MS/MS do extrato RAE sendo (A) - Quercetina 3-β-D-Glicosídeo; (B) - Taxifolina ; (C) - Quercetina e (D) –Luteolina.
81
Figura 2 - Resultado da análise cromatográfica por UPLC–MS/MS da amostra F-5 sendo (A) -
Quercetina 3-β-D-Glicosídeo.
Dos quatro flavonoides identificados, apenas a taxifolina não apresenta relatos que
descrevem seu efeito inibitório sobre a replicação do HSV-1. A quercetina, um dos flavonoides de
maior distribuição, apresenta diversas propriedades biológicas descritas, tais como antitumorais,
antibacterianas, e antivirais (DOS-SANTOS et al., 2018; MAMBE et al., 2019; BOFF et al., 2016).
Este flavonoide já foi associado à atividade anti-herpética em vários extratos oriundos de diferentes
espécies vegetais (EL-TOUMY et al., 2018; HUNG et al., 2015; MARTINS et al., 2011) e sua ação,
em células Vero, pode ser atribuída a fase de adsorção e de penetração da partícula viral, no entanto,
este mecanismo ainda não é esclarecido (LEE et al., 2017; HUNG et al., 2015). No organismo, os
flavonoides podem influenciar no aumento de citocinas, tais como TNF-α e IFN-γ, que
desempenham um papel benéfico no combate contra o HSV, além disso contribuem para o aumento
da viabilidade de neurônios infectados, fenômeno que pode ser correlacionado a supressão da
expressão gênica viral (POLANSKY; JAVAHERIAN; ITZKOVITZ., 2016). Derivados da
quercetina, tais como a quercetina-3,7-O-α-l-dirhamnosídeo e quercetina-3-β-D-glicosídeo (CHEN
et al., 2011, OZÇELIK; KARTAL; ORHAN, 2011; TIAN et al., 2009), também apresentam efeito
82
anti-HSV. O efeito anti-herpético contra o vírus HSV-1 (BIDONE et al., 2015; REICHLING et al.,
2008) e contra o HSV-2 (OJHA et al., 2015), bem como o efeito contra o vírus Chikungunya
(MURALI et al., 2015) e o vírus da Encefalite Japonesa (FAN et al., 2016) já foi descrito para a
luteolina.
Nota-se que a atividade anti-HSV avaliada para o extrato RAE foi menor do que a observada
na fração ativa, este fato pode estar relacionado diretamente à concentração das substâncias nesta
fração e a quercetina-3-β-D-glicosídeo pode ser a responsável por esta atividade, visto que os
demais flavonoides não foram encontrados em tal fração.
Tanto o extrato RAE quanto a fração F-5 não demonstraram potencial antiviral nos ensaios
utilizando o pré-tratamento das células Vero E6 previamente a infecção, no entanto o extrato RAE
demonstrou potencial virucida (IS igual a 8,35) e mostrou-se efetivo no ensaio de pós-tratamento
(IS igual a 3,38). O ensaio virucida permite avaliar a ação direta, dos compostos presentes no
extrato, sob a partícula viral, desta forma permite avaliar os efeitos de inibição ou inativação direta.
Estes efeitos podem ocorrer em decorrência da desestabilização estrutural irreversível do vírion,
impedindo que este interaja com receptores celulares que mediariam as etapas seguintes da
infecção. Já o ensaio de pós-tratamento permite avaliar se a amostra é capaz de atuar diretamente no
ciclo replicativo. Estes efeitos podem ser atribuídos aos flavonoides, pois estes podem desestabilizar
completamente a estrutura do envelope viral por atuarem como agentes surfactantes e detergentes
inativando diretamente a partícula viral (KELLER et al., 2005; NIKOLIC; PIGUET, 2010;
OZÇELIK; KARTAL; ORHAN, 2011).
