Biodiversidad de actinomicetos aislados de plantas

Biodiversidad de actinomicetos aislados de plantas depuradoras de aguas

residuales. Estudio de la capacidad de biodegradación de compuestos tóxicos

Albert Soler Hernández

Universitat Politècnica de València

Departamento de Biotecnología

Tesis Doctoral

BIODIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS AISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DE BIODEGRADACIÓN

DE COMPUESTOS TÓXICOS

Memoria presentada por Albert Soler Hernández para optar al grado de Doctor por la Universitat Politècnica de València

Directores Gonzalo Cuesta Amat

José Luis Alonso Molina

Valencia, Febrero 2012

Esta editorial es miembro de la UNE, lo que garantiza la difusión y comercialización de sus publicaciones a nivel nacional e internacional.

© Albert Soler Hernández, 2012

Primera edición, 2012

© de la presente edición: Editorial Universitat Politècnica de València www.editorial.upv.es ISBN: 978-84-8363-840-8 (versión impresa) Ref. editorial: 5530 (versión impresa) 5531 (versión electrónica) Queda prohibida la reproducción, distribución, comercialización, transformación, y en general, cualquier otra forma de explotación, por cualquier procedimiento, de todo o parte de los contenidos de esta obra sin autorización expresa y por escrito de sus autores.

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO

NATURAL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

ÁREA DE MICROBIOLOGÍA D. Gonzalo Cuesta Amat, Profesor Contratado Doctor perteneciente al Departamento de Biotecnología (Área de Microbiología) de la Universitat Politècnica de València y D. José Luis Alonso Molina, Responsable del Grupo de Química y Microbiología del Agua perteneciente al Instituto de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente de la Universitat Politècnica de València, CERTIFICAN: Que la tesis doctoral titulada “BIODIVERSIDAD DE ACTINOMICETOS AISLADOS DE PLANTAS DEPURADORAS DE AGUAS RESIDUALES. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DE BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS TÓXICOS”, que presenta D. Albert Soler Hernández para optar al grado de Doctor por la Universitat Politècnica de València, ha sido realizada bajo su dirección y reúne los requisitos adecuados para ser presentada como tesis doctoral ante el tribunal correspondiente para su lectura y defensa. Y para que conste a los efectos oportunos, firman el presente certificado,

Valencia, 23 de Enero de 2012 Fdo.: D. Gonzalo Cuesta Amat Fdo.: D. José Luis Alonso Molina

A mi madre, a Luis y a mi padre

Agradecimientos

Al finalizar un trabajo tan arduo y lleno de dificultades, como el desarrollo de esta Tesis Doctoral,

es inevitable que te asalte un muy humano egocentrismo que te lleva a concentrar la mayor parte

del mérito en la tarea que has realizado. Sin embargo, el análisis objetivo te muestra

inmediatamente que la magnitud de ese aporte hubiese sido imposible sin la participación de

muchas personas que han facilitado las cosas para que este trabajo llegue a un feliz término. Por

ello, es para mí un verdadero placer utilizar este espacio para ser justo y consecuente con ellas,

expresándoles mis agradecimientos. Como se suele decir, es de bien nacido el ser agradecido.

A mi madre y a Luis por su apoyo, colaboración y cariño. No solamente en la realización de este

trabajo ya que son muchos los malos momentos que hemos vivido pero que, por suerte, ya han

pasado y nos han hecho más fuertes.

A mi padre que, pese a no estar a mi lado físicamente, me ha alentado en todo momento a

continuar con mis estudios y metas. Sus sabios consejos han hecho que, en momentos de

flaqueza, aprenda a tomarme las cosas con filosofía y entereza.

Gracias a mis directores, Gonzalo y José Luis. El apoyo y confianza en mi trabajo y su capacidad

para guiar mis ideas ha sido un aporte valioso, no solamente en el desarrollo de esta tesis, sino

también en mi formación como investigador. Les agradezco también el haberme facilitado

siempre los medios suficientes para llevar a cabo todas las actividades propuestas durante el

desarrollo de este trabajo. Una mención especial para Gonzalo que, pese a los malos momentos

por los que ha pasado, siempre ha estado ahí. Ánimo Gon, ya queda menos!!!!!

Un fuerte abrazo a todas las personas que forman parte, de una manera o de otra, del

laboratorio de Microbiología de la Escuela de Agrónomos: Mª Antonia, Mª Ángeles, Manolo, Ana

J., Yolanda, Javier, Salut, Rafa, Ana G., Rosa y Nancy. Mi cariño también para mis compañeros

de laboratorio: Paula, Jorge, Claudia, Javi y tantos otros. Sin vuestra ayuda esto tampoco

hubiera sido posible.

A todos mis amigos, en especial a los del Bajo, los de la facultad, los del máster y los de

Agustinos. A todos aquellos que han pasado por mi vida y me han aportado muchas alegrías y,

sobretodo, su amistad. Gracias, de corazón.

Por supuesto a mi familia que siempre me ha apoyado en todas las decisiones tomadas. Muchas

gracias a mis padres y a Luis.

A Carolina, con la que tengo por delante el mayor proyecto de mi vida. Gracias por todos esos

momentos que hemos vivido, tu paciencia, tus consejos, tus ánimos.....

Gracias a todos

“La suerte favorece a la mente preparada”

Louis Pasteur (1822 - 1895)

ÍNDICES Y RESÚMENES

Índice

I

INTRODUCCIÓN..................................................................................................................... 1

1.- Diversidad microbiana......................................................................................................... 3

2.- Phylum Actinobacteria........................................................................................................ 6

2.1.- Orden Actinomycetales............................................................................................... 7

2.1.1. Suborden Corynebacterineae.............................................................................. 10

2.1.1.1.- Familia Corynebacterineae......................................................................... 10

2.1.1.1.1.- Género Corynebacterium.................................................................... 11

2.1.1.2.- Familia Dietziaceae..................................................................................... 11

2.1.1.2.1.- Género Dietzia.................................................................................... 11

2.1.1.3.- Familia Mycobacteriaceae.......................................................................... 12

2.1.1.3.1.- Género Amycolicicoccus..................................................................... 12

2.1.1.3.2.- Género Mycobacterium....................................................................... 12

2.1.1.4.- Familia Nocardiaceae................................................................................. 13

2.1.1.4.1.- Género Gordonia................................................................................ 13

2.1.1.4.2.- Género Millisia.................................................................................... 14

2.1.1.4.3.- Género Nocardia................................................................................. 15

2.1.1.4.4.- Género Rhodococcus......................................................................... 16

2.1.1.4.5.- Género Skermania.............................................................................. 16

2.1.1.4.6.- Género Williamsia............................................................................... 17

2.1.1.5.- Familia Segniliparaceae.............................................................................. 17

2.1.1.5.1.- Género Segniliparus........................................................................... 17

2.1.1.6.- Familia Tsukamurellaceae.......................................................................... 18

2.1.1.6.1.- Género Tsukamurella.......................................................................... 18

2.1.2.- Suborden Pseudonocardineae............................................................................ 18

2.1.2.1.- Familia Pseudonocardiaceae...................................................................... 18

2.1.2.1.1.- Género Pseudonocardia..................................................................... 19

2.1.3.- Suborden Micrococcineae................................................................................... 19

2.1.3.1.- Familia Microbacteriaceae.......................................................................... 19

2.1.3.1.1.- Género Microbacterium....................................................................... 19

3.- Detección e identificación de actinomicetos nocardioformes en fangos activos................. 20

3.1.- Aislamiento y recuento................................................................................................ 20

3.2.- Identificación y caracterización................................................................................... 21

Índice

II

3.2.1.- Métodos clásicos................................................................................................. 21

3.2.1.1.- Caracteres morfológicos............................................................................. 21

3.2.1.2.- Quimiotaxonomía........................................................................................ 22

3.2.2.- Métodos genotípicos........................................................................................... 24

3.2.2.1.- Análisis de las secuencias del 16S rDNA................................................... 25

3.2.2.2.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)............................................. 27

3.2.3.- Métodos fenotípicos............................................................................................ 29

4.- Aguas residuales................................................................................................................. 30

4.1.- Depuración aguas residuales...................................................................................... 32

4.1.1.- Antecedentes...................................................................................................... 32

4.1.2.- Clasificación de los métodos de tratamiento de aguas residuales..................... 32

4.2.- Aguas residuales urbanas........................................................................................... 36

4.3.- Aguas residuales en la industria petroquímica........................................................... 37

4.4.- Sistema de fangos activos.......................................................................................... 40

4.4.1.- El flóculo.............................................................................................................. 40

4.4.2.- Composición de la microbiota............................................................................. 41

4.4.3.- Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos...................... 42

4.4.3.1.- Tasa de crecimiento.................................................................................... 42

4.4.3.2.- Tolerancia a factores abióticos y toxinas.................................................... 42

4.4.3.3.- Capacidad para contribuir a la formación del flóculos................................ 43

4.5.- Problemas producidos por microorganismos en sistemas de fangos activos............. 43

4.5.1.- Aumento del volumen de los sólidos sedimentables o “Bulking”........................ 43

4.5.2.- Formación de espumas biológicas o “Foaming”................................................. 43

4.5.3.- Microorganismos productores de espumas........................................................ 46

4.5.4.- Principales factores que influyen en la formación de espumas.......................... 49

4.5.4.1.- Burbujas de aire.......................................................................................... 49

4.5.4.2.- Partículas hidrofóbicas................................................................................ 50

4.5.4.3.- Tensoactivos.............................................................................................. 51

4.5.5.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de

espumas.................................................................................................................................... 51

4.5.5.1.- Requisitos nutricionales............................................................................... 51

4.5.5.2.- Requisitos de oxígeno................................................................................. 52

4.5.5.3.- Temperatura................................................................................................ 52

Índice

III

4.5.5.4.- pH................................................................................................................ 53

4.5.6.- Métodos de control.............................................................................................. 53

4.5.6.1- Manipulación de la edad del fango............................................................... 53

4.5.6.2.- Cloración...................................................................................................... 53

4.5.6.3.- Empleo de selectores.................................................................................. 54

4.5.6.4.- Eliminación física......................................................................................... 54

4.5.6.5.- Otros métodos............................................................................................. 54

4.6.- Identificación de microorganismos filamentosos en fangos activos............................ 55

4.6.1.- Método clásico de identificación de microorganismos filamentosos.................... 55

5.- Biodegradación.................................................................................................................... 57

5.1.- Antecedentes............................................................................................................... 57

5.2.- Contaminación por hidrocarburos................................................................................ 58

5.2.1.- Composición del crudo del petróleo..................................................................... 59

5.2.1.1.- Hidrocarburos monoaromáticos................................................................... 61

5.2.1.2.- Hidrocarburos poliaromáticos...................................................................... 61

5.2.2.- Fuentes de contaminación................................................................................... 62

5.3.- Biorremediación........................................................................................................... 63

5.3.1.- Factores condicionantes de la biorremediación microbiana................................ 65

5.3.1.1.- Nutrientes..................................................................................................... 66

5.3.1.2.- Variables ambientales.................................................................................. 66

5.3.1.2.1.- Oxígeno............................................................................................... 67

5.3.1.2.2.- Salinidad.............................................................................................. 67

5.3.1.2.3.- Temperatura........................................................................................ 68

5.3.1.2.4.- pH........................................................................................................ 68

5.3.1.2.5.- Concentración de sustancias contaminantes...................................... 69

5.3.1.3.- Características del producto petrolífero....................................................... 69

5.3.1.4.- Factores relacionados con los microorganismos......................................... 69

5.3.2.- Microorganismos degradadores.......................................................................... 70

5.4.- Biodegradación de fenol y naftaleno............................................................................ 74

5.4.1.- Fenol.................................................................................................................... 74

5.4.2.- Naftaleno.............................................................................................................. 76

5.5.- Gen de la catecol 1,2-dioxigenasa............................................................................... 78

Índice

IV

OBJETIVOS.............................................................................................................................. 81

MATERIAL Y MÉTODOS......................................................................................................... 85

1.- Cepas bacterianas de referencia......................................................................................... 87

2.- Caracterización de muestras de fangos activos.................................................................. 88

2.1.- Toma de muestras y aislamiento................................................................................. 88

2.2.- Caracterización fenotípica basada en características morfológicas............................ 90

2.3.- Caracterización quimiotaxonómica.............................................................................. 90

2.3.1.- Extracción y análisis de ácidos micólicos............................................................ 91

2.3.1.1.- Materiales.................................................................................................... 91

2.3.1.2.- Metodología................................................................................................. 91

2.3.2.- Determinación de los isómeros del ácido diaminopimélico (DAP)....................... 92

2.3.2.1.- Materiales.................................................................................................... 92

2.3.2.2.- Metodología................................................................................................. 92

2.3.3.- Extracción y análisis de los azúcares predominantes de la pared celular........... 93

2.3.3.1.- Materiales.................................................................................................... 93

2.3.3.2.- Metodología................................................................................................. 94

2.4.- Caracterización genotípica.......................................................................................... 95

2.4.1.- Extracción de DNA. Protocolo del CTAB............................................................. 95

2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa......................................................................... 96

2.4.3.- Amplificación por PCR......................................................................................... 97

2.4.4.- Purificación del DNA............................................................................................ 97

2.4.5.- Obtención y análisis de las secuencias del 16S rDNA........................................ 98

2.4.6.- Árboles filogenéticos............................................................................................ 98

2.4.7.- Matrices de similaridad........................................................................................ 99

2.5.- Caracterización fenotípica basada en características metabólicas............................. 99

2.5.1.- Crecimiento a diferentes temperaturas................................................................ 99

2.5.2.- Pigmentación de colonias.................................................................................... 100

2.5.3.- Actividades metabólicas...................................................................................... 100

2.5.3.1.- Esculina....................................................................................................... 100

2.5.3.2.- L-Tirosina..................................................................................................... 100

2.5.3.3.- Nitratos......................................................................................................... 100

Índice

V

2.5.3.4.- Urea............................................................................................................. 101

2.5.4.- Uso de fuentes de carbono (1%): azúcares......................................................... 101

2.5.4.1.- D+Lactosa.................................................................................................... 101

2.5.4.2.- D+Maltosa.................................................................................................... 101

2.5.4.3.- D-Arabinosa................................................................................................. 101

2.5.4.4.- D+Fructosa.................................................................................................. 102

2.5.4.5.- D-Galactosa................................................................................................. 102

2.5.4.6.- D-Glucosa.................................................................................................... 102

2.5.4.7.- D-Manitol...................................................................................................... 102

2.5.4.8.- meso-inositol................................................................................................ 103

2.5.5.- Uso de fuentes de carbono y nitrógeno (0.1%): aminoácidos............................. 103

2.5.5.1.- L-Alanina...................................................................................................... 103

2.5.5.2.- L-Histidina.................................................................................................... 103

2.5.5.3.- L-Prolina....................................................................................................... 103

3.- Biodegradación de compuestos derivados del petróleo...................................................... 104

3.1.- Ensayos biodegradación.............................................................................................. 104

3.2.- Detección molecular del gen catecol 1,2-dioxigenasa................................................. 105

3.2.1.- Purificación del DNA............................................................................................ 106

3.2.2.- Obtención y análisis de las secuencias del gen catA.......................................... 106

RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................................. 109

1.- Caracterización de muestras de fangos activos.................................................................. 111

1.1.- Aislamiento.................................................................................................................. 111

1.2.- Caracterización fenotípica basada en características morfológicas............................ 112

1.3.- Caracterización quimiotaxonómica.............................................................................. 114

1.4.- Caracterización genotípica.......................................................................................... 120

1.4.1.- Árboles filogenéticos y matrices de similaridad.................................................. 121

1.4.1.1.- Género Corynebacterium............................................................................. 127

1.4.1.2.- Género Dietzia............................................................................................. 129

1.4.1.3.- Género Gordonia......................................................................................... 131

1.4.1.4.- Género Microbacterium............................................................................... 138

1.4.1.5.- Género Mycobacterium................................................................................ 139

Índice

VI

1.4.1.6.- Género Pseudonocardia.............................................................................. 141

1.4.1.7.- Género Rhodococcus.................................................................................. 143

1.4.1.8.- Género Tsukamurella.................................................................................. 145

1.4.1.9.- Género Williamsia........................................................................................ 146

1.5.- Caracterización fenotípica basada en características metabólicas............................. 148

1.5.1.- Género Corynebacterium.................................................................................... 149

1.5.2.- Género Dietzia.................................................................................................... 150

1.5.3.- Género Gordonia................................................................................................ 151

1.5.4.- Género Microbacterium...................................................................................... 156

1.5.5.- Género Mycobacterium....................................................................................... 156

1.5.6.- Género Pseudonocardia..................................................................................... 158

1.5.7.- Género Rhodococcus......................................................................................... 160

1.5.8.- Género Tsukamurella......................................................................................... 161

1.5.9.- Género Williamsia............................................................................................... 163

2.- Biodegradación de compuestos derivados del petróleo...................................................... 164

2.1.- Ensayos de biodegradación......................................................................................... 164

2.2.- Detección molecular del gen catecol 1,2-dioxigenasa................................................. 169

2.2.1.- Género Corynebacterium.................................................................................... 171

2.2.2.- Género Dietzia.................................................................................................... 171

2.2.3.- Género Gordonia................................................................................................ 171

2.2.4.- Género Microbacterium...................................................................................... 173

2.2.5.- Género Mycobacterium....................................................................................... 173

2.2.6.- Género Pseudonocardia..................................................................................... 173

2.2.7.- Género Rhodococcus......................................................................................... 173

2.2.8.- Género Tsukamurella......................................................................................... 174

2.2.9.- Género Williamsia............................................................................................... 174

2.2.10.- Obtención y análisis de las secuencias del gen catA....................................... 174

3.- Consideraciones finales....................................................................................................... 176

CONCLUSIONES..................................................................................................................... 183

PROPUESTA DE NUEVA ESPECIE........................................................................................ 187

1.- Pseudonocardia hispalensis................................................................................................ 189

Índice

VII

BIBLIOGRAFÍA........................................................................................................................ 191

ANEXOS................................................................................................................................... 215

Anexo 1: Medios de cultivo empleados................................................................................ 217

Anexo 2: Soluciones, reactivos y material de identificación para PCR................................ 220

Anexo 3: Términos y Abreviaturas empleadas.................................................................... 221

Anexo 4: Árbol filogenético completo género Corynebacterium.......................................... 223

Anexo 5: Árbol filogenético completo género Dietzia........................................................... 225

Anexo 6: Árbol filogenético completo género Gordonia....................................................... 227

Anexo 7: Árbol filogenético completo género Microbacterium............................................. 229

Anexo 8: Árbol filogenético completo género Mycobacterium............................................. 231

Anexo 9: Árbol filogenético completo género Pseudonocardia............................................ 233

Anexo 10: Árbol filogenético completo género Rhodococcus.............................................. 235

Anexo 11: Árbol filogenético completo género Tsukamurella.............................................. 237

Anexo 12: Árbol filogenético completo género Williamsia................................................... 239

Índice de tablas

VIII

INTRODUCCIÓN

Tabla 1: Especies descritas y estimadas de los diferentes grupos de microorganismos......... 6

Tabla 2: Clasificación jerárquica del suborden Corynebacterineae basada en las

secuencias de DNA y RNA ribosómico 16S.............................................................................. 10

Tabla 3: Tipos de pared celular según sus constituyentes mayoritarios.................................. 22

Tabla 4: Tipos de pared celular y tipos glucídicos de los actinomicetos aerobios con meso-

DAP........................................................................................................................................... 23

Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: causas y efectos............. 44

Tabla 6: Composición de las fracciones químicas contenidas en un crudo de petróleo.......... 60

MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla 7: Microorganismos de referencia utilizados................................................................... 87

Tabla 8: Aislados obtenidos...................................................................................................... 89

Tabla 9: Ciclos de la reacción de amplificación de la PCR para el gen 16S rDNA.................. 97

Tabla 10: Ciclos de la PCR para el gen catecol 1,2-dioxigenasa............................................. 106

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 11: Descripción macroscópica de los aislados............................................................... 112

Tabla 12: Descripción microscópica de los aislados................................................................ 113

Tabla 13: Resultados pruebas quimiotaxonómicas.................................................................. 115

Tabla 14: Identificación obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S

rDNA.......................................................................................................................................... 123

Tabla 15: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA diferenciado por géneros.......................... 126

Tabla 16: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Gordonia amarae.................... 132

Tabla 17: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Gordonia hirsuta..................... 133

Tabla 18: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Gordonia jacobaea y

Gordonia sputi........................................................................................................................... 134

Tabla 19: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Gordonia malaquae................ 135

Tabla 20: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Tsukamurella pseudospumae

y Tsukamurella sunchonensis................................................................................................... 145

Tabla 21: Resultados fenotípicos para el género Corynebacterium (I)..................................... 149

Índice de tablas

IX

Tabla 22: Resultados fenotípicos para el género Corynebacterium (II).................................... 150

Tabla 23: Resultados fenotípicos para el género Corynebacterium (III)................................... 150

Tabla 24: Resultados fenotípicos para el género Dietzia (I)..................................................... 150

Tabla 25: Resultados fenotípicos para el género Dietzia (II).................................................... 151

Tabla 26: Resultados fenotípicos para el género Dietzia (III)................................................... 151

Tabla 27: Resultados fenotípicos para el género Gordonia (I)................................................. 152

Tabla 28: Resultados fenotípicos para el género Gordonia (II)................................................ 153

Tabla 29: Resultados fenotípicos para el género Gordonia (III)............................................... 154

Tabla 30: Resultados fenotípicos para el género Microbacterium (I)....................................... 156

Tabla 31: Resultados fenotípicos para el género Microbacterium (II)...................................... 156

Tabla 32: Resultados fenotípicos para el género Microbacterium (III)..................................... 156

Tabla 33: Resultados fenotípicos para el género Mycobacterium (I)........................................ 157

Tabla 34: Resultados fenotípicos para el género Mycobacterium (II)....................................... 158

Tabla 35: Resultados fenotípicos para el género Mycobacterium (III)...................................... 158

Tabla 36: Características de crecimiento aislado PA.3 vs. P. asaccharolytica........................ 159

Tabla 37: Perfil ácidos grasos aislado PA.3 vs. P. asaccharolytica.......................................... 159

Tabla 38: Tests fenotípicos diferenciadores entre aislado PA.3 y P. asaccharolytica.............. 160

Tabla 39: Resultados fenotípicos para el género Rhodococcus (I).......................................... 161

Tabla 40: Resultados fenotípicos para el género Rhodococcus (II)......................................... 161

Tabla 41: Resultados fenotípicos para el género Rhodococcus (III)........................................ 161

Tabla 42: Resultados fenotípicos para el género Tsukamurella (I).......................................... 162

Tabla 43: Resultados fenotípicos para el género Tsukamurella (II)......................................... 162

Tabla 44: Resultados fenotípicos para el género Tsukamurella (III)........................................ 163

Tabla 45: Resultados fenotípicos para el género Williamsia (I)................................................ 163

Tabla 46: Resultados fenotípicos para el género Williamsia (II)............................................... 163

Tabla 47: Resultados fenotípicos para el género Williamsia (III).............................................. 163

Tabla 48: Resultados ensayos biodegradación a los 21 días de incubación........................... 165

Tabla 49: Resultados PCR catecol 1,2-dioxigenasa................................................................. 170

Tabla 50: Resultados BLAST catecol 1,2-dioxigenasa............................................................. 175

Índice de figuras

X

INTRODUCCIÓN

Figura 1: Relación intraclase del phylum Actinobacteria, basada en la comparación de las

secuencias del 16S rDNA/rRNA................................................................................................ 8

Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata..................... 24

Figura 3: Vista esquemática de los componentes celulares y técnicas usadas........................ 25

Figura 4: Resolución taxonómica de las técnicas utilizadas..................................................... 26

Figura 5: Esquema general del proceso................................................................................... 39

Figura 6: Problema real de espumas en depuradora................................................................ 45

Figura 7: Factores condicionantes en la biorremediación microbiana...................................... 65

Figura 8: Rutas metabólicas para la degradación del fenol...................................................... 76

Figura 9: Ruta metabólica para la degradación del naftaleno................................................... 77

Figura 10: Degradación del catecol mediante la escisión orto del anillo aromático.................. 79


Figura 11: Placa aislado CQG-5a............................................................................................. 111

Figura 12: Placa aislado PA.3................................................................................................... 111

Figura 13: Placa aislado P175.................................................................................................. 111

Figura 14: Rhodococcus ruber (54B)........................................................................................ 114

Figura 15: Mycobacterium smegmatis (PB.6)........................................................................... 114

Figura 16: Gordonia paraffinivorans (C2.2)............................................................................... 114

Figura 17: Cromatoplaca de ácidos micólicos de los aislados QB8.2, D1.1, QB7.2, P2.3,

P1.1, N1, N4, N5, N9-1 y 8V. Gordonia amarae (CECT 5704) (1) y Streptomyces albus

(CECT 3051) (2)......................................................................................................................... 118

Figura 18: Cromatoplaca de ácidos micólicos de los aislados D3.2, PA.2, 54B, P135, RG-

4b, Ca20.2 y PA.3. Gordonia amarae (CECT 5704) (1) y Streptomyces albus (CECT 3051)

(2)............................................................................................................................................... 118

Figura 19: Cromatoplaca de isómeros del DAP de los aislados P26, J4.1, CS7.1, R1, P54,

C4.1, C5.5a, D2.3, QB2.2 y CS1.1. En los extremos (1 y 2) se observan los patrones de las

formas L-DAP y meso-DAP........................................................................................................ 119

Figura 20: Cromatoplaca de los azúcares predominantes de los aislados QB8.1, P39,

CS20.4, D9.1, L2 y CS32.1. En los extremos (1, 2, 3 y 4) se observan los patrones de

arabinosa y galactosa................................................................................................................ 119

Índice de figuras

XI

Figura 21: Comprobación extracción DNA. 1: CQG5.a; 2: L10; 3: CS25.1; 4: D7.1; 5:

CS27.2; 6: CS32.3; 7: PB.7; 8: PA.3.......................................................................................... 120

Figura 22: Gel de PCR con los productos de amplificación del 16S rDNA.1 y 16: Marcador

de peso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: P26; 4: QB17.2; 5: P1.2; 6:D1.1; 7: CS5.1; 8:

Ca10.1; 9: RG4b; 10: C2.1; 11: C5.6; 12: C4.5; 13: 54B; 14: CS20.1; 15: N16-9....................

121

Figura 23: Comparación de la similaridad de las secuencias del gen 16S rDNA y los valores

de hibridación DNA:DNA............................................................................................................ 126

Figura 24: Árbol filogenético parcial del género Corynebacterium basado en la comparación

de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del

género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de bootstrap significativos basados

en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido..................................... 128

Figura 25: Árbol filogenético parcial del género Dietzia basado en la comparación de

secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género.

Los porcentajes en los nudos indican los niveles de bootstrap significativos basados en

1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.......................................... 130

Figura 26: Árbol filogenético parcial (I) del género Gordonia basado en la comparación de




Figura 27: Árbol filogenético parcial (II) del género Gordonia basado en la comparación de




Figura 28: Árbol filogenético parcial del género Microbacterium basado en la comparación




Figura 29: Árbol filogenético parcial del género Mycobacterium basado en la comparación



en 1000 réplicas. Escala: 0.02 sustituciones por posición de nucleótido................................... 140

Índice de figuras

XII

Figura 30: Árbol filogenético parcial del género Pseudonocardia basado en la comparación




Figura 31: Árbol filogenético parcial del género Rhodococcus basado en la comparación de



1000 réplicas. Escala: 0.02 sustituciones por posición de nucleótido........................................ 144

Figura 32: Árbol filogenético parcial del género Tsukamurella basado en la comparación de




Figura 33: Árbol filogenético parcial del género Williamsia basado en la comparación de




Figura 34: control positivo glucosa medio MSM (A) y aislado 54B en medio MSM

suplementado con fenol (B)....................................................................................................... 168

Figura 35: control positivo glucosa medio M9 (A) y aislado C5.5a en medio M9

suplementado con fenol (B)....................................................................................................... 168

Figura 36: Gel de PCR con los productos de amplificación del gen catecol 1,2-dioxigenasa.

1: Marcador de peso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: Control negativo; 4: Control positivo;

5: PB.1; 6:P39; 7: Ca27.1; 8: 54B; 9: QB7.1; 10: CS6.1........................................................... 169

Resumen

Actualmente, el tratamiento de las aguas residuales, tanto urbanas como industriales, se

centra principalmente en la reducción de la demanda biológica de oxígeno y, en ocasiones, en la

eliminación de nutrientes, tales como nitrógeno y fósforo, sin prestar demasiada atención a los

microorganismos que realizan la depuración ni en los que interfieren en el proceso.

En estos ambientes se encuentra una gran diversidad de microorganismos que han sido

estudiados con poco detalle y que podrían proporcionar soluciones prácticas y reales a los

problemas que pudieran ocasionar al proceso de depuración de aguas y, además, proporcionar

aplicaciones biotecnológicas importantes como puede ser la eliminación de compuestos

recalcitrantes o tóxicos en diferentes ambientes contaminados. Es por ello que los estudios de

biodiversidad bacteriana en estos ambientes mejorarían sustancialmente la eficacia del proceso

de depuración de aguas y por lo tanto el medio ambiente, favoreciendo un crecimiento sostenible

que repercutiría positivamente en el bienestar de la sociedad.

En base a lo anteriormente expuesto, en este trabajo se planteó realizar un estudio de

biodiversidad de actinomicetos aislados de diferentes estaciones depuradoras de aguas

residuales (EDAR) y conocer qué tipo de especies estaban implicadas en los procesos de

formación de espumas así como en la degradación de compuestos tóxicos.

Se estudiaron un total de 28 EDAR de diferentes localidades, la gran mayoría de ellas

con frecuentes episodios de formación de espumas biológicas. Se procedió, en primer lugar, al

aislamiento en placa en tres medios de cultivo distintos con el objeto de obtener la máxima

biodiversidad posible. En total se obtuvieron 152 aislados con morfología típica de actinomiceto

nocardioforme. Estos aislados se caracterizaron, en primer lugar, mediante observación

morfológica, tinción Gram y detección de ácidos micólicos para comprobar que pertenecían al

suborden Corynebacterineae. Posteriormente se realizó la detección del isómero del ácido

diaminopimélico así como el azúcar predominante en la pared celular. Todos los aislados,

excepto cinco, contienen ácidos micólicos, meso-diaminopimélico y arabinosa y galactosa como

azucares predominantes, por lo tanto pertenecen al suborden Corynebacterineae.

Para identificar los aislados a nivel de especie se realizó el análisis de las secuencias del

16S rDNA. Se amplificó el gen 16S con iniciadores universales, se secuenció y se elaboraron

árboles filogenéticos con su correspondiente matriz de similaridad nucleotídica. Los resultados

demuestran que el 66% de los aislados identificados pertenecen al género Gordonia, de los

Resumen

cuales solo el 22% pertenece a la especie G. amarae. El 11% de los aislados pertenece al

género Mycobacterium, el 10% al género Tsukamurella, el 6% al género Rhodococcus y el 6,5%

restante repartido entre los géneros Corynebacterium, Dietzia, Microbacterium, Pseudonocardia

y Williamsia. Para completar la identificación de los aislados mediante taxonomía polifásica se

realizaron una serie de tests fenotípicos para corroborar la identificación filogenética. En algunas

especies la identificación no es concluyente por lo que se puede pensar que se trata de especies

nuevas.

Una vez identificados los aislados, se realizaron estudios de biodegradación de dos

compuestos tóxicos derivados del petróleo, como son el fenol y el naftaleno. Para ello se

cultivaron las cepas en tres medios de cultivo minerales utilizando como única fuente de carbono

el fenol y el naftaleno por ser estas sustancias las que mayores problemas ocasionaban en las

depuradoras industriales. Finalmente, se realizó la puesta a punto de la técnica de PCR para la

detección del gen catecol 1,2-dioxigenasa y así determinar el potencial genético de

biodegradación de los microorganismos identificados.

El resultado indica que un 50% de cepas degradan, al menos, un compuesto tóxico. El

gen de la catecol 1,2-dioxigenasa se detectó en el 20% de los aislados.

La taxonomía polifásica se mostró como el método más fiable para la identificación a

nivel de especie de los microorganismos aislados en EDAR. Asimismo, se observó que existe

una gran diversidad de especies que no han sido frecuentemente encontradas en otras plantas

depuradoras y que un elevado porcentaje tenía la capacidad de degradar compuestos tóxicos

con lo que, además de permitir mejorar el proceso biológico en función de las bacterias

filamentosas encontradas y así mejorar la calidad del efluente, existe la capacidad de utilización

de esas bacterias degradadoras en otros ambientes contaminados y, por tanto, la mejora del

medio ambiente en general.

Resum

Actualment, el tractament de les aigües residuals, tant urbanes com industrials, es centra

principalment en la reducció de la demanda biològica d'oxigen i, en ocasions, en l'eliminació de

nutrients, tals com el nitrogen i fòsfor, sense prestar massa atenció als microorganismes que

realitzen la depuración ni en els que interfereixen en el procés.

En aquests ambients es troba una gran diversitat de microorganismes que han estat

estudiats amb poc detall i que podrien proporcionar solucions pràctiques i reals als problemes

que poguessin ocasionar al procés de depuració d'aigües i, a més, proporcionar aplicacions

biotecnològiques importants com pot ser l'eliminació de compostos reclacitrants o tòxics en

diferents ambients contaminats. És, per això, que els estudis de biodiversitat bacteriana en

aquests ambients millorarien substancialment l'eficàcia del procés de depuració d'aigües i per

tant el medi ambient, afavorint un creixement sostenible que repercutiria positivament en el

benestar de la societat.

Sobre la base de l'anteriorment exposat, en aquest treball es va plantejar realitzar un

estudi de biodiversitat dáctinomicets aïllats de diferents estacions depuradores d'aigües

residuals (EDAR) i conèixer què tipus d'espècies estaven implicades en els processos de

formació d'escumes així com en la degradació de compostos tòxics.

Es van estudiar un total de 28 EDAR de diferents localitats, la gran majoria d'elles amb

freqüents episodis de formació d'escumes biològiques. Es va procedir, en primer lloc, a

l'aïllament en placa en tres medis de cultiu diferents amb l'objecte d'obtenir la màxima

biodiversitat possible. En total es van obtenir 152 aïllats amb morfologia típica dáctinomicet

nocardioforme. Aquests aïllats es van caracteritzar, en primer lloc, mitjançant observació

morfològica, tinció Gram i detecció d'àcids micòlics per comprovar que pertanyienn al subordre

Corynebacterineae. Posteriorment es va realitzar la detecció de l'isòmer de l'àcid diaminopimèlic

així com el sucre predominant en la paret cel·lular. Tots els aïllats, excepte cinc, contenien àcids

micòlics, meso-diaminopimèlic i arabinosa i galactosa com sucres predominants, per tant

pertanyen al subordre Corynebacterineae.

Per identificar els aïllats a nivell d'espècie es va realitzar l'anàlisi de les seqüències del

16S rDNA. Es va amplificar el gen 16S amb iniciadors universals, es va seqüenciar i es van

elaborar arbres filogenètics amb la seva corresponent matriu de similitud nucleotídica. Els

resultats demostren que el 66% dels aïllats identificats pertanyen al gènere Gordonia, dels quals

Resum

solament el 22% pertany a l'espècie G. amarae. El 11% dels aïllats pertany al gènere

Mycobacterium, el 10% al gènere Tsukamurella, el 6% al gènere Rhodococcus i el 6,5% restant

repartit entre els gèneres Corynebacterium, Dietzia, Microbacterium, Pseudonocardia i

Williamsia. Per completar la identificació dels aïllats mitjançant taxonomia polifàsica es van

realitzar una sèrie de tests fenotípics per corroborar la identificació filogenètica. En algunes

espècies la identificació no és concloent pel que es pot pensar que es tracta d'espècies noves.

Una vegada identificats els aïllats, es van realitzar estudis de biodegradació de dos

compostos tòxics derivats del petroli, com són el fenol i el naftalé. Per això es van cultivar els

aïllats en tres medis de cultiu minerals utilitzant com a única font de carboni el fenol i el naftalé

per ser aquestes substàncies les que majors problemes ocasionaven en les depuradores

industrials. Finalment, es va realitzar la posada a punt de la tècnica de PCR per a la detecció del

gen catecol 1,2-dioxigenasa i així determinar el potencial genètic de biodegradació dels

microorganismes identificats.

El resultat indica que un 50% de aïllats degraden almenys un compost tòxic. El gen de la

catecol 1,2-dioxigenasa es va detectar en el 20% dels aïllats.

La taxonomia polifàsica es va mostrar com el mètode més fiable per a la identificació a

nivell d'espècie dels microorganismes aïllats en EDAR. Així mateix, es va observar que existeix

una gran diversitat d'espècies que no han estat freqüentment trobats en altres plantes

depuradores i que un elevat percentatge tenia la capacitat de degradar compostos tòxics amb el

que, a més de permetre millorar el procés biològic en funció dels bacteris filamentosos trobats i

així millorar la qualitat de l'efluent, existeix la capacitat d'utilització d'aquests bacteris

degradadors en altres ambients contaminats i, per tant, la millora del medi ambient en general.

Abstract

Currently, urban and industrial wastewater treatment plants (WWTP), are focused mainly

on the reduction of biological oxygen demand and sometimes on the removal of nutrients such as

nitrogen and phosphorus without paying too much attention neither the microorganisms that

perform the treatment nor the microorganisms that interfere in the process.

In these environments there is a large diversity of microorganisms that haven’t been

studied in detail and that could provide real and practical solutions to the problems that could be

caused by the wastewater treatment process. These microorganisms could also provide

important biotechnological applications such as the elimination of recalcitrant or toxic compounds

in different contaminated environments. That is why studies of bacterial biodiversity in these

environments would substantially improve the efficiency of water treatment process and therefore

the environment, promoting sustainable development that would have a positive impact on the

society’s welfare.

On the basis of the above, this work propounded a study of the biodiversity of

actinomycetes isolated from different wastewater treatment plants (WWTP) and the identification

of the species involved in the processes of foam formation and degradation of toxic compounds.

Twenty eight WWTP from different localities were studied, most of them with frequent

episodes of biological foaming. First of all, plate isolation in three different culture media was

carried out in order to obtain the maximum possible biodiversity. A total of 152 isolates were

obtained with typical morphology of nocardioform actinomycete. These isolates were

characterized, first, by morphological observation, Gram staining and mycolic acids detection to

verify they belong to the suborder Corynebacterineae. Then, detection of diaminopimelic acid

isomer and of the predominant sugar in cell wall was performed. All isolates, except five, contain

mycolic acids, meso-diaminopimelic and arabinose and galactose as predominant sugars,

therefore these isolates belong to the suborder Corynebacterineae.

To identify the isolates to species level, sequence analysis of 16S rDNA was performed.

16S gene was amplified with universal primers, sequenced and phylogenetic trees were

constructed with the corresponding nucleotide similarity matrix. The results show that 66% of the

identified isolates belong to the genus Gordonia, of which only 22% belong to the species G.

amarae. 11% of the isolates belong to the genus Mycobacterium, 10% to the genus

Tsukamurella, 6% to the genus Rhodococcus and the remaining 6.5% distributed among the

Abstract

genera Corynebacterium, Dietzia, Mycobacterium, Pseudonocardia and Williamsia. To complete

the identification of the isolates by the means of polyphasic taxonomy, a series of phenotypic

tests was conducted to corroborate the phylogenetic identification. In some species, the

identification is not conclusive, so may be considered they are new species.

Once the isolates were identified, studies of biodegradation of two toxic compounds from

petroleum, such as phenol and naphthalene, were carried out. For this purpose, strains were

grown in three mineral culture media, using as the sole carbon source phenol and naphthalene,

because these substances cause the worst problems in industrial water treatment plants. Finally,

PCR technique adjustment was conducted for the detection of catechol 1,2-dioxygenase gene

and so to determine the genetic potential of biodegradation of identified microorganisms.

The result indicates that 50% of strains degrade at least one of the toxic compounds. The

catechol 1.2-dioxygenase gene was detected in 20% of the isolates.

Polyphasic taxonomy was found to be the most reliable method for species level

identification of isolates from WWTP. It was also noted that there is a great diversity of species

that are not often found in other treatment plants and that a high percentage of the species had

the ability to degrade toxic compounds. In this way, besides the fact that the biological process

can be optimized depending on the filamentous bacteria found and the effluent quality can be

improved, these degrading bacteria can be used in contaminated environments to improve the

environment in general.

INTRODUCCIÓN

Introducción

3

1.- Diversidad microbiana

El término biodiversidad nos evoca frecuentemente la imagen de ecosistemas en los que

abundan especies vegetales y animales, como es el caso de las selvas tropicales. Sin embargo,

en nuestro planeta los organismos que presentan una mayor biodiversidad biológica y funcional

son los microorganismos (Oren, 2004; Schleifer, 2004; González Pastor, 2010).

El hecho de que exista una gran variedad de microorganismos y que muchos de ellos

hayan sido estudiados con poco detalle, abre la posibilidad de su estudio para su uso y beneficio

en algún aspecto de tipo industrial. En este sentido, los microorganismos pertenecientes a la

clase Actinobacteria (bacterias Gram positivas con un alto contenido en Guanina y Citosina)

genéricamente conocidos como actinomicetos, destacan por su capacidad para producir

importantes compuestos activos (Stackebrandt et al., 1997) y diversas aplicaciones

biotecnológicas (Bull et al., 2000).

El aprovechamiento de los recursos microbianos presentes en nuestros ecosistemas,

por ejemplo en las aguas residuales, permitiría profundizar en el estudio de microorganismos

capaces de producir diversos metabolitos, que pudieran ser empleados para la obtención de

algún bien o servicio en favor del ser humano, así como para estudiar de una forma precisa y

objetiva cualquier forma de vida existente en nuestro entorno.

El mundo viviente es uniforme, sobre todo, en la composición química en cuanto a la

presencia de las moléculas portadoras de la información genética (DNA y RNA) que, a su vez, es

transmitida a los descendientes. A partir de esta capacidad de multiplicación, los seres vivos se

diversifican, evolucionan y, con el tiempo, se adaptan a distintos ambientes y situaciones (Volcy,

2004).

Basándose en esto, caben al menos dos tipos de definición de la vida. La primera,

planteada por Lynn Margulis y la más generalizada, considera que la vida sobre la Tierra es

exclusivamente celular y, por lo tanto, como afirma Forterre (1999), “la forma de vida minima es

un sistema circunscrito en un compartimento semi-permeable y que produce sus propios

elementos constitutivos por la transformación de la energía y de los nutrientes”. Desde este

punto de vista, el metabolismo o autopoyesis es la esencia de la vida, lo cual implica capacidad

Introducción

4

para sintetizar proteínas, sincronizar las reacciones vitales, mantener su organización a nivel

molecular y estructural, y capacidad continua de auto-reparación. La segunda postura asocia la

vida a las moléculas con capacidad para autoreplicarse y dotadas de mecanismos de adaptación

y evolución. En este caso, la vida pudo haber aparecido bajo la forma de moléculas de RNA

capaces de multiplicarse (Margulis y Dolan, 2006).

El científico John Maynard Smith plantea que la evolución es la esencia de la vida

misma. A su modo de ver, “la vida es un equilibrio activo entre el organismo vivo y su medio” y si

este último se modifica excesivamente, se rompe, conduce a la muerte de los seres vivos y/o a la

supervivencia de algunos. Un ser vivo, en su concepto, es aquel que puede variar, que puede

multiplicarse y que puede evolucionar (Maynard y Eörs, 2001).

Maynard Smith considera diferentes tipos de adaptación que pueden darse por distintos

mecanismos. Se refiere en primer lugar a la adaptación genética, si el organismo posee los

caracteres que le permiten vivir en unas condiciones determinadas; una adaptación fisiológica

cuando es capaz de cambiar y reajustar su fisiología de acuerdo con los cambios externos, y

según la expresión del propio autor, una adaptación “desarrollatica” y flexible, cuando el

organismo, bajo unas nuevas condiciones, elabora estructuras aptas y especiales para su

supervivencia (Maynard y Eörs, 2001).

De este modo, la adaptación cataliza el proceso evolutivo, conduce a variantes

biológicas e intraespecificas y refleja así las diferencias genéticas. En cierta medida, la

adaptación es un proceso rítmico con una regularidad temporal y en una secuencia

predeterminada. Por otro lado, debido a que no es un proceso fiel, la adaptación conduce a la

innovación y asegura la perpetuación de la vida (Volcy, 2004).

Tradicionalmente, los microorganismos y organismos en general han sido catalogados

en procariontes y eucariontes basándose en la presencia o ausencia de membrana nuclear. Carl

Woese planteó, en la década de los 80, una propuesta radical con tres formas de vida: bacterias,

arqueobacterias y eucariontes. Estas tres formas de vida son representadas en un árbol

evolutivo que muestra la cercanía, el origen común y las relaciones filogenéticas entre las

arqueobacterias y los eucariontes, en contraposición con el punto de vista mas difundido, de la

supuesta afinidad entre las arqueobacterias y las eubacterias. Quiere decir que estas dos

Introducción

5

categorías son distintas entre sí y que la noción de procarionte (clasificación que engloba a

ambas categorías) como grupo monofilético carecería de justificación (Woese, 1987).

Dentro de estos grupos podemos incluir a la totalidad de especies conocidas hasta el

momento. Pero los aportes de biólogos, genetistas, ecólogos y fisiólogos hacen de la taxonomía

una disciplina dinámica, flexible y cambiante; contrariamente a la opinión generalizada, no podría

afirmarse una clasificación oficial para ningún grupo de organismos.

La cantidad o número de especies de los diferentes organismos, los nichos o hábitats

ecológicos que ocupan y su diversidad genética constituyen los tres pilares de la biodiversidad.

Estas tres áreas no están desligadas, se alimentan las unas de las otras, y en consecuencia, la

diversidad o riqueza de especies revela de modo implícito una diversidad genética heterogénea

de los organismos; al igual que la diversidad ecológica es una consecuencia de la diversidad de

especies (Volcy, 2004).

