UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO 

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR & MOLECULAR E BIOAGENTES PATOGÊNICOS 

 

 

 

LEONARDO BARCELOS DE PAULA 

 

 

“Análise proteômica das diversas fases de diferenciação osteoblástica de 

células‐tronco mesenquimais de medula óssea” 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ribeirão Preto 2010 

 

 

 

LEONARDO BARCELOS DE PAULA 

 

 “Análise proteômica das diversas fases de diferenciação osteoblástica de 

células‐tronco mesenquimais de medula óssea” 

      Dissertação  apresentada  ao  Programa  de  Pós‐Graduação  em  Biologia  Celular  e Molecular  da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto para a obtenção  do  título  de  Mestre  em  Biologia Celular e Molecular  

 Departamento:  Biologia  Celular & Molecular  e Bioagentes Patogênicos  Área  de  concentração:  Biologia  Celular  e Molecular   Orientador:  Prof. Dr. José César Rosa 

  

     

Ribeirão Preto  2010 

 

 

AUTORIZO  A  REPRODUÇÃO  E  DIVULGAÇÃO  TOTAL  OU  PARCIAL  DESTE  TRABALHO,  POR QUALQUER MEIO  CONVENCIONAL  OU  ELETRÔNICO,  PARA  FINS  DE  ESTUDO  E  PESQUISA, DESDE QUE CITADA À FONTE. 

  

FICHA CATALOGRÁFICA 

 

 

 

Barcelos, Leonardo de Paula 

“ANÁLISE PROTEÔMICA DAS DIVERSAS FASES DE DIFERENCIAÇÃO OSTEOBLÁSTICA  DE  CÉLULAS‐TRONCO  MESENQUIMAIS  DE MEDULA ÓSSEA”. Ribeirão Preto, 2010. 

         145 p. : II. ; 30 cm. 

 

                                    Dissertação de Mestrado, apresentada à                                      Faculdade de Medicina de                                      Ribeirão Preto/USP, 2010. 

                                                                             Área de concentração: Biologia Celular e Molecular  

                                    Orientador: Prof. Dr. José César Rosa. 

 

1. Células‐tronco mesenquimal. 2. Diferenciação osteoblástica.  

3. Shotgun proteomics e iTRAQ. 4. Processo de regeneração óssea. 

 

 

FOLHA DE APROVAÇÃO 

 

 

 

DEDICATÓRIA  

  

Dedico este trabalho às pessoas inesquecíveis em minha vida... 

 

À Deus, fonte inesgotável de energia que me fortalece todos os dias. 

 

Aos meu pais, 

 

À minha mãe, Margareth Maria Barcelos de Paula, mulher de  fibra que nunca  se 

deixou  abater  pelos  problemas  sejam  eles  os  mais  complicados  de  serem  resolvidos. 

Dedicação em tempo integral com sua força de mulher e seu amor sincero e único. Sempre 

lutou  pela  felicidade  de  seus  filhos  fortalecendo  cada  passo  dos mesmos  através  de  sua 

imensa  ternura,  braços  fortes  e  coração  puro. Mulher,  companheira,  guerreira,  lutadora, 

protetora, amiga, meu anjo... minha mãe! Atravessou montanhas, percorreu caminhos de 

pedra,  chorou em  silêncio, mas estava ali,  sempre  com  seu brilho no olhar e  sua  firmeza 

inabalável... 

Mãe, obrigado pelo eterno amor, carinho, graditão, pela confiança deposita em mim 

e por estar sempre ao meu lado onde quer que eu esteja... 

  

Ao meu pai, Adahil de Paula Rodrigues, meu herói que sempre me orientou não com 

base nas suas próprias experiências, mas sim, demonstrando que em cada experiência existe 

uma  lição  a  ser  aprendida.  Sempre  procurou  dar  a melhor  educação  para  os  seus  filhos 

mostrando o quanto é necessário a busca do conhecimento para continuar caminhando na 

vida. Na verdade, pai não é aquele que sempre diz “não faça isso”ou “faça aquilo”, mas sim 

faça o melhor de acordo com os seus princípios.  

Pai, obrigado por  ser  esse  amigo  sempre presente,  atento,  amoroso  e por  ter me 

dado  todo  o  suporte  para  que  eu  pudesse  alcançar  todos  os meus  objetivos  da melhor 

maneira possível. 

 

 

 

Ao  meu  irmão,  Leandro  Barcelos  de  Paula,  grande  amigo  que  eu  posso  contar 

sempre seja nos momentos bons ou ruins. Meu carinho, admiração e respeito por você não 

tem fronteiras. Não importa a nossa distância, sempre  seremos irmãos‐amigos. 

 

À minha  irmã, Ludmilla Barcelos de Paula, a garotinha que eu sempre quis ter... Só 

podia ser a minha irmãzinha... Uma grande amiga que eu posso contar sempre. Está sempre 

disposta a me oferecer seu abraço e seu carinho  incondicional. Nos momentos em que eu 

não via, estava ali, para me ajudar a enxergar. Sempre me divertiu, me surpreendeu e claro, 

me  aconselhou  quando  necessário.  É maravilhoso  poder  compartilhar  contigo  esse  laço 

sanguíneo que nos uni pela força de nossas almas. 

   

 

 

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS 

 

Ao meu  orientador Dr.  José  César  Rosa,  pela  oportunidade  de  fazer  parte  de  seu 

grupo  e  compartilhar de  seus  conhecimentos que,  sem  dúvida,  contribuíram  para o meu 

crescimento profissional. Ter sido seu aluno de mestrado me proporcionou “desvendar” o 

mundo  proteômico  que,  até  então,  era  obscuro  para mim.  O  convívio  no  dia‐a‐dia  não 

proporcionou apenas o meu enriquecimento intelectual, mas sim, o meu crecimento pessoal  

e amadurecimento profissional permitindo que eu compreendesse o significado profundo do 

que é ciência. Sob sua orientação, a palavra profissionalismo sempre foi marcante em seus 

ensinamentos. Ser membro do Centro de Química de Proteínas é um grande diferencial na 

minha vida profissional. Parabéns pelo empenho e competência frente à pesquisa, por todo 

apoio  e  suporte  para  o  desenvolvimento  desse  trabalho  e  por  sempre me  incentivar  a 

alcançar os meus objetivos. O senhor sempre terá o meu respeito e admiração. 

 

 

Ao  Dr.  Adalberto  Luiz  Rosa,  pelo  apoio  incondicional  e  ensinamentos  que 

proporcionaram o desenvolvimento desse trabalho, abrindo as portas do seu  laboratório e 

deixando a disposição toda a sua equipe para que o mesmo fosse desenvolvido da melhor 

maneira  possível.  Agradeço  pela  oportunidade  de  poder  trabalhar  com  pessoas 

extremamente competentes e profissionais.    

 

 

AGRADECIMENTOS 

 

Ao Dr. Lewis  Joel Greene, pelo compartilhamento da sua vasta experiência na vida 

acadêmica para o meu crescimento profissional e pessoal. 

À Dra. Clarice  Izumi, pelos momentos de grandes ensinamentos em que durante a 

execução de um experimento se tornava obscuro, ali ela estava, para deixar tudo as claras. 

À Dra. Hélen Julie Laure, pelos inúmeros esforços durante a obtenção dos resultados 

gerados no espectrômetro de massas. 

Aos  companheiros  do  Centro  de  Química  de  Proteínas  (CQP‐USP):  Silvia  Elena 

Bolfarini, Regina Amábile Mazzucato de Oliveira, Maria Helena da Silva Martins, Dra. Helen 

Cristina Miranda,  Dra.  Glauce  Gaspar  Gomes,  Dra.  Patrícia  Pereira Macaroff,  Dra.  Gisele 

Guiçardi Tomazella, Alana Maria Cerqueira, Ana Carolina Humanes, Anelisa Ramão,  Carolina 

Hassibe Thomé e Germano Aguiar Ferreira, pelos momentos de alegrias, festas e de muitas 

risadas... muito obrigado!! 

Ao trio  fantástico: Marcela Gimenez, Lucas Oliveira Sousa e Talita Diniz Melo, pelas 

inúmeras discussões científicas, companheirismo e, principalmente, pela amizade que foi de 

fundamental importância nessa caminhada... 

À  Fabíola  Singaretti  de  Oliveira  e  o  Roger  Rodrigo  Fernandes,  pertencentes  aos 

Laboratórios  de Biologia Molecular  e  Cultura  de  Células da  Faculdade  de Odontologia  de 

Ribeirão  Preto  (FORP‐USP)  por  todo  o  apoio  e  dedicação  no  auxílio  do  desenvolvimento 

desse trabalho. A colaboração de vocês foi de suma importância. 

Aos grandes amigos: Dra. Angela Adamski da Silva Reis, Rodrigo da Silva Santos, Aline 

Helena da Silva Cruz e Danilo Candido de Almeida, pela  força, pelo companheirismo sendo 

na alegria ou na tristeza sempre estaremos juntos na caminhada... Agradeço de coração. Ao 

companheiro Victor Rodrigues Santos pela empreitada na vida de pós‐graduando. 

À  Sandra  Navarro  Bresciani,  sempre  disposta  a  me  socorrer  nos  momentos  de 

desespero para a construção de uma imagem e responsável pela arte gráfica desse trabalho. 

Muito obrigado!!!  

