8/13/2019 bibliografia 11

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J O U R N A L O F V I RO L OG Y , J U l Y 1 9 9 0 , p . 3 3 9 1 - 3 3 9 80 0 2 2 - 5 3 8 X / 9 0 / 0 7 33 9 1 - 0 8 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 0 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 6 4 , N o . 7

S t r u c t u r e a n d E x p r e s s i o n o f t a t - , r e v - , a n d n e f S p e c i f i c T r a n s c r i p t so f Human I m m u n o d e f i c i e n c y V i r u s T y p e 1 i n I n f e c t e dL y m p h o c y t e s a n d M a c r o p h a g e sMARJORIE R O B E R T - G U R O F F , l MIKULAS P O P O V I C , l t SUZANNE GARTNER,lt PHILLIP MARKHAM,2ROBERT C . GALLO, AN D MARVIN S . R E I T Z 1 ' *

L a b o r a t o r y o f Tumor C e l l B i o l o g y , N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e , B e t h e s d a , M a r y l a n d 2 0 8 9 2 , 1 andD e p a r t m e n t o f C e l l B i o l o g y , B i o n e t i c s R e s e a r c h , I n c . , K e n s i n g t o n , M a r y l a n d 2 0 8 9 5 2R e c e i v e d 5 J a n u a r y 1 9 9 0 / A c c e p t e d 1 3 A p r i l 1 9 9 0

P r i m a r y RNA t r a n s c r i p t s f r o m t h e human i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s t y p e 1 ( H I V - 1 ) a r e p r o c e s s e d i n t o m a t u r emRNA b y a c o m p l e x s e r i e s o f s p l i c i n g e v e n t s . V i r a l s t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d r e v e r s e t r a n sc r i p t as e a r e t r a n s l a t e df r o m u n s p l i c e d o r s i n g l y s p l i c e d t r a n s c r i p t s . P r o t e i n s w h i c h c on tr o l v i ru s r e p l i c a t i o n , i n c l u d i n g t a t , r e v , a n dn e f , a r e t r a n s l a t e d f r o m t r a n s c r i p t s w h i c h a r e t h e p r o d u c t o f m u l t i p l e s p l i c i n g . We h a v e a n a l y z e d t h ec o m p o s i t i o n a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e l a t t e r t r a n s c r i p t s i n l o n g - t e r m i n f e c t e d c e l l l i n e s a n d i n a c u t e l yi n f e c t e d p e r i p h e r a l b l o o d c e l l s b y a m p l i f i c a t i o n w i t h t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) f o U l o w e d b y S o u t h e r nb l o t , m o l e c u l a r c l o n i n g , a n d DNA s e q u e n c e a n a l y s e s . I n H9 c e l l s c h r o n i c a l l y i n f e c t e d w i t h t h e H I V - 1 s t r a i nH T L V - I I I B , t h e p r e d o m i n a n t o f t h e t h r e e k i n d s o f t r a n s c r i p t s i s t h o s e c o d i n g f o r n e f . T r a n s c r i p t s w i t h c o d i n gp o t e n t i a l f o r r e v c o n s t i t u t e d a n i n t e r m e d i a t e f r a c t i o n o f t h o s e a n al y z e d, w h i l e t h o s e f o r t a t a c c o u n t e d f o r o n l ya s m a l l m in or i ty . A s i m i l a r p a t t e r n w a s o b s e r v e d w i t h S o u t h e r n b l o t s o f P C R - a m p l i f i e d t r a n s c r i p t s f r o mp e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s a c u t e l y i n f e c t e d w i t h H T L V - I I I B . T h e s a m e g e n e r a l p a t t e r n w a s a l s o o b s e r v e dw i t h P C R - a m p l f f i e d t r a n s c r i p t s f r o m p e r i p h e r a l b l o o d m o n o c y t e - m a c r o p h a g e s i n f e c t e d w i t h a n H I V - 1 s t r a i n( B A - L ) a b l e t o g r o w t o h i g h t i t e r s i n m a c r o p h a g e s . I n t h e s e c e l l s , h o w e v e r , t h e a p p a r e n t m a j o r f o r m o f n e ft r a n s c r i p t c o n t a i n e d o nl y t h e f i r s t a n d t h i r d e x o n s o f t h e m u l t i p l y s p l i c e d t r a n s c r i p t s a n d a p p e a r e d t o b eg e n e r a t e d b y e i t h e r a s i n g l e o r a t r i p l e s p l i c i n g m e c h a n i s m . A s w i t h l y m p h o c y t e s , t a t - s p e c i f i c mRNAs w e r e b yf a r t h e l e a s t a b u n d a n t . I t t h u s a p p e a r s t h a t d i f f e r e n t c e l l t y p e s i n f e c t e d w i t h d i f f e r e n t s t r a i n s o f H I V - 1 m a i n t a i na s i m i l a r b a l an c e o f e x p r e s s i o n i n w h i c h t r a n s c r i p t s f o r n e f v a s t l y p r e d o m i n a t e o v e r t h o s e f o r t a t a n d t h at t h o s ef o r r e v a r e i n t e r m e d i a t e i n a b u n d a n c e .

T h e p r i m a r y f u l l - l e n g t h RNA t r a n s c r i p t o f t h e humani m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s t y p e 1 ( H I V - 1 ) , t h e e t i o l o g i c a g e n to f t h e a c q u i r e d i m m u n e d e f i c i e n c y s y n d r o m e , i s p r o c e s s e dt o m a t u r e mRNA s p e c i e s b y a c o m p l e x s e r i e s o f s p l i c i n ge v e n t s ( 2 , 1 6 ) . A s w i t h o t h e r r e t r o v i r u s e s , f u l l - l e n g t h RNA i st r a n s l a t e d i n t o t h e gag c o r e s t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d a l s o , b ya t r a n s l a t i o n a l f r a m e s h i f t , t h e p o l p r o d u c t s ( 1 2 ) , w h i l e t h ee n v mRNA i s g e n e r a t e d b y a s i n g l e s p l i c i n g e v e n t . T h e r e a r ea l s o a n u m b e r o f s m a l l e r , m u l t i p l y s p l i c e d t r a n s c r i p t s p r e s e n ti n H I V - 1 - i n f e c t e d c e l l s w h i c h c o d e f o r some o f t h e o t h e rg e n e s o f H I V - 1 , i n c l u d i n g t h e r e g u l a t o r y g e n e s t a t , r e v , a n dn e f ( 1 , 2 , 1 6 ) . T h e s e t r a n s c r i p t s c o n s i s t o f t h r e e o r moree x o n s , a n d t h e i r e x p r e s s i o n a n d t h a t o f t h e g a g - p o l a n d e n vmRNAs a r e d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e d . T h i s r e g u l a t i o n i s m e d i -a t e d b y t h e r e v g e n e , w h i c h a p p e a r s t o b i n d t o t a r g e ts e q u e n c e s w i t h i n t h e e n v g e n e a n d f a c i l i t a t e t r a n s p o r t o fmRNA f r o m t h e n u c l e u s b e f o r e m u l t i p l e s p l i c i n g o c c u r s 5 ,7 , 1 0 , 1 1 , 1 4 , 1 5 ) . I n t h e a b s e n c e o f r e v , most v i r a l RNAu n d e r g o e s m u l t i p l e s p l i c i n g b e f o r e e x i t i n g t h e n u c l e u s , a n dl i t t l e s y n t h e s i s o f v i r a l s t r u c t u r a l p r o t e i n s i s o b s e r v e d 6 ) . t a ta c t s , p o s s i b l y a t s e v e r a l d i f f e r e n t l e v e l s , t o i n c r e a s e t h eo v e r a l l l e v e l o f v i r a l RNA 4 , 6 , 2 2 ) , w h i l e n e f h a s b e e nr e p o r t e d t o h a v e a n e g a t i v e e f f e c t on t h e r a t e o f v i r a lr e p l i c a t i o n ( 1 3 , 1 7 ) .T h e b a l a n c e d e x p r e s s i o n o f t h e s e m u l t i p l y s p l i c e d t r a n -s c r i p t s i s t h u s c r i t i c a l i n r e g u l a t i n g v i r u s r e p l i c a t i o n a n d

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : P r i m a t e R e s e a r c h I n s t i t u t e , N e w M e x i c o S t a t eU n i v e r s i t y , H o l l o m a n A i r F o r c e B a s e , NM 8 8 3 3 0 .

e x p r e s s i o n . B e c a u s e o f s i m i l a r i t i e s i n s i z e , h o w e v e r , t h ea n a l y s i s o f t h e i r r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s b y N o r t h e r n( R N A ) b l o t s i s n o t f e a s i b l e . We t h e r e f o r e u n d e r t o o k t o u s et h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) t o a m p l i f y r e v e r s et r a n s c r i p t s o f s e l e c t e d r e g i o n s o f t h e s e mRNAs. T h e a m p l i -f i e d f r a g m e n t s were t h e n a n a l y z e d b y S o u t h e r n b l o t t i n g ,m o l e c u l a r c l o n i n g , a n d DNA s e q u e n c e a n a l y s e s i n o r d e r t oc h a r a c t e r i z e t h e i r c o m p o s i t i o n a n d r e l a t i v e a b u n d a n c e .