Independientemente de las diferencias entre tipos de microorganismos, esta respuesta

inesperada de crecimiento es el reflejo de su muy corto tiempo generacional y de la rapidez con

que se adaptan a las nuevas condiciones. Las bacterias, debido a su capacidad de adaptación,

incluso pueden adquirir genes de otras especies de bacterias cohabitantes recombinándolos y

adquiriendo así nuevas funciones (Volcy, 2004).

En los eucariotas, una especie es “cualquier grupo de organismos vivientes que

comparten un conjunto de características y que son capaces de aparearse en estado natural”; y

la especiación es “el proceso evolutivo que genera nuevas especies” que, al mantenerse

aisladas, se vuelven tan diferentes que ya no pueden cruzarse. Por lo pronto, se acepta esta

definición clásica de especie a pesar de su impracticabilidad en diversos grupos de

microorganismos, tales como los procariotas.

La unidad básica en taxonomía de procariotas se ajusta al concepto que denominamos

filo-fenético, y entiende una especie como una categoría que circunscribe a un grupo de cepas

de origen monofilético y que se muestran coherentes tanto desde el punto de vista genómico

como fenotípico, y que por ello se pueden distinguir de otros grupos semejantes (Roselló-Mora y

Amann, 2001).

Introducción

6

Basándonos en lo anteriormente expuesto, podríamos formularnos la siguiente pregunta,

¿cuántas formas de vida existen? o, al menos ¿cuántas de ellas conocemos?. En la tabla 1

podemos encontrar respuesta a esta pregunta.

Tabla 1: Especies descritas y estimadas de los diferentes grupos de microorganismos (Schleifer, 2004)

Grupo Especies descritas Especies estimadas Procariotas 5.000 > 1.000.000 Hongos 72.000 1.500.000 Algas 40.000 400.000

Protozoos 40.000 200.000

Las bacterias son los organismos con mayor capacidad metabólica pudiendo realizar

funciones propias de plantas, animales y hongos. La mayoría recicla los compuestos

hidrocarbonados, algunas fotosintetizan como las plantas, y otras descomponen diversos

compuestos como los hongos. Su capacidad de fermentación es prácticamente ilimitada, y por

otra parte, son los mayores productores de antibióticos (Volcy, 2004).

Por ello, a través de la biodiversidad microbiana, se puede conocer las aplicaciones de

los microorganismos en término de producción de antibióticos, control biológico, fuente de

alimentos y, en una palabra, aplicaciones para el bienestar de la sociedad (Bull et al., 2000).

Los microorganismos son ubicuos y, de estos, las bacterias son las más cosmopolitas.

La mayor cantidad de bacterias se halla en el suelo, pero se estima una mayor presencia todavía

en los fondos oceánicos.

2.- Phylum Actinobacteria

En la década de los años 90 se observó que las secciones del Volumen 4 del Bergey’s

Manual of Systematic Bacteriology (Williams et al., 1989) no coinciden con los datos de la

secuencia del 16S rDNA. Con el fin de corregir este problema se realizó una propuesta para una

nueva clasificación jerárquica basada en el estudio filogenético de las secuencias del 16S rDNA.

En 1997 se propone la clase Actinobacteria (Stackebrandt et al., 1997) compuesta por el orden

Actinomycetales y sus parientes filogenéticos con un alto contenido en G+C. La clase

Actinobacteria constituye uno de los principales phyla dentro del dominio Bacteria (Ludwig y

Introducción

7

Klenk, 2001). Esta clasificación adoptó 95 géneros, pertenecientes a 30 familias y 10

subórdenes.

La segunda edición del Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Boone et al., 2001)

recoge la clasificación actual, en la que la clase Actinobacteria se eleva al rango de Phylum.

Dentro del Phylum se reconoce una única clase, Actinobacteria, que mantiene la estructura

jerárquica propuesta por Stackebrandt et al., (1997). En el año 2006 Dworkin y sus

colaboradores adoptaron una nueva clasificación donde se incluían 6 órdenes, 39 familias y más

de 130 géneros. Actualmente (Figura 1), el phylum Actinobacteria cuenta con más de 215

géneros, englobados en 50 familias,13 subórdenes y 5 órdenes, siendo el más importante el

orden Actinomycetales, grupo conocido como actinomicetos (Zhi et al., 2009).

2.1.- Orden Actinomycetales

Los actinomicetos forman un grupo de microorganismos morfológicamente muy

heterogéneo, pertenecientes al dominio Bacteria, formado por bacterias generalmente aerobias,

Gram-positivas, con alto contenido en G+C. Muchos de ellos forman filamentos ramificados o

hifas y esporas asexuales. Su diversidad morfológica es considerable, desde formas bacilares

hasta formas filamentosas ramificadas. Dos de las propiedades más significativas de los

actinomicetos son su capacidad para desarrollarse sobre sustratos muy diversos que no pueden

ser usados por otros microorganismos, como la quitina y celulosa y su aptitud para sintetizar

numerosos metabolitos bioactivos. Estas propiedades ponen de manifiesto la riqueza destacable

del metabolismo celular de este grupo microbiano (Goodfellow et al., 1997).

El interés por los actinomicetos comenzó a raíz del descubrimiento de la capacidad de

estos microorganismos para producir antibióticos. Aunque la búsqueda de compuestos

bioactivos sigue en auge, el interés por los actinomicetos se ha diversificado y actualmente

ocupa áreas muy variadas. Pueden ser patógenos de plantas, de animales, de humanos,

descomponer productos del caucho o crecer en el combustible de los aviones. En las estaciones

depuradoras de aguas residuales causan espumas densas que llegan a obstruir las

instalaciones. Por la diversidad de hábitats que pueden colonizar este grupo de microorganismos

tiene un enorme interés ecológico (Dworkin et al., 2006).

Introducción

8

La primera clasificación formal se dio en el año 1943 por Waksman y Henrici, al

considerar dichos microorganismos como un puente evolutivo entre bacterias y hongos.

Transcurrieron varias décadas considerando a este grupo microscópico como parte del reino

Fungi debido a su similitud morfológica. Su nombre proviene del griego actis: rayo de sol y

mykes: hongo, por lo que dada su forma era fácil denominarlos “hongos radiados”.

El taxón incluye géneros con morfologías diferentes. Así podemos encontrar organismos

que forman micelio ramificado y bien diferenciado como es el caso del género Streptomyces,

otros poseen hifas que pueden fragmentar, como es el caso del género Nocardia o el género

Figura 1: Relación intraclase del phylum Actinobacteria, basada en la comparación de las secuencias del 16S rDNA/rRNA (Zhi et al., 2009)

Introducción

9

Rhodococcus; además varios géneros como Gordonia y Mycobacterium poseen formas

cocáceas o cocobacilares.

Los actinomicetos están presentes en todo tipo de suelos tanto en las capas más

superficiales como en horizontes profundos disminuyendo su concentración con la profundidad.

Suele ser el segundo grupo de microorganismos más abundante, después de las bacterias no

actinomicetos. Los actinomicetos utilizan como fuente de carbono compuestos simples y

complejos tales como ácidos orgánicos, azúcares, polisacáridos, lípidos, proteínas e

hidrocarburos alifáticos. Muchos pueden degradar proteínas, lípidos, almidón y quitina. Estos

microorganismos participan en muchos procesos, tales como la descomposición de los

compuestos más resistentes procedentes de plantas y animales, formación de humus,

fermentación del compost, causantes de fitopatologías, infecciones en animales y en humanos y

simbiosis con plantas.

Actualmente se cuenta con más de 10.000 productos aislados tan solo del orden de los

actinomicetales (Bull y Stach, 2007). Entre los metabolitos secundarios se encuentran

antibióticos, antitumorales, inmunosupresores y enzimas. Debido a la excelente trayectoria de las

actinobacterias en este campo, se han diseñado numerosas estrategias para el aislamiento de

estas a lo largo de la historia. La falta de accesibilidad a hábitats poco comunes como los que

constituyen los ecosistemas acuáticos, poco a poco se ha ido superando con los avances

tecnológicos (Fenical y Jensen. 2006).

Las aguas residuales, tanto urbanas como industriales, representan una gran fuente no

explotada de aislamiento de nuevos actinomicetos con elevado potencial de producción de

metabolitos secundarios activos. De ellos se conoce su producción de diversos compuestos con

un amplio rango de actividad biológica (Bredholt et al., 2008).

Debido a las distintas características existentes entre los hábitats terrestres y acuáticos,

se refleja, por tanto, una gran diversidad genética y metabólica (Lam, 2006).

Es precisamente debido al interés desde el punto de vista económico, que la búsqueda

de actinomicetos se ha reorientado hacia ambientes poco estudiados como sedimentos de ríos,

lagos, océanos e incluso desiertos (Maldonado et al., 2009; Okoro et al., 2009; Zhang et al.,

Introducción

10

2010), pues ofrecen la posibilidad de encontrar cepas nativas desconocidas que produzcan

nuevos metabolitos activos.

2.1.1.- Suborden Corynebacterineae

Dentro de este suborden están incluidos los actinomicetos caracterizados por la

presencia de ácidos micólicos, también llamados mycolata. En la tabla 2 se muestra la nueva

clasificación, propuesta para este suborden, formado por 6 familias: Corynebacteriaceae,

Dietziaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Segniliparaceae y Tsukamurellaceae (Zhi et al.,

2009). Los microorganismos pertenecientes al suborden Corynebacterineae son

mayoritariamente aerobios, contienen en la pared celular ácido meso-diaminopimélico y los

azúcares predominantes en la pared celular son la galactosa y la arabinosa (quimiotipo de pared

celular IV). Asimismo, poseen ácidos micólicos, son Gram positivos y catalasa positivos.

Tabla 2: Clasificación jerárquica del suborden Corynebacterineae basada en las secuencias de DNA y RNA ribosómico 16S (Zhi et al., 2009)

Suborden Familia Género

Corynebacteriaceae Corynebacterium

Dietziaceae Dietzia

Amycolicicoccus Mycobacteriaceae

Mycobacterium

Gordonia

Millisia

Nocardiaceae Nocardia

Rhodococcus

Skermania

Williamsia

Segniliparaceae Segniliparus

Corynebacterineae

Tsukamurellaceae Tsukamurella

2.1.1.1.- Familia Corynebacterineae

Es la familia tipo del suborden Corynebacterineae. Contiene un único género,

Corynebacterium (Zhi et al., 2009). Corynebacterium está incluido en el grupo 20 del Bergey´s

Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994).

Introducción

11

2.1.1.1.1.- Género Corynebacterium

El género Corynebacterium contiene bacilos rectos o levemente curvados, a menudo de

extremos afilados, cuyo tamaño oscila entre 2-6 µm de longitud y 0,5 µm de diámetro. Son

bacterias Gram positivas, catalasa positivas, no esporuladas, que carecen de motilidad, aerobias

y anaerobias facultativas. Su contenido en G+C expresado en mol% se encuentra entre el 51-

65%. Las corinebacterias poseen un quimiotipo de pared celular tipo IV, esto es, ácido meso-

diaminopimélico en el tetrapéptido de la mureína, arabinosa y galactosa como azúcares

predominantes en la pared celular y ácidos micólicos de 22-36 átomos de carbono (Collins y

Cummins, 1986). Actualmente se conocen 85 especies validadas de este género. La especie tipo

del género es Corynebacterium diphtheriae (Euzéby, 2011).

Corynebacterium es un género muy diverso que se encuentra en gran variedad de

ambientes y que contiene importantes especies patógenas humanas como C. diphteriae. Ciertos

saprófitos, como C. glutamicum, poseen una larga tradición como microorganismos industriales

en procesos de producción biotecnológica debido a la producción de aminoácidos y nucleótidos

(Theilleux, 2000). Aunque este género pertenece al grupo de los mycolata que, frecuentemente

ocasionan problemas en estaciones depuradoras con sistemas de fangos activos, hasta ahora

ninguna especie de Corynebacterium se ha visto implicada en estos problemas.

2.1.1.2.- Familia Dietziaceae

Solamente posee un único género, Dietzia (Rainey et al., 1995).

2.1.1.2.1.- Género Dietzia

Este género fue propuesto para organismos inicialmente conocidos como

Flavobacterium maris y después Rhodococcus maris (Nesterenko et al., 1982). Posteriormente

se reclasificó como Dietzia maris basándose en la secuencia del 16S rDNA (Rainey et al., 1995).

El género Dietzia está constituido por cocobacilos, Gram-positivos, catalasa positivos, aerobios y

no formadores de esporas. Posee un quimiotipo de pared celular IV. Contiene ácidos micólicos

de 34-38 átomos de carbono. Su contenido en G+C, expresado en mol%, es del 73% (Rainey et

al., 1995).

Introducción

12

Actualmente se conocen 12 especies validadas de este género, siendo la especie tipo

del género Dietzia maris (Euzéby, 2011). Se conoce un caso en el que Dietzia maris ha causado

infección nosocomial asociado a prótesis por lo que esta especie debería ser considerada como

un potencial patógeno oportunista (Pidoux et al., 2001).

2.1.1.3.- Familia Mycobacteriaceae

Contiene dos géneros, Mycobacterium y Amycolicicoccus (Euzéby, 2011).

2.1.1.3.1.- Género Amycolicicoccus

Este género ha sido descrito recientemente y solamente posee 1 especie,

Amycolicicoccus subflavus (Euzéby, 2011). Está compuesto por cocos sin flagelo, aerobios y

Gram positivos. La pared celular contiene arabinosa, galactosa, glucosa y xilosa como azúcares

predominantes. El contenido en G+C, expresado en mol%, es aproximadamente del 60%. El

rasgo predominante del género es que no posee ácidos micólicos (Wang et al., 2010).

2.1.1.3.2.- Género Mycobacterium

El género Mycobacterium está compuesto por bacilos ligeramente curvos o rectos. Son

aerobios y catalasa positivos. El quimiotipo de pared celular es IV y el contenido en G+C,

expresado en mol%, es del 62-70%. Sus paredes celulares son muy ricas en lípidos y contienen

ceras con ácidos micólicos de 60 a 90 átomos de carbono. La presencia de ácidos micólicos y de

otros lípidos por fuera de la capa de peptidoglicano hace que las micobacterias sean fuertemente

ácido-alcohol resistentes (Sneath et al., 1986). Actualmente se conocen 145 especies validadas

de este género, siendo la especie tipo del género Mycobacterium tuberculosis (Euzéby, 2011).

Las micobacterias suelen crecer muy lentamente y han de ser incubadas desde 2 hasta

40 días tras su inoculación en un medio complejo solidificado para formar colonias visibles. Se

dividen en micobacterias de lento crecimiento y de rápido crecimiento. Las micobacterias

patógenas suelen ser de lento crecimiento, como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium

leprae, mientras que las de rápido crecimiento se consideran ambientales y son frecuentemente

aisladas del suelo, como Mycobacterium moriokaense (Hartmans y de Bont, 1992).

Introducción

13

Se ha demostrado que las micobacterias pueden multiplicarse en agua pura aunque la

materia orgánica favorece su crecimiento (Dailloux et al., 1999). En sistemas de tratamiento de

aguas potables han sido aisladas diversas especies de micobacterias no tuberculosas (Le

Dantec et al., 2002, Torvinen et al., 2004). Aunque las micobacterias se pueden observar en

fangos activos, no se ha demostrado todavía que son responsables de formación de espumas

biológicas.

2.1.1.4.- Familia Nocardiaceae

Contiene 6 géneros, Nocardia, Gordonia, Millisia, Rhodococcus, Skermania y Williamsia

(Stackebrandt et al., 1997, Chun et al., 1997, Zhi et al., 2009) descritos en la sección 17

(nocardioformes) y sección 26 (actinomicetos nocardioformes) de la primera edición del Manual

Bergey´s (Williams et al., 1989).

El término nocardioforme, introducido por Prauser en 1967, hace referencia a los

actinomicetos que forman un micelio fugaz que se fragmenta en elementos bacilares o cocoides.

Actualmente, ésta no es una definición satisfactoria ya que se conocen cepas individuales de

nocardioformes que no presentan esta característica. Este término intentó unir, de una manera

informal, un número de organismos con características similares sin que eso significara que

fueran organismos estrechamente relacionados.

2.1.1.4.1.- Género Gordonia

Originariamente, este género fue propuesto por Tsukamura en 1971 para algunos

actinomicetos débilmente ácido-alcohol resistentes, aislados del suelo y de esputos de pacientes

con enfermedades pulmonares. Las tres especies originales G. bronchialis, G. rubropertincta y

G. terrae fueron transferidas en 1977 por Goodfellow y Alderson al género Rhodococcus

desapareciendo como tal el género Gordonia. Posteriormente, el descubrimiento de que en el

género Rhodococcus existían dos grupos filogenéticamente distintos, según el análisis de la

secuencia del 16S rDNA, condujo a Stackebrandt et al. (1988) a recuperar el género Gordonia.

Actualmente existen 33 especies de Gordonia válidamente descritas, siendo la especie

tipo del género Gordonia bronchialis (Euzéby, 2011). Gordonia amarae fue transferida desde el

género Nocardia a este género en base a sus propiedades químicas, fenotípicas y a la secuencia

Introducción

14

del 16S rDNA (Klatte et al., 1994, Goodfellow et al., 1994). Desde su primera descripción como

N. amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en gran cantidad de

plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los mycolata más

frecuentemente implicados en problemas de espumas biológicas (Iwahori et al., 2001).

El género incluye pequeños bacilos y formas cocáceas. Pueden formar hifas con

ramificaciones en ángulo recto, son aerobios, Gram-positivos o Gram-variable, catalasa positivos

y normalmente parcialmente ácido-alcohol resistentes. Forman colonias marronáceas, rosas,

naranjas o rojas cuyas células se encuentran en algunos casos formando agregados. La pared

celular contiene ácido meso-diaminopimélico (DAP) y los azúcares mayoritarios son galactosa y

arabinosa (quimiotipo de pared celular IV), estando comprendido su contenido en G+C,

expresado en mol%, entre el 60% y el 70%. Poseen ácidos micólicos de 48-66 átomos de

carbono (Arensköter et al., 2004).

El género Gordonia ha sido considerado como patógeno oportunista aislado de esputos

de pacientes con afecciones pulmonares como G. sputi y G. bronchialis (Tsukamura, 1982) o

como productor de bacteremias (Pham et al., 2003). Sin embargo, muchas de las especies

aisladas presentan una diversidad metabólica considerable y son capaces de degradar

xenobióticos como G. desulfuricans y G. amicalis (Kim et al., 1999, Kim et al., 2000), alcanos

como G. alkanivorans (Kummer et al.,1999) o caucho como G. polyisoprenivorans (Linos et al.,

1999), mientras que otras especies como G. hydrophobica y G. hirsuta (Bendinger et al., 1995,

Klatte et al., 1996) son capaces de eliminar malos olores en biofiltros. La diversidad metabólica

de este género queda reflejada en la revisión realizada por Arensköter et al., (2004). Otra

especie de este género, G. jacobea, produce pigmentos de aplicación industrial (De Miguel et al.,

2000). La etimología del género fue corregida por Stackebrandt en 1997 quedando como

Gordonia y no Gordona (Stackebrandt et al., 1997).

2.1.1.4.2.- Género Millisia

Este género fue propuesto por Soddell et al. en 2006 y fue aislado de espumas

procedentes de plantas de fangos activados. Actualmente la única especie de este género es,

Millisia brevis (Euzéby, 2011). Está constituido por bacilos con ramificaciones en ángulo recto,

aerobios, Gram-positivos o Gram-variables, ácido-alcohol resistentes, catalasa positivos y con

gránulos de polifosfato. Forman colonias rosáceo-asalmonadas, irregulares y con escasos

Introducción

15

filamentos. La pared celular contiene ácido meso-diaminopimélico (DAP) y los azúcares

mayoritarios son galactosa y arabinosa (quimiotipo de pared celular IV). Poseen ácidos micólicos

de 44-52 átomos de carbono. Su contenido en G+C, expresado en mol%, es del 64,7%.

2.1.1.4.3.- Género Nocardia

La primera Nocardia fue aislada en 1888 por el veterinario y bacteriólogo francés

Edmond Nocard y fue caracterizada un año después por Trevisan, el cual le dio el nombre de

Nocardia farcinica. En 1980 N. asteroides sustituyó a N. farcinica como especie tipo (Wallace et

al., 1990).

Actualmente estas cepas se incluyen en el llamado Nocardia asteroides complex

constituido por N. asteroides “sensu estricto”, N. farcinica y N. nova y se dispone de métodos

moleculares precisos para diferenciar estas tres especies (Steingrube et al.,1995).

Desde la transferencia de N. amarae al género Gordonia como G. amarae (Goodfellow

et al., 1994) y de N. pinensis al género Skermania como S. piniformis (Chun et al., 1997) el

género Nocardia ha quedado como un taxón homogéneo. El género Nocardia contiene 79

especies válidamente descritas, siendo la especie tipo del género Nocardia asteroides (Euzéby,

2011). Se ha demostrado que una de estas especies, N. farcinica, es una de las responsables

de la formación de espumas en plantas de fangos activos (Stratton et al., 1996).

Nocardia está distribuido en el suelo de todo el planeta y se encuentra también en

hábitats acuáticos. Se ha llegado a detectar especies de Nocardia en aguas oligotróficas

radiactivas (Chicote Guerrero, 2004). Aunque en su mayoría son saprófitos de vida libre, algunas

especies, en particular N. asteroides, son patógenas oportunistas que causan nocardiosis en

seres humanos y en algunos animales. Es más frecuente la afectación pulmonar, pero también

pueden llegar a invadir el sistema nervioso y otros órganos (McNeil et al ., 1994).

Son aerobios, catalasa positivos, parcialmente ácido-alcohol resistentes, Gram-positivos

o Gram-variables. Forman un micelio aéreo, aunque únicamente visible al microscopio, que se

eleva por encima del agar, donde ocasionalmente se pueden encontrar conidios. Las hifas del

micelio del sustrato adquieren unas dimensiones de 0.5 - 1,2 µm de diámetro y la principal

característica morfológica de este género es la tendencia a fragmentarse con facilidad en bacilos

Introducción

16

y elementos cocoides. Las hifas forman ramificaciones características en ángulo recto. Las

colonias tienen un aspecto aterciopelado o calcáreo y pueden ser marrones, rosas, rojas,

naranjas, púrpuras, grises o blancas y, además, pueden producir pigmentos solubles de color

marrón o amarillo. Los componentes mayoritarios de la pared celular son el ácido meso-DAP y la

arabinosa y la galactosa como azúcares predominantes. Contienen ácidos micólicos de 44-60

átomos de carbono y su contenido en G+C, expresado en mol%, es del 64-72%.

2.1.1.4.4.- Género Rhodococcus

El género Rhodococcus abarca actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasa

positivos y parcialmente ácido-alcohol resistentes en alguno de sus estados de crecimiento. Son

coco-bacilos que pueden formar micelio de sustrato que da lugar a la aparición de extensas

hifas, mientras que tan sólo en algunas especies es característico un micelio aéreo visible al

microscopio. Las colonias de Rhodococcus pueden ser aterciopeladas, rugosas o mucosas, de

color rojo, naranja, amarillo o crema. Los componentes mayoritarios del peptidoglicano de la

pared celular son el ácido meso-DAP y la arabinosa y galactosa como azúcares predominantes.

Contiene ácidos micólicos de 32-66 átomos de carbono y su contenido en G+C, expresado en

mol%, es del 73%.

El hábitat de Rhodococcus es muy amplio y frecuentemente es aislado de suelos,

medios acuáticos y excrementos de animales herbívoros. Existen 31 especies de Rhodococcus

válidamente descritas, siendo la especie tipo del género Rhodococcus rhodochrous (Euzéby,

2011). Algunas especies como R. equi son patógenos para hombres y animales. Otras especies

tienen interés medioambiental ya que son capaces de degradar herbicidas y otros compuestos

(Finnerty, 1992, Briglia et al., 1996).

2.1.1.4.5.- Género Skermania

Nocardia pinensis fue propuesta como una de las principales especies de actinomicetos

que ocasionan espumas en las superficies de los tanques de aireación de las plantas de

tratamiento de aguas residuales de Australia (Blackall et al., 1989). La secuencia completa del

16S rDNA y la estructura de los ácidos micólicos representativos de los mycolata ha sido

determinante para clarificar la posición taxonómica de esta especie, ya que pone de manifiesto el

error al clasificarla en el género Nocardia, a pesar de estar relacionada filogenéticamente con las

Introducción

17

distintas familias que integran la clase Actinobacteria. En base al estudio realizado por Chun et

al. (1997), Nocardia pinensis fue reclasificada como un género nuevo dentro de la familia

Nocardiaceae, renombrándose como Skermania piniformis, la única especie del género.

El género Skermania lo componen bacterias filamentosas, Gram-positivas, no ácido-

alcohol resistentes con un metabolismo oxidativo y catalasa, oxidasa y ureasa positivos. Los

componentes mayoritarios de la pared celular son el ácido meso-DAP y la arabinosa y galactosa

como azúcares predominantes. El número de átomos de carbono de sus ácidos micólicos oscila

entre 58 y 64, y su contenido en G + C, expresado en mol%, es del 67.5% (Chun et al., 1997).

2.1.1.4.6.- Género Williamsia

Este nuevo género fue aislado de las paredes de una guardería en Finlandia (Kämpfer et

al., 1999). Existen 6 especies de Williamsia válidamente descritas, siendo la especie tipo del

género Williamsia muralis (Euzéby, 2011). Los componentes mayoritarios de la pared celular son

el ácido meso-DAP, y los azúcares arabinosa, galactosa, manosa y ribosa. El número de átomos

de carbono de sus ácidos micólicos oscila entre 50 y 56. La secuencia del 16S rDNA indica que

representa un taxón dentro del suborden Corynebacterineae. Aunque las propiedades

morfológicas y quimiotaxonómicas son parecidas a las del género Gordonia, pueden ser

diferenciadas por la secuencia del 16S rDNA y la longitud de las cadenas de ácidos micólicos.

Este taxón fue reconocido como familia en la edición del Bergey’s Taxonomic Outline (Garrity et

al., 2002), sin embargo, actualmente, está incluido en la familia Nocardiaceae (Zhi et al., 2009).

2.1.1.5.- Familia Segniliparaceae

Esta familia está integrada por un único género, Segniliparus (Butler et al., 2005).

2.1.1.5.1.- Género Segniliparus

Actualmente contiene únicamente 2 especies validadas, Segniliparus rotundus y

Segniliparus rugosus, siendo Segniliparus rotundus la especie tipo del género. Estas bacterias

están caracterizadas por tener forma bacilar. Producen colonias no pigmentadas (de blancas a

beiges), lisas o arrugadas. Su contenido en G+C se encuentra comprendido entre un 68 y un 72

mol%. La pared celular contiene ácido meso-DAP y ácidos micólicos (Butler et al., 2005).

Introducción

18

2.1.1.6.- Familia Tsukamurellaceae

Aparece en el Grupo 22 correspondiente a los actinomicetos nocardioformes del

Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). Está integrada por un único

género, Tsukamurella, el cuál fue introducido en 1988 por Collins et al., para acomodar dos

organismos previamente clasificados como Corynebacterium paurometabolum y Rhodococcus

auranticus y reducirlos a una sola especie, T. paurometabola, mediante el análisis de la

secuencia del 16S rDNA (Collins et al., 1988).

2.1.1.6.1.- Género Tsukamurella

El género incluye actinomicetos aerobios, Gram-positivos, catalasa positivos, débilmente

ácido-alcohol resistentes y de forma bacilar, que pueden observarse solos, en parejas o en

masa. También pueden aparecer elementos cocobacilares. Forman colonias convexas que son

secas pero ligeramente emulsificables y cuyos colores van desde el blanco o crema hasta el

naranja. El componente mayoritario del peptidoglicano es el ácido meso-DAP, y la galactosa y

arabinosa como azúcares predominantes. La envoltura celular posee ácidos micólicos de 62-78

átomos de carbono y su contenido en G+C, expresado en mol%, es del 68%.

Han sido aisladas mayoritariamente del suelo y de esputos humanos. La especie T.

spumae ha sido aislada en espumas de fangos activos (Nam et al., 2003), al igual que la especie

T. pseudospumae (Nam et al., 2004). Actualmente, el género contiene 11 especies válidamente

descritas, siendo Tsukamurella paurometabola la especie tipo del género (Euzéby, 2011).

2.1.2.- Suborden Pseudonocardineae

Este suborden se compone de 2 familias: Actinasynnemaceae y Pseudonocardiaceae.

(Euzéby, 2011).

2.1.2.1.- Familia Pseudonocardiaceae

Es la familia tipo del suborden Pseudonocardineae. Dentro de esta familia encontramos

un total de 21 géneros, siendo el género Pseudonocardia el género tipo de la familia (Euzéby,

2011).

Introducción

19

2.1.2.1.1.- Género Pseudonocardia

Actualmente el género contiene 38 especies válidamente descritas, siendo

Pseudonocardia thermophila la especie tipo del género (Euzéby, 2011). Son bacterias aerobias y

Gram-positivas. El género se caracteriza por no poseer ácidos micólicos y una pared celular tipo

IV (ácido meso-diaminopimélico, arabinosa y galactosa) (Huang et al., 2002). El contenido en

G+C del DNA, expresado en mol%, se encuentra comprendido entre el 68% y el 79 % (Dworkin

et al., 2006).

2.1.3.- Suborden Micrococcineae

Este suborden se compone de 16 familias: Beutenbergiaceae, Bogoriellaceae,

Brevibacteriaceae, Cellulamonadaceae, Dermabacteraceae, Dermacoccaceae,

Dermatophilaceae, Intrasporagiaceae, Jonesiaceae, Microbacteriaceae, Micrococcaceae,

Promicromonosporaceae, Rarobacteraceae, Ruaniaceae, Sanguibacteraceae y Yaniaceae

(Euzéby, 2011).

2.1.3.1.- Familia Microbacteriaceae

Dentro de esta familia encontramos un total de 34 géneros, siendo el género

Microbacterium el género tipo de la familia (Euzéby, 2011).

2.1.3.1.1.- Género Microbacterium

Actualmente el género contiene 72 especies válidamente descritas, siendo la especie

tipo del género Microbacterium lacticum (Euzéby, 2011). Las especies de este género son

aerobias, Gram-positivas y catalasa positivas y se caracterizan por poseer generalmente formas

bacilares. El género no posee ácidos micólicos. El contenido en G+C del DNA, expresado en

mol%, se encuentra comprendido entre el 66% y el 72 % (Dworkin et al., 2006).

Introducción

20

3.- Detección e identificación de actinomicetos nocardioformes en

fangos activos

3.1.- Aislamiento y recuento

Para aislar nocardioformes se utiliza la técnica de dilución y siembra en medios

selectivos suplementados con antibióticos, como el ácido nalidíxico que inhibe la flora

acompañante Gram-negativa (Goodfellow et al., 1996). Además, es necesario resaltar que la

morfología de algunos organismos formadores de espumas puede variar en cultivo puro debido a

las influencias en su ritmo de crecimiento y estado fisiológico y hay que tener en cuenta también

que los nocardioformes no suelen crecer a temperaturas superiores a los 30º C. Sin embargo,

recientes avances en biología molecular están permitiendo el desarrollo de pruebas más rápidas

y exactas en la identificación in situ, aunque el aislamiento por métodos clásicos es necesario

como primer peldaño en este tipo de investigaciones (Amann et al., 1995).

Uno de los inconvenientes de esta técnica es la gran cantidad de microbiota

acompañante que enmascara el crecimiento de los nocardioformes más lentos como Skermania

piniformis. Debido a esta limitación con este método, sólo pueden ser aislados los

nocardioformes más abundantes y de crecimiento más rápido, siendo inadecuado este método

para nocardioformes de crecimiento lento.

La siembra se realiza en superficie para así obtener colonias aisladas. Con este método

las cantidades relativas de microorganismos de la muestra original pueden estimarse sobre la

base de crecimiento de las colonias más allá del área original sembrada (Bailey y Scott, 2007).

El aislamiento de las colonias individuales durante los cultivos no sólo es importante para

examinar posteriormente la morfología y las características sino también para la realización de

tinciones Gram y los posteriores subcultivos pertinentes (Bailey y Scott, 2007).

Introducción

21

3.2.- Identificación y caracterización

3.2.1.- Métodos clásicos

Para identificar los diversos grupos de actinomicetos se utilizan tradicionalmente criterios

fisiológicos, morfológicos y quimiotaxonómicos. Los criterios fisiológicos se limitan al tipo de

metabolismo oxidativo o fermentativo. Los caracteres morfológicos y quimiotaxonómicos son los

más importantes. Estos últimos se han utilizado tanto para distinguir grupos supragenéricos

como para distinguir especies (Williams et al., 1989).

3.2.1.1.- Caracteres morfológicos

Los caracteres morfológicos son todavía muy utilizados para caracterizar a nivel de

género. Los principales tratan sobre el modo de septación de las hifas, la estabilidad o fugacidad,

importancia y disposición de las hifas del micelio del sustrato o del micelio aéreo, la presencia de

esporangios o de las diversas formas de los conidios, la presencia de esporas, su número, su

movilidad, su disposición en las hifas y su forma. La observación microscópica de estos

caracteres debe realizarse alterando lo menos posible las estructuras morfológicas de las cepas

examinadas. Esto es posible empleando objetivos a gran distancia focal que permiten el estudio

de las colonias desarrolladas sobre medios sólidos translúcidos.

La evaluación inicial de la morfología en las placas de cultivo primario tiene extrema

importancia. Las características clave de una colonia incluyen su tamaño, pigmentación, forma,

aspecto de la superficie de la colonia, cambios en los medios de agar como resultado del

crecimiento, así como el olor característico puede ayudar a la identificación preliminar (Bailey y

Scott, 2007).

Pero, aunque a veces sea posible clasificar una cepa en base a criterios morfológicos

completamente evidentes, estos no son suficientes para establecer una determinación correcta y

es indispensable considerar otros caracteres (Lechevalier et al., 1980).

Muchos de estos criterios son algo subjetivos y los términos calificativos y descriptivos

utilizados pueden variar. Aunque es importante la determinación cuidadosa del aspecto de la

colonia, es imprudente confiar totalmente en la morfología de la colonia para su primera

Introducción

22

identificación. Las colonias de una especie bacteriana, a menudo, presentan características casi

indistinguibles de las de muchas otras especies. Además, bacterias de una misma especie

pueden presentar diferente morfología.

Después de la descripción de las características de crecimiento en los medios en placa

primarios todos los procedimientos posteriores para la identificación definitiva requieren el uso de

cultivos puros.

Si se puede obtener un inóculo suficiente a partir de los medios primarios no es

necesario realizar subcultivos, excepto como precaución para obtener mayor cantidad del

microorganismo. Sin embargo, los medios primarios con frecuencia no proporcionan cantidades

suficientes de bacterias en cultivos puros y se requiere un subcultivo. Una vez que se dispone de

cultivos puros en cantidad suficiente puede prepararse un inóculo para los procedimientos de

identificación posteriores.

3.2.1.2.- Quimiotaxonomía

El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos

tiene una importancia taxonómica considerable. De esta forma se muestra que estos

microorganismos se pueden dividir en ocho tipos, de los cuales los más frecuentes son los

cuatro primeros (Tabla 3).

Tabla 3: Tipos de pared celular según sus constituyentes mayoritarios (Lechevalier y Lechevalier, 1980)

Tipo Pared Constituyentes mayoritarios Ejemplo de géneros I L-DAP, glicina Streptomyces II Meso-DAP, glicina Micromonospora III Meso-DAP Actinomadura

IV Meso-DAP, arabinosa, galactosa Nocardia, Saccharopolyspora V Lisina, ornitina Actinomyces VI Acido aspártico y galactosa Oerskovia VII DAB, glicina Agromyces VIII Ornitina Cellulomonas

Los actinomicetos con paredes celulares del tipo I poseen principalmente ácido

diaminopimélico de la forma L, mientras que la forma meso de este mismo ácido es

Introducción

23

característica de los tipos II, III y IV. Por otra parte, la presencia o ausencia de cuatro azúcares,

arabinosa, galactosa, xilosa y madurosa, en los hidrolizados ácidos de células enteras permite

clasificar los actinomicetos de los tipos II, III y IV que contienen ácido meso-diaminopimélico

(Tabla 4). Sobre esta misma base, es posible repartir en dos grupos los actinomicetos con pared

celular tipo III según la presencia o ausencia de madurosa.

Tabla 4: Tipos de pared celular y tipos glucídicos de los actinomicetos aerobios con meso-DAP (Lechevalier y Lechevalier, 1980)

Tipo pared Constituyentes mayoritarios

Tipo glucídico Constituyentes

glucídicos II Glicina D Xilosa, arabinosa

B Madurosa III Ninguno

C Ninguno o ramnosa IV Arabinosa, galactosa A Arabinosa, galactosa

Para completar los caracteres citados se utilizan otros caracteres quimiotaxonómicos. Es

el caso de los fosfolípidos de la membrana, de los ácidos micólicos y de las menaquinonas. Se

han definido de este modo cinco perfiles fosfolipídicos característicos de los actinomicetos

(Lechevalier et al., 1980), así como cuatro perfiles basados en los tipos de ácidos grasos

presentes en estos fosfolípidos.

Los ácidos micólicos (3-hidroxi-ácidos grasos con un sustituyente alifático de cadena

moderadamente larga en la posición 2) son constituyentes únicos y característicos de la pared

celular de los géneros Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Millisia, Mycobacterium, Nocardia,

Rhodococcus, Segniliparus, Skermania, Tsukamurella y Williamsia, también conocidos como

mycolata. Los únicos actinomicetos que contienen ácidos micólicos pertenecen al suborden

Corynebacterineae al que pertenecen la mayoría de los microorganismos estudiados en el

presente trabajo.

Los ácidos micólicos tienen un amplio rango de longitudes, un número variable de dobles

enlaces y grupos funcionales, dependiendo de las especies o del género (Baba et al., 1997,

Nishiuchi et al., 1999). Están unidos covalentemente a una molécula de arabinosa del

arabinogalactano. Este polímero está unido, a su vez, a una molécula de ácido N-

glucolilmurámico. El modelo propuesto por Minnikin para la estructura de la cubierta celular de

Introducción

24

los mycolata está descrito en el trabajo de Sutcliffe (1998). En este modelo, los ácidos micólicos

pueden llegar al 30% del peso de la pared celular (Figura 2).

La detección de ácidos micólicos se realiza por cromatografía en capa fina (Hecht et al.,

1976; Minnikin et al., 1980; Cardinali et al., 1995) y por HPLC y cromatografía de gases (Baba et

al., 1997; Chou et al. 1998). Recientes estudios han demostrado que el medio de cultivo puede

influir en el perfil de ácidos micólicos en micobacterias (Wick et al., 2002) y en nocardioformes

(Stratton et al., 1993; Stratton et al., 1997; Sokolovská et al., 2003).

3.2.2.- Métodos genotípicos

Actualmente, para clasificar correctamente un microorganismo se utiliza la taxonomía

polifásica, es decir, utilizar gran cantidad de información. Esta información se divide en

información genotípica e información fenotípica. Este tipo de taxonomía intenta asimilar muchos

niveles de información, desde moleculares a ecológicos, para así poder clasificar e identificar de

una manera más correcta a los microorganismos (Figura 3).

De los métodos moleculares disponibles (Figura 4), los mejores son aquellos que no

dependen de cultivo. Entre estos se puede destacar la técnica de la PCR, que se puede realizar

directamente de la muestra si los cebadores diseñados son suficientemente específicos, y la

secuenciación de DNA. De los métodos moleculares no dependientes de cultivo el que más

Figura 2: Modelo propuesto por Minnikin para la cubierta de los mycolata (Sutcliffe,1998)

Introducción

25

información aporta es, sin lugar a dudas, el FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), ya que

combina técnicas morfológicas con la especificidad de las técnicas moleculares (Amann et al.,

1995).

3.2.2.1.- Análisis de las secuencias del 16S rDNA

En la actualidad está demostrado que ciertas macromoléculas se pueden utilizar como

cronómetros evolutivos, es decir, medidas del cambio evolutivo. Así pues, la distancia evolutiva

entre dos organismos puede determinarse por las diferencias en la secuencia de aminoácidos o

nucleótidos de macromoléculas homólogas aisladas de cada uno de ellos.

Figura 3: Vista esquemática de los componentes celulares y técnicas usadas (Vandamme et al., 1996)

Introducción

26

Para determinar las verdaderas relaciones evolutivas entre organismos es esencial elegir

las moléculas adecuadas para los estudios de secuenciación. Esto es importante por varios

motivos. Primero, la molécula debe estar universalmente distribuida en el grupo elegido para ser

estudiada. Segundo, deben ser funcionalmente homólogas en cada organismo; las

comparaciones filogenéticas deben realizarse con moléculas de idéntica función. Tercero, resulta

crucial poder alinear apropiadamente las dos moléculas a fin de identificar regiones tanto con

homología como con variación de secuencia. Finalmente, la secuencia de la molécula elegida

debería cambiar con una velocidad proporcional a la distancia filogenética que se va a

determinar y, de hecho, cuanto mayor sea la distancia filogenética a determinar, menor será la

velocidad de cambio de la molécula; demasiado cambio tiende a enturbiar el registro evolutivo.

Se han evaluado muchas moléculas como cronómetros evolutivos, y entre ellas, los

genes que codifican los RNAs ribosómicos, componentes clave del sistema de traducción, son

Figura 4: Resolución taxonómica de las técnicas utilizadas (Vandamme et al., 1996 )

Introducción

27

los que han proporcionado la información más significativa sobre los microorganismos para

poder establecer relaciones filogenéticas.

La mayor parte de la atención se ha centrado en las secuencias del rDNA 5S y 16S,

aislados respectivamente de las subunidades 50S y 30S de los ribosomas procariotas. Los rDNA

son prácticamente ideales para los estudios de evolución y parentesco microbianos, puesto que

son imprescindibles para un orgánulo esencial que se encuentra en todos los microorganismos.

Su papel funcional es el mismo en todos los ribosomas. Además, su secuencia se modifica muy

lentamente en el tiempo, debido probablemente a la función esencial y constante que

desempeñan.

Debido a que el rDNA contiene secuencias variables y estables, es posible comparar

tanto microorganismos estrechamente relacionados como de parentesco muy lejano. Esto

constituye una importante ventaja ya que los microorganismos de parentesco lejano sólo pueden

estudiarse utilizando secuencias que sufren pocas modificaciones con el tiempo. (Madigan et al.,

2009).

3.2.2.2.- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Las bases para el método de amplificación in vitro de ácidos nucleicos fueron descritas

por Kleppe et al. (1971), quienes describieron una síntesis extensiva de DNA catalizada por DNA

polimerasas en la reparación de la replicación. Pero fue K. Mullis, científico de la compañía

Cetus, quien en 1983 desarrolló un proceso de amplificación in vitro de ácidos nucléicos,

apoyándose en la teoría de la síntesis automatizada de oligonucleótidos, patentándose la técnica

en 1987. En 1991, la empresa Hoffmann La Roche adquirió la patente, así como los derechos de

la PCR y en 1993, Mullis, autor inicial de la idea, recibió el Premio Nobel de Química.

La PCR es un proceso de amplificación enzimática in vitro del DNA o RNA, iniciada por

unos fragmentos cortos de DNA llamados iniciadores o cebadores (primers). Este proceso se

lleva a cabo cíclicamente. Cada ciclo está dividido temporalmente en tres fases térmicas:

desnaturalización de la doble cadena de DNA, acoplamiento o unión de los iniciadores y

polimerización mediante la adición de dNTPs por la enzima Taq polimerasa. Los productos de la

PCR, llamados amplicones, se detectan normalmente por electroforesis en gel de agarosa y se

visualizan bajo luz ultravioleta.

Introducción

28

Debido a su sencillez, sensibilidad y rapidez, su uso en laboratorios microbiológicos ha

supuesto una revolución en el concepto de la detección de microorganismos. Muchos problemas

derivados de la detección mediante las técnicas tradicionales pueden obviarse mediante la PCR,

lo que ha hecho que esta técnica suponga una alternativa muy eficaz en microbiología. Además,

la versatilidad de esta técnica ha permitido su aplicación a otros campos de interés económico,

como la identificación genética, la medicina forense o el control de calidad en las industrias.

Recientemente el proceso de PCR se ha automatizado, permitiendo además la

cuantificación de los productos de amplificación en tiempo real. Esta nueva técnica conocida

como “Real-Time PCR” no requiere el análisis posterior de la muestra, evitando contaminaciones

y minimizando el tiempo de análisis de las muestras. Esta técnica se ha usado para cuantificar

poblaciones microbianas en fangos activos (Hall et al., 2002, Dionisi et al., 2003).

En algunos casos para la extracción de los ácidos nucleicos de la muestra basta con el

tratamiento por ebullición para conseguir la lisis celular. En general, la mayoría de protocolos

para la extracción de ácidos nucleicos en bacterias Gram-positivas utilizan la lisozima seguida de

la proteinasa K y la purificación con fenol-cloroformo. Los sistemas comerciales para la

extracción y purificación del DNA incorporan, además de los reactivos ya preparados, unas

columnas con filtros de polipropileno que facilitan la labor.

Para poder diseñar los iniciadores es necesario conocer la secuencia del fragmento o

gen de DNA o RNA que se va amplificar. En muchos casos conocer la secuencia completa del

organismo que nos interesa es un proceso caro y difícil, por lo que se recurre a información

generada por otros investigadores y almacenada en los numerosos bancos de datos para esta

finalidad (NCBI, Ribosomal Database Project). La información generada por los genetistas, al

secuenciar y analizar las secuencias de DNA para determinar las relaciones entre los diferentes

grupos bacterianos, basándose en las diferencias en sus secuencias, se utiliza para identificar

organismos a nivel de especie. De los tres genes que forman el rDNA, son el 16S y el 23S los

que se estudian para establecer diferencias entre microorganismos. El 5S es demasiado corto

(150-200 pb) para ser relevante como portador de variaciones genéticas entre bacterias. La

recopilación de varias secuencias del 16S y del 23S en los bancos de datos es una excelente

ayuda a los investigadores en el desarrollo de iniciadores para la detección mediante PCR.

Introducción

29

La PCR ha sido aplicada con éxito para caracterizar actinomicetos nocardioformes

principalmente en muestras clínicas. En el caso del género Nocardia se disponen de iniciadores

específicos de género (Laurent et al., 2000) que son de gran utilidad para el diagnostico de

casos de nocardiosis.