À Rosângela Catarina Peral Mesquita, por  sempre  ajudar e  auxiliar nos momentos 

burocráticos que deparamos durante esse período. 

 

 

À Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pelo suporte e auxílio permitindo que o 

conhecimento  adiquirido  com  esse  trabalho  fosse  difundido  na  comunidade  científica 

através de congressos e eventos científicos. 

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo  (FAPESP), pela bolsa de 

mestrado  concedida  que,  sem  dúvida,  sem  este  auxílio  tudo  teria  sido  muito  mais 

complicado.  

À Universidade de São Paulo e ao Departamento de Biologia Celular & Molecular e 

Bioagentes Patogênicos,  sempre preocupados na  formação de excelentes pesquisadores e 

profissionais. 

À  todos que de alguma  forma  contribuíram para a execução desse  trabalho, deixo 

registrado a minha eterna gratidão.  

 

                             

 

 

EPÍGRAFES                                

“Querem que vos ensine o modo de chegar à ciência verdadeira? Aquilo que se sabe, saber que se sabe; aquilo que não se sabe, saber que não se sabe; na verdade é este o saber.” 

  Confúcio ( 551 a.C. ‐ 479 a.C.) 

  

    “Não confunda derrotas com fracasso nem vitórias com sucesso. Na vida de um campeão sempre haverá algumas derrotas, assim como na vida de um perdedor sempre 

haverá vitórias. A diferença é que, enquanto os campeões crescem nas derrotas, os perdedores se acomodam nas vitórias.” 

 Roberto Shinyashiki (1952 ‐) 

 

XI 

RESUMO 

BARCELOS,  L. P. Análise proteômica das diversas  fases de diferenciação osteoblástica de 

células‐tronco mesenquimais de medula óssea. [Proteomics analysis of the various stages of 

osteoblastic  differentiation  of  mesenchymal  stem  cells  from  bone  marrow]  Dissertação 

(Mestrado  em  Biologia  Celular  e Molecular)  ‐  Faculdade  de Medicina  de  Ribeirão  Preto, 

Departamento de Biologia Celular & Molecular e Bioagentes Patogênicos ‐ Universidade de 

São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. 

O  crescimento, desenvolvimento e manutenção do  tecido ósseo  são processos  altamente 

regulados.  Diversas  proteínas  como  hormônios,  fatores  de  crescimento  e  citocinas  estão 

envolvidas  nestes  processos  e  exercem  atividade  direta  sobre  células  osteoblástica  e 

osteoclástica,  atuando  em  sua  diferenciação  e  ativação  metabólica.  O  processo  de 

regeneração  óssea  é  iniciado  por  fatores  estimuladores  locais  como  as  proteínas 

morfogenética óssea (BMP – “Bone Morphogenetic Proteins”). As BMPs são um produto do 

metabolismo  dos  osteoblastos,  odontoblastos  e  de  várias  células  tumorais,  sendo 

armazenadas  na  forma  de  concentrados  no  osso,  dentina  e  em  células  neoplásicas  do 

osteossarcoma  e  de  certos  tumores  odontogênicos,  tais  como:  fibroma  cementificante, 

cementoblastoma  benigno,  dentinoma,  fibroma  odontogênico  e  odontoma.  Esclarecer  os 

mecanismos que controlam a remodelação óssea é uma questão bastante relevante. Nesse 

sentido,  as  células‐tronco mesenquimais  têm  despertado  grande  interesse  devido  ao  seu 

potencial  envolvimento  no  processo  de  reparo  tissular.  A  obtenção  de  osteoblastos 

funcionais  a  partir  de  células‐tronco mesenquimais  tem  sido  utilizada  na  engenharia  de 

tecidos  e  terapia  celular.  Desse  modo,  no  presente  trabalho  foi  realizada  uma  análise 

proteômica  das  proteínas  envolvidas nas diversas  fases de  diferenciação osteoblástica  de 

células‐tronco mesenquimais de medula óssea de rato Wistar e humana, no sentido de obter 

maiores  informações  sobre  a  diferenciação  celular  e  a  biologia  do  tecido  ósseo.  Células‐

tronco mesenquimais obtidas de medula óssea  foram cultivadas em meio osteogênico por 

diferentes períodos para obter células em diversas fases da diferenciação osteoblástica. Para 

análise proteômica foram utilizadas ferramentas como a estratégia de “shotgun proteomics” 

 

XII 

e quantificação  relativa  (iTRAQ  ‐  Isobaric Tag  for Relative and Absolute Quantitation) para 

separação de proteínas e a espectrometria de massas para a  identificação e quantificação 

relativa de proteínas e peptídeos. Neste contexto, os nossos resultados nos levam a concluir 

que: as CTMs de medula óssea de  rato Wistar expressam  genes que estão envolvidos na 

diferenciação osteogênica quando estimuladas in vitro formando matriz óssea no período de 

14 dias, ou  seja, o  fator estimulante no microambiente é de  fundamental  importância; as 

CTMs de medula óssea humana apresentaram resultados semelhantes com as CTMs de ratos 

em nível genômico durante a diferenciação osteogênica, entretanto quando estimuladas  in 

vitro  formaram  a  matriz  óssea  no  período  de  21  dias;  utilizando  duas  abordagens 

proteômicas, foi possível identificar proteínas importantes que estão envolvidas no processo 

de  diferenciação.  Mas  cabe  salientar  que,  embora  tenham  sido  detectados  genes  que 

parecem envolvidos no processo de diferenciação, isso não teve reflexo no proteoma dessas 

células nos períodos de 7 e 14 dias da indução de diferenciação à osteogênese, o que indica 

que a maior parte da funcionalidade dessas células quanto aos outros processos biológicos 

estão  preservados,  como  por  exemplo  a  proliferação  celular  permaneceu  sem  grandes 

alterações.  Isso  indica que manipulações de  isolamento, cultivo e  indução da diferenciação 

dessas células não afetaram o proteoma, com aspectos positivos para a utilização de células‐

tronco mesenquimais  em  terapia  celular. Do  ponto  de  vista metodológico,  esse  trabalho 

abre  perspectivas  da  utilização  de  estratégias  proteômicas  baseadas  na  marcação  por 

isóbaros em combinação com separação de proteínas por eletroforese unidimensional SDS‐

PAGE para a análise de amostras biologicamente complexas e de quantidades  limitadas de 

obtenção como células‐tronco mesenquimais. O estudo da expressão de proteínas durante 

as  fases  de  diferenciação  osteoblástica  de  células‐tronco mesenquimais  de medula  óssea 

deve  refletir  seu  estado  funcional  e  contribuir  para  o  entendimento  das  diversas  vias 

envolvidas no processo de diferenciação. 

 

Palavras Chaves: 1. Células‐tronco mesenquimal. 2. Diferenciação osteoblástica. 3. Shotgun 

proteomics e iTRAQ. 4. Processo de regeneração óssea. 

 

 

XIII 

ABSTRACT 

BARCELOS, L. P. Proteomics analysis of the various stages of osteoblastic differentiation of 

mesenchymal  stem cells  from bone marrow Dissertação  (Mestrado em Biologia Celular e 

Molecular) ‐ Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Biologia Celular & 

Molecular e Bioagentes Patogênicos ‐ Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2010. 

 

The growth, development and maintenance of bone  tissue are highly  regulated processes. 

Several  proteins  such  as hormones,  growth  factors  and  cytokines  are  actively  involved  in 

these processes and exert direct activity on osteoblastic and osteoclastic cells, acting in their 

differentiation  and metabolic  activation.  The process  of  bone  regeneration  is  initiated  by 

local stimulating factors as bone morphogenetic proteins (BMP). BMPs are a product of the 

metabolism of osteoblasts, odontoblasts and various tumor cells and is stored in the form of 

concentrates  in bone, dentin and neoplastic cells of osteosarcoma and certain odontogenic 

tumors  such  as  fibroma  cementifying,  cementoblastoma  benign  dentinoma,  odontogenic 

fibroma  and  odontoma.  Clarify  the mechanisms  that  control  bone  remodeling  is  a  very 

relevant  issue.  Accordingly,  the  mesenchymal  stem  cells  have  attracted  great  interest 

because  of  its  potential  involvement  in  the  process  of  tissue  repair. Obtaining  functional 

osteoblasts  from mesenchymal  stem  cells  has  been  used  in  tissue  engineering  and  cell 

therapy.  Thus,  this  present work  performed  a  proteomic  analysis  of  proteins  involved  in 

various stages of osteoblast differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow of 

Wistar  rat  and  human,  in  order  to  obtain  more  information  on  the  biology  of  cell 

differentiation and bone tissue. Mesenchymal stem cells obtained from bone marrow were 

cultured  in osteogenic medium  for  different periods  to  obtain  cells  at different  stages  of 

osteoblast  differentiation.  For  proteomics  analysis  tools  were  used  as  the  strategy  of 

shotgun  proteomics  and  relative  quantification  (iTRAQ  ‐  isobaric  Tag  for  Relative  and 

Absolute quantitation) for protein separation and mass spectrometry to identify proteins. In 

this  context,  our  results  take  us  to  conclude  that  the MSCs  of Wistar  rat  bone marrow 

express  genes  that  are  involved  in  osteogenic  differentiation  in  vitro when  stimulated  to 

form bone matrix during the 14 days, thus stimulating factor  in the microenvironment  is of 

fundamental  importance, the MSCs  from human bone marrow showed similar results with 

 

XIV 

rat MSCs at the genomic  level during osteogenic differentiation, however, when stimulated 

in  vitro  formed  bone matrix within  21  days,  using  two  proteomic  approaches, we  could 

identify proteins  important that are  involved  in the process of differentiation. But  it should 

be noted  that although  it has been  identified genes  that  seem  involved  in  the process of 

differentiation,  it was not  reflected  in  the proteome of  these  cells at 7 and 14 days after 

induction of the osteogenic differentiation, indicating that most of the functionality of these 

cells  and  other  biological  processes  are  preserved,  such  as  cell  proliferation  remained 

without major changes. This indicates that manipulations of isolation, culture and induction 

of differentiation of these cells did not affect the proteome, with positive aspects to the use 

of mesenchymal stem cells in cell therapy. From the methodological point of view, this work 

opens up the use of proteomic strategies based on the score for isobars in combination with 

protein  separation  by  electrophoresis,  one‐dimensional  SDS‐PAGE  for  the  analysis  of 

complex biological samples and limited quantities of production as mesenchymal stem cells. 

