Biguaçu - Univalisiaibib01.univali.br/pdf/Isaac Pittigliani Jorge.pdf · 2014. 5. 22. · Aos meus irmãos, Iara e Igor, meus companheiros e amigos verdadeiros, os quais eu deixei

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAI

ISAAC PITTIGLIANI JORGE

ANÁLISE DO COMPORTAMENTO NOCICEPTIVO DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS À AVULSÃO DO PLEXO BRAQUIAL

Biguaçu 2011

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Monografia apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Fisioterapia na Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências da Saúde. Orientadora: Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão

Biguaçu, novembro de 2011.



Esta monografia foi julgada adequada para a obtenção do título de Bacharel em Fisioterapia e aprovada pelo Curso de Fisioterapia da Universidade do Vale do Itajaí, Centro de Ciências da Saúde. Área de Concentração: Farmacologia da dor.

Biguaçu, 21 de novembro de 2011.

______________________________________

Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão UNIVALI – Centro de Ciências da Saúde

Orientador

______________________________________ Profa. Dra. Kathryn Ana Bortolini Simão da Silva

UNIVALI – Centro de Ciências da Saúde Membro

______________________________________

Profa. Ma. Gislaine Franciele da Silva Membro

Este trabalho é dedicado a minha família.

Meus pais, CarlosCarlosCarlosCarlos e GicéliaGicéliaGicéliaGicélia que me ensinaram o valor de um sonho,

e compreenderam minha ausência.

Os meus irmãos IaraIaraIaraIara e IgorIgorIgorIgor, que mesmo longe sempre estiveram ao

meu lado em todas as etapas da minha vida.

À minha esposa MarivaneMarivaneMarivaneMarivane que de forma especial e carinhosa me deu

força e coragem, me apoiando nos momentos mais difíceis desta

minha jornada acadêmica.

E ao meu filho Luiz MiguelLuiz MiguelLuiz MiguelLuiz Miguel que com sua inocência de criança me

fez ser pai.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à Deus, pela vida, por estar sempre no meu

caminho, iluminando-me e guiando-me às escolhas certas, e por me privilegiar de

exercer uma profissão magnífica.

Aos meus pais, Carlos e Gicélia, que me deram toda a estrutura para que me

tornasse a pessoa que sou hoje. Pela confiança e pelo amor que me fortalece todos

os dias. Que mesmo longe sempre me incentivaram a continuar nesta luta e

compreenderam minha ausência durante todos estes anos fora de casa.

Aos meus irmãos, Iara e Igor, meus companheiros e amigos verdadeiros, os

quais eu deixei em Imbituba para eu poder levar a diante este meu sonho de ser

fisioterapeuta, deixando de participar do crescimento de vocês, e quando me dei

conta já eram adultos e não mais crianças, saudade é o que eu posso descrever,

amo vocês.

A professora Dra. Nara Lins Meira Quintão, meu agradecimento em especial

pela orientação, por seus ensinamentos a mim transmitidos que me acompanharão

por toda a vida, por todos estes anos de estudo e dedicação a pesquisa que

passamos juntos, nas horas que passei cronometrando meus animais e você estava

ali para me ajudar a dar continuidade ao trabalho, por acreditar que hoje eu estaria

chegando aonde cheguei.

Ao Professor Me. Marcelo Dias, por acreditar em meu potencial, transmitindo

seus ensinamentos incansavelmente, mostrando o caminho certo a seguir,

corrigindo meus erros, incentivando meus acertos, estando você junto a nossa turma

desde o início de minha vida acadêmica.

Ao Professor Cristiano Coelho, um grande amigo, pelas suas caronas quando

eu morava em Tijucas, tirando dúvidas em sala de aula, argumentando o porquê das

minhas respostas esperando sempre mais de mim. Deixando saudades quando saiu

do quadro de docentes.

Aos professores, de uma forma geral que me deixavam dormindo até o ultimo

minuto antes das aulas começarem e entenderam minhas horas sonolentas no

período em que eu trabalhava de madrugada, estudava pela manhã e dormia

somente à tarde, repassando a matéria em momentos de dúvidas e incertezas

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ocasionadas pelo sono.

Aos professores: Aline Moreira, Ana Paula, Angelise Mozerle, Cladis Moraes,

Claudia Thofehrn, Clarice Pamplona, Cristiani Burguer, Daniela Simoni, Eliana

Trevisan, Elaine Farina, Fabiane Dell, Isabela Sell, Juliana Vidotto, Mariem El Saya,

Rita de Cássia, Adriano de Sousa, Alceu Furtado, Felipe Lacerda... entre outros,

pelos ensinamentos durante estes longos seis anos de estudo, que sempre se

propuseram a esclarecer dúvidas, sempre mostrando o melhor caminho e a serem

seguidos, pelos momentos de distração, conversas e seriedade, transmitindo sábios

conhecimentos durante todo esse tempo.

A técnica do laboratório de farmacologia de Itajaí, Maria Angélica, a Maggie,

pelos momentos de ajuda com o cuidado de meus animais após as longas cirurgias,

as horas de conversas, risadas e cafezinhos para descontrair e passar o tempo, meu

imenso carinho.

Aos meus colegas, amigos de laboratório que me ajudaram durante as horas

de pesquisa e experimento, no laboratório de farmacologia, as viagens para

congressos e o companheirismo... são vocês: Gislaine, Isabel, Zeca, Ana Paula,

Juliana, Philipe, Nicole, Lilian, Rosana, Luiz Carlos, Iandra, Maurício, Ana Roseli,

Gabriel, Diogo... amigos que jamais vou esquecer.

Ao Douglas, meu companheiro de quarto nos congressos, pelas horas de

descontração e estudo, pelos momentos de troca de conhecimento e ansiedade

pelas apresentações dos banners.

As minhas amigas e companheiras de jornada, meninas, mulheres em

especial, por me aturarem durante todos estes anos juntos de formação e

aprendizado, pelas horas de descontração e divertimento com nossos pacientes e

nas horas sérias durante as aulas e atendimentos... são vocês: Célia, Fabiane,

Letícia, Mariana, Regiani, Suely e Vanessa... amigas as quais estarão sempre em

meu coração, porque eu sei o quanto é difícil suportar minha presença.

Em especial a minha companheira e amiga de jornada Célia Regina Caetano

Fernandes, pelos vários e incontáveis momentos de risadas e descontração pelos

ensinamentos que dela eu absorvi, pelos momentos de atendimento que não foram

poucos, pela nossa sincronia durante todos estes anos que com você eu convivi,

pelo carinho com o qual você tem e sabe passar aos outros, por me apoiar todo

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esse tempo que passamos juntos, pessoa igual a você é raridade, que esta nossa

amizade flua eternamente, amo você.

Ao meu amigo Maurício Milanese pelas horas de “happy hour” fora do

cotidiano acadêmico.

Aos meus amigos de jornada na Portobello, que sempre acreditaram que um

dia eu chegaria até aqui, me incentivando, me encobertando enquanto eu estudava

durante o horário de trabalho, me deixando dormir uns minutos a mais durante os

poucos minutos de café, pelas horas incansáveis de trabalho, conversas e risadas...

São vocês: Tonho, Dioclei, Dione, Moisés, Pacheco entre muitos outros que não me

recordo no momento... vocês sempre estarão marcados em minha vida.

Aos meus primos... Ellen, André, Arthur, Lúcia e Clau... por me ajudarem

durante minha morada em Tijucas, sem vocês eu não estaria hoje onde estou e em

especial a minha afilhada Letícia, um amor de menina.

À Marivane... por hoje fazer parte da minha história, esposa e amiga, pelas

inúmeras horas de dedicação ao meu lado, durante as horas extras de experimento,

ficando ao meu lado, pelo seu jeito alegre, seu sorriso encantador, pelos momentos

de descontração e conversas intermináveis ao final dos experimentos aos arredores

de Itajaí e por ter dado a mim a dádiva de ser pai. Amo você e o nosso filho Luiz

Miguel.

À Universidade do Vale do Itajaí, por disponibilizar instalações e materiais

para a realização deste trabalho.

E por fim, agradeço ao PROBIC/PIBIC pelo apoio financeiro.

Muito obrigado...

““““Não despreze Não despreze Não despreze Não despreze oooo filhote fraco.filhote fraco.filhote fraco.filhote fraco.

Ele podeEle podeEle podeEle pode sesesese tornar tornar tornar tornar um tigre feroz”.um tigre feroz”.um tigre feroz”.um tigre feroz”.

(Provérbio Mongol) (Provérbio Mongol) (Provérbio Mongol) (Provérbio Mongol)


Isaac Pittigliani Jorge

Resumo

A dor crônica, causada por lesões ou doenças que superam a capacidade do organismo de reverter o quadro, envolve alterações adaptativas, como neuroplasticidade, em diferentes níveis do sistema nervoso. A lesão por avulsão do plexo braquial (APB) é um evento comum em humanos, podendo levar a importantes alterações patológicas responsáveis pela indução e estabelecimento de dor neuropática. O objetivo deste estudo é investigar as alterações nociceptivas agudas em animais submetidos à APB, com a finalidade de expandir o conhecimento dos mecanismos envolvidos nos quadros de dor persistente e auxiliar na busca de tratamentos eficazes. Diferentes grupos de animais foram submetidos ao procedimento cirúrgico de APB e no 6º ou 30º dia após a cirurgia foram desafiados em modelos de nocicepção aguda induzida por formalina, capsaicina, glutamato e bradicinina, tornando-se necessário verificar principalmente a participação do sistema cininérgico e glutamatérgico através de ensaios in vivo utilizando agonistas e antagonistas seletivos em animais operados e falso-operados. Procurou-se também avaliar a nocicepção na pata traseira contralateral à cirurgia, verificando se as alterações nas respostas nociceptivas estariam limitadas ao hemisfério corporal do animal que sofreu APB. Foi demonstrado que a resposta nociceptiva induzida pela formalina em camundongos submetidos à APB foi significativamente diferente quando comparada a resposta dos animais falso-operados. Estas alterações foram revertidas pelo pré-tratamento com o anti-inflamatório indometacina ou dexametasona, ou com baixas doses de morfina. Animais submetidos à APB injetados com glutamato ou bradicinina apresentaram redução do comportamento nociceptivo comparado com o grupo falso-operado. Quando camundongos operados receberam injeção i. pl. de capsaicina, não se observou diferença significativa. Os resultados do presente trabalho demonstram que a APB produz alterações na resposta nociceptiva aguda, sugerindo que a APB desenvolve alterações na atividade do sistema glutamatérgico e de cininas e não interfere com a ação de receptores vaniloides periféricos. Demonstrou-se também o envolvimento de componentes inflamatórios nestas alterações. A redução da resposta nociceptiva após a injeção de formalina foi atribuída ao comportamento de freezing, uma vez que quando administrado um anti-inflamatório não esteroidal ou mesmo doses subliminares de morfina esta redução na resposta foi revertida e o animal passou a responder de maneira semelhante aos animais falso-operados. No modelo de nocicepção induzida por formalina, a administração do HOE-140 e da DALBK (antagonistas dos receptores B2 e B1 para cininas, respectivamente) promoveu um aumento da resposta dolorosa na segunda fase do teste, sugerindo que a redução na resposta frente à injeção de 2,5% de formalina possa estar relacionada a uma maior expressão dos receptores B1 e/ou B2. No modelo de nocicepção induzida por glutamato, os animais submetidos à ABP apresentaram uma redução na resposta nociceptiva em todas as concentrações testadas,

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sugerindo que a expressão dos receptores glutamatérgicos possa estar diminuída, ou a resposta nociceptiva possa estar bloqueada em nível de controle central da dor, visto que as alterações na neurobiologia causadas pela APB possam estar interferindo nos processos de sinalização das respostas nociceptivas envolvidas. Palavras-chave: Dor. Dor neuropática. Avulsão do plexo braquial.