El análisis de enzimas de restricción (REA) de la porción de 65-kDa de la proteína de

stress térmico (HSP) se ha utilizado con éxito para diferenciar especies de Nocardia incluso

dentro del complejo N. asteroides (Steingrube et al., 1995; Cuesta, 2004).

A la rapidez de la técnica se puede añadir, además, la posibilidad de detectar varias

especies o varios genes de una misma especie a la vez en una misma muestra, lo que se

conoce como PCR múltiple, utilizando varios pares de iniciadores en una misma reacción de

amplificación (Cormican et al., 1995, Cheng et al., 2004).

Otra modificación de la PCR es la “nested PCR” o PCR anidada, que consiste en una

doble amplificación con dos parejas de iniciadores, en donde la segunda pareja reconoce y

amplifica una región interna del primer producto amplificado, siendo así de mayor sensibilidad y

especificidad, especialmente útil en el caso de muestras ambientales. Esta técnica se ha

utilizado para identificar N. restricta en monumentos de piedra biodegradados (Palla et al., 2002)

y para amplificar un elemento extragénico repetitivo para detectar N. asteroides en diferentes

ambientes (Yamamura et al., 2004).

3.2.3.- Métodos fenotípicos

El estudio del 16S rDNA solamente abarca una pequeña porción del genoma de la

bacteria, con lo que estaríamos despreciando un alto contenido de información. Como datos de

apoyo se utilizan los marcadores quimiotaxonómicos y las pruebas fenotípicas que nos dan una

visión más global de la expresión del genoma (Garrity et al., 2001).

Las pruebas fenotípicas convencionales que se suelen utilizar se basan en la

observación de las características morfológicas macroscópicas de las colonias en los diferentes

medios de cultivo, observación de morfología microscópica con las tinciones de Gram y la

descomposición de algunos sustratos específicos, tales como adenina, xantina, caseína,

hipoxantina, testosterona, tirosina y urea entre otros (Biehle et al., 1996).

Introducción

30

Hay que destacar que el crecimiento relativamente lento de las especies del género

Nocardia y la gran similitud morfológica y fisiológica que pueden presentar algunas de las

especies de este género dificulta aún más la identificación (Wauters et al., 2005).

4.- Aguas residuales

La organización mundial de la salud (OMS) ha establecido como uno de los derechos

fundamentales de todo ser humano “el disfrute del grado máximo de salud posible”. Considera la

salud como un “estado completo de bienestar físico, mental y social”, y fija el nivel de salud por el

grado de armonía, que exista entre el hombre y el medio que sirve de escenario a su vida (citado

por Hernández, et al., 1996).

La contaminación, a efectos del Real Decreto RD 1/2001, es la acción y el efecto de

introducir materias o formas de energía, o inducir condiciones en el agua que, de modo directo o

indirecto, impliquen una alteración perjudicial de su calidad en relación con los usos posteriores o

con su función ecológica. La contaminación de las aguas es uno de los factores importantes que

rompe la armonía entre el hombre y su medio tanto a corto, como a medio y largo plazo; por lo

que la prevención y lucha contra ella constituye, en la actualidad, una necesidad de importancia

prioritaria (Hernández, et al., 1996).

Los humanos han utilizado las aguas no sólo para su consumo, sino, con el paso del

tiempo, para su actividad y para su confort, convirtiendo las aguas usadas en vehículo de

desechos. De aquí surge la denominación de aguas residuales. La mayoría de los vertidos de

aguas residuales que se hacen en el mundo no son tratados. Simplemente se descargan en el

río, mar o lago más cercano y se deja que los sistemas naturales, con mayor o menor eficacia y

riesgo, degraden los desechos de forma natural. En los países desarrollados, una proporción

cada vez mayor de los vertidos es tratada, antes de que lleguen a los ríos o mares, en

estaciones depuradoras de aguas residuales. El objetivo de estos tratamientos es, en general,

reducir la carga de contaminantes del vertido y convertirlo en inocuo para el medio ambiente.

Para cumplir estos fines se usan distintos tipos de tratamiento dependiendo de los

contaminantes que arrastre el agua y de otros factores más generales, como localización de la

planta depuradora, clima, ecosistemas afectados, etc.

Introducción

31

“Las aguas residuales pueden definirse como las aguas que provienen del sistema de

abastecimiento de agua de una población, después de haber sido modificadas por diversos usos

en actividades domésticas, industriales y comunitarias” (Mara, 1976).

Según su origen, las aguas residuales resultan de la combinación de líquidos y residuos

sólidos transportados por el agua que proviene de residencias, oficinas, edificios comerciales e

instituciones, junto con los residuos de las industrias y de actividades agrícolas, así como de las

aguas subterráneas, superficiales o de precipitación que también pueden agregarse

eventualmente al agua residual (Mendonça, 1987).

Así, de acuerdo con su origen, las aguas residuales pueden ser clasificadas como:

� Domésticas: son aquellas utilizadas con fines higiénicos (baños, cocinas, lavanderías,

etc.). Consisten básicamente en residuos humanos que llegan a las redes de alcantarillado por

medio de descargas de instalaciones hidráulicas de la edificación y también en residuos

originados en establecimientos comerciales, públicos y similares.

� Industriales: son líquidos generados en los procesos industriales. Poseen

características específicas, dependiendo del tipo de industria.

� Infiltración y caudal adicionales: las aguas de infiltración penetran en el sistema de

alcantarillado a través de los empalmes de las tuberías, paredes de las tuberías defectuosas,

tuberías de inspección y limpieza, etc. Hay también aguas pluviales, que son descargadas por

medio de varias fuentes, como canales, drenajes y colectores de aguas de lluvias.

� Pluviales: son agua de lluvia, que descargan grandes cantidades de agua sobre el

suelo. Parte de esta agua es drenada y otra escurre por la superficie, arrastrando arena, tierra,

hojas y otros residuos que pueden estar sobre el suelo.

Los múltiples usos a que se destina el agua y la creciente demanda la han convertido en

un recurso limitado, cuando no escaso. Por otra parte, las aguas residuales pueden ser la causa

de un impacto ambiental cuyo control forma parte de los programas de bienestar social de

cualquier gobierno.

Introducción

32

4.1.- Depuración de aguas residuales

4.1.1.- Antecedentes

Aunque la captación y el drenaje de las aguas residuales pluviales datan de tiempos

antiguos, la recogida de aguas residuales no aparece hasta principios del siglo XIX, mientras que

el tratamiento sistemático de las aguas residuales data de finales del siglo pasado y principios

del presente. El desarrollo de la teoría de los gérmenes productores de enfermedades a cargo de

Koch y Pasteur en la segunda mitad del siglo XIX marcó el inicio de una nueva era en el campo

del saneamiento.

Hasta ese momento se había profundizado poco en la relación entre contaminación y

enfermedades, y no se había aplicado al tratamiento de aguas residuales la microbiología,

disciplina entonces en sus inicios. En Estados Unidos, el tratamiento y eliminación de las aguas

residuales no recibió demasiada atención hasta finales del siglo XIX porque los daños causados

por el vertido de aguas no tratadas en las relativamente grandes masas de agua receptoras

(comparadas con las europeas) no eran graves, y porque se disponía de grandes extensiones de

terreno para su evacuación. Sin embargo, a principios del siglo XX, los daños causados y las

condiciones sanitarias impulsaron una creciente demanda de mayor eficiencia en el tratamiento y

gestión de las aguas residuales (Metcalf y Eddy, 1995).

4.1.2.- Clasificación de los métodos de tratamiento de aguas residuales

La depuración consiste en la eliminación de la contaminación e impurezas incorporadas

en el agua a tratar. Sus objetivos consisten en prevenir y reducir la contaminación y sus

molestias, mantener un balance ecológico y asegurar la protección de la biosfera, prever el

desarrollo urbano y asegurar una atención especial a los aspectos ambientales en la

planificación del suelo y de las ciudades.

Podemos clasificar los métodos de tratamiento de aguas residuales:

- Según mecanismos de la operación: se conoce como operaciones físicas unitarias

aquellos métodos de tratamiento en los que predominan fenómenos físicos, mientras que

aquellos métodos en los que la eliminación de contaminantes se realiza basándose en procesos

Introducción

33

químicos o biológicos se conocen como procesos químicos y biológicos unitarios. Las

operaciones físicas unitarias utilizan fuerzas físicas mediante el desbaste, mezclado, floculación,

sedimentación, flotación, transferencia de gases y filtración, para la eliminación de sólidos

sedimentables y flotantes presentes en el agua residual. En los procesos químicos unitarios la

transformación de la materia se produce mediante reacciones químicas. En este caso la

eliminación de los contaminantes se consigue por medio de la adición de productos químicos

(Metcalf y Eddy, 1995). El objetivo de los procesos biológicos unitarios es la eliminación,

estabilización o transformación de la materia orgánica, presente en las aguas como sólidos

coloidales no sedimentables. Esta acción se logra por la acción de los microorganismos

mediante dos acciones complementarias: acción metabólica, la cual transforma los glúcidos,

lípidos, ésteres, hidratos de carbono y proteínas en materia viva; y la acción físico-química, en la

cual se emplea: coagulación, oxidación de la materia carbonosa, decantación y arrastre de

bacterias (Hernández, et al., 1996).

En la actualidad, las operaciones y procesos unitarios se agrupan entre sí para

constituir los así llamados tratamiento primario, secundario y terciario (o tratamiento avanzado)

(Metcalf y Eddy, 1995).

- Según la posición dentro del esquema de depuración y el uso que se les de a las

diferentes operaciones:

� Pretratamiento de las aguas residuales: el primer paso en la depuración de aguas

residuales ha de consistir en una eliminación de materias gruesas, cuerpos gruesos y arenosos,

cuya presencia en el efluente perturbaría el tratamiento total y el eficiente funcionamiento de las

máquinas, equipos e instalaciones de la estación depuradora (Hernández, et al., 1996). En este

proceso se emplean cribas, rejas gruesas, rejas finas y tamices que separan los restos

voluminosos.

� Tratamiento primario: reducción de la materia suspendida por medio de la

precipitación o sedimentación, con o sin reactivos, o por medio de diversos tipos de oxidación

química, poco utilizada en la práctica, salvo aplicaciones especiales, por su alto coste.

� Tratamiento secundario: se emplea para eliminar la contaminación orgánica disuelta,

que no se puede eliminar por tratamientos físico-químicos. Suele aplicarse tras los anteriores.

Introducción

34

Consisten en la oxidación aerobia de la materia orgánica (en sus diversas variantes de fangos

activados, lechos de partículas, lagunas de oxidación y otros sistemas) o su eliminación

anaerobia en digestores cerrados. Ambos sistemas producen fangos en mayor o menor medida

que, a su vez, deben ser tratados para su reducción, acondicionamiento y destino final.

� Tratamientos terciarios: utiliza técnicas de los tratamientos primarios y secundarios

destinadas a mejorar el vertido final, mejorando alguna de sus características. Con este

tratamiento se consigue eliminar: nutrientes, compuestos tóxicos, excesos de materia orgánica y

sólidos en suspensión. Si se emplea intensivamente puede lograr hacer el agua de nuevo apta

para el abastecimiento de necesidades agrícolas, industriales e incluso para potabilización.

� Tratamiento de fangos: la evacuación final de los residuos sólidos, semisólidos

(fangos) y contaminantes concentrados separados del agua residual mediante los diversos

procesos de tratamiento, ha sido y continúa siendo uno de los problemas más complejos y

costosos en el ámbito de la ingeniería de las aguas residuales (Metcalf y Eddy, 1995). En este

proceso se tratan los fangos extraídos de las diferentes operaciones de tratamiento, para su

posterior aprovechamiento o eliminación.

El tratamiento de aguas residuales empieza por la separación física inicial de sólidos de

la corriente de aguas domésticas o industriales, seguido por la conversión progresiva de materia

biológica disuelta en una masa biológica sólida usando bacterias adecuadas, generalmente

presentes en estas aguas. Una vez que la masa biológica es separada, el agua tratada puede

experimentar una desinfección adicional mediante procesos físicos o químicos. Este efluente

final puede ser descargado o reintroducido en un medio natural u otro ambiente. Los sólidos

biológicos segregados experimentan un tratamiento y neutralización adicional antes de la

descarga o reutilización apropiada.

Las operaciones unitarias empleadas en el tratamiento de aguas residuales promueven

el desarrollo de la población bacteriana y, como consecuencia, la aceleración de los procesos de

degradación natural, dentro de recintos controlados, de modo que la carga contaminante se

reduzca hasta concentraciones que no causen efectos en el medio receptor (Metcalf y Eddy,

1995).

Introducción

35

El nombre de tratamientos secundarios abarca todos los procesos biológicos de

tratamiento de aguas residuales, tanto aerobios como anaerobios. Constituye una de las etapas

fundamentales, en la que la mayor parte de la carga orgánica es eliminada por el efecto de una

biomasa activa presente.

Los tratamientos biológicos se pueden clasificar según dos criterios:

- En función de los requerimientos de oxígeno por parte de los microorganismos:

� Procesos aerobios: se dan en presencia de oxígeno molecular. Incluye el proceso de

fangos activados.

� Procesos anaerobios: se dan en ausencia de oxígeno molecular.

� Procesos facultativos: los organismos responsables pueden funcionar en presencia o

ausencia de oxígeno molecular.

- En función del estado físico del medio donde se desarrollan los

microorganismos:

� Procesos de cultivo en medio líquido o en suspensión: los organismos responsables

de la degradación de la carga contaminante se encuentran en suspensión dentro de la masa

líquida.

� Procesos de cultivo fijo o de soporte sólido: los organismos responsables de la

degradación de la carga contaminante están fijados a un medio inerte como son las piedras,

escorias, materiales cerámicos y plásticos especialmente diseñados para esta función.

� Procesos biológicos, donde se pueden distinguir cuatro grupos:

• Fangos activos

• Lagunas aireadas

Introducción

36

• Lagunaje

• Tratamiento de fangos

El proceso de fangos activos es estrictamente aerobio en donde el aire es aportado por

medio de difusores o aireación mecánica. Los fangos activos constituyen una mezcla de

microorganismos vivos y muertos contenidos en el agua residual, que transforma la materia

orgánica biodegradable hasta formas más simples y estables (H2O, NH3 y principalmente CO2), y

nueva biomasa celular, que se agrupa para formar el flóculo.

Una vez transformada la materia orgánica del agua residual, ésta pasa a un tanque de

sedimentación donde los flóculos, por gravedad, se van depositando y agregando para formar el

fango. De aquí se extrae el agua depurada y clarificada.

4.2.- Aguas residuales urbanas

Llamamos aguas residuales a los líquidos procedentes de la actividad humana, que

llevan en su composición gran parte de agua y que generalmente son vertidos a cursos o a

masas de agua continentales o marinas.

Su origen puede ser muy diverso y se agrupan, según Brebion (1973) en 5 categorías de

origen:

� Mecánico y físico

� Inorgánico y mineral

� Orgánico

� Urbano

� Colectivo

Introducción

37

Las aguas residuales urbanas se componen de (Brebion, 1973)

� Excretas: son las que contienen los residuos sólidos y líquidos que constituyen las

heces humanas fundamentalmente.

� Residuos domésticos: son los que proceden de la evacuación de los residuos y

manipulaciones de cocinas (desperdicios, arenas de lavado, residuos animales y vegetales,

detergentes y partículas), de los lavados domésticos (jabones, detergentes sintéticos con

espumantes MES, sales, etc.), y de la actividad general de las viviendas (celulosa, almidón,

glucógeno, insecticidas, partículas orgánicas, etc.).

� Arrastres de lluvia: al caer la lluvia sobre una ciudad, arrastrará las partículas y fluidos

presentes en las superficies expuestas, es decir, hollín, polvo de ladrillo y cemento, esporas,

polvo orgánico e inorgánico de los tejados, partículas sólidas polvo, hidrocarburos de las vías

públicas, restos de vegetales y animales y partículas sólidas (tierras) de los parques y zonas

verdes. Si la precipitación es suficiente, los arrastres se efectuarán hasta la red de evacuación y

aparte de los componentes extraños, el volumen de agua es tal que produce diluciones a tener

en cuenta en los procesos de depuración.

� Infiltraciones: a veces las zonas verdes urbanas, por la composición de su suelo,

permiten el paso de las aguas de arrastre hacia los acuíferos, con el consiguiente peligro de

contaminación.

� Residuos industriales: son los que proceden de la evacuación de los residuos y

manipulaciones de las fábricas. Debe tenerse en cuenta que las características de los residuos

estarán relacionadas con cada sector industrial.

4.3.- Aguas residuales en la industria petroquímica

Por regla general, las instalaciones de refino son grandes y están completamente

integradas. Las refinerías son centros industriales que manipulan enormes cantidades de

materias primas y productos y además tienen un consumo intensivo de energía y agua. En los

procesos de almacenamiento y refino, las refinerías generan emisiones a la atmósfera, al agua y

Introducción

38

al suelo, hasta el punto de que la gestión ambiental se ha convertido en un factor importante de

su actividad (Bref Document, 2003).

En una refinería se consumen grandes cantidades de agua, ya sea con fines de proceso

o de refrigeración. Este agua se contamina con productos derivados del petróleo. Los principales

contaminantes del agua son los hidrocarburos, sulfuros, amoníaco y algunos metales. Teniendo

en cuenta la enorme cantidad de materia prima que procesan, las refinerías no generan

cantidades significativas de residuos. En la actualidad, los residuos generados por las refinerías

consisten principalmente en lodos, desechos no específicos, tales como basuras, y productos

químicos agotados, como por ejemplo ácidos, aminas o catalizadores.

Las aguas residuales de las refinerías se recolectan separadas, de acuerdo con el punto

de su generación y su concentración y se llevan a las plantas de tratamiento o purificación

(Asociación Alemana de Saneamiento, 1986). Además, se debe diferenciar entre aguas libres de

petróleo, aguas que pueden contener petróleo y aguas que han estado en contacto con el

petróleo. Generalmente, estas aguas, proceden del vapor condensado, el agua de separación, la

descarga procedente de la purga de torres de refrigeración y calderas, el agua de lavado, las

aguas procedentes del proceso de desalación del crudo, el agua de neutralización de residuos

ácidos y alcalinos otras aguas relacionadas con los procesos y las aguas sanitarias.

En cualquier caso, la cantidad y características de los contaminantes varían en función

de los crudos que se procesan, de la complejidad y tipos de procesos de cada planta y de la

integración y tipo de petroquímica derivada que incorpore las existencias de redes separativas o

tratamiento específicos de corriente (Zornoza et al., 2008).

Por lo general, en una refinería, se practican las siguientes etapas de tratamiento (Figura

5):

� Tratamiento previo de las aguas de proceso: los destiladores eliminan sustancias

altamente volátiles, entre otras, por medio del vapor de agua.

� Separación del petróleo: en separadores. El que flota en la superficie se recupera para

su posterior transformación.

Introducción

39

� Procedimientos químicos de tratamiento: eliminan las partículas de petróleo que

están finamente distribuidas u otras sustancias. Este proceso puede ser apoyado por una

flotación.

� Tratamiento biológico posterior: las sustancias que aún quedan en el agua, después

de estos pasos, se eliminan en buena medida en el tratamiento biológico posterior, en caso de

que sean biodegradables o de que se puedan someter a una eliminación físico-química.

Figura 5: Esquema general del proceso (Zornoza et al., 2008)

Si fuera necesario, como etapa biológica avanzada, se puede descargar posteriormente

en una laguna secundaria o laguna aireada (Asociación Alemana de Saneamiento, 1986).

Las aguas residuales purificadas por esta vía se descargan en el cuerpo receptor. El

lodo activado que se ha producido en la etapa biológica de tratamiento se separa en una

sedimentación secundaria o por medio de instalaciones de tratamiento posteriores. Este lodo

activado separado se elimina después junto con otros lodos que se generan en el tratamiento de

aguas residuales.

Introducción

40

4.4.- Sistema de fangos activos

El proceso de fangos activos es el sistema de tratamiento biológico más habitual en la

depuración de las aguas residuales urbanas. Fue desarrollado en Inglaterra, en 1914, por Ardern

y Lockett, quienes realizaron experimentos con un cultivo biológico en suspensión en un tanque

aireado e introdujeron la idea de recircular la biomasa suspendida formada durante la aireación.

Esta suspensión fue llamada fangos activos y correspondía a la biomasa activa responsable del

proceso de depuración. Inmediatamente después de la publicación de su primer trabajo,

comenzaron a desarrollarse instalaciones a gran escala en Inglaterra y en Estados Unidos.

Este proceso surgió a partir de la observación de que cualquier agua residual, ya sea

doméstica o industrial, aireada durante un cierto periodo de tiempo, reduce su contenido en

materia orgánica, al mismo tiempo que se forma un fluido con flóculos de bacterias. Estos

flóculos se encuentran formados por una población muy heterogénea de microorganismos.

(Soddell y Seviour, 1990; Bitton, 1999).

Los fangos activos constituyen una mezcla de microorganismos, en su mayoría bacterias

heterótrofas, que transforman la materia orgánica biodegradable hasta formas más simples y

estables. Consiste en un tratamiento aeróbico que oxida la materia orgánica hasta CO2, NH3 y

H2O y forma nueva biomasa celular. La biomasa celular obtenida forma flóculos que sedimentan

en el tanque de clarificación o sedimentación. Este procedimiento se utiliza a escala mundial

como tratamiento biológico secundario para el tratamiento de aguas residuales domésticas

(Bitton, 1999). Parte de los fangos recogidos en el sedimentador secundario se recirculan al

reactor y son los que contienen los microorganismos que llevan a cabo la depuración biológica.

(Metcalf y Eddy, 2000).

4.4.1.- El flóculo

El flóculo está formado por la unión de microorganismos, partículas orgánicas e

inorgánicas, teniendo un tamaño que oscila entre 1 y 1000 µm. Para que el proceso de

depuración sea llevado a cabo con éxito es necesaria la formación de un flóculo adecuado de

microorganismos en el tanque de aireación. Con ello se permite la separación de los sólidos en

suspensión en el tanque de sedimentación produciéndose un sobrenadante fluido y claro. A su

Introducción

41

vez, parte de estos sólidos que contienen los flóculos son recirculados al tanque de aireación

para así aumentar el nivel de actividad microbiana (Soddell y Seviour, 1990).

Las bacterias filamentosas juegan un papel importante ya que, gracias a ellas, el flóculo

adquiere consistencia con lo que se pueden formar flóculos de mayor tamaño y más compactos

que resisten mucho mejor las turbulencias del sistema de agitación. También ayudan a capturar

y mantener atrapadas pequeñas partículas durante la sedimentación (Kerley y Forster, 1995).

Si no existieran bacterias filamentosas o éstas estuvieran en una proporción muy baja se

formarían flóculos llamados “flóculos en punta de alfiler”, los cuales son de pequeño tamaño y de

consistencia muy débil con lo que el sistema de aireación los disgregaría, además la

sedimentación no se produciría correctamente con lo que se originaría un sobrenadante turbio

con muchos sólidos en suspensión. En cambio, si hubiera un crecimiento excesivo de

microorganismos filamentosos se produciría un aumento de volumen de los sólidos

sedimentados por compactación defectuosa denominado “bulking” (Bitton, 1999). Si, por el

contrario, se produce un crecimiento excesivo de actinomicetos nocardioformes que contienen

ácidos micólicos (mycolata) se produce la formación de espumas biológicas, fenómeno conocido

como “foaming” (Seviour y Blackall, 1998).

4.4.2.- Composición de la microbiota

El flóculo de los fangos activos contiene un amplio rango de procariotas y eucariotas,

muchos de ellos pueden ser observados por las técnicas microscópicas habituales.

Dentro de las bacterias, las Gram-negativas son las más importantes en el flóculo. Son

las responsables de la oxidación de la materia orgánica y de la transformación de nutrientes. Se

cree que en el flóculo pueden existir cientos de especies bacterianas pero sólo una pequeña

fracción puede ser detectada con métodos basados en técnicas de cultivo. Cuando se usan

estos métodos se aíslan principalmente Zooglea, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcalígenes,

Achromobacter, Corynebacterium, Comamonas, Brevibacterium, Acinetobacter, Bacillus, así

como bacterias filamentosas como Sphaerotilus y Beggiatoa entre otras, que son responsables

del “bulking” (Bitton, 1999).

Introducción

42

4.4.3.- Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos

El sistema de fangos activos actúa básicamente como un cultivo continuo con una

biomasa que recircula. En estos sistemas se produce una presión selectiva sobre los organismos

de manera que aquellos que no sean capaces de prevalecer en esas condiciones serán

eliminados en el efluente (Seviour y Blackall, 1998). Los factores que hacen que un organismo

permanezca dentro de este sistema se discuten a continuación.

4.4.3.1.- Tasa de crecimiento

La tasa específica de crecimiento de un organismo determinará su capacidad para

competir con otras poblaciones microbianas. Este parámetro está relacionado con el tiempo

medio de residencia celular. La disponibilidad de substratos necesarios para el crecimiento y

otros factores pueden afectar a la tasa de crecimiento y, por lo tanto, al tiempo medio de

residencia celular.

Los microorganismos del fango degradadores de materia orgánica requieren fuentes de

nitrógeno, sulfuro e iones como Ca2+, Mg2+ y K+ para su crecimiento, algunos de los cuales

pueden estar en concentraciones limitantes de crecimiento. La capacidad para obtener estos

nutrientes afectará claramente a la tasa específica de crecimiento.

4.4.3.2.- Tolerancia a factores abióticos y toxinas

La capacidad de tolerar condiciones abióticas en el reactor como temperatura, pH y

potencial redox también puede afectar a la tasa de crecimiento, así como la presencia de

determinados productos tóxicos, incluidos metales pesados, que entran en el influente de la

planta de tratamiento. Si alguno de estos tóxicos excede el máximo de tolerancia de un

organismo se produce la muerte celular (Mazierski, 1995; Seviour y Blackall, 1998). Existen

pocos datos experimentales que demuestren in situ el efecto tóxico de tales sustancias aunque

se ha sugerido que los microorganismos asociados al flóculo pueden estar protegidos de alguna

manera de estos tóxicos (Seviour y Blackall, 1998).

Introducción

43

4.4.3.3.- Capacidad para contribuir a la formación del flóculo

Los microorganismos de vida libre que viven suspendidos, independientemente de su

tasa de crecimiento, serán eliminados del sistema con el efluente después de la sedimentación.

Por el contrario, los que forman el flóculo podrán sedimentar tan pronto como éste se haya

formado y, por lo tanto, serán recirculados en el reactor. Esto se traduce en un enriquecimiento

de microorganismos con capacidad para formar flóculos (Jenkins et al., 2004).

4.5.- Problemas producidos por microorganismos en sistemas de fangos

activos

En los sistemas de fangos activos, para que la depuración se lleve a cabo de forma

eficiente, es necesaria una buena separación de los sólidos. Existen muchos problemas

derivados de la separación de sólidos en los que se ven implicados los microorganismos

presentes en el reactor y en el decantador secundario. En la tabla 5 se enuncian los problemas

detectados y sus posibles causas.

4.5.1.- Aumento del volumen de los sólidos sedimentables o “Bulking”

Este fenómeno se produce por el crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos

no mycolata en el líquido de mezcla. Su presencia provoca que los flóculos biológicos del reactor

sean voluminosos y poco consistentes. Estos flóculos no sedimentan bien y suelen ser

arrastrados en grandes cantidades en el efluente de los tanques de sedimentación con el

consiguiente problema que comporta (Chi et al., 1999).

4.5.2.- Formación de espumas biológicas o “Foaming”

Se produce cuando hay un crecimiento excesivo de microorganismos filamentosos que

contienen ácidos micólicos y a ´Microthrix parvicella´ (Goodfellow et al., 1996). Aunque pueden

existir otros tipos de espumas producidas por tensoactivos de lenta degradación (Jenkins et al.,

1993) las espumas producidas por mycolata son espesas, viscosas y muy estables (Figura 6).

De todos los microorganismos que pueden producir el foaming los mycolata son los más

Introducción

44

problemáticos ya que las espumas que originan son de gran consistencia y su eliminación es

difícil sin que se altere la calidad del efluente.

Tabla 5: Problemas en estaciones depuradoras de fangos activos: causas y efectos

Problema Causa Efecto

Crecimiento disperso

Los microorganismos no forman flóculos, sino que están dispersos, formando sólo

pequeños grupos o en células aisladas

Efluente turbio. No hay zona de sedimentación del fango

Limo (Gelatina) Bulking viscoso (también se ha

denominado bulking no filamentoso)

Los microorganismos aparecen entre grandes cantidades de limo exocelular. En casos severos

este limo confiere al fango activo una consistencia gelatinosa

Reducción de los porcentajes de sedimentación y compactación. En casos severos no hay separación de sólidos y se pierde fango con el efluente del clarificador secundario. En casos más leves suele aparecer una

espuma viscosa

Flóculo - alfiler “Pin - floc” o “Pinpoint floc”

Se forman flóculos pequeños, compactos, tenues, toscamente esféricos. Los mayores decantan

rápidamente. Los menores decantan lentamente

Índice volumétrico del Fango (I.V.F.) bajo y efluente turbio

Esponjamiento “Bulking”

Organismos filamentosos se extienden fuera de los flóculos por la solución, interfiriendo en la compactación y decantación del

fango activo

I.V.F. alto, sobrenadante muy claro. Concentración del Fango Activo Recirculado (F.A.R.) y del Fango Activo

en Exceso (F.A.E.) baja. En casos severos hay pérdidas de fango con el efluente. El proceso de manejo de los sólidos resulta sobrecargado

hidráulicamente

Manto ascendente

La desnitrificación en el clarificador secundario libera N2 gaseoso poco soluble que se adhiere a los flóculos de fango activo subiéndolos a la superficie

del clarificador

Se forma una espuma de fango activo en la superficie del clarificador secundario

Formación de espumas y/o natas

Causado por (I) sobrenadantes no degradables y por (II) la

presencia de GALO y, en algunas ocasiones, de Microthrix

parvicella

Grandes cantidades de sólidos del fango activo flotan formando espuma en la superficie de los elementos del tratamiento. Las espumas de Gordonia y Microthrix son persistentes y difíciles de eliminar mecánicamente. Se acumulan y pueden pudrirse. Los sólidos pueden pasar al clarificador y al efluente o derramarse de las cubas

de aireación

La primera vez que se describió la formación de estas espumas fue en el año 1969. En

ese año se realizó un estudio en donde se describió el llamado “misterio de Milwaukee”, por ser

ésta la localidad en donde se observaron por primera vez estas espumas que contenían gran

cantidad de actinomicetos ramificados Gram-positivos. Estas bacterias fueron posteriormente

identificadas como pertenecientes al género Nocardia, concretamente N. amarae y N.

Introducción

45

rhodochrous (Lechevalier y Lechevalier, 1974), y por ello a estas espumas se les empezó a

conocer como “Nocardia foams” (Jenkins et al., 1993). Posteriormente, esta especie fue

transferida al género Gordonia como G. amarae (Klatte et al., 1994; Goodfellow et al., 1994). Sin

embargo, actualmente, este término hace referencia al problema de espumas producidas por

mycolata, ya que otros microorganismos también pueden causar este problema, entre ellos

Rhodococcus, y Tsukamurella (Nam et al., 2003).

Figura 6: Problema real de espumas en depuradora

La formación de espumas en las plantas de fangos activos es un problema muy

extendido. En América el 66% de las plantas han experimentado algún tipo de foaming (Seviour

y Blackall, 1998). En Australia el 68% de las plantas sufren problemas de espumas (Seviour et

al., 1994). Un amplio seguimiento realizado en Francia puso de manifiesto que el 19.8% de las

plantas, sobre todo las que utilizan intensa aireación, habían presentado problemas de espumas.

Este estudio revela que en una de cada tres plantas con espumas de origen biológico el

problema es puramente estético, sin embargo, en el resto se produce un cambio significativo en

la calidad del efluente.

La aparición de espumas causa una serie de problemas (Seviour y Blackall, 1998):

� Las espumas pueden llegar a tener más de un metro de espesor y, por tanto,

desbordarse en las pasarelas y áreas circundantes donde se originan peligrosas zonas

resbaladizas.

Introducción

46

� Se pierde gran cantidad de sólidos sedimentables, ya que las espumas pueden retener

más del 40% de los sólidos en suspensión.

� Son responsables de la disminución de oxígeno transferido a la superficie de los tanques

aireados mecánicamente.

� Los sistemas de eliminación de espumas pueden verse bloqueados y éstas pueden

entrar, en algunos casos, en el tanque de sedimentación, reduciendo así la calidad del efluente.

� La espuma puede congelarse en climas fríos o pudrirse en climas cálidos.

� La espuma puede introducirse en los digestores anaerobios y ocasionar también

problemas de foaming.

Los aerosoles de los organismos formadores de espumas constituyen un peligro

potencial para la salud (Goodfellow et al., 1998). Algunos organismos hallados en las espumas

son patógenos oportunistas, tales como Nocardia asteroides y Rhodococcus equi (Prescott,

1991).

4.5.3.- Microorganismos productores de espumas

Antes de los 80, los únicos microorganismos reconocidos como formadores de espumas

eran los actinomicetos nocardioformes, sin embargo, algunos trabajos han implicado ciertos tipos

de microorganismos filamentosos asociados previamente con el aumento de volumen,

especialmente Microthrix parvicella (Blackall et al., 1994; Blackall et al., 1996).

Nocardia (Gordonia) es la bacteria filamentosa cuya presencia es más común en fangos

activos de EE.UU y la mayoría de espumas biológicas están producidas por este género, aunque

diversos estudios en otros países sugieren que la situación es más compleja (Jenkins et al.,

1993).

Los mycolata son la causa más importante de foaming en Australia, Sudáfrica, los

Países Bajos o Francia. Estudios realizados en Australia remarcan una morfología distinguible

como Skermania piniformis, que no ha sido identificada en ningún país europeo, sin embargo,

Introducción

47

recientemente han sido observadas morfologías PTLO (Pine Tree - Like Organism) en dos

plantas de fangos activos en Dinamarca (Eales et al., 2003)

Microthrix parvicella y diversos microorganismos todavía no clasificados, debido a su

imposibilidad de ser aislados en cultivo puro, como el tipo 0675, el tipo 0092, Thiothrix sp. o

Nostocoida limicola son, junto a los mycolata, los principales responsables de la formación de

espumas en las plantas de fangos activos al crecer en el licor mezcla y posteriormente

acumularse en cantidades considerables en la espuma.

Los microorganismos dominantes identificados por microscopía en espumas de fangos

activos son:

� Gordonia amarae (GALO): perteneciente a la familia Nocardiaceae y dentro de ésta al

género Gordonia. Debido a que durante 20 años el principal productor de espumas biológicas

era conocido como N. amarae y debido a su similitud morfológica todavía existe la tendencia de

llamar a estas bacterias NALO (Nocardia amarae - Like Organism). Sin embargo, fue transferida

desde el género Nocardia a este género (Klatte et al., 1994; Goodfellow et al., 1994) por sus

propiedades químicas, microbiológicas y secuencia del 16S rDNA, por lo que ahora, estas

bacterias, se denominan GALO (Gordonia amarae - Like Organism). Desde su primera

descripción como N. amarae (Lechevalier y Lechevalier, 1974) esta especie ha sido aislada en

gran cantidad de plantas depuradoras con sistemas de fangos activos y es uno de los mycolata

más frecuentemente implicado en problemas de espumas biológicas. Su abundancia provoca

disgregación flocular y presentan una cubierta cérea que forma una suspensión en medio líquido,

ya que atrapan burbujas de aire, que causa la aparición de espumas densas en el sobrenadante

clarificado. Además, su abundancia está asociada a bajas cargas másicas, alta edad del fango y

altas temperaturas.

� Skermania piniformis (PTLO): perteneciente a la familia Nocardiaceae y dentro de ésta

al género Skermania. Es la única especie con morfología lo suficientemente característica como

para identificarla correctamente. Originariamente se llamaba PTLO porque sus ramificaciones se

asemejan a las hojas de un pino (Eales et al., 2003 y Ramírez et al., 2005).

Introducción

48

� Rhodococcus: perteneciente a la familia Nocardiaceae y dentro de ésta al género

Rhodococcus. Generalmente son cocos Gram-positivos que producen espumas filamentosas en

diversas plantas de fangos activos australianas.

� Microthrix parvicella: es muy frecuente en plantas de Europa, Australia y Sudáfrica,

pero menos frecuente en plantas de EE.UU. Su ubicación taxonómica no está clara todavía

aunque su secuencia de 16S rDNA indica un parentesco con los actinomicetos (Blackall et al.,

1994). Por ello se ha ubicado en la clase Actinobacteria, en una subdivisión denominada

“Actinobacterias no clasificadas”. Es una bacteria filamentosa, Gram-positiva, con una

apariencia irregular y unas necesidades nutricionales que hacen que hasta la fecha no se haya

conseguido aislar en cultivo puro. A pesar de que Microthrix no es un nombre taxonómicamente

válido, debido a la carencia de una caracterización fenotípica detallada, se propuso conservar el

nombre, elevando al organismo al estado de Candidatus, debido a que esta bacteria filamentosa

es muy frecuente en toda la industria del tratamiento de aguas residuales. Por tanto, el género

“Candidatus Microthrix” se ubica en la clase Actinobacteria, en una subclase denominada

“Actinobacterias sin clasificar”. Incluye dos especies, “Candidatus Microthrix parvicella” y

“Candidatus Microthrix calida”, y son unas de las bacterias formadoras de espumas más

importantes. Es una bacteria constituida por filamentos largos y finos, que crecen atravesando la

estructura del flóculo. No presentan ramificaciones ni vaina y son Gram-positivas y con gránulos

Neisser positivos.

� Tipos morfológicos Eikelboom 0092, 0675, 0041: son bacterias filamentosas que no

han podido ser cultivadas, pero se han caracterizado por la morfología de sus filamentos en

fangos activos.

Resulta clara la necesidad de encontrar técnicas que permitan identificar a los

microorganismos formadores de espumas de una forma más precisa y rápida, ya que, aunque

todos están relacionados de forma taxonómica, difieren substancialmente en su fisiología y tasa

de crecimiento. Rhodococcus crece relativamente rápido, obteniendo colonias aisladas en una

media de 2 - 3 días, Nocardia en 5 - 7 días, mientras que G. amarae tarda más de una semana y

S. piniformis más de tres semanas. Además, es muy importante conocer si los organismos

presentes en las espumas son patógenos debido a su potencial propagación a través de la

creación de aerosoles.

Introducción

49

Aunque los principales actinomicetos formadores de espumas como Gordonia amarae y

Skermania piniformis no son conocidos como patógenos otros, como Nocardia asteroides,

Rhodococcus equi y Tsukamurella paurometabolum, pueden causar enfermedades,

particularmente en pacientes que usan medicación inmunodepresiva o infectados por el virus

VIH (Castelli et al., 1994). Las micobacterias, también detectadas en fangos activos aunque no

causantes de espumas, pueden representar un peligro potencial para la salud (Dailloux et al.,

1999). Además, el personal de la planta se encuentra expuesto a los aerosoles producidos por

los nocardioformes que son potencialmente patógenos y cuya ruta de infección es

probablemente la inhalación (Goodfellow, 1992).

4.5.4.- Principales factores que influyen en la producción de espumas

La formación de una espuma biológica estable y viscosa en los tanques de aireación en

las plantas de tratamiento de aguas residuales implica el enriquecimiento selectivo de los

organismos en el licor mezcla mediante un proceso de flotación (Seviour y Blackall, 1998) y

resulta de la combinación de elementos relacionados con la flotación de los microorganismos y

mecanismos para estabilizar la espuma producida.

Para que se originen estas espumas biológicas es necesaria la presencia conjunta de

burbujas de aire y partículas hidrofóbicas. Estos componentes están presentes en la mayoría de

plantas de fangos activos con problemas de espumas. Las burbujas de aire son producidas por

el sistema de aireación y retenidas por la matriz de bacterias filamentosas. Las partículas

hidrofóbicas más importantes en espumas biológicas son los ácidos micólicos contenidos en la

pared celular de los mycolata.

4.5.4.1.- Burbujas de aire

El examen de espumas de fangos activos por microscopía muestra que el foaming

consiste en burbujas de aire sujetas en una densa matriz de microorganismos filamentosos en

cuyo alrededor se encuentran burbujas individuales que contienen material celular (Foot et al.,

1993). La formación de burbujas se ve favorecida por los sistemas de agitación. Se ha

examinado también la relación entre el foaming y el tamaño de la burbuja.

Introducción

50

El tamaño de la burbuja de aire no viene determinado únicamente por el método de

aireación empleado, sino que depende a su vez de factores físicos como la viscosidad y la

tensión superficial del licor mezcla (Seviour y Blackall, 1998). Otros gases, como el CO2, N2 y

H2S, también se encuentran presentes en el licor mezcla como resultado del metabolismo de la

microbiota presente, pero el aumento producido es insignificante comparado con el ocasionado

por la aireación y no contribuyen significativamente a la formación de espumas (Lemmer y

Bauman, 1988a y 1988b).

4.5.4.2.- Partículas hidrofóbicas

La mayoría de los microorganismos productores de espumas contienen grandes

cantidades de material lipídico hidrofóbico en sus células. El 35% del peso seco de M. parvicella

es material lipídico y los nocardioformes poseen un elevado contenido de ácidos micólicos en su

pared celular, lo que hace que todas las especies exhiban una elevada hidrofobicidad en algún

estadio de su ciclo de crecimiento, aunque esta característica varía según las especies y, en

algunos casos, con la edad del cultivo y con la riqueza del medio en carbono y nitrógeno. Por

ejemplo, se han detectado diferencias en la hidrofobicidad de Rhodococcus rhodochrous

aislados de espumas y otras especies de Rhodococcus incluso sabiendo que sus ácidos

micólicos son similares (Sunairi et al., 1997). La composición de los ácidos micólicos de R.

rhodochrous y de R. erythropolis varía con la edad del cultivo, la temperatura de crecimiento y la

fuente de carbono (Stratton et al., 1997, Sokolovská et al., 2003).

La técnica comúnmente utilizada para determinar la hidrofobicidad de la superficie

celular de una suspensión acuosa de células es la adherencia microbiana a los hidrocarburos.

Mediante esta técnica se examinó la hidrofobicidad de fangos de plantas con y sin problemas de

espumas, llegando a la conclusión de que la biomasa presente en el licor mezcla era

normalmente más hidrofóbica en las plantas de tratamiento con foaming que en la de plantas

que no tienen este problema (Rosenberg et al., 1980).

Se ha conseguido medir la hidrofobicidad de diferentes especies de Corynebacterium,

Rhodococcus, Gordonia y Mycobacterium observándose una tendencia a su aumento cuanto

mayor es la longitud de la cadena de ácidos micólicos, aunque la hidrofobicidad de las especies

de Mycobacterium estudiadas no ha sido tan elevada como cabría esperar por su larga cadena

de ácidos micólicos. Esto se atribuye a efectos contrarios en la hidrofobicidad del resto de

Introducción

51

componentes de la superficie celular. Es por ello que la hidrofobicidad de la superficie celular

está probablemente determinada por el balance entre componentes hidrofóbicos e hidrofílicos

más que por un sólo componente aislado (Stratton et al., 1997).

También se ha comparado la estabilidad de las espumas producidas por G. amarae y

una especie sin identificar de Rhodococcus sp., siendo tres veces más estable la espuma de

Rhodococcus debido a la mayor longitud de su cadena de ácidos micólicos.

4.5.4.3.- Tensoactivos

Un tensoactivo es una sustancia que, cuando se presenta en bajas concentraciones en un

sistema, tiene la propiedad de reducir la tensión superficial del agua. Los componentes de la

superficie activa se encuentran presentes en fangos activos debido a que ciertos

microorganismos, incluyendo los mycolata, producen lípidos que poseen estas propiedades

(Seviour y Blackall, 1998). Dichos lípidos producen tanto asociaciones bacteria-tensoactivo, que

causan una asociación entre la bacteria y las gotitas de aceite, como tensoactivos extracelulares,

que conducen a la emulsión de hidrocarburos en agua. Ambos tipos soportan la entrada de

moléculas hidrofóbicas hacia el interior de las células (Goclick et al., 1990).

El licor mezcla procedente de plantas con problemas de foaming muestra menor tensión

superficial que el del resto de plantas sin espumas, sugiriéndose, que grandes cantidades de

tensoactivos se encuentran presentes en las plantas con foaming (Goddard y Forster, 1991).

4.5.5.- Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos productores de

espumas

A pesar de que los microorganismos formadores de espumas, los mycolata y M. parvicella,

están considerados de crecimiento lento, de algún modo, logran competir por los nutrientes y

producir grandes cantidades de biomasa en las plantas de fangos activos.

4.5.5.1.- Requisitos nutricionales

Diversos estudios taxonómicos han demostrado que los mycolata son capaces de utilizar

un amplio rango de sustratos que va desde los azúcares simples hasta componentes orgánicos

Introducción

52

muy complejos. Otros trabajos revelan que Nocardia y los organismos relacionados son también

capaces de metabolizar varios hidrocarburos, lípidos complejos, esteroides y fenoles (Klatte et

al., 1994). Los mycolata aislados de fangos activos también muestran esta capacidad para

metabolizar un amplio rango de sustratos, incluyendo sustratos inusuales como tiofenos y

quinolonas (Seviour y Blackall, 1998).

Todos los mycolata, y especialmente Rhodococcus, son extremadamente versátiles en su

capacidad para degradar sustratos y, consecuentemente, mostrarían una exitosa competencia

contra otros microorganismos con capacidades metabólicas más limitadas, incluso a pesar de

que estos últimos crezcan más rápidamente en sustratos sencillos como la glucosa. Un estudio

demuestra que los mycolata aislados de fangos activos crecen pobremente en glucosa y acetato,

mientras que el crecimiento es mayor con fructosa como fuente de carbono (Kämpfer et al.,

1995).

4.5.5.2.- Requisitos de oxígeno

Los mycolata son aerobios estrictos, esto no significa necesariamente que algunos

mycolata no sean capaces de crecer bajo condiciones anaeróbicas, como ciertas especies de

Rhodococcus que pueden metabolizar anaeróbicamente clorofenoles (Uotila et al., 1992).