The study of protein expression during stages of osteoblast differentiation of mesenchymal 

stem  cells  from bone marrow  should  reflect  their  functional  status  and  contribute  to  the 

understanding of pathways involved in the process of differentiation. 

 Keywords: 1. Mesenchymal stem cells. 2. Osteoblast differentiation. 3. Shotgun proteomics 

and iTRAQ. 4. Process of bone regeneration. 

 

 

XV 

LISTAS DE ILUSTRAÇÕES  Figura  1.  Representação  esquemática  da  diferenciação  da  célula‐tronco multipotente  em determinados tipos celulares....................................................................................................3  

Figura  2.  Representação  esquemática  dos  possíveis  processos  de  plasticidade  celular.  A) Existência  de  células  de  um  determinado  tecido  em  um  órgão  não‐relacionado.  B)  Fusão entre  célula‐tronco  e  célula  diferenciada.  C)  Reprogramação  genética.  D)  Presença  de células‐tronco pluripotentes em tecidos adulto........................................................................5  

Figura  3.  Potencialidade  de  diferenciação  das  células‐tronco  mesenquimais  da  medula óssea..........................................................................................................................................9  

Figura  4.  Delineamento  experimental  para  estudo  da  diferenciação  das  células‐tronco mesenquimais de medula óssea de rato.................................................................................12  Figura  5.  Delineamento  experimental  para  estudo  da  diferenciação  das  células‐tronco mesenquimais de medula óssea humana................................................................................21  

Figura 6. Exemplo de espectro de massa de peptídeo obtidos por em uma fração de nano‐HPLC  em  que  a  fragmentação  do  íon  m/z  1620.86  [M+H+]  por  CID‐MS/MS  para  a visualização da marcação com  iTRAQ. (Fração 7, SDS‐PAGE). A proteína Ras‐related protein Rab‐1A  foi  identificada utilizando o software MASCOT contra o banco de dados Swiss Prot versão 57.2.fasta......................................................................................................................34  

Figura 7. Atividade da fosfatase alcalina de células osteogênicas derivadas da medula óssea de ratos Wistar cultivadas durante   o período de 7, 10 e 14 dias. Desvio padrão – MEM  (7 dias: 1,4978; 10 dias: 1,6915; 14 dias: 1,1068) e MTS (7 dias: 3,2634; 10 dias: 9,9566; 14 dias: 13,1430). Os dados são reportados como média ± desvio padrão (n=4)...............................41  Figura 8. Atividade da fosfatase alcalina de células osteogênicas derivadas da medula óssea humana  cultivadas  durante  o  período  de  7,  10  e  14  dias. Desvio  padrão  – MEM  (7  dias: 2,2545; 10 dias: 0,9862; 14 dias: 0,7623) e MTS  (7 dias: 1,7540; 10 dias: 9,0064; 14 dias: 9,6961). Os dados são reportados como média ± desvio padrão (n = 3)................................41  Figura 9. Processo de mineralização das células osteogênicas derivadas da medula óssea de ratos  Wistar  cultivadas  durante  14  dias.  Microscopia  de  contraste  de  fase:  (A)  células 

 

XVI 

cultivadas em MEM 15%; (B) células cultivadas em MTS 15%. Coloração pelo método Alizarin red  S:  (C)  cultura  de  células mesenquimais  com  ausência  de  estímulos  de  diferenciação osteogênica (MEM 15%); (D) cultura de células mesenquimais na presença de estímulos para a osteogênese (MTS 15%)........................................................................................................43  Figura 10. Processo de mineralização das  células osteogênicas derivadas da medula óssea humana cultivadas durante 21 dias. Microscopia de contraste de fase: (A) células cultivadas em MEM 10%; (B) células cultivadas em MTS 10%. Coloração pelo método de Alizarin red S: (C)  cultura  de  células  mesenquimais  com  ausência  de  estímulos  de  diferenciação osteogênica (MEM 10%); (D) cultura de células mesenquimais na presença de estímulos para a osteogênese (MTS 10%)........................................................................................................43  Figura 11. Processo de mineralização das células osteogênicas derivadas da medula óssea de ratos Wistar  cultivadas  durante  14  dias.  Viabilidade  células  (média  ±  desvio  padrão,  em densida  óptica)  de  culturas  de  células‐tronco  mesenquimais  na  aus%encia  (MEM)  e  na presença (MTS) de estímulos para a diferenciação osteogênica nos períodos de 24 horas, 3, 7 e 10 dias, determinada pelo ensaio colorimétrico MTT..........................................................44  Figura 12. Viabilidade celular (média ± desvio padrão, em densidade óptica) de culturas de células‐tronco mesenquimais na ausência  (MEM) e na presença  (MTS) de estímulos para a diferenciação  osteogênica  nos  períodos  de  3,  7  e  10  dias,  determinada  pelo  ensaio colorimétrico MTT...................................................................................................................45  Figura 13. Análise da expressão gênica dos marcadores de diferenciação osteoblástica ALP, RUNX2, BSP, OC, OSTERIX e MSX2 em culturas com ausência (MEM) e na presença (MTS) de estímulos para a diferenciação osteogênica nos períodos de 7, 10 e 14 dias. Os valores foram normalizados pelo gene constitutivo GAPDH e calibrados pelos valores obtidos para o grupo MEM........................................................................................................................................46  Figura 14. Análise da expressão gênica dos marcadores de diferenciação osteoblástica COL I, RUNX2, BSP, ALP, OP, OC e RANKL em culturas com ausência  (MEM) e presença  (MTS) de estímulos  de  diferenciação  osteogênica  nos  períodos  7  e  14  dias.  Os  valores  foram normalizados pelo gene constitutivo ACTIN (β‐actina) e calibrados pelos valores obtidos para o grupo MEM...........................................................................................................................46  Figura 15. SDS‐PAGE obtido de extratos de células mesenquimais de medula óssea de rato. Foram  submetidos  à  eletroforese  25µg  de  proteínas  de  cada  amostra  em  duplicata.  (I) células cultivadas em MEM 15%: as bandas foram recortadas do gel e submetidas à hidrólise enzimática por tripsina. As bandas que apresentaram em duplicidade, foram unidas em um único  tubo  (a+b=A: 7 dias, c+d=B: 14 dias).  (II) células  cultivadas em MTS 15%: as bandas sofreram  os  mesmos  procedimentos  do  (I),  sendo  (e+f=C:  7  dias,  g+h=D:  14  dias).  M: 

 

XVII 

marcador de peso molecular –  LMW  (Protein and Peptide Molecular Weigth Markers) GE Healthcare…………………………………………………………………………………………..………………………………48  Figura 16. Análise por Gene Ontology (BABELOMICS v3.2) das proteínas identificadas por MS de  células‐tronco  mesenquimais  de  medula  óssea  de  rato  durante  a  indução  da osteogênese.............................................................................................................................57  Figura 17. Eletroforese em SDS‐PAGE obtido de extratos de células mesenquimais de medula óssea  de  rato  para  a  marcação  com  iTRAQ.  Foram  submetidos  à  eletroforese  30µg  de proteínas de cada amostra. (I) células cultivadas até o período de 7 dias (7D). (A) MEM 15%; (B) MTS  15%  e  (C)  Controle  interno  1  (15µg  MEM  7D  +  15µg  MTS  7D).  (II)  células cultivadas até o período de 14 dias (14D). (D) MEM 15%; (E) MTS 15% e (F) Controle interno 2  (15µg  MEM  14D  +  15µg  MTS 14D). M: marcador de peso molecular  –  LMW‐SDS Marker  Kit  GE  Healthcare.  As  frações  foram  recortadas  do  gel  e  submetidas  à  hidrólise enzimática por tripsina............................................................................................................59  Figura 18. Eletroforese em SDS‐PAGE obtido de extratos de células mesenquimais de medula óssea  humana  para  a marcação  com  iTRAQ.  Foram  submetidos  à  eletroforese  30µg  de proteínas de cada amostra. (I) células cultivadas até o período de 7 dias (7D). (A) MEM 10%; (B) MTS  10%  e  (C)  Controle  interno  1  (15µg  MEM  7D  +  15µg  MTS  7D).  (II)  células cultivadas até o período de 14 dias (14D). (D) MEM 10%; (E) MTS 10% e (F) Controle interno 2  (15µg  MEM  14D  +  15µg  MTS 14D). M: marcador de peso molecular  –  LMW‐SDS Marker  Kit  GE  Healthcare.  As  frações  foram  recortadas  do  gel  e  submetidas  à  hidrólise enzimática por tripsina............................................................................................................65  Figura 19. Análise por Gene Ontology das proteínas  identificadas por MS de células‐tronco mesenquimais de medula óssea humana durante a indução da osteogênese....................68  8.1  ANEXO  A  –  COMITÊ  DE  ÉTICA NO USO  DE  ANIMAIS  ‐  FACULDADE  DE MEDICINA  DE CATANDUVA.............................................................................................................................93  8.2 ANEXO B – COMITÊ DE ÉTICA NO USO DE CÉLULAS HUMANAS – UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO (FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO)...............................................94  8.3 ANEXO C – Identificação de proteínas das células‐tronco mesenquimais de medula óssea de rato através do método de shotgun proteomics................................................................95  8.4 ANEXO D –  IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DAS CÉLULAS‐TRONCO MESENQUIMAIS DE MEDULA ÓSSEA DE RATO ATRAVÉS DO MÉTODO DE iTRAQ..................................................99  