MATERIALS AND METHODSC e l l s a n d v i r u s e s . T h e H9 c e l l l i n e i n f e c t e d b y t h e HTLV- ' B s t r a i n o f H I V - 1 ( 1 8 ) was u s e d a s a s o u r c e o f RNA f r o mc h r o n i c a l l y i n f e c t e d c e l l s . V i r u s f r o m t h i s c e l l l i n e was u s e d

t o i n f e c t f r e s h p h y t o h e m a g g l u t i n i n - s t i m u l a t e d p e r i p h e r a lb l o o d l y m p h o c y t e s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 8 ) . I n f e c t e dc e l l s were h a r v e s t e d 4 8 h a f t e r i n f e c t i o n . T h e BA-L s t r a i n o fH I V - 1 , w h i c h h a s a h i g h r e p l i c a t i v e a b i l i t y i n m a c r o p h a g e s 8 ) , was u s e d t o i n f e c t f r e s h p e r i p h e r a l b l o o d m o n o c y t e -m a c r o p h a g e s a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e 8 ) . I n f e c t e d mono-c y t e - m a c r o p h a g e s were h a r v e s t e d a f t e r 1 2 t o 1 4 d a y s i nc u l t u r e . C o n t r o l c e l l s i n c l u d e d u n i n f e c t e d H9 c e l l s , u n i n -f e c t e d m o n o c y t e - m a c r o p h a g e s a f t e r 1 2 d a y s o f c u l t u r e , a n du n i n f e c t e d p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s 4 8 h a f t e r a c t i v a -t i o n w i t h p h y t o h e m a g g l u t i n i n ( 5 , u g / m l ) .N u c l e i c a c i d s . RNA was p u r i f i e d f r o m 1 0 7 t o 1 0 8 c e l l s b yd i g e s t i o n w i t h p r o t e i n a s e K ( 1 0 0 , u g / m l , 4 2 C , 9 0 m i n ) i n t h ep r e s e n c e o f 1 s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - 1 0 mM T r i s h y d r o -c h l o r i d e ( p H 7 . 4 ) - 5 mM EDTA. T h e RNA wa s e x t r a c t e dt w i c e w i t h p h e n o l - c h l o r o f o r m - i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 : 2 4 : 1 ) ( p H7 . 4 ) a n d t h e n p r e c i p i t a t e d o v e r n i g h t a t - 2 0 C b y t h e a d d i t i o n

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3 3 9 2 ROBERT-GUROFF ET A L .o f sodium a c e t a t e t o 0 . 4 5 M, f o l l o w e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 . 5volumes o f e t h y l a l c o h o l ( E t O H ) . RNA f r o m m o n o c y t e -m a c r o p h a g e s was p r e p a r e d b y t h e g u a n i d i n e i s o t h i o c y a n a t emethod ( 3 ) . The amount and q u a l i t y o f RNA we r e e s t i m a t e db y m e a s u r i n g t h e A 2 6 0 and A 2 8 0 a n d b y a n a l y z i n g a s a m p l e o na f o r m a l d e h y d e - a g a r o s e g e l a n d c o m p a r i n g t h e r e l a t i v e i n -t e n s i t i e s o f t h e b a n d s o f 1 8 S a n d 2 8 S rRNAs v i s u a l i z e d b ys t a i n i n g w i t h e t h i d i u m b r o m i d e .Fo r PCR a n a l y s e s , t h e RNA was f i r s t c o p i e d w i t h a v i a nm y e l o b l a s t o s i s v i r u s r e ve rse t r a n s c r i p t a s e ( B o e h r i n g e rMannheim B i o c h e m i c a l s , I n d i a n a p o l i s , I n d . ) i n 1 0 0 - , I u reac-t i o n m i x t u r e s c o n t a i n i n g t h e f o l l o w i n g : 1 0 mM T r i s h y d r o -c h l o r i d e ( p H 8 . 3 ) ; 5 0 mM K C l ; 1 . 5 mM M g C l 2 ; 0 . 0 1 %g e l a t i n ; 2 0 0 p , M e a c h dATP, d C T P , dGTP, a n d T T P ; 1 1 L g o fa n t i s e n s e p r i m e r ; 1 , u g o f RNA; a n d a p p r o x i m a t e l y 1 5 U o freverse t r a n s c r i p t a s e . A f t e r 1 h a t 3 7 C , 1 , u g o f sense p r i m e rand 2 . 5 U o f T a q DNA p o l y m e r a s e ( P e r k i n - E l m e r C e t u s ,N o r w a l k , C o n n . ) we r e added a n d t h e m i x t u r e was h e a t e d t o9 4 C f o r 4 m i n t o i n a c t i v a t e t h e reverse t r a n s c r i p t a s e . ThePCR was c a r r i e d o u t b y u s i n g a DNA T h e r m a l C y c l e r( P e r k i n - E l m e r C e t u s ) u n d e r c o n d i t i o n s s p e c i f i e d b y t h em a n u f a c t u r e r . R e p e t i t i v e c y c l e s c o n s i s t e d o f 1 m i n 4 5 s o fd e n a t u r a t i o n a t 9 4 C , 1 m i n 4 5 s o f a n n e a l i n g a t 4 3 C , a n d 1m i n 3 0 s o f e x t e n s i o n a t 7 2 C . A f t e r 3 0 c y c l e s , a f i n a l 4 m i no f e x t e n s i o n a t 7 2 C was c a r r i e d o u t .S a m p l e s o f t h e PCR r e a c t i o n m i x we r e a n a l y z e d b ye l e c t r o p h o r e s i s on 3 g e l s c o n t a i n i n g 3 p a r t s N u S i e v e GTGan d 1 p a r t SeaKem agarose (FMC B i o P r o d u c t s , R o c k l a n d ,M a i n e ) f o l l o w e d b y c a p i l l a r y t r a n s f e r i n 1 0 x SSC ( 1 x SSC i s0 . 1 5 M NaCl p l u s 0 . 0 1 5 M sodium c i t r a t e , pH 7 ) t o a NyTranmembrane ( S c h l e i c h e r S c h u e l l , I n c . , K e e n e , N . H . ) . DNAwas i m m o b i l i z e d b y c r o s s - l i n k i n g t o t h e membrane w i t h UVl i g h t i n a S t r a t a l i n k e r ( S t r a t a g e n e , La J o l l a , C a l i f . ) a n dh y b r i d i z e d w i t h t h e i n d i c a t e d o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . P r e h y -b r i d i z a t i o n was w i t h 6x SSC-10x D e n h a r d t s o l u t i o n - 2 0 , u go f tRNA pe r ml-50 , u g o f d e n a t u r e d s a l m o n sperm DNA pe rml f o r 4 h a t 3 7 C . H y b r i d i z a t i o n was c a r r i e d o u t f o r 1 h a troom t e m p e r a t u r e i n 6x SSC c o n t a i n i n g s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e and 1 x 1 0 6 t o 2 x 1 0 6 cpm o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b el a b e l e d w i t h [ - y - 3 2 P ] A T P b y u s i n g T4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , I n c . , G a i t h e r s b u r g , M d . )t o a s p e c i f i c a c t i v i t y o f - 1 0 9 c p m / , l g . The h y b r i d i z e d b l o t swere washed s e v e r a l t i m e s a t t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 3 7t o 5 5 C , d e p e n d i n g o n t h e p r o b e , i n 6x SSC-0.1 s o d i u md o d e c y l s u l f a t e and d e v e l o p e d b y a u t o r a d i o g r a p h y a t - 7 0 Cw i t h X-Omat f i l m ( E a s t m a n Kodak C o . , R o c h e s t e r , N . Y . ) i na c a s s e t t e , u s i n g a Q u a n t a I I I i n t e n s i f y i n g screen.Fo r c l o n i n g e x p e r i m e n t s , a m p l i f i e d f r a g m e n t s were sepa-r a t e d from u n i n c o r p o r a t e d p r i m e r s a n d p r i m e r d i m e r s b ye l e c t r o p h o r e s i s i n 1.5 agarose g e l s . T h e f r a g m e n t s werer e c o v e r e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n t o a DEAE membrane (NA-4 5 ; S c h l e i c h e r S c h u e l l ) , e l u t i o n w i t h 1 M N a C l - 1 mMEDTA-1 0 mM T r i s h y d r o c h l o r i d e ( p H 8 ) , a n d p r e c i p i t a t i o nw i t h 2 v o l u m e s o f EtOH. A f t e r t h e p r e c i p i t a t e was w a s h e dw i t h 70 EtOH, t h e a m p l i f i e d f r a g m e n t s were d i g e s t e d w i t ht h e i n d i c a t e d r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s u n d e r c o n d i t i o n ss p e c i f i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r ( B o e h r i n g e r - M a n n h e i m B i o -c h e m i c a l s , B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , o r N e w E n -g l a n d B i o L a b s , I n c . , B e v e r l y , M a s s . ) , e x t r a c t e d once w i t hp h e n o l - c h l o r o f o r m a n d o n c e w i t h c h l o r o f o r m a l o n e , andt h e n r e p r e c i p i t a t e d w i t h s a l t - E t O H . A f t e r a w a s h i n g w i t h70 EtOH, a s a m p l e c o n t a i n i n g o n e - t h i r d o f t h e p u r i f i e da m p l i f i e d f r a g m e n t s ( - 5 t o 2 0 n g ) was l i g a t e d w i t h T4 DNAl i g a s e ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) f o r 4 t o 1 6 h a t 1 2 Ci n a b u f f e r s u p p l i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r i n t o an M13 vector( P h a g e s c r i p t S K ; S t r a t a g e n e ) ( 5 0 n g ) c u t w i t h t h e a p p r o p r i a t e