ANALYSIS OF BEHAVIOR NOCICEPTIVE MICE SUBMITTED TO BRACHIAL PLEXUS AVULSION

Isaac Pittigliani Jorge

Abstract Chronic pain caused by injury or illness that exceed the body's ability to reverse the situation involves adaptive changes, such as neuroplasticity at different levels of the nervous system. The injury of the brachial plexus avulsion (BPA) is a common event in humans and may lead to important pathological changes responsible for the induction and establishment of neuropathic pain. The aim of this study is to investigate the acute nociceptive changes in animals submitted to BPA for the purpose of expanding knowledge of the mechanisms involved in the frames of persistent pain and assist in the search for effective treatments. Different animals groups underwent the surgical procedure of BPA and 6 or 30 days after surgery were challenged in models of nociception-induced acute formalin, capsaicin, glutamate, and bradykinin, making it necessary to check mainly the shareholding cininergic and glutamatergic system through in vivo using selective agonists and antagonists in animals operated and false-operated. We also sought to evaluate the process nociceptive hind paw contralateral to the surgery, making sure that the changes in nociceptive responses were limited to the hemisphere, the animal's body that has BPA.It was shown that formalin-induced nociceptive response in mice submitted to BPA was significantly different when compared the response of false-operated animals. These changes were reversed by pretreatment with anti-inflammatory drug indomethacin or dexamethasone, or with low doses of morphine. Animals treated with glutamate or BPA injected with bradykinin showed a reduction in nociceptive behavior compared to the false-operated group. When operated mice were injected i.pl. of capsaicin, there was no significant difference. The present results demonstrate that the BPA produces changes in acute nociceptive response, suggesting that the BPA develops changes in the activity of glutamatergic system and kinin and does not interfere with the action of peripheral vanilloid receptors. It also demonstrated the involvement of inflammatory components in these changes. The reduction of the nociceptive response after formalin injection was attributed to the freezing behavior, when administered as a non-steroidal anti-inflammatory or even subthreshold doses of morphine reduced this response was reversed and the animal began to respond in a similar way to animals false-operated. In the model of formalin-induced nociception, the administration of HOE-140 and DALBK (receptor antagonists for kinin B1 and B2, respectively) promoted an increase in pain response in the second phase of the trial, suggesting that the reduction in response to the injection front 2.5% formalin may be related to increased expression of B1 receptors and / or B2. In the model of glutamate-induced nociception, the animals treated with BPA showed a reduction in nociceptive response at all concentrations tested, suggesting that the expression of glutamate can be reduced, or the nociceptive response can be blocked at the level of central control of pain since the changes caused by the BPA in neurobiology might be interfering in signaling processes involved in nociceptive responses. Keywords: Pain. Neuropathic pain. Brachial plexus avulsion.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Tabela dos vários tamanhos de axônios aferentes primários. O diâmetro do axônio está correlacionado com a sua velocidade de condução, e com o tipo de receptor sensorial ao qual está conectado. ............................................................... 27

Figura 2. Esquema representativo do percurso do estímulo doloroso até o córtex cerebral. .................................................................................................................... 28

Figura 3. Ilustração demonstrando os procedimentos cirúrgicos da APB. (A) Região da incisão, (B e C) anatomia do plexo braquial, (D) separação de nervos e vasos, (E) preensão do tronco inferior, (F) avulsão do tronco inferior. Tronco inferior do plexo braquial (setas pretas); vasos subclávios (setas brancas). ....................................... 34

Figura 4. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (0,5 – 2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett)..................................................................................................................... 39

Figura 5. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (0,5 – 2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 30 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett)..................................................................................................................... 40

Figura 6. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (0,5 – 2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) na pata contralateral de animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). ................................................................................................ 41

Figura 7. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia e pré-tratados com HOE-140 (50 nmol/kg s.c.). Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo operado tratado com salina ##p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado. ............................................................................................... 42

Figura 8. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia e pré-tratados. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo operado tratado com salina ##p < 0,01 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado. ........... 43

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Figura 9. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de capsaicina (0,016 – 1,6 µg/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). ...................... 43

Figura 10. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de glutamato (0,3 – 30 µmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). ...................... 44

Figura 11. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de bradicinina (0,1 – 10 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado. ............................................................................................... 45

Figura 12. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de BK (10 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado. .................................................................................................................... 46

Figura 13. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de bradicinina (1 – 10 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado. ............................................................................................... 47

Figura 14. Efeito do pré-tratamento com indometacina (10 mg/kg, i.p.) sobre a resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (1,5 %) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 e ***p < 0,001. (#) difere significativamente do grupo operado tratado com salina (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). .................................................... 48

Figura 15. Efeito do pré-tratamento com dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.) sobre a resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (1,5 %) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 e ***p < 0,001. (#) difere significativamente do grupo operado tratado com salina (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). .................................................... 48

Figura 16. Efeito do pré-tratamento com morfina (0,5 mg/kg, s.c.) sobre as respostas nociceptivas (A) neurogênica e (B) inflamatória induzidas pela injeção de formalina

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(2,5 %) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). ...................... 49

Figura 17. Resposta hiperalgesica induzida pela injeção de (A) PGE2, (0,1 nmol/pata) (B) epinefrina (100 ng/pata) e (C) BK (0,1 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado #p < 0,05 (ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni). ......................................... 50

LISTA DE ABREVIATURAS

Aαααα - Fibras do tipo A subtipo alfa

Aββββ - Fibras do tipo A subtipo beta

Aδδδδ - Fibras do tipo A subtipo delta

AAE - Aminoácidos excitatórios

AINEs - Anti-inflamatórios não-esteroidais

AMPA - Ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiônico

AMPc - Adenosina monofosfato cíclico

ANOVA - Análise de variância

APB - Avulsão do plexo braquial

ATP - Adenosina trifosfato

B1 - Receptor de bradicinina do tipo 1

B2 - Receptor de bradicinina do tipo 2

BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro

BK - Bradicinina

C - Fibras do tipo C

CCDV - Canais de cálcio dependentes de voltagem

CFA - Completo adjuvante de Freund

CGRP - Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

COX1 - Enzima ciclo-oxigenase do tipo 1

COX2 - Enzima ciclo-oxigenase do tipo 2

DABK - Des-Arg-BK

DALBK - Des-Arg9-Leu8-BK

DRG - Gânglio da raiz dorsal

E. P. M. - Erro padrão da média

FOP - Falso operado

i. p. - intra peritonial

i. pl. - intra plantar

IASP - International Association for the Study of Pain

NGF - Fator de crescimento neuronal

NMDA - N-metil-D-aspartato

NO - Óxido nítrico

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OP - Operado

PGE2 - Prostaglandina do tipo E2

PGs - Prostaglandinas

PKA - Proteína quinase do tipo A

PKC - Proteína quinase do tipo C

PKCγ - Proteína quinase do tipo C subtipo gama

PKCε - Proteína quinase do tipo C subtipo episilon

RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro

RVM - Medula ventromedial rostral

s. c. - subcutâneo

SNC - Sistema nervoso central

SP - Substância P

TNFα - Fator de necrose tumoral alfa

TrkA - Tirosina quinase do tipo A

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 18

2 OBJETIVOS ............................................................................................ 20

2.1 Objetivo geral .......................................................................................... 20

2.2 Objetivos específicos ............................................................................... 20

3 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................. 21

3.1 Uma breve história sobre a dor ............................................................... 21

3.2 Definição da dor ...................................................................................... 23

3.3 As vias da dor: mecanismos de indução, transmissão e processamento

da dor ................................................................................................................ 25

3.4 Sinalização celular e neuroplasticidade na dor crônica ........................... 29

4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................... 33

4.1 Animais .................................................................................................... 33

4.1.1 Delineamento experimental ..................................................................... 33

4.2 Procedimento cirúrgico para a avulsão do plexo braquial ....................... 34

4.3 Análise do limiar mecânico através do filamento de von Frey ................. 35

4.4 Avaliação da Atividade Antinociceptiva ................................................... 35

4.4.1 Modelo de nocicepção espontânea induzida pela formalina ................... 35

4.4.2 Modelo de nocicepção espontânea induzida pela capsaicina ................. 35

4.4.3 Modelo de nocicepção espontânea induzida pelo glutamato .................. 36

4.4.4 Modelo de nocicepção espontânea induzida pela bradicinina ................. 36

4.4.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela BK .......................................... 36

4.4.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela PGE2...................................... 37

4.4.7 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina ............................... 37

4.5 Estudo farmacológico .............................................................................. 37

4.5.1 Envolvimento do sistema de cininas........................................................ 37

4.5.2 Envolvimento de componentes inflamatórios e sistema opióide ............. 37

4.6 Drogas e reagentes ................................................................................. 38

4.7 Análise estatística.................................................................................... 38

5 RESULTADOS ........................................................................................ 39

17

5.1 Resposta nociceptiva induzida pela formalina ......................................... 39

5.2 Resposta nociceptiva induzida pela capsaicina ...................................... 43

5.3 Resposta nociceptiva induzida pelo glutamato ........................................ 44

5.4 Resposta nociceptiva induzida pela bradicinina ...................................... 45

5.5 Participação de componentes inflamatórios na alteração da resposta

nociceptiva de animais submetidos à APB ....................................................................

................................................................................................................ 47

5.6 Efeito do tratamento com morfina sobre a resposta nociceptiva induzida

pela formalina ............................................................................................................ 49

5.7 Resposta hipernociceptiva induzida pela PGE2, epinefrina e BK. ........... 49

6 DISCUSSÃO ........................................................................................... 51

7 CONCLUSÕES ....................................................................................... 60

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 61

18

1 INTRODUÇÃO

Tanto a dor aguda quanto a dor crônica estão frequentemente associadas a

processos inflamatórios, como resultado da lesão tecidual, reatividade imune

anormal ou lesão nervosa (STEIN et al., 2003). Na dor crônica, muitas alterações

ocorrem em associação com os eventos básicos da nocicepção, que modificam a

relação entre o estímulo e a resposta nociceptiva, afetando a modulação do estado

doloroso resultante. Além disso, alterações centrais crônicas na neuroquímica da

sinalização da dor produzem hipersensibilidade, aumentando a frequência e a

duração dos impulsos aferentes. Ademais, mudanças estruturais secundárias à

lesão nervosa periférica incluem a perda de interneurônios espinhais, rearranjos não

apropriados de processos neurais aferentes na medula espinhal e a proliferação de

fibras simpáticas no gânglio sensorial (WATKINS, MAIER, 2002; DOGRUL et al.,

2003).

O que dificulta o desenvolvimento de terapias racionais e efetivas para o

tratamento de processos dolorosos crônicos é a falta de conhecimento do quanto os

mecanismos envolvidos na dor crônica diferem daqueles implicados na dor aguda

(ALEY et al., 2000). O entendimento dos mecanismos envolvidos na transmissão do

sinal doloroso tem progredido muito nos últimos anos, em grande parte devido a um

aprimoramento na compreensão dos mecanismos envolvidos na fisiologia das fibras

aferentes e no processo de neurotransmissão no corno dorsal da medula espinhal

(GRUBB, 1998; FÜRST, 1999; MILLAN, 1999). Este progresso foi só possível com o

uso de múltiplos protocolos experimentais, incluindo estudos comportamentais,

eletrofisiológicos in vivo e in vitro, estudos anatômicos e principalmente através de

técnicas de biologia molecular (GRUBB, 1998; MILLAN, 1999; JULIUS; BASBAUM,

2001).

A dor induzida por lesão nervosa tem sido muito descrita como aumento na

sensibilidade de fibras aferentes primárias com consequente sensibilização do

circuito nociceptivo do corno dorsal da medula espinhal (CAMPBELL; MEYER,

2006). Entretanto, estudos mais recentes revelam que sistemas modulatórios do

tronco cerebral como a medula ventromedial rostral (RVM) também tem um papel

crítico, podendo facilitar ou suprimir a resposta nociceptiva (PORRECA, OSSIPOV,

GEBHART, 2002; FIELDS et al., 2005).

Diante deste contexto, este projeto teve como objetivo investigar os

19

mecanismos envolvidos nas alterações das respostas nociceptivas agudas de

camundongos submetidos à avulsão do plexo braquial (APB), com seis e trinta dias

após a cirurgia, frente a modelos de nocicepção aguda, amplamente descritos na

literatura, na tentativa de melhor conhecer a amplitude das alterações sensoriais

decorrentes da lesão nervosa, avaliando também a participação do sistema

cininérgico e glutamatérgico nos processos de nocicepção induzida por formalina,

capsaicina, bradicinina e glutamato.

Além disso, sabe-se que a lesão por avulsão do plexo braquial (APB) é um

evento comum em humanos, podendo levar a importantes alterações patológicas

responsáveis pela indução e estabelecimento de dor neuropática (CARVALHO,

NIKKHAH, SAMII, 1997). Segundo Wynn Parry (1980), a dor por deaferentação é

uma das mais significantes razões de incapacidade. Em virtude da carência de

conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos nas alterações

hipernociceptivas observadas no modelo de APB, a investigação das alterações no

comportamento nociceptivo agudo destes animais poderá auxiliar no maior

entendimento deste quadro patológico contribuindo para a busca de terapias

clinicamente mais eficazes.

20

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

O presente estudo teve como objetivo investigar os mecanismos envolvidos

nas alterações das respostas nociceptivas agudas de camundongos submetidos à

avulsão do plexo braquial (APB) na tentativa de melhor conhecer a amplitude das

alterações sensoriais decorrentes da lesão nervosa, bem como, identificar melhor os

mecanismos envolvidos nos diferentes tipos de dor.

2.2 Objetivos específicos

Os objetivos específicos do presente estudo foram:

1. Avaliar a resposta nociceptiva de animais submetidos à APB através do

modelo de nocicepção induzida quimicamente por capsaicina, formalina, glutamato,

ou bradicinina.

2. Verificar a resposta hiperalgésica de animais submetidos à APB

através dos modelos de hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 e Epinefrina.

3. Verificar o papel dos receptores de cininas nas alterações da resposta

nociceptiva induzida pela formalina através da administração de antagonistas

seletivos para os receptores B1 e B2.

4. Avaliar a participação do sistema opioide, bem como dos processos

inflamatórios nas alterações da resposta nociceptiva induzida pela APB através do

modelo de formalina.