 

XVIII 

 8.5 ANEXO E –  IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DAS CÉLULAS‐TRONCO MESENQUIMAIS DE MEDULA ÓSSEA HUMANA NO PERÍODO DE 7 DIAS: MEM 10%(113), MTS 10% (114)..........110   8.6 ANEXO F –  IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS DAS CÉLULAS‐TRONCO MESENQUIMAIS DE MEDULA ÓSSEA HUMANA NO PERÍODO DE 14 DIAS: MEM 10%(116), MTS 10% (117)........124 

                                         

 

XIX 

LISTAS DE TABELAS  Tabela  1  –  Primers  utilizados  para  a  reação  de  Real  time  PCR  para  amostras  de  células‐tronco de medula óssea de rato..............................................................................................28  

Tabela  2  –  Primers  utilizados  para  a  reação  de  Real  Time  PCR  para  amostras  de  células‐tronco de medula óssea humana.............................................................................................29  

Tabela 3 – Característica imunifenotípicas de células mesenquimais obtidas de medula óssea humana cultivadas em meios de cultura sem fatores estimuladores da osteogênese (MEM) e com  fatores  estimuladores  da  osteogênese  (MTS)  com  pacientes  entre  21  a  45 anos..........................................................................................................................................39  

Tabela  4  –  Identificação das proteínas por MALDI‐TOF‐TOF detectadas  a partir de  células cultivadas em MEM 15% com score ≥ 35.................................................................................49  Tabela  5  –  Identificação das proteínas por MALDI‐TOF‐TOF detectadas  a partir de  células cultivadas em MTS 15% com score ≥ 35 .................................................................................52  

Tabrla 6 – Identificação de proteínas por MALDI‐TOF‐TOF comuns entre as células cultivadas em MEM 15% e MTS 15%........................................................................................................55  

Tabela 7 –  Identificação de proteínas por MALDI‐TOF‐TOF exclusivas das células cultivadas em MEM 15%...........................................................................................................................56  Tabela 8 –  Identificação de proteínas por MALDI‐TOF‐TOF exclusivas das células cultivadas em MTS 15%............................................................................................................................56  Tabela 9 – Identificação de proteínas por MALDI‐TOF‐TOF marcadas com iTRAQ nos períodos 7 e 14 dias das células cultivadas em MEM 15% e MTS 15% ................................................60  Tabela  10  –  Identificação de proteínas por MALDI‐TOF‐TOF no período  7 dias das  células cultivadas em MEM 15% (113) e MTS 15% (114)....................................................................61  Tabela 11 –  Identificação de proteínas por MALDI‐TOF‐TOF no período 14 dias das células cultivadas em MEM 15% (116) e MTS 15% (117)....................................................................62  

 

XX 

Tabela  12  –  Identificação de  proteínas  por MALDI‐TOF‐TOF  com único peptídeo marcado com  iTRAQ  nos  períodos  7  e  14  dias  das  células  cultivadas  em  MEM  10%  e  MTS 10%..........................................................................................................................................66  Tabela 13 –  Identificação de proteínas por MALDI‐TOF‐TOF  com dois peptídeos marcados com iTRAQ no período 7 dias das células cultivadas em MTS 10%........................................67 

 

XXI 

LISTAS DE SIGLAS E SÍMBOLOS  

  1D:       eletroforese unidimensional 

ARS:       do inglês “Alizarin red S” 

BMP:    do inglês “Bone Morphogenetic Protein” oC:      Graus Celsius 

cDNA:                      do inglês “Complementary desoxiribonucleic acid” 

CFU‐F:                        do inglês “Colony forming units – fibroblastic” 

cm2:                          Centímetros quadrados 

CO2:                          Dióxido de Carbono 

CT:    Célula‐tronco 

CTM:                    Célula‐tronco mesenquimal 

CTM‐MO:            Célula‐tronco mesenquimal derivada da medula óssea 

DNA:      do inglês “Desoxiribonucleic acid”       

DO:      Densidade óptica 

DTT:                         Ditiotreitol 

EDTA:                       Ácido etilenodiamiotetracético (sal dissódico) 

FORP‐USP:                   Faculdade  de Odontologia de Ribeirão  Preto da Universidade  de  São 

Paulo 

HCFMRP‐USP:  Hospital das Clínicas da  Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da 

Universidade de São Paulo 

HCI:                           Ácido Clorídrico 

iTRAQ:     do inglês “(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation)” 

MAPC:     do inglês “Multipotent adult progenitors cells” 

MALDI‐TOF/TOF:  Espectrômetro de massas do tipo MALDI‐TOF/TOF 

MEM:    do inglês “α‐Minimum Essential Medium” 

MTS:                        Meio  de  cultura MEM  suplementado  com  os  estimuladores  para  a 

osteogêneses 

mg:      Miligrama 

mL:                              Mililitro 

mM:                           Milimolar 

 

XXII 

MO:    Medula Óssea 

pb:                            Pares de bases 

PBS:              do inglês “Phosphate Buffered Saline” 

PCR:    do inglês “Polimerase chain reaction” 

RNA:    do inglês “Ribonucleic acid”     

RT‐PCR:    do inglês “Reverse transcriptase‐polymerase chain reaction” 

SITC:    Sociedade Internacional de Terapia Celular 

SP:    do inglês “Shotgun Proteomics” 

TA:    Temperatura Ambiente 

TGF‐β:    do inglês “Transforming Growth Factor‐β”  

v/v:    Volume/Volume 

VEGF:    do inglês “Vascular endothelial growth factor” 

µg:    Micrograma 

µl:    Microlitro 

µm:      Micrômetro    

 

 

SUMÁRIO   

RESUMO ..................................................................................................................................... XI ABSTRACT ................................................................................................................................ XIII LISTAS DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................................... XV LISTAS DE TABELAS .................................................................................................................. XIX LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS .................................................................................................. XXI   1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 2

1.1. Definição e classificação das células‐tronco ............................................................. 2 1.2. Células‐tronco adultas e sua plasticidade celular .................................................... 3 1.3. Células‐tronco mesenquimais .................................................................................. 6 1.4. Células‐tronco mesenquimais e diferenciação em osteoblastos ........................... 12 1.5. Abordagem proteômica ......................................................................................... 14

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 17 2.1. Objetivo geral ......................................................................................................... 17 2.2. Objetivos específicos .............................................................................................. 17

3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................... 19 3.1. Obtenção das células‐tronco mesenquimais de medula óssea de rato ................ 19 3.2. Obtenção de células‐tronco mesenquimais de medula óssea humana ................ 20

3.2.1. Caracterização imunofenotípica das células‐tronco mesenquimais humanas ..................................................................................................... 20

3.3. Padronização das condições de diferenciação osteoblástica ................................ 21 3.4. Caracterização da diferenciação osteoblástica ...................................................... 22

3.4.1. Determinação dos níveis enzimáticos de fosfatase alcalina ...................... 22 3.4.2. Análise da formação da matriz extracelular e mineralização por 

colorimetria utilizando “Alizarin red S” ...................................................... 23 3.4.3. Ensaio de proliferação celular .................................................................... 24

3.5. Análise da expressão gênica dos marcadores da diferenciação osteoblástica ........................................................................................................... 24 3.5.1. Extração de RNA total ................................................................................. 24 3.5.2. Quantificação de RNA ................................................................................. 25 3.5.3. Construção do cDNA ................................................................................... 26 3.5.4. Análise da diferenciação osteoblástica por pcr em tempo real 

(Real‐time PCR) ........................................................................................... 26 3.6. Análise proteômica ................................................................................................. 30

3.6.1. Obtenção dos extratos protéicos de células‐tronco mesenquimais de medula óssea de rato e humana ........................................................... 30

3.6.2. Caracterização de protéinas por “shotgun proteomics” ............................ 30 3.6.3. Marcação isobárica para quantificação absoluta e relativa ‐ iTRAQ .......... 33

4. RESULTADOS .................................................................................................................... 38 4.1. Imunofenotipagem de células mesenquimais obtidas de medula óssea 

humana ................................................................................................................... 38 4.2. Caracterização da diferenciação osteoblástica ...................................................... 40