r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s . s m a l l p o r t i o n ( 1 t o 2 % ) wast r a n s f e c t e d i n t o c o m p e t e n t h o s t c e l l s ( D H S a F ; B e t h e s d aR e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) a n d p l a t e d o v e r n i g h t . T h e r e s u l t a n tc l o n e s w e r e a n a l y z e d b y h y b r i d i z a t i o n w i t h t h e o l i g o m e rp r o b e s a s d e s c r i b e d b e l o w a n d b y DNA s e q u e n c e a n a l y s e su s i n g t h e d i d e o x y t e r m i n a t i o n m e t h o d ( 2 1 ) .RESULTSPCR a m p l i f i c a t i o n o f t a t , r e v , a n d n e f mRNAs. T h e s t r a t e g yf o r a n a l y z i n g t h e r e l a t i v e l e v e l s o f e x p r e s s i o n o f m u l t i p l ys p l i c e d H I V - 1 mRNAs was t o f i r s t s y n t h e s i z e cD NA f r o mRNA f r o m i n f e c t e d c e l l s , u s i n g t h e a n t i s e n s e p r i m e r s h o w ni n F i g . 1 , a n d t h e n t o a m p l i f y t h e c D N A b y t h e PCRt e c h n i q u e , u s i n g t h e o r i g i n a l p r i m e r a n d t h e s e n s e p r i m e rs h o w n i n F i g . 1 . T h e PCR e x t e n s i o n t i m e was s u f f i c i e n t l ys h o r t ( 1 m i n 3 0 s ) t o p r e c l u d e s i g n i f i c a n t a m p l i f i c a t i o n o f t h ea p p r o x i m a t e l y 8 - k i l o b a s e s e g m e n t p r e s e n t b e t w e e n t h e s et w o p r i me rs o n v i r a l DNA. T h e mRNAs f o r t a t , r e v , a n d n e fw o u l d b e e x p e c t e d t o c o n t a i n l e s s t h a n 1 k i l o b a s e b e t w e e nt h e p r i m e r b i n d i n g s i t e s . T h e a m p l i f i e d mRNAs were t h e na n a l y z e d b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d S o u t h e r n b l o t t i n g , u s i n gs p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s . P r o b e s s p e c i f i c f o r t h e n e f

p l u s r e v p l u s t a t m i d d l e e x o n ( F i g . 1 , D 3 ) , r e v p l u s t a t ( D 2 ) ,a n d t a t a l o n e ( D l ) w e r e d e s i g n e d o n t h e b a s i s o f p r e v i o u ss t u d i e s o f H I V - 1 mRNA s t r u c t u r e 2 , 1 6 , 2 0 ) . T h e p r o b e sw e r e h y b r i d i z e d i n t h e o r d e r D 1 - D 2 - D 3 t o d e t e c t , r e s p e c -t i v e l y , t a t , r e v , a n d n e f . P r o b e s w e r e a l s o u s e d f o r t h e t w os m a l l u p s t r e a m e x o ns r e p o r t e d b y M u e s i n g e t a l . ( 1 6 ) ( F i g . 1 ,e x o n s B a n d C ) a n d t h e 3 - t e r m i n a l e x o n ( E ) .S o u t h e r n b l o t s o f a m p l i f i e d cD NA f r o m H9 c e l l s c h r o n i -c a l l y i n f e c t e d w i t h t h e H T L V - I I I B s t r a i n o f H I V - 1 wereh y b r i d i z e d w i t h t h e d i f f e r e n t p r o b e s . T h e m o s t p r o m i n e n tb a n d d e t e c t e d w i t h t h e t a t - s p e c i f i c p r o b e w a s a p p r o x i m a t e l y5 8 0 b a s e p a i r s ( b p ) . T h i s b a n d s o m e t i m e s a p p e a r e d a s ac l o s e l y s p a c e d d o u b l e t . T h e m a i n r e v - s p e c i f i c b a n d was a t4 0 0 b p a n d w a s o n l y s l i g h t l y r e s o l v e d f r o m t h e m a i n n e f -s p e c i f i c b a n d a t 3 8 0 b p . O t h e r , f a i n t b a n d s o f l a r g e r s i z e sh y b r i d i z i n g w i t h t h e s e p r o b e s a l s o h y b r i d i z e d w i t h p r o b e sf o r t h e s m a l l u p s t r e a m e x o n s B a n d C . A s m a l l e r b a n d ,w h i c h w a s s o m e t i m e s e v i d e n t b y e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n i n gb u t w h i c h f a i l e d t o h y b r i d i z e w i t h a n y o f t h e p r e v i o u sp r o b e s , w a s l a b e l e d w i t h a p r o b e f o r e x o n E . By t h e p a t t e r no b t a i n e d b y s t a i n i n g w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , t h e n e f - s p e c i f i cb a n d a p p e a r e d b y f a r t h e m o s t a b u n d a n t , a n d t h e t a t - s p e c i f i cb a n d w a s b y f a r t h e l e a s t a b u n d a n t . T h i s w a s f u r t h e rd e m o n s t r a t e d b y h y b r i d i z a t i o n w i t h t h e e x o n E p r o b e c o m -mo n t o a l l t h e a mp l if i ed b a n d s ( F i g . 2 , l a n e a ) . A m p l i f i e dRNA f r o m a c u t e l y i n f e c t e d p e r i p h e r a l b l o o d T l y m p h o c y t e sg a v e a p a t t e r n s u b s t a n t i a l l y s i m i l a r t o t h a t f r o m t h e i n f e c t e dH9 c e l l s ( n o t s h o w n ) .T h e p a t t e r n o f e x p r es s i o n o f t h e s ma ll m u l t i p l y s p l i c e dmRNAs i n a c u t e l y i n f e c t e d m a c r o p h a g e s w a s a l s o e x a m -i n e d . T h e BA-L s t r a i n o f H I V - 1 , w h i c h i s h i g h l y r e p l i c a t i v ei n m a c r o p h a g e s , w a s u s e d t o i n f e c t f r e s h p e r i p h e r a l b l o o dm o n o c y t e - m a c r o p h a g e s . RNA w a s p u r i f i e d 1 2 t o 1 4 d a y sa f t e r i n f e c t i o n , a n d P C R - a m p l i f i e d cDNAs w e r e p r e p a r e da n d a n a l y z e d b y S o u t h e r n b l o t t i n g a n d m o l e c u l a r c l o n i n g i nM 1 3 . T h e S o u t h e r n b l o t s d i f f e r e d f r o m t h o s e o f t h e H9 a n dl y m p h o c y t e c D N A p r i m a r i l y b y t h e p r e s e n c e a f t e r e t h i d i u mb r o m i d e s t a i n i n g o f a p r e d o m i n a n t b a n d o f a r e l a t i v e l y s m a l ls i z e ( - 3 2 0 b p ) w h i c h h y b r i d i z e d o n l y w i t h t h e p r o b e f o re x o n E ( F i g . 2 , l a n e c ) a n d a c o n c o m i t a n t d e c r e a s e i n t h er e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h e 3 8 0 - b p n e f - s p e c i f i c b a n d .DN A s e q u e n c e a n a l y s e s o f a m p l i f i e d c D N A s . I n o r d e r t oc o n f i r m t h e i n f e r r e d s t r u c t u r e s o f t h e a mp l i f ie d cDNAs, t h e

J . V I R O L .