4.5.5.3.- Temperatura

Es más probable la aparición de mycolata formadores de espumas en climas cálidos

(Eikelboom, 1994), mientras que M. parvicella es más frecuente en climas fríos (Seviour et al.,

1994). Sin embargo, no se excluye la posibilidad de que los mycolata no puedan crecer a

temperaturas más bajas. Los mycolata aislados de fangos activos crecen en un amplio rango de

temperaturas. Algunos aislados, particularmente Rhodococcus, crecen a temperaturas tan bajas

como 5º C, mientras que la temperatura mínima de crecimiento para G. amarae es de 15° C.

De estos estudios se deduce que el crecimiento de algunas bacterias formadoras de

espumas en las plantas de fangos activos puede tener lugar a bajas temperaturas si otros

requisitos metabólicos no son limitantes. La temperatura óptima de estos microorganismos es de

25° C, mientras que las temperaturas máximas de crecimiento son, al igual que las mínimas,

muy variadas, algunos no pueden crecer con temperaturas de 30° C o superiores y, sin

Introducción

53

embargo, otros lo hacen a más de 40° C. La capacidad para crecer a altas temperaturas puede

ser muy significativa en algunas plantas de tratamiento, ya que la temperatura en las secciones

donde aparece la espuma puede aumentar por el contacto directo con el sol.

4.5.5.4.- pH

El pH del licor mezcla influye de forma importante en el crecimiento de los filamentos. Se

ha determinado que el nivele de pH óptimo para el desarrollo de los mycolata se encuentra entre

6 y 8. La mayoría de Rhodococcus, exceptuando R. rhodnii, Gordonia y Tsukamurella crecen

también a pH alcalinos superiores a 9 (Goodfellow et al., 1991).

4.5.6.- Métodos de control

La formación de espumas en los sistemas de fangos activos tiene lugar en muchas de

las plantas de tratamiento, las cuales difieren significativamente en sus parámetros

operacionales. La temperatura, los métodos de aireación, la edad del fango, el nivel de sólidos,

etc. puede determinar qué microorganismos crecen particularmente en una planta y resulta,

pues, difícil determinar los factores específicos que favorecen el crecimiento de las grandes

cantidades de organismos formadores de espumas.

4.5.6.1.- Manipulación de la edad del fango

Debido a que los actinomicetos son considerados microorganismos de crecimiento lento,

una reducción en la edad del fango eliminaría al organismo del sistema. Sin embargo, ésta no

resulta una medida totalmente efectiva por la variabilidad en la velocidad de crecimiento de los

nocardioformes. Aunque esta medida controla el problema en situaciones adversas, la calidad

del efluente se ve afectada (Seviour y Blackall, 1998).

4.5.6.2.- Cloración

La cloración es normalmente utilizada como un método de control no específico para los

problemas de “bulking” y “foaming”, aunque hoy en día se cree que perjudica a los flóculos que

contienen mycolata. Un uso más efectivo de la cloración en el control de espumas reside en su

aplicación pulverizando directamente sobre la espuma en el tanque de aireación (Jenkins et al.,

Introducción

54

1993).

4.5.6.3.- Empleo de selectores

Este método se basa en la manipulación del crecimiento del filamento a través de una

zona de selección previa al tanque de aireación. En esta zona se crea un ambiente anaeróbico

donde los aireadores dejan de funcionar durante determinados períodos de tiempo,

favoreciéndose así el crecimiento de bacterias formadoras de flóculos a expensas de los

mycolata (Seviour y Blackall, 1998).

4.5.6.4.- Eliminación física

Existen diversas técnicas de eliminación física empleadas en el control del foaming que

incluyen la eliminación mecánica de la capa superficial del licor mezcla, el uso de nebulizadores

o flotación selectiva mediante el incremento de la aireación y la eliminación selectiva de las

espumas originadas (Pagilla et al.,1996). Los nebulizadores son la opción mayoritaria en las

plantas americanas, pero presenta el inconveniente de su baja efectividad ante problemas de

espumas moderados o severos.

4.5.6.5.- Otros métodos

La adición de compuestos antiespumantes ha tenido poco éxito a la hora de combatir

problemas de “foaming”, probablemente debido a que estas espumas biológicas son mucho más

estables que las espumas contra las que están diseñadas esos antiespumantes (Duchene,

1994). Además, estos compuestos suelen tener un precio excesivo. Se ha ensayado también la

dosificación de sales metálicas como FeCl3 o coagulantes basados en aluminio. Pero ensayos de

laboratorio realizados muestran que los nocardioformes tienen diferentes niveles de

susceptibilidad a los niveles de hierro (Seviour y Blackall, 1998).

Diferentes compañías comercializan mezclas de microorganismos conteniendo además

nutrientes y enzimas. Estos productos no tienen aplicación práctica porque obligan a un uso

continuado y por lo tanto resultan caros (Soddell y Seviour, 1990). Recientemente se ha

propuesto la utilización de actinofagos para controlar las espumas biológicas producidas por

Introducción

55

nocardioformes. Miembros de la familia viral Siphoviridiae han sido aislados de géneros de

mycolata presentes en muestras de reactores de fangos activos (Thomas et al., 2002).

4.6.- Identificación de microorganismos filamentosos en fangos activos

La detección de los microorganismos filamentos presentes en el sistema de fangos

activos es importante para la identificación del problema y para encontrar sus posibles

soluciones.

Los métodos clásicos se basan en la observación microscópica de las muestras para

determinar las características morfológicas. Aunque estos se siguen utilizando, están siendo

sustituidos por los métodos moleculares de detección e identificación ya que evitan, en gran

medida, los largos tiempos de incubación y se reduce la manipulación.

4.6.1.- Método clásico de identificación de microorganismos filamentosos

La distinción entre los grupos de actinomicetos se ha basado, tradicionalmente, en

criterios fisiológicos, morfológicos y quimiotaxonómicos.

Eikelboom (1975), estableció una nomenclatura basada en la observación microscópica

de las características morfológicas, que actualizaron posteriormente Jenkins et al. (2004). Estos

caracteres morfológicos son:

� Ramificación: presente o ausente, y si está presente, si es verdadera o falsa. La

verdadera ramificación significa que es celular, con un citoplasma continuo entre las ramas. En el

fango activo, los únicos organismos que forman tricomas ramificados son los hongos y los

mycolata (Gordonia, Nocardia, Skermania, Rhodococcus). En la falsa ramificación no hay

continuidad citoplasmática entre tricomas, simplemente se han pegado dos tricomas y han

crecido hacia fuera. La falsa ramificación se suele observar en el fango activo sólo en

Sphaerotilus natans, aunque también se ha descrito ocasionalmente en el tipo 1701.

� Movilidad: ausente, o si la hay, describirla. Sólo unos pocos organismos filamentosos

del fango activo son móviles. Beggiatoa spp, Flexibacter spp, y algunas bacterias fotosintéticas

Introducción

56

(Cyanophyceae) son móviles por deslizamiento. Thiothrix spp. y el Tipo 021N pueden mostrar

limitados movimientos de balanceo o de contracción.

� Forma del filamento: recto, ligeramente curvo, doblado, irregular “cadena celular”,

enrollado o micelial.

� Color: transparente, medio, oscuro.

� Ubicación: extendiéndose fuera del flóculo, principalmente dentro del flóculo o libre en

el líquido interflocular.

� Crecimiento adherido o de bacterias unicelulares: presente o ausente. Si existe

indicar si es importante o fortuito.

� Vaina: presente o ausente.

� Paredes transversales (septos celulares): presencia o ausencia.

� Diámetro del filamento: debe medirse tanto el diámetro medio como su extensión en

µm; es importante apreciar si el diámetro es mayor o menor de 1 µm.

� Longitud del filamento: extensión en µm.

� Forma celular: cuadrada, rectangular, ovalada, con forma de barril, discoidal o varilla

con extremos redondeados.

� Tamaño: anchura y longitud medias de las células en µm.

� Depósitos de azufre: presencia o ausencia in situ y presencia de gránulos o ausencia

tras realizar el “S test”.

� Otros gránulos: presentes o ausentes. Los gránulos observados más frecuentemente

son de polifosfatos (gránulos Neisser +) y de PHB (confirmados con la tinción PHB).

Introducción

57

� Reacciones de tinción: cada organismo filamentoso presente debe evaluarse por

separado frente a su reacción a las tinciones de Gram y de Neisser.

� Observaciones adicionales: dos organismos filamentosos, Thiothrix spp. y el Tipo

021N (poco frecuente) pueden presentar rosetas y gonidios. Una roseta se desarrolla cuando los

tricomas crecen radialmente desde un origen común. Los gonidios son células ovaladas o con

forma de varilla, que aparecen en el ápice del tricoma, con una apariencia claramente distinta a

las células vegetativas. Ambos indican un crecimiento rápido de los organismos. También

aparecen en condiciones de deficiencia de nutrientes, así como cuando se trata agua séptica.

Sin embargo, la detección e identificación de éstas a través de métodos clásicos,

basados en las características morfológicas y en tinciones diferenciales y de estructuras

específicas, no son aclaratorias por varias razones:

� Una misma especie puede mostrar polimorfismos o diferentes especies parecer iguales.

� La cuantificación sólo se puede hacer de modo indicativo, ya que los microorganismos

filamentosos que se encuentran en el interior del flóculo pueden pasar desapercibidos.

� El método tradicional es subjetivo y depende del nivel de entrenamiento y experiencia

del personal que realiza la identificación y/o cuantificación.

5.- Biodegradación

5.1.- Antecedentes

Muy frecuentemente se designa al pasado siglo XX como el siglo de la química orgánica

debido al desarrollo de miles de compuestos diferentes utilizados para la elaboración de una

infinidad de nuevos productos: fibras sintéticas, plásticos, compuestos farmacéuticos, etc.

Paralelamente, esto ha supuesto el vertido al medio ambiente en forma de efluentes

líquidos, sólidos o gaseosos, de un gran número de estas sustancias, con un fuerte impacto

asociado sobre el medio receptor. Este impacto está en numerosas ocasiones originado por el

Introducción

58

papel limitado que pueden jugar estas sustancias en los ciclos naturales de descomposición de

la materia debido a su carácter antropogénico y xenobiótico. Un ejemplo claro lo constituye la

industria química y petroquímica, que tiene el dudoso honor de ser la principal fuente de este tipo

de residuos, completamente diferentes a los residuos generados por el sector agroindustrial

(Méndez, 2002).

Por otra parte, uno de los principales puntos que tiene en cuenta la nueva legislación de

la Unión Europea es la necesidad de adoptar procesos de producción con “emisión cero”, que

pueden desarrollarse a partir de la minimización de la descarga de los contaminantes generados

por las actividades industriales. Para alcanzar ese objetivo, la primera prioridad sería la

reducción de la emisión de contaminantes en cada etapa del proceso de fabricación, mientras

que la segunda se centraría en el tratamiento y reciclaje de productos de desecho (Méndez,

2002).

5.2.- Contaminación por hidrocarburos

En la actualidad ya no se discute que el petróleo y, por lo tanto, sus componentes

mayoritarios, los hidrocarburos, tienen su origen en los compuestos que forman parte de los

organismos, los denominados compuestos biogénicos.

Una sucesión de reacciones químicas, ocurridas a altas temperaturas y presiones y

durante millones de años, que los geoquímicos engloban con el término de procesos

diagenéticos y catagenéticos, han conducido a la conversión paulatina de estas estructuras

biogénicas en hidrocarburos (Solanas, 2009).

En lugares donde se han encontrado hidrocarburos, se ha podido demostrar la

existencia, en etapas geológicas anteriores, de organismos que poseían en sus células

compuestos biogénicos como el pigmento eritroafina o el alcaloide veratramina. Este fenómeno

supone que los microorganismos, capaces de crecer en sus orígenes solamente a expensas de

compuestos biogénicos, como los azúcares o las proteínas, han ido conviviendo a lo largo de

millones de años con una serie de compuestos orgánicos que finalmente han dado lugar a los

componentes de los crudos de petróleo actuales (Solanas, 2009).

Introducción

59

La firme demanda de energía en el mundo moderno ha determinado el uso intensivo del

petróleo y sus derivados como fuente de energía. Muchos de sus componentes son empleados

como materias primas básicas en las industrias químicas y petroquímicas.

El uso masivo y el transporte del petróleo y sus derivados ocasionan fuertes derrames,

los cuales cada vez son más frecuentes, por lo que la contaminación por hidrocarburos es una

de las principales causas de destrucción de ecosistemas edáficos y acuáticos (Riojas et al.,

2010).

Particularmente, en las zonas de producción petroquímica, la superficie del suelo y las

aguas están expuestas a contaminaciones debidas a los productos que allí se utilizan. Las aguas

residuales de algunas plantas petroquímicas, además de hidrocarburos, contienen químicos

clorados (Shokrollahzadeh et al., 2008).

La importancia de la contaminación producida por estos compuestos viene determinada

por sus características mutagénicas, carcinogénicas y tóxicas. Además, su propiedad de escasa

solubilidad dificulta aún más la biodegradación natural.

5.2.1.- Composición del crudo del petróleo

El petróleo se define como una mezcla heterogénea de gas natural y aceite crudo (Okoh,

2006). El crudo del petróleo se caracteriza por ser un líquido negro, viscoso y una composición

química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, básicamente de la

familia de los hidrocarburos.

Los hidrocarburos constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales más

importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos

ambientales (Casellas et al., 1995).

El petróleo contiene mayoritariamente alcanos de cadena lineal (n-alcanos o n-

parafinas), en menor cantidad alcanos ramificados, cicloalcanos (o naftenos) y cantidades

variables de hidrocarburos aromáticos (Fernández et al., 1992).

Introducción

60

La composición elemental de un crudo está condicionada por la predominancia de los

compuestos tipo hidrocarburo. Los hidrocarburos están compuestos, casi en su totalidad, por

elementos como el hidrógeno y el carbono en una proporción aproximada de dos átomos de

hidrógeno por cada átomo de carbono. También abarca elementos que constituyen menos del

3% (v/v) como el nitrógeno, el azufre y el oxígeno. Asimismo, hay una presencia menor del 1%

(v/v) de elementos traza que comprenden el fósforo y metales pesados tales como el vanadio y

el níquel (Okoh, 2006).

Los principales componentes (Tabla 6) se subdividen y purifican en distintas fracciones:

fracción saturada (n-alcanos, alcanos ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas),

fracción aromática (monoaromáticos e hidrocarburos aromáticos policíclicos o HAPs), fracción de

resinas y fracción de asfaltenos, que son menos abundantes y consisten en compuestos más

polares, pudiéndose encontrar hidrocarburos heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y

agregados de alto peso molecular (Speight, 1991).

Tabla 6: Composición de las fracciones químicas contenidas en un crudo de petróleo (Viñas, 2005)

Fracción Composición n-alcanos

Alcanos de cadena ramificada Isoprenoides

Cicloparafinas o cicloalcanos Saturada

Hopanos Hidrocarburos monoaromáticos

Aromática Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)

Agregados de piridinas Agregados de quinolinas Agregados de carbazoles Agregados de tiofenos Agregados de sulfóxidos

Resinas

Agregados de amidas Agregados de HAP Ácidos nafténicos

Sulfuros Ácidos grasos Metaloporfirinas

Asfaltenos

Fenoles polihidratados

No obstante, la composición puede variar con la localización, la antigüedad y la

profundidad del yacimiento petrolífero (Okoh, 2006).

Introducción

61

5.2.1.1.- Hidrocarburos monoaromáticos

En esta familia se hallan el benceno y sus alquilados (monoalquilados como el tolueno y

dialquilados como los xilenos) formando la familia de los BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y

xileno), de gran importancia ambiental debido a su solubilidad en el agua y su elevada toxicidad.

Su alto grado de solubilidad contribuye a su movilidad, permitiéndoles migrar al subsuelo y

contaminar aguas subterráneas que abastecen a los seres humanos y a los animales (Margesin

et al., 2003).

5.2.1.2.- Hidrocarburos poliaromáticos

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) se definen por ser estructuras

formadas por 2 o más moléculas de benceno fusionadas. Se conocen unos 100 HAPs diferentes

ya que existe una elevada cantidad de isómeros. Debido a la elevada energía de resonancia

negativa que posee el anillo bencénico, estos compuestos adquieren una gran estabilidad

termodinámica. Entre los hidrocarburos diaromáticos encontramos el naftaleno y sus alquilados.

Constituyen la familia mayoritaria de hidrocarburos aromáticos presentes en el crudo.

Entre los hidrocarburos poliaromáticos de tres anillos, encontramos el fenantreno,

antraceno, fluoreno y sus derivados alquilados. Entre los hidrocarburos poliaromáticos de más de

tres anillos encontramos el fluorantreno (3 anillos bencénicos y uno no bencénico), pireno y

criseno (4 anillos aromáticos), benzo(a)pireno (5 anillos aromáticos) y cororeno (un HAP

condensado con 6 anillos).

Asimismo, se pueden incluir compuestos muy relacionados con los hidrocarburos

aromáticos que contienen anillos aromáticos heterocíclicos con azufre (tiofenos, dibenzotiofenos)

o nitrógeno (carbazoles) ya que muestran características similares. Las peculiaridades más

importantes que condicionan el comportamiento de los HAPs en el medio ambiente van ligadas a

las características fisicoquímicas propias de la estructura de cada HAP.

Son de gran importancia la hidrofobicidad, que aumenta con el número de anillos y la

volatilidad de los HAPs de menor peso molecular. Debido a las propiedades hidrofóbicas, los

HAPs muestran una fuerte tendencia a absorberse a las superficies lo que dificulta su

biodegradación y facilita su acumulación en la cadena trófica (Clements et al., 1994).

Introducción

62

Los HAPs existentes en el medio ambiente (atmósfera, suelos y ecosistemas acuáticos)

pueden proceder tanto de la naturaza como de las actividades antropogénicas. Básicamente las

fuentes de HAPs se resumen en tres: el petróleo u origen petrogénico, la combustión u origen

pirolítico y la síntesis por seres vivos, cuya aportación es minoritaria (Viñas, 2005).

La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América (USEPA) ha

incluido los HAPs entre sus contaminantes prioritarios. Fundamentalmente se debe a la

peligrosidad intrínseca ya que presentan una toxicidad aguda y de tipo teratogénico, mutagénico

y carcinogénico. En suma, también se bioacumulan y su biodegradación en general es mucho

más lenta, especialmente los HAPs de elevado peso molecular (Kanaly et al., 2000).

5.2.2.- Fuentes de contaminación

Una investigación realizada en 1981 por el instituto americano de petróleo (API)

identificó entre las principales fuentes de contaminación (Benavides et al., 2004):

� Lodos de perforación de tipo inverso y recortes: estos lodos contienen un tipo de

aceite muy similar al diesel en concentraciones de aproximadamente un 10% y son sumamente

arcillosos. Este material se deposita en presas, las cuales anteriormente eran construidas con

materiales permeables y filtraban los hidrocarburos al medio ambiente.

� Suelo contaminado por derrames de tuberías corroídas: existen campos petrolíferos

con alrededor de 50 años de antigüedad, ubicados en zonas pantanosas, manglares u otras

selvas inundables. Los acueductos de estos campos se instalaron conectando los pozos

individuales a baterías de separación y desde ahí hasta las petroquímicas y refinerías,

generándose corrosión anaerobia, debido principalmente a bacterias reductoras de sulfato dando

como resultado acueductos corroídos y derramamientos. Los tipos de suelos afectados son de

zonas bajas con altos contenidos de materia orgánica y arcilla y los menos afectados, son por lo

general los más aptos para la agricultura por poseer texturas menos finas y alta fertilidad. Los

ubicados en la planicie costera son los que más preocupan en caso de contaminación por el

impacto que puede tener sobre los acuíferos, debido a su alta permeabilidad.

� Tiraderos de desechos aceitosos semisólidos: se utilizan pozos que nunca

produjeron petróleo o pozos antiguos que están tapados y fueron construidos de materiales

Introducción

63

impermeables. Muchas veces se termina el espacio disponible y se sigue depositando el relleno

sobre la plataforma lo que resulta en escurrimientos e infiltraciones de hidrocarburos al medio

ambiente cercano.

� Sitios contaminados por descargas petroquímicas y refinerías: estos tienen

sistemas antiguos de tratamiento de aguas residuales, las cuales generalmente contienen sales

de los yacimientos de petróleo, lo que puede afectar a masas de agua.

5.3.- Biorremediación

La biorremediación se define como el proceso mediante el cual los residuos tóxicos son

degradados por medio de plantas, hongos, algas, bacterias naturales o modificadas

genéticamente, en condiciones controladas, convirtiéndolos en compuestos inocuos, como el

CO2 y el H2O, para el ambiente o la salud humana, o reduciendo su concentración por debajo de

los límites establecidos por las regulaciones legales (López et al., 2006).

Una de las medidas biocorrectoras más empleada es la utilización de microorganismos

para la descontaminación de suelos y aguas. Estos sistemas de descontaminación se basan en

la absorción de las sustancias orgánicas por parte de dichos microorganismos, los cuales las

utilizan como la fuente de carbono necesaria para su crecimiento y como la fuente de energía

para sus funciones metabólicas (Torres, 2003).

La biorremediación utiliza la habilidad de los microorganismos para degradar

compuestos orgánicos. Esta tecnología está basada en el uso de organismos naturales o

mejorados genéticamente para recuperar sitios contaminados y proteger el ambiente (Poindexter

y Miller,1994). Marivela et al. (2002) señalan que el proceso de biorremediación puede

clasificarse de acuerdo al organismo que efectúe la degradación del compuesto xenobiótico en

los siguientes tipos:

� Fitorremediación: consiste en el uso de plantas verdes para contener, eliminar o

neutralizar compuestos orgánicos, metales pesados o radionucleidos. Un ejemplo de la

fitorremediación la constituye el uso de la especie Thlaspi caurulencens en suelos contaminados

con zinc y cadmio (Vázquez et al., 1992).

Introducción

64

� Biorremediación animal: existen animales que actúan como agentes

descontaminantes, ya que pueden desarrollarse en medios con fuerte toxicidad y poseen en su

interior microorganismos capaces de retener los metales pesados.

� Biorremediación microbiana: existe la posibilidad del uso de bacterias con la

propiedad de acumular o metabolizar metales pesados. La utilización de microorganismos que

transforman diferentes compuestos nocivos en otros de menor impacto ambiental ha

experimentado un gran desarrollo reciente. Aunque las bacterias son las más empleadas en el

proceso de biorremediación, también se han empleado otros microorganismos como hongos,

algas y cianobacterias para la degradación de compuestos tóxicos en el suelo.

De entre todos los tipos de contaminantes, los hidrocarburos son los que han mostrado

mejores resultados en la aplicación de la tecnología de la biorremediación (Rosenberg et al.,

1992).

Dado que los productos petrolíferos son mezclas complejas de hidrocarburos y

derivados, la biodegradación es selectiva ya que los microorganismos no degradan por igual las

distintas familias de hidrocarburos (Alexander, 2004).

Después de un proceso de biorremediación pueden quedar concentraciones residuales

de algunos hidrocarburos. Es entonces cuando se plantea la necesidad de revisar que la

concentración de estos hidrocarburos residuales no sea el único criterio para establecer su

descontaminación.

Cuando hablamos de biodegradación microbiana de hidrocarburos nos referimos al

hecho de que los microorganismos pueden crecer a expensas de la utilización de estos

compuestos químicos.

Aunque pueda sorprendernos que un organismo sea capaz de alimentarse a expensas

de compuestos tan extraños para el ser humano como el benceno, naftaleno o el pireno, las

investigaciones llevadas a cabo por geoquímicos y microbiólogos nos ofrecen una explicación.

Observando los sucesos que han ocurrido a lo largo de los tiempos geológicos desde la

formación de la Tierra hasta nuestros días, vemos que los microorganismos están en la Tierra

desde hace más de 3.500 millones de años, mientras que los organismos superiores desde hace

Introducción

65

menos de 1000 millones de años y el hombre desde hace sólo 6 millones de años, un instante a

escala de tiempos geológicos (Solanas, 2009).

5.3.1.- Factores condicionantes de la biorremediación microbiana

Generalmente, en un ambiente con contaminación recurrente o con episodios previos de

contaminación, las poblaciones microbianas autóctonas se habrán seleccionado a favor de la

metabolización del contaminante, el cual puede ser transformado con mayor rapidez que la

materia orgánica húmica del suelo (Viñas, 2005).

Si nos centramos en los genes, la presencia de módulos discretos como los operones y

de elementos móviles como los transposones y los plásmidos, favorecen la adaptación del

microorganismo a agentes contaminantes, permitiéndole desarrollar estrategias para la

obtención de energía de prácticamente cualquier compuesto en condiciones aerobias o

anaerobias, adoptando de este modo vías metabólicas con sistemas enzimáticos especializados

para degradar compuestos complejos (Díaz, 2004).

Principalmente los factores que más influyen en las tasas de biodegradación del petróleo

son los nutrientes y las variables ambientales (Figura 7).

Figura 7: Factores condicionantes en la biorremediación microbiana (Díaz, 2004)

Introducción

66

5.3.1.1.- Nutrientes

Los microorganismos dependen de diversos nutrientes para su supervivencia. A pesar

de que los requerimientos son diferentes en función del tipo de microorganismo de que se trate,

todos necesitan nitrógeno, fósforo y carbono.

En la descomposición del fuel, la fuente de carbono no representa ninguna limitación ya

que proviene de las propias moléculas orgánicas. Existe cierta confusión y conflicto cuando se

analiza la limitación de la biodegradación de petróleo debido a la disponibilidad de nitrógeno y

fósforo en agua de mar. Mientras que un gran número de investigadores han afirmado que se

trata de nutrientes limitantes (Ahn et al., 1998; Head y Swannell, 1999) aunque con distintas

conclusiones acerca de la proporción C / N, C / P necesaria, otros han llegado a la conclusión

opuesta debido a que, cuando se consideran hidrocarburos solubles, la solubilidad de estos es

tan baja que imposibilita que se dé un ratio C / N o C / P desfavorable (Atlas, 1981).

Según Ahn et al. (1998) el naftaleno podría ser tóxico para Pseudomonas putida cuando

no existe una fuente de nitrógeno y/o oxígeno. Estos dos elementos son claves en la

biodegradación del naftaleno y probablemente de otros HAPs, no solamente para el

mantenimiento del metabolismo que conduce a la degradación, sino para la supresión de la

toxicidad que podría ocurrir si el naftaleno no es metabolizado y se acumulase hasta niveles

tóxicos.

La fuente de nitrógeno podría influir en los productos finales o intermedios del

metabolismo del naftaleno. Diferentes fuentes de nitrógeno durante la oxidación del naftaleno

pueden dar lugar a diferencias en la morfología celular, acumulación de ácido salicílico,

evolución de CO2 y producción de un color amarillo en el medio (Aranha y Brown, 1981).

5.3.1.2.- Variables ambientales

Además de estos factores nutricionales existen variables ambientales que influyen en la

degradación de los contaminantes orgánicos, tanto en sistemas terrestres como acuáticos. Estas

variables incluyen la temperatura, pH, salinidad y, en particular, la disponibilidad de oxígeno

(Bauer y Capone, 1985). A continuación se comentan algunas de las condiciones ambientales

Introducción

67

que pueden afectar al crecimiento y, por tanto, a la efectividad del proceso de biodegradación de

los hidrocarburos:

5.3.1.2.1.- Oxígeno

Los pasos iniciales del catabolismo de hidrocarburos alifáticos, cíclicos y aromáticos por

parte de bacterias implican la oxidación del sustrato mediante oxigenasas, las cuales requieren

oxígeno molecular. Normalmente no existen condiciones limitantes en la superficie de la columna

de agua o en las capas superficiales de los ecosistemas bentónicos marinos.

Tradicionalmente se ha considerado que la biodegradación anaeróbica de hidrocarburos

tiene lugar a tasas despreciables y que, por lo tanto, la importancia ecológica es limitada. No

obstante, posteriores investigaciones han puesto de manifiesto la trascendencia de las rutas

catabólicas anaeróbicas en la biorremediación (Leahy y Colwell, 1990).

En el caso concreto de la degradación del naftaleno por Pseudomonas putida G7 se ha

demostrado que la carencia de oxígeno provocaba la muerte de la misma en presencia de

naftaleno (Ahn et al., 1998).

5.3.1.2.2.- Salinidad

Cuando la concentración de sal en las zonas afectadas por un vertido es elevada, la

eliminación de contaminantes con métodos de biorremediación convencionales resulta difícil.

Concentraciones de sal elevadas provocan alteraciones en las membranas de las células,

pueden desnaturalizar los enzimas implicados en el proceso o provocar la desecación osmótica

de las células provocándoles su muerte (Kargi y Dincer, 2000).

El número de estudios que analiza el efecto de la salinidad en la degradación

microbiológica de fueles es escaso, aunque su efecto perjudicial sobre la actividad microbiana sí

ha sido descrito. No obstante, se han obtenido diversos microorganismos capaces de vivir y

mantener las tasas de biodegradación en condiciones de salinidad elevadas (Diaz et al., 2000).

Introducción

68

5.3.1.2.3.- Temperatura

La temperatura es un parámetro fundamental a considerar en la biorremediación in situ,

ya que tanto la biodisponibilidad como la solubilidad de los compuestos más hidrofóbicos

dependen de este parámetro. Un incremento de temperatura provoca un descenso de la

viscosidad y, por tanto, afecta al grado de dispersión y al aumento de las tasas de difusión de los

compuestos orgánicos.

Temperaturas altas incrementan la metabolización de los hidrocarburos normalmente

hasta un máximo entorno a los 30 - 40° C, por encima de la cual la toxicidad de los

hidrocarburos aumenta para la membrana celular (Leahy y Colwell, 1990).

En comparación con los ecosistemas mesofílicos, hay pocos ejemplos de

biorremediación de lugares contaminados sometidos a bajas temperaturas. Se han caracterizado

diversos microorganismos adaptados a las bajas temperaturas capaces de degradar

hidrocarburos. El umbral para una degradación significativa es de 0º C (Siron et al., 1995). De la

misma manera, a temperaturas elevadas, como por ejemplo en las zonas litorales de regiones

semiáridas, también se han encontrado microorganismos termófilos que poseen un determinado

potencial para la conversión de hidrocarburos.

En general, la tasa de degradación decrece cuando baja la temperatura, lo cual se cree

que está relacionado con la disminución de la actividad enzimática (Leahy y Colwell, 1990).

Además, la solubilidad del oxígeno depende de la temperatura y éste, como ya se ha

comentado, es un factor fundamental en la biodegradación aeróbica.

5.3.1.2.4.- pH

Afecta a la solubilidad de muchos compuestos y, por tanto, a la disponibilidad de

productos que pueden afectar a la actividad biológica. El pH óptimo para la actividad del sistema

enzimático naftaleno dioxigenasa, que cataliza el primer paso de la ruta catabólica del naftaleno

es 7. Según Dorn et al., (2003) el catabolismo del naftaleno está influenciado por el pH.

Introducción

69

5.3.1.2.5.- Concentración de sustancias contaminantes

En aquellos casos en los que la concentración de hidrocarburos es demasiado elevada

se produce una reducción en la cantidad de oxígeno y nutrientes disponibles. Esto crea una

situación de estrés para los microorganismos que puede reducir su capacidad para degradar el

fuel.

5.3.1.3.- Características del producto petrolífero

Si bien los microorganismos pueden degradar una parte importante de un crudo de

petróleo, tienen preferencias por algunos hidrocarburos. Los crudos de petróleo están formados,

como se ha comentado anteriormente, por cuatro familias de compuestos o fracciones: los

hidrocarburos alifáticos, los hidrocarburos aromáticos, las resinas y los asfaltenos.

Los microorganismos degradan con facilidad los hidrocarburos lineales de la fracción

alifática, especialmente los que contienen menos de 28 carbonos, aunque se han llegado a

describir biodegradaciones de hidrocarburos de hasta 44 carbonos. Los isoprenoides y los

hidrocarburos cíclicos o nafténicos son degradados más lentamente que los lineales. Respecto a

los hidrocarburos aromáticos, a medida que aumenta el número de anillos y los sustituyentes

alquilo, por tanto su peso molecular, aumenta su resistencia a la biodegradación (Prince, 2005).

Otro aspecto importante relacionado con las características de los productos petrolíferos

es su hidrofobicidad y su facilidad para adsorberse en partículas del suelo como las arcillas o

absorberse en la materia orgánica. Estos fenómenos, así como la difusión en microporos dan

lugar a una disminución de su biodisponibilidad hacia los microorganismos que deben

degradarlos.

5.3.1.4.- Factores relacionados con los microorganismos

Por lo que respecta a los factores relacionados con los microorganismos, se define el

período de aclimatación como aquel tiempo que requieren las poblaciones microbianas

presentes en un emplazamiento para empezar a degradar los contaminantes.

Introducción

70

En este sentido, se conocen distintos factores que pueden disminuir o aumentar este

tiempo pero en términos generales están relacionados con el historial de contaminación del

emplazamiento.

Si la contaminación es remota los microorganismos están muy adaptados a la presencia

de los contaminantes y pueden dar una respuesta rápida a una bioestimulación sin

prácticamente un período de aclimatación. En el caso de contaminaciones accidentales, este

período podría alargarse.

Sin embargo, cabe señalar que en el caso de la contaminación por hidrocarburos, al

tratarse de unos contaminantes prácticamente omnipresentes desde la década de 1860 en que

se construye el primer motor de combustión interna, se ha podido constatar que se encuentran

microorganismos degradadores de hidrocarburos en prácticamente cualquier emplazamiento.

5.3.2- Microorganismos degradadores

En Long Beach (California), aplicaron la biorremediación in situ en suelos contaminados

con aceite diesel mediante el uso de microorganismos autóctonos complementada con la adición

de nutrientes y oxigeno en el suelo (Cunningham y Philp, 2000) e inoculación de una mezcla

enriquecida de consorcios bacterianos previamente extraída del mismo suelo.

Esto permitió encontrar consorcios bacterianos degradadores de hidrocarburos

identificados por secuenciación de genes 16S rDNA, demostrando la presencia de Bacillus

cereus, Bacillus sphaericus, Bacillus fusiformis, Bacillus pumilis, Acinetobacter junii y

Pseudomonas sp. (Téllez y Valderrama, 2000).

Los microorganismos aislados en suelos poseen actividades de peroxidasas y

oxigenasas, que permiten la oxidación de algunas fracciones del petróleo (Rich et al., 2000).

Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos haciéndolos susceptibles a ataques

secundarios y facilitando su conversión a CO2 y H2O (Van Hamme et al., 2000; Torres, 2003).

El suborden Corynebacterineae alberga un gran número de degradadores xenobióticos.

Especies del género Gordonia, Rhodococcus y Mycobacterium son bien conocidas por su

Introducción

71

versatilidad metabólica y capacidad para degradar sustancias químicas peligrosas para el medio

ambiente (Bell et al., 1998; Arenskötter et al., 2004; Larkin et al., 2005).

Las micobacterias son organismos metabólicamente muy versátiles. No solamente

crecen en sustratos comunes tales como azúcares, alcoholes y ácidos orgánicos, sino que

también lo hacen sobre una gran variedad de hidrocarburos, incluyendo los aromáticos y cíclicos.

Además, también degradan hidrocarburos policíclicos aromáticos como el pireno (Heitkamp et

al., 1988a; Heitkamp et al., 1988b) y el fenantreno. Muchas micobacterias crecen sobre

compuestos de carbono simple tales como el metanol y las metilaminas (Kato et al., 1988;

Urakami y Yano, 1989).

Un área de la biotecnología que tiene muchas aplicaciones comerciales utilizando las

micobacterias es la biotransformación de esteroides. Estos procesos incluyen la modificación de

los esteroides y la degradación selectiva de las cadenas de esteroles tales como el colesterol y

el β – sitosterol (Martin, 1984).

El uso de micobacterias en la biorremediación de sedimentos contaminados también

está siendo cada vez más habitual. La adición de cepas de Mycobacterium degradadoras de

pireno en sedimentos mejora las tasas de mineralización de muchos hidrocarburos aromáticos.

Varias cepas de la especie Mycobacterium chlorophenolicum degradan los tri-, tetra-, y

pentaclorofenoles (Apajalahti y Salkinoja-Salonen, 1987; Häggblom et al., 1988). Micobacterias

de rápido crecimiento que degradaban tolueno fueron aisladas de la superficie de rocas en

arroyos contaminados con este compuesto (Tay et al., 1998).

En general, la desventaja de las micobacterias es su baja tasa de crecimiento y sus

bajas actividades catalíticas. Sin embargo, las micobacterias juegan un rol muy importante como

fuentes de interesantes capacidades biocatalíticas.

Uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos no convencionales es

Rhodococcus, un grupo único consistente en microorganismos que presentan una gran

diversidad metabólica, capaz de transformar, biodegradar y utilizar como única fuente de

carbono compuestos hidrófobos (Flavio et al., 1999). Además, son capaces de sobrevivir en

Introducción

72

hábitats contaminados bajo condiciones de inanición (Warhust y Fewson, 1994; Acharya y Desai,

1997)

Las características bioquímicas encontradas en algunas cepas son la producción de poli-

3- hidroxialcanoatos, acumulación de metales pesados y enzimas útiles como la fenilalanina,

deshidrogenasas y endoglucosidasas.

El género Rhodococcus posee una gran variedad de vías metabólicas para la

degradación y modificación de compuestos aromáticos, incluyendo las actividades de di-

oxigenasa y mono-oxigenasa sobre anillos, así como la actividad de ruptura de catecol. Algunas

cepas presentan también la vía del 3-oxoadipato. Lo anterior sumado a su capacidad de

crecimiento en medios con escasos nutrientes, la carencia de un sistema de represión catabólica

y su persistencia ambiental las hacen excelentes candidatas para los tratamientos de

biorremediación (Flavio et al., 1999).

Rhodococcus sp. utiliza el dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de azufre (Matsui et

al., 2002). En México, investigadores del Instituto Mexicano del Petróleo, han aislado cepas de

Rhodococcus de sitios contaminados con petróleo, capaces de desulfurar muestras de diesel.

Otros microorganismos reportados como capaces de utilizar el DBT como fuente de azufre son

los pertenecientes al género Gordonia (Li et al., 2006).

Dentro de las aplicaciones industriales y ambientales, se incluye la producción de ácido

acrílico y acrilamida, conversión de esteroides, biorremediacion de hidrocarburos clorados y

fenoles, a lo que se añade su gran capacidad de degradar hidrocarburos alifaticos halogenados y

numerosos compuestos aromáticos, como los HAPs (Eriksson et al., 2003), evidenciándose que

tanto Rhodococcus rhodochrous como Rhodococcus erythropolis demostraron ser una

excepción, pues la degradación de naftaleno por parte de estos no es significativa, debido a que

la actividad degradadora de HAPs por parte de estos microorganismos se ve regulada por las

proteobacterias del medio afectado (Kästner et al., 1998; Hideki et al., 2000; Carla et al., 2004).

Los hidrocarburos alifáticos y aromáticos son químicamente tóxicos y resistentes a la

degradación biológica. Aunque muchos organismos son capaces de degradar el benceno,

solamente unos pocos Rhodococcus pueden utilizar este substrato (Zaitsev et al., 1993; Rehfuss

y Urban, 2005)

Introducción

73

Muchas especies de Rhodococcus son consideradas buenas biosurfactantes (Blackall y

Marshall, 1988a; Lang y Philp, 1988; Choi et al., 1999). Los Rhodococcus responden a la

presencia de alcanos produciendo biosurfactantes que les ayudan a usar componentes

hidrofóbicos como sustratos (McDonald et al., 1981; Wagner et al., 1983; Kurane et al., 1995).

La versatilidad degradadora del género Rhodococcus puede ser debida a la presencia

de múltiples plásmidos que poseen genes para la degradación de diferentes componentes (Van

der Geize y Dijkhuizen, 2004; Konig et al., 2004). La presencia de múltiples rutas catabólicas y

genes también contribuye a la versatilidad catabólica del género (Larkin et al., 2005).

Mucho menos se ha referenciado sobre las habilidades degradadoras del género

Gordonia, posiblemente porque el taxón fue establecido como tal mucho más tarde que el

género Mycobacterium o el género Rhodococcus.

Los aislados de Gordonia utilizan benceno, tolueno, xileno, pireno, diésteres de eftalato y

alcanos como única fuente de carbono y energía y, además, transforman varios componentes

del sulfato (Kumeer et al., 1999; Kim et al., 2000).

Una de las propiedades más interesantes del género Gordonia es su habilidad para

degradar isoprenos naturales o sintéticos del caucho, así como también diferentes eftalatos

(Chatterjee y Dutta, 2003). Varias cepas de este género desintegran y mineralizan el caucho

natural y los guantes de látex (Linos et al., 1999).

Además, el género Gordonia también se caracteriza por ser un buen degradador de

compuestos tales como el fenol. Un estudio reciente descubre la capacidad degradadora de

Gordonia kroppenstedtii (Kim et al., 2009). Ésta es una especie nueva, aislada de un arroyo

contaminado con fenol, en Corea.

El género Pseudonocardia se caracteriza por tener varias especies con una gran

capacidad degradadora. Así podemos encontrar Pseudonocardia asaccharolytica y

Pseudonocardia sulfidoxydans, dos especies capaces de degradar el dimetil disulfuro (Reichert

et al., 1998); Pseudonocardia benzenivorans, degradadora de benceno (Kämpfer y

Kroppenstedt, 2004); Pseudonocardia chloroethenivorans, capaz de degradar el cloroeteno (Lee

et al., 2004); Pseudonocardia dioxanivorans, degradadora del 1,4-dioxano (Mahendra y Álvarez-

Introducción

74

Cohen, 2005); Pseudonocardia ammonioxydans, capaz de oxidar el amonio (Liu et al., 2006);

Pseudonocardia tetrahydrofuranoxydans, capaz de oxidar tetrahidrofuranos (Kämpfer et al.,

2006) y Pseudonocardia carboxydivorans, capaz de oxidar el monóxido de carbono (Park et al.,

2008).

En cuanto al género Microbacterium encontramos Microbacterium dextranolyticum,

capaz de degradar polisacáridos producidos por bacterias (Yokota et al., 1993) o Microbacterium

hydrocarbonoxydans, capaz de degradar hidrocarburos (Schippers et al., 2005).

5.4.- Biodegradación de fenol y naftaleno

5.4.1- Fenol

Recibe el nombre de fenol, el alcohol monohidroxílico derivado del benceno, además de

todos los compuestos que tengan un radical oxidrílico unido al anillo bencénico. El fenol es

conocido también como ácido fénico o ácido carbólico. Puede sintetizarse mediante la oxidación

parcial del benceno.

El fenol en forma pura es un sólido cristalino de color blanco-incoloro a temperatura

ambiente. Su fórmula química es C6H5OH, y tiene un punto de fusión de 43° C y un punto de

ebullición de 182° C. El fenol es una sustancia manufacturada. El producto comercial es un

líquido. Tiene un olor dulce y alquitranado.

El fenol fue obtenido por Ruge en 1834. Separó del asfalto lo que él llamó ácido

carbólico, nombre con el que se conoció hasta principios de este siglo. En 1914 Meyers y

Bergius, proponen hidrolizar el monoclorobenceno con hidróxido de sodio. Proceso que se

generalizó pocos años después. En 1930, se transforma el proceso de hidrólisis del

monoclorobenceno, obteniéndose el fenol en fase vapor, hidrolizando el monoclorobenceno con

agua, en lo que se conoce como proceso de Rashig-Hooker. Actualmente se obtiene mediante

oxidación de cumeno (isopropil benceno) a hidroperóxido de cumeno, que posteriormente, en

presencia de un ácido, se escinde en fenol y acetona, que se separan por destilación.

El fenol se usa principalmente en la producción de resinas fenólicas. También se usa en

la manufactura de nylon y otras fibras sintéticas. Es muy utilizado en la industria química,

Introducción

75

farmacéutica y clínica como un potente fungicida, bactericida, sanitizante, antiséptico y

desinfectante, también para producir agroquímicos, bisfenol A (materia prima para producir

resinas epoxi y policarbonatos), en el proceso de fabricación de ácido acetilsalicílico (aspirina) y

en preparaciones médicas como enjuagues bucales y pastillas para el dolor de garganta. Los

fenoles son sustancias tóxicas frecuentemente encontradas en los ambientes acuáticos como

resultado de la contaminación a partir de una gran variedad de fuentes (industriales,

biogeoquímicas o degradación de pesticidas, entre otras) (Patterson, 1995).

La alta toxicidad de los compuestos fenólicos ha hecho que la Agencia de Protección

Ambiental de los Estados Unidos de América (USEPA) y la Comunidad Económica Europea, los

consideren como contaminantes prioritarios (Di Corcia et al., 1993; Wild et al., 1993). En tal

sentido, la eliminación de fenoles de las aguas residuales, tanto urbanas como industriales, tiene

gran importancia ambiental.

El tratamiento biológico ha sido utilizado eficientemente en la depuración de aguas

residuales que contienen compuestos orgánicos peligrosos (Brenner et al., 1992; Yoong y Lant,

2001). Si bien los compuestos tóxicos, como el fenol, contribuyen a la inestabilidad de los

sistemas de tratamiento biológico de aguas residuales, estos compuestos también son usados

como fuentes de carbono y energía por ciertos grupos de microorganismos (Yoong y Lant, 2001).

Con este tipo de tratamiento, el fenol es eliminado y convertido en compuestos inocuos de bajo

peso molecular. Sin embargo no es una tarea fácil debido a las propiedades tóxicas que este

compuesto ejerce hacia los microorganismos (Barrios et al., 2006).

En la industria petroquímica, incluso en bajas concentraciones, los compuestos fenólicos

pueden inhibir el crecimiento de microorganismos. Para concentraciones superiores, la

degradación de fenol no se produce por completo, provocando la inhibición o baja eliminación de

nutrientes (Barrios et al., 2006).

La ruta metabólica (Figura 8) típica para la degradación de fenol ocurre mediante la vía

de los derivados del catecol, antes de la división del anillo a través de la oxidación –orto o –meta,

para, posteriormente convertirse en acetaldehido, succinato o piruvato, según la oxidación

seguida (Barrios et al., 2006).

