BBM2013-2014, MEBIOM

Bioqumica e Biologia MolecularRelatrio da Atividade Experimental TP3

Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica

Francisco Caiado -76032 Ins Domingos - 76973Marta Barbas - 79693

Data do laboratrio: 22.10.2013Turno: A, Laboratrio de Cincias Biolgicas

RESUMOA actividade laboratorial TP3 baseou-se na caracterizao cintica da enzima invertase. Esta enzima capaz de catalisar a hidrlise da sacarose nos seus diferentes monmeros.Ento a finalidade do trabalho prtico foi estudar a influncia que a quantidade de substrato tem na actividade da enzima.Aps a medio da absorvncia de cada soluo e atravs dos mtodos de Lineweaver-Burk e Michaelis-Menten, foi possvel determinar o Km (concentrao de substrato) e a velocidade mxima correspondente enzima em estudo.Os valores obtidos para o Km e para a velocidade so, respectivamente,

ResultadosCom a realizao da actividade laboratorial obtivemos o valor de absorvncia de cada uma das concentraes de sacarose ao longo do tempo, em que ocorria a aco da enzima.

Concentrao de sacarose (g/L)Absorvncia

150,0570,0930,3350,7030,655

300,010,2020,9421,5992,244

450,0110,2360,7881,4222,477

600,0050,3751,0841,7822,415

750,0040,1170,4530,911,37

10000,30,9311,7352,057

Tabela 1 : Valores obtidos experimentalmente nos vrios ensaios

A partir dos valores anteriormente mencionados obteve-se a concentrao de Produto, atravs da recta de calibrao DNS (y=)Concentrao de sacarose (g/L)Concentrao de Produto (g/mol)

150,08110,12340,40760,83970,7833

300,02600,25141,12041,89192,6492

450,02710,29130,93951,68402,9229

600,02010,45461,28712,10672,8500

750,01890,15160,54611,08281,6229

1000,01420,36651,10742,05162,4297

Tabela 2 : Valores da concentrao de produto formado

Foi possvel traar um grfico que mostra a variao de concentrao de glucose em funo do tempo e ainda a sua regresso linear.

Grfico 1 : Concentrao de aucar (g/mol, eixo dos yy) em funo do tempo (min, eixo dos xx)

Nas tabelas 1 e 2 h a sinalizao de um valor a vermelho, o qual foi desprezado na realizao do Grfico 1, para que os clculos do trabalho ficassem sujeitos a um erro menor.

A partir do Grfico 1 podemos chegar velocidade de reao de cada concentrao de sacarose, atravs do declive de cada regresso.

Concentrao de Sacarose (g/L)Velocidade (g/Lmin)

(1)1/V

(2)1/S

(3)Velocidade (mol/Lmin)

(4)1/V (Lmin/mol)

(5)Inverso da concentrao mol/Lmin(6)Concentrao mol/L

(7)

150,10419,60610,06670,00030423287,6080722,81600,043828892

300,38452,60080,03330,0011235890,09102711,40800,087657784

450,40552,46610,02220,0011848843,9950687,60530,131486676

600,40312,48080,01670,0011778849,0200945,70400,175315568

750,23214,30850,01330,00067821474,536844,56320,21914446

1000,36132,76780,01000,0010557947,2460563,42240,292192613

Tabela 3 : Valores calculados. Legenda: (1)- velocidade minima em (g/L); (2)- Inverso da velocidade 1; (3) Inverso da concentrao de sacarose; (4) Velocidade minima em (mol/L); (5) Inverso da velocidade 4; (7) Concentrao (mol/L)

Com os valores da tabela 3 foi possvel construir os grficos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk.

Grfico 2 : Grfico de Michaelis-Menten

O grfico foi obtido atravs da equao de Michaelis-Menten:

No entanto parra termos de simplificao, inverteu-se a equao de forma a criar um grfico de Lineweaver-Burk, da seguinte maneira:

Obtemos assim o grfico de onde possvel retirar os valores de velocidade mxima (Vmx) e do Km.

Grfico 3 : Lineweaver-burk

y= 114,14x + 325,94

y = mx + b

. possvel ento chegar aos valores de Vmx e Km:

Vmx (g/Lmin)Km(mM)

0,00307Produto350,1872

Substrato332,6156

tabela 4 : valores de velocidade mxima e Km do produto e subtrato

DISCUSSONo presente trabalho, pretendia-se caracterizar a cintica de Michaelis-Menten para a enzima invertase. No modelo da cintica de Michaelis-Menten, afirmado que a variao da velocidade de uma reao enzimtica depende do aumento da concentrao de substrato com que a enzima reage e demonstra-se da seguinte forma:

Figura Curva de Michaelis- Menten

Nesta figura possvel observar o Km, constante de Michaelis, que representa a concentrao de sacarose (substrato) para a qual a velocidade metade da velocidade mxima. Esta constante uma medida de afinidade, sendo que valores muito elevados correspondem a uma afinidade muito baixa. Tambm se pode observar a velocidade mxima, Vmx, que corresponde ao valor mximo para que tende a curva experimental. Esta curva descrita pela seguinte equao: Assim, de modo a obter Km for necessrio recorrer a uma forma linearizada da equao (Lineweaver-Burke), isto , calcularam-se os parmetros pretendidos a partir da equao inversa. Deste modo, obtiveram-se como valores experimentais para o Km 114.0940. Estes apresentam um enorme um erro relativo, isto um erro de 86.4281% (relativamente ao tabelado de apenas 61.2, pelo que se devem ter em considerao quais os erros realizados.

importante referir que no que diz respeito espcia acerca da qual era necessrio procurar na literatura - Saccharomyces bayanus no foram encontrados quaisquer dados, pelo que utilizmos dados acerca de Saccharomyces cerevisiae, uma espcie muito semelhante. No que diz respeito aos erros sistemticos nesta atividade experimental, para a obteno de resultados mais consistentes e com erro menos aprecivel, foram desprezados alguns pontos, por estes se afastarem da linha de tendncia. No entanto, como possvel observar, os erros obtidos foram ainda assim bastante elevados. Este fenmeno ficou-se a dever-se a vrios fatores. Podem ter ocorrido erros de valores devido a uma pipetagem no uniforme para todos os ensaios de DNS. O DNS um reagente que apenas tem afinidade para aucares redutores, como a frutose e a glucose, pelo que no deteta a sacarose. Tambm podem ter ocorrido erros como o prprio efeito de diluio quando era adicionada a gua destilada e, ainda, com a pipetagem de enzima invertase. A no homogeneizao da enzima antes da adio ao vaso reacional pode tambm alterar os valores obtidos. A existncia de risco ou impurezas nas clulas onde era lida a absorvncia tambm pode ter alterado a leitura, diminuindo o valor da absorvncia. ainda fundamental ter em ateno que os valores de tempo assinalados relativamente extrao da amostra do vaso reacional e do banho quente so tempos relativos e no tempos exatos, ou seja, a regularidade destas aes no foi sempre a mesma, ainda que fosse medida com um cronmetro, existem sempre substncias que podem ter estado mais 2 ou 3 s no vaso.Como concluso, o grupo pensa que esta atividade no foi totalmente bem conseguida uma vez que os erros obtidos foram demasiado elevados.

Pgina - 10