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3/8

H I V - 1 t a t , r e v , AND n e f mRNA STRUCTURE AND EXPRESSION 3 3 9 3[Proviral DN A1 2 3 4 5 6 7 8 9

A

2 1 3 - 1: 1

5'-CCTAAAGAATTCGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCE c o R I S s t l

2 3 3 -G - 3 '

3

B C D 1 E

D38 4 8 1 6 3 C l a lCTAACACCTTGAAGACCCTGCGTTAGCTATAAGC-58 0 3 9 - 8 0 6 4 -GGTAATCACTTGCCTAGGAACCGTG-5'

5 5 5 7 - 5 5 7 5 -3 - C T T C T T C G C C T C T G T C G C T - 5 ( n e f + r e v + t a t )5 5 3 6 - 5 5 5 9 -3'-GAATCCGTAGAGGATACCGTCCTT-5' ( r e v + t a t )

5 3 6 1 - 5 3 8 4 -3-ACCCACAGCTGTATCGTCTTATCC-5 t a t )5 4 5 3 - 5 4 7 2 -

3'-CCTTCAGTCGGATTCTGA-5'5 0 0 9 - 5 0 2 6 -3 - C G G G A T C C A CA C T T A T A G - 5

4 5 2 5 - 4 5 4 2 --GTTTCGAGGAGACCTTTC-5'

V i r a l RN A

A m p l i f i c a t i o nP r i m e r s

O l i g n u c l e o t i d eP r o b e s

F I G . 1 . O l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s a n d p r o b e s . T h e o l i g o n u c l e o t i d e s w h o s e s e q u e n c e s a r e i n d i c a t e d w e r e s y n t h e s i z e d o n a m o d e l 3 8 1 A DNAs y n t h e s i z e r ( Ap p l i ed B i o sy s t em s ). A l l PCR a m p l i f i c a t i o n s w e r e p e r f o r m e d b y u s i n g t h e b a s e 8 0 3 9 t o 8 1 6 4 o l i g o me r a s t h e p r i m e r f o r t h er e v e r s e t r a n s c r i p t i o n s t e p . T h e b a s e 2 1 3 t o 2 3 3 p r i m e r w a s a d d e d w i t h t h e T a q p o l y m e r a s e f o r t h e a m p l i f i c a t i o n c y c l e s . E x o n s D l , D 2 , a n dD3 r e p r e s e n t , r e s p e c t i v e l y , t h e f i r s t c o d i n g e x o n s f o r t a t a n d r e v a n d t h e m i d d l e e x o n o f t h e d o u b l y s p l i c e d n e f mRNA. T h e p r o b e s f o r b a s e s5 3 6 1 t o 5 3 8 4 o r 5 4 5 3 t o 5 4 7 2 , 5 5 3 6 t o 5 5 3 9 a n d 5 5 5 7 t o 5 5 7 5 w e r e u s e d i n s e q u e n t i a l h y b r i d i z a t i o n s t o a m p l i f i e d DNA t o d e t e c t t a t , r e v p l u st a t , a n d n e f p l u s r e v p l u s t a t , r e s p e c t i v e l y . T h e s m a l l u p s t r e a m e x o n s ( B a n d C ) w e r e d e t e c t e d w i t h t h e p r o b e s f o r b a s e s 4 5 2 5 t o 4 5 4 2 a n d 5 0 0 9t o 5 0 2 6 . T h e s e c o n d c o d i n g e x o n f o r r e v a n d t a t a n d t h e f i r s t c o d i n g e x o n f o r n e f ( ex o n E ) w e r e d e t e c t e d w i t h t h e p r o b e f o r b a s e s 8 0 3 9 t o 8 0 6 4 .T h e b o x es o n t h e p r o v i r a l DNA r e p r e s e n t t h e l o n g t e r m i n a l r e p e a t r e g i o n s . T h e n u m b e r i n g s y s t e m i s t h a t o f R a t n e r e t a l . ( 1 9 ) .u n i nc o r p o r at e d p r i me r s w e r e r e m o v e d b y g e l e l e c t r o p h o r e -s i s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s a n d t h e PCRp r o d u c t was d i g e s t e d w i t h C l a I a n d E c o R I a n d c l o n e d i n t ot h e s a m e s i t e s i n t h e p o l y l i n k e r o f M1 3 P h a g e s c r i p t ( S t r a t a -

a . b . c .

492- f t3 6 9 - 2 4 6 -

F I G . 2 . S o u t h e r n b l o t a n a l y s i s o f cDNAs o f m u l t i p l y s p l i c e dH I V - 1 mRNAs. RNA was p u r i f i e d f r o m H9 c e l l s i n f e c t e d w i t hH T L V - I I I B ( l a n e a ) , u n i n f e c t e d H9 c e l l s ( l a n e b ) , o r f r e s h p e r i p h e r a lb l o o d m o n o c y t e - m a c r o p h a g e s i n f e c t e d w i t h H I V - 1 ( B A - L ) ( l a n e c ) .F i f t e e n m i c r o l i t e r s f r o m s t a n d a r d PCR r e a c t i o n s was a n a l y z e d b yS o u t h e r n b l o t t i n g a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s a n dh y b r i d i z e d t o t h e p r o b e f o r exon E ( F i g . 1 ) . T h e p o s i t i o n s o f DNAm a r k e r s i n a 1 2 3 - b p l a d d e r ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ) a r ei n d i c a t e d ( i n b a s e p a i r s ) a t t h e l e f t .

g e n e ) . P l a q u e s h y b r i d i z i n g t o c o m b i n a t i o n s o f p r o b e s c o r r e -s p o n d i n g t o p a t t e r n s s e e n w i t h d i f f e r e n t b a n d s o n t h e S o u t h -e r n b l o t s w e r e g r o w n a n d a n a l y z e d b y DNA s e q u e n c i n g ,u s i n g T t r a c k i n g . S a m p l e s y i e l d i n g i d e n t i c a l T t r a c k s w e r eg r o u p e d , a n d i n d i v i d u a l m e m b e r s o f e a c h g r o u p w e r e a n a -l y z e d b y s t a n d a r d DNA s e q u e n c i n g .DNA s e q u e n c e d a t a c o n f i r m e d t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e5 8 0 - , 4 0 0 - , a n d 3 8 0 - b p b a n d s r e p r e s e n t e d mRNAs c o n t a i n i n gt h r e e e x o n s a n d a b l e t o c o d e f o r t a t , r e v , a n d n e f , r e s p e c -t i v e l y ( r e p r e s e n t e d a t t h e t o p o f F i g . 3 ) . T h e d a t a , c o n s i s t e n tw i t h a n e a r l i e r r e p o r t ( 2 0 ) , r e v e a l e d a mRNA d i s t i n c t f r o mt h a t o f t a t a n d a b l e t o c o d e f o r r e v . I n a d d i t i o n , t h e y a l l o w e dt h e p r e c i s e a s s i g n m e n t o f i t s s p l i c e j u n c t i o n . B a s e 2 8 7 ( u s i n gt h e n u m b e r i n g s y s t e m o f R a t n e r e t a l . [ 1 9 ] ) was j o i n e d t ob a s e 5 5 3 6 , 1 5 b a s e s u p s t r e a m f r o m t h e r e v i n i t i a t i o n c o d o n( F i g . 3 ) . F o u r o f f o u r cDNAs s e q u e n c e d h a d t h e same s p l i c ej u n c t i o n . T wo t a t cDNAs s e q u e n c e d were i d e n t i c a l t o t h e t a tc D N A p r e v i o u s l y r e p o r t e d 2 , 1 6 ) .T h e DNA s e q u e n c e d a t a a l s o i n d i c a t e d a g r e a t d e a l o fd i v e r s i t y i n t r a n s c r i p t s a b l e t o c o d e f o r n e f . T wo o f t h e s es t r u c t u r e s ( F i g . 4 ) h a v e b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d ( 2 , 1 6 ) .One c o n s i s t e d o f t h r ee e x o n s ( A , D 3 , a n d E ) . The f i r s t exonwas j o i n e d a t b a s e 2 8 7 t o t h e m i d d l e exon a t b a s e 5 5 5 7 , a n dt h e m i d d l e e x o n was j o i n e d a t b a s e 5 6 3 5 t o t h e t h i r d e x o n ,w h i c h c o n t a i n s t h e n e f - c o d i n g r e g i o n , a t b a s e 7 9 5 6 . A s e c o n ds t r u c t u r e was i d e n t i c a l e x c e p t f o r t h e p r e s e n c e o f a s m a l le x o n ( C ) , d e r i v e d f r o m b a s e s 4 9 6 9 t o 5 0 4 3 i m m e d i a t e l yu p s t r e a m f r o m t h e v p r r e a d i n g f r a m e , b e t w e e n t h e a n d D3e x o n s . T h e o t h e r t h r e e n e f - s p e c i f i c cDNAs a n a l y z e d , a l s o

V O L . 6 4 , 1 9 9 0

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4/8

3 3 9 4 ROBERT-GUROFF ET A L .