Introducción

76

La degradación de los compuestos fenólicos puede ser llevada a cabo por organismos

procariotas y eucariotas, tanto en condiciones aeróbicas (oxígeno como aceptor final de

electrones) como anaeróbicas (nitrato, sulfato, iones metálicos o dióxido de carbono como

aceptores finales de electrones) (Lovley y Lonergan, 1990).

5.4.2- Naftaleno

El naftaleno es el hidrocarburo aromático policíclico de menor tamaño y mayor

solubilidad. Se trata de un hidrocarburo aromático de bajo peso molecular con dos anillos

bencénicos. Es moderadamente volátil con un punto de ebullición de 218º C y una solubilidad en

agua de 31,7 mg/l a 25º C. (Preuss et al., 2003).

Figura 8: Rutas metabólicas para la degradación del fenol (Barrios et al., 2006)

Introducción

77

El naftaleno es un sólido blanquecino que predomina fundamentalmente en los

combustibles fósiles. Posee un olor fuerte pero no desagradable, es bastante inflamable y

fácilmente evaporable.

Cuando se encuentra expuesto al aire es degradado por la humedad, la luz solar y por

determinadas bacterias. Es insoluble en agua, pero bastante soluble en disolventes orgánicos

como el tolueno y el benceno.

Se obtiene generalmente de la pirólisis de la gasolina o de aceites residuales de la

pirólisis mediante destilación fraccionada. El contenido de naftaleno en el producto asciende

como mínimo al 95%, siendo los componentes restantes impurezas tales como los metilindenos.

El naftaleno y sus derivados metilados (metilnaftalenos) suelen ser los HAPs dominantes

en la mayoría de los fueles y crudos, y también los que antes se pierden por disolución.

Su degradación fue una de las primeras rutas estudiadas (Figura 9), comprobándose

desde el principio que el crecimiento sobre este sustrato permitía aislar salicilato y 1,2-dihidro-

1,2- dihidroxinaftaleno del medio de cultivo. Por inducción secuencial se demostró que ambos

son compuestos intermedios en el metabolismo del naftaleno (Silva et al., 2003). A partir de la

conversión a catecol entran en juego, como en el caso del fenol, las dioxigenasas que permiten

degradar este compuesto y transformarse en acetaldehido, succinato o piruvato, según la

oxidación seguida (Barrios et al., 2006).

Figura 9: Ruta metabólica para la degradación del naftaleno (Atlas et al., 2008)

Introducción

78

5.5.- Gen de la catecol 1,2-dioxigenasa

La presencia de genes catabólicos determina el potencial de biodegradación de las

comunidades microbianas. Por lo tanto, desde un punto de vista práctico, las técnicas

moleculares son necesarias para la identificación y seguimiento de los microorganismos que

intervienen en las muestras de los procesos de biorremediación en ambientes contaminados

(Táncsics et al., 2007).

A través del desarrollo y las aplicaciones de las técnicas moleculares se ha llegado a

una mayor comprensión de los procesos catabólicos de hidrocarburos y, en suma, nuevos

mecanismos catalíticos han sido caracterizados (Van Hamme et al., 2003).

Las rutas de biodegradación aeróbica de compuestos aromáticos tales como el fenol,

naftaleno o benzoato convergen en la escisión del anillo del catecol. La escisión del anillo

aromático está catalizada por dioxigenasas y ocurre mediante la división en orto o meta de este

anillo (Veselý et al., 2007; Min et al., 2009; Matera et al., 2010).

Las dioxigenasas que están implicadas en la ruptura del anillo se subdividen en extradiol

dioxigenasas si la apertura del anillo aromático dihidroxilado se lleva a cabo mediante un

proceso de meta-escisión (entre los carbonos 2 y 3) como es el caso de la catecol 2,3-

dioxigenasa o intradiol dioxigenasas si la apertura del anillo aromático dihidroxilado se lleva a

cabo mediante un proceso de orto-escisión (entre los carbonos 1 y 2) como es el caso de la

catecol 1,2-dioxigenasa (Táncsics et al., 2007).

El gen catA codifica para la catecol 1,2-dioxigenasa y está involucrado en el primer paso

de la catálisis del anillo aromático, llevando a cabo la apertura del anillo mediante un proceso de

orto-escisión. En esta ruptura en orto (Figura 10) interviene el gen catA (que codifica para la

catecol 1,2-dioxigenasa), seguido por el gen catB (que codifica para la cis,cis-muconato

cicloisomerasa) y el gen catC (que codifica para la muconolactona isomerasa), resultando en la

degradación del catecol a β-ketoadipato (Veselý et al., 2007; Shen et al., 2009). Finalmente los

productos intermedios generados entran a formar parte del ciclo del citrato (Veselý et al., 2007).

Introducción

79

Figura 10: Degradación del catecol mediante la escisión orto del anillo aromático (Shen et al., 2009)

OBJETIVOS

Objetivos

83

La depuración de aguas residuales por el sistema de fangos activos es un proceso

biotecnológico donde intervienen multitud de parámetros operacionales, todos ellos

interrelacionados. Tradicionalmente se han controlado los parámetros fisico-químicos como si de

un sistema inerte se tratara, aunque actualmente se conoce el papel crucial que realizan los

microorganismos.

Según se ha explicado en la introducción, el crecimiento indeseado de actinomicetos

filamentosos que contienen ácidos micólicos puede interferir seriamente en el funcionamiento

correcto del sistema de fangos activos. En muchas plantas de tratamiento europeas, australianas

y americanas se han estudiado con detalle estos microorganismos. En las plantas de tratamiento

españolas no existe ningún estudio que vaya más allá de la observación microscópica de la

muestra de fango activo.

Por ello, es importante conocer la diversidad de especies que se encuentran en las

plantas de tratamiento y que son potenciales productoras de espumas.

Además, actualmente, generamos gran cantidad de residuos que inevitablemente van a

parar a los ecosistemas que nos rodean. Sin embargo existe muy poca bibliografía acerca de la

capacidad de biodegradación de microorganismos aislados de las EDAR.

Por lo tanto, en el presente trabajo nos planteamos utilizar la taxonomía polifásica para

estudiar la biodiversidad de los actinomicetos productores de espumas, además de estudiar la

capacidad de biodegradación sobre ciertos productos tóxicos. Los objetivos parciales son:

1.- Aislamiento en cultivo puro de actinomicetos de las plantas depuradoras de aguas

residuales domésticas, de las refinerías de petróleo y de las plantas químicas. Se seleccionarán

los aislados más representativos y se caracterizarán morfológicamente.

2.- Caracterización quimiotaxonómica de las cepas mediante la extracción y análisis de

ácidos micólicos, la determinación de los isómeros del ácido diaminopimélico (DAP) y la

extracción de los azúcares predominantes de la pared celular.

Objetivos

84

3.- Identificación a nivel de especie mediante análisis de la secuencia del 16S rDNA, por

medio de la realización de árboles filogenéticos, para establecer las relaciones evolutivas entre

los aislados y realizar el análisis de las matrices de similaridad nucleotídica.

4.- Caracterización fenotípica de las cepas mediante la realización de una serie de tests

fenotípicos.

5.- Realización de estudios de biodegradación de las especies identificadas mediante

taxonomía polifásica para poder dar una solución práctica y real a los problemas ocasionados

por las diferentes sustancias tóxicas.

6.- Detección molecular del gen catecol 1,2-dioxigenasa para determinar qué aislados

poseen el potencial catabólico para degradar hidrocarburos aromáticos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material y Métodos

87

1.- Cepas bacterianas de referencia

Para familiarizarnos con la morfología típica de este tipo de bacterias se utilizaron un

total de 30 cepas de referencia suministradas por la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)

y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ). Las cepas elegidas

incluían las principales especies encontradas en estaciones depuradoras de aguas residuales,

pertenecientes todas ellas al suborden Corynebacterineae.

Entre las cepas del género Gordonia se encuentra la especie Gordonia amarae que es la

especie aislada con más frecuencia en muestras de espumas. De los géneros Nocardia y

Rhodococcus se incluyen las especies patógenas Nocardia asteroides y Rhodococcus equi. En

la tabla 7 se muestra la relación de cepas de referencia utilizadas.

Tabla 7: Microorganismos de referencia utilizados

Cepa Número de la colección* Cepa Número de la colección*

Corynebacterium xerosis CECT 4160 Nocardia farcinica CECT 3053 Dietzia maris CECT 4617 Nocardia nova CECT 3056

Gordonia alkanivorans CECT 7017 Nocardia soli CECT 3375 Gordonia amarae CECT 5704 Rhodococcus aetherivorans DSMZ 44752 Gordonia defluvii DSMZ 44981 Rhodococcus coprophilus CECT 5751 Gordonia hirsuta CECT 7018 Rhodococcus equi CECT 555

Gordonia hydrophobica CECT 7021 Rhodococcus erythropolis CECT 3013 Gordonia malaquae DSMZ 45064 Rhodococcus percolatus DSMZ 44240

Gordonia paraffinivorans DSMZ 44604 Rhodococcus phenolicus DSMZ 44812 Gordonia rubropertincta CECT 5393 Rhodococcus pyridinivorans DSMZ 44555

Gordonia terrae CECT 5707 Rhodococcus rhodnii CECT 5750 Mycobacterium phlei CECT 3009 Rhodococcus rhodochrous CECT 5749 Nocardia asteroides CECT 3051 Skermania piniformis CECT 3057 Nocardia brasiliensis CECT 3052 Tsukamurella spumae DSMZ 44113

Nocardia carnea CECT 3374 Williamsia maris DSMZ 45037

*CECT: Colección Española de Cultivos Tipo

*DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

Todas las cepas se incubaron en medio ISP-2 (Anexo 1), en condiciones de aerobiosis,

de 5 a 10 días dependiendo de la cepa. En el caso de Skermania piniformis se utilizó el medio

180 según recomienda la CECT. Esta especie necesita un tiempo de incubación de 20 - 25 días

para obtener colonias visibles.

Material y Métodos

88

Para su almacenamiento se mantuvieron en crioviales con caldo nutritivo con un 20% de

glicerol a - 80º C. Antes de proceder a su congelación, así como después de recuperar una cepa,

se comprobó la pureza del cultivo mediante tinción Gram, para comprobar que no hubiera habido

ningún tipo de contaminación. El estudio previo de estas cepas de referencia, tanto a nivel

macroscópico como a nivel microscópico, facilitó la posterior caracterización morfológica de los

aislados estudiados en este trabajo.

2.- Caracterización de muestras de fangos activos

2.1.- Toma de muestras y aislamiento

La toma de muestras fue realizada por el propio personal de las plantas. Se tomaron

muestras de las espumas del reactor biológico en recipientes estériles y se enviaron al

laboratorio donde se guardaron en refrigeración a 4º C y se procesaron dentro de las 48 horas

siguientes. Todas las plantas estudiadas realizan el proceso basado en el sistema de fangos

activos.

Para realizar el aislamiento se utilizaron 3 medios de cultivo diferentes para aumentar la

diversidad. Estos 3 medios fueron el medio Sauton, el medio Czapeck modificado y el medio

GYEA (Anexo 1). Una vez recibidas las muestras se procesaron realizando una serie de

diluciones seriadas para rebajar la carga microbiana y poder seleccionar posteriormente, de

forma mucho más clara, los aislados que más nos interesaban.

Una vez sembradas las placas con 0.1 ml de cada dilución se dejaron en estufa a 28º C

durante 7 - 21 días. Transcurrido este tiempo se procedió a elegir los aislados que fueran lo más

representativos posibles seleccionando aquellos que presentaron mayor diversidad morfológica y

una mayor abundancia.

Estos aislados se sembraron nuevamente, pero esta vez en medio ISP-2, y se volvieron

a introducir en estufa a 28º C durante 7 - 21 días. Este paso se realizó un mínimo de 3 veces

hasta que se obtuvo un cultivo puro y sin ningún tipo de contaminación.

Material y Métodos

89

A continuación, en la tabla 8 se muestran las plantas estudiadas en el presente trabajo y

los aislados obtenidos.

Tabla 8: Aislados obtenidos

En total se estudiaron 28 plantas depuradoras de aguas residuales pertenecientes a las

provincias de Alicante, Cádiz, Castellón, Huelva y Valencia. Cuatro de ellas, las pertenecientes a

las provincias de Cádiz y Huelva, eran depuradoras de aguas residuales industriales

pertenecientes al sector petroquímico.

EDAR Fecha Aislados Alcoy 2004 P54 Algemesí 2004 P145 Algorós 2004 P152 Benidorm 2004 P72 Benissa 2004 P108 Camp de Turia 2004 P135 Carcaixent 2004 E9

Carraixet 2008 - 2009 Ca3.1, Ca7.2, Ca9.1, Ca10.1, Ca16.1, Ca17.1, Ca19.1, Ca20.2, Ca21.1, Ca22.2, Ca27.1

Castellón 2005 / 2009

N16-9, CS1.1, CS3.1, CS5.1, CS6.1, CS6.2, CS7.1, CS8.1, CS8.2, CS9.1, CS9.2, CS10.1, CS10.2, CS10.3, CS11.1, CS11.2, CS12.1, CS12.2, CS12.3, CS13.1, CS16.1, CS16.2, CS17.1, CS17.3, CS18.1, CS18.2, CS18.3, CS19.2, CS20.1, CS20.2, CS20.3, CS20.4, CS21.3, CS21.4, CS24.2, CS25.1, CS26.1, CS26.2, CS27.1, CS27.2, CS28.1, CS28.3, CS28.4, CS32.1, CS32.2, CS32.3, CS32.4, CS33.1

Denia 2004 / 2009 P158, D1.1, D1.2, D2.1, D2.2, D2.3, D3.2, D6.1, D7.1, D8.1, D8.2, D9.1, D11.1, D11.2, D12.2, D12.3, D13.1, D15.1, D15.2, D16.1, D16.2

Formentera 2005 N4 Jijona 2009 J4.1 Lloc Nou 2005 L2, L10 Mancomunada 2004 P175 Mora dÉbre 2005 N5 Pinedo 2004 / 2009 P48b, P1.1, P1.2, P2.1, P2.2, P2.3

Quart Benáger 2004 / 2009 P26, QB2.1, QB2.2, QB6.1, QB7.1, QB7.2, QB8.1, QB8.2, QB10.1, QB10.2, QB13.1, QB16.1, QB16.2, QB17.2, QB18.1, QB18.2, QB19.1, QB19.2, QB20.1, QB21.1, QB21.2, QB22.1

Rincón de León 2004 P39 Rojales 2005 N1 Torres Torres 2004 P166 Torrevieja 2004 P141 Vall dÚxó 2005 N9-1 Vinalopó 2004 / 2008 P46p, 8V Viver 2005 N17-4 Planta Química 1 2008 C5.1a, C5.1b, C5.6, C5.5a, PA.2, PA.3, PB.1, PB.3, PB.6, PB7, PC4 Refinería 1 2008 C2.1, C2.2, C2.3, R1, R5, LR-4 Planta química 2 2008 CQG-5a Refinería 2 2008 C4.1, C4.5, 54B, RG4-a, RG4-b

Material y Métodos

90

Se obtuvieron un total de 152 aislados, la mayor parte pertenecientes a las depuradoras

de Carraixet, Castellón, Denia y Quart Benáger ya que fue en éstas donde se realizó un estudio

pormenorizado durante todo el año 2009 con recepción de muestras cada 15 días. El resto de

aislados se obtuvo en los años 2004, 2005 y 2008.

2.2.- Caracterización fenotípica basada en características morfológicas

Para cada aislado se realizó una observación macroscópica y una observación

microscópica. Con esto se comprobó que los resultados obtenidos coincidieran con el trabajo

previo realizado. La observación macroscópica se fundamenta en el aspecto de las colonias

aisladas: dimensión, color, contorno regular o irregular, textura, superficie lisa o rugosa,

opacidad, color reverso, consistencia…etcétera. Además, se efectuó la prueba de la catalasa

para comprobar que fueran catalasa positivos.

Para la observación microscópica se realizó una tinción Gram para comprobar que

tuvieran una morfología típicamente nocardioforme. La microscopía directa está basada en que

determinados grupos de mycolata tienen una morfología peculiar que se puede utilizar para

identificarlos:

� Morfología cocobacilar irregular: ausencia de ramificaciones o muy escasas

ramificaciones.

� Morfología GALO (Gordonia amarae-Like-Organism): presenta ramificaciones en

ángulo recto producidas por especies de Gordonia y de Nocardia.

� Morfología PTLO (Pine-Tree-Like-Organism): presenta ramificaciones en ángulo

agudo para el caso de Skermania.

2.3.- Caracterización quimiotaxonómica

Para esta caracterización se llevaron a cabo tres pruebas fundamentales:

� Extracción y análisis de ácidos micólicos.

Material y Métodos

91

� Determinación de los isómeros del ácido diaminopimélico (DAP).

� Extracción y análisis de los azúcares predominantes de la pared celular (WCS).

Estos tres marcadores quimiotaxonómicos son los que mejor definen al grupo de los

mycolata.

2.3.1.- Extracción y análisis de ácidos micólicos

2.3.1.1.- Materiales

Para realizar este análisis se preparó previamente:

� TBAH (hidróxido de tetrabutil amonio): al 5%, mediante la dilución, con agua

destilada y estéril, de TBAH al 40%.

� Ácido molibdofosfórico: al 5%, mediante la dilución de ácido molibdofosfórico al 10%

con etanol absoluto. La solución adquiere un color verdoso. Es necesario mantener a 4º C.

En el ensayo se empleó una placa de celulosa TLC de 20x20 cm (Merck 1.05554).

2.3.1.2.- Metodología

La detección de ácidos micólicos se ha realizado siguiendo el método propuesto por

Hamid et al. (1993). En primer lugar se añadió, en criotubos de 2 ml., 1000 µl de TBAH y

aproximadamente 100 mg de perlas de vidrio (<106 µ). Posteriormente, a partir de los cultivos en

ISP-2 de los actinomicetos, se agregó un asa de siembra de cada muestra a cada criotubo y, tras

agitar en vórtex durante 30 segundos como mínimo, se incubaron en termoblock a 100º C

durante 4 horas.

Tras las 4 horas de incubación, los criotubos se centrifugaron a 4000 rpm durante 5

minutos. Seguidamente se transfirió el sobrenadante a un nuevo criotubo, al que se le añadió 1

ml de diclorometano y 25 µl de yodometano (todo ello se realizó en la cámara de extracción de

gases) para, posteriormente, homogeneizarlo en un tuborotador a 40 rpm durante 30 minutos.

Material y Métodos

92

Pasados estos 30 minutos, se centrifugó a 2000 rpm durante 3 minutos y se transfirió la capa

inferior a un nuevo tubo eppendorf. Esos tubos eppendorf se depositaron en termoblock a una

temperatura constante de 55º C hasta que estuvieron completamente secos y, seguidamente, se

redisolvieron con 75 µl de éter de petróleo. Una vez preparadas las muestras se procedió a

aplicar 5 µl de cada una de ellas en una placa de celulosa.

Esta placa de celulosa se colocó en una cubeta de vidrio que contenía éter de petróleo y

acetona (95:5) y se mantuvo allí hasta que el frente estuvo aproximadamente a 1 cm del final de

la placa. A continuación se dejó secar la placa y se pulverizó, en la cámara extractora de gases,

con ácido molibdofosfórico al 5%. Finalmente se incubó en estufa a 100º C durante 5 - 10

minutos y se procedió a su lectura.

2.3.2.- Determinación de los isómeros del ácido diaminopimélico (DAP)


Para realizar esta prueba se tuvo que preparar anteriormente:

� 50 ml de sistema disolvente: añadiendo 33,3 ml de metanol, 11 ml de agua destilada y

esterilizada, 1,6 ml de HCl 6N y 4,1 ml de piridina. La mezcla se conservó a 4º C en cámara

frigorífica hasta su utilización.

� 100 ml de control: disolviendo 0,0019 g del patrón de DAP (Sigma) en 10 ml de agua

destilada y esterilizada.

En el ensayo se empleó una placa de celulosa TLC de 20x20 cm (Merck 1.05716).


La detección de la presencia de ácido diaminopimélico (DAP) y la identificación de sus

isómeros es uno de los procedimientos más utilizados para bacterias Gram-positivas del grupo

de los actinomicetos.

Material y Métodos

93

El principal componente de la pared celular en las bacterias Gram-positivas es el

peptidoglicano, que puede contener uno de los isómeros del DAP, estos son, L-DAP o meso-

DAP. Estos isómeros pueden ser determinados por análisis del hidrolizado ácido de la célula

total y separación por cromatografía en capa fina (Staneck y Roberts, 1974).

Para llevar a cabo dicha determinación, en primer lugar, se añadieron 500 µl de HCl 6N a

criotubos de 2 ml conteniendo aproximadamente 100 mg de perlas de vidrio (<106 µ). A

continuación, y a partir de los cultivos en ISP-2 de los actinomicetos, se añadió un asa de

siembra de cada una de las cepas a cada criotubo y, tras agitar en vórtex durante 6 minutos, se

incubaron en termoblock a 100º C durante 4 horas.

Transcurridas las 4 horas de incubación, los criotubos se centrifugaron a 4000 rpm durante

5 minutos y se transfirió el sobrenadante a nuevos tubos eppendorf. Estos eppendorf se

incubaron en termoblock a 100º C hasta el secado del sobrenadante y, una vez seco, se

añadieron 500 µl de agua destilada estéril, resuspendiendo la mezcla mediante vórtex. De

nuevo, se centrifugaron las muestras durante 5 minutos a 4000 rpm y se transfirió el

sobrenadante a nuevos tubos eppendorf, que se llevaron a incubar a 100º C hasta que el

sobrenadante se secó por completo. Transcurrido el tiempo necesario para su secado, se

redisolvió con 75 µl de agua destilada. Una vez preparadas las muestras, se procedió a aplicar 3

µl de cada una de ellas y 1 µl del control en la placa de celulosa.

Realizado esto, la placa se colocó en una cubeta de vidrio conteniendo 50 ml del sistema

disolvente previamente preparado y se mantuvo allí durante 5 horas. Al cabo de esas 5 horas se

dejó secar la placa y se pulverizó, en la cámara extractora de gases, con ninidrina en acetona al

0,2%. A continuación, se incubó en estufa a 100º C durante 5 - 10 minutos y se procedió a su

lectura.

2.3.3.- Extracción y análisis de los azúcares predominantes de la pared celular


Para realizar esta prueba se preparó anteriormente:

Material y Métodos

94

� Reactivo de eftalato de anilina: se preparó con 3,25 g de ácido eftálico, que se

añadieron a 100 ml de agua saturada en butanol y 2 ml de anilina. Se mantuvo a 4º C en cámara

frigorífica hasta su utilización.

� Agua saturada en butanol: se añadieron agua y n-butanol en una proporción de 1:1.

� Azúcar estándar en piridina al 1%: en nuestro caso arabinosa y galactosa.

En el ensayo se utilizó una placa de celulosa TLC de 10x20 cm (Merck 1.05552).


El estudio de los constituyentes mayoritarios de la pared celular de los actinomicetos tiene

una importancia taxonómica considerable. Es por ello por lo que consideramos que esta prueba

es fundamental. Para llevarla a cabo se utilizó el protocolo propuesto por Hasegawa et al., 1983.

En primer lugar se añadieron 0,1 ml de HCl 0,25N a cada criotubo. Posteriormente, y a

partir de los cultivos puros de cada cepa, se añadió media asa de siembra a cada criotubo y se

autoclavaron durante 15 minutos a 121º C.

Después de dejar enfriar a temperatura ambiente se añadieron, a la placa de celulosa

TLC, 1 µl de la preparación estándar de los azúcares (arabinosa y galactosa) y 3 µl de cada

muestra.

Hecho esto, la placa se introdujo en una cubeta de vidrio conteniendo 10 n-butanol : 6 H2O

: 6 piridina : 1 tolueno y se dejó desarrollar hasta que el frente estuvo a 1 cm del final de la placa.

Posteriormente, se dejó secar fuera de la cubeta y se metió de nuevo en la cubeta durante 2

horas aproximadamente.

Una vez transcurridas esas 2 horas se dejó secar la placa fuera de la cubeta y se roció, en

la cámara extractora de gases, con el reactivo de eftalato de anilina. A continuación se incubó en

estufa a 100º C durante 4 minutos y se procedió a su lectura.

Material y Métodos

95

2.4.- Caracterización genotípica

Para ello, partiendo de un cultivo puro de cada una de las cepas, se procedió a la

extracción del DNA mediante el protocolo del CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium Bromide).

Además se utilizó un kit de extracción comercial (Sigma) siguiendo las instrucciones del

fabricante. El DNA extraído de las muestras fue amplificado mediante PCR (Reacción en Cadena

de la Polimerasa) utilizando los iniciadores específicos (Lane, 1991):

� 27f (5ÁGAGTTTGATCMTGGCTCAG, siendo M = C, A)

� 1492r (5´TACGGYTACCTTGTTACGACTT, siendo Y = C, T)

Finalmente, los productos obtenidos de la PCR se purificaron y secuenciaron para,

posteriormente, analizar la secuencia e identificar cada cepa a nivel de especie.

2.4.1.- Extracción de DNA. Protocolo del CTAB

Los nocardioformes filamentosos forman agrupaciones de hifas fuertemente unidas que

es necesario disgregar para conseguir rendimientos adecuados en la extracción de DNA.

Además, muchas especies crecen fuertemente adheridas al agar debido al micelio de sustrato

que producen. En este caso las cepas se cultivan en medio líquido en agitación a 28º C durante

3-5 días, se recogen las células por centrifugación, se lavan y se homogeneizan en tampón TE

(Tris-HCl 10mM, EDTA 1 mM) en un tubo de vidrio con tapón de rosca con perlas de vidrio para

deshacer agregados de hifas. Estas células se someten a dos pasos de congelación para ayudar

a romper la pared.

En las cepas que no forman micelio y que no se adhieren al agar se puede suspender

las células directamente del medio sólido en tampón TE sin perlas de vidrio.

Una vez suspendidas en 500 µl de tampón TE, las células se lisaron añadiendo 100 µl

de lisozima (50 mg/ml) y se incubaron durante 1 hora a 37º C, agitando cada 5 - 10 minutos en

vórtex para deshacer agregados y facilitar la acción de la lisozima. Posteriormente, se añadieron

30 µl de dodecil sulfato sódico (SDS) al 10% y 3 µl de proteinasa K (20 mg/ml). Los tubos

eppendorf se agitaron e incubaron nuevamente, esta vez durante 30 minutos a 37º C.

Material y Métodos

96

Pasado este tiempo se añadieron 100 µl de NaCl 5 M, se agitó y se añadieron 80 µl de

una solución de CTAB/NaCl (CTAB 10% en NaCl 0.7M), se agitaron bien en vórtex y se

incubaron a 65º C durante 10 minutos.

La purificación del DNA se realizó añadiendo un volumen de 700 µl de

fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), agitando y centrifugando a 12000 rpm durante 5

minutos para eliminar los complejos formados por el CTAB. El sobrenadante se transfirió a un

nuevo tubo eppendorf y se añadió un volumen de 700 µl de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1).

Se agitó la muestra y se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos de

complejos con el CTAB (proteínas y polisacáridos).

A continuación, el sobrenadante, que contiene los ácidos nucleicos, se transfirió a otro

tubo eppendorf y se adicionó el mismo volumen de isopropanol frío para precipitar el DNA. El

DNA precipitado se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos para eliminar el isopropanol y se

lavó el precipitado con 500 µl de etanol frío al 70%, agitando suavemente. Finalmente, se

centrifugó para eliminar el etanol, se secó en una secadora de vacío durante 15 minutos y se

resuspendió en 50 µl de tampón TE. Para eliminar los restos de RNA extraído se añadió 1 µl de

RNAsa (25 mg/ml). Las muestras se conservaron a 4º C durante 24 horas, tras las cuales se

realizó un gel de comprobación de la extracción.

2.4.2.- Electroforesis en gel de agarosa

Para comprobar la adecuada extracción del DNA se analizaron las muestras (3 µl de

cada una de ellas) mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% en tampón TAE 1X. Para

ello se añadió 1,2 g de agarosa en 100 ml de TAE 1X, preparado a partir de la adición de 20 ml

de TAE 50X (48,9 g de Tris base, 7,44 g de Na2EDTA· 2H2O y 1,42 ml de ácido acético glacial a

1000 ml de agua MiliQ, ajustando el pH a 8,5) y 980 ml de agua MiliQ.

Una vez solidificado el gel, se procedió a cargarlo con los 3 µl de cada muestra, a los

que anteriormente se mezclaron un tampón de carga. Además, se debe disponer en los

extremos del gel un marcador que, en nuestro caso, es de 100 pb. Una vez cargado el gel, se le

somete a un voltaje de 90 V durante 45 minutos. Los fragmentos de DNA se visualizaron con un

transiluminador de UV tras teñirlos con bromuro de etidio. Finalmente, las muestras se

conservaron a - 20º C hasta su utilización.

Material y Métodos

97

2.4.3.- Amplificación por PCR

La amplificación del 16S rDNA se realizó mediante PCR, utilizando los iniciadores 27f y

1492r (Lane, 1991). La reacción se realizó en un volumen total de 50 µl, conteniendo 1.5 µM de

MgCl2, 0.2 mM de dNTPs (mezcla equimolar de los cuatro nucleótidos), 0.4 µM de cada iniciador,

1.25 U del enzima Taq polimerasa (Ecogen) con su correspondiente tampón y 3 µl de DNA. En

cada reacción de amplificación se incluyó un control negativo en el que el DNA se sustituyó por

agua estéril.

A continuación, se realizó la reacción de amplificación (Tabla 9) que comienza con una

fase inicial de desnaturalización (95º C, durante 5 minutos), seguida de 35 ciclos compuestos por

la desnaturalización (95º C, durante 1 minuto), la unión de iniciadores (55º C, durante 1 minuto) y

la elongación (72º C, durante 1 minuto). Por último, se produce un ciclo final de extensión (72º C,

durante 10 minutos).

El DNA amplificado por la PCR (8 µl) se visualizó mediante electroforesis en gel de

agarosa del modo descrito anteriormente.

Tabla 9: Ciclos de la reacción de amplificación de la PCR para el gen 16S rDNA

1 ciclo 95º C 5 min. Desnaturalización

95º C 1 min. Desnaturalización

35 ciclos 55º C 1 min. Unión de iniciadores

72º C 1 min. Elongación

1 ciclo 72º C 10 min. Extensión

2.4.4.- Purificación del DNA

El 16S rDNA obtenido tras la PCR se purificó utilizando el kit de purificación GenElute

(Sigma), siguiendo las indicaciones del fabricante. A continuación, los productos purificados

(3 µl) se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa del modo descrito anteriormente.

Material y Métodos

98

2.4.5.- Obtención y análisis de las secuencias del 16S rDNA

La secuenciación de los productos obtenidos tras la PCR fue realizada en el Laboratorio

de Secuenciación del IBMCP (Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas) de la

Universitat Politècnica de València (UPV). Para la realización de las reacciones de secuenciación

se utilizó el kit ABI PRISM® Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction (versión 3.1).

Estas reacciones fueron sometidas a electroforesis capilar en un secuenciador automático

“Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer”.

La secuencia de bases de cada fragmento, con una longitud aproximada de 600 a 700

nucleótidos, se obtuvo en un archivo de texto electrónico desde el electroferograma mediante la

aplicación científica CHROMAS (versión 1.43). Las secuencias del 16S rDNA fueron

ensambladas manualmente, utilizando el programa informático PHYDIT, a partir de la

combinación de fragmentos separados generados con los iniciadores 27f y 1492r que amplifican

el segmento 16S en sentidos opuestos. Los segmentos inicial y final (alrededor de 25 nucleótidos

de longitud) de cada secuencia parcial, debido a que suelen presentar una baja fiabilidad, fueron

eliminados antes de ensamblar la secuencia completa. Las secuencias parcialmente alineadas

se unieron para generar una secuencia completa del gen del 16S rDNA.

La probable identidad de cada una de las cepas secuenciadas se determinó mediante la

herramienta informática BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponible en Internet a

partir del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Jones, 2006).

2.4.6.- Árboles filogenéticos

A partir de las secuencias se obtienen los árboles filogenéticos de cada género, para así

poder caracterizar mejor cada especie encontrada. Como se ha comentado anteriormente, lo que

nos aporta el BLAST (Basic Local Alignment Tool) es la posible identidad, con un alto porcentaje

de validez, de cada cepa secuenciada.

Para realizar dichos árboles filogenéticos se utilizó el programa informático PHYDIT y,

dentro de él, la herramienta llamada CLUSTAL X. Previamente se seleccionaron las especies

validadas de cada género (Euzéby, 2011) y se obtuvo la secuencia del 16S rDNA de cada

especie en el banco de datos del NCBI. Posteriormente se escogieron las especies tipo de cada

Material y Métodos

99

género del suborden Corynebacterineae. Por último, se escogió una especie alejada de ellas que

sirviera como raíz para así poder dar validez al árbol filogenético.

Una vez realizado esto, se procedió a generar los árboles filogenéticos mediante la

herramienta PHYDIT package (Chun, 1995). Primero se dedujeron los árboles usando el método

del algoritmo Neighbour-Joining. Posteriormente se evaluaron por el análisis del “bootstrap”

(Felsenstein, 1993) utilizando el método del Neighbour-Joining (Saitou y Nei, 1987). Por último,

se utilizó el programa informático TREECONW para generar los árboles filogenéticos.

2.4.7.- Matrices de similaridad

Una vez realizados los árboles filogenéticos se procede a confeccionar las matrices de

similaridad que indican el porcentaje de similaridad que existe entre las cepas aisladas y las

cepas más representativas que componen el árbol filogenético. Las matrices de similaridad se

realizan mediante el programa informático PHYDIT, utilizando la herramienta Sim Table.

2.5.- Caracterización fenotípica basada en características metabólicas

Se han realizado una serie de test fenotípicos, basados en la degradación de diversos

compuestos, crecimientos en diferentes fuentes de carbono y crecimientos en diferentes fuentes

de carbono y nitrógeno. Además se realizaron tests de tolerancia para comprobar los

crecimientos a diferentes temperaturas.

2.5.1.- Crecimiento a diferentes temperaturas

En este test fenotípico se realizó la siembra de las cepas en medio GYEA (Anexo 1) y se

incubaron a 10º C, 28º C (control) y 37º C. Las placas a 28º C y 37º C se examinaron a los 7 y 14

días, mientras que las placas incubadas a 10º C se examinaron a las 4 semanas. El crecimiento

en las placas indicaba un resultado positivo.

La nomenclatura que se utilizó fue: - para describir que no hay crecimiento, + para

describir que existe un crecimiento bajo, ++ para un crecimiento medio y +++ para un

crecimiento alto, todo ello tomando como referencia las cepas incubadas a 28º C.

Material y Métodos

100

2.5.2.- Pigmentación de colonias

La pigmentación de las colonias se determinó observando las placas utilizadas para el

examen morfológico. Para determinar los colores se utilizaron los métodos propuestos por

Shirling y Gottlieb (1966).

2.5.3.- Actividades metabólicas

2.5.3.1.- Esculina

La hidrólisis de la esculina se determinó en el medio basal de Williams (Anexo 1). Para

ello se suplementó este medio con esculina (0.1%). Todo ello se vertió en placas, las cuales se

inocularon con las cepas a estudiar. Posteriormente cada una de ellas fue examinada después

de 7 y 14 días. Si el medio se ennegrecía indicaba un resultado positivo.

2.5.3.2.- L- Tirosina

Este test se realizó utilizando el medio GYEA al que se le añadió L-Tirosina (0.5%).

Después de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y

21 días, indicando un resultado positivo la presencia de halos en las placas.

2.5.3.3.- Nitratos

Para la reducción de nitratos se utiliza como medio de cultivo el agua de peptona nitrato,

que se distribuye en tubos con campana Durham. Se inocula el microorganismo y se incuba a

28º C durante 2-7 días. Los resultados se leen añadiendo a los tubos 1 ml de los reactivos I y II

de Griess-Ilosvay. La presencia de nitrito se manifiesta por el desarrollo de un color rojo en el

plazo de unos minutos. La presencia de gas en la campana de Durham indica la formación de

nitrógeno gaseoso y, por tanto, la completa reducción del nitrato.

Material y Métodos

101

2.5.3.4.- Urea

Para realizar este test, las colonias se siembran en el medio Urea Agar Base. Se

mantienen en estufa a 28º C durante 2 semanas aproximadamente. Los microorganismos que

hidrolizan la urea producen iones amonio que viran el medio a rojo.

2.5.4.- Uso de fuentes de carbono (1%): azúcares

Para estas pruebas se realizó un control positivo que consistió en incubar las cepas en

medio GYEA a 28º C durante 7, 14 y 21 días.

2.5.4.1.- D+Lactosa

Este test se realizó utilizando el medio Stevenson (Anexo 1) al que se le añadió D-

Lactosa (1%). Después de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se

examinaron a los 7, 14 y 21 días, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor

o igual que en la placa de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento

es menor que en las placas de control positivo GYEA.

2.5.4.2.- D+Maltosa

Este test se realizó utilizando el medio Stevenson al que se le añadió D+Maltosa (1%).


21 días, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa

de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las

placas de control positivo GYEA.

2.5.4.3.- D-Arabinosa

Para realizar este test se utilizó el medio Stevenson al que se le añadió D-Arabinosa

(1%). Después de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los

7, 14 y 21 días, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la

placa de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en

las placas de control positivo GYEA.

Material y Métodos

102

2.5.4.4.- D+Fructosa

Este test utilizó el medio Stevenson al que se le añadió D+Fructosa (1%). Después de

verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 días,

indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa de control

positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las placas de

control positivo GYEA.

2.5.4.5.- D-Galactosa

Para realizar este test se utilizó el medio Stevenson al que se le añadió D-Galactosa





2.5.4.6.- D-Glucosa

Este test utilizó el medio Stevenson al que se le añadió D-Glucosa (1%). Después de





2.5.4.7.- D-Manitol

Este test utilizó el medio Stevenson al que se le añadió D-Manitol (1%). Después de





Material y Métodos

103

2.5.4.8.- meso-inositol

Para realizar este test se utilizó el medio Stevenson al que se le añadió meso-inositol





2.5.5.- Uso de fuentes de carbono y nitrógeno (0.1%): aminoácidos

Para estas pruebas se realizó un control positivo que consistió en incubar las cepas en

medio GYEA a 28º C durante 7, 14 y 21 días.

2.5.5.1.- L-Alanina

En este test se utilizó el medio Stevenson al que se le añadió L-Alanina (0.1%).


21 días, indicando un resultado positivo cuando el crecimiento es mayor o igual que en la placa

de control positivo GYEA y un resultado negativo cuando el crecimiento es menor que en las

placas de control positivo GYEA.

2.5.5.2.- L-Histidina

Para realizar este test se utilizó el medio Stevenson al que se le añadió L-Histidina

(0.1%). Después de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los




2.5.5.3.- L-Prolina

En este test se utilizó el medio Stevenson al que se le añadió L-Prolina (0.1%). Después

de verter el medio en las placas e inocularlo con las cepas, se examinaron a los 7, 14 y 21 días,


Material y Métodos

104



3.- Biodegradación de compuestos derivados del petróleo

3.1.- Ensayos biodegradación

Antes de realizar los ensayos de biodegradación del fenol y del naftaleno, a fin de

aumentar la capacidad de éxito de los mismos, se efectúa una revisión bibliográfica de los

medios de cultivo minerales utilizados con anterioridad por otros investigadores en dicho tipo de

ensayos. Los medios seleccionados fueron el M9, el BHM y el MSM (Anexo 1) (Rehfuss et al.,

2005; Okoh et al., 2006; y Auffret et al., 2009).

En primer lugar se realiza un cultivo de aclimatación previa de los microorganismos a

estos tres medios de cultivo que mejore su posterior siembra en los mismos medios

suplementados con los diferentes compuestos tóxicos. Este es un paso fundamental ya que, si

sembráramos directamente los microorganismos, se podrían producir inhibiciones en el

crecimiento al pasar de un medio rico en nutrientes, como es el medio ISP2, a cualquiera de los

medios elegidos que no son tan ricos en nutrientes. Lo que se hace es sembrar las cepas en

cada medio de cultivo suplementado con glucosa al 0,1% como única fuente de carbono.

La elección del fenol y del naftaleno para los ensayos de biodegradación se debe a que

en las depuradoras donde se obtuvieron las cepas, principalmente las del sector petroquímico,

estos compuestos son los predominantes.

Las cepas, durante el proceso de aclimatación se mantienen durante 14 días a 28º C.

Una vez transcurridos estos 14 días de aclimatación, las cepas se siembran en los tres medios

seleccionados, los cuales se suplementan con fenol al 0,1% y naftaleno al 0,1%.

Se utiliza como control positivo una resiembra en los diferentes medios suplementados

únicamente con glucosa al 0,1%. Seguidamente se incuban a 28º C durante 14 días, tiempo en

el que se realiza una primera lectura, y se dejan durante 7 días más, hasta llegar a los 21 días de

incubación, fecha en la cual se realiza la segunda y definitiva lectura de crecimiento.

Material y Métodos

105

La nomenclatura que se utiliza es la siguiente: - para describir que no hay crecimiento, +

para describir que existe un crecimiento bajo, ++ para un crecimiento medio y +++ para un

crecimiento alto o máximo, similar al que se obtiene en los medios únicamente suplementados

con glucosa.

Por último, se realizaron unos ensayos para comprobar que las cepas estudiadas no

presentaran autotrofía y poder confirmar que los resultados obtenidos en los ensayos de

biodegradación eran válidos.

Para ello se utilizó la misma metodología. Se sembraron las cepas a partir de las placas

de aclimatación en los medios de cultivo elegidos, pero esta vez sin ninguna fuente de carbono

presente. Así se comprueba si los aislados son capaces de crecer en condiciones autótrofas

utilizando el CO2 como fuente de carbono.

3.2.- Detección molecular del gen catecol 1,2-dioxigenasa

La detección del gen catecol 1,2-dioxigenasa se realiza por medio de la amplificación

mediante PCR de dicho gen. En este caso se utilizan los iniciadores C120f y C120r (Shen et al.,

2009).

� C120f (5’ – GGCACCAAGGGCAGCATCGAGGGCCCGTACTAC - 3’)

� C120r (5’ – CAGGTGCAGGTGCGCGGGCCGCCACGGATGGCC – 3’)

La reacción de amplificación (Tabla 10) comienza con una fase inicial de

desnaturalización (95º C, durante 5 minutos), seguida de 30 ciclos compuestos por la

desnaturalización (95º C, durante 30 segundos), la unión de iniciadores (66º C, durante 45

segundos) y la elongación (72º C, durante 1 minuto). Por último, se produce un ciclo final de

extensión (72º C, durante 7 minutos).

La reacción se realizó en un volumen total de 50 µl conteniendo 2 µM de MgCl2, 0.4 mM

de dNTPs (mezcla equimolar de los cuatro nucleótidos), 1 µM de cada iniciador, 0.4 U del

enzima Taq polimerasa (Ecogen) con su correspondiente tampón y 3 µl de DNA. En cada

Material y Métodos

106

reacción de amplificación se incluyó un control negativo en el que el DNA se reemplazó por agua

estéril. El DNA amplificado por la PCR (8 µl) se visualiza mediante electroforesis en gel de

agarosa del modo previamente descrito en el apartado 2.4.2.

Tabla 10: Ciclos de la PCR para el gen catecol 1,2-dioxigenasa (Shen et al., 2009)

1 ciclo 95º C 5 min. Desnaturalización

95º C 30 seg. Desnaturalización

30 ciclos 66º C 45 seg. Unión de iniciadores

72º C 1 min. Elongación

1 ciclo 72º C 7 min. Extensión

En cada reacción de amplificación se incluye el DNA de dos cepas de referencia

(Gordonia amarae, CECT 5704; Gordonia amicalis, DSMZ 44461) suministradas por la Colección

Española de Cultivos Tipo (CECT) y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos

Celulares (DSMZ). Estas cepas se utilizan como control negativo y como control positivo

respectivamente. A su vez, en cada reacción, se dispone de un blanco en el que el DNA se

sustituye por agua estéril.

3.2.1.- Purificación del DNA

Igualmente que en la purificación del 16S rDNA, el DNA obtenido tras la PCR se purificó

utilizando el mismo kit de purificación GenElute (Sigma). Posteriormente, para comprobar la

calidad de los productos purificados (3µl) se visualizaron mediante electroforesis en gel de

agarosa mediante el modo descrito anteriormente.

3.2.2.- Obtención y análisis de las secuencias del gen catA

Una vez purficados los productos de PCR se enviaron, como en el caso de los productos

del 16S rDNA, al Laboratorio de Secuenciación del IBMCP de la Universitat Politècnica de

València. Para la realización de las reacciones de secuenciación se utilizó el mismo kit ABI

PRISM® Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction (versión 3.1) y las reacciones fueron

sometidas a electroforesis capilar en un secuenciador automático “Applied Biosystems 3730xl

DNA Analyzer”.

Material y Métodos

107

Como la secuencia de bases poseía una longitud de aproximadamente 400 bases no

hizo falta el ensamblaje previo de los dos fragmentos (forward y reverse). Simplemente se

eliminaron los segmentos iniciales y finales que poseían mala calidad de secuencia (alrededor de

25 nucleótidos de longitud). Las secuencias se analizaron realizando un BLAST, con lo que se

obtuvo una identificación del gen.


Resultados y Discusión

111

1.- Caracterización de muestras de fangos activos

1.1.- Aislamiento

Se realizaron 189 muestreos en 28 estaciones depuradoras diferentes, obteniéndose un

total de 152 aislados con una gran variablidad morfológica. De estos, 147 pertenecían al

suborden Corynebacterineae, 4 al suborden Pseudonocardineae y 1 al suborden

Micrococcineae. En las figuras 11, 12 y 13 se pueden observar algunas placas donde se

realizaron los aislamientos.

Figura 13: Placa aislado P175

Figura 12: Placa aislado PA.3

Figura 11: Placa aislado CQG-5a


112

1.2.- Caracterización fenotípica basada en características morfológicas

Para realizar la caracterización morfológica se realizó una observación macroscópica

directa en placa y, posteriormente, una observación microscópica mediante tinción Gram.