21

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Uma breve história sobre a dor

A dor é uma experiência embutida de inúmeros significados, não podendo

estar limitado somente ao aspecto físico associado à lesão, mas também a aspectos

cognitivos, não tão bem explorados pela neurofarmacologia moderna. Desde o início

dos tempos pré-históricos encontram-se registros de que eventos de dor e seu

controle recebem atenção especial. A interpretação da dimensão da dor varia a cada

sociedade, e talvez não seja sentida de forma idêntica por todos os indivíduos. O

limiar da dor varia de indivíduo para indivíduo e de sociedade para sociedade,

independentemente de suas bases anatômicas e fisiológicas (TEIXEIRA, OKADA,

2001).

Em todas as sociedades primitivas, sejam mesopotâmicos, gregos ou

egípcios, encontramos relatos das consequências da dor e de como proceder em

seu controle. As lendas em torno de heróis e deuses fazem referencias à ocorrência

da dor como forma de punição e controle de atitudes humanas. Ainda nos dias

atuais, podemos encontrar povos com este mesmo conceito, ligando a dor a atos

divinos ou demoníacos. Assim, a medicina era exercida por sacerdotes a serviço dos

deuses, que empregavam diversos métodos para proporcionar o alívio da dor. De

acordo com Hipócrates, pai da medicina, “Divinunstest opus sedare dolorien” (Sedar

a dor é obra divina) (TEIXEIRA, OKADA, 2001).

No início do século XIX, surgiram os primeiros trabalhos relacionando a dor

com informações sensoriais provenientes das raízes ventrais e dorsais da medula

espinhal. O anatomista escocês Charles Bell (1774-1842) defendia a idéia de que os

nervos sensoriais possuíam funções especializadas para detectar informações

somáticas incluindo a dor (PERL, 2007). Em 1826, Johannes Müller (1801-1858),

psicólogo e fisiologista alemão, propôs sua teoria da "energia nervosa específica", a

qual defendia que os diferentes nervos (ótico, auditivo, etc.) transmitiam uma

espécie de "código", que identificava sua origem ao cérebro (MÜLLER, 1840). Já

Mortiz Schiff (1823-1896) fisiologista alemão, aluno do célebre médico neurologista e

fisiologista François Magendie (1783-1855), demostrou que lesões específicas na

medula espinhal resultavam na perda de sensações táteis e dolorosas, propondo

22

que a dor é uma sensação independente das demais (SCHIFF, 1858).

Nas décadas seguintes, foram identificadas as vias ascendentes com origem

nos neurônios espinhais (via espinotalâmica) e que o quadrante antero-lateral da

medula espinhal era a via anatômica que leva a informação dolorosa da periferia até

o cérebro. Anos mais tarde, o tálamo foi considerado a estrutura encefálica

fundamental no reconhecimento da dor (EDINGER, 1890; BROWN-SÉQUARD,

1868; DEJERINE, ROUSSY, 1906; HEAD; HOLMES, 1911).

No entanto, o neurologista Wilhelm Erb (1840-1921) postulou que a dor é

resultado da ativação vigorosa das vias nervosas comuns, contradizendo o conceito

de especificidade da dor, originando assim, uma nova teoria sobre a dor, onde

propunha que a intensidade do estímulo gerador, e que determinaria uma resposta

dolorosa ou não (ERB, 1874). Anos mais tarde, descobriu-se que não apenas a

intensidade do estímulo era necessária, mas que o padrão neuronal gerado também

determinava a resposta de dor (NAFE, 1929). Assim, os médicos e fisiologistas do

início do século XX estavam divididos sobre as origens e natureza da dor.

As observações feitas pelo fisiologista Maximiliano Ruppert Franz von Frey

(1852-1932) concluíram que a estimulação de distintas áreas da pele estavam

relacionadas à estrutura dos terminais nervosos, reforçando a idéia da

especificidade da dor, porém essa sensação específica era dada por estímulos não

específicos (mecânicos, térmicos ou químicos). O histologista, microbiologista e

patologista britânico Sir Charles Scott Sherrington (1857-1952) foi um histologista,

microbiologista e patologista britânico, percebeu que a dor era gerada por estímulos

lesivos (estímulos nocivos) independente de sua natureza física. Assim cunhou o

termo nociceptor como sendo a estrutura responsável por tal detecção dos estímulos

nocivos, embora não tivesse identificado nenhuma estrutura (SHERRINGTON,

1906).

Entre o início e a metade do século XX, os registros de sinais nervosos

levaram os pesquisadores a sugerir que as fibras mielinizadas Aδ e fibras não-

mielinizadas C eram ativadas por estímulos nocivos. Embora estudos apoiassem a

Teoria da Especificidade, a ausência de estudos sobre a existência de receptores

específicos fez com que o Departamento de Anatomia de Oxford repudiasse tal

teoria. Somente em 1965, Patrick Wall e Ronald Melzack, estudante de medicina e

psicólogo respectivamente, postularam a Teoria do Portão, onde o balanço entre a

ativação das fibras de pequeno (C) e de grande (A) diâmetro localizadas na medula

23

espinhal é que determinariam a condução ou não do estímulo nocivo: quando a

ativação das fibras C se sobressai a ativação das fibras A, o “portão” se abre e o

estímulo é conduzido. Se o contrário acontece, o “portão” se fecha e o estímulo

nocivo não é levado aos centros supra-espinhais. Esta teoria se tornou precursora

no conceito de modulação da dor, sendo confirmada em anos mais tarde

(HEINBECKER, BISHOP, O'LEARY, 1933; ZOTTERMAN, 1933; CLARK, HUGHES,

GASSER, 1935; LANDAU, BISHOP, 1953; COLLINS, NULSEN, RANDT, 1960;

MELZACK, WALL, 1965).

Em 1970, os pesquisadores demonstraram que os neurônios presentes na

lamina I do corno dorsal da medula espinhal eram ativados por estímulos térmicos

nocivos, e em 1975 foram identificados neurônios presentes em lâminas espinhais

profundas (V-VI) capazes de responder tanto a estímulos mecânicos e térmicos,

nocivos e inócuos. Estes neurônios foram denominados neurônios polimodais.

Atualmente sabe-se que a medula espinhal apresenta lâminas compostas por

neurônios nociceptivos e polimodais que estão particularmente envolvidas na

condução do estímulo nocivo (CHRISTENSEN, PERL, 1970; PRICE, MAYER, 1975;

CRAIG, 2003).

A detecção de estímulos dolorosos depende de estruturas especializadas,

mas, no entanto, a medula espinhal está sujeita a alterações plásticas quando

submetidas a contínuas estimulações, levando a respostas alteradas. Os

mecanismos envolvidos na condução e modulação da dor não estão completamente

elucidados, sendo que a idéia de dor deve ser estendida não apenas a experiência

física, delimitada apenas por características anatômicas e fisiologias, mas também

por um processo dinâmico sujeito a diversas alterações e modulações ligadas a

processos neuronais complexos (MELZACK, WALL, 1965; WOOLF, 1983).

3.2 Definição da dor

Existe uma grande variedade de definições para a dor, mas nenhuma delas é

capaz de agrupar todos os aspectos desta sensação tão complexa e subjetiva.

Sendo assim, sua definição é difícil, apesar da transposição de seu significado. O

termo dor, como definido pela IASP (International Association for the Study of Pain),

descreve não somente uma sensação, mas também uma emoção desagradável

24

associada a um estímulo lesivo ou potencialmente lesivo, sendo de natureza

subjetiva e estabelecendo a necessidade de tratamento para qualquer tipo de dor,

seja acompanhada de lesão tecidual ou não. A dor é uma experiência subjetiva

complexa, cuja percepção é o resultado de processos fisiológicos sensoriais ligados

a características pessoais e sociais sendo um estimulo percebido como doloroso

independente da sua natureza, mas sim, de acordo com o contexto em que o

indivíduo está inserido, ligado a suas emoções e memórias (LOESER, TREEDE,

2008).

Nocicepção é o termo utilizado para descrever os processos neurais na

identificação dos estímulos nocivos, capazes de produzir lesão tecidual. Nocicepção

e dor não devem ser confundidos, pois um pode ocorrer na ausência do outro,

justamente pela complexidade que envolve as definições cognitivas da dor. Em

1979, Merskey definiu a dor como sendo “uma experiência sensorial e emocional

desagradável associada a um dano tecidual real ou potencial”. Esta definição foi

então adotada pela IASP e permanece até os dias atuais. (MOGIL, BASBAUM,

2000; JULIUS, BASBAUM, 2001; PRICE, 2002).

A dor tem como papel fisiológico a função de proteger o organismo de forma a

prevenir e/ou diminuir os danos, avisando o indivíduo de que uma lesão tecidual está

para ocorrer ou já ocorreu. Assim que este mecanismo de alerta é estabelecido em

um indivíduo, a ameaça de dor pode provocar respostas comportamentais

generalizadas, tais como ativação simpática, aumento de corticosterona, taquicardia

e hipertensão arterial. Esses eventos melhoram o desempenho do indivíduo e o

afastam de uma situação de risco (MARKENSON, 1996; MILLAN, 1999; COSTIGAN,

WOOLF, 2000; WOOLF, SALTER, 2000; ALMEIDA, ROIZENBLATT, TUF, 2004).

As manifestações de dor podem ser estendidas com base nos substratos

neurais que medeiam às funções sensoriais e afetivas: enquanto o sistema sensorial

percebe e permite a localização tempo-espacial, a qualificação física e a intensidade

do estímulo nocivo, o componente cognitivo-afetivo atribui emoções as experiências,

sendo responsável pela resposta à dor. Sendo assim, a dor tem uma conotação

individual, sofrendo influência de experiências anteriores e ligadas a fatores sociais e

culturais. Porém, a dor pode perder a sua conotação de sobrevivência em um

ambiente hostil e perigoso, tornando-se resultado de mudanças no sistema nervoso,

tornando-se assim patológica, crônica e debilitante. Esta forma de dor é resultante

de um processo tecidual de reparo, estabelecendo um estado de hipersensibilidade

25

localizada dentro e ao redor da região lesada. Nestas condições, um estímulo

normalmente inócuo torna-se uma sensação extremamente desconfortável (WOOLF,

2000; JULIUS, BASBAUM, 2001; ALMEIDA, ROIZENBLATT, TUF, 2004).

Sendo assim, a dor pode ser classificada de acordo com a duração, podendo

ser aguda ou crônica, fisiológica ou não e se possui localização no sistema nervoso

central ou na periferia. A dor aguda é pontual e delimitada, desaparecendo com a

resolução do processo patológico. Já a dor crônica persiste por um longo período de

tempo, sendo associada a processos patológicos crônicos e mudanças no padrão de

transmissão neuronal (LENT, 2004; ALMEIDA, ROIZENBLATT, TUF, 2004).

3.3 As vias da dor: mecanismos de indução, transmissão e processamento

da dor

Estímulos mecânicos, térmicos ou químicos podem ser interpretados como

estímulos nociceptivos quando promovem a estimulação de vias aferentes primárias

denominadas para este caso de nociceptores, ou seja, qualquer que seja o estímulo

que excite o nociceptor, o efeito imediato é a alteração do potencial elétrico da

membrana da fibra nervosa. A dor se inicia pela ativação ou sensibilização de

nociceptores. Este estímulo é levado da periferia para o sistema nervoso central

através de fibras nociceptivas, que são as aferentes primárias de pequeno diâmetro

dos nervos periféricos. Os nociceptores fazem a transdução e codificação do

estímulo nocivo e estão presentes em praticamente todos os tecidos do organismo.

O processamento neural dos estímulos nocivos segue uma sequência de eventos,

sendo que a primeira etapa se inicia com a estimulação, seguida da transdução dos

estímulos nocivos, e posteriormente transmitida à medula espinhal e outras regiões

do SNC, podendo ocorrer à modulação da dor através do processamento do

estímulo nocivo (MEYER et al., 2005; SANDKUHLER, 2009; GUYTON, HALL, 2002,

LENT, 2004).

A ativação dos nociceptores por estímulos nocivos leva à despolarização do

neurônio e gera um potencial de ação que se propaga por toda a fibra. Em uma

inflamação, esta ativação pode ocorrer por mediadores inflamatórios ou provocar

uma lesão que ativa ou sensibilizar os nociceptores. Muitas vezes, estas fibras

sensibilizadas assumem limiares de ativação mais baixos que o normal (WOOLF,

26

SALTER, 2000; JULIUS, BASBAUM, 2001).

As fibras aferentes de primeira ordem são classificadas de acordo com sua

estrutura, diâmetro, mielinização e velocidade de condução: Aα, Aβ, Aδ e C. As

fibras Aα e Aβ são mielinizadas com diâmetro maior que 40 µm e velocidade de

condução de 30-100 m/s. As fibras aferentes Aδ são pouco mielinizadas, variando

seu diâmetro entre 2 e 6 µm e tem velocidade de condução de 12-30 m/s. As fibras

tipo C não são mielinizadas, possuem um diâmetro entre 0,4-1,2 µm e possuem

velocidade de condução de 0,5-2,0 m/s. (Figura 1) (JULIUS, BASBAUM, 2001).