4.2.1. Atividade de fosfatase alcalina ................................................................... 40

 

 

4.2.2. Avaliação do processo de calcificação ........................................................ 42 4.2.3. Proliferação celular ..................................................................................... 44

4.3. Análise da expressão gênica durante a diferenciação osteoblástica ..................... 45 4.4. Análise proteômica de células mesenquimais de medula óssea de rato 

em diversas fases de diferenciação osteoblástica ................................................. 47 4.4.1. Identificação de proteínas por 1D‐LC‐MALDI‐TOF/TOF ............................. 47 4.4.2. Quantificação relativa de proteínas presentes nas diferentes 

fases da diferenciação osteoblástica utilizando isóbaros iTRAQ ............... 57 4.5. Análise proteômica de células mesenquimais da medula óssea humana 

em diversas fases de diferenciação osteoblásticas ................................................ 63 5. DISCUSSÃO....................................................................................................................... 72 6. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 83 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 85 8. ANEXOS .......................................................................................................................... 101    

 

 

 

 

 

 

 

INTRODUÇÃO 

 

 

 

INTRODUÇÃO  

 

2 

1. INTRODUÇÃO 

1.1. Definição e classificação das células‐tronco 

As células‐tronco (CT) são definidas como as células que se encontram no topo da hierarquia 

de uma linhagem com capacidade de auto‐renovação contínua (proliferação), possibilitando originar 

células funcionalmente e morfologicamente diferenciadas de um determinado tecido (diferenciação) 

(KOOY et al., 2000). 

Com relação à sua origem e suas propriedades biológicas, as CTs podem ser classificadas em 

embrionárias e adultas. As células‐tronco embrionárias são derivadas da camada interna do embrião, 

na  fase de desenvolvimento do blastocisto e possuem  capacidade de originar mais de 200  tipos 

celulares diferentes (ZHANG et al., 2006). Já as células‐tronco adultas estão presentes em órgãos ou 

tecidos  diferenciados,  como  cérebro,  medula  óssea,  vasos  sanguíneos,  pele  e  fígado  (BARRY; 

MURPHY, 2004) e são responsáveis pela manutenção da integridade dos tecidos, pelo reparo diante 

de lesões e pela remodelação dos tecidos (ZAGO; COVAS, 2006). 

Com  relação  ao  potencial  de  diferenciação,  as  CTs  podem  ser  classificadas  em  quatro 

categorias: totipotentes, pluripotentes, multipotentes e oligopotentes (ZHANG et al., 2006). 

As  células‐tronco  totipotentes  possuem  o  potencial  de  diferenciação  em  todos  os  tipos 

celulares desde os três folhetos embrionários (ectoderme, mesoderme e endoderme) até os anexos 

embrionários.  Tais  células  têm  a  capacidade  de  originar  um  ser  humano  completo  quando 

implantadas  em  um  útero  normal.    Particularmente  em  mamíferos,  apenas  os  zigotos  são 

totipotentes  (ZHANG  et  al.,  2006).  Entretanto,  na  fase  de  blastocisto,  as  camadas mais  internas 

podem originar células do folheto embrionário sendo denominadas de pluripotentes. Já a placenta 

originará células da camada mais externa (ZHANG et al., 2006). 

INTRODUÇÃO  

 

3 

As células multipotentes podem se diferenciar em determinados tipos celulares dentro de 

um  determinado  órgão;  por  exemplo,  as  células‐tronco  hematopoiéticas  adultas  darão  origem 

apenas a glóbulos vermelhos e brancos ou plaquetas (Figura 1). Células‐tronco oligopotentes podem 

originar poucos tipos celulares especializados; por exemplo, as células mesenquimais se diferenciam 

em células ósseas, musculares, lipídicas e células de tecidos conectivos (ZHANG et al., 2006).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 1. Representação esquemática da diferenciação da célula‐tronco multipotente em determinados  tipos celulares.  

 

1.2. Células‐tronco adultas e sua plasticidade celular 

As  células‐tronco  adultas  foram  isoladas  de  vários  tecidos,  dentre  eles:  hematopoiético, 

neural,  gastrointestinal,  epidermal, hepático  (JIANG  et  al.,  2002),  vascular, muscular, pancreático 

(SPPES et al. 2003), cordão umbilical (KIM et al., 2004; LEE et al., 2004), dentre outros. 

O  papel  fisiológico  destas  células  em  adultos  ainda  não  está  totalmente  esclarecido. 

Entretanto, o seu potencial de diferenciação in vitro em vários tecidos está sendo explorado, visando 

a regeneração óssea (LUYTEN, 2004) e de outros tecidos (BOCELLI‐TYNDALL et. at., 2007). As células‐

INTRODUÇÃO  

 

4 

tronco  tecido‐específicas,  até  pouco  tempo,  eram  consideradas  como  células  capazes  de  se 

diferenciar  somente em  células do  tecido de origem, ou  seja, multipotentes. Entretanto,  Jiang e 

colaboradores (2002) demonstraram que tais células podem se diferenciar em outras linhagens além 

das do tecido de origem (JIANG et al., 2002). 

Tal  atributo,  em  relação  à  potência  das  células‐tronco  adultas,  é  denominado  como 

plasticidade celular. Herzog e colaboradores (2003) definiram que a plasticidade se refere às novas 

habilidades, descritas na literatura, das células‐tronco adultas de atravessar barreiras de linhagem e 

adquirir fenótipos funcionais de células de outros tecidos (HERZOG et al., 2003), sendo tal definição a 

mais aceita pela comunidade científica. 

Experimentos in vivo demonstraram o processo de plasticidade através de modelos de lesão 

induzida  e  observações  da migração  e  diferenciação  dessas  células  para  as  áreas  lesadas  com 

subseqüente  regeneração  (HERZOG et al., 2003). Quatro hipóteses  são propostas para explicar a 

plasticidade observada em experimentos  in vivo  (Figura 2), entre elas:  (1) múltiplas células‐tronco 

(células de um determinado tecido podem existir em um órgão não relacionado); (2) fusão celular; 

(3)  transdiferenciação e  (4) pluripotência  (persistência de células‐tronco pluripotentes em  tecidos 

adultos). A primeira é atribuída à presença de CT em um dado tecido que poderiam se diferenciar 

em  células  de  um  tecido  não‐relacionado,  dando  a  falsa  impressão  de  plasticidade  (VERFAILLIE, 

2002). Um mecanismo alternativo seria a fusão celular de uma célula‐tronco adulta com uma célula 

diferenciada,  o  que  converteria  o  padrão  de  expressão  da  célula‐tronco  no  padrão  de  célula 

diferenciada.  Entretanto,  experimentos  in  vitro  têm mostrado  que  este  parece  ser  um  evento 

bastante raro (1/104 a 1/106) (JIANG et al., 2002; HERZOG et al., 2003; VERFAILLE, 2002). Há ainda a 

possibilidade de uma célula diferenciada  sofrer  reprogramação genética e  tornar‐se pluripotente, 

fenômeno  denominado  transdiferenciação  ou  desdiferenciação  (VERFAILLIE,  2002).  Uma  última 

INTRODUÇÃO  

 

5 

explicação  seria a permanência de células‐tronco pluripotentes em  tecidos adultos  (JIANG, et al., 

2002;  VERFAILLIE,  2002).  A  presença  desses  tipos  celulares  no  organismo  adulto  não  é 

completamente  aceita  na  comunidade  científica,  devido  às  contradições  nos  experimentos 

realizados in vitro e in vivo. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2. Representação esquemática dos possíveis processos de plasticidade celular. A) Existência de células de um  determinado  tecido  em  um  órgão  não‐relacionado. B)  Fusão  entre  célula‐tronco  e  célula  diferenciada.  C) Reprogramação genética. D) Presença de células‐tronco pluripotentes em tecidos adulto. 

 

Song e Tuan  (2004) mostraram que  células‐tronco mesenquimais humanas podem  sofrer 

transdiferenciação  in vitro em outros  tipos celulares de acordo com o estímulo externo. Ou  seja, 

quando  o  agente  indutor  de  diferenciação  é  trocado,  as  células  totalmente  diferenciadas 

(osteoblastos,  condrócitos  e  adipócitos)  poderiam  sofrer  transdiferenciação  a  um  estágio 

indiferenciado através de reprogramação genética. Esses autores conseguiram originar adipócitos e 

condrócitos a partir de osteoblastos derivados de CTMs, bem como osteócitos e condrócitos a partir 

de adipócitos e osteoblastos e adipócitos a partir de condrócitos (SONG & TUAN, 2004). 

INTRODUÇÃO  

 

6 

Outros estudos mostraram uma série de eventos de transdiferenciação: células de músculo 

esquelético  (células  satélites)  em  células  sanguíneas  (TSAI;  KITTAPPA;  MCKAY,  2002;  CAPLAN; 

BRUDER,  2001);  do  sistema  nervoso  central  em  musculares,  hepatócitos, miocárdio  e  neurais; 

hematopoéticas  em  epitélio  e  tecidos  endodérmicos  e  ectodérmicos  (TSAI;  KITTAPPA; MCKAY, 

2002). A falta de consenso na literatura envolve o fato de que os dados coletados são geralmente 

baseados em características morfológicas e ensaios imunohistoquímicos, o que pode ser insuficiente 

para  concluir  que  estas  células  irão  se  integrar  funcionalmente  nos  tecidos.  Segundo  estudos 

desenvolvidos por Verfaillie (2002), Grove e colaboradores (2004) a ausência de provas funcionais in 

vivo se torna insustentável a conclusão de que estas células são, de fato, plásticas. 