Además se realizó la prueba de la catalasa. En las tablas 11 y 12 se muestran los resultados

obtenidos:

Tabla 11: Descripción macroscópica de los aislados

Aislado Descripción macroscópica QB2.1 Colonias pequeñas, rugosas, mates y amarillas QB8.1 Colonias pequeñas, rugosas, mates y amarillo pálido P46p Colonias medianas, mucosas, brillantes y naranjas P26 Colonias pequeñas, mucosas, brillantes y naranjas

P39, L10 Colonias pequeñas, rugosas, mates y naranjas QB7.1, QB13.1, QB17.2, QB21.2, QB22.1, J4.1, P1.2, CS3.1, CS6.1, CS8.1, CS8.2, CS9.1, CS9.2, CS12.2, CS16.1, CS18.1, CS20.3, CS21.4, CS24.2, CS25.1,

CS27.1, P152

Colonias medianas, rugosas, mates y amarillo pálido

QB19.1, QB19.2, CS10.3 Colonias pequeñas, rugosas, mates y color ocre CS6.2, CS11.1 Colonias pequeñas, rugosas, mates y naranjas

QB8.2 Colonias pequeñas, rugosas, mates y blancas P158 Colonias medianas, rugosas, mates y color ocre

QB6.1, QB18.2, P2.3, D11.2, D12.3, CS5.1, CS11.2, CS12.1, CS12.3, CS16.2, CS18.2, CS19.2, CS20.4, CS21.3, CS26.1, CS27.2, CS28.1, CS28.4, Ca10.1,

Ca17.1

Colonias pequeñas, rugosas, mates y de color blanco

QB10.1, QB10.2, QB16.1, QB20.1, QB21.1, D8.1, D8.2, CS10.1, CS32.3, Ca22.2

Colonias pequeñas, rugosas, mates y de color amarillo pálido

QB18.1, P2.2, D1.1, D2.2, D7.1, D12.2, D15.1, CS13.1, CS17.3, CS18.3, Ca16.1, P175

Colonias medianas, rugosas, mates y ocres

C2.1, C2.2, LR-4, R1, R5, C5.6 Colonias medianas, rugosas, mates y naranjas D16.1, CS7.1, CS32.4, P54, P141, D11.1 Colonias pequeñas, rugosas, mates y anaranjadas

Ca9.1 Colonias medianas, rugosas, mates y naranjas E9, D13.1, D15.2, CS17.1, CS20.2, CS28.3, CS32.1,

CS32.2, Ca3.1, Ca21.1, P48b Colonias pequeñas, rugosas, mates y de color rosa

Ca19.1, Ca27.1, P108 Colonias pequeñas, lisas, mucosas y naranjas CQG-5a Colonias pequeñas, lisas, mucosas y amarillas

D6.1, D9.1, P72 Colonias pequeñas, lisas, mucosas y amarillas D3.2 Colonias medianas, rugosas, mates y amarillo pálido CS33.1 Colonias pequeñas, rugosas, mates y blancas

C2.3, C5.1a, C5.1b, C4.1, C4.5, PA.2, PB.6, PB.7 Colonias pequeñas, rugosas, mates y ocres RG4-a, RG4-b Colonias pequeñas, lisas, mucosas y amarillas D16.2, Ca7.2 Colonias pequeñas, lisas, mucosas y amarillas

PA.3, PB.1, PB.3, PC.4 Colonias pequeñas, rugosas, mates y blancas 54B, C5.5a, P135 Colonias medianas, lisas, mucosas y naranjas

D1.2 Colonias pequeñas, rugosas, mates y asalmonadas P1.1, P2.1, D2.3, CS26.2, Ca20.2 Colonias medianas, rugosas, mates y ocres

QB7.2, QB16,2, 8V, CS20.1, P145, N1, N4, N5, N9-1, N17-4

Colonias medianas, rugosas, mates y naranjas

CS10.2 Colonias medianas, rugosas, mates y naranjas D2.1, P166, L2 Colonias medianas, rugosas, mates y naranjas QB2.2, N16-9 Colonias medianas, rugosas, mates y naranjas

CS1.1 Colonias pequeñas, lisas, mucosas y asalmonadas


113

Tabla 12: Descripción microscópica de los aislados

Aislado Descripción microscópica QB2.1 Cocos medianos, ovalados y regulares QB8.1 Bacilos pequeños, gruesos y regulares P46p Cocos pequeños redondos y regulares P26 Cocos pequeños, redondos y regulares

P39, L10 Cocos pequeños, ovalados y regulares QB7.1, QB13.1, QB17.2, QB21.2, QB22.1, J4.1, P1.2, CS3.1, CS6.1, CS8.1, CS8.2, CS9.1, CS9.2, CS12.2, CS16.1, CS18.1, CS20.3, CS21.4, CS24.2, CS25.1,

CS27.1, P152

Bacilos ramificados en ángulo recto

QB19.1, QB19.2, CS10.3 Bacilos pequeños, cortos, estrechos y regulares CS6.2, CS11.1 Bacilos pequeños, cortos, estrechos y regulares

QB8.2 Bacilos pequeños, gruesos y regulares P158 Cocobacilos pequeños, estrechos e irregulares

QB6.1, QB18.2, P2.3, D11.2, D12.3, CS5.1, CS11.2, CS12.1, CS12.3, CS16.2, CS18.2, CS19.2, CS20.4, CS21.3, CS26.1, CS27.2, CS28.1, CS28.4, Ca10.1,

Ca17.1

Cocos pequeños, redondos y regulares

QB10.1, QB10.2, QB16.1, QB20.1, QB21.1, D8.1, D8.2, CS10.1, CS32.3, Ca22.2

Bacilos pequeños, cortos, gruesos e irregulares

QB18.1, P2.2, D1.1, D2.2, D7.1, D12.2, D15.1, CS13.1, CS17.3, CS18.3, Ca16.1, P175

Bacilos pequeños, estrechos y regulares

C2.1, C2.2, LR-4, R1, R5, C5.6 Bacilos pequeños, cortos, gruesos y regulares D16.1, CS7.1, CS32.4, P54, P141, D11.1 Bacilos pequeños, gruesos y regulares

Ca9.1 Bacilos pequeños, estrechos y regulares E9, D13.1, D15.2, CS17.1, CS20.2, CS28.3, CS32.1,

CS32.2, Ca3.1, Ca21.1, P48b Cocos pequeños, ovalados y regulares

Ca19.1, Ca27.1, P108 Bacilos pequeños, cortos y regulares CQG-5a Bacilos pequeños, estrechos y regulares

D6.1, D9.1, P72 Cocos pequeños, ovalados e irregulares D3.2 Bacilos pequeños, estrechos y regulares CS33.1 Bacilos pequeños, estrechos y regulares

C2.3, C5.1a, C5.1b, C4.1, C4.5, PA.2, PB.6, PB.7 Bacilos pequeños, estrechos y regulares RG4-a, RG4-b Bacilos pequeños e irregulares D16.2, Ca7.2 Cocos pequeños, redondos y regulares

PA.3, PB.1, PB.3, PC.4 Cocobacilos pequeños, cortos y regulares 54B, C5.5a, P135 Bacilos pequeños, cortos, finos y regulares

D1.2 Cocos pequeños, redondos y regulares P1.1, P2.1, D2.3, CS26.2, Ca20.2 Bacilos pequeños, finos e irregulares

QB7.2, QB16,2, 8V, CS20.1, P145, N1, N4, N5, N9-1, N17-4

Bacilos pequeños, estrechos y regulares

CS10.2 Bacilos pequeños, estrechos, cortos y regulares D2.1, P166, L2 Bacilos pequeños, estrechos y regulares QB2.2, N16-9 Bacilos estrechos, cortos y regulares

CS1.1 Cocos pequeños, ovalados e irregulares


114

En las figuras 14,15 y 16 se observan ejemplos de cepas de diferentes géneros:

Con la tinción Gram se comprobó que todas las cepas estudiadas eran Gram-positivas.

Por último, para la prueba de la catalasa se demostró que todas las cepas estudiadas eran

catalasa positivas.

1.3.- Caracterización quimiotaxonómica

Para realizar esta caracterización se utilizan tres marcadores quimiotaxonómicos que

definen correctamente a los aislados dentro del suborden Corynebacterineae.

En primer lugar se realizó la extracción y análisis de los ácidos micólicos de la pared

celular. Con ello se comprueba su pertenencia al suborden, ya que si no poseen estos ácidos no

se podrían incluir en él. La segunda prueba realizada fue la determinación de los isómeros del

ácido diaminopimélico (DAP). Todas las especies pertenecientes al suborden Corynebacterineae

deben tener la forma meso-DAP. Por último se determinaron los azúcares predominantes de la

pared celular. En nuestro caso se debe obtener un tipo de pared celular IV, siendo los

constituyentes distintivos mayoritarios arabinosa y galactosa.

Figura 14: Rhodococcus ruber (54B)

Figura 15: Mycobacterium smegmatis (PB.6)

Figura 16: Gordonia paraffinivorans (C2.2)


115

A continuación (Tabla 13) se muestran los resultados obtenidos para los tres parámetros

tras la separación cromatográfica en placa de celulosa.

Tabla 13: Resultados pruebas quimiotaxonómicas

Aislado Ácidos micólicos DAP Azúcares predominantes QB2.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB8.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P46p + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P26 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P39 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa L10 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB7.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB13.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB17.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB21.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB22.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa J4.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P1.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS3.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS6.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS8.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS8.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS9.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS9.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS12.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS16.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS18.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS20.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS21.4 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS24.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS25.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS27.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P152 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB19.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB19.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS10.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS6.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS11.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB8.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P158 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB6.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB18.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P2.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D11.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D12.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS5.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS11.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS12.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS12.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS16.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS18.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS19.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS20.4 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa


116

Tabla 13 (continuación): Resultados pruebas quimiotaxonómicas

Aislado Ácidos micólicos DAP Azúcares predominantes CS21.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS26.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS27.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS28.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS28.4 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca10.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca17.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB10.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB10.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB16.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB20.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB21.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D8.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D8.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS10.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS32.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca22.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa E9 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa

QB18.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P2.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D1.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D2.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D7.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D12.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D15.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS13.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS17.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS18.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca16.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P175 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C2.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C2.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa LR-4 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa R1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa R5 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C5.6 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D16.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS7.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS32.4 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P54 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P141 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D11.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca9.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D13.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D15.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS17.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS20.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS28.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Cs32.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS32.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca3.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca21.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P48b + meso-DAP Arabinosa y Galactosa


117

Tabla 13 (continuación): Resultados pruebas quimiotaxonómicas

Aislado Ácidos micólicos DAP Azúcares predominantes Ca19.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca27.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P108 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa

CQG-5a - - - D6.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D9.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P72 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D3.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS33.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C2.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C5.1a + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C5.1b + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C4.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C4.5 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa PA.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa PB.6 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa PB.7 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa RG4-a + meso-DAP Arabinosa y Galactosa RG4-b + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D16.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca7.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa PA.3 - meso-DAP Arabinosa y Galactosa PB.1 - meso-DAP Arabinosa y Galactosa PB.3 - meso-DAP Arabinosa y Galactosa PC.4 - meso-DAP Arabinosa y Galactosa 54B + meso-DAP Arabinosa y Galactosa C5.5a + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P135 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D1.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P1.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P2.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D2.3 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS26.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa Ca20.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB7.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa QB16.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa 8V + meso-DAP Arabinosa y Galactosa

CS20.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P145 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa N1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa N4 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa N5 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa N9-1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa N17-4 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS10.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa D2.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa P166 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa L2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa

QB2.2 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa N16-9 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa CS1.1 + meso-DAP Arabinosa y Galactosa


118

Como se puede observar en la tabla 13, de las 152 cepas estudiadas, 147 de ellas

poseen ácidos micólicos. Las 5 restantes (CQG-5a, PA.3, PB.1, PB.3 y PC.4) pertenecen a

subórdenes diferentes al suborden Corynebacterineae, sin embargo, debido a la abundancia que

mostraron en las placas de aislamiento, así como también a su morfología, se decidió aislarlas y

comprobar sus características quimiotaxonómicas. Se utilizó un sistema de separación

cromatográfica en capa fina (Figuras 17 y 18). El control positivo que se utilizó fue la cepa

Gordonia amarae CECT 5704 y el control negativo fue la cepa Streptomyces albus CECT 3077,

que no posee ácidos micólicos, ambas suministradas por la Colección Española de Cultivos

Tipo.

D3.2 PA.2 54B P135 RG-4b Ca20.2 PA.3 1 2

Ácidos micólicos

Figura 18: Cromatoplaca de ácidos micólicos de los aislados D3.2, PA.2, 54B, P135, RG-4b, Ca20.2 y PA.3. Gordonia amarae (CECT 5704) (1) y Streptomyces albus (CECT 3051) (2).

Ácidos micólicos

QB8.2 D1.1 QB7.2 P2.3 P1.1 N1 N4 N5 N9-1 8V 1 2

Figura 17: Cromatoplaca de ácidos micólicos de los aislados QB8.2, D1.1, QB7.2, P2.3, P1.1, N1, N4, N5, N9-1 y 8V. Gordonia amarae (CECT 5704) (1) y Streptomyces albus (CECT 3051) (2).


119

Tal y como se observa en la tabla 13, de las 152 cepas estudiadas, tan solo 1 no posee

la forma meso-DAP (CQG-5a). En la figura 19 se observa la forma meso-DAP en algunos de los

aislados.

En la determinación de los azúcares se toma como referencia la arabinosa y la

galactosa, ya que son estos azúcares los predominantes en la pared celular de los mycolata.

Como se observa en la tabla 13 todos los aislados contienen arabinosa y galactosa como

azúcares predominantes, a excepción de 1 de ellos (CQG-5a). En la figura 20 se observan los

azúcares de algunos de los aislados, arabinosa (color granate) y galactosa (color verdoso).

← L-DAP ← meso-DAP

1 P26 J4.1 CS7.1 R1 P54 C4.1 C5.5a D2.3 QB2.2 CS1.1 2

Figura 19: Cromatoplaca de isómeros del DAP de los aislados P26, J4.1, CS7.1, R1, P54, C4.1, C5.5a, D2.3, QB2.2 y CS1.1. En los extremos (1 y 2) se observan los patrones de las formas L-DAP y meso-DAP.

Figura 20: Cromatoplaca de los azúcares predominantes de los aislados QB8.1, P39, CS20.4, D9.1, L2 y CS32.1. En los extremos (1, 2, 3 y 4) se observan los patrones de arabinosa y galactosa.

1 2 QB8.1 P39 CS20.4 D9.1 L2 CS32.1 3 4

Galactosa

Arabinosa


120

1.4.- Caracterización genotípica

Para extraer el DNA de las cepas aisladas se empleó el método del CTAB, descrito

previamente, y un kit de extracción (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez

realizada la extracción de DNA, se comprobó la cantidad y calidad del mismo antes de llevar a

cabo la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% (Figura 21). Después de realizar

la separación electroforética, se procedió a la tinción del gel con bromuro de etidio.

La extracción se llevó a cabo con éxito para las 152 cepas aisladas. Posteriormente se

realizó la PCR de cada una de las cepas. Para todas ellas se comprobó el fragmento amplificado

tenía un tamaño aproximado de 1500 pares de bases.

La PCR para cada aislado se realizó por triplicado. Con esto nos asegurábamos la

obtención de un volumen suficiente después del proceso de purificación para, posteriormente,

llevar a cabo con éxito la secuenciación. La detección de los fragmentos amplificados obtenidos

tras la PCR se realizó también mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 22).

Los productos de la PCR se purificaron utilizando el kit de purificación GenElute (Sigma),

siguiendo las indicaciones del fabricante, y se enviaron a secuenciar al Laboratorio de

Secuenciación del IBMCP (Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas) de la Universidad

Politécnica de Valencia (UPV).

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 21: Comprobación extracción DNA. 1: CQG-5a; 2: L10; 3: CS25.1; 4: D7.1; 5: CS27.2; 6: CS32.3; 7: PB.7; 8: PA.3


121

Para la realización de las reacciones de secuenciación se utilizó el kit ABI PRISM® Big

DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction (versión 3.1). Estas reacciones fueron sometidas a

electroforesis capilar en un secuenciador automático “Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer”.

Las secuencias completas, obtenidas con ayuda de los programas informáticos

CHROMAS y PHYDIT, se analizaron mediante el programa BLAST (NCBI) para obtener la

posible identificación a nivel de especie.

Con estos resultados se obtiene una identificación a nivel de género al 100% y una

posible identificación a nivel de especie. Esto es así porque el Blast utiliza un algoritmo muy

rápido pero, a la vez, se pierde exactitud en los alineamientos. Para conseguir una identificación

a nivel de especie es necesario realizar los respectivos árboles filogenéticos y las matrices de

similaridad de nucleótidos.

1.4.1.- Árboles filogenéticos y matrices de similaridad

Los árboles filogenéticos son el resultado del alineamiento de las secuencias del 16S

rDNA de los aislados con las especies validadas de cada género. A partir de ellos se generan las

tablas de similaridad nucleotídica que nos identifican la cepa a nivel de especie.

Figura 22: Gel de PCR con los productos de amplificación del 16S rDNA. 1 y 16: Marcador de peso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: P26; 4: QB17.2; 5: P1.2; 6: D1.1; 7: CS5.1; 8: Ca10.1;

9: RG4b; 10: C2.1; 11: C5.6; 12: C4.5; 13: 54B; 14: CS20.1; 15: N16-9

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1500 pb


122

En la tabla 14 se observan los datos de identificación a nivel de especie con su

respectivo porcentaje de similaridad. Los resultados marcados en verde poseen un porcentaje

menor del 98.70% y los marcados en naranja un porcentaje comprendido entre el 98.70% y el

99%.

De los 152 aislados seleccionados se obtuvieron 9 géneros distintos (Corynebacterium,

Dietzia, Gordonia, Microbacterium, Mycobacterium, Pseudonocardia, Rhodococcus,

Tsukamurella y Williamsia) y 37 especies diferentes:

� Género Corynebacterium: Corynebacterium freneyi y Corynebacterium variabile.

� Género Dietzia: Dietzia cercidiphylli y Dietzia maris.

� Género Gordonia: Gordonia alkanivorans, Gordonia amarae, Gordonia araii, Gordonia

bronchialis, Gordonia cholesterolivorans, Gordonia effusa, Gordonia hirsuta, Gordonia

hydrophobica, Gordonia jacobaea, Gordonia malaquae, Gordonia paraffinivorans, Gordonia

polyisoprenivorans, Gordonia rhizosphera, Gordonia sputi y Gordonia terrae.

� Género Microbacterium: Microbacterium lacus.

� Género Mycobacterium: Mycobacterium astroafricanum, Mycobacterium fallax,

Mycobacterium mageritense, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium vaccae y

Micobacterium vanbalenii.

� Género Pseudonocardia: Pseudonocardia assacharolytica.

� Género Rhodococcus: Rhodococcus ruber, Rhodococcus rhodochrous y Rhodococcus

zopfii.

� Género Tsukamurella: Tsukamurella pseudospumae, Tsukamurella pulmonis,

Tsukamurella spongiae, Tsukamurella spumae, Tsukamurella strandjordii y Tsukamurella

tyrosinosolvens.

� Género Williamsia: Williamsia muralis.


123

Tabla 14: Identificación obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S rDNA

Aislado Identificación Similaridad (%) QB2.1 Corynebacterium freneyi 99.33 % QB8.1 Corynebacterium variabile 100 % P46p Dietzia cercidiphylli 100 % P26 Dietzia maris 99.85 % P39 Gordonia alkanivorans 100 % L10 Gordonia alkanivorans 99.86 % QB7.1 Gordonia amarae 99.03 % QB13.1 Gordonia amarae 98.82 % QB17.2 Gordonia amarae 99.04 % QB21.2 Gordonia amarae 98.95 % QB22.1 Gordonia amarae 99.04 % J4.1 Gordonia amarae 98.82 % P1.2 Gordonia amarae 98.71 % CS3.1 Gordonia amarae 98.75 % CS6.1 Gordonia amarae 98.89 % CS8.1 Gordonia amarae 98.68 % CS8.2 Gordonia amarae 99.85 % CS9.1 Gordonia amarae 98.66 % CS9.2 Gordonia amarae 98.89 % CS12.2 Gordonia amarae 98.75 % CS16.1 Gordonia amarae 99.03 % CS18.1 Gordonia amarae 98.97 % CS20.3 Gordonia amarae 98.75 % CS21.4 Gordonia amarae 98.82 % CS24.2 Gordonia amarae 98.97 % CS25.1 Gordonia amarae 99.18 % CS27.1 Gordonia amarae 98.89 % P152 Gordonia amarae 99.93 % QB19.1 Gordonia araii 98.00 % QB19.2 Gordonia araii 97.93 % CS10.3 Gordonia araii 98.50 % CS6.2 Gordonia bronchialis 99.78 % CS11.1 Gordonia bronchialis 99.70 % QB8.2 Gordonia cholesterolivorans 98.51 % P158 Gordonia effusa 98.89 % QB6.1 Gordonia hirsuta 98.01 % QB18.2 Gordonia hirsuta 98.01 % P2.3 Gordonia hirsuta 97.42 % D11.2 Gordonia hirsuta 98.01 % D12.3 Gordonia hirsuta 98.01 % CS5.1 Gordonia hirsuta 98.01 % CS11.2 Gordonia hirsuta 98.01 % CS12.1 Gordonia hirsuta 98.00 % CS12.3 Gordonia hirsuta 98.01 % CS16.2 Gordonia hirsuta 98.01 % CS18.2 Gordonia hirsuta 97.72 % CS19.2 Gordonia hirsuta 97.99 % CS20.4 Gordonia hirsuta 97.79 % CS21.3 Gordonia hirsuta 97.94 % CS26.1 Gordonia hirsuta 98.01 % CS27.2 Gordonia hirsuta 98.01 % CS28.1 Gordonia hirsuta 98.01 % CS28.4 Gordonia hirsuta 98.01 % Ca10.1 Gordonia hirsuta 97.35 %


124

Tabla 14 (continuación): Identificación obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S rDNA

Aislado Identificación Similaridad (%) Ca17.1 Gordonia hirsuta 97.35 % Ca22.2 Gordonia hirsuta 97.28 % QB10.1 Gordonia hydrophobica 99.11 % QB10.2 Gordonia hydrophobica 98.89 % QB16.1 Gordonia hydrophobica 99.11 % QB20.1 Gordonia hydrophobica 99.11 % QB21.1 Gordonia hydrophobica 99.04 % D8.1 Gordonia hydrophobica 99.10 % D8.2 Gordonia hydrophobica 99.11 % CS10.1 Gordonia hydrophobica 97.47 % CS32.3 Gordonia hydrophobica 99.11 % QB18.1 Gordonia malaquae 98.15 % P2.2 Gordonia malaquae 98.08 % D1.1 Gordonia malaquae 99.25 % D2.2 Gordonia malaquae 98.08 % D7.1 Gordonia malaquae 99.26 % D12.2 Gordonia malaquae 100 % D15.1 Gordonia malaquae 98.08 % CS13.1 Gordonia malaquae 98.08 % CS17.3 Gordonia malaquae 98.75 % CS18.3 Gordonia malaquae 99.63 % Ca16.1 Gordonia malaquae 99.63 % P175 Gordonia malaquae 99.26 % C2.1 Gordonia paraffinivorans 99.78 % C2.2 Gordonia paraffinivorans 99.78 % LR-4 Gordonia paraffinivorans 99.78 % R1 Gordonia paraffinivorans 99.78 % R5 Gordonia paraffinivorans 99.78 % C5.6 Gordonia paraffinivorans 99.78 % D16.1 Gordonia polyisoprenivorans 98.53 % CS7.1 Gordonia polyisoprenivorans 98.53 % CS32.4 Gordonia polyisoprenivorans 98.52 % P54 Gordonia polyisoprenivorans 98.52 % P141 Gordonia polyisoprenivorans 98.52 % D11.1 Gordonia polyisoprenivorans 98.01 % Ca9.1 Gordonia rhizosphera 98.66 % E9 Gordonia sputi / jacobaea 99.00 %

D13.1 Gordonia sputi / jacobaea 99.93 % D15.2 Gordonia sputi 100 % CS17.1 Gordonia sputi / jacobaea 99.93 % CS20.2 Gordonia sputi / jacobaea 99.85 % CS28.3 Gordonia sputi 99.93 % CS32.1 Gordonia sputi 100 % CS32.2 Gordonia sputi / jacobaea 99.93 % Ca3.1 Gordonia sputi 99.93 % Ca21.1 Gordonia sputi / jacobaea 99.93 % P48b Gordonia sputi 100 % Ca19.1 Gordonia terrae 99.93 % Ca27.1 Gordonia terrae 99.93 % P108 Gordonia terrae 98.97 %

CQG-5a Microbacterium lacus 99.04 % D6.1 Mycobacterium austroafricanum 100 % D9.1 Mycobacterium austroafricanum 100 % P72 Mycobacterium austroafricanum 100 % D3.2 Mycobacterium fallax 100 %


125

Tabla 14 (continuación): Identificación obtenida mediante matrices de similaridad de la secuencia del 16S rDNA

Aislado Identificación Similaridad (%)

CS33.1 Mycobacterium mageritense 100 % C2.3 Mycobacterium smegmatis 100 % C5.1a Mycobacterium smegmatis 100 % C5.1b Mycobacterium smegmatis 100 % C4.1 Mycobacterium smegmatis 100 % C4.5 Mycobacterium smegmatis 100 % PA.2 Mycobacterium smegmatis 100 % PB.6 Mycobacterium smegmatis 100 % PB.7 Mycobacterium smegmatis 100 % RG4-a Mycobacterium vaccae 99.48 % RG4-b Mycobacterium vaccae 99.48 % D16.2 Mycobacterium vanbalenii 100 % Ca7.2 Mycobacterium vanbalenii 100 % PA.3 Pseudonocardia asaccharolytica 97.48 % PB.1 Pseudonocardia asaccharolytica 97.47 % PB.3 Pseudonocardia asaccharolytica 97.47 % PC.4 Pseudonocardia asaccharolytica 97.47 % 54B Rhodococcus ruber 100 % C5.5a Rhodococcus ruber 100 % P135 Rhodococcus ruber 99.93 % D1.2 Rhodococcus rhodochrous 97.78 % P1.1 Rhodococcus zopfii 100 % P2.1 Rhodococcus zopfii 98.67 % D2.3 Rhodococcus zopfii 99.93 % CS26.2 Rhodococcus zopfii 98.68 % Ca20.2 Rhodococcus zopfii 98.58 % QB7.2 T. pseudospumae / spongiae 99.93 % QB16.2 T. pseudospumae / spongiae 100 % 8V T. pseudospumae / spongiae 99.93 %

CS20.1 T. pseudospumae / spongiae 100 % P145 T. pseudospumae / spongiae 100 % N1 T. pseudospumae / spongiae 99.93 % N4 T. pseudospumae / spongiae 100 % N5 T. pseudospumae / spongiae 100 % N9-1 T. pseudospumae / spongiae 99.93 % N17-4 T. pseudospumae / spongiae 100 % CS10.2 Tsukamurella pulmonis 99.85 % D2.1 T. spumae / strandjordii 100 % P166 T. spumae / strandjordii 100 % L2 T. spumae / strandjordii 99.16 %

QB2.2 Tsukamurella tyrosinosolvens 99.78 % N16-9 Tsukamurella tyrosinosolvens 99.78 % CS1.1 Williamsia muralis 99.93 %

En cuanto a los porcentajes de similaridad nucleotídica observamos como varían desde

el 97.28%, como porcentaje más bajo, hasta el 100%. En la tabla 15 se observan los porcentajes

de similaridad diferenciados por géneros.


126

Tabla 15: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA diferenciado por géneros

Género % Similaridad (min – max %) Corynebacterium 99.33 - 100

Dietzia 99.85 - 100 Gordonia 97.28 - 100

Microbacterium 99.04 Mycobacterium 99.48 - 100 Pseudonocardia 97.47 - 97.48

Rhodococcus 97.78 - 100 Tsukamurella 99.16 - 100

Williamsia 99.93

Desde el principio de los años 90, el límite con que un par de especies se podían

considerar la misma especie correspondía a un 97% como valor mínimo. Sin embargo, estudios

realizados por Stackebrandt y Ebers (2006) demuestran que este porcentaje no es el idóneo y lo

elevan casi un 2%, hasta llegar a valores comprendidos entre 98.70% y 99%, debido a que

porcentajes de similaridad nucleotídica menores al 98.5% correspondían a porcentajes menores

del 70% en la hibridación DNA:DNA. Si ese porcentaje de hibridación DNA:DNA es inferior se

puede afirmar que ese par de especies corresponden a especies diferentes (Figura 23).

Es por ello que observando la tabla 14 podemos decir que, atendiendo a este criterio, 65

especies podrían ser consideradas como nuevas especies. Las marcadas en verde (48

especies) poseen un porcentaje menor del 98.70% y las marcadas en naranja (17 especies)

Figura 23: Comparación de la similaridad de las secuencias del gen 16S rDNA y los valores de hibridación DNA:DNA (Stackebrandt y Ebers, 2006)


127

poseen un porcentaje comprendido entre el 98.70% y el 99%. Para comprobar esta hipótesis se

debería realizar una hibridación DNA:DNA y diversas pruebas confirmatorias tales como

menaquinonas, ácidos grasos, lípidos polares, contenido en G + C y diferentes tests fenotípicos

que diferenciaran el aislado de la especie de referencia filogenéticamente más próxima.

1.4.1.1.- Género Corynebacterium

Mediante el programa PHYDIT se ha construido el árbol filogenético del género

Corynebacterium, que actualmente cuenta con 85 especies validadas (Anexo 4). Este programa

realiza un alineamiento múltiple, esto es, un alineamiento entre las secuencias de las cepas de

estudio y las secuencias de las especies validadas del género, para lograr alcanzar la máxima

similitud entre ellas. Esto se logra introduciendo gaps o huecos que representan sustituciones,

inserciones o deleciones ocurridas durante el proceso evolutivo y así obtener un modelo

hipotético para explicar este tipo de mutaciones ocurridas durante la evolución. Sin embargo, no

es posible saber incuestionablemente cual es el mejor alineamiento.

El out-group o raíz es una secuencia relacionada con las secuencias objeto de análisis

de la cual sabemos que presenta una mayor divergencia evolutiva. La inclusión de un out-group

permite mejorar la capacidad predictiva del árbol siempre y cuando la divergencia evolutiva no

sea excesiva. En nuestro caso la secuencia del 16S rDNA de Turicella otitidis (X73976) es la

elegida, debido a que es una bacteria coreniforme próxima a los aislados estudiados pero lo

suficientemente alejada como para dar validez al árbol filogenético. Además se han incluido

todas las especies tipo de las familias que componen el suborden Corynebacterineae para así

mostrar la posición de este género con respecto a los demás y dar, más aún si cabe, validez al

árbol filogenético.

La técnica de bootstrapping consiste en remuestrear las secuencias analizadas mediante

la combinación aleatoria de distintas columnas y la generación de nuevos alineamientos y

árboles. Un valor de “bootstrap” > 70% suele considerarse significativo. El “bootstrap” utilizado

fue de 1000 réplicas (mostrando únicamente los valores superiores al 50%).

Los números de secuencia (“accession numbers”) se muestran en paréntesis. La escala

del árbol filogenético indica 0.1 sustituciones por posición de nucleótido, esto es, nos indica los

cambios que han sucedido a través del tiempo en una zona determinada de la secuencia.


128

La figura 24 muestra el árbol filogenético parcial del género Corynebacterium basado en

las secuencias del 16S rDNA obtenido mediante el método del Neighbour-Joining, que es un

método que utiliza matrices de distancia, esto es, crea los árboles filogenéticos en función de las

distancias genéticas entre las secuencias de estudio, obteniendo los resultados en función del

“vecino más cercano”. En este árbol se muestra la posición de las cepas QB2.1

(Corynebacterium freneyi) y QB8.1 (Corynebacterium variabile) con respecto a sus parientes

filogenéticos más cercanos.

Figura 24: Árbol filogenético parcial del género Corynebacterium basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.10

D. maris DSM 43672T (X79290)

C. ulceribovis DSM 45146T (X84256)

C. bovis DSM 20582T (X84444)

C. sphenisci CECT 5990T (AJ440964)

C. amycolatum DSM 6922T (X82057)

C. sputi DSM 45148T (AM930556)

C. hansenii DSM 45109T (AM946639)

C. nuruki JCM 17162T (HM165487)

C. terpenotabidum JCM 10555T (AB004730)

C. suicordis CECT 5724T (AJ504424)

C. urealyticum DSM 7109T (X81913)

C. freneyi DSM 44506T (AJ292762)

C. auriscanis DSM 44609T (AJ243819)

C. resistens JCM 12819T (AB128981)

C. falsenii DSM 44353T (Y13024)

C. jeikeium DSM 7171T (X84250)

Aislado QB8.1

C. variabile DSM 20132T (AJ222815)

Aislado QB2.1

C. xerosis DSM 20743T (X81914)

100

97

79

74

73

99

57

95

100

80

91

65

72

100

72

99


129

Analizando ya el árbol, observamos que la cepa QB8.1 forma un único cluster con

Corynebacterium variabile, siendo el porcentaje de similaridad nucleotídica del 100% y 0 el

número de nucleótidos diferentes para un total de 1353.

Para la cepa QB2.1 podemos observar que los parientes filogenéticos más cercanos son

Corynebacterium freneyi, Corynebacterium xerosis y Corynebacterium hansenii. Sin embargo, la

matriz de similaridad nos indica que su pariente filogenético más próximo es Corynebacterium

freneyi con un porcentaje de similaridad del 99.33%, siendo 9 el número de nucleótidos

diferentes para un total de 1351.

1.4.1.2.- Género Dietzia

Para el género Dietzia, que cuenta con 12 especies validadas, encontramos dos

aislados, P26 (Dietzia maris) y P46p (Dietzia cercidiphylli). El árbol filogenético completo del

género se muestra en el anexo 5, obtenido igualmente por el método del Neighbour-Joining.

De igual modo que en el género anterior la secuencia del 16S rDNA de Turicella otitidis

(X73976) se utiliza como out-group o raíz del árbol y se muestran las especies tipo de las

familias correspondientes al suborden al que pertencen todos los aislados.

Los números de secuencia (“accession numbers”) se muestran entre paréntesis. El

“bootstrap” utilizado fue de 1000 réplicas (mostrando únicamente los valores superiores al 50%)

y la escala del árbol filogenético indica 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

Analizando el árbol parcial (figura 25) observamos que la cepa P46p está

filogenéticamente próxima a Dietzia cercidiphylli, Dietzia natronolimnaea y Dietzia

psychralcaliphila. Sin embargo, la matriz de similaridad indica que esta cepa corresponde a

Dietzia cercidiphylli con un porcentaje de similaridad del 100% y 0 nucleótidos diferentes para un

total de 1351. Si nos fijamos en el cluster formado por estas tres especies junto con el aislado

P46p, observamos como la escala, esto es, el número de sustituciones nucleotídicas a lo largo

del tiempo, es menor con Dietzia cercidiphylli que con las otras dos especies.

Para la cepa P26, se observa un cluster formado por ésta y las especies Dietzia

kunjamensis, Dietzia maris, y Dietzia schimae. Lo que nos indica la matriz de similaridad


130

nucleotídica es que la cepa P26 muestra una mayor similaridad (99.85%) con Dietzia maris que

con las otras dos y que el número de nucleótidos diferentes es de 2 sobre un total de 1351. Al

igual que ocurría con el aislado anterior, la escala del árbol nos muestra como nuestra cepa de

estudio está más próxima filogenéticamente a la especie con mayor porcentaje de similaridad

que con respecto a las otras 2.

Figura 25: Árbol filogenético parcial del género Dietzia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA

entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

C. diphtheriae DSM 44123T (X84248)

D. timorensis NRBC 104184T (AB377289)

D. lutea DSM 45074T (EU821598)

D. aerolata DSM 45334T (FM995533)

D. alimentaria JCM 16360T (GQ368824)

D. psychralcaliphila JCM 10987T (AB049630)

D. kunjamensis DSM 44907T (AY972480)

D. natronolimnaea DSM 44860T (X92157)

Aislado P26

D. maris DSM 43672T (X79290)

D. schimae DSM 45139T (EU375845)

Aislado P46p

D. cercidiphylli DSM 45140T (EU375846)

D. cinnamea DSM 44904T (AJ920289)

D. papillomatosis DSM 44961T (AY643401)

100

87

81

93

54

73

99

97

56

54

98

100


131

1.4.1.3.- Género Gordonia

Para este género se obtuvieron 100 aislados. El árbol filogenético completo del género,

con 33 especies validadas, se muestra en el anexo 6, obtenido igualmente por el método del

Neighbour-Joining.

La secuencia del 16S rDNA de Turicella otitidis (X73976) se utiliza como out-group y

están incluidas todas las especies tipo de las familias correspondientes al suborden al que

pertencen todos los aislados.




Las cepas P39 y L10 forman un cluster con la especie Gordonia alkanivorans. El

porcentaje de similaridad es idéntico para ambos aislados (99.93%), mostrando un nucleótido

diferente de un total de 1347.

Las cepas CS3.1, CS6.1, CS8.1, CS8.2, CS9.1, CS9.2, CS12.2, CS16.1, CS18.1,

CS20.3, CS21.4, CS24.2, CS25.1, CS27.1, J4.1, P1.2, P152, QB7.1, QB13.1, QB17.2, QB21.2 y

QB22.1 forman un único cluster con Gordonia amarae. Podemos observar como 2 cepas (CS8.1

y CS9.1) no cumplen los requisitos propuestos por Stackebrandt y Ebers (2006) y que 14 de

ellas (CS3.1, CS6.1, CS9.2, CS12.2, CS18.1, CS20.3, CS21.4, CS24.2, CS27.1, J4.1, P1.2,

QB13.1 y QB21.2) se encuentran en el límite de dicho criterio. Los resultados obtenidos se

muestran en la tabla 16.

Gordonia araii forma un cluster con las cepas CS10.3, QB19.1 y QB19.2, siendo los

porcentajes de similaridad del 98.50%, 98.00% y 97.93% respectivamente, con lo que

estaríamos ante tres posibles especies nuevas. El número de nucleótidos diferentes es de 20

sobre 1344 para la cepa CS10.3, 27 sobre 1352 para la cepa QB19.1 y de 28 sobre 1352 para la

cepa QB19.2.

Las cepas CS6.2 y CS11.1 forman un único cluster con Gordonia bronchialis, siendo los

porcentajes de similaridad del 99.78% y 99.70% respectivamente. La cepa CS6.2 tiene 3


132

nucleótidos diferentes sobre un total de 1357 y la cepa CS11.1 tiene 4 nucleótidos diferentes

sobre 1355.

Tabla 16: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Gordonia amarae

Aislado Similaridad Nucleótidos ≠ CS3.1 98.75 % 17 / 1356 CS6.1 98.89 % 15 / 1354 CS8.1 98.68 % 18 / 1360 CS8.2 99.85 % 2 / 1358 CS9.1 98.66 % 18 / 1348 CS9.2 98.89 % 15 / 1354 CS12.2 98.75 % 17 / 1357 CS16.1 99.03 % 13 / 1347 CS18.1 98.97 % 14 /1355 CS20.3 98.75 % 17 / 1358 CS21.4 98.82 % 16 / 1352 CS24.2 98.97 % 14 / 1355 CS25.1 99.18 % 11 / 1339 CS27.1 98.89 % 15 / 1354 J4.1 98.82 % 16 / 1355 P1.2 98.71 % 12 / 1345 P152 99.93 % 1 / 1354 QB7.1 99.03 % 13 / 1346 QB13.1 98.82 % 11 / 1351 QB17.2 99.04 % 13 /1350 QB21.2 98.95 % 14 / 1337 QB22.1 99.04 % 13 / 1356

Gordonia cholesterolivorans, Gordonia hydrophobica, Gordonia neofelifaecis y Gordonia

sihwensis forman un cluster con la cepa QB8.2. Sin embargo, el porcentaje de similaridad

nucleotídica nos indica que la especie a la que está más próxima, filogenéticamente hablando,

es Gordonia cholesterolivorans con un porcentaje del 98.51%, con lo que podríamos estar ante

una posible especie nueva. El número de nucleótidos diferentes es de 20 sobre un total de 1343.

La cepa P158 forma un único cluster con Gordonia effusa y, pese a ello, el porcentaje de

similaridad es del 98.89%, límite en el cual podríamos estar hablando de una especie nueva. 15,

sobre un total de 1353, son los nucleótidos que diferencian la especie aislada de la especie con

la cual se ha identificado.

Un total de 22 aislados (Ca10.1, Ca17.1, Ca22.2, CS5.1, CS10.1, CS11.2, CS12.1,

CS12.3, CS16.2, CS18.2, CS19.2, CS20.4, CS21.3, CS26.1, CS27.2, CS28.1, CS28.4, D11.2,

D12.3, P2.3, QB6.1 y QB18.2) forman un único cluster con Gordonia hirsuta. Los porcentajes de

similaridad y número de nucleótidos diferentes se muestran en la tabla 17.


133

Tabla 17: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Gordonia hirsuta

Aislado Similaridad Nucleótidos ≠ Ca10.1 97.35 % 36 / 1356 Ca17.1 97.35 % 36 / 1356 Ca22.2 97.28 % 37 / 1359 CS5.1 98.01 % 27 / 1356 CS10.1 97.39 % 35 / 1342 CS11.2 98.01 % 27 / 1356 CS12.1 98.00 % 27 / 1352 CS12.3 98.01 % 27 / 1355 CS16.2 98.01 % 27 / 1354 CS18.2 97.72 % 31 / 1362 CS19.2 97.99 % 27 / 1345 CS20.4 97.79 % 30 / 1357 CS21.3 97.94 % 28 / 1356 CS26.1 98.01 % 27 / 1356 CS27.2 98.01 % 27 / 1356 CS28.1 98.01 % 27 / 1356 CS28.4 98.01 % 27 / 1356 D11.2 98.01 % 27 / 1356 D12.3 98.01 % 27 / 1356 P2.3 97.42 % 35 / 1358 QB6.1 98.01 % 27 / 1356 QB18.2 98.01 % 27 / 1358

Si observamos la tabla 17 veremos como los porcentajes de similaridad no cumplen con

los requisitos para ser la misma especie, por tanto podríamos considerarlas como especies

nuevas a falta de un estudio más profundo.

También hay que destacar que, pese a que la cepa CS10.1 está incluida en el árbol en

el cluster de Gordonia hirsuta, el porcentaje de similaridad con Gordonia hydrophobica (97.47%)

es mayor que el porcentaje con Gordonia hirsuta (97.39%). Realmente, al estar muy por debajo

del umbral propuesto por Stackebrandt y Ebers (2006), no debe suponernos un problema en

saber si es una especie u otra ya que, con toda seguridad, se trata de una especie nueva.

Gordonia cholesterolivorans, Gordonia hydrophobica, Gordonia neofelifaecis y Gordonia

sihwensis forman un cluster con las cepas CS32.3, D8.1, D8.2, QB10.1, QB10.2, QB16.1,

QB20.1, QB21.1. Los porcentajes de similaridad indican que estos aislados pertenecen a la

especie Gordonia hydrophobica, siendo los porcentajes de similaridad del 99.11%, 99.10%,

99.11%, 99.11%, 98.89%, 99.11%, 99.11% y 99.04% respectivamente. Como hemos comentado

anteriormente la cepa CS10.1 que forma grupo con los aislados de Gordonia hirsuta posee un

porcentaje del 97.47% con Gordonia hydrophobica por lo que se consideraría especie nueva.


134

Los nucleótidos diferentes son, respectivamente, 12 / 1345, 12 / 1339, 12 / 1354, 12 / 1354, 15 /

1351, 12 / 1355, 12 / 1354 y 13 / 1354.

Las cepas Ca3.1, Ca21.1, CS17.1, CS20.2, CS28.3, CS32.1, CS32.2, D13.1, D15.2, E9

y P48b foman un cluster con las especies Gordonia jacobaea, Gordonia aichiensis y Gordonia

sputi. Sin embargo, los porcentajes de similaridad indican que los aislados pertenecen a la

especie G. sputi y, en algunos casos, poseen el mismo porcentaje entre ésta y G. jacobaea. De

forma aclaratoria, en la tabla 18 se pueden observar los resultados ya que, en este caso como se

ha dicho anteriormente, existen varias cepas (*) que poseen el mismo porcentaje de similaridad

nucleotídica con G. jacobaea que con G. sputi. Para saber con seguridad qué especie es cada

cepa se debería hacer una hibridación DNA:DNA y comprobar qué pocentaje es el más elevado.

Tabla 18: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a G. jacobaea y G. sputi

Aislado Similaridad Nucleótidos ≠ Ca3.1 99.93 % 1 / 1358 Ca21.1 * 99.93 % 1 - 1 / 1357 CS17.1 * 99.93 % 1 - 1 / 1357 CS20.2 * 99.85 % 2 - 2 / 1357 CS28.3 99.93 % 1 / 1357 CS32.1 100 % 0 / 1357 CS32.2 * 99.93 % 1 - 1 / 1358 D13.1 * 99.93 % 1 - 1 / 1357 D15.2 100 % 0 / 1357 E9 * 99.00 % 14 - 14/ 1405 P48b 100 % 0 / 1355

Gordonia malaquae forma un cluster con las cepas Ca16.1, CS13.1, CS17.3, CS18.3,

D1.1, D2.2, D7.1, D12.2, D15.1, P2.2, P175 y QB18.1, siendo los porcentajes de similaridad los

que se detallan en la tabla 19. Tal y como se observa en la tabla, 5 aislados (CS13.1, D2.2,

D15.1, P2.2, y QB18.1) podrían ser nuevas especies y 1 aislado (CS17.3) estaría en el límite

propuesto.

Los aislados C2.1, C2.2, C5.6, LR-4, R1 y R5 forman un cluster con la especie Gordonia

paraffinivorans. El porcentaje de similaridad para todos ellos es de 99.78% y el número de

nucleótidos diferentes es de 3 sobre un total 1340. El aislado C5.6 proviene de una planta

depuradora diferente al resto, por tanto, podríamos considerar a las demás como la misma cepa

al provenir todas de la misma estación depuradora.