Neurônios que possuem fibras com diâmetro maior (Aα e Aβ) detectam

estímulos inócuos e neurônios com fibras de médio e pequeno diâmetro (Aδ e C)

possuem a maioria dos nociceptores. As fibras Aδ possuem dois tipos de

nociceptores (tipo I e II), que respondem a estímulos mecânicos intensos, mas

podem responder a estímulos de calor intenso. As fibras Aδ do tipo I se ativam em

temperaturas superiores a 53 °C enquanto que as fibras Aδ do tipo II são ativadas

por temperaturas superiores a 43 °C. Já a maioria das fibras C é de característica

polimodal, ou seja, estímulos mecânicos, térmicos e químicos. É difícil identificar

qual o estímulo natural que irá ativar a fibra C. Algumas são insensíveis a estímulos

mecânicos, mas respondem ao calor nocivo. Outras apenas respondem a estímulos

químicos, como ácidos. Estes receptores são chamados de nociceptores silenciosos

ou adormecidos, que passam a ser ativados apenas quando sensibilizados por lesão

tecidual (JULIUS, BASBAUM, 2001).

As fibras C podem expressar o receptor purinérgico do tipo P2X3, cujos

terminais sinápticos localizam-se mais internamente na medula espinhal (lâmina II),

sendo que outro grupo de fibras C sintetiza peptídeos como a substância P e o

peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e expressa receptores TrkA

para o fator de crescimento do nervo (NGF), fazendo conexões com neurônios da

lâmina mais externa do corno dorsal da medula (lâmina I) (CUELLO et al.,1993;

AVERIL et al., 1995).

27

Figura 1. Tabela dos vários tamanhos de axônios aferentes primários. O diâmetro do axônio está correlacionado com a sua velocidade de condução, e com o tipo de receptor sensorial ao qual está conectado. Fonte: Traduzido e adaptado pelo autor: <http://thebrain.mcgill.ca/flash/d/d_03/d_03_cl/d_03_cl_dou/d_03_cl_dou.html>

Os estímulos nocivos resultam em uma dor rápida, fina e bem localizada em

geral refletem a ativação das fibras Aδ e a nocicepção difusa e lenta, tipo

queimação, é conduzida por fibras C. Após a transdução do estímulo pelas fibras Aδ

e C pertencentes aos corpos celulares dos neurônios dos nociceptores localizados

nos gânglios da raiz dorsal e do trigêmeo e enviam eferências do corno dorsal da

medula espinhal e ao núcleo do trigêmeo respectivamente (Figura 2) (BESSON,

1999; JULIUS, BASBAUM, 2001, LENT, 2004).

28

Figura 2. Esquema representativo do percurso do estímulo doloroso até o córtex cerebral. Fonte: Adaptado pelo autor: <http://saude.hsw.uol.com.br/cipa2.htm> e <http://saude.hsw.uol.com.br/dor3.htm>

O corno dorsal é uma estação de retransmissão dos impulsos sensoriais para

a transmissão da dor, aonde as fibras aferentes primárias chegam de maneira

altamente organizadas, com as fibras Aδ terminando principalmente nas laminas I e

V e as fibras C terminando na lâmina II. Os neurônios de segunda ordem emitem

axônios dentro da medula que cruzam para o lado oposto e se incorporam ao feixe

espinotalâmica na coluna anterolateral da medula e ascende até o tronco encefálico

encontrando fibras de segunda ordem do núcleo espinhal do trigêmeo, formando o

lemnisco espinhal. Neste ponto as fibras Aδ estão misturadas as fibras C. os

impulsos da dor rápida vão para os núcleos talâmicos posterior e ventral posterior

onde estão os neurônios de terceira ordem, cujos axônios projetam ao córtex

somestésico primário. Isso caracteriza a via direta da dor rápida (MILLAN, 1999;

LENT, 2004).

A partir desta região, são acionados neurônios de projeção e interneurônios

de segunda ordem na medula espinhal, sendo que alguns são ativados somente por

estímulos nociceptivos e outros respondem a estímulos de alta ou baixa intensidade

(limiar dinâmico e amplo). Esta conexão sináptica entre as fibras aferentes primárias

e os neurônios do corno dorsal envolve neurotransmissores como o glutamato e a

29

substância P, que são responsáveis pela produção de potenciais pós-sinápticos

excitatórios rápidos e lentos, respectivamente (MILLAN, 1999).

As fibras C são extensas e ramificadas, que podem se convergir. As fibras

secundárias se dirigem ao tálamo e a área somestésica primária e também para

diversas outras regiões do SNC que controlam fenômenos vegetativos e emocionais.

Algumas fibras de segunda ordem projetam aos neurônios do sistema reticular

ascendente, outras projetam a núcleos do sistema límbico e tálamo. As informações

nociceptivas chegam ao córtex cingulado anterior, além do córtex somestésico.

Quanto à modulação do estimulo nociceptivo, este permite a inibição ou facilitação

seletiva dos sinais nociceptivos que chegam ao corno dorsal da medula espinhal. O

sistema de modulação endógeno constitui-se de interneurônios nas camadas

superficiais da medula espinhal, onde há participação de peptídeos endógenos

(endorfinas, encefalinas, dinorfinas), cuja função é modular as sinapses

nociceptivas, bloqueando a liberação de neurotransmissores endógenos excitatórios

pelo terminal pré-sináptico e hiperpolarizando a membrana pós-sináptica. Todos

esses peptídeos são encontrados na substância cinzenta periaquidural, nos núcleos

da rafe e no corno da medula espinhal (REN, DUBNER, 2002; LENT, 2004).

3.4 Sinalização celular e neuroplasticidade na dor crônica

Primeiramente, uma lesão ativa as fibras nociceptivas produzindo uma dor

aguda, e posteriormente também resulta em uma série de mudanças ao nível de

nociceptores e da medula espinhal, e dependendo do grau dessas mudanças, o

resultado pode ser um estado de dor persistente onde há uma resposta exacerbada

de dor a estímulos nociceptivos (hiperalgesia) ou inócuos (alodínia) ou ainda

produzir a sensação de dor espontânea, isto é, dor sem estímulo externo. Este

estado doloroso persistente é chamado de dor crônica e geralmente persiste por

mais de 12 semanas, ou por um tempo anormal ao da cura. (BESSON, 1999;

ASHBURN; STAATS, 1999; JI, WOOLF, 2001; MERSKEY, BOGDUK, 2002).

A dor crônica é um grave problema de saúde, que afeta centenas de milhões

de pessoas por todo o mundo, diminuindo a qualidade de vida, incapacitando a

pessoa para o trabalho, induzindo a ansiedade e depressão e resultando em

prejuízos para a sociedade (RUSSO, BROSE, 1998; ASHBURN; STAATS, 1999;

30

TANG; CRANE, 2006).

Os tipos de dores crônicas mais comuns são a dor neuropática, que é

decorrente de uma lesão ou doença que afeta ou afetou o sistema somatosensorial,

como por exemplo, a neuropatia diabética; e a dor inflamatória, causada por

doenças inflamatórias crônicas, tais como a artrite reumatoide e a gota. Em qualquer

dos eventos acima citados, o processamento sensorial está alterado, produzindo

mudanças nas propriedades eletrofisiológicas e moleculares dos neurônios dos

nociceptores e da medula espinhal, resultando em hiperalgesia (BESSON, 1999;

WOOLF, SALTER, 2000).

A hiperalgesia é resultado da sensibilização neuronal nos receptores

periféricos, e está relacionada com a diminuição do limiar de estimulação e a uma

resposta aumentada dos nociceptores a estímulos aplicados na região da lesão

(hiperalgesia primária). Já a sensibilização de neurônios na medula espinhal

caracterizada por atividade ectópica ou espontânea aumentada de neurônios

nociceptivos e de neurônios não nociceptivos (hiperalgesia secundária), como

aqueles associados a sensações táteis que adquirem a capacidade de gerar dor

(alodínia). A hiperalgesia primaria está relacionados com processos normais de

proteção e recuperação de tecidos, enquanto que a hiperalgesia secundária está

relacionada com a dor crônica e está intimamente relacionada ao fenômeno de

sensibilização central (WOOLF, 1983; LOESER, TREEDE, 2008).

A sensibilização central envolve uma série de eventos que acabam por alterar

a neurobiologia da dor. Sob circunstâncias patológicas em que a estimulação dos

nociceptores encontra-se aumentada, a transmissão nociceptiva é alterada:

mudanças no potencial de membrana celular levam à ativação de canais iônicos,

como canais de sódio e canais de cálcio dependentes de voltagem (CCDV),

ocorrendo, então, um aumento na liberação de neurotransmissores, como o

glutamato, e a facilitação da transmissão excitatória que, através da ativação de

canais iônicos dependentes de voltagem ou operados por ligantes e da liberação de

estoques intracelulares, produz elevação nos níveis de cálcio. O aumento da

concentração de cálcio intracelular inicia inúmeros processos de sinalização celular.

Dentre eles está à ativação direta ou indireta de uma série de proteínas cinases que

podem em primeira instância, produzir alterações pós-transcricionais, como a

fosforilação de receptores e canais iônicos, e, em última instância, induzir à síntese

de novas proteínas envolvidas na transmissão nociceptiva (WOOLF, THOMPSON,

31

1991; WOOLF, COSTIGAN, 1999; JI, WOOLF, 2000).

Tais eventos ocorrem em intervalos de tempo precisos durante o

desenvolvimento da hiperalgesia e estão diretamente relacionados a alterações

drásticas no fenótipo celular (expressão de neurotransmissores, enzimas, canais

iônicos e receptores) e a mudanças estruturais, como a perda de interneurônios

espinhais, rearranjos inapropriados de neurônios na medula espinhal e a

proliferação de fibras simpáticas nos gânglios sensoriais (WOOLF,

SHORTLAND,COGGESHALL, 1992; MCLACHLAN et al., 1993; MOORE, BABA,

WOOLF, 2000; MOORE et al., 2002).

Embora compartilhem de mecanismos em comum, a dor de origem

inflamatória e neuropática apresenta algumas características únicas. Por exemplo, a

sensibilização decorrente da ação de mediadores inflamatórios como a bradicinina, a

prostaglandina E2 (PGE2), a serotonina e a histamina nos nociceptores, embora

presente na fase inicial da dor neuropática é uma característica que predomina na

dor inflamatória. Por outro lado, a lesão de nervos periféricos produz atividade

ectópica e espontânea de fibras sensoriais e as tornam sensíveis à estimulação pela

noradrenalina (WALL, DEVOR, 1983, TAIWO, LEVINE, 1989; McLACHLAN et al.,

1993; RUEFF, DRAY, 1993; MIZUMURA, 1997; WOOLF, MANNION, 1999).

Ademais, parece haver diferenças quanto à participação de segundos

mensageiros e de cascatas de sinalização celular na geração da dor inflamatória e

da dor neuropática. É amplamente estudada a sinalização via adenosina 3',5'-

monofosfato cíclico (AMPc) e ativação de proteína cinase A (protein kinase A - PKA)

na geração de dor inflamatória. Enquanto que a dor neuropática parece estar mais

atrelada à ativação de determinadas isoformas da proteína cinase C (protein kinase

C - PKC). Por exemplo, em camundongos, a ablação do gene que codifica a

isoforma neuronal da PKA que contém a subunidade regulatória RIβ causa

diminuição na nocicepção evocada por inflamação, mas não altera a dor neuropática

desses animais. Ainda, embora determinadas isoformas de PKC, como a isoforma

epsilon (PKCε), estejam envolvidas em processos de dor inflamatória, evidências

apontam para uma ação quase que exclusiva da isoforma gama (PKCγ) nos

mecanismos de dor neuropática (MAO et al., 1995; ALEY, LEVINE, 1999; OHSAWA

et al., 2001; YAJIMA et al., 2003; HUCHO, LEVINE, 2007).

A dor aguda e crônica representam diferentes condições psicofisiológicas e

32

exigem estratégias de condutas com drogas diferentes. Atualmente existem

múltiplos recursos disponíveis para o tratamento da dor, tais como métodos

fisioterápicos, acupuntura, técnicas de neuroestimulação e bloqueios anestésicos,

porém nenhuma delas é totalmente eficaz (SOBREIRA, ZAMPIER, 1999;

ABRAHAM, MCGINTY, BREWER, 2001).

Tais diferenças justificam o uso de diferentes abordagens terapêuticas no

tratamento da dor crônica inflamatória e neuropática. Por exemplo, a inibição da

síntese de PGE2 pelos anti-inflamatórios não esteirodais (AINES) é efetiva no

tratamento da dor inflamatória, mas não da neuropática. Ademais quadros de dor

inflamatória respondem bem à morfina, que apresenta até mesmo eficácia

analgésica superior nessas situações. Já em situações de dor neuropática a morfina

tem sua eficácia drasticamente reduzida (STANFA, DICKENSON, 1995; OBARA et

al., 2009).