LID L p r o v i r a l DN At a t - 1 mRNA

1 5 3 5 7

r e v - 1 mR NA_e f - i mRNA2 8 7 5 5 5 7 5 6 2 5 7 9 5 6C o d i n g e x o n 1 o f r e v - 1 a n d t a t - 15 3 4 2 t a t S AI VGTTTATCCATTTTCAGAATTGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGTTACTCGACAGAGGAGAGCAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGt a t M E P V D P R L E P W K H P G S 0CCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTP K T A C T N C Y C K K C C F H C 0 V C

n e f SAVTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAF T K A L G S Y G R K K R R 0 R R Rr e v M A G R S G D S D E DSD 5 6 3 2VCCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGTAAGTAP P 0 G S 0 T LH 0 V S L S K 0L L K A V R L K F L Y 0 S

r e v - 1 mRNA2 8 7 S J 5 5 3 6VTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGCTTAGGCATCTCCT

ATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGM A G R S G D S D E D L L K A V R L K5 6 2 5 S J 7 9 5 6VTTTCTCTATCAAAGCAACCCACCTCCCAACCCCGGGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATF L Y 0 S N P P P N P G G T R 0 A R R N

AGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCR R R R W R E R 0 R 0 H S S E RF I G . 3 . N u cl e o t id e s e q u e n c e a n d s p l i c e j u n c t i o n s o f r e v c D N A c l o n e s f r o m H T L V - I I I B . T h e s t r u c t u r e s o f d o u b l y s p l i c e d . mRNAs f o r t a t ,r e v , a n d n e f a r e s h o w n a t t h e t o p . T h e m i d d l e e x o n s o f p r e v i o u s l y c h a r a c t e r i z e d d o u b l y s p l i c e d mR NAs f o r t a t a n d n e f a r e s h o w n , w i t h t h es p l i c e j u n c t i o n s i n d i c a t e d b y b a s e n u m b e r ( 1 9 ) . T h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f f o u r d i f f e r e n t c l o n e s o f r e v - s p e c i f i c c D N A a r e s h o w n a t t h eb o t t o m .

s h o w n i n F i g . 4 , l a c k e d t h e m i d d l e ( D 3 ) e x o n a n d d i f f e r e ds l i g h t l y i n t h e i r s p l i c e j u n c t i o n s . O n e c D N A c o n s i s t e d o fe x o n A j o i n e d a t b a s e 2 8 7 t o b a s e 7 9 5 6 o f e x o n E , w h i l ea n o t h e r w a s s p l i c e d f r o m b a s e 2 6 9 t o b a s e 7 9 5 6 . T h e t h i r dc D N A was s p l i c e d f r o m a p p r o x i m a t e l y b a s e 3 2 5 t o b a s e8 0 1 3 ; t h e p r e c i s e j u n c t i o n i s i m p o s s i b l e t o a s s i g n b e c a u s e o fa r e p e a t s e q u e n c e (G GAGAGAGA) p r e s e n t a t b o t h b as es3 2 5 a n d 8 0 1 3 . O n l y o n e e x a m p l e o f t h i s c D N A was f o u n d ,a n d i t may t h e r e f o r e r e p r e s e n t a c l o n i n g o r PCR a r t i f a c t .R e l a t i v e l e v e l s o f t a t - , r e v - , a n d n e f - s p e c i f i c t r a n s c r i p t s . I no r d e r t o b e t t e r q u a n t i t a t e t h e r e l a t i v e l e v e l s o f e x p r e s s i o n o fe a c h o f t h e s e mRNAs, we a n a l y z e d a l a r g e n u m b e r o f M1 3c l o n e s o f a m p l i f i e d RNA f r o m t h e i n f e c t e d H9 c e l l s . T h ec l o n e s w e r e p l a t e d o u t a n d h y b r i d i z e d w i t h t h e s a m e p r o b e su s e d f o r t h e S o u t h e r n b l o t s . T h i s p r o c e d u r e , t o g e t h e r w i t ht h e DNA s e q u e n c e d a t a , a l l o w e d t h e a n a l y s i s a n d e n u m e r -a t i o n o f i n d i v i d u a l a m p l i f i e d mRNAs. T h e r e s u l t s ( F i g . 5 )a g r e e d w i t h t h e S o u t h e r n b l o t r e s u l t s , s u g g e s t i n g t h a t n e f -s p e c i f i c t r a n s c r i p t s a r e t h e m o s t a b u n d a n t o f t h e s e s m a l l v i r a lmRNAs.O f a t o t a l o f 1 6 9 c l o n e s e x a m i n e d , 1 3 4 ( 7 9 % ) h a d s t r u c -

t u r e s s i m i l a r t o t h o s e o f t h e n e f cDNAs a n a l y z e d b y DNAs e q u e n c i n g . T h e y i n c l u d e d c l o n e s w i t h t h r e e e x o n s ( A , D 3 ,a n d E ) ( 6 0 ) , two e x o n s ( A a n d E ) ( 1 4 ) , a n d f o u r e x o n s ,e i t h e r A , B , D 3 , a n d E ( 2 % ) o r A , C , D 3 , a n d E ( 4 ) .T h i r t y - t w o c l o n e s ( 1 9 % ) w e r e r e v s p e c i f i c a n d i n c l u d e d twoc l o n e s w i t h f o u r e x o n s ( A , B o r C , D 2 , a n d E ) a n d o n e c l o n ew i t h f i v e e x o n s ( A , B , C , D 2 , a n d E ) . O n l y t h r e e t a t c l o n e s( 2 % ) w e r e o b s e r v e d ; a l l h a d t h e s t r u c t u r e A - D 1 - E .A s i m i l a r a n a l y s i s o f t h e c D N A c l o n e s f r o m m a c r o p h a g e si n f e c t e d w i t h a d i f f e r e n t H I V - 1 s t r a i n ( B A - L ) s h o w e d t h a tt h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f n e f - , r e v - , a n d t a t - s p e c i f i c mRNAsa p p r o x i m a t e d t h a t o f t h e H9 c e l l s . O f a t o t a l o f 3 5 5 c D N Ac l o n e s e x a m i n e d , 77 w e r e s p e c i f i c f o r n e f , 20 f o r r e v , a n d3 f o r t a t ( F i g . 5 ) . I n c o n t r a s t t o t h e H9 c l o n e s , h o w e v e r ,t h e m a j o r i t y o f t h e n e f - s p e c i f i c c l o n e s ( 2 0 4 o f 2 7 4 ) c o n t a i n e do n l y two e x o n s ( A a n d E ) . From t h e s e d a t a , i t i s a p p a r e n tt h a t t h e t w o e x o n n e f cDNAs a r e r e p r e s e n t e d b y t h e i n t e n s e3 2 0 - b p b a n d o b s e r v e d i n S o u t h e r n b l o t s o f c D N A f r o mi n f e c t e d m a c r o p h a g e s . None o f t h e n e f - , r e v - , o r t a t - s p e c i f i cc l o n e s i n i n f e c t e d m a c r o p h a g e s w e r e f o u n d t o c o n t a i n e i t h e ro f t h e u p s t r e a m e x o n s B o r C .

J . V I R O L .

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H I V - 1 t a t , r e v , AND n e f mRNA STRUCTURE AND EXPRESSION 3 3 9 5n e t - 1

c o d i n g r e g i o n V i r a l RN An e f - I mRNA v a r i n t B

p N e f ( 3 B ) 32 8 7 5 5 5 7 5 6 2 5 7 9 5 6

p N e t ( 3 B ) - 1 02 8 7 4 9 6 9 5 5 5 7 5 6 2 5 7 9 5 65 0 4 387 = - p N e f M - L ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ p e B - ) - lp N e t B A - L ) - 3

p N e f 3 B 8 - 1 52 8 7 3 25 4 9 70

GAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGAGTG p N o f 3 8 ) . 3It i i t i l l i l l i l i 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 l i i i i l i l l i l i l t i l l|| W @ e | @ 8 e | g g g | g X pGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCT TGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGAGTG ACTCTGCTATAAGAAAGGCCT TATTAGG p N I e 3 B 9 1 0GAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAA GCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGAGTG p N e f B A - L U -GAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAA GCGCACGGCAAGAG Ne(BAL3t i C T l t G G C T T G C T G A A G C G C G C AlGlAGGl G GT CGllCCl GGCT GpttLFGAGCTCTCTCGACGCA^AGAC TCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGAGTGGTGAGTACGCCAAAAAT T TTGACTAGCGGAGGCTAGAA 5 N @ f ( 3 8 ) - 1 55 0 4 3 5 5 5 7 5 6 2 5 7 9 5 6GAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCA ACCCACCTCCCACACATAGT TAGCCCTAGGTGTGAATATCAAGCAGGACATAACAAG GAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCA ACCCACCTCCC111111111ACCCACCTCCCCCCCCTCCC8 0 1 3 p 1 4 3 1 3 8 1 1 5AACCCCGGGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCC p N 5 8 ( 3 8 ) 3AACCCCGGGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCC pN*f(3810

lI HI 1 1 1I IIIIAGCCTCGAGGGGACCCGACAGGCCCGGAGGAATCGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGTTCCGGTCCATTAGTGAACGGATTC p N e l ( B A L - lAGCCTCGAGGGGACCCGACAGGCCCGGAGGAATCGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGTTCCGGTCCATTAGTGAACGGATTC p N e 1 ( B A - L ) - 3

GGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCC p N e t 3 8 I - 1 5F I G . 4 . S t r u c t u r e s o f mRNAs p o t e n t i a l l y e n c o d i n g n e f . M1 3 c lo ne s o f n e f - s p e c i f i c c D N A f r o m e i t h e r H T L V - I I I B o r H I V - 1 ( B A - L ) weres e l e c t e d f r o m P C R - g e n e r a t e d l i b r a r i e s on t h e b a s i s o f a l a c k o f h y b r i d i z a t i o n t o t h e t a t - a n d r e v - s p e c i f i c o l i g o m e r s a n d t h e a b i l i t y t o h y b r i d i z e

t o t h e p r o b e f o r ex o n E ( F i g . 1 ) . T h e DNA sequenc es o f s e l e c t e d c D N A c l o n e s , d e t e r m i n e d as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , ar e s h o w na b o v e . C l o n e s pNef ( 3 B ) - 3 , - 1 0 , a n d - 1 5 were f r o m H T L V - I I I B a n d p N ef ( B A- L ) - 1 a n d - 3 were f r o m H I V - 1 ( B A - L ) . The exon s t r u c t u r e s o ft h e c o r r e s p o n d i n g mRNAs i n f e r r e d f r o m t h e c D N A n u c l e o t i d e sequenc es ar e shown a b o v e . T h e wavy l i n e r e p r e s e n t t h e p o l y ( A ) t r a c t s o f t h ev i r a l RNAs.

DISCUSSIONWe h a v e u s e d t h e PCR t e c h n i q u e t o s e l e c t i v e l y a m p l i f yt h e s m a l l , m u l t i p l y s p l i c e d mRNA s p e c i e s f r o m H I V - 1 -i n f e c t e d l y m p h o c y t e s a n d m o n o c y t e - m a c r o p h a g e s a n d ana-l y z e t h e r e l a t i v e l e v e l s o f t a t - , r e v - , a n d n e f - s p e c i f i c t r a n -s c r i p t s . We b a s e o ur c o n c l u s i o n s on t h e a s s u m p t i o n t h a t a l lt r a n s c r i p t s ar e a m p l i f i e d w i t h e q u a l e f f i c i e n c y . T h i s assump-t i o n d o e s n o t seem u n r e a s o n a b l e i n v i e w o f t h e f a c t t h a t a l lt h e t r a n s c r i p t s d e s c r i b e d h e r e ar e a m p l i f i e d w i t h t h e same

primer p a i r s . The a m p l i f i e d RNA was a n a l y z e d b y S o u t h e r nb l o t t i n g a n d s e q u en t i al h y b r i di z a ti o n , using o l i g o n u c l e o t i d ep r o b e s s p e c i f i c f o r t a t , t a t p l u s r e v , a n d t a t p l u s r e v p l u s n e f .S o u t h e r n b l o t s o f a m p l i f i e d RNA from H9 c e l l s c h r o n i c a l l yi n f e c t e d w i t h t h e H T L V - I I I B s t r a i n o f H I V - 1 showed t h a t t h es i z e s o f t h e p r e d o m i n a n t a m p l i f i e d u n i t s f o r t a t , r e v , and n e fwere 5 8 0 , 4 0 0 , a n d 3 8 0 b p , r e s p e c t i v e l y . T h i s would corre-s p o n d t o o r i g i n a l t r a n s c r i p t s i z e s o f a p p r o x i m a t e l y 1 , 8 2 0 ,1 , 6 4 0 , a n d 1 ,6 2 0 b p , r e s p e c t i v e l y , n o t i n c l u d i n g t h e p o l y ( A )t r a c t . E t h i d i u m b r o m i d e s t a i n i n g o f g e l s o f t h e a m p l i f i e dDNA s u g g e s t e d t h a t n e f was b y f a r t h e most abundantt r a n s c r i p t and t h a t t h e t a t t r a n s c r i p t was p r e s e n t a t r e l a t i v e l yl o w l e v e l s . A s i m i l a r p a t t e r n was o b s e r v e d when mRNAsf r o m f r e s h p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s i n f e c t e d w i t h

H T L V - I I I B a n d h a r v e s t e d 4 8 h a f t e r i n f e c t i o n were s i m i l a r l ya n a l y z e d .The i d e n t i t i e s o f t h e p u t a t i v e t a t , rev, a n d n e f t r a n s c r i p t sw er e v e r i f i e d b y c l o n i n g t h e a m p l i f i e d mRNAs i n t o M 1 3 ,s e l e c t i n g i n d i v i d u a l c l o n e s on t h e b as i s o f t h e i r p a t t e r n s o fh y b r i d i z a t i o n t o t h e d i f f e r e n t p r o b e s , and d e t e r m i n i n g t h e i rDNA sequences. The n u c l e o t i d e sequences o f t h e 5 8 0 - and3 8 0 - b p f r a g m e nt s c o r r e s p o n d e d t o t h o s e o f p r e v i o u s l y d e -s c r i b e d cD NAs s y n t h e s i z i n g t a t a n d n e f , r e s p e c t i v e l y ( 1 ) .Each f r a g m e n t i s d e r i v e d f r o t n a d o u b l y s p l i c e d mRNAc o n t a i n i n g t h r e e exons. T he 4 0 0 - b p f r a g m n e n t r e p r e s e n t s ad o u b l y s p l i c e d mRNA whose u p s t r e a m s p l i c e j u n c t i o n i s j u s tu p s t r e a m o f t h e i n i t i a t i o n c o d o n f o r rev. T h i s f i n d i n g con-f i r m s an e a r l i e r r e p o r t ( 2 0 ) o f a u n i q u e mRNA f o r r e v whichi s d i s t i n c t f r o m t h a t f o r t a t and maps t h e s p l i c e j u n c t i o n asb e i n g from b a s e 2 8 7 t o b a s e 5 5 3 6 , f o l l o w i n g t h e n u m b e r i n gs y s t e m o f R a t n e r e t a l . ( 1 9 ) .I n a d d i t i o n , s e v e r a l o t h e r a p p a r e n t forms o f r e v and n e fmRNAs were f o u n d . They c o n t a i n e d f o u r o r f i v e exo n s an di n c l u d e d o ne o r b o t h o f t wo s m a l l u p s t r e a m ex o ns d e s c r i b e db y M u e s i n g e t a l . ( 1 6 ) . T he more u p s t r e a m of t h e s e exons i sj u s t 5 t o t h e i n i t i a t i o n s i t e f o r v i f . T h e more downstream o ft h e two l i e s j u s t 5 o f t h e i n i t i a t i o n s i t e f o r v p r . I t i s p o s s i b l e

V O L . 6 4 , 1 9 9 0

p N e f I 3 8 3

p N * f I B A - L ) - lp N * f 8 A - L U - 3

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3 3 9 6 ROBERT-GUROFF ET AL.r e v -

t a t _v p rv i f

4 U U L 6

3 5 7 562D l

5 5 3 6 5 6 2 5R n C t E D2O B 5 5 5 7 5 6 2 5tiD3

_ r evU t a t

n efV i r a lRN A

E

R e l a t i v e E x p r e s s i o n o f t a t , r e v , an d n e f i n :

H9/HTLV-IIIB /n e f ( 7 9 % )

rev ( 1 9 % )

t a t ( 2 % )

M 0 / B A - Ln e f ( 7 7 % )

r e v ( 2 0 % ) _ II

l o T o t a l1 46 024

1 70 . 60 . 60 . 62

572 0

2 0

t a t ( 3 % ) 1 1 1 1 2 3F I G . 5 . R e l a t i v e a b u n d a n c e o f t a t - , r e v - , a n d n e f - s p e c i f i c t r a n s c r i p t s i n H I V - 1 - i n f e c t e d T c e l l s a n d m a c r o p h a g e s . M1 3 c l o n e s were p l a t e da n d c h a r a c t e r i z e d b y h y b r i d i z a t i o n a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s t o a s e r i e s o f o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s s p e c i f i c f o r d i f f e r e n t e x o n s ,r e p r e s e n t e d b y o p e n , c l o s e d , p a r t i a l l y c l o s e d , o r h a t c h e d b a r s , a s i n d i c a t e d a t t h e t o p . T h e p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l c l o n e s a n a l y z e d w h i c h a r es p e c i f i c f o r n e f , r e v , a n d t a t i s g i v e n o n t h e l e f t ; t h e p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l t r a n s c r i p t s w i t h e a ch o f t h e i n d i c a t e d s t r u c t u r e s i s g i v e n o n t h er i g h t . T h e n a r r o w b a r s s h o w n a b o v e t h e v i r a l RNA s h o w t h e p o s i t i o n s o f t h e r e a d i n g f r a m e s f o r v i f , v p r , t a t , r e v , a n d n e f . T h e n u m b e r s a r et h e n u c l e o t i d e p o s i t i o n s g i v e n b y R a t n e r e t a l . ( 1 9 ) .