 

1.3. Células‐tronco mesenquimais 

Dentre os diversos  tipos de células‐tronco adultas, as células‐tronco mesenquimais  (CTM) 

compõem um grupo que vem despertando grande interesse. 

Segundo Minguell e colaboradores (2001), a multipotencialidade, bem como a facilidade de 

isolamento e sua expansão  in vitro, tornam as CTMs uma alternativa terapêutica atrativa com um 

amplo espectro de aplicações  clínicas no  contexto de  terapia  celular  (MINGUELL et al., 2001). O 

interesse neste  tipo  celular  cresceu nos últimos anos devido  ao  seu grande potencial de uso na 

regeneração de tecidos e órgão lesados, como vem sendo demonstrado nos estudos clínicos e pré‐

clínicos  (BARRY; MURPHY, 2004). As CTMs  são  responsáveis pela manutenção do microambiente 

estromal da medula óssea  e participam  como  agentes  reguladores da hematopoiese  (GARTNER; 

HIATT, 2007). 

Em  1867,  com  estudos  realizados  pelo  patologista  Julius  Friedrich  Cohnheim,  surgiu  a 

primeira  evidência  de  que  células  não  hematopoéticas  apresentavam  potencial  regenerativo. 

Cohnheim, com base em suas observações em  trabalhos de  reparo de  feridas,  identificou não só 

INTRODUÇÃO  

 

7 

células  inflamatórias,  mas  também  células  com  formato  fibroblastóide  agindo  no  local  da 

cicatrização. Foi observado  também que a maioria das  células, as quais atuavam na cicatrização, 

eram, provavelmente, oriundas da medula óssea (FEHRER; LEPPERDINGER, 2005). 

Após  um  século,  as  CTMs  foram  originalmente  descritas  por  Alexander  Friedenstein  e 

colaboradores em 1966 e posteriormente em 1970 e 1974 (FRIEDENSTEIN et al., 1966). No entanto, 

nestes  estudos  os  autores  propuseram  somente  a  identificação  de  uma  população  de  células 

fibroblastóides com capacidade de aderência e formação de colônias CFU‐Fs (“colony‐forming units‐

fibroblast”) in vitro.  

Arnold Caplan, em 1991, propôs que as CTMs poderiam ser  isoladas da medula óssea de 

indivíduos adultos e seriam correspondentes às CTMs do embrião. Nesse trabalho, o autor relatou 

que essas células poderiam ser utilizadas terapeuticamente para tratamento de doenças ósseas e 

articulares. 

As  CTMs  ganharam  maiores  destaque  na  comunidade  científica  há  apenas  quase  uma 

década. Entretanto, evidências in vivo de que as referidas CTMs possuam características de célula‐

tronco (CT) como capacidade de auto‐renovação, sobrevivência por um longo período e repopulação 

tecidual com potencial de diferenciação em múltiplas  linhagens permanecem escassas  (PHINNEY, 

2002 e HORWITZ et al., 2005) assim como estudos proteômicos  relacionados com o processo de 

diferenciação dessas células. 

A  Sociedade  Internacional  de  Terapia  Celular  (SITC),  em  2005,  com  o  objetivo  de 

promover o uso de uma  terminologia padronizada para  facilitar o  intercâmbio de  conhecimento 

entre pesquisadores da área, propôs que as células aderentes ao plástico, atualmente chamadas 

células‐tronco  mesenquimais,  sejam  nomeadas  como  células  estromais  mesenquimais 

multipotentes.  A  terminologia  células‐tronco mesenquimais  deve  ser  utilizada  apenas  para  um 

INTRODUÇÃO  

 

8 

subgrupo destas células que demonstrem atividade de células‐tronco através de critérios mínimos 

(HORWITZ  et  al.,  2005).  A  SITC  estabeleceu  três  critérios  mínimos  para  definir  as  células 

estromais mesenquimais multipotentes:  (1º)  essas  células  devem manter  a  propriedade  de 

aderência  ao  plástico  quando  submetidas  a  uma  condição  padrão  de  cultura;  (2º) 

obrigatoriamente  devem  expressar  como  moléculas  de  superfície  celular  os  marcadores 

CD105, CD73 e CD90 e, simultaneamente, não expressar CD45, CD34, CD14 (ou CD11b, CD79a  

ou  CD19)  e  HLA‐DR  e  (3º)  esses  tipos  celulares  devem,  pelo  menos,  diferenciar  em 

condroblastos, adipócitos e osteoblastos  in vitro  (DOMINICI et al., 2006). A versatilidade e a 

abundância  de  fontes  para  obtenção  destas  células  são  notáveis.  Assim  como  as  demais 

células‐tronco  adultas,  vários estudos demonstram  a plasticidade destas  células  in  vivo e  in 

vitro (Figura 3). Todavia, no presente trabalho, somente por razões de conveniência, as células 

estromais mesenquimais multipotentes serão denominadas de células‐tronco mesenquimais. 

 

 

 

INTRODUÇÃO  

 

9 

Figura 3. Potencialidade de diferenciação das células‐tronco mesenquimais da medula óssea.  

 

As CTMs são consideradas progenitores multipotentes e podem ser caracterizadas  in vitro 

pelo  seu  potencial  de  diferenciação  (sob  estímulo  adequado)  em:  osteócitos,  condrócitos  e 

adipócitos.  Essas  células  também  possuem  grande  habilidade  para  a  produção  de  um  número 

variado  de  citocinas  e  fatores  de  crescimento  (AWAD  et  al.,  1999,  CAPLAN;  BRUDER,  2001  e 

CHATEAUVIEUX et al., 2007).  As CTMs estão sendo testadas para o tratamento de doenças cardíacas 

isquêmicas e degenerativas,  lesões ósseas, condrais, tendinosas, pulmonares, da medula espinhal, 

do sistema nervoso central, do fígado e em doença genéticas como a osteogênese imperfeita (ZAGO; 

COVAS, 2006). 

Como  parte  do  nicho  das  CT  hematopoiéticas,  as  CTMs  participam  na  regulação  da 

sobrevivência, quiescência e diferenciação em células sanguíneas maduras. As CTMs exercem uma 

influência na formação inicial de linfócitos B, sendo a interação com as células estromais da medula 

óssea  fundamental  para  o  desenvolvimento  normal  dos  progenitores  de  linfócitos  B.  Foi 

demonstrado que a galectina‐1 é um ligante da célula estromal para o receptor pré‐B humano, que é 

INTRODUÇÃO  

 

10 

indispensável  para  a  sobrevivência  do  linfócito  B  imaturo.  Interessantemente,  a  galectina‐1  é 

altamente expressa em CTMs (AGGARWAL; PITTENGER, 2005). 

Nos  estudos  com  células  de medula  óssea  já  era  conhecida  a  existência  de  um  grande 

número de células que se aderiam ao plástico na cultura, proporcionando um microambiente para o 

crescimento das CT hematopoiéticas e para a diferenciação em granulócitos e eritrócitos. Observou‐

se que os precursores hematopoiéticos interagiam diretamente com estas células aderentes e estas 

compartilham muitas características com as CTMs (PROCKOP, 1997). 

Pitterger  e  colaboradores  (1999)  realizaram  o  isolamento,  a  expansão  e  a  caracterização 

destas células a partir de medula óssea humana extraída da crista ilíaca. Estas células multipotentes, 

responsáveis pela composição em torno de 0,001% a 0,01% das células nucleadas da medula óssea 

adulta,  crescem  in  vitro  de maneira  aderente,  como  células  fibroblastóides  em meio  de  cultura 

apropriado. Observou‐se  ainda  a  capacidade  das  células  expandidas de  se  diferenciar, mediante 

estímulos específicos, em linhagens mesenquimais tais como: ossos, cartilagens, adipócitos, tendões, 

músculos e estroma medular (PITTERGER et al., 1999). 

Do  ponto  de  vista  fisiológico,  a  diferenciação  de  CTM  em  osteoblastos  é  importante  na 

manutenção das espículas trabeculares ósseas, que compõem a medula óssea. Por outro lado, com a 

idade, a medula é parcialmente substituída por tecido adiposo, o que explicaria a diferenciação em 

adipócitos.  Com  relação  aos  condroblastos,  pode  estar  relacionada  ao  reparo  inicial  de  fraturas 

(PROCKOP, 1997). 

As CTMs são encontradas tipicamente na  fração estromal da medula óssea adulta, porém 

nos últimos  anos,  células  exibindo  características morfológicas de CTM  foram  isoladas de  tecido 

adiposo (ZUK et al., 2001), trabéculas ósseas (SOTTILE et al., 2002), cordão umbilical (LEE et al., 2004; 

INTRODUÇÃO  

 

11 

KIM et al., 2004) sangue fetal, fígado, pulmão, vilo coriônico da placenta e fluido amniótico (JACKSON 

et al., 2007). 

A presença destas células em sangue periférico adulto é controversa. O estudo conduzido 

por Zvaifler et al. (2000) demonstrou que existem CTMs no sangue periférico de indivíduos normais. 