As drogas mais comumente utilizadas no tratamento da dor crônica são os

analgésicos não-opiodes, os anti-inflamatórios não-esteroidais, os analgésicos

narcóticos, os opioides, os anticonvulsivantes, os antidepressivos, os neurolépticos,

os corticoides, vitaminas (principalmente do complexo B) e gangliosídeos. Além

disso, outras drogas tais como a calcitonina e a capsaicina também são utilizadas,

embora não tão frequentes (OLIVEIRA, A. S. B.; GABBAI, 1998)

A farmacoterapia na dor crônica inclui a administração de drogas por via

sistêmica, bem como procedimentos anestésicos locais ou de administração

intratecal. As dificuldades mais críticas surgem nos pacientes jovens, que desejam

levar uma vida social ativa e são impedidos de fazê-lo. O uso à longo prazo de

analgésicos, especialmente os mais potentes, pode levar a vários problemas,

incluindo-se o desenvolvimento de tolerância, ou mesmo ao surgimento de

dependência à droga. O insucesso terapêutico seria evitado através de avaliação

clínica, neurológica e psiquiátrica apropriadas (OLIVEIRA, A. S. B.; GABBAI, 1998).

33

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais

Foram utilizados camundongos machos Swiss (pesando entre 20 e 28 g),

provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí. Os animais foram

mantidos em ambiente com temperatura e umidade controladas (22 ± 1°C, 60 a 80%

de umidade), em ciclo 12 h claro/12 h escuro, com água e ração fornecidos ad

libitum. Os animais permaneceram no laboratório durante um período de adaptação

de pelo menos 1 h antes da realização dos testes farmacológicos, realizados

geralmente entre 8 e 17 h, a temperatura de 22 ± 1 ºC.

Os experimentos descritos foram conduzidos de acordo com as diretrizes

atuais de cuidados com os animais de laboratório e com as diretrizes éticas para

investigações de dor experimental em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983).

O Comitê de Ética da Universidade do Vale do Itajaí aprovou todos os

procedimentos experimentais (com parecer nº 363/07 na data de 25 de julho de

2007). O número de animais e a intensidade do estímulo nocivo utilizado foram os

mínimos necessários para demonstrar os efeitos dos tratamentos com as drogas.

4.1.1 Delineamento experimental

Nos testes de nocicepção espontânea os animais foram divididos em 2

grupos experimentais, sendo um grupo falso-operado e um grupo operado. Cada

grupo foi composto de 10 animais. Oito procedimentos experimentais, com 6 grupos

(3 doses de cada agente) de 10 animais cada (total de 480 animais). Para avaliar o

efeito farmacológico de drogas, os animais foram divididos em 4 grupos, sendo 1

grupo falso-operado tratado com salina, 1 grupo falso-operado tratado com a droga

em questão, 1 grupo operado tratado com salina e 1 grupo operado tratado com a

droga em questão. Como foram testadas 8 drogas diferentes, serão realizados 8

procedimentos experimentais, com 4 grupos de 10 animais cada (total de 480

animais). Ensaios de biologia molecular: 6 grupos de 10 animais cada (total de 60

animais).

34

4.2 Procedimento cirúrgico para a avulsão do plexo braquial

A metodologia utilizada para a realização da APB foi similar àquela descrita

para ratos (RODRIGUES-FILHO et al., 2003) e adaptada para camundongos

(QUINTÃO et al., 2006). Primeiramente, os animais foram anestesiados com hidrato

de cloral 7% (8 ml/kg; i.p.). O plexo braquial direito foi abordado através de uma

incisão longitudinal paralela a clavícula, transcorrendo do esterno à região axilar (1

cm aproximadamente, Figura 3 A). Os vasos subclávios foram localizados e o tronco

inferior foi dissecado (Figura 3 B – D). Um grupo de animais teve o tronco inferior

pinçado e avulsionado por tração utilizando duas pinças cirúrgicas (Figura 3 E e F).

No grupo falso-operado, o plexo braquial foi exposto e dissecado sem sofrer

qualquer lesão. Por fim a pele do animal foi suturada utilizando fio de sutura de seda

4,0 (Ethicon, Edinburgh).

Figura 3. Ilustração demonstrando os procedimentos cirúrgicos da APB. (A) Região da incisão, (B e C) anatomia do plexo braquial, (D) separação de nervos e vasos, (E) preensão do tronco inferior, (F) avulsão do tronco inferior. Tronco inferior do plexo braquial (setas pretas); vasos subclávios (setas brancas). Fonte: Adaptado de QUINTÃO et al., 2006.

35

4.3 Análise do limiar mecânico através do filamento de von Frey

Para avaliar a hipernocicepção mecânica, os animais foram colocados

individualmente em compartimentos de acrílico transparente individuais (9 X 7 X 11

cm) localizados em uma plataforma de arame elevada para permitir o acesso à

superfície ventral das patas traseiras. Os animais foram aclimatizados por pelo

menos 30 min antes dos testes comportamentais. A frequência de resposta de

retirada foi obtida através de 10 aplicações (duração de 1 s cada) do filamento de

von Frey 0,6 g (VFH, Stoelting, Chicago, USA). Os estímulos foram realizados na

superfície plantar da pata traseira direita do animal (QUINTÃO et al., 2005; 2006).

Objetivando determinar o limiar mecânico basal (B), todos os grupos de animais

foram submetidos à avaliação pré-cirúrgica e novamente reavaliados em diferentes

tempos após a APB.

4.4 Avaliação da Atividade Antinociceptiva

4.4.1 Modelo de nocicepção espontânea induzida pela formalina

O procedimento que foi utilizado é similar ao descrito na literatura (MENDES

et al., 2000), sendo composto de duas fases distintas: 1ª fase (resposta fásica 0-5

min) e 2ª fase (resposta tônica 15-30 min). Animais operados e falso-operados, 6

dias e 30 dias após a cirurgia, receberam uma injeção i.pl. de 20 µL de formalina

(0,5 - 2,5 %), na pata traseira direita. Após a injeção de formalina, os animais foram

imediatamente colocados em funis de vidro de 20 cm de diâmetro, e o tempo que o

animal ficou lambendo ou mordendo a pata injetada nas duas fases descritas acima

foi considerado com indicativo de nocicepção.

4.4.2 Modelo de nocicepção espontânea induzida pela capsaicina

Com o objetivo de avaliar o comportamento nociceptivo de animais

submetidos à APB frente à nocicepção neurogênica, camundongos operados e

falso-operados foram submetidos, 6 dias após a cirurgia, ao teste de nocicepção

36

induzida pela capsaicina descrito por Sakurada et al., (1992), com algumas

modificações (CORRÊA et al., 1996). Os animais receberam 20 µL de capsaicina

(0,016 - 1,6 µg/pata), injetado por via i.pl. na pata traseira direita. Imediatamente

após a injeção de capsaicina, os animais foram individualmente colocados em funis

de vidro cilíndricos de 20 cm de diâmetro, e o tempo que o animal lambeu ou

mordeu a pata injetada dentro de um intervalo de 5 min foi considerado como

indicativo de nocicepção.

4.4.3 Modelo de nocicepção espontânea induzida pelo glutamato

Para avaliar o efeito da APB no sistema glutamatérgico, foi utilizado o teste de

nocicepção induzida pelo glutamato descrito por Beirith et al. (2002). Primeiramente,

os animais foram submetidos à APB e transcorridos 6 dias da cirurgia os

camundongos receberam uma injeção i.pl. de 20 µL de glutamato (0,3 - 30

µmol/pata) na para direita traseira. O tempo que o animal ficou lambendo ou

mordendo a pata injetada num intervalo de tempo de 15 min foi considerado como

indicativo de nocicepção.

4.4.4 Modelo de nocicepção espontânea induzida pela bradicinina

Este teste avalia a participação dos receptores B2 para cininas. Os animais

foram submetidos à APB e, após 6 dias receberam uma injeção i.pl. de bradicinina

(BK; 0,1 - 10 nmol/pata) e o tempo que o animal lambeu ou mordeu a pata injetada,

durante 10 min, foi tomado como indicativo de nocicepção (FERREIRA et al., 2004).

4.4.5 Hipernocicepção mecânica induzida pela BK

Os animais foram submetidos à APB 6 dias antes da injeção de 20 µL de BK

(0,1 nmol/pata, i.pl.), e a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do

monofilamento de von Frey 0,4 g nos intervalos de tempo de 1/2, 1, 2, 4, 6 e 24 h

após a injeção i.pl. (FERREIRA et al., 2004).

37

4.4.6 Hipernocicepção mecânica induzida pela PGE2

Os animais foram submetidos à APB 6 dias antes da injeção i.pl. de 20 µL de

PGE2 (0,1 nmol/pata, i.pl.), e a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do

monofilamento de von Frey 0,4 g nos intervalos de tempo de 1/2, 1, 2, 4, 6 e 24 h

após a injeção i.pl. (KASSUYA et al., 2007).

4.4.7 Hipernocicepção mecânica induzida pela epinefrina

Os animais serão submetidos à APB 6 dias antes da injeção de i.pl. de

Epinefrina (100 ng/pata), e a hipernocicepção mecânica foi avaliada através do

monofilamento de von Frey 0,4 g nos intervalos de tempo de 1/6, 1/2, 1, 2, 4 e 6 h

após a injeção i.pl. (KHASAR et al., 2005).

4.5 Estudo farmacológico

4.5.1 Envolvimento do sistema de cininas

Para o estudo farmacológico foram utilizados animais falso-operados e

animais submetidos à APB. Com base na avaliação das respostas obtidas nos

modelos citados anteriormente foram utilizados antagonistas dos receptores de

cininas [HOE-140, antagonista dos receptores B2 para cininas; DALBK (Des-Arg9-

Leu8-BK) antagonista de receptores B1 frente à nocicepção induzida pela formalina

2,5% ou pela BK (10 nmol/pata) 6 dias após a realização da APB. Em seguida estes

animais foram submetidos a testes de nocicepção aguda.

4.5.2 Envolvimento de componentes inflamatórios e sistema opioide

Para o estudo farmacológico foram utilizados animais falso-operados e

animais submetidos à avulsão do plexo braquial. Com base na avaliação das

respostas obtidas no modelo de nocicepção induzida pela formalina citado

38

anteriormente foram utilizadas drogas de uso clínico, tais como indometacina (10

mg/kg, i.p.), dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.) ou morfina (0,5 mg/kg, s.c.). Estes

ensaios tiveram o objetivo de avaliar o papel dos componentes inflamatórios nas

alterações da resposta nociceptiva apresentadas pelos animais submetidos à APB,

bem como investigar o motivo da redução da resposta nociceptiva apresentada

pelos animais operados quando injetados com formalina 2,5 %.

4.6 Drogas e reagentes

As seguintes drogas e reagentes foram utilizados: Formalina (Merck,

Darmstadt, Alemanha); capsaicina, glutamato, bradicinina e dexametasona (Sigma

Chemical Co.;St. Louis, Missouri, EUA); morfina (Dimorf®, Cristália, Itapina, São

Paulo Brasil); indometacina (DEG Importação de Produtos Químicos Ltda, Brasil),

HOE- 140, DALBK e DABK. (Sigma Chemical Co.; St. Louis, Missouri, EUA);

4.7 Análise estatística

Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média

(E.P.M., 95%). As porcentagens de inibição foram citadas como a média ± o erro

padrão da média da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas

obtidas para cada experimento individual em relação ao grupo controle

correspondente ou por cada experimento individual. A análise estatística dos dados

foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de duas vias seguida pelo

teste de Bonferroni, de análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelos

testes de Dunnett ou Newman-Keuls, ou através do teste t de Student, quando

apropriado. Valores de p menores que 0,05 (P < 0,05) foram considerados como

indicativos de significância. Todas as análises citadas acima foram realizadas

utilizando o programa GraphPad PRISM®.

39

5 RESULTADOS

5.1 Resposta nociceptiva induzida pela formalina

Como se pode observar na Figura 4A e B, os animais operados e não

operados, quando injetados com solução de formalina 2,5 % no 6º dia após a

cirurgia, apresentaram redução da resposta nociceptiva quando comparados aos

animais falso-operados. Esta redução foi de 45 ± 2 % e 40 ± 8 %, para a primeira e

segunda fase, respectivamente.

Entretanto, quando animais operados receberam formalina nas concentrações

de 0,5 % (somente na 1ª fase) ou 1,5 % (somente na 2ª fase), esta resposta

apresentou-se significativamente aumentada em ambas às fases, com 45 ± 2 % para

a concentração de 0,5 % na primeira fase e 117 ± 26 % para a concentração de 1,5

% na segunda fase do teste.