t h a t t h e RNAs c o n t a i n i n g t h e s e exo n s were f i r s t s p l i c e d t of o r m t r a n s c r i p t s f o r v i f and vpr a n d t h e n , b e f o r e e x i t i n g t h en u c l e u s , u n d e r w e n t a s u b s e q u e n t s p l i c i n g s t e p w h i c h r e -moved t h e v i f - a n d v p r - c o d i n g r e g i o n s , f o r m i n g r e v a n d n e fmRNAs i n s t e a d .I n o r d e r t o more p r e c i s e l y q u a n t i t a t e t h e r e l a t i v e expres-s i o n l e v e l s o f t a t , r e v , a n d n e f mRNAs, t h e M13 c l o n e s o f t h ea m p l i f i e d f r a g m e n t s were p l a t e d a n d s e q u e n t i a l l y h y b r i d i z e d

t o t h e b a t t e r y o f o l i g o m e r p r o b e s . N e a r l y 8 0 a n d 20 o f t h ec l o n e s o f a m p l i f i e d cDNA r e p r e s e n t e d n e f - a n d r e v - s p e c i f i ct r a n s c r i p t s , r e s p e c t i v e l y . O n l y 3 o f 1 6 9 c l o n e s a n a l y z e d weref r o m t a t mRNA.S o u t h e r n b l o t s o f t h e a m p l i f i e d mRNA from m a c r o p h a g e si n f e c t e d w i t h t h e BA-L s t r a i n o f HIV-1 c o n t a i n e d , i n a d d i -t i o n t o b a n d s c o r r e s p o n d i n g t o t h e main t a t - , r e v - , a n dn e f - s p e c i f i c f r a g m e n t s n o t e d w i t h a m p l i f i e d RNA from

IA

- , ~ ~ ~ ~ ~ ~ \ \ l l l l l l l

J . V I R O L .

F M

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H I V - 1 t a t , r e v , AND n e f mRNA STRUCTURE AND EXPRESSION 3 3 9 7H T L V - I I I B - i n f e c t e d H9 c e l l s , a p r e d o m i n a n t b a n d o f a p -p r o x i m a t e l y 3 2 0 b p . T h i s b a n d h y b r i di z e d w i t h a p r o b e f o rt h e t h i r d e x o n ( F i g . 1 , e x o n E ) o f t h e d o u b l y s p l i c e d v i r a lmRNA b u t f a i l e d t o h y b r i d i z e w i t h a p r o b e f o r t h e m i d d l ee x o n . T h e a p p a r e n t t a t - s p e c i f i c b a n d , a s w i t h t h e a mp l i fi e di n f e c t e d H9 c e l l RNA, w a s r e l a t i v e l y q u i t e f a i n t .DNA s e q u e n c e a n a l ys es o f t h e a m p l i f i e d t r a n s c r i p t sc l o n e d i n t o M1 3 s h o w e d t h a t t h e p u t a t i v e t a t , r e v , a n d l a r g e rn e f t r a n s c r i p t s c o r r e s p o n d e d p r e c i s e l y t o t h e t h r e e e x o nf o r m s w h i c h c o n s t i t u t e d t h e p r e d o m i n a n t t a t , r e v , a n d n e ft r a n s c r i p t s o f t h e i n f e c t e d H9 c e l l s . I n a d d i t i o n , f r a g m e n t sw h i c h d i d n o t h y b r i d i z e t o a n y o f t h e p r o b e s f o r t h e m i d d l ee x o n w e r e f o u n d t o c o n t a i n o n l y t h e f i r s t a n d t h i r d e x o n s o ft h e d o u b l y s p l i c e d mRNAs. M o s t w e r e s p l i c e d f r o m t h em a j o r s p l i c e d o n o r a t b as e 2 8 7 t o t h e m a j o r s p l i c e d o n o r a tb a s e 7 9 5 6 , b u t s o m e h e t e r o g e n e i t y w a s e v i d e n t . T h e s ecDNAs w o u l d c o r r e s p o n d t o a mRNA o f a p p r o x i m a t e l y1 , 5 5 0 b p . I t i s n o t c l e a r w h e t h e r t h e s e t w o e x o n n e f mRNAsa r e f o r m e d b y a s i n g l e s p l i c i n g s t e p o r w h e t h e r t h e y i n s t e a da r e f o r m e d b y a t h i r d s p l i c i n g s t e p w h i c h r e m o v e s t h e m i d d l ee x o n o n t h e d o u b l y s p l i c e d t r a n s c r i p t s .H y b r i d i z a t i o n o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r o b e s t o p l a q u e l i f t so f p l a t e d M1 3 c l o n e s o f t h e a m p l i f i e d RNA f r o m i n f e c t e dm a c r o p h a g e s a l l o w e d q u a n t i t a t i o n o f t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o no f t r a n s c r i p t s f o r t a t , r e v , a n d n e f . A s w i t h t h e i n f e c t e d H9c e l l s , t h e g r e a t m a j o r i t y ( 7 7 % ) o f t he s e t r a n s c r i p t s f r o mm a c r o p h a g e s i n f e c t e d w i t h H I V - 1 ( B A - L ) w e r e n e f s p e c i f i c .I n c o n t r a s t t o t h e H9 c e l l s , h o w e v e r , a m aj o r i t y ( 2 0 4 o f 2 7 4c l o n e s ) o f t h e n e f t r a n s c r i p t s w e r e o f t h e t w o - e x o n f o r m ,c o n s i s t e n t w i t h t h e i n t e n s i t y o f t h e 3 2 0 - b p f r a g m e n t i ne t h i d i u m b r o mi d e- s t ai n ed g e l s o f a m p l i f i e d c D N A f r o mi n f e c t e d m a c r o p h a g e s . T h i s r e s u l t c o n t r a s t s w i t h t h a t f o r t h ec D N A f r o m i n f e c t e d H9 c e l l s , f r o m w h i c h o n l y 2 3 o f 1 3 4 n e fc l o n e s a n a l y z e d w e r e o f t h e t w o - e x o n f o r m . We w e r e u n a b l et o d e t e c t a n y c l o n e s o f t h e m a c r o p h a g e c D N A w h i c h c o n -t a i n e d e i t h e r o f t h e s m a l l u p s t r e a m e x o n s c o n t a i n e d i n s o m eo f t h e n e f - a n d r e v - s p e c i f i c c l o n e s f r o m t h e i n f e c t e d H9 c e l l s .We h a v e s h o w n t h a t n e f i s b y f a r t h e m o s t a b u n d a n t o f t h es m a l l m u l t ip l y s p l i c e d t r a n s c r i p t s o f H I V - 1 - i n f e c t e d c e l l s .T h i s f i n d i n g i s i n d e p e n d e n t o f t h e s t r a i n o f v i r u s a n d t h e c e l lt y p e a n d i s s e e n w i t h b o t h c h r o n i c a n d s h o r t - t e r m i n f e c t i o n s .R e l a t i v e l y , t a t i s e x p r e s s e d a t e x t r e m e l y l o w l e v e l s , w h i l er e v i s p r e s e n t a t i n t e r m e d i a t e l e v e l s . T h e r e a s o n f o r t h i sb a l a n c e i s n o t c l e a r . n e f h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e a n e g a t i v ee f f e c t o n v i r u s r e p l i c a t i o n ( 1 3 , 1 7 ) , b u t d e s p i t e h i g h l e v e l s o fe x p r e s s i o n o f n e f - s p e c i f i c t r a n s c r i p t s c o m p a r e d w i t h t h o s ef o r r e v a n d t a t , v i r u s i s p r o d u c ed b y t h e t e s t e d c e l l t y p e s a th i g h l e v e l s . T h u s , n e f u n d e r s o m e c i r c u m s t a n c e s i s r e l a t i v e l yi n e f f i c i e n t a t i n h i b i t i n g v i r u s e x p r e s s i o n . T h i s r e s u l t , t a k e nt o g e t h e r w i t h t h e h i g h l e v e l o f e x p r e s s i o n o f n e f i n a v a r i e t yo f t y p es o f i n f e c t i o n , s u g g e s t s t h a t n e f may p l a y a n o t h e r ,m o r e c r i t i c a l r o l e i n t h e v i r a l l i f e c y c l e i n v i v o w h i c h ma y b er e l a t e d t o i t s r e p o r t e d G T P - b i n d i n g a c t i v i t y 9 ) .D e s p i t e t h e s i m i l a r i t i e s i n t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f t a t ,r e v , a n d n e f i n H9 c e l r s a n d m a c r o p h a g e s , t h e r e a r e a l s od i f f e r e n c e s . M o s t o f t h e n e f t r a n s c r i p t s f r o m m a c r o p h a g e sc o n t a i n e d o n l y t w o e x o n s , w h i l e t h o s e f r o m t h e H9 c e l l sw e r e m o s t l y o f t h r e e e x o n s . A l s o , a b o u t 10 o f t h e n e f a nd