135

Tabla 19: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Gordonia malaquae

Aislado Similaridad Nucleótidos ≠ Ca16.1 99.63 % 5 / 1356 CS13.1 98.08 % 26 / 1354 CS17.3 98.75 % 17 / 1355 CS18.3 99.63 % 5 / 1349 D1.1 99.25 % 10 / 1342 D2.2 98.08 % 26 / 1352 D7.1 99.26 % 10 / 1351 D12.2 100 % 0 / 1339 D15.1 98.08 % 26 / 1354 P2.2 98.08 % 26 / 1354 P175 99.26 % 10 / 1351 QB18.1 98.15 % 25 / 1354

Las cepas CS7.1, CS32.4, D16.1, P54 y P141 forman un cluster (ver Anexo 6) con la

especie Gordonia polyisoprenivorans, siendo los porcentajes de similaridad del 98.53% y 20

nucleótidos diferentes de un máximo de 1354 aproximadamente.

La cepa D11.1, pese a que forma un cluster con Gordonia sinesedis, posee un

porcentaje de similaridad más alto con respecto a Gordonia polyisoprenivorans (98.01% y 27

nucleótidos diferentes de un total de 1353) que con respecto a Gordonia sinesedis (97.19% y 38

nucleótidos diferentes de un total de 1354). Sin embargo, al estar estos porcentajes por debajo

del límite propuesto en 2006, estaríamos hablando de una posible especie nueva.

La especie Gordonia rhizosphera forma un cluster con el aislado Ca9.1, siendo el

porcentaje de similaridad del 98.66% y 18 los nucleótidos diferentes. Para comprobar si es esa

especie se debería hacer una hibridación DNA:DNA.

Por último, las cepas Ca19.1, Ca27.1 y P108 forman un cluster con la especie Gordonia

lacunae y con la especie Gordonia terrae. Sin embargo, la matriz de similaridad indica que

pertenecen a la segunda, Gordonia terrae, con 99.93%, 99.93% y 98.97% de similaridad

respectivamente. Los nucleótidos difentes fueron 1 sobre 1348 para Ca19.1, 1 sobre 1362 para

Ca27.1 y 14 sobre 1356 para P108, siendo esta última cepa una posible especie nueva a la que

deberiamos realizar una hibridación DNA:DNA.

En las figuras 26 y 27 podemos observar los árboles parciales para el género Gordonia y

así tener una mayor comprensión acerca de los resultados obtenidos.


136

Figura 26: Árbol filogenético parcial (I) del género Gordonia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de

“bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

R.rhodochrous DSM 43241T (X79288)

Aislado CS9.1

Aislado CS25.1

Aislado CS16.1 Aislado QB7.1

G. hydrophobica DSM 44015T (X87340)

Aislado CS21.3

Aislado CS17.3

Aislado CS21.4

Aislado QB16.1

Aislado QB6.1

Aislado CS12.3

Aislado CS27.1

Aislado D8.2

Aislado D12.2

Aislado D12.3

Aislado CS16.2

Aislado CS9.2

Aislado QB10.1

G. hirsuta DSM 44140T (X93485)

Aislado D11.2

Aislado CS12.1

Aislado CS6.1

Aislado QB20.1

Aislado CS28.1

Aislado CS5.1

Aislado QB18.1

Aislado CS3.1

Aislado P2.2

Aislado QB10.2

Aislado CS27.2

Aislado CS26.1

Aislado QB21.2 Aislado P152

Aislado Ca17.1

Aislado CS12.2

Aislado D15.1

Aislado CS24.2

Aislado D1.1 Aislado Ca16.1

Aislado CS32.3

Aislado CS11.2

Aislado CS28.4

Aislado P175 Aislado D7.1

Aislado CS18.3 G. malaquae DSM 45064T (AM406674)

Aislado D2.2 Aislado CS13.1

Aislado QB8.2 G. neofelifaecis CCTCC AB-209144T (FJ938167)

G. cholesterolivorans DSM 45229T (EU244645) G. sihwensis DSM 44576T (AJ416151)

Aislado D8.1 Aislado QB21.1

G. defluvii DSM 44981T (AY650265) G. humi DSM 45298T (FN561544)

Aislado P158 G. effusa DSM 44810T (AB162799)

Aislado P1.2 Aislado J4.1

Aislado CS8.2 G. amarae DSM 43392T (X80635)

Aislado QB22.1 Aislado QB17.2

Aislado CS18.1 Aislado CS8.1

Aislado QB13.1 Aislado CS20.3

Aislado Ca22.2 Aislado Ca10.1

Aislado P2.3 Aislado CS10.1


Aislado QB18.2 Aislado Cs19.2

100

53

79

97

59

55

100

52

80

60

70

55

81

100

63

62

87

57

65

100

100 96

60

95

97

72

53

82 85

63

100

62

100

96

93

74

61


137

Figura 27: Árbol filogenético parcial (II) del género Gordonia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

R. rhodochrous DSM 43241T (X79288)

G. shandongensis JCM 13907T (DQ420167)

Aislado Ca9.1 G. otitidis IFM 10032T (AF122026) Aislado CS28.3 Aislado Ca3.1

G. aichiensis DSM 43978T (X80633) Aislado P48b

G. polyisoprenivorans DSM 44302T (Y18310)

G. desulfuricans DSM 44462T (AF101416)

Aislado D11.1

G. amicalis DSM 44461T (AF101418)

Aislado C5.6

Aislado D13.1

Aislado C2.1

G. sinesedis DSM 44455T (AF380834)

G. westfalica DSM 44215T (AJ312907)

Aislado C2.2

Aislado P108

Aislado D16.1

Aislado R5

Aislado Ca19.1

Aislado CS7.1

G.rhizosphera IFO 16247T (AB023368)

G. nitida DSM 44499T (AF148947)

Aislado Ca27.1

G. bronchialis DSM 43247T (X79287)

Aislado CS10.3

Aislado P141

Aislado R1

G. alkanivorans DS M44369T (Y18054)

Aislado Ca21.1 Aislado CS17.1

Aislado D15.2

Aislado E9 Aislado CS20.2

Aislado CS32.2 G. jacobaea MV-1T (AF251791)

Aislado CS32.1 G. sputi DSM 43896T (X80634)

Aislado P54 Aislado CS32.4 Aislado CS11.1 Aislado CS6.2

G. hankookensis JCM 16947T (FJ572038) G. soli DSM 44995T (AY995560)

G. araii IFM 10211T (AB162800) G. kroppenstedtii JCM 16948T (AM883151)


G. lacunae DSM 45085T (EF151959) G. terrae DSM 5707T (X79286)

G. namibiensis DSM 44568T (AF380930) G. rubripertincta DSM 43197T (X80632)

Aislado P39 Aislado L10

Aislado L-R4 G. paraffinivorans DSM 44604T (AF432348)

100

83 100

88

74 73

100

65

96

97

100

100

87

98

100

67

63

98

100

100

63

88


138

1.4.1.4.- Género Microbacterium

El árbol filogenético completo, obtenido mediante el método del Neighbour-Joining, del

género Microbacterium, que actualmente cuenta con 72 especies validadas, se muestra en el

Anexo 7. El árbol parcial, para una mayor comprensión, se muestra en la figura 28. En este árbol

encontramos únicamente 1 aislado, el CQG-5a (Microbacterium lacus).

Figura 28: Árbol filogenético parcial del género Microbacterium basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

La secuencia del 16S rDNA de Agreia bicolorata (AF159363) se utiliza como out-group o

raíz del árbol. Los números de secuencia (“accession numbers”) se muestran entre paréntesis. El

0.1

A. bicolorata JCM 12206T (AF159363)

M. hatanonis DSM 19179T (AB274908)

M. terricola JCM 14903T (A234025)

M. aoyamense NBRC 101280T (AB234028)

M. flavum DSM 18909T (AB286029)

M. aurum DSM 8600T (Y17229)

M. fluvii DSM 18908T (AB286028)

M. lacus DSM 18910T (AB286030)

M. deminutum JCM 14901T (AB234026)

M. pumilum JCM 14902T (AB234027)

M. awajiense DSM 18907T (AB286027)

M. koreense JCM 15305T (AY962574)

M. lacticum DSM 20427T (X77441)

M. schleiferi DSM 20489T (Y17237)

Aislado CQG5-a

M. invictum DSM 19600T (AM949677)

M. pygmaeum JCM 15925T (AB248875)

M. terregens DSM 20449T (AB004721)

100

93

64

66

53

87

67


139



En el árbol observamos como la cepa de estudio, CGQ-5a, forma un cluster con

Microbacterium invictum con un porcentaje de similaridad del 98.75% y 17 nucleótidos diferentes

de un total de 1356. Sin embargo, el porcentaje de similaridad más próximo dado por la matriz es

con la especie Microbacterium lacus con 99.04% y 13 nucleótidos diferentes de un total de 1355.

El porcentaje de similaridad con cualquiera de las especies es bastante bajo por lo que

sería conveniente realizar la hibridación DNA:DNA con las especies con las que tenga mayor

porcentaje ya que podríamos estar hablando de una posible especie nueva.

1.4.1.5.- Género Mycobacterium

Actualmente este género cuenta con un total de 145 especies validadas. En el árbol

filogenético de este género (Anexo 8), obtenido por el método del Neighbour-Joining, se

muestran los 17 aislados que se encontraron en los diferentes muestreos.







En la figura 29 se observa que Mycobacterium austroafricanum forma un cluster con las

cepas D6.1, D9.1 y P72. El porcentaje de similaridad de los tres aislados con respecto a esa

especie es del 100%, siendo 0, de un total de 1356, el número de nucleótidos diferentes.

La cepa D3.2 forma un único cluster con Mycobacterium fallax, siendo el porcentaje de

similaridad del 100% y, obviamente, el número de nucleótidos diferentes es de 0 sobre un total

de 1351.


140

Figura 29: Árbol filogenético parcial del género Mycobacterium basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los

niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.02 sustituciones por posición de nucleótido.

0.02

R.rhodochrous DSM 43241T (X79288) M. brumae DSM 44177T (AF480576)

M. phlei DSM 43239T (AF480603) M. duvalii DSM 44244T (U94745)

M. goodii DSM 44492T (Y12872)

M. chitae DSM 44633T (X55603)

M. smegmatis DSM 43756T (AJ131761)

M. pyrenivorans DSM 44605T (AJ431371) M. aurum DSM 43999T (X55595)

Aislado C2.3

M. hodleri DSM 44183T (X93184)

Aislado C4.5

M. brisbanense DSM 44680T (AY250177)

M. austroafricanum DSM 44191T (X93182)

M. conceptionense JCM 15299T (AY859684)

Aislado PB.7

M. neoaurum DSM 44074T (AF480593)

M. immunogenum DSM 45594T (AJ812215)

M. obuense DSM 44075T (X55597)

M. frederiksbergense DSM 44346T (AJ276274)

M. abscesus DSM 44196T (AY457071)

Aislado C4.1

M. rutilum JCM 16371T (DQ370011)

M.bolletii JCM 15297T (AY859681)

Aislado C5.1a

M. poriferae JCM 12603T (AF450589)

M. gadium DSM 44077T (X55594)

Aislado D16.2

Aislado PA.2

M. vaccae DSM 43292T (AF480591)

M. moriokaense DSM 44221T (AJ429044)

M. chubuense DSM 44219T (AF480597)

M. wolinskyi DSM 44493T (AY457083)

M. septicum DSM 44393T (AY457070)

Aislado D9.1

M. porcinum DSM 44242T (AY457077)

M. aichiense DSM 44147T (X55598)

M. insubricum DSM 45132T (EU605695)

M. farcinogenes DSM 43637T (AY457084)

M. massiliense JCM 15300T (AY593980)

M. hiberniae DSM 44241T (X67096)

M. parafortuitum DSM 43528T (X93183)

Aislado PB.6 Aislado C5.1b

M. confluentis DSM 44017T (AJ634379) M. madagascariense JCM 13574T (AB535170)

M. elephantis DSM 44368T (AJ010747) M. pulveris DSM 44222T (AJ429046)

M. agri DSM 44515T (AJ429045) M. thermoresistibile DSM 44167T (X55602)

M. flavescens DSM 43991T (X52932) M. novocastrense DSM 44203T (U96747)

M. doricum DSM 44339T (AF264700) M. monacense DSM 44395T (AF107039)

Aislado RG4-b Aislado RG4-a

Aislado P72 Aislado D6.1

Aislado Ca7.2 M. vanbaalenii DSM 7251T (X84977)

M. gilvum JCM 15464T (X81996) M. psychrotolerans DSM 44697T (AJ534886)

M. chlorophenolicum DSM 43826T (X79292) M. rufum JCM 16372T (AY943385)

Aislado CS33.1 M. mageritense DSM 44476T (AJ639399)

M. komossense DSM 44078T (X55591) M. tusciae DSM 44338T (AF058299)

M. aromaticivorans JCM 16368T (AY943686) M. rhodesiae DSM 44223T (AJ429047)

M. crocinum JCM 16369T (DQ534008) M. pallens JCM 16370T (DQ370008)

M. alvei DSM 44176T (AF023664) M. peregrinum DSM 43271T (AY457069)

M. boenickei DSM 44677T (AY012573) M. neworleansense DSM 44679T (AY457068)

M. fortuitum DSM 46621T (AY457066) M. setense DSM 45070T (EF138818)

M. houstonense DSM 44676T (AY457067) M. senegalense DSM 43656T (AY457081)

M. mucogenicum ATCC 49650T (AY457074) M. phocaicum JCM 15301T (AY859682)

M. aubagnense JCM 15296T (AY859683) M. llatzerense CECT 7273T (AJ746070)

M. diernhoferi DSM 43524T (AF480599) M. fluoranthenivorans DSM 44556T (AJ617741) M. canariasense JCM 15298T (AY255478)

M. cosmeticum JCM 14739T (AY449728) Aislado D3.2 M. fallax DSM 44179T (AF480600)

M. arupense DSM 44942T (DQ156760) M. nonchromogenicum DSM 44164T (X52928)

M. kumamotonense JCM 13453T (AB239925) M. senuense DSM 44999T (DQ536408)

M. algericum DSM 45454T (GU564404) M. terrae DSM 44227T (M29568)

M. murale DSM 44340T (AB537171) M. tokaiense DSM 44635T (AF450890)

M. bohemicum DSM 44277T (U84502) M. holsaticum DSM 44478T (AJ310467)

M. chelonae DSM 43804T (AY457072) M. salmoniphilum DSM 43276T (DQ866768)

100

88

78

52

94 87

57

60

96

98

52

100 97

50

51

86

58

92

82

89

79

89

73

94

70

60

100 100

52 100

77 65

91

65

100 69

80

100 98

69 100

98


141

La cepa CS33.1 forma un único cluster con Mycobacterium mageritense, siendo el

porcentaje de similaridad del 100% y, obviamente, el número de nucleótidos diferentes es de 0

sobre un total de 1340.

Mycobacterium smegmatis, forma un cluster con los aislados C2.3, C4.1, C4.5, C5.1a,

C5.1b, PA.2, PB.6 y PB7. El porcentaje de similaridad con todas ellas es del 100% y 0 el número

diferente de nucleótidos.

Las cepas RG4-a y RG4-b poseen un porcentaje de similaridad del 99.48 con respecto a

Mycobacterium vaccae, con la cual forman un cluster. El número diferente de nucleótidos es de 9

sobre 1347 para RG4-a y de 9 sobre 1356 para RG4-b.

Por último, la especie Mycobacterium vanbaalenii forma un cluster con los aislados

Ca7.2 y D16.2, siendo el porcentaje de similaridad del 100%. El número de nucleótidos

diferentes para el aislado Ca7.2 es de 0 sobre 1347 y de 0 sobre 1354 para el aislado D16.2.

1.4.1.6.- Género Pseudonocardia

El árbol filogenético, obtenido mediante el método del Neighbour-Joining, del género

Pseudonocardia, que actualmente cuenta con 38 especies validadas, se muestra en el anexo 9.

En este árbol encontramos 4 aislados: PA.3, PB.1, PB.3 y PC.4.

La secuencia del 16S rDNA de Amycolatopsis orientalis (AJ400711) se utiliza como out-

group o raíz del árbol. Los números de secuencia (“accession numbers”) se muestran entre

paréntesis. El “bootstrap” utilizado fue de 1000 réplicas (mostrando únicamente los valores

superiores al 50%) y la escala del árbol filogenético indica 0.1 sustituciones por posición de

nucleótido.

Como observamos en el árbol filogenético parcial (Figura 30), los aislados forman un

cluster con la especie Pseudonocardia asaccharolytica, siendo el porcentaje de similaridad del

97.47% para las cepas PB.1, PB.3 y PC.4 y del 97.48% para la cepa PA.3. El número de

nucleótidos diferentes es de 34 para todas ellas.


142

Figura 30: Árbol filogenético parcial del género Pseudonocardia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

Como se observa en los porcentajes de similaridad y atendiendo al criterio de especie

nueva de Stackebrandt y Ebers (2006) se puede afirmar que son especies nuevas. Para

comprobarlo se decidió realizar la hibridación DNA:DNA del aislado PA3 además de otras

pruebas que demostraran que estos aislados eran especies diferentes a Pseudonocardia

asaccharolytica.

0.1

A. orientalis DSM 40040T (AJ400711)

P. chloroethenivorans DSM 44698T (AF454510)

P. mongoliensis NBRC 105885T (AB521671)

P. saturnea DSM 43195T (AJ252829)

P. artemisiae DSM 45313T (GU227146)

P. babensis NBRC 105793T (AB514449)

P. asaccharolytica DSM 44247T (Y08536)

Aislado PC4

Aislado PB3

P. petroleophila DSM 43193T (AJ252528)

Aislado PB1

Aislado PA3

P. aurantiaca DSM 44773T (FR749916)

P. xinjiangensis DSM 44661T (EU722520)

P. alaniniphila DSM 44660T (EU722519)

P. yunnanensis DSM 44253T (AJ252822)

P. adelaidensis DSM 45352T (FJ805427)

P. kunmingensis DSM 44525T (AJ282533)

P. khuvsgulensis NBRC 105886T (AB521672)

P. thermophila DSM 43832T (EF528218)

100

51

65

63

97

100

100

100

97


143

La hibridación DNA:DNA se llevó a cabo en los laboratotios de la DSMZ (Deutsche

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen).

Los DNA extraidos se purificaron por cromatografía en hidroxiapatito (Cashion et al.,

1977). La hibridación se llevó a cabo, por duplicado, mediante el método de Huss et al. (1983),

utilizando un espectrofotómetro modelo Cary 100 Bio UV/Vis.

Los valores del DNA:DNA fueron 36.2% y 38.0%, valores bastante bajos respecto al

punto de corte recomendado (Wayne et al., 1987) del 70%. Es por ello que los aislados PA.3,

PB.1, PB.3 y PC.4 son especies nuevas.

1.4.1.7.- Género Rhodococcus


filogenético completo de este género (Anexo 10), obtenido por el método del Neighbour-Joining,

se muestran los 9 aislados que se encontraron en los diferentes muestreos.







La figura 31, árbol filogenético parcial del género, muestra como la especie

Rhodococcus ruber forma un cluster con las cepas C5.5a, 54B y P135. El porcentaje de

similaridad de los tres aislados con respecto a esta especie es del 100% para las 2 primeras y

del 99.93% para la P135. Lógicamente, para los aislados C5.5a y 54B el número de nucleótidos

diferentes es de 0 y de 1 sobre un total de 1358 para el aislado P135.


144

Figura 31: Árbol filogenético parcial del género Rhodococcus basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los


Según la matriz de similaridad nucleotídica la especie más próxima al aislado D1.2 es

Rhodococcus rhodochrous con un porcentaje de similaridad nucleotídica del 97.78% y 30

nucleótidos diferentes sobre un total de 1354. Esto nos indica que podríamos encontrarnos ante

una posible especie nueva y se deberían realizar las pruebas pertinentes.

Por último, los aislados P1.1, P2.1, D2.3, CS26.2 y Ca20.2 se sitúan próximos a la

especie Rhodococcus zopfii, siendo los porcentajes de similaridad del 100%, 98.67%, 99.93%,

98.68% y 98.58% respectivamente. Para estas cepas el número diferente de aislados es de 0

0.02

G. bronchialis DSM 43247T (CP001802)

Aislado D1.2

R. aetherivorans DSM 44752T (AF447391)

Aislado 54B

R. coprophilus DSM 43347T (X80626)

R. phenolicus DSM 44812T (AY533293)

R. rhodochrous DSM 43241T (X79288)

Aislado C5.5a

R. zopfii DSM 44108T (AF191343)

Aislado P2.1

Aislado CS26.2

Aislado Ca20.2

Aislado P1.1

Aislado D2.3

R. pyridinivorans DSM 44555T (AF173005)

R. gordoniae DSM 44689T (AY233201)

Aislado P135

R. ruber DSM 43338T (X80625)

R. kroppenstedtii DSM 44908T (AY726605)

R. corynebacterioides DSM 20151T (AF430066)

R. triatomae DSM 44892T (AJ854055)

R. rhodnii DSM 43336T (X80621)

100

56

50

73

100

99

71

72

99

98

99

56

93

59

76

53


145

sobre un total de 1356 para el aislado P1.1, de 18 sobre un total de 1351 para la cepa P2.1, de 1

sobre un total de 1339 para el aislado D2.3, de 18 sobre un total de 1359 para el aislado CS26.2

y de 19 sobre un total de 1338 para el aislado Ca20.2.

1.4.1.8.- Género Tsukamurella

Para este género encontramos 16 aislados. El árbol filogenético completo del género,

con 11 especies validadas, se muestra en el anexo 11, obtenido igualmente por el método del

Neighbour-Joining.







Las cepas QB7.2, QB16.2, 8V, CS20.1, P145, N1, N4, N5, N9-1 y N17-4 forman un

cluster con Tsukamurella pseudospumae y Tsukamurella sunchonensis, estando el porcentaje de

similaridad, con respecto a estas dos especies, comprendido entre el 99.93% y el 100%. Por

tanto no podemos afirmar que las cepas aisladas se traten de una u otra especie a menos que

se realice una hibridación DNA:DNA. En la tabla 20 se muestran los resultados obtenidos para

estos aislados.

Tabla 20: Porcentaje de similaridad del 16S rDNA respecto a Tsukamurella pseudospumae y Tsukamurella

sunchonensis

Aislado Similaridad Nucleótidos ≠ QB7.2 99.93 % 1 / 1362 QB16.2 100 % 0 / 1359 8V 99.93 % 1 / 1353

CS20.1 100 % 0 / 1357 P145 100 % 0 / 1349 N1 99.93 % 1 / 1349 N4 100 % 0 / 1353 N5 100 % 0 / 1353 N9-1 99.93 % 1 /1352 N17-4 100 % 0 / 1352


146

Para la cepa CS10.2 se observa en el árbol como forma un cluster con Tsukamurella

spongiae, sin embargo su porcentaje de similaridad con ésta es, según la matriz de similaridad

nucleotídica, del 98.89% mientras que con la especie Tsukamurella pulmonis es del 99.85% con

2 nucleótidos diferentes sobre un total de 1351.

Podemos observar como 3 cepas (D2.1, P166 y L2) forman un cluster con Tsukamurella

spumae, siendo los porcentajes de similaridad del 100%, 100% y 99.16% respectivamente. El

aislado D2.1 presentaba 0 nucleótidos diferentes sobre un total de 1360, la cepa P166

presentaba 0 sobre un total de 1352 y el aislado L2 presentaba 12 sobre un total de 1424.

Por último, para las cepas QB2.2 y N16-9 ocurre lo mismo que para los aislados de

Tsukamurella pseudospumae y Tsukamurella spongiae, esto es, la matriz de similaridad

nucleotídica nos dice que el porcentaje de similaridad de éstas con respecto a las especies

Tsukamurella tyrosinosolvens y Tsukamurella strandjordii es el mismo (99.78%), y es por ello

que se debería realizar una hibridación DNA:DNA. El número de nucleótidos diferentes es de 3

sobre un total de 1354 para el aislado N16-9 y de 3 sobre un total de 1337 para el aislado QB2.2.

En la figura 32 podemos observar el árbol filogenético parcial del género.

1.4.1.9.- Género Williamsia


filogenético completo de este género (Anexo 12), obtenido por el método del Neighbour-Joining,

se muestra el único aislado (CS1.1) encontrado en los diferentes muestreos.



pertenece el único aislado.





147

Figura 32: Árbol filogenético parcial del género Tsukamurella basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los


La figura 33 muestra que las especies Williamsia marianensis y Williamsia muralis

forman un cluster con el aislado CS1.1. Sin embargo el porcentaje de similaridad de la matriz

indica que está más próximo filogenéticamente a la especie Williamsia muralis, siendo el

porcentaje del 99.93% y el número de nucleótidos diferentes de 1 sobre un total de 1352.

0.02

D. maris DSM 43672T (X79290)

T. strandjordii DSM 44573T (AF283283)

T. spongiae DSM 44940T (AY714239)

T. pulmonis DSM 44142T (X92981)

Aislado CS10.2

Aislado QB7.2

Aislado QB16.2

Aislado CS20.1

Aislado N5

T. spumae DSM 44113T (Z37150)

Aislado N17-4

Aislado N4

Aislado D2.1

Aislado 8V

Aislado P145

Aislado N1

T. sunchonensis JCM 15929T (AF150494)

Aislado N9-1

T. pseudospumae DSM 44118T (AY238513)

Aislado P166

Aislado L2

Aislado QB2.2

Aislado N16-9

T.carboxydivorans JCM 15482T (EU521689)

T. tyrosinosolvens DSM 44234T (AY238514)

100

61

90

61

84

63

53

77


148

Hay que destacar que la especie Williamsia muralis no se ha aislado nunca de plantas

depuradoras españolas, es más, esta especie se aisló en las paredes de una guardería en

Dinamarca (Kämpfer et al., 1999).

Figura 33: Árbol filogenético parcial del género Williamsia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de

“bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.02 sustituciones por posición de nucleótido.

1.5.- Caracterización fenotípica basada en características metabólicas

Para esta caracterización se realizaron 17 test fenotípicos. En este punto se presentan

los resultados de 16 de ellos ya que la pigmentación de colonias está descrita en la tabla 11 del

punto 1.2 de Resultados y Discusión. Las pruebas fenotípicas resultan de gran ayuda ya que

apoyan los resultados obtenidos tanto en la caracterización quimiotaxonómica como en la

caracterización genotípica.

Debido al gran volumen de aislados a manejar se decidió hacer una selección

representativa que englobara todos los géneros y especies que se habían caracterizado

genotípicamente. Para una mayor comprensión de los resultados se ha decidido englobar las

pruebas por géneros. A continuación se exponen los resultados.

0.02

G. bronchialis DSM 43247T (CP001802)

W. serinedens DSM 45037T (AM283464)

W. deligens DSM 44902T (AJ920290)

W. maris DSM 44693T (AB010909)

W. faeni DSM 45372T (DQ157929)

Aislado CS1.1

W. marianensis DSM 44944T (AY894336)

W. muralis DSM 44343T (Y17384)

100

64

94

100

99

72


149

1.5.1.- Género Corynebacterium

En la tabla 21 se observan los resultados, para este género, de los test fenotípicos de

degradación de esculina, tirosina, urea y reducción de nitratos y el crecimiento a diferentes

temperaturas (tomándose como control de crecimiento la temperatura de 28º C).

Tabla 21: Resultados fenotípicos para el género Corynebacterium (I)

Temperaturas Degradación

Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento

37ºC Reducción Nitratos

Urea Esculina Tirosina

QB2.1 - +++ ++ + - - - QB8.1 - +++ + - + - -

Las lecturas para el crecimiento a 10º C se realizaron a los 28 días y, como se observa

en la tabla 21, el resultado para ambos aislados fue negativo. Este resultado es coherente con la

bibliografía consultada ya que este género no suele crecer a temperaturas tan bajas, estando

comprendida su temperatura óptima de crecimiento entre 20ºC y 30ºC (Collins, 1987). Es por ello

que el crecimiento a 28º C es máximo y a 37º C crece pero no llegando al crecimiento máximo.

Las lecturas para los test de biodegradación se realizaron entre los 2 y 21 días. Para

este género no se suele observar degradación de esculina y tirosina y la reducción de nitratos y

degradación de urea es variable dependiendo de cada especie, por tanto los resultados

observados en la tabla 20 son coherentes con la bibliografía (Renaud et al., 2001; Ben-Dov et al.,

2009).

En la tabla 22 se presentan los resultados para el crecimiento de los aislados en

diferentes fuentes de carbono al 1%. Las lecturas se realizaron a los 7, 14 y 21 días de

crecimiento, mostrándose en la tabla adjunta los resultados al cabo de 21 días de incubación.

Para poder cuantificar el crecimiento se realizaron crecimientos paralelos de los aislados en

medio GYEA, tomándolo como control positivo.

Según la bibliografía consultada (Renaud et al., 2001; Yassin et al., 2003) los resultados

obtenidos son coherentes. Como se ha comentado anteriormente, el crecimiento en las

diferentes fuentes de carbono puede variar en función de cada especie, sin embargo, el patrón

general se mantiene en todas las especies de este género y difieren en pocas pruebas según la

afinidad que presenten por el sustrato.


150

Tabla 22: Resultados fenotípicos para el género Corynebacterium (II)

Fuentes de carbono 1% Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol QB2.1 - + - + - + - - QB8.1 - + - + - + + -

Las lecturas para el crecimiento en diferentes fuentes de carbono y nitrógeno al 0.1% se

realizó, al igual que la anterior, a los 7, 14 y 21 días, mostrándose los resultados para los 21 días

de crecimiento.

Como se puede observar en la tabla 23 no existen diferencias significativas en los

resultados obtenidos, los cuales son coherentes con la bibliografía consultada (Renaud et al.,

2001).

Tabla 23: Resultados fenotípicos para el género Corynebacterium (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1% Aislado Alanina Histidina Prolina QB2.1 - - + QB8.1 - - +

Con todo ello podemos afirmar que, tal y como indican los resultados genotípicos y

filogenéticos, los aislados son especies diferentes entre sí y pertenecen a las especies que se

han indicado en el apartado 1.4.1.1. de Resultados y Discusión.

1.5.2.- Género Dietzia

El género Dietzia presenta un rango de temperaturas de crecimiento comprendido

generalmente entre los 10º C y los 37º C, aunque pueden llegar a crecer a temperaturas de

hasta 45ºC (Li et al., 2008), de ahí que los resultados obtenidos (tabla 24) sean coherentes con

los resultados que nos facilita la bibliografía consultada.

Tabla 24: Resultados fenotípicos para el género Dietzia (I)


Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento



P46p + +++ + - + - - P26 + +++ + + + - -


151

En cuanto al crecimiento en diferentes fuentes de carbono al 1% y carbono y nitrógeno al

0.1% los resultados se muestran en las tablas 25 y 26.

Tabla 25: Resultados fenotípicos para el género Dietzia (II)

Fuentes de carbono 1%

Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol P46p + + + + - + - - P26 - + - + + + - -

Tabla 26: Resultados fenotípicos para el género Dietzia (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1% Aislado Alanina Histidina Prolina P46p - - - P26 - + -

Atendiendo a estos resultados, coherentes totalmente con la bibliografía consultada (Li

et al., 2008) podemos afirmar que los aislados pertenecen a las especies que se habían obtenido

en la filogenia.

1.5.3.- Género Gordonia

Los resultados para el género Gordonia se muestran en las tablas 27, 28 y 29. Como se

ha comentado anteriormente, se realizó una selección de cepas en función de la especie, el

porcentaje de similaridad y la estación depuradora a la que pertenecía cada aislado para así

tener una muestra representativa mucho más manejable.

El rango de crecimiento óptimo para el género Gordonia varía, aproximadamente, entre

los 13º C y los 40º C (Kummer et al., 1999) por lo que los resultados obtenidos son coherentes

con la bibliografía.

Los aislados P39 (Gordonia alkanivorans), CS11.1 (Gordonia bronchialis), C2.2 y LR-4

(Gordonia paraffinivorans) presentan un patron de resultados coherentes con la bibliografía

consultada (Bizet et al., 1997; Kummer et al., 1999; Xue et al., 2003) por lo que podríamos

afirmar que pertenecen a las especies obtenidas en la filogenia.


152

Tabla 27: Resultados fenotípicos para el género Gordonia (I) Temperaturas Degradación

Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento



P39 + +++ + + + - - QB7.1 - +++ - + + + - CS9.1 - +++ - + + + - J4.1 - +++ - + + + -

QB19.1 - +++ + + + - - CS11.1 + +++ + + + + - QB8.2 - +++ + + + + + P158 - +++ - - + + - QB18.2 + +++ + + + - - Ca10.1 - +++ - + + + - P2.3 - +++ - + + - - Ca22.2 - +++ - + + - - D8.2 - +++ - + + - - QB18.1 + +++ - + + + - D12.2 + +++ - + + + - CS13.1 + +++ - + + + - C2.2 + +++ + - + + - LR-4 + +++ + - + + - CS7.1 - +++ + - + + - D11.1 - +++ - - + + - Ca9.1 + +++ - + + + + D13.1 + +++ + - + + - CS32.1 + +++ + - + + - Ca21.1 + +++ + - + + - P108 - +++ + + + + -

Los aislados QB7.1, CS9.1 y J4.1 (Gordonia amarae) presentaban en la filogenia unos

porcentajes de similaridad que se encontraban en el límite de lo estipulado por Stackebrandt y

Ebers (2006) para considerarse la misma especie. Fijándonos en la bibliografía (Bizet et al.,

1997) observamos como los resultados obtenidos en las diferentes pruebas son coherentes, lo

que nos puede indicar que nuestros aislados, pese a no estar en el límite fijado, sí que podrían

ser especies de Gordonia amarae, sin embargo, es conveniente realizar, como se ha comentado

en el apartado de la filogenia, la hibridación DNA:DNA para poder tener la certeza de que

pertenecen a esta especie.

Según la bibliografía (Kageyama et al., 2006) el aislado QB19.1 posee un patrón

diferente a la especie Gordonia araii, ya que para esta especie en cuestión, el crecimiento en

galactosa como fuente de carbono es negativa y en nuestro caso es positiva. Esto nos aporta un

indicio, junto con el porcentaje de similaridad (98.00%), para poder intuir que se tratan de

especies diferentes, lo que habría que comprobar con la hibridación DNA:DNA.


153

Para el aislado QB8.2 (Gordonia cholesterolivorans), el test fenotípico que difiere con

dicha especie es, como en el caso anterior, la galactosa como fuente de carbono. En nuestro

caso es positiva y la bibliografía consultada (Drzyzga et al., 2009) indica que es negativa, con lo

cual podríamos estar ante una posible especie nueva a expensas, eso si, de realizar más

pruebas confirmatorias y la pertinente hibridación DNA:DNA.

Tabla 28: Resultados fenotípicos para el género Gordonia (II)

Fuentes de carbono 1% Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol P39 - + - + + + - + QB7.1 - + - + - + + - CS9.1 - + - + - + + - J4.1 - + - + - + + -

QB19.1 - + - + + + - - CS11.1 - - - + - + - + QB8.2 + + - + + + - - P158 - + - + - + + + QB18.2 - + - + - + - - Ca10.1 - + - + - + - - P2.3 - + - + - + - - Ca22.2 - + - + - + - - D8.2 - + - + - + - - QB18.1 - - - + - + - + D12.2 - - - + - + - - CS13.1 - - - + + + - - C2.2 - + - + + + - - LR-4 - + - + + + - - CS7.1 - + + + - + + + D11.1 - + + + - + + + Ca9.1 - + - + - + - - D13.1 - - - + - + + - CS32.1 - - - + - + + - Ca21.1 - - - + - + + - P108 - - - + - + + -

La bibliografía consultada (Kageyama et al., 2006) para el aislado P158 (Gordonia

effusa) nos indica que posee el mismo patrón de pruebas fenotípicas. El porcentaje de

similaridad nucleotídica obtenido (98.89%) se encuentra en el límite propuesto, sin embargo,

esto apoya la teoría de que el aislado pertenece a esta especie.

El porcentaje de similaridad de los aislados QB18.2 (98.01%), Ca10.1 (97.35%) y P2.3

(97.42%) todas ellas pertenecientes, según la filogenia, a la especie Gordonia hirsuta nos indica

que con toda seguridad se tratan de especies nuevas. Para poder confirmar esto, como se lleva

comentando durante toda la discusión, se deberían hacer más pruebas para poder diferenciar de


154

una manera más clara que no se trata de esa especie sino de otra completamente nueva. Una

pequeña ayuda la aportan los tests fenotípicos realizados que nos indican que poseen un

resultado diferenciador. Este no es otro que el crecimiento en galactosa como única fuente de

carbono. Si se observa la tabla 28 observamos que para este test el resultado obtenido es

negativo, mientras que para la bibliografía consultada (Klatte et al., 1996) el resultado que se

obtiene es positivo. Esto nos da una idea que, con toda seguridad, se traten de especies nuevas,

lo que deberá comprobarse mediante la hibridación DNA:DNA.

Tabla 29: Resultados fenotípicos para el género Gordonia (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1% Aislado Alanina Histidina Prolina P39 + - + QB7.1 - - - CS9.1 - - - J4.1 - - -

QB19.1 - - - CS11.1 - - - QB8.2 + + + P158 + - + QB18.2 - - - Ca10.1 - - - P2.3 - - - Ca22.2 - - + D8.2 - - + QB18.1 + - + D12.2 + - + CS13.1 + - + C2.2 + - + LR-4 + - + CS7.1 + - + D11.1 + - + Ca9.1 + - - D13.1 + - + CS32.1 + - + Ca21.1 + - + P108 - + -

Las pruebas que diferencian, según la bibliografía consultada (Bizet et al., 1997;

Kummer et al., 1999; Xue et al., 2003; Kageyama et al., 2006) a los aislados D8.2 y Ca22.2 con

respecto a la especie Gordonia hydrophobica son el crecimiento en galactosa y maltosa como

fuentes de carbono. Esto nos hace pensar que se tratan de especies diferentes a falta de realizar

más pruebas confirmatorias.


155

Para los aislados pertenecientes a la especie Gordonia malaquae (QB18.1, D12.2 y

CS13.1) encontramos que para dos de ellos (QB18.1 y CS13.1) las pruebas que los diferencian

respecto a la especie obtenida mediante la filogenia son, respectivamente, el meso-inositol y la

galactosa. Según la bibliografía consultada (Yassin et al., 2007) estos aislados no deberían

crecer en presencia de galactosa ni meso-inositol. Es por ello que, observando también los

porcentajes de similaridad obtenidos (98.15% para la cepa QB18.1 y 98.08% para la cepa

CS13.1), podrían tratarse de especies nuevas a expensas de las pertinentes pruebas que

determinen dicha posibilidad.

En la bibliografía consultada (Linos et al., 1999; Xue et al., 2003) para los aislados CS7.1

y D11.1 (Gordonia polyisoprenivorans) se observa como el crecimiento en galactosa como única

fuente de carbono es positivo y, si nos fijamos en la tabla 28, nuestros resultados son negativos.

Esto es un dato de apoyo para discernir si se tratan de especies diferentes. Además, observando

también los porcentajes de similaridad (98.53% y 98.01% respectivamente), los cuales no se

encuentran dentro del límite propuesto por Stackebrandt y Ebers (2006), podríamos afirmar que

se tratan de posibles especies nuevas, siempre y cuando se realicen las posteriores pruebas

confirmatorias.

El aislado Ca9.1 (Gordonia rhizosphera) no posee ninguna prueba diferenciadora según

la bibliografía consultada (Xue et al., 2003). Sin embargo, el porcentaje de similaridad se

encuentra en el límite para considerarla la misma especie. Es por ello que se deberían realizar la

hibridación DNA:DNA y otras pruebas diferentes a las realizadas en el presente trabajo para

poder afirmar que se trata de la misma especie.

Los aislados D13.1, CS32.1 y Ca21.1 (Gordonia sputi / Gordonia jacobaea) no poseen

ninguna prueba diferenciadora para la especie Gordonia sputi según la bibliografía consultada

(Bizet et al., 1997). La especie Gordonia jacobaea es una especie que está en proceso de

validación y es por ello que no se han podido comparar los resultados con ella, sin embargo, el

hecho de que los aislados no posean ninguna prueba diferenciadora con respecto a Gordonia

sputi nos hace pensar que, con toda seguridad, pertenezcan a esta especie aunque para

confirmar se deben realizar las pruebas confirmatorias oportunas.

El porcentaje de similaridad 98.97% del aislado P108 (Gordonia terrae) parece indicar

que se podría tratar de una nueva especie, sin embargo, los resultados obtenidos en los tests


156

fenotípicos son coherentes totalmente con la bibliografía consultada (Bizet et al., 1997),

debiéndonos asegurar mediante otras pruebas confirmatorias.

1.5.4.- Género Microbacterium

En las tablas 30, 31 y 32 podemos observar los resultados de las pruebas fenotípicas

realizadas para el género Microbacterium.

Tabla 30: Resultados fenotípicos para el género Microbacterium (I)


Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento



CQG-5a + +++ - - + + -

Observando la bibliografía (Kageyama et al., 2007) se aprecia como los resultados de

ésta corresponden con los resultados obtenidos en nuestros tests fenotípicos. Es por ello que,

aunque el porcentaje de similaridad del aislado CQG-5a (99.04%) está en torno al límite

propuesto por Stackebrandt y Ebers (2006), podríamos considerar que nuestro aislado se

corresponde con la especie obtenida en la filogenia (Microbacterium lacus).

Tabla 31: Resultados fenotípicos para el género Microbacterium (II)

Fuentes de carbono 1% Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol CQG-5a + + - + + + - +

Tabla 32: Resultados fenotípicos para el género Microbacterium (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1% Aislado Alanina Histidina Prolina CQG-5a - - -

1.5.5.- Género Mycobacterium

Los resultados para el género Mycobacterium se muestran en las tablas 33, 34 y 35. Tal

y como se comentó en el punto 1.5.3 (género Gordonia) se realizó una selección de cepas en

función de la especie, el porcentaje de similaridad y la estación depuradora a la que pertenecía

cada aislado para así tener una muestra representativa mucho más manejable.


157

Tabla 33: Resultados fenotípicos para el género Mycobacterium (I)


Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento



D6.1 + +++ + + + - - D3.2 - +++ + + - - - CS33.1 - +++ + + + + - C5.1a - +++ + + + + - PB6 - +++ + + + + - RG-4b - +++ + + - - - Ca7.2 + +++ + + + - -

Para el aislado D6.1 (Mycobacterium austroafricanum) los resultados obtenidos en los

tests fenotípicos corresponden totalmente con los resultados observados en la bibliografía

consultada (Tsukamura et al., 1983). Por tanto, y observando el porcentaje de similaridad

nucleotídica, podemos afirmar que se trata de la especie en cuestión.

Según la bibliografía consultada (Lévy-Frébault et al., 1983) los resultados obtenidos

para el aislado D3.2 (Mycobacterium fallax) son coherentes con los obtenidos en dicha

bibliografía. Por tanto podemos afirmar que nuestro aislado corresponde con dicha especie, más

aún si cabe teniendo en cuenta que posee un porcentaje de similaridad del 100% con respecto a

ésta.

Atendiendo a los resultados observados en la bibliografía (Doménech et al., 1997) y al

porcentaje de similaridad nucleotídica que presenta el aislado CS33.1 (100% con respecto a

Mycobacterium mageritense) podemos afirmar que nuestro aislado corresponde con dicha

especie.

Los aislados C5.1a y PB6, caracterizados como Mycobacterium mageritense, poseen un

porcentaje de similaridad con dicha especie del 100%. Además, en la bibliografía consultada

(Lévy-Frébault et al., 1983; Doménech et al., 1997) se observa como los resultados obtenidos en

nuestros tests fenotípicos son coherentes. Por tanto podemos afirmar que nuestro aislado se

corresponde con la especie Mycobacterium mageritense.

Para el aislado RG4-b observamos en la bibliografía consultada (Lévy-Frébault et al.,

1983) que el crecimiento en inositol es negativo y en nuestros resultados (Tabla 34) es positivo.

Para confirmar que se corresponde con dicha especie deberemos realizar una hibridación


158

DNA:DNA, pese a que el porcentaje de similaridad (99.48%) es superior al límite fijado por

Stackebrandt y Ebers (2006).

Tabla 34: Resultados fenotípicos para el género Mycobacterium (II)

Fuentes de carbono 1% Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol D6.1 + + - + - + + + D3.2 + + + + + + - - CS33.1 - - - + + + + + C5.1a + + + + + + - + PB6 + + + + + + - + RG-4b - + - - + + + + Ca7.2 - - - + - - + +

Por último, observando el porcentaje de similaridad del aislado Ca7.2 con respecto a la

especie Mycobacterium vanbalenii (100%) y los resultados observados en la bibliografía

consultada (Khan et al., 2002) podemos afirmar que el aislado se corresponde con dicha

especie.

Tabla 35: Resultados fenotípicos para el género Mycobacterium (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1% Aislado Alanina Histidina Prolina D6.1 + + + D3.2 - - - CS33.1 + + + C5.1a + + + PB6 + + + RG-4b + - + Ca7.2 + - +

1.5.6.- Género Pseudonocardia

Como se ha comentado en el apartado 1.4.1.6 de Resultados y Discusión, estos aislados

presentaban un porcentaje de similaridad del 97.47%, con lo que se encontraban muy por debajo

del límite propuesto por Stackebrandt y Ebers (2006). Es por ello que se decidió realizar la

hibridación DNA:DNA, lípidos polares y menaquinonas, entre otras. Las pruebas se realizaron

tan solo para el aislado PA.3 ya que los demás aislados tenían los mismos porcentajes de

similaridad y provenían de la misma planta y, por tanto, se suponían la misma especie.


159

Las características morfológicas se llevaron a cabo en los medios Czapek modificado,

PDA y los medios incluidos en el standard “International Streptomyces Project” (Shirling y

Gottlieb, 1966). También se realizó el perfil de los ácidos grasos. Estos resultados se pueden

observar en las tablas 36 y 37.