0

50

100

150

Não operado

Falso-operado

Operado

0,5 1,5 2,5

Formalina (%)

*

*

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

0

100

200

300

0,5 1,5 2,5

Formalina (%)

*

*

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

A B

Figura 4. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (0,5 – 2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

As Figuras 5A e B demonstram a resposta nociceptiva induzida pela formalina

em animais submetidos à APB 30 dias antes do teste. Como se pode observar

ocorreu um aumento significativo do tempo de reação dos animais injetados com

formalina 1,5 % na primeira fase do teste (34 ± 8 %). Diferente do que ocorreu com

40

os animais observados 6 dias após a cirurgia, não houve alteração significativa da

resposta nociceptiva induzida pela formalina nas demais concentrações, sugerindo

que estas alterações estão presentes em períodos mais precoces do processo

neuropático.

0

50

100

150

Não operado

Falso-operado

Operado

0,5 1,5 2,5

Formalina (%)

*

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

0

50

100

150

200

250

300

350

0,5 1,5 2,5

Formalina (%)

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

A B

Figura 5. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (0,5 – 2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 30 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

Com o intuito de verificar se estas mudanças estariam limitadas ao hemisfério

corporal que o animal sofreu a APB, foi injetado formalina nas diferentes

concentrações 6 dias após a cirurgia, porém na para contralateral ao lado lesionado

(pata traseira esquerda). Como se pode observar nas Figuras 6A e B houve um

aumento na resposta nociceptiva induzida pela formalina de 31 ± 8 % e 42 ± 11 %

para as concentrações de 0,5 % e 2,5 %, a 1ª fase, e 99 ± 40 % na concentração de

1,5 % na 2ª fase do teste.

41

0

50

100

150

Não operado

Falso-operado

Operado

0,5 1,5 2,5

Formalina (%)

**

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

0

50

100

150

200

250

300

350

0,5 1,5 2,5

Formalina (%)

*

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

A B

Figura 6. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (0,5 – 2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) na pata contralateral de animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

Para avaliar a participação dos receptores B2 de cininas, envolvido no

processo doloroso da APB, um antagonista sintético e seletivo de receptores B2,

chamado de HOE-140 ou icatibante foi administrado aos animais submetidos APB,

30 dias após a cirurgia. Na Figura 7A e B, pode-se observar que os animais,

avaliados 6 dias após a cirurgia, pré-tratados uma hora antes dos experimentos com

HOE-140 (50 nmol/kg, s.c.), apresentaram um aumento significativo da resposta

nociceptiva induzida pela injeção i.pl. de formalina 2,5 %, na segunda fase do teste

(139 ± 52 %), quando comparados com os animais operados que receberam salina.

42

sham salOp sal hoe shamhoe op0

100

200

Salina (10 mL/kg, s.c.)Hoe-140 (50 nmol/kg, s.c.)

+-

+-

-+

-+

FOP FOPOP OP

Formalina (2,5%)

Lic

kin

g (

s)

sham salOp sal hoe shamhoe op0

100

200

##

+-

+-

-+

-+

FOP FOPOP OP

Formalina (2,5%)

Lic

kin

g (

s)

A B

Figura 7. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia e pré-tratados com HOE-140 (50 nmol/kg s.c.). Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo operado tratado com salina ##p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado.

Para se avaliar o envolvimento dos receptores B1 de cinina, o antagonista

seletivo para receptores B1 DALBK (des-Arg9-Leu8-BK) foi administrado aos animais

submetidos APB, com 6 dias de cirurgia. As Figuras 8A e B demonstram o efeito da

administração de DALBK (150 nmol/kg, s.c.) uma hora antes do teste de nocicepção

induzida por formalina (2,5 %). Na primeira fase, os animais operados não

apresentaram significativa alteração da resposta nociceptiva. Na segunda fase do

teste, os animais operados tratados com DALBK apresentaram um aumento na

resposta nociceptiva de 170 ± 49 % quando comparados com os animais operados

tratados com salina (Figura 8).

43

Sal Sal DALBK DALBK 0

100

200

Salina (10 mL/kg, s.c.)DALBK (150 nmol/kg, s.c.)

+-

+-

-+

-+

FOP FOPOP OP

Formalina (2,5%)

Lic

kin

g (

s)

sham sal Op sal DALBK hoe op0

100

200##

+-

+-

-+

-+

FOP FOPOP OP

Formalina (2,5%)

Lic

kin

g (

s)

A B

Figura 8. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (2,5 %; A – primeira fase; B – segunda fase) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia e pré-tratados. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo operado tratado com salina ##p < 0,01 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado.

5.2 Resposta nociceptiva induzida pela capsaicina

Para verificar se a APB era capaz de alterar a resposta dos receptores

vaniloide (TRPV1) presente nas terminações periféricas, foi realizado o teste de

nocicepção induzida pela injeção i.pl. de capsaicina em diferentes concentrações. A

Figura 9 demonstra que não foi observada qualquer diferença significativa na

resposta dos animais operados quando comparados aos animais falso-operados.

0

20

40

60

80

0,016 1,6

Capsaicina (µµµµg/pata)

Falso-operado

Operado

0,16

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Figura 9. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de capsaicina (0,016 – 1,6 µg/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

44

5.3 Resposta nociceptiva induzida pelo glutamato

A Figura 10A e B demonstram as respostas nociceptivas causadas pelo

glutamato em animais com 6 dias após a cirurgia de APB. A injeção i.pl. de

glutamato causa alterações nociceptivas por ativar receptores glutamatérgicos

periféricos. Os animais operados, quando injetados com solução de glutamato no

30º dia após a cirurgia, apresentaram redução da resposta nociceptiva quando

comparados aos animais falso-operados. Esta redução foi de 69 ± 15 %, 23 ± 8 % e

23 ± 8 %, respectivamente para as três doses testadas. Buscando-se verificar se

estas mudanças estariam limitadas ao hemisfério corporal, aos animais que

sofreram APB, foi injetada uma solução de glutamato na concentração de 30

µmol/pata 6 dias após a cirurgia, porém na pata contralateral ao lado lesionado (pata

traseira esquerda). A mesma redução da resposta nociceptiva apresentada pela

pata ispilateral pode ser observada também na pata contralateral, porém com menor

intensidade, onde se observa redução significativa na resposta.

0

100

200

300

400

0.3 30

Glutamato (µµµµmol/pata)

**

*

*

3FOP OP FOP OP FOP OP

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Sham OP0

50

100

150

**

30 30

FOP OP

Glutamato (µµµµmol/pata)

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Pata IpsilateralPata Contralateral

A

B

Figura 10. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de glutamato (0,3 – 30 µmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

45

5.4 Resposta nociceptiva induzida pela bradicinina

Na Figura 11A e B, observou-se que os animais operados, quando injetados

uma solução de bradicinina i.pl. (0,1 e 1,0 nmol/pata) no 6º dia após a cirurgia,

apresentaram aumento da resposta nociceptiva quando comparados com os animais

falso-operados. Esse aumento foi de 218 ± 77 % e 237 ± 66 %, respectivamente.

Entretanto, quando se utilizou concentrações menores de bradicinina (0,1 ou 1

nmol/pata) ocorreu um aumento na resposta nociceptiva dos animais operados

quando comparada a resposta dos animais falso-operados, com aumento de 214 ±

76 % e 237 ± 66 %, para as concentrações de 0,1 e 1 nmol/pata, respectivamente.

Este resultado foi semelhante ao obtido com a injeção i.pl. de formalina 2,5%.Porém,

o aumento não foi significativo quando administrado na pata contralateral ao

membro avulsionado. Entretanto, quando os animais operados receberam uma

solução de bradicinina na concentração de 10 nmol/pata, apresentaram uma

resposta nociceptiva significativamente reduzida tanto na pata ipsilateral quanto na

pata contralateral, quando comparado aos animais falso-operados. A redução

apresentada foi de 81 ± 4 % para a pata ipsilateral, e 63 ± 5 % para a pata

contralateral.

0

25

50

75

100

0.1 1 10

Bradicinina (nmol/pata)

****

**

FOP OP FOP OP FOP OP

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

0

25

50

75

100

**

0.1 1 10

Bradicinina (nmol/pata)

FOP OP FOP OP FOP OP

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Pata Ipsilateral Pata Contralateral

A B

Figura 11. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de bradicinina (0,1 – 10 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado.

46

Ainda, buscando-se avaliar a participação dos receptores B2 de cinina, o

antagonista seletivo de receptores B2, HOE-140, foi administrado aos animais

submetidos APB, com 6 dias de cirurgia, uma hora antes do teste de nocicepção

induzida por bradicinina. A Figura 12 apresenta os resultados observados no pré-

tratamento dos animais com HOE-140 (50 nmol/kg), e submetidos à nocicepção

induzida por bradicinina (10 nmol/pata) no 6º dia após a cirurgia de APB. Quando

injetada a bradicinina, tanto os animais operados quanto falso-operados pré-tratados

com HOE-140 apresentaram completa redução da resposta nociceptiva, quando

comparados com os animais tratados com salina.

0

20

40

60

80

100

120

#

** **

Salina (10 mL/kg, s.c.)Hoe-140 (50 nmol/kg, s.c.)

+-

+-

-+

-+

Bradicinina (10 nmol/pata)

FOP FOPOP OP

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Figura 12. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de BK (10 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado.

Como se pode observar na Figura 13, a injeção i.pl. de DABK, em todas as

concentrações testadas não foi capaz de evocar comportamento nociceptivo, tanto

quando injetada na para ipsilateral quanto contralateral em animais submetidos à

cirurgia (6º ou 30º dia PO – dado não mostrado).

47

1 1 3 3 10 100

5

10

15

DABK (nmol/pata)

FOP FOP FOPOP OP OP

1 2 3

Tem

po

de

reaç

ão(s

)

1 1 3 3 10 100

1

2

3

4

5

6

DABK (nmol/pata)

FOP FOP FOPOP OP OP

1 2 3

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Pata Ipsilateral Pata Contralateral

A B

Figura 13. Resposta nociceptiva induzida pela injeção de bradicinina (1 – 10 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado **p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett). FOP, falso-operado; OP operado.

5.5 Participação de componentes inflamatórios na alteração da resposta

nociceptiva de animais submetidos à APB

Na tentativa de determinar os possíveis mecanismos de ação e quais os

processos inflamatórios envolvidos no aumento da resposta nociceptiva presente

nos animais operados injetados com formalina 1,5 %, foi realizado o pré-tratamento

destes animais com dois anti-inflamatórios clássicos, a indometacina (inibidor não

seletivo da enzima COX1 e COX2) ou dexametasona (glicocorticóide, inibidor de

síntese proteica). Os dados apresentados na Figura 14 demonstra que o pré-

tratamento com indometacina (10 mg/kg, i.p.) 30 min antes da administração da

formalina, foi capaz de reverter significativamente o aumento da resposta

nociceptiva apresentado pelos animais operados, quando comparado aos animais

falso-operados.

48

0

50

100

150

Não operado

Falso-operado

Operado

*

***

##

2a fase

Salina(10 ml/kg)

Indometacina(10 mg/kg, i.p.)

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

1a fase

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Figura 14. Efeito do pré-tratamento com indometacina (10 mg/kg, i.p.) sobre a resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (1,5 %) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 e ***p < 0,001. (#) difere significativamente do grupo operado tratado com salina (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

De maneira semelhante, o pré-tratamento dos animais operados com

dexametasona 4 horas antes da realização do teste, foi capaz de reverter o aumento

da resposta nociceptiva dos animais operados presente em ambas as fases do teste

(Figura 15). Este resultado complementa o dado anteriormente descrito,

demonstrando a participação do componente inflamatório na resposta nociceptiva de

animais submetidos à APB.

0

50

100

150

200

250 Não operado

Falso-operado

Operado

*

***

#

1a fase 2a fase

Salina(10 ml/kg)

Dexametasona(0,5 mg/kg, s.c.)

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

#

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

Figura 15. Efeito do pré-tratamento com dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.) sobre a resposta nociceptiva induzida pela injeção de formalina (1,5 %) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 e ***p < 0,001. (#) difere significativamente do grupo operado tratado com salina (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

49

5.6 Efeito do tratamento com morfina sobre a resposta nociceptiva induzida

pela formalina

Para investigar qual a possível causa da redução da resposta nociceptiva

apresentada pelos animais submetidos à APB e injetados, foi administrado uma

dose sub-limiar de morfina (0,5 mg/kg, s.c.). Como se pode observar nas Figuras 16

A e B, o pré-tratamento com morfina foi capaz de reestabelecer a resposta dos

animais operados frente à aplicação de formalina 2,5 %. Este dado sugere que os

animais operados respondem menos a administração de formalina (2,5%) devido a

uma superestimulação das vias nociceptiva e consequente dessensibilização de

receptores, culminando na redução da resposta.

0

20

40

60

80

100

120

*

Salina Morfina(0,5 mg/kg, s.c.)

Falso-operado

Operado

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

0

60

120

180

**

#

Salina Morfina(0,5 mg/kg, s.c.)

Falso-operado

Operado

Tem

po

de

reaç

ão (

s)

A B

Figura 16. Efeito do pré-tratamento com morfina (0,5 mg/kg, s.c.) sobre as respostas nociceptivas (A) neurogênica e (B) inflamatória induzidas pela injeção de formalina (2,5 %) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado *p < 0,05 (ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett).