r e v t r a n s c r i p t s f r o m t h e H9 c e l l s c o n t a i n e d s m a l l e x o n s ( f r o mb a s e s 4 4 9 1 t o 4 5 4 2 a n d 4 9 7 0 t o 5 0 4 3 ) d e r i v e d f r o m t h e r e g i o n si m m e d i a t e l y 5 t o t h e c o d i n g r e g i o n s o f v i f a n d v p r . T h e s et r a n s c r i p t s w i t h s m a l l u p s t r e a m e x o n s may b e d e r i v e d f r o mv i f a n d v p r mR NAs b y a s u b s e q u e n t s p l i c i n g e v e n t . We w e r eu n a b l e t o f i n d a n y c l o n e s o f m a c r o p h a g e c D N A c o n t a i n i n ge i t h e r o f t h e s e e x o n s . T h i s s u g g e s t s t h a t e i t h e r i n f e c t e d

m a c r o p h a g e s e x p r e s s f e w e r v i f a n d v p r mRNAs t h a n i n -f e c t e d H9 c e l l s o r t h e y m o r e e f f i c i e n t l y r e m o v e t h e s e e x o n s .T h e s p l i c i n g p a t h w a y s o f HIV mRNA a r e o b v i o u s l y q u i t ec o m p l e x . We s u g g e s t t h a t t h e t w o - e x o n n e f t r a n s c r i p t mayr e p r es e nt t h e f i n a l p r o d u c t o f t h e v i r a l s p l i c i n g p a t h w a y a n dt h a t a l l t r a n s c r i p t s m i g h t u l t i m a t e l y b e p r o c e s s e d t o t h i s f o r mi f t h e y r e m a i n e d i n t h e n u c l e u s f o r a s u f f i c i e n t t i m e . T h i s mayn o t b e t h e c a s e , s i n c e t h e f i r s t s p l i c i n g e v e n t c o u l d d i s r u p tc o n s e n s u s d o n o r a n d a c c e p t o r s e q u e n c e s f o r o t h e r s p l i c e s .H o w e v e r , i f t h i s i s t r u e , i t w o u l d s u g g e s t t h a t v i r a l mRNA i sn o t p r o c e s s e d o u t o f t h e n u c l e i o f i n f e c t e d m a c r o p h a g e s a sr a p i d l y a s w i t h i n f e c t e d H9 c e l l s . A s i d e f r o m t h e s e d i f f e r -e n c e s , h o w e v e r , t h e b a l a n ce o f e xp r es s i o n o f t a t - , r e v - , a n dn e f - s p e c i f i c t r a n s c r i p t s s e e m s c o m p a r a b l e i n i n f e c t e d mac-r o p h a g e s a n d l y m p h o c y t e s .

ACKNOWLEDGMENTSWe t h a n k E r w i n T s c h a c h l e r , U n i v e r s i t y o f V i e n n a , V i e n n a ,A u s t r i a , f o r t h e g i f t o f p u r i f i e d RNA f r o m H I V - 1 - i n f e c t e d m a c r o -p h a g e s , R e b e c c a K a u f m a n f o r e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e , a n dAnna M a z z u c a f o r e x p e r t e d i t o r i a l a s s i s t a n c e .

LITERATURE CITED1 . A r y a , S . K . 1 9 8 7 . 3 - o r f a n d s o r g e n e s o f human i m m u n o d e f i -c i e n c y v i r u s : i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n - t r a n s l a t i o n a n d i m m u n o r e a c -t i v e d o m a i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 : 5 4 2 9 - 5 4 3 3 .2 . A r y a , S . K . , C . G u o , S . F . J o s e p h s , a n d F . W o n g - S t a a l . 1 9 8 5 .T r a n s - a c t i v a t o r g e n e o f human T - l y m p h o t r o p i c v i r u s t y p e I I I( H T L V - I I I ) . S c i e n c e 2 2 9 : 6 9 - 7 3 .3 . C h i r g w i n , J . M . , A . E . P r z y b y l a , R . J . M a c D o n a l d , a n d W. J .R u t t e r . 1 9 7 9 . I s o l a t i o n o f b i o l o g i c a l l y a c t i v e r i b o n u c l e i c a c i df r o m s o u r c e s e n r i c h e d i n r i b o n u c l e a s e . B i o c h e m i s t r y 1 8 : 5 2 9 4 -5 2 9 9 .4 . C u l i e n , B . R . 1 9 8 6 . T r a n s - a c t i v a t i o n o f human i m m u n o d e f i -c i e n c y v i r u s o c c u r s v i a a b i m o d a l m e c h a n i s m . C e l l 4 6 : 9 7 3 - 9 8 2 .5 . D a y t o n , A . I . , E . F . T e r w i l l i g e r , J . P o t z , M. K o w a l s k i , J . G .S o d r o s k i , a n d W. A . H a s e l t i n e . 1 9 8 8 . C i s - a c t i n g s e q u e n c e sr e s p o n s i v e t o t h e r e v g e n e p r o d u c t o f t h e human i m m u n o d e f i -c i e n c y v i r u s . J . AIDS 1 : 4 4 1 - 4 5 2 .6 . F e i n b e r g , M . B . , R . F . J a r r e t t , A . A l d o v i n i , R . C . G a l l o , a n d F .W o n g - S t a a l . 1 9 8 6 . H T L V - I l l e x p r e s s i o n a n d p r o d u c t i o n i n v o l v ec o m p l e x r e g u l a t i o n a t t h e l e v e l s o f s p l i c i n g a n d t r a n s l a t i o n o fv i r a l RNA. C e l l 4 6 : 8 0 7 - 8 1 7 .7 . F e l b e r , B . K . , M . H a d z o p o u l o u - C l a d a r a s , C . C l a d a r a s , T . C o p e -l a n d , a n d G . N . P a v l a k i s . 1 9 8 9 . r e v p r o t e i n o f human i m m u n o -d e f i c i e n c y v i r u s t y p e 1 a f f e c t s t h e s t a b i l i t y a n d t r a n s p o r t o f t h ev i r a l mRNA. P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 : 1 4 9 5 - 1 4 9 9 .8 . G a r t n e r , S . , P . M a r k o v i t s , D . M. M a r k o v i t z , M. H . K a p l a n ,R . C . G a l l o , a n d M. P o p o v i c . 1 9 8 6 . T h e r o l e o f m o n o n u c l e a rp h a g o c y t e s i n H T L V - I I I / L A V i n f e c t i o n . S c i en ce 2 3 3 : 2 1 5 - 2 1 9 .9 . G u y , B . , M. P . K i e n y , Y . R i v i e r e , C . L e P e u c h , K . D o t t , M.G i r a r d , L . M o n t a g n i e r , a n d J . P . L e c o c q . 1 9 8 7 . HIV F / 3 o r fe n c o d e s a p h o s p h o r y l a t e d G T P - b i n d i n g p r o t e i n r e s e m b l i n g a no n c o g e n e p r o d u c t . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 0 : 2 6 6 - 2 6 9 .1 0 . H a d z o p o u l o u - C l a d a r a s , M . , B . K . F e l b e r , C . C l a d a r a s , A . A t h a -n a s s o p o u l o s , A . T s e , a n d G . N . P a v l a k i s . 1 9 8 9 . T h e r e v t r s l a r t )

p r o t e i n o f human i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s t y p e 1 a f f e c t s v i r a lmRNA a n d p r o t e i n e x p r e s s i o n v i a a c i s - a c t i n g s e q u e n c e i n t h ee n v r e g i o n . J . V i r o l . 6 3 : 1 2 6 5 - 1 2 7 4 .1 1 . H a m m a r s k j o l d , M. L . , J . H e i m e r , B . H a m m a r s k j o l d , I . S a n g -w a n , L . A l b e r t , a n d D . R e k o s h . 1 9 8 9 . R e g u l a t i o n o f humani m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s e n v e x p r e s s i o n b y t h e r e v g e n e p r o d u c t .J . V i r o l . 6 3 : 1 9 5 9 - 1 9 6 6 .1 2 . J a c k s , T . , M. D . P o w e r , F . R . M a s i a r z , P A . L u c i w , P . J . B a r r ,a n d H . E . V a r m u s . 1 9 8 8 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f r i b o s o m a l f r a m e -s h i f t i n g i n H I V - 1 g a g - p o l e x p r e s s i o n . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 1 :2 8 0 - 2 8 3 .1 3 . L u c i w , P . A . , C . C h e n g - M a y e r , a n d J . A . L e v y . 1 9 8 7 . M u t a t i o n a la n a l y s i s o f t h e human i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s : t h e o r f - B r e g i o nd o w n - r e g u l a t e s v i r u s r e p l i c a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA

VOL. 6 4 , 1 9 9 0

8/13/2019 bibliografia 11

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