Compostos isolados ou em fitocomplexos, com potencial terapêutico, por mais que sejam
eficientes em gerar resposta farmacológica, podem apresentar propriedades físico-químicas
insatisfatórias (JANA et al., 2014). Uma alternativa para driblar este problema está na incorporação
a sistemas nanoestruturados (QIN et al., 2018; CHARÃO et al., 2015; FIEL et al., 2014). A
aplicação tecnológica de copolímeros vêm ganhando grande destaque na indústria farmacêutica por
permitir a elaboração de sistemas de liberação controlada (AKHGARI; TAVAKOL, 2016)
Assim, o extrato RAE foi incorporado as nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (LNC)
sem carga e carregadas positivamente, formulada com o polímero Eudragit RL 100® (LNC +) e ao
lipossoma (LP). Nanoestruturas brancas foram formuladas para confirmar a ausência de
interferência dos nanocarreadores no teste. Anterior ao teste antiviral, as formulação foram
caracterizadas quanto ao diâmetro médio das nanopartículas, índice de polidispersão (PDI),
potencial zeta (mV) e pH.
Macroscopicamente, todas as formulações contendo o extrato incorporado (LNC, LNC+ e
LP) apresentaram característica homogêneas, aspecto leitoso, opalescente e cor ligeiramente
83
esverdeada, por conta da presença do extrato RAE. As formulações brancas (LNCBR, LNC+BR e
LPBR) apresentaram aspecto esbranquiçado e opalescente.
A Tabela 3 descreve os valores de diâmetro médio, polidispersão, pH e potencial zeta
obtidos após análise das formulações. Percebe-se que as amostras apresentaram baixa
polidispersidade e o seu diâmetro foi em escala nanométrica.
Tabela 3. Resultado da caracterização das nanopartículas por espectroscopia de correlação de fótons, potencial zeta e pH.
Características LNCBR LNCBR+ LPBR LNC LNC+ LP
Z-average (ηm) 142 116 119 189 138 131
PDI 0,076 0,110 0,137 0,078 0,204 0,139
p ζ (mV) -9,8 +8,0 -15,8 -5,85 +6,6 -8,38
pH 5,86 4,62 7,1 5,18 4,43 7,06 Onde Z- avarage indica o diâmetro médio das nanopartículas, PDI – o índice de polidispersão, p ζ – o potencial zeta, LNC corresponde à nanocápsulas de núcleo lipídico; LNC
+ a nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico formulado com o p olímero
Eudragit RL e LP a lipossomas; LPBR. LNCBR e LNCBR corresponde as formulações brancas.
As suspensões de LNCBR/LNC+BR apresentaram valores médios de diâmetro que variaram
de 116 – 142 ηm, enquanto os valores de diâmetro médio para as LNC/LNC+ variaram de 138 – 189
ηm, estes valores, quando menores ou próximos a 200 ηm, são capazes de aumentar a eficiência e
otimizar a atividade de princípios ativos incorporados (MOGHIMI et al., 2001).
Apenas LNCBR e LNC+ podem ser consideradas quase-monodispersas (PDI < 0,08), as
demais formulações, por apresentarem o PDI entre 0,08 e 0,3 são consideradas de baixa
polidispersibilidade. Em relação as propriedades de superfície, o potencial zeta (p ζ) apresentado
pelas formulações com extrato foram inferiores a 10 mV em módulo, predizendo estabilidade
físico-química intermediária das formulações (MORA-HUERTAS et al., 2011; FIEL et al., 2004).
O pH das LNC+/LNC foi ligeiramente ácido enquanto o pH dos lipossomas (LP/LPBR) esteve
próximo a neutralidade.
As formulações tiveram seu potencial antiviral avaliado através do ensaio do MTT e apenas
as nanocapsulas poliméricas de núcleo lipídico foram consideradas promissoras (Tabela 4).
Tabela 4 – Resultado da avaliação do potencial anti-HSV-1, através do ensaio do MTT, do
extrato RAE de F. longifolia incorporado nas nanopartículas LNC, LNC+ e LP e do extrato RAE
livre.