5.7 Resposta hipernociceptiva induzida pela PGE2, epinefrina e BK.

As Figuras 17A, B e C demonstram que as respostas hipernociceptivas

causadas pela PGE2, epinefrina e BK apresentou-se significativamente aumentada

nos animais submetidos à APB (6 dias PO), quando comparado com os animais

falso-operados.

50

B 1 2 4 60

25

50

75

100

Operado

Falso-operado

Tempo (h)

Fre

qu

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

B 1 2 4 60

25

50

75

100

125

Operado

Falso-operado

Tempo (h)

Fre

qu

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

B 1 2 4 60

25

50

75

100

125Operado

Falso-operado

Tempo (h)

Fre

qu

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

A B C

Figura 17. Resposta hiperalgésica induzida pela injeção de (A) PGE2, (0,1 nmol/pata) (B) epinefrina (100 ng/pata) e (C) BK (0,1 nmol/pata) em animais submetidos à APB ou falso-operados, avaliados 6 dias após a cirurgia. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais e as linhas verticais indicam o E.P.M. Significativamente diferente dos valores do grupo falso-operado #p < 0,05 (ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni).

51

6 DISCUSSÃO

A lesão do plexo braquial é causada pela avulsão da raiz medular, produzindo

dor característica constante, intermitente e frequentemente intratável (BERMAN,

BIRCH, ANAND et al., 1998; ANAND; BIRCH, 2002). A dor geralmente acomete a

projeção do ombro e região supra-escapular com irradiação para o membro superior

ipsilateral, dependendo da intensidade e da região do plexo lesionado. A APB foi

primeiramente descrita em ratos como um novo modelo de dor neuropática

persistente (RODRIGUES-FILHO et al., 2003). Recentemente, este modelo foi

adaptado para camundongos (QUINTÃO et al., 2006). Na primeira semana após

uma lesão nervosa periférica, o processo de reorganização dentro dos neurônios

sensoriais lesionados produz um aumento pronunciado no transporte axonal

retrógrado de pequenas proteínas, tais como citocinas e fatores neurotróficos

(CAHILLl et al., 2003). Por outro lado, os fatores neurotróficos são capazes de

modular a expressão de outras proteínas, tais como os receptores B1 (induzido) e B2

(constitutivo) para cininas (LEE et al., 2002).

A dor crônica, diferente da dor aguda, é caracterizada por modificar a relação

entre os estímulos e respostas nociceptivas. Ocorrem alterações neuroquímicas

centrais, resultando em hipersensibilidade, aumento da frequência e duração dos

impulsos aferentes, além de mudanças estruturais secundárias a lesão nervosa

periférica, como a perda de interneurônios espinhais, rearranjos nos processos

neurais aferentes da medula espinhal e proliferação de fibras simpáticas no gânglio

sensorial (WATKINS; MAIER, 2002; DOGRUL et al., 2003).

O modelo de nocicepção induzida por formalina foi descrito por Dubuisson e

Dennis (1977) em ratos e gatos, e tem sido utilizado para o estudo de drogas

analgésicas em roedores, principalmente em camundongos. Este teste permite

avaliar duas fases distintas da sensibilização dolorosa: a primeira fase, que ocorre

nos primeiros 5 min após a injeção de formalina (resposta nociceptiva neurogênica),

caracterizada pela estimulação direta dos nociceptores presentes nas fibras

aferentes tipo C, e, em parte, fibras Aδ (liberação de glutamato e substancia P). A

segunda fase da nocicepção, que ocorre entre 15 e 30 min após à injeção de

formalina (resposta nociceptiva inflamatória), está relacionada com a liberação de

mediadores pró-inflamatórios tais como adenosina, bradicinina, histamina,

prostaglandina e serotonina (REEVE, DICKENSON, 1995). Estudo realizado por

52

Hunskaar e Hole (1987) demonstrou que doses crescentes de formalina, acima de

3%, induzem a uma redução da resposta nociceptiva dos animais, e não ao

aumento.

O passo seguinte foi verificar se concentrações menores de formalina (0,5 %

e 1,5 %) produziriam a mesma resposta da dose maior (2,5 %) em animais

operados. Nas menores doses, a resposta nociceptiva foi maior nos animais

operados do que nos animais falso-operados, sugerindo que a hipótese de hiper-

estimulação na dose de 2,5 % possa estar correta. Os mesmos testes foram

realizados na pata traseira esquerda de animais submetidos à APB (pata

contralateral a cirurgia), e foi observado um aumento da resposta nociceptiva em

todas as dores testadas. O comportamento de freezing não foi observado em

nenhuma das concentrações testadas, sugerindo que as alterações sensoriais

decorrentes da lesão nervosa na periferia unilateral são distintas quando

comparados os dois hemisférios corporais. Quando animais submetidos à APB

foram avaliados 30 dias após a cirurgia não foi observada alteração significativa.

A persistência do quadro nociceptivo resulta em alterações centrais crônicas

na neuroquímica da sinalização da dor produzindo hipersensibilidade, aumento da

frequência e a duração dos impulsos aferentes. Estas alterações estruturais

secundárias à lesão nervosa periférica englobam a perda de interneurônios

espinhais, rearranjos não apropriados de processos neurais aferentes na medula

espinhal e a proliferação de fibras simpáticas no gânglio sensorial. (WATKINS;

MAIER, 2002; DOGRUL et al., 2003).

Dados da literatura demonstram que os mecanismos envolvidos no controle

da dor aguda e crônica são bem distintos e que há um balanço diferente entre a

facilitação e a inibição descendentes da dor nos neurônios espinhais e periféricos,

contribuindo para um balanço distinto de receptores e mediadores envolvidos na dor

aguda e crônica (YASHPAL et al., 2001; ZHAO et al., 2006; HÖSL et a., 2006).

O modelo de nocicepção induzida por capsaicina demonstra o envolvimento

dos componentes neurogênicos na dor. A capsaicina, quando injetada na pata de

camundongos, é capaz de ativar uma subpopulação distinta de fibras aferentes

primárias, as quais transmitem informações nociceptivas ao SNC e induzem a

liberação de neuropeptídeos pró-inflamatórios (HOLZER, 1991). Em 1992, Sakurada

e colaboradores demonstraram que a injeção i.pl. de capsaicina na pata traseira de

camundongos induz um profundo comportamento nociceptivo, caracterizado pela

53

mordida e lambida da pata injetada, relacionado à dor neurogênica. Sabe-se que há

a liberação de alguns mediadores químicos, tais como aminoácidos excitatórios,

substancia P, cininas, CGRP, PGE2 e NO, que contribuem para o aumento do

processo doloroso (WU et al., 1998). Nossos resultados sugerem que a APB não

induz a uma alteração na resposta dos receptores vanilóides periféricos (receptores

TRPV1) frente à injeção de capsaicina, mesmo reduzindo a concentração da

mesma.

Atualmente, sabe-se que dentre os diferentes neurotransmissores envolvidos

nos modelos de nocicepção anteriormente citados, os aminoácidos excitatórios (AAE

- glutamato e aspartato) têm um papel relevante. Perifericamente, demonstra-se o

importante papel fisiológico do glutamato. Alguns pesquisadores têm demonstrado a

intensa liberação de AAE na medula espinhal, principalmente glutamato e aspartato,

após a injeção i.pl. de formalina e capsaicina (OMOTE et al., 1998). Os dados

apresentados neste estudo demonstram que animais submetidos à APB respondem

menos à injeção i.pl. de glutamato do que animais falso-operados, sugerindo que

receptores glutamatérgicos possam estar com sua expressão reduzida ou que a

resposta nociceptiva induzida pelo glutamato possa estar sendo bloqueada por

algum mecanismo central de controle da dor.

As cininas constituem uma importante família de peptídeos biologicamente

ativos envolvidos em diversos efeitos biológicos incluindo a homeostasia

cardiovascular, inflamação e nocicepção (CALIXTO et al., 2000; 2001; 2004;

CAMPOS et al., 2006; LEEB-LUNDBERG et al., 2005; MOREAU et al., 2005). Estes

peptídeos estão entre os primeiros mediadores a serem liberados nos tecidos

lesionados, sendo originados a partir da clivagem dos cininogênios (de alto e baixo

peso molecular) pela calicreína plasmática, a qual é ativada precocemente na

cascata de coagulação ou, pela calicreína tecidual, que por sua vez é ativada por

proteases liberadas no sítio da lesão (REGOLI, BARABÉ, 1980; VAVREK,

STEWART, 1985; MURRAY et al., 1990; REGOLI et al., 1990; BEAUBIEN et al.,

1991; BHOOLA et al., 1992; REGOLI et al., 1994; HALL, MORTON, 1997).

As cininas desempenham seus efeitos através da ativação de dois receptores

de membrana específicos, denominados B1 e B2. A classificação dos dois subtipos

de receptores teve origem em estudos farmacológicos conduzidos no final da

década de 70, que determinaram a ordem de potência dos agonistas cininérgicos

em preparações de órgãos isolados (REGOLI, BARABÉ, 1980). Assim, os

54

receptores do tipo B1 são ativados preferencialmente pela des-Arg9-BK e pela Lys-

des-Arg9-BK, enquanto que os receptores B2 são praticamente insensíveis a estes

metabólitos. Por outro lado, os receptores B2 apresentam alta afinidade pela BK e

pela Lys-BK, ao passo que os peptídeos produzidos pela ação da cininase I são

praticamente inativos neste receptor (MOREAU et al., 2005).

O papel das cininas nas respostas nociceptivas em animais já está bem

estabelecido, há mais ou menos duas décadas (CALIXTO et al., 2000; 2001; 2004;

CAMPOS et al., 2006; LEEB-LUNDBERG et al., 2005). Atualmente, a ativação do

receptor B2 tem sido relacionada com a fase inicial da dor inflamatória, enquanto a

estimulação do receptor B1 estaria associada com processos patológicos mais

persistentes. De fato, o aumento nos níveis de RNAm para o receptor B1, ou da

proteína, foi descrito no DRG após lesão por constrição do nervo ciático em ratos e

camundongos (PETERSEN et al., 1998; ECKERT et al., 1999; LEVY, ZOCHODNE,

2000; YAMAGUCHI-SASE et al., 2003; RASHID et al., 2004).

Walker et al. (1995) já afirmavam a existência de componentes do sistema

calicreína-cininas no SNC, em regiões como córtex, tronco encefálico, cerebelo e

hipotálamo, o que seria condizente com a atuação das cininas no controle central da

dor. Foram evidenciadas também, concentrações razoáveis de BK na medula,

cerebelo e córtex, bem como uma densidade moderada de sítios de ligação para a

BK no hipocampo (PERRY, SNYDER, 1984; KARIYA et al., 1985; FUJIWARA et al.,

1989; COUTURE, LINDSEY, 2000). Petersen e colaboradores (1998) demonstraram

que após a lesão parcial ou axotomia do nervo ciático ocorrem alterações na

expressão de neuropeptídeos e de receptores para cininas em neurônios do DRG.

Ademais, em estudos in vitro, o aumento na expressão de receptores B1 e B2 para

cininas parece estar relacionado com a interação da neurotrofina NGF com o

receptor p75NTR (PETERSEN et al., 1996). Todas estas alterações ocorrem tanto

no lado ipsilateral à lesão, como também no lado contralateral. Estas mudanças

parecem ter como pré-requisito a lesão nervosa, uma vez que em animais falso-

operados não ocorre aumento na expressão destes receptores (PETERSEN et al.,

1998). Levy e Zochodne (2000) demonstraram que a lesão nervosa periférica está

associada com o aumento na expressão do RNAm para os receptores B1 e B2 nos

DRG, apesar da existência de receptores de forma constitutiva. Ainda, os mesmos

autores relataram o aumento da expressão destes receptores no lado contralateral à

lesão.

55

Estes dados, juntamente com evidências comportamentais, permitem sugerir

que os receptores cininérgicos estão envolvidos no desenvolvimento e na

manutenção da hipersensibilidade térmica após a lesão nervosa. Mais

recentemente, Rashid e colaboradores (2004) demonstraram a ocorrência da

síntese de novo dos receptores B1 para cininas após a lesão parcial do nervo ciático,

principalmente em neurônios mielinizados do DRG, enquanto que a expressão dos

receptores B2 encontra-se reduzida. Dados da literatura relatam que os antagonistas

para o receptor B2 são capazes de causar redução significativa, porém em menor

grau do que a induzida por antagonistas do receptor B1, no modelo de hiperalgesia

mecânica ipsilateral induzida pela injeção de CFA (PERKINS et al., 1993; BURGESS

et al., 2000). Entretanto, outros autores demonstraram que a hiperalgesia térmica

induzida pela injeção intraplantar de CFA não foi modificada em animais com

deleção gênica para o receptor B2 (RUPNIAK et al., 1997).