Já DA SILVA MEIRELLES; CHAGASTELLES; NARDI (2006) demonstraram que as CTMs são encontradas 

em todos os tecidos, exceto em sangue periférico, sugerindo que o compartimento perivascular deva 

ser considerado um novo nicho para estas células. 

O  método  de  isolamento  tradicional  baseia‐se  na  característica  das  CTMs  aderirem 

seletivamente em superfícies plásticas, enquanto as hematopoiéticas são removidas com as trocas 

de meio de cultura. Não há um marcador específico que a identifique, por isso diferentes grupos têm 

optado por uma variedade de combinações de marcadores, a maioria inclui CD29 e CD105 (JACKSON 

et al., 2007). 

A  diferenciação  de  células‐tronco mesenquimais  em  células  neurais  foi  demonstrada  em 

vários trabalhos tanto in vitro como in vivo. Entretanto, a capacidade de geração de neurônios com 

capacidade funcional é hipotética. De acordo com o estudo de Mareschi e colaboradores (2006), a 

presença  de  marcadores  e  morfologia  neurais,  somadas  às  propriedades  eletrofisiológicas 

características, demonstram a capacidade de células‐tronco mesenquimais de medula óssea gerar 

células que se assemelham a neurônios. 

Reyes e  colaboradores  (2002) mostraram que  as MAPCs  (Multipotent  adult  progenitors 

cells)   diferenciam em células com morfologia e  fenótipo endotelial  tanto  in vitro quanto  in vivo. 

Ferrari  e Mavilio  (2002)  observaram que  as  células  de medula  óssea  entravam  em  processo  de 

diferenciação miogênica frente a danos musculares, participando assim do reparo muscular. Outros 

estudos sugerem ainda que CTMs podem dar origem a endotélio, hepatócitos, células neurais após 

INTRODUÇÃO  

 

12 

injeção em blastocistos (TSAI; KITTAPPA; MCAY, 2002; MINGUELL; ERICES; CONGET, 2001; CAPLAN; 

BRUDER, 2001). 

 

1.4. Células‐tronco mesenquimais e diferenciação em osteoblastos 

O  modelo  de  diferenciação  in  vitro  de  CTMs  em  osteoblastos  é  clássico  e  de  fácil 

reprodutibilidade para estudos de diferenciação celular. 

Jaiswal  e  colaboradores  (1997)  desenvolveram  um  sistema‐modelo  de  indução  de 

diferenciação de CTMs humanas  adultas  em osteoblastos. O protocolo otimizado  inclui meio de 

cultura (DMEM ou α‐MEM) suplementado com indutores (dexamentasona 100nM, β‐glicerofosfato 

10nM e ácido ascórbico 0,05nM). 

Os  glicocorticóides  endógenos  estão  envolvidos  no  remodelamento  e  formação  óssea. A 

dexametasona é um potente corticosteróide muito utilizado na avaliação de respostas celulares  in 

vitro.  O  ácido  ascórbico,  essencial  em  culturas  de  células  osteogênicas,  age  como  cofator  na 

hidroxilação de resíduos de lisina e prolina do colágeno, atuando ainda como promotor da síntese de 

matriz óssea (JAISWAL et al., 1997). 

Segundo Long (2001), a osteopoiese pode ser definida como o processo de desenvolvimento 

de  células  ósseas  que  geram  osteoblastos  a  partir  de  células‐tronco  mesenquimais.  O  termo 

osteogênese  deve  ser  reservado  para  a  geração  de matriz  óssea mineralizada  por  osteoblastos 

maduros. 

A  indução da osteopoiese é observada pelo aparecimento de morfologia de osteoblastos 

(forma cubóide), pelo aumento na atividade de fosfatase alcalina e formação de matriz extracelular 

mineralizada (JAISWAL et al., 1997). 

INTRODUÇÃO  

 

13 

Quatro  estágios  na  maturação  destas  células  são  observados,  de  acordo  com  critérios 

morfológicos  e  histoquímicos:  pré‐osteoblasto,  osteoblasto,  osteócito  e  células  de  revestimento 

ósseo (AUBIN, 1998). 

Segundo  Long  (2001),  pode‐se  compartimentalizar  de  acordo  com  o  estágio  do 

desenvolvimento  em:  CTM,  células  osteoprogenitoras,  pré‐osteoblastos  e  osteoblastos.  As 

osteoprogenitoras seriam células comprometidas com a linhagem óssea. 

Osteoblastos  são definidos como células pós‐proliferativas, cubóides,  fortemente positivas 

para fosfatase alcalina, que revestem a matriz óssea em regiões ativas de produção de matriz. Os 

osteoblastos podem ainda ser identificados pela capacidade de sintetizar macromoléculas fenótipo‐

específicas,  como  proteínas  da  matriz  óssea,  receptores  de  hormônios,  citocinas  e  fatores  de 

crescimento. O fenótipo de um osteoblasto maduro é definido pela habilidade de síntese de tecido 

mineralizado, conhecido como osso (AUBIN, 1998). 

Aproximadamente 10‐20% de osteoblastos são  incorporados na matriz extracelular recém‐

formada fazendo parte do estágio maduro de diferenciação da linhagem osteoblástica, os osteócitos. 

Estes, são menores que os precursores, perdem muitas organelas citoplasmáticas e são considerados 

metabolicamente inativos (AUBIN, 1998). 

Os ossos são responsáveis pelas funções de locomoção, suporte e proteção de órgãos vitais 

(encéfalo, medula espinhal, coração e pulmões), suporte da hematopoiese na medula óssea, reserva 

de minerais, especialmente cálcio, apoio para músculos, ligamentos e tendões. 

A  deposição  óssea  e  a  reabsorção,  efetuados  por,  respectivamente,  osteoblastos  e 

osteoclastos, são processos dinâmicos que ocorrem continuadamente (COHEN, 2006). 

A  compreensão  dos  processos  celulares  e mecanismos moleculares  da  formação  óssea 

requer a identificação de genes e proteínas envolvidos no comprometimento das CTMs, proliferação 

INTRODUÇÃO  

 

14 

de osteoprogenitores, diferenciação e mineralização  (LONG, 2001; NAKASHIMA; CROMBRUGGHE, 

2003). 

A obtenção de osteoblastos  funcionais a partir de  células‐tronco mesenquimais  tem  sido 

utilizada amplamente na engenharia de tecidos e terapia celular. Ohgushi e colaboradores  (2004) 

desenvolveram um estudo envolvendo mais de 30 pacientes usando CTMs para  reconstrução de 

ossos após excisão cirúrgica. As células foram extraídas da medula óssea e cultivadas sobre próteses 

de hidroxiapatita e fosfato tricálcio e então implantadas nos locais lesados. 

Infusões  intravenosas  de  CTM  humanas  expandidas  ex  vivo  foram  bem  toleradas  em 

pacientes voluntários e parecem ser seguras (DEANS; MOSELEY, 2000). 

   

1.5. Abordagem proteômica 

Vários  estudos  têm  demonstrado  que  a  medula  óssea  (MO)  é  dos  locais  em  que  se 

encontram  as  células‐tronco  mesenquimais.  De  acordo  com  Baksh  e  colaboradores  (2004),  as 

células‐tronco mesenquimais adultas expressam oito genes essenciais durante a diferenciação em 

condroblastos, osteoblastos e adipócitos. De acordo com os achados desses autores, 235 genes são 

comuns  entre  os  processos  de  adipogênese  e  osteogênese,  quando  comparado  com  3  genes 

comuns  entre  a  condrogênese  e  osteogênese,  e  10  genes  comuns  para  adipogênese  e 

condrogênese, sendo que os dois tipos celulares (adipócitos e osteoblastos) vieram de um mesmo 

precursor. Ou seja, os processos celulares e moleculares da diferenciação de CTMs foram elucidados 

em nível genômico (ÇELEBI et al. 2010). 

Recentemente,  foi  relatado  que  proteínas  são  reguladas  através  de  períodos  específicos 

durante o processo de diferenciação das CTMs, podendo desempenhar um papel na diminuição do 

potencial de proliferação de CTMs de medula óssea de ratos durante os períodos de cultivo celular 

(ÇELEBI et al. 2009).  

INTRODUÇÃO  

 

15 

A possibilidade de diferenciação de CTMs‐MO de ratos em condições de cultura, na ausência 

de estímulos, em outros tipos celulares é um processo lento e contínuo (ÇELEBI et al. 2009). Nesse 

contexto, a utilização da ferramenta proteômica na análise das proteínas que estão sendo expressas 

durante o processo de diferenciação das CTMs é praticamente ausente. 

A  espectrometria  de massas  é  atualmente  o método  para  identificação  e  para  análise 

estrutural  utilizado  em  estudos  proteômicos,  devido  à  sua  alta  sensibilidade  e  a  capacidade  de 

produzir  informações estritamente com base em estrutura de proteínas e peptídeos. A proteína é 

identificada  por  correlação  com  sequências  depositadas  em  banco  de  dados,  utilizando‐se  de 

parâmetros  restritivos,  tais  como  grupo  de massas  de  peptídeos  e  sequências  de  aminoácidos 

parciais ou  totais obtidas de peptídeos que  foram produzidos por proteólise  limitada  (GRAVES & 

HAYSTEAD, 2002). 