VERO E6
HSV-1
[ ] testada CC50 (µg.mL-
1)
CE50 (µg.mL-
1)
IS Inibição*
LPBR 250 26,98 ± 0,13 - - -
LP 20 si
LNCBR 250 96,54 ± 0,28 - - -
LNC 7,8 - - - 47,00 ± 17,43
LNC+BR 250 22,83 ± 0,29 - - -
LNC+ 7,8 24,47 ± 0,98 2,7 ± 0,49 9,06 -
Extrato RAE
(livre)
50 >400 37,60 ± 7,54 10,63 -
Onde LNC corresponde à nanocápsulas de núcleo lipídico; LNC+
a nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico formulado com o polímero Eudragit RL e LP a lipossomas. LPBR. LNCBR e LNCBR corresponde as formulações brancas (*) porcentagens de inibição foram descritas apenas para os extratos que apresentaram inibição inferior a 50 % em virtude
84
da inviabilidade para cálculo da concentração eficiente 50%. CE50= Concentração eficiente 50%; CC5 0=Co ncentr ação
Citotóxica 50% e IS= Índice de seletividade. si= Sem inibição da replicação viral.
O extrato RAE livre mostrou-se ativo contra o HSV-1 como supradescrito, porém
incorporado ao LP não apresentou atividade. Os lipossomas diferem-se constitutivamente das
nanocápsulas, desta forma pode-se inferir que os polímeros associados a constituição do
nanocarredor influenciam na atividade visto que sua ausência, no caso dos lipossomas, implicou em
inatividade do extrato.
Ao comparar a natureza dos componentes das LNCs, pode-se inferir que a carga do
polímero pode contribuir para aumentar a eficiência do nanocarreador. Esta carga, resultado da
presença de copolímeros de metacrilato de etila e metila, além de ésteres metacrílicos que contêm
grupamento amônio, aumentam a interação do invólucro com a célula alvo, maximizando as taxas
de difusão do ativo presente na formulação (JANA et al., 2014; YYSLOUZIL et al., 2013; DAS et
al., 2010).
Testes antivirais com o extrato RAE livre, apesar do índice de seletividade interessante
(10,6), demonstraram que este extrato não apresenta nenhuma influência sobre a replicação do
HSV-1 em concentrações abaixo de 12,5 µg.mL-1. Sendo assim, o sistema LNC+ otimizou a
atividade do extrato. As nanocápsulas poliméricas são eficientes e configuram promissores sistemas
carreadores de substâncias biologicamente ativas (CHARÃO et al., 2015; DAS et al., 2010). Devido
seu núcleo hidrofóbico, o carreamento de ativos, compostos ou extratos hidrofóbicos, em
nanocápsulas mostra-se mais eficiente para redução da quantidade requerida para a atividade
biológica de interesse (FIEL et al., 2014). Para desempenhar o efeito antiviral sobre o HSV-1 foi
necessário 2,7±0,49 µg.mL-1 de extrato incorporado em LNC+, concentração 14 vezes menor do que
a requerida de extrato livre.
Existem algumas descrições de efeitos antivirais de algumas substâncias incorporadas em
nanoestruturas formuladas com polímeros catiônicos, no entanto não há descrições referentes a
incorporação de extratos. Inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa incorporados a nanogéis
catiônicos (Nano-NRTI’s) demostraram potentes efeitos antivirais frente ao HIV e este efeito foi
associado a carga do polímero (GERSON et al., 2014).
Conclusões
De todos os extratos avaliados, apenas o extrato acetato de etila dos ramos de F. longifolia
avaliadas (RAE) foi considerado promissor. Este extrato apresentou eficiência no teste de pós-
tratamento (IS = 3,38) e mostrou-se ativo no ensaio virucida frente ao HSV-1 (IS = 8,35). Das
frações de RAE avaliadas, apenas F5 apresentou potencial antiviral com IS = 15,67 e efeito
virucida. Análises cromatográficas, por UPLC-MS/MS, de RAE e F5 revelaram a presença de
85
quercetina–3-β-D-glicosídeo; taxifolina; quercetina e luteolina em RAE e de quercetina–3-β-D-
glicosídeo em F5. Dos nanossistemas avaliados, apenas as nanocápsulas LNC+ potencializaram o
efeito de RAE, enquanto que quando incorporado em LP tornou-se ineficaz contra o HSV-1.
Agradecimentos
Os autores agradecem o auxilio financeiro concedido pela Fundação de Amparo à Pesquisa
do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT).
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