Resultados similares foram obtidos por Ferreira et al. (2001), onde animais

com deficiência do receptor B2 apresentaram essencialmente o mesmo

comportamento hipernociceptivo após a injeção de CFA, em relação aos animais

selvagens. Estes resultados foram confirmados através da utilização do antagonista

seletivo para o receptor B2, HOE-140. Outro fato interessante é que a resposta

hiperalgésica induzida pelo agonista seletivo do receptor B1, a des-Arg9-BK, é

potencializada em animais com deleção gênica para o receptor B2, em comparação

com animais selvagens (FERREIRA et al., 2004). Estes dados reforçam a hipótese

de que pode ocorrer um aumento compensatório na expressão do receptor B1 em

animais com deleção gênica para o receptor B2 (MADEDDU et al., 1997; DUKA et

al., 2001).

Ademais, pode-se sugerir que o aumento da resposta presente nos animais

operados e injetados com concentrações menores de formalina (0,5 – 1,5 %) deva-

se a presença de componentes inflamatórios já na primeira fase do teste. Esta

hipótese se deve a reversão do quadro quando estes animais são pré-tratados com

anti-inflamatórios clássicos, como indometacina e dexametasona. Estudos prévios

demonstraram que estes mesmos anti-inflamatórios não tinham efeito algum sobre a

primeira fase do teste de nocicepção induzido pela formalina (HUNSKAAR, HOLE,

1987).

Eventos fisiológicos e o envolvimento dos receptores de cininas podem ser

avaliados e confirmados pelo uso de ferramentas farmacológicas importantes, tais

56

como o uso de antagonistas e agonistas seletivos. No modelo de APB em

camundongos, foi observado que a citocina pró-inflamatória, o fator de necrose

tumoral-α (TNFα), tem um papel relevante na gênese e manutenção da

hipernocicepção mecânica induzida pela APB (QUINTÃO et al., 2006). Ademais,

dados da literatura demonstram que os fatores neurotróficos, principalmente o fator-

neurotrófico-derivado-do-cérebro (BDNF), bem como o aumento na expressão dos

receptores B1 para cininas são fundamentais na indução e na perpetuação do

quadro hipernociceptivo observado no modelo de formalina.

Nos modelos de nocicepção induzida por formalina e bradicinina, avaliou-se a

participação dos receptores de cininas através da administração de antagonistas

seletivos, o HOE-140 (D-Arg0[Hyp3, Thi5, D-Tic7, Oic8]-BK ou icatibante), para

receptores B2, e a DALBK ([Leu8][des-Arg9]-BK), para receptores B1, e administração

i.pl. de um agonista seletivo, a DABK ([des-Arg9]-BK) para receptores B1 (VAVREK,

STEWART, 1985; LEMBECK et al., 1991; WIRTH et al., 1991; TRIFILIEFF, DA

SILVA, GIES, 1993; HALL, MORTON, 1997).

Os receptores B2 são amplamente encontrados nos tecidos (isoforma

constitutiva), e os receptores B1 são regulados a partir de estímulos pró-inflamatórios

(isoforma induzida). (REGOLI, BARABÉ, 1980; MARCEAU, REGOLI, 2004). O

ligante natural dos receptores B1 é a bradicinina, sendo menos potente que seus

metabólitos, as des-Arg-cininas. Os receptores B1 são potentemente ativados pelos

metabólitos des-Arg-cininas, formados pela enzima cininase I a partir da bradicinina,

tais como a Lis-[des-Arg9]-BK e a [des-Arg9]-BK; e são inibidos pelos agonistas

sintéticos [Leu8][des-Arg9]-BK (TRIFILIEFF, DA SILVA, GIES, 1993; MOREAU et al.,

2005).

Os receptores B2 apresentam uma maior afinidade para Lis-BK (calidina) e a

bradicinina do que para seus metabólitos des-Arg-cininas (FARMER, BURCH, 1991).

A bradicinina também é o ligante natural para os receptores B2. O papel das cininas

nas respostas nociceptivas já está bem estabelecido, porém o perfil farmacológico,

fisiológico e patológico destes receptores não está completamente elucidado,

tornando-se necessário o estudo da sua participação nestes processos, buscando-

se a pesquisa de novos fármacos agonistas ou antagonistas que possam ser

utilizados nas terapias de doenças crônicas, tais como em quadros neuropáticos

(REGOLI, RIZZI, CALO, 1997; HESS et al., 2001; CALIXTO et al., 2000; 2001; 2004;

CAMPOS et al., 2006; LEEB-LUNDBERG et al, 2005; MOREAU et al., 2005).

57

As cininas constituem uma importante família de peptídeos biologicamente

ativos, e são os primeiros mediadores a serem liberados em tecidos lesionados. A

calicreína plasmática, por exemplo, é ativada precocemente na cascata de

coagulação. Já a calicreína tecidual é ativada por proteases liberadas no sítio da

lesão. (REGOLI, BARABÉ, 1980; VAVREK, STEWART, 1985; MURRAY et al., 1990;

REGOLI et al., 1990; BEAUBIEN et al., 1991; BHOOLA et al., 1992; REGOLI et al.,

1994; HALL, MORTON, 1997).

Como o quadro nociceptivo é resultante das alterações crônicas na

neuroquímica da sinalização da dor e o envolvimento dos receptores de cininas

pode estar relacionado. No modelo de nocicepção induzida por formalina foi

observado que os animais submetidos à APB com 6 dias de cirurgia apresentaram

um aumento da resposta dolorosa na segunda fase do teste, tanto nos tratamentos

com HOE-140 e com DALBK. Isso pode estar relacionado com a expressão de

receptores B1 para cininas, visto que os receptores B2 estão bloqueados pela ação

do HOE-140. Podemos também sugerir que a redução na resposta dos animais

operados injetados com formalina 2,5% possa representar um comportamento de

freezing desencadeado pela hiper-estimulação das vias nociceptivas decorrentes do

aumento na expressão dos receptores B2 para cininas. O mesmo pode ser

observado com a administração da DALBK, a qual foi capaz de inibir a nocicepção

induzida pela formalina. A ação dos antagonistas cininérgicos também pode ser

observada no modelo de nocicepção induzida pela BK.

A ativação do receptor B2 das cininas tem sido descrita como participante da

fase inicial da dor inflamatória produzida por agentes nociceptivos, tais como a

formalina, enquanto que a estimulação do receptor B1 estaria associada com

processos patológicos mais persistentes, visto que em modelos animais de

constrição do nervo ciático em ratos e camundongos observou-se o aumento nos

níveis de RNAm para a transcrição do receptor B1 (PETERSEN et al.,1998; ECKERT

et al., 1999; LEVY, ZOCHODNE, 2000; YAMAGUCHI-SASE et al., 2003; RASHID et

al., 2004).

Trabalhos na literatura descrevem a existência de componentes do sistema

cininérgico em regiões do sistema nervoso central (córtex, tronco encefálico,

cerebelo e hipotálamo) e a presença de bradicinina na medula, córtex, cerebelo e

hipocampo, demonstrando a atuação das cininas no controle central da dor (PERRY,

SNYDER, 1984; KARIYA, YAMAUCHI, SASAKI, 1985; FUJIWARA et al., 1989;

58

WALKER, PERKINS, DRAY, 1995; COUTURE, LINDSEY, 2000).

Após a lesão do nervo do plexo ocorrem alterações na expressão de

neuropeptídeos e de receptores para cininas em neurônios do gânglio da raiz dorsal.

O aumento na expressão desses receptores parece estar relacionado com a

interação dos fatores de crescimento neuronal (neurotrofina NGF) com o receptor

p75NTR. Essas alterações ocorrem tanto no lado ipsilateral quanto no lado

contralateral a lesão, sendo pré-requisito para o aparecimento da lesão nervosa,

visto que animais falso-operados não apresentam aumento da expressão desses

receptores (PETERSEN et al., 1996; PETERSEN et al., 1998; LEVY, ZOCHONE,

2000).

A participação dos receptores cininérgicos envolvidos no desenvolvimento e

manutenção do quadro nociceptivo em processos onde ocorrem danos nervosos,

como no caso da lesão do nervo ciático ou da avulsão do plexo braquial é, em parte,

determinada pela síntese de “novos” receptores B1, principalmente em neurônios do

gânglio da raiz dorsal, sendo que a expressão de receptores B2 encontra-se

diminuída. Ainda, a participação de antagonistas de receptores B2 causa uma

redução significativa na expressão desses receptores, porém em menor grau do que

os antagonistas de receptores B1. Além disso, o bloqueio do receptor B2 causa um

aumento compensatório na expressão de receptores B1 (PERKINS, CAMPBELL,

DRAY, 1993; MADEDDU et al., 1997; BURGESS et al., 2000; DUKA et al., 2001;

RASHID et al., 2004).

O principal neurotransmissor presente em todos os nociceptores é o

aminoácido excitatório glutamato, que atua principalmente em receptores

ionotrópicos do tipo NMDA, AMPA e cainato, porém, pode atuar também em

receptores metabotrópicos. Perifericamente, o glutamato tem importante papel

fisiológico, atuando em processos nociceptivos induzidos, tais como os observados

no modelo de formalina. Este estudo demonstrou que os animais submetidos à APB

com 30 dias após a cirurgia apresentaram uma reduzida resposta nociceptiva frente

à injeção i.pl. de glutamato quando comparados com os animais falso-operados,

tanto na pata ipsilateral, quanto na contralateral. Esses dados sugerem que a

expressão dos receptores glutamatérgicos possa estar reduzida, ou que a resposta

nociceptiva induzida pelo glutamato possa estar sendo bloqueada por algum

mecanismo de controle central da dor, visto que as alterações na neurobioquímica

causadas pela APB possam estar interferindo nos processos de sinalização

59

mediados por CGRP, SP, ATP, PGs, histamina, neuropeptídeo Y, neurotrofinas,

somatostatinas, serotonina, entre outros (BESSON, 1999; LOESER, MELZACK,

1999; HUNT, JULIUS, BASBAUM, 2001; KIDD, PHOTIOU, INGLIS, 2004).

Além disso, a ativação contínua e sucessiva das fibras pelo glutamato ocorre

através da ativação de canais iônicos e receptores específicos, que sinalizam

através de uma cascata de mediadores intracelulares, pode acarretar em alterações

na expressão gênica, induzindo assim alterações na estrutura e função dos

neurônios sensoriais, resultando no aumento ou diminuição da expressão de canais

iônicos e receptores, na produção de mediadores e na indução de enzimas (KIDD,

PHOTIOU, INGLIS, 2004; SHIBASAKI, 2004, KNYIHAR, CSILLIK, 2006).

Cabe ressaltar ainda o envolvimento do prostanóide PGE2 e a amina

simpatomimética epinefrina, nos papéis de seus respectivos receptores, nas

alterações das vias nociceptivas após a indução de um processo doloroso crônico.

Já está bem estabelecido que a PGE2 participa da sensibilização das vias

nociceptivas, tornando os neurônios muito mais responsivos. Cabe a este sistema o

papel de induzir o processo conhecido como Wind up, juntamente com o aumento

na liberação do glutamato, onde os neurônios ficam incapazes de estabelecer

potencial de repouso e adquirem um comportamento de memória. Ao menor

estímulo, em que normalmente não seria evocada resposta nociceptiva, os

nociceptores despolarizam-se e retomam o estado doloroso anteriormente

vivenciado.

60

7 CONCLUSÕES

Este trabalho demonstra pela primeira vez que uma lesão nervosa periférica é

capaz de causar alteração na resposta nociceptivas frente aos modelos de

nocicepção aguda clássicos. Inicialmente foi demonstrado que animais submetidos à

avulsão do plexo braquial, quando injetados com formalina 2,5% (concentração

utilizada nos testes de nocicepção para avaliar o potencial analgésico de

substâncias), responderam menos quando comparado aos animais falso-operados.

Esta resposta poderia significar ou a redução da resposta nociceptiva dos animais

decorrente da redução da sensibilidade (ausência de nocicepção) ou uma redução

da resposta devido a uma dessensibilização das vias nociceptivas decorrente de

uma estimulação excessiva (resposta conhecida como freezing).

Nossos resultados demonstraram que os animais operados apresentam uma

resposta reduzida frente à injeção i.pl. de bradicinina (agonista B2) quando

comparados aos animais falso-operados. Porém, esta resposta se altera quando a

concentração da bradicinina é reduzida, ocorrendo o mesmo quadro presente nos

experimentos realizados com a formalina. Estes dados nos levam a sugerir que as

alterações presentes nos experimentos realizados com a formalina possam, pelo

menos em parte, ser decorrentes de alterações na expressão de receptores B2 para

cininas. Acredita-se que estes possam sofrer dessensibilização e internalização,

reduzindo a resposta nociceptiva frente ao estímulo.

Estes dados em conjunto nos leva a concluir que a APB é capaz de causar

uma alteração nas vias nociceptivas, porém distintas no que se refere aos

hemisférios corporais e tempo de duração do processo neuropático. Acredita-se que

estas alterações envolvam um componente inflamatório, que levam ao aumento da

resposta nociceptiva e até mesmo a supressão da resposta por hiper-estimulação

dos terminais sensoriais. Estudos adicionais são necessários para que estes

mecanismos de controle da nocicepção sejam mais definidos, podendo colaborar na

busca de estratégias seguras e eficazes no controle da dor neuropática.

61

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