Ye  e  colaboradores  (2006)  demonstraram  os  efeitos  do  indutor  de  cardiomiócitos,  5‐

azacitidina, em CTMs‐MO de ratos, sendo que 9, entre as 34 proteínas identificadas pela análise por 

MALDI‐TOF‐MS,  mostraram  distinta  regulação  protéica  depois  do  tratamento  com  o  indutor. 

Estudos  realizados  por  Sun  e  colaboradores  (2006) mostraram mudanças  no  perfil  proteômico 

durante a diferenciação de CTMs humanas no processo da osteogênese. 

A abordagem “shotgun proteomics” (SP) compreende a produção de uma mistura complexa 

de peptídeos, obtidos por  tratamento enzimático  com  tripsina de proteínas extraídas a partir de 

células inteiras. A análise proteômica por SP é complementar ao método de separação de proteínas 

por  gel  bidimensional. O método  de  SP  é  extremamente  útil  para  a  identificação  de  classes  de 

proteínas de difícil análise em gel bidimensional, dentre elas, as proteínas de membrana, proteínas 

com ponto isoelétrico muito alcalino e proteínas de alta massa molecular (FOURNIER et al., 2007). 

INTRODUÇÃO  

 

16 

Outra  abordagem  proteômica  consiste  na marcação  isobárica  (iTRAQ)  para  quantificação 

absoluta e relativa que se baseia na derivação de grupos amino primários de peptídeos obtidos após 

o  processo  de  digestão.  Esse  método  permite  marcar  peptídeos  de  diferentes  amostras  com 

diferentes isóbaros denominado iTRAQ (8 plex, m/z 113, 114, 115, 116, 117 e 118). Estas amostras 

são reagrupadas após a derivação química, separadas por nano‐HPLC e, posteriormente, submetidas 

à análise em espectrometria de massas. Durante o processo de  fragmentação dos  íons peptídeos 

tripsínicos que foram marcados, ocorre a formação de íons repórteres de baixa massa (m/z 113, 114, 

115, 116, 117 e 118) (“low mass zoom”) que são utilizados para a quantificação relativa da proteína 

nas  diversas  amostras  em  uma  análise  única,  seguindo  o  princípio  da  diluição  isotópica,  como 

descrito por Shadforth e colaboradores (2005). 

Os  trabalhos  na  literatura,  relacionando  a  diferenciação  das  CTMs  em  osteoblastos,  são 

escassos, havendo a necessidade de uma análise minuciosa do perfil protéico dessas células para 

entendermos os aspectos biológicos referentes ao processo de diferenciação celular in vitro para a 

utilização das mesmas no auxílio dos biomateriais que são usados em processos ortopédicos.  

 

 

 

 

 

 

 

 

OBJETIVOS 

 

OBJETIVOS  

 

17 

2. OBJETIVOS 

2.1. Objetivo geral 

Investigar  o  perfil  protéico,  por  análise  proteômica,  nas  diversas  fases  da  diferenciação 

osteoblástica  (células  indiferenciadas,  pré‐osteoblastos  e  osteoblastos)  de  células‐tronco 

mesenquimais  de  medula  óssea  de  ratos  e  humana,  visando  obter  subsídios  para  a 

compreensão de eventos celulares e moleculares envolvidos no processo de diferenciação 

celular. 

 

2.2. Objetivos específicos 

Cultivo  e  caracterização  morfológica  e  imunofenotípica  de  células‐tronco 

mesenquimais  de  medula  óssea  de  rato  e  humana  em  diferentes  estágios  de 

diferenciação osteoblástica durante 7, 14 e 21 dias após estímulos osteogênicos. 

Análise proteômica dos extratos de células mesenquimais de medula óssea de rato e 

humana em diferentes estágios de diferenciação osteoblástica pela combinação de 

eletroforese  em  gel  de  poliacrilamida  com  SDS  seguida  de  cromatografia  de  alta 

performance  de  fase  reversa  e  identificação  de  proteínas  por  espectrometria  de 

massas tipo MALDI‐TOF/TOF. 

Quantificação  relativa  de  proteínas  nos  diferentes  extratos  celulares  utilizando  a 

marcação com isóbaros e espectrometria de massas. 

Análise  da  expressão  gênica  de  células‐tronco mesenquimais  de medula  óssea  de 

rato e humana quanto ao grau de diferenciação osteoblástica através de Real Time 

PCR. 

 

 

 

 

 

 

 

 

MATERIAL E MÉTODOS 

 

MATERIAL E MÉTODOS  

 

19 

3. MATERIAL E MÉTODOS 

3.1. Obtenção das células‐tronco mesenquimais de medula óssea de rato 

Células mesenquimais de medula óssea de rato  foram obtidas e submetidas ao 

estudo  genômico  e  proteômico  segundo  o  delineamento  experimental mostrado  na 

figura 4. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 4. Delineamento experimental para estudo da diferenciação das células‐tronco mesenquimais de medula óssea de rato. 

 

Células mesenquimais  foram  obtidas  de  fêmures  de  quatro  ratos  da  espécie 

Wistar,  sob aprovação prévia do Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de 

Medicina  de  Catanduva  (Fundação  Padre  Albino)  (ANEXO  A).  Estas  células  foram 

cultivadas em frascos de cultura de 75mm2 em meio essencial mínimo, modificação alfa 

(Gibco‐Life  Technologies,  EUA),  suplementado  com  15% de  soro  fetal bovino  (Gibco), 

50µg/mL  de  vancomicina  (Acros  Organics,  Bélgica),  20µg/mL  de  ampicilina  (USB 

Corporation, EUA) e 0,3µg/mL de fungisona (Gibco) durante cerca de 6‐7 dias. Durante 

MATERIAL E MÉTODOS  

 

20 

todo o período, as células  foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada contendo 

5% de CO2 e 95% de ar atmosférico, sendo os meios trocados a cada 3 dias. 

 

3.2. Obtenção de células‐tronco mesenquimais de medula óssea humana 

A figura 5 apresenta o delineamento experimental utilizado no presente trabalho 

para  o  estudo  genômico  e  proteômico  de  células  mesenquimais  de  medula  óssea 

humana. 

Células mesenquimais  foram obtidas de descartes de pacientes, entre 20 a 25 

anos,  submetidos  a  cirurgias  ortopédicas  no  Hospital  das  Clínicas  da  Faculdade  de 

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP‐USP), sob aprovação 

prévia do Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto  (FORP‐USP) 

(ANEXO B).  Estas  células  foram  cultivadas  em  frascos de  cultura de  75mm2  em meio 

essencial mínimo, modificação alfa  (Gibco‐Life Technologies, EUA), suplementado com 

10%  de  soro  fetal  bovino  (Gibco),  20µg/mL  de  ampicilina  (USB  Corporation,  EUA)  e 

0,3µg/mL de  fungisona  (Gibco) durante cerca de 4‐5 dias. Durante  todo o período, as 

células foram mantidas a 37°C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de 

ar atmosférico, sendo os meios trocados a cada 3 dias. 

 

3.2.1. Caracterização imunofenotípica das células‐tronco mesenquimais humanas 

As  células‐tronco  mesenquimais  humanas  foram  caracterizadas  por 

imunofenotipagem  nos  diferentes  graus  de  diferenciação  celular  (pré‐osteoblastos  e 

osteoblastos)  por  citometria  de  fluxo  com  diferentes  anticorpos  monoclonais  de 

moléculas de superfície celular (CD45, CD14, CD61, CD44, CD29, CD13, CD90, HLA classe 

MATERIAL E MÉTODOS  

 

21 

1, HLA  classe  2,  CD34,  CD73,  CD49e,  CD105,  caderina,  CD54,  CD31,  CD106,  CD166  e 

CD146 – BD Biosciences) conforme instruções do fabricante. 

Figura 5. Delineamento experimental para estudo da diferenciação das células‐tronco mesenquimais de medula óssea humana. 

 

3.3. Padronização das condições de diferenciação osteoblástica 

Ao final de 6‐7 dias (para CTM de rato) ou 4‐5 dias (para CTM humana), as células 

foram removidas dos frascos de cultura por lavagem com solução contendo EDTA 1mM 

(Gibco,  EUA)  e  tripsina  0,25%  (Gibco,  EUA)  e  contadas  em  hemocitômetro.  Células 

obtidas  da  cultura  primária  foram  cultivadas  em  frascos  de  cultura  de  25  mm2  na 

ausência  (MEM)  ou  na  presença  dos  estimuladores  da  osteogênese  (MTS):  ácido 

ascórbico  (Gibco)  na  concentração  final  de  5µg/mL,  β‐glicerofosfato  7mM  (Sigma)  e 

dexametasona 0,1µM (Sigma, EUA). 

 

MATERIAL E MÉTODOS  

 

22 

3.4. Caracterização da diferenciação osteoblástica 

3.4.1.  Determinação dos níveis enzimáticos de fosfatase alcalina 

As  células  foram  caracterizadas  aos  7,  10  e  14  dias,  quanto  ao  grau  de 

diferenciação celular (pré‐osteoblastos e osteoblastos) pela determinação da atividade 

enzimática  de  fosfatase  alcalina  (ALP)  (proteína  presente  nos  estágios  iniciais  de 

diferenciação dos osteoblastos). 

A atividade de ALP foi medida através da liberação de timolftaleína pela hidrólise 

do substrato timolftale