Tabla 36: Características de crecimiento aislado PA.3 vs. P. asaccharolytica

Aislado PA.3 P. asaccharolytica DSM 44247

Medio Crecimiento Color micelio

Color Micelio aéreo

Crecimiento Color micelio

Color Micelio aéreo

ISP-2 ++ Amarillo Blanco ++ Amarillo Blanco ISP-3 ++ Blanco Blanco ++ Blanco Blanco ISP-4 +++ Blanco Blanco ++ Blanco Blanco

ISP-5 +++ Amarillo miel

Blanco + Opaco Ninguno

ISP-6 ++ Amarillo débil -

marrón Blanco ++

Amarillo débil - marrón

Blanco

ISP-7 +++ Amarillo miel

Ninguno + Opaco Ninguno

Clave: +++, abundante; ++, moderado; +, crecimiento pobre.

Tabla 37: Perfil ácidos grasos aislado PA.3 vs. P. asaccharolytica

Ácidos grasos Aislado PA3 P. asaccharolytica DSM

44247 Ácidos grasos hidroxi C16:1 2OH 1.41 - Ácidos grasos saturados C14:0 - 1.04 C17:0 - 3.12 C16:0 tr 6.33 Ácidos grasos insaturados C17:1 ω8c tr 5.77 C17:1 ω6c 9.85 5.50 C18:1 ω9c tr 2.13 Ácidos grasos ramificados iso-C14:0 tr 2.18 iso-C15:0 12.27 14.48 iso-C16:0 23.54 23.79 iso-C17:0 14.68 11.46 iso-C18:0 tr - iso-C16:1 H 12.07 6.20 anteiso-C17:0 5.87 4.32 C17:0 10-methyl 3.44 2.73 C18:0 10-methyl tr - Suma de características 3(C16:1 ω7c/ C16:1 ω6c) 2.87 7.33 4(C17:1 iso I/ anteiso B) tr - 9(iso-C17:0 ω9c/ C16:0 10-methyl) 10.28 3.61

Clave -, no detectable.


160

El perfil de ácidos grasos se realizó en los laboratorios de la CECT (Colección española

de Cultivos Tipo). Además, también se realizaron unos tests mediante tira API-ZYM (actividades

enzimáticas) para diferenciar de forma más clara nuestros aislados de la especie

Pseudonocardia asaccharolytica, así como la reducción de nitratos, degradación de tirosina o el

crecimiento a diferentes temperaturas. Estos resultados se muestran en la tabla 38 (solamente

se muestran los resultados diferenciadores).

Tabla 38: Tests fenotípicos diferenciadores entre aislado PA.3 y P. asaccharolytica

Característica Aislado PA3 P. asaccharolytica DSM 44247 Ácido fosfatasa - +

Cisteína arilamidasa + - Esterasa (C4) - +

Leucina arilamidasa + - Valina arilamidasa + -

Tirosina - +

Reducción nitratos - + Crecimiento 37ºC + -

Crecimiento en NaCl al 3% + - Rango pH (crecimiento) 5-10 6-9

Clave: +, positivo; +, positivo débil; -, negativo.

1.5.7.- Género Rhodococcus

A continuación, en las tablas 39, 40 y 41, se muestran los resultados para el género

Rhodococcus.

El aislado 54B, caracterizado como Rhodococcus ruber posee un porcentaje de

similaridad con dicha especie del 100%. Fijándonos en la bibliografía consultada (Bizet et al.,

1997) se observa como los resultados obtenidos en nuestros tests fenotípicos son coherentes

con los resultados aportados por ésta. Por tanto podemos afirmar que nuestro aislado se

corresponde con la especie Rhodococcus ruber.

Para el aislado D1.2 observamos en la bibliografía consultada (Bizet et al., 1997) que los

resultados que se obtienen en la degradación de la urea, el crecimiento en maltosa, el

crecimiento en manitol y en prolina son diferentes a los obtenidos en los tests fenotípicos que se

han realizado. El porcentaje de similaridad (97.78%) es demasiado bajo como para poder afirmar

que se tratan de la misma especie, por tanto sería necesario realizar más pruebas que confirmen

esta posibilidad.


161

Tabla 39: Resultados fenotípicos para el género Rhodococcus (I) Temperaturas Degradación

Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento



54B + +++ + + - - + D1.2 - +++ + + + - + CS26.2 + +++ + + + + - Ca20.2 + +++ + + + + -

Tabla 40: Resultados fenotípicos para el género Rhodococcus (II)

Fuentes de carbono 1% Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol 54B - - - + - + + - D1.2 - + - + - + - - CS26.2 - + - + - + - - Ca20.2 - + - + - + - -

Para acabar con el género Rhodococcus, los aislados CS26.2 y Ca20.2 presentan

diferencias con respecto a la bibliografía consultada (Bizet et al., 1997) en el crecimiento en

maltosa y glucosa y en la degradación de la esculina. Es por ello que, observando también los

porcentajes de similaridad (98.68% y 98.58% respectivamente), se deberá realizar una

hibridación DNA:DNA, además de otras pruebas confirmatorias, para comprobar a que especie

pertenecen.

Tabla 41: Resultados fenotípicos para el género Rhodococcus (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1% Aislado Alanina Histidina Prolina 54B - + - D1.2 - - + CS26.2 - - - Ca20.2 - - -

1.5.8.- Género Tsukamurella

Los resultados para el género Tsukamurella se muestran, a continuación, en las tablas

42, 43 y 44.

Como se vio en el punto 1.4.1.8 de Resultados y Discusión, los aislados QB16.2, 8V y

N1 (recuérdese que el total de cepas es mayor pero se realiza una selección para mejorar la


162

manejabilidad debido a la gran cantidad de aislados y pruebas fenotípicas a realizar), según la

filogenia, presentaban el mismo porcentaje (100%, 99.93% y 99.93% respectivamente) con

respecto a Tsukamurella pseudospumae y Tsukamurella spongiae.

Tabla 42: Resultados fenotípicos para el género Tsukamurella (I)


Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento



QB16.2 + +++ - - - + + 8V - +++ - - - + - N1 - +++ - - - - +

CS10.2 - +++ + - + - - D2.1 - +++ + - + + + QB2.2 - +++ + - + - -

Según la bibliografía consultada (Nam et al., 2004; Olson et al., 2007) el aislado QB16.2

pertenecería a la especie Tsukamurella pseudospumae y los aislados 8V y N1 a la especie

Tsukamurella spongiae. Como se ha comentado anteriormente se deberían realizar más pruebas

aclaratorias para poder estar seguros de una manera más fiable de a qué especie pertenece

cada aislado.

Tabla 43: Resultados fenotípicos para el género Tsukamurella (II)

Fuentes de carbono 1% Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol QB16.2 + + + + + + + - 8V + - - + + + + - N1 + - - + + + + -

CS10.2 - - - + + + - - D2.1 + + + + + + + + QB2.2 - + + + + + + +

El aislado CS10.2, caracterizado como Tsukamurella pulmonis, posee un porcentaje de

similaridad con dicha especie del 99.85%. Además, en la bibliografía consultada (Kattar et al.,

2001; Seong et al., 2003) se observa como los resultados obtenidos en nuestros tests fenotípicos

son coherentes. Por tanto podemos afirmar que nuestro aislado se corresponde con la especie

Tsukamurella pulmonis.


163

Tabla 44: Resultados fenotípicos para el género Tsukamurella (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1% Aislado Alanina Histidina Prolina QB16.2 + + + 8V + + + N1 + + +

CS10.2 + + + D2.1 + + + QB2.2 + + +

Por último, para los aislados D2.1 y QB2.2, la bibliografía consultada (Olson et al., 2007)

demuestra que podrían pertenecen a la especie Tsukamurella tyrosinosolvens y no a la especie

Tsukamurella strandjordii, sin embargo, para estar seguros de que realmente es así se deberían

realizar las pertinentes pruebas confirmativas.

1.5.9.- Género Williamsia

Este género solo cuenta con un aislado (CS1.1). Los resultados se muestran a

continuación en las tablas 45, 46 y 47.

Tabla 45: Resultados fenotípicos para el género Williamsia (I)


Aislado Crecimiento

10ºC Crecimiento

28ºC Crecimiento



CS1.1 + +++ + + + - -

Para el aislado CS1.1 (Williamsia muralis) los resultados obtenidos en la bibliografía

consultada (Kämpfer et al., 1999; Yassin et al., 2007) son coherentes con los resultados

obtenidos en los tests fenotípicos realizados. Por tanto, podemos afirmar que el aislado CS1.1

pertenece a la especie Williamsia muralis.

Tabla 46: Resultados fenotípicos para el género Williamsia (II)

Fuentes de carbono 1% Aislado Lactosa Maltosa Arabinosa Fructosa Galactosa Glucosa Manitol Meso-inositol CS1.1 + - + + - + - +

Tabla 47: Resultados fenotípicos para el género Williamsia (III)

Fuentes de carbono y nitrógeno 0.1%

Aislado Alanina Histidina Prolina CS1.1 + + +


164

2.- Biodegradación de compuestos derivados del petróleo

2.1.- Ensayos de biodegradación

Para realizar las pruebas de biodegradación se sembraron todos los aislados en los tres

medios de cultivo conteniendo cada uno de ellos fenol, naftaleno y glucosa, siendo este último el

control positivo tomado como referencia. Todas las cepas se incubaron a una temperatura

constante de 28º C.

En primer lugar, y antes de realizar la siembra en los compuestos tóxicos a degradar, se

sembró cada aislado en los tres medios de cultivo suplementados únicamente con glucosa al

0.1% como única fuente de carbono para realizar una aclimatación previa de los

microorganismos al medio mineral y así facilitar su posterior crecimiento.

La lectura de las pruebas de crecimiento se realizó a los 14 y 21 días de incubación a

28º C. Como se puede observar en la tabla 48 (crecimiento a los 21 días), todas las cepas tienen

un crecimiento máximo en los tres medios de cultivo suplementados con glucosa al 0.1% como

única fuente de carbono.

Como se puede observar en la tabla 48, 76 aislados (resaltados en naranja) son capaces

de degradar al menos un producto tóxico (fenol, naftaleno o ambos).

Los mejores degradadores de naftaleno son, considerando los aislados que posean una

degradación de dos + o superior, las especies Corynebacterium freneyi (QB8.1), Dietzia

cercidiphylli (P46p), Gordonia alkanivorans (P39 y L10), Gordonia amarae (CS6.1, CS8.1, CS9.2,

CS24.2 y CS27.1), Gordonia araii (QB19.1, QB19.2 y CS10.3), Gordonia bronchialis (CS6.2 y

CS11.1), Gordonia cholesterolivorans (QB8.2), Gordonia hirsuta (P2.3 y CS5.1), Gordonia

malaquae (QB18.1 y P2.2), Gordonia polyisoprenivorans (CS7.1, CS32.4, D11.1, D16.1, P54 y

P141), Mycobacterium fallax (D3.2), Mycobacterium mageritense (CS33.1), Mycobacterium

vanbalenii (D16.2 y Ca7.2), Rhodococcus rhodochrous (D1.2) y Tsukamurella tyrosinosolvens

(QB2.2 y N16-9).


165

Tabla 48: Resultados ensayos biodegradación a los 21 días de incubación

M9 MSM BHM Aislado Glucosa Naftaleno Fenol Glucosa Naftaleno Fenol Glucosa Naftaleno Fenol QB2.1 +++ - - +++ - - +++ - - QB8.1 +++ ++ ++ +++ ++ + +++ ++ ++ P46p +++ ++ - +++ ++ - +++ + - P26 +++ + + +++ + ++ +++ + + P39 +++ + - +++ ++ - +++ ++ - L10 +++ ++ - +++ ++ - +++ + - QB7.1 +++ + - +++ ++ - +++ ++ - QB13.1 +++ - - +++ - - +++ - - QB17.2 +++ - - +++ - - +++ - - QB21.2 +++ - - +++ - - +++ - - QB22.1 +++ - - +++ - - +++ - - J4.1 +++ - - +++ - - +++ - - P1.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS3.1 +++ + - +++ + - +++ + - CS6.1 +++ ++ - +++ + - +++ ++ - CS8.1 +++ ++ - +++ + - +++ + - CS8.2 +++ - - +++ + - +++ + - CS9.1 +++ + - +++ + - +++ + - CS9.2 +++ ++ - +++ + - +++ - - CS12.2 +++ + - +++ + - +++ + - CS16.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS18.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS20.3 +++ + - +++ ++ - +++ + - CS21.4 +++ - - +++ - - +++ - - CS24.2 +++ ++ - +++ + - +++ ++ - CS25.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS27.1 +++ ++ - +++ ++ - +++ + - P152 +++ - - +++ - - +++ - - QB19.1 +++ ++ - +++ + - +++ +++ - QB19.2 +++ + - +++ ++ - +++ ++ - CS10.3 +++ ++ - +++ ++ - +++ ++ - CS6.2 +++ +++ - +++ ++ - +++ +++ - CS11.1 +++ +++ - +++ ++ - +++ +++ - QB8.2 +++ ++ - +++ ++ - +++ +++ - P158 +++ + + +++ + + +++ + + QB6.1 +++ - - +++ - - +++ - - QB18.2 +++ + - +++ + - +++ ++ - P2.3 +++ ++ - +++ ++ - +++ + - D11.2 +++ - - +++ - - +++ - - D12.3 +++ - - +++ - - +++ - - CS5.1 +++ ++ - +++ ++ - +++ ++ - CS11.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS12.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS12.3 +++ - - +++ - - +++ - - CS16.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS18.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS19.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS20.4 +++ - - +++ - - +++ - - CS21.3 +++ - - +++ - - +++ - - CS26.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS27.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS28.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS28.4 +++ - - +++ - - +++ - - Ca10.1 +++ + - +++ ++ - +++ + -


166

Tabla 48 (continuación): Resultados ensayos biodegradación a los 21 días de incubación

M9 MSM BHM Aislado Glucosa Naftaleno Fenol Glucosa Naftaleno Fenol Glucosa Naftaleno Fenol Ca17.1 +++ - - +++ - - +++ - - Ca22.2 +++ + - +++ + - +++ + - QB10.1 +++ - - +++ - - +++ - - QB10.2 +++ + - +++ ++ - +++ + - QB16.1 +++ - - +++ - - +++ - - QB20.1 +++ - - +++ - - +++ - - QB21.1 +++ - - +++ - - +++ - - D8.1 +++ - - +++ - - +++ - - D8.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS10.1 +++ + - +++ + - +++ + - CS32.3 +++ - - +++ - - +++ - - QB18.1 +++ ++ - +++ + - +++ + - P2.2 +++ ++ - +++ ++ - +++ + - D1.1 +++ - - +++ - - +++ - - D2.2 +++ + - +++ + - +++ + - D7.1 +++ - - +++ - - +++ - - D12.2 +++ - - +++ - - +++ - - D15.1 +++ + - +++ + - +++ + - CS13.1 +++ + - +++ + - +++ + - CS17.3 +++ + - +++ + - +++ ++ - CS18.3 +++ - - +++ - - +++ - - Ca16.1 +++ - - +++ - - +++ - - P175 +++ - - +++ - - +++ - - C2.1 +++ - - +++ - - +++ - - C2.2 +++ - - +++ - - +++ - - LR-4 +++ - - +++ - - +++ - - R1 +++ - - +++ - - +++ - - R5 +++ - - +++ - - +++ - - C5.6 +++ - - +++ - - +++ - - D16.1 +++ +++ - +++ ++ - +++ +++ - CS7.1 +++ ++ - +++ ++ - +++ ++ - CS32.4 +++ ++ - +++ +++ - +++ ++ - P54 +++ +++ - +++ ++ - +++ + - P141 +++ ++ - +++ ++ - +++ + - D11.1 +++ + - +++ ++ - +++ ++ - Ca9.1 +++ + - +++ + - +++ - - E9 +++ - - +++ - - +++ - -

D13.1 +++ - - +++ - - +++ - - D15.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS17.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS20.2 +++ - - +++ - - +++ - - CS28.3 +++ - - +++ - - +++ - - CS32.1 +++ - - +++ - - +++ - - CS32.2 +++ - - +++ - - +++ - - Ca3.1 +++ - - +++ - - +++ - - Ca21.1 +++ - - +++ - - +++ - - P48b +++ - - +++ - - +++ - - Ca19.1 +++ + + +++ + ++ +++ + ++ Ca27.1 +++ + ++ +++ - ++ +++ + ++ P108 +++ - + +++ + ++ +++ + ++

CQG-5a +++ - - +++ - - +++ - - D6.1 +++ + - +++ + - +++ - - D9.1 +++ ++ - +++ + - +++ + - P72 +++ + - +++ + - +++ + -


167

Tabla 48 (continuación): Resultados ensayos biodegradación a los 21 días de incubación

M9 MSM BHM Aislado Glucosa Naftaleno Fenol Glucosa Naftaleno Fenol Glucosa Naftaleno Fenol D3.2 +++ ++ - +++ + - +++ + - CS33.1 +++ ++ - +++ + - +++ ++ - C2.3 +++ - - +++ - - +++ - -

C5.1a +++ - - +++ - - +++ - -

C5.1b +++ - - +++ - - +++ - -

C4.1 +++ - - +++ - - +++ - -

C4.5 +++ - - +++ - - +++ - -

PA.2 +++ - - +++ - - +++ - -

PB.6 +++ - - +++ - - +++ - -

PB.7 +++ - - +++ - - +++ - -

RG4-a +++ - - +++ - - +++ - -

RG4-b +++ - - +++ - - +++ - -

D16.2 +++ ++ - +++ + - +++ ++ - Ca7.2 +++ ++ - +++ + - +++ ++ - PA.3 +++ - - +++ - - +++ - -

PB.1 +++ - - +++ - - +++ - -

PB.3 +++ - - +++ - - +++ - -

PC.4 +++ - - +++ - - +++ - -

54B +++ + +++ +++ + +++ +++ + +++ C5.5a +++ + +++ +++ + +++ +++ + +++ P135 +++ + ++ +++ + +++ +++ + ++ D1.2 +++ ++ - +++ +++ - +++ ++ - P1.1 +++ + - +++ ++ - +++ ++ - P2.1 +++ - - +++ - - +++ - -

D2.3 +++ ++ - +++ + - +++ + - CS26.2 +++ - - +++ - - +++ - -

Ca20.2 +++ - - +++ - - +++ - -

QB7.2 +++ + - +++ - - +++ + - QB16.2 +++ + - +++ + - +++ + - 8V +++ + - +++ + - +++ + -

CS20.1 +++ - - +++ + - +++ + - P145 +++ - - +++ + - +++ - - N1 +++ + - +++ + - +++ + - N4 +++ + - +++ + - +++ + - N5 +++ + - +++ + - +++ + - N9-1 +++ + - +++ + - +++ - - N17-4 +++ + - +++ - - +++ + - CS10.2 +++ + + +++ + ++ +++ + + D2.1 +++ + + +++ + + +++ + ++ P166 +++ + + +++ + + +++ + + L2 +++ + + +++ + + +++ + +

QB2.2 +++ + - +++ +++ - +++ ++ - N16-9 +++ ++ - +++ +++ - +++ ++ - CS1.1 +++ + - +++ ++ - +++ + -

A su vez, las mejores especies degradadoras de fenol son Corynebacterium variabile

(QB8.1), Gordonia terrae (Ca19.1, Ca27.1 y P108) y Rhodococcus ruber (54B, C5.5a y P135).


168

En las figuras 34 y 35 podemos observar dos ejemplos de la degradación del fenol por

parte de los aislados de Rhodococcus ruber.

Con todo ello, para reafirmar más aún los resultados obtenidos, se decidió hacer una

prueba para comprobar si los aislados degradadores eran autótrofos. El motivo fue que los

aislados PA.3, PB.1, PB.3 y PC.4, pertenecientes al género Pseudonocardia, degradaban

aparentemente el naftaleno y el fenol pero, según la bibliografía consultada (Warwick et al.,

1994), existe alguna especie de este género que es autótrofa.

Los aislados se sembraron a partir de las placas de aclimatación previa en los medios de

cultivo elegidos, pero esta vez sin ninguna fuente de carbono presente. Los resultados que se

obtuvieron fueron los esperados, esto es, que ninguno de los aislados pertenecientes al

suborden Corynebacterineae presentaba autotrofía ya que, consultando la bibliografía, en el

grupo de los mycolata no se encontró ninguna autotrofía descrita. Sin embargo, los aislados del

género Pseudonocardia (PA.3, PB.1, PB.3 y PC.4) sí que poseían esta característica, con lo que

los resultados fueron falsos positivos y, por tanto, no se contabilizaron como especies

degradadoras de fenol o naftaleno.

Figura 34: control positivo glucosa medio MSM (A) y aislado 54B en medio MSM suplementado con fenol (B)

Figura 35: control positivo glucosa medio M9 (A) y aislado C5.5a en medio M9 suplementado con fenol (B)

A B

A B


169

2.2.- Detección molecular del gen catecol 1,2-dioxigenasa

Como ya se ha explicado en la introducción, la catecol 1,2-dioxigenasa está implicada en

la ruptura del anillo aromático, mediante la división en orto, esto es, entre los carbonos 1 y 2 del

anillo bencénico.

Para detectar este gen se llevó a cabo, como se comentó en el punto 3.1 de Material y

Métodos, la amplificación mediante PCR de dicho gen, utilizando los iniciadores C120f y C120r

(Shen et al., 2009).

La PCR se realizó para todas las cepas obtenidas en el proceso de aislamiento (un total

de 152). Posteriormente, la detección de los fragmentos amplificados obtenidos en la PCR de la

catecol 1,2-dioxigenasa se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,2% (Figura 36).

Tras realizar la electroforesis, de las 152 cepas de estudio, 31 de ellas dieron un

resultado positivo y, por tanto, poseen la capacidad de degradar productos tóxicos que

contengan el anillo bencénico (Tabla 49).

Todos los géneros, a excepción de los géneros Corynebacterium, Microbacterium,

Mycobacterium y Tsukamurella, poseen el gen en alguna de sus especies. Hay que resaltar que

el número de aislados que degradan no corresponde con el número de aislados que poseen el

gen de la catecol.

Figura 36: Gel de PCR con los productos de amplificación del gen catecol 1,2-dioxigenasa. 1: Marcador de peso molecular; 2: Blanco sin DNA; 3: Control negativo; 4: Control positivo;

5: PB.1; 6:P39; 7: Ca27.1; 8: 54B; 9:QB7.1 y 10: CS6.1.

400 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


170

Tabla 49: Resultados PCR catecol 1,2-dioxigenasa

Aislado QB2.1 QB8.1 P26 P46p P39 L10 QB7.1 QB13.1

PCR - - + + + + + -

Aislado QB17.2 QB21.2 QB22.1 J4.1 P1.2 CS3.1 CS6.1 CS8.1

PCR - - - - - + + +

Aislado CS8.2 CS9.1 CS9.2 CS12.2 CS16.1 CS18.1 CS20.3 CS21.4

PCR + + + + - - + -

Aislado CS24.2 CS25.1 CS27.1 P152 QB19.1 QB19.2 CS10.3 CS6.2

PCR + - + - - - - +

Aislado CS11.1 QB8.2 P158 QB6.1 QB18.2 P2.3 D11.2 D12.3

PCR + - - - - - - -

Aislado CS5.1 CS11.2 CS12.1 CS12.3 CS16.2 CS18.2 CS19.2 CS20.4

PCR - - - - - - - -

Aislado CS21.3 CS26.1 CS27.2 CS28.1 CS28.4 Ca10.1 Ca17.1 QB10.1

PCR - - - - - - - -

Aislado QB10.2 QB16.1 QB20.1 QB21.1 D8.1 D8.2 CS10.1 CS32.3

PCR - - - - - - - -

Aislado Ca22.2 E9 QB18.1 P2.2 D1.1 D2.2 D7.1 D12.2

PCR - - - - - - - -

Aislado D15.1 CS13.1 CS17.3 CS18.3 Ca16.1 P175 C2.1 C2.2

PCR - - - - - - - -

Aislado LR-4 R1 R5 C5.6 D16.1 CS7.1 CS32.4 P54

PCR - - - - - - - -

Aislado P141 D11.1 Ca9.1 D13.1 D15.2 CS17.1 CS20.2 CS28.3

PCR - - - - - - - -

Aislado CS32.1 CS32.2 Ca3.1 Ca21.1 P48b Ca19.1 Ca27.1 P108

PCR - - - - - + + +

Aislado CQG-5a D6.1 D9.1 P72 D3.2 CS33.1 C2.3 C5.1a

PCR - - - - - - - -

Aislado C5.1b C4.1 C4.5 PA.2 PB.6 PB.7 RG4-a RG4-b

PCR - - - - - - - -

Aislado D16.2 Ca7.2 PA.3 PB.1 PB.3 PC.4 54B C5.5a

PCR - - + + + + + +

Aislado P135 D1.2 P1.1 P2.1 D2.3 CS26.2 Ca20.2 QB7.2

PCR + + + - + - - -

Aislado QB16.2 8V CS20.1 P145 N1 N4 N5 N9-1

PCR - - - - - - - -

Aislado N17-4 CS10.2 D2.1 P166 L2 QB2.2 N16-9 CS1.1

PCR - - - - - - - +


171

2.2.1.- Género Corynebacterium

Dentro del género Corynebacterium, los aislados QB2.1 (Corynebacterium freneyi) y

QB8.1 (Corynebacterium variabile) no presentan el gen de la catecol 1,2-dioxigenasa, sin

embargo, el aislado QB8.1 degrada el naftaleno y el fenol. Esto puede ser debido a que estas

especies presenten una ruta de degradación alternativa a la de la catecol 1,2-dioxigenasa (como

puede ser la ruta de degradación de la catecol 2,3-dioxigenasa), debido a mutaciones

(inserciones o deleciones) que no permitan la correcta hibridación de los primers o también a la

transferencia horizontal de genes (Táncsics et al., 2007).

2.2.2.- Género Dietzia

Los aislados P26 (Dietzia maris) y P46p (Dietzia cercidiphylli) presentan el gen catA.

Estos datos coinciden con los resultados de los ensayos de biodegradación ya que ambos

aislados degradadan el naftaleno.

2.2.3.- Género Gordonia

Este género presenta una amplia variedad en los resultados. Los aislados P39 y L10

(Gordonia alkanivorans) dan positivo para la reacción de PCR y, como se ha visto en los

ensayos de biodegradación, degradan el naftaleno.

Los aislados QB13.1, QB17.2, QB21.2, QB22.1, J4.1, P1.2, CS16.1, CS18.1, CS21.4,

CS25.1 y P152 (Gordonia amarae) no presentan el gen de la catecol ni degradan ningún

compuesto tóxico, algo que es de esperar ya que en la bibliografía consultada (Shen et al., 2009)

se toma como control negativo en dicha PCR. Sin embargo, los aislados QB7.1, CS3.1, CS6.1,

CS8.1, CS8.2, CS9.1, CS9.2, CS12.2, CS20.3, CS24.2 y CS27.1, también pertenecientes a la

especie Gordonia amarae, presentan el gen de la catecol y, además, degradan el naftaleno. Es

por ello, como se ha explicado en la caracterización genotípica, que cabe la posibilidad de que

pertenezcan a otra especie diferente.

Para la especie Gordonia araii, los aislados QB19.1, QB19.2 y CS10.3 no presentaban el

gen de la catecol, sin embargo degradaban el naftaleno, debiéndose a una incorrecta hibridación


172

de los primers ocasionada por mutaciones en el genoma, la transferencia horizontal de genes o

porque esa especie presente una ruta de degradación alternativa (Táncsics et al., 2007).

Los aislados pertenecientes a la especie Gordonia bronchialis (CS6.2 y CS11.1) poseen el

gen catA y degradan el naftaleno. Las especies Gordonia cholesterolivorans y Gordonia effusa

no presentan el gen catA pero sí degradan el naftaleno (QB8.2) y el naftaleno y el fenol (P158),

debido a que presenten rutas alternativas de degradación, mutaciones en el genoma o

transferencia horizontal de genes (Táncsics et al., 2007).

Los aislados QB6.1, D11.2, D12.3, CS11.2, CS12.1, CS12.3, CS16.2, CS18.2, CS19.2,

CS20.4, CS21.3, CS26.1, CS27.2, CS28.1, CS28.4 y Ca17.1 (Gordonia hirsuta) no presentan el

gen catA ni degradan ninguno de los dos compuestos tóxicos. Sin embargo, los aislados QB18.2,

P2.3, CS5.1, Ca10.1 y Ca22.2, pertenecientes a la misma especie, aunque no presentan dicho

gen sí que degradan el naftaleno, algo que puede ser debido, según Táncsics et al. (2007) a la

transferencia horizontal de genes, la mala hibridación de los primers o a que presenten una ruta

de degradación alternativa a la de la catecol 1,2-dioxigenasa.

Lo mismo ocurre con los aislados QB10.2, CS10.1 (Gordonia hydrophobica) y con los

aislados QB18.1, P2.2, D2.2, D15.1, CS13.1 y CS17.3 (Gordonia malaquae) que no poseen el

gen catA pero sí degradan el naftaleno. El resto de los aislados de estas especies (CS18.3,

CS32.3, QB10.1, QB16.1, QB20.1, QB21.1, D1.1, D7,.1 D8.1, D8.2, D12.2, Ca16.1 y P175) ni

presentan el gen ni degradan ningún compuesto tóxico.

Para la especie Gordonia paraffinivorans, los aislados C2.1, C2.2, LR-4, R1, R5 y C5.6 no

presentan el gen catA ni degradan ningún compuesto tóxico. Para los aislados E9, D13.1, D15.2,

CS17.1, CS20.2, CS28.3, CS32.1, CS32.2, Ca3.1, Ca21.1 y P48b (Gordonia sputi) ocurre lo

mismo, esto es, ni poseen dicho gen ni degradan ningún compuesto tóxico.

Los aislados D16.1, CS7.1, CS32.4, P54, P141 y D11.1, pertenecientes a la especie

Gordonia polyisoprenivorans (recuérdese que los porcentajes de similaridad nucleotídica están

por debajo de los límites fijados por Stackebrandt y Ebers (2006) y que, por tanto, pueden ser

consideradas especies diferentes), degradan el naftaleno pero no presentan el gen catA.

Igualmente ocurre con el aislado Ca9.1 (Gordonia rhizosfera).


173

Para la especie Gordonia terrae, todos sus aislados (Ca19.1, Ca27.1 y P108) presentan el

gen de la catecol 1,2-dioxigenasa y, además degradan tanto el naftaleno como el fenol.

2.2.4.- Género Microbacterium

El único aislado de este género, CQG-5a, (Microbacterium lacus) no presenta el gen

catA ni degrada ningún tipo de compuesto.

2.2.5.- Género Mycobacterium

Los aislados C2.3, C5.1a, C5.1b, C4.1, C4.5, PA.2, PB.6, PB.7 (Mycobacterium

smegmatis) y los aislados RG4-a y RG4-b (Mycobacterium vaccae) no presentan el gen catA ni

degradan ninguno de los dos compuestos.

En cambio, los aislados D6.1, D9.1 y P72 (Mycobacterium austroafricanum), el aislado

D3.2 (Mycobacterium fallax), el aislado CS33.1 (Mycobacterium mageritense) y los aislados

D16.2 y Ca7.2 (Mycobacterium vanbalenii) no poseen dicho gen pero, sin embargo, degradan el

naftaleno, lo que puede ser debido a la mala hibridación de los primers en la reacción de PCR, a

mutaciones en el genoma, la transferencia horizontal de genes o a que presenten rutas

alternativas de degradación (Táncsics et al., 2007).

2.2.6.- Género Pseudonocardia

Estos aislados (PA.3, PB.1, PB.3 y PC.4), considerados especies nuevas, presentan el

gen de la catecol 1,2-dioxigenasa pero no degradan ningún compuesto tóxico. Esto puede ser

debido a que alguna zona funcional del enzima esté afectada por alguna mutación.

2.2.7.- Género Rhodococcus

La especie Rhodococcus ruber (54B, C5.5a y P135) posee el gen catecol 1,2-dioxigenasa

y en los ensayos de biodegradación ha degradado ambos tóxicos. La especie Rhodococcus

rhodochrous (D1.2) también posee el gen catA pero tan solo degrada el naftaleno.


174

Los aislados P1.1 y D2.3 (Rhodococcus zopfii) presentan un resultado positivo para la

amplificación del gen catA y, además, degradan el naftaleno. El resto de aislados pertenecientes

a esta especie (P2.1, CS26.2 y Ca20.2) ni presentaban el gen ni degradaban ningún compuesto.

Esto puede ser debido a que, como se ha visto en el apartado de la caracterización genotípica,

los porcentajes de similaridad nucleotídica son muy bajos y podriamos estar hablando de otra

especie que no fuera la que se obtuvo realizando la filogenia.

2.2.8.- Género Tsukamurella

Todos los aislados de este género degradan al menos un compuesto tóxico pero

ninguno de ellos posee el gen catA. Según Táncsics et al. (2007) esto puede ser debido a que

estas especies presenten una ruta de degradación alternativa a la de la catecol 1,2-dioxigenasa

(como puede ser la ruta de degradación de la catecol 2,3-dioxigenasa), debido a mutaciones

(inserciones o deleciones) que no permitan la correcta hibridación de los primers o también a la

transferencia horizontal de genes.

Los aislados QB7.2, QB16.2, 8V, CS20.1, P145, N1, N4, N5 N9-1 y N17-4 (Tsukamurella

pseudospumae) y los aislados QB2.2 y N16-9 (Tsukamurella tyrosinosolvens) degradan tan solo

el naftaleno.

El aislado CS10.2 (Tsukamurella pulmonis) y los aislados D2.1, P166 y L2 (Tsukamurella

spumae) degradan los dos compuestos tóxicos.

2.2.9.- Género Williamsia

Para este género, el único aislado (CS1.1), perteneciente a la especie Williamsia

muralis, posee el gen y además degrada el naftaleno.

2.2.10.- Obtención y análisis de las secuencias del gen catA

Para comprobar que el gen detectado era el gen que estábamos buscando se decidió

realizar un BLAST con algunas de las cepas pertenecientes a los géneros Dietzia, Gordonia,

Pseudonocardia, Rhodococcus y Williamsia que habían dado positivo en la PCR.


175

Los productos de la PCR se purificaron utilizando el kit de purificación GenElute (Sigma),

siguiendo las indicaciones del fabricante, y se enviaron a secuenciar al Laboratorio de

Secuenciación del IBMCP (Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas) de la Universidad

Politécnica de Valencia (UPV).

Para la realización de las reacciones de secuenciación se utilizó el kit ABI PRISM® Big

DyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction (versión 3.1). Estas reacciones fueron sometidas a

electroforesis capilar en un secuenciador automático “Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer”.

Las secuencias completas, con una longitud aproximada de 400 bases, se obtuvieron en

un archivo de texto electrónico desde el electroferograma mediante la aplicación científica

CHROMAS (versión 1.43). Al ser de tan poca longitud no hizo falta el ensamblaje de los

fragmentos (forward y reverse), simplemente se eliminaron los segmentos inicial y final

(alrededor de 25 nucleótidos de longitud) de cada secuencia ya que suelen presentar una baja

fiabilidad.

En la tabla 50 se observan los resultados obtenidos. Como se puede observar, los

resultados confirman el resultado positivo del gen.

Tabla 50: Resultados BLAST catecol 1,2-dioxigenasa

Aislado Identificación Similaridad (%) P26 Gordonia terrae gen catecol 1,2-dioxigenasa 80.00 %

CS11.1 Gordonia bronchialis gen catecol 1,2-dioxigenasa 99.00 % Ca27.1 Gordonia terrae gen catecol 1,2-dioxigenasa 100.00 % PA.3 Gordonia rubripertincta gen catecol 1,2-dioxigenasa 83.00 % D1.2 Rhodococcus rhodochrous gen catecol 1,2-dioxigenasa 98.75 % C5.5a Rhodococcus ruber gen catecol 1,2-dioxigenasa 99.00 % 54B Rhodococcus ruber gen catecol 1,2-dioxigenasa 99.00 % CS1.1 Williamsia muralis gen catecol 1,2-dioxigenasa 99.00 %

Además, para los aislados CS11.1 (Gordonia bronchialis), Ca27.1 (Gordonia terrae),

D1.2 (Rhodococcus rhodochrous) C5.5a (Rhodococcus ruber), 54B (Rhodococcus ruber) y

CS1.1 (Williamsia muralis) se confirman los resultados obtenidos en la filogenia.

Sin embargo, el aislado P26 (Dietzia maris según la filogenia) y el aislado PA.3

(Pseudonocardia asaccharolytica según la filogenia) no muestran un porcentaje de similaridad


176

alto ni la identificación corresponde con la obtenida en la caracterización genotípica debido a

que, hasta ahora, no se había detectado este gen en estas 2 especies o, si se había detectado,

en el momento de realizar el BLAST aún no estaba depositada la secuencia en la base de datos

del NCBI.

3.- Consideraciones finales

Desde que se desarrolló el sistema de depuración de aguas residuales basado en el

sistema de fangos activos, en 1914, las plantas de depuración de aguas residuales fueron

diseñadas y controladas principalmente por ingenieros dejando de lado el hecho de que el propio

proceso de depuración es principalmente microbiológico. Una fecha importante que apoyó el

papel que juegan los microorganismos fue en 1969. En ese año se describió el llamado “Misterio

de Milwaukee” donde se comprobó que uno de los principales problemas que interfieren en la

depuración de aguas residuales es causado por microorganismos. A partir de aquí se empieza a

estudiar el proceso de depuración por equipos interdisciplinares formados por ingenieros y por

microbiólogos en donde estudian todos los grandes grupos microbianos que intervienen en la

depuración, tanto útiles como perjudiciales. Dentro de los microorganismos perjudiciales, los

actinomicetos juegan un papel muy importante como se ha demostrado en la presente tesis

doctoral.

A partir de los años 40, desde el descubrimiento por parte de Waksman y Woodruff

(1941) de que los actinomicetos son capaces de producir antibióticos, el interés por estos

microorganismos ha ido en aumento, no solamente por la capacidad de generar este tipo de

sustancias sino también por otras muchas aplicaciones biotecnológicas tales como la

descomposición de sustancias tóxicas, descomposición de restos vegetales y animales o la

formación de compuestos húmicos.

En la actualidad se están llevando a cabo numerosos estudios de biodiversidad de este

tipo de microorganismos por todo el mundo ya que, como se ha indicado anteriormente, ofrecen

numerosas aplicaciones biotecnológicas. En este contexto se planteó un estudio para evaluar la

biodiversidad de actinomicetos cultivables en diferentes estaciones depuradoras de aguas

residuales urbanas e industriales, situadas en diferentes emplazamientos de la geografía

española.


177

Este trabajo se estructuró en dos partes. En la primera se realizó una caracterización de

cepas pertenecientes al suborden Corynebacterineae presentes en muestras de fangos activos

mediante su aislamiento, identificación y caracterización quimiotaxonómica, genotípica y

fenotípica.

Se aislaron un total de 152 cepas provenientes de 28 plantas, todas ellas con problemas

de espumas biológicas o “foaming”. Se observó, mediante el estudio previo de cepas de

referencia pertenecientes a este suborden, que los aislados que se obtuvieron tenían la

morfología típica nocardioforme, predominando las colonias pequeñas, rugosas y / o mucosas y

un micelio basal que se fragmentaba dando lugar a formas bacilares o cocoides. Todas ellas

eran Gram positivas y catalasa positivas. Sin embargo, estos métodos convencionales, basados

en características morfológicas y tinciones diferenciales, no permiten diferenciar los géneros de

mycolata formadores de espumas.

La quimiotaxonomía ha sido muy utilizada para caracterizar actinomicetos (Lechevalier y

Lechevalier 1980). El primer paso en la caracterización taxonómica de actinomicetos es el

estudio del quimiotipo de pared celular. Los nocardioformes poseen una pared celular tipo IV,

aunque otros géneros de actinomicetos que no contienen ácidos micólicos también tienen este

tipo de pared, por lo tanto la determinación del quimiotipo de pared no es suficiente. En este

trabajo se ha realizado la detección de ácidos micólicos por cromatografía en capa fina (TLC)

(Hamid et al., 1993) ya que los mycolata son las únicas bacterias que contienen estos

compuestos, la determinación de los isómeros del ácido diaminopimélico (Staneck y Roberts,

1974) y la extracción y análisis de los azúcares predominantes de la pared celular (Hasegawa et

al., 1983). Se ha observado que estos tres parámetros tienen valor taxonómico suficiente para

incluir a un aislado dentro del suborden Corynebacterineae y en el caso de los ácidos micolicos

pueden dar una buena aproximación a nivel de género si comparamos la movilidad

cromatográfica de los aislados con cepas de referencia. No obstante, estos parámetros

quimiotaxonomicos pueden variar según las condiciones de cultivo (Wick et al., 2002), por lo

tanto en este trabajo se ha realizado la detección de estos 3 parámetros, en condiciones

estándar de cultivo, como un primer paso en la caracterización de mycolata.

Estas pruebas demostraron que todos los aislados, a excepción de 5, pertenecían al

suborden Corynebacterineae ya que poseían ácidos micólicos, componentes indispensables

para formar parte de dicho suborden. Sin embargo, se decidió mantener los aislados que no


178

tenían los componentes típicos de la pared celular de los mycolata ya que presentaban una

morfología muy similar a la nocardioforme y presentaban una abundancia en el aislamiento inicial

en placa muy alta, con lo que también podrían estar implicados en algún proceso de depuración.

Después de obtener estos 3 parámetros, se realizó una PCR para amplificar el gen 16S

rDNA, utilizando para ello los iniciadores específicos diseñados por Lane (1991). En la

caracterización de cepas, los métodos moleculares basados en la PCR son más efectivos que

los fenotípicos por su especificidad, sensibilidad y reproducibilidad. La sensibilidad de la PCR

depende en gran medida de la especificidad de los iniciadores. En todos los aislados se amplificó

el gen 16S rDNA, obteniéndose un fragmento de aproximadamente 1500 pares de bases.

Posteriormente se realizó la secuenciación de los productos de PCR, se elaboraron los

árboles filogenéticos y las matrices de similaridad obteniéndose un total de 9 géneros distintos

(Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Rhodococcus, Tsukamurella y Williamsia

pertenecientes al suborden Corynebacterineae; Microbacterium perteneciente al suborden

Micrococcineae y Pseudonocardia, género perteneciente al suborden Pseudonocardineae) y 37

especies diferentes lo que indica la gran biodiversidad encontrada en el presente estudio.

Además, se identificaron no solamente géneros y especies típicas de fangos activos

como Gordonia amarae (Goodfellow et al., 1994; Klatte et al., 1994) o Tsukamurella spumae

(Nam et al., 2003) sino también géneros y especies que no se habían encontrado hasta la fecha

en estos ambientes como es el caso de Williamsia muralis (Kämpfer et al., 1999) o especies

patógenas para humanos como es el caso de Dietzia maris (Pidoux et al., 2001), Gordonia

bronchialis (Tsukamura, 1971) o Gordonia terrae (Pham et al., 2003). Todo esto indica que

todavía queda mucho por estudiar en el proceso microbiológico de depuración de aguas

residuales, ya que tradicionalmente, los microorganismos que interfieren en el proceso, sobre

todo los productores de espumas biológicas, se han limitado a grupos poco definidos, es decir,

morfologías observadas en plantas con problemas de espumas denominadas como GALO

(antiguamente NALO) sin especificar qué especies en concreto eran las responsables.

Hay que tener en cuenta que la capacidad de producción de espumas de un

microorganismo, en nuestro caso de los mycolata, depende de la abundancia del mismo en la

planta y de la hidrofobicidad de la membrana externa. Dicha hidrofobicidad viene derterminada

por los ácidos micólicos presentes en todas las especies incluidas dentro del grupo de los


179

mycolata. Estos compuestos varían en longitud y en complejidad presentando diversos patrones

de ramificaciones, de manera que cuanto más largas y más ramificadas sean las cadenas

carbonadas, más hidrofobicidad confieren al microorganismo. En este sentido las especies que

contienen acidos micólicos de cadena más corta pertenecen a los géneros Corynebacterium

(22C - 36C) y Dietzia (34C - 38C) mientras que las especies con acidos micólicos más largos y

más complejos pertenecen a los géneros Mycobacterium (60C - 90C) y Tsukamurella (62C -

78C). Esto indica que se está pasando por alto dos géneros de mycolata con alta hidrofobicidad,

Mycobacterium y Tsukamurella, y por lo tanto con alta capacidad para producir espumas. En la

presente tesis doctoral se ha demostrado que ambos géneros en conjunto suponen un

porcentaje importante (aproximadamente un 21%). Por lo tanto se debería incluir, además de los

clásicos productores de espumas como Gordonia y Rhodococcus, a los géneros Tsukamurella y

Mycobacterium.

De las 152 especies, atendiendo al criterio y límites fijados por Stackebrandt y Ebers

(2006) para considerar a un par de especies como pertenecientes a la misma especie,

basándose en la similitud de secuencias del 16S rDNA, encontramos que 48 de ellas poseen un

porcentaje menor del 98.70% propuesto y que 17 de ellas lo poseen en el límite comprendido

entre el 98.7% y el 99%, con lo que estaríamos hablando de un total de 65 posibles especies

nuevas.

En el presente estudio se ha comprobado que el género Gordonia es el más importante

en la formación de espumas ya que, de los 152 aislados, 100 de ellos pertenecen a dicho

género, algo que concuerda perfectamente con la bibliografía dado que la importancia de este

género en estaciones depuradoras con sistemas de fangos activos ha sido estudiada en

numerosas ocasiones, llegando a tal conclusión (Goodfellow et al., 1996; Stainsby et al., 2002).

Además, tradicionalmente se ha considerado Gordonia amarae como la principal

productora de espumas. En el presente estudio tan solo el 22% de los aislados del género

Gordonia pertenecían a esta especie. Por lo tanto el acrónimo conocido como GALO debería

incluir muchas más especies de este género. Este hecho pone de manifiesto que no solo esta

especie es la principal especie productora de espumas y, por tanto, el papel de otros géneros,

como por ejemplo Rhodococcus, Tsukamurella o Mycobacterium, en la formación de espumas

biológicas puede estar subestimado. Es por ello que los técnicos de depuradora, extrapolando

esos resultados, tienden a equivocarse en la identificación de los microorganismos productores


180

de espumas y, por tanto, muchas veces no eligen las soluciones correctas para eliminar

eficazmente dichos problemas.

La caracterización fenotípica basada en características metabólicas se realizó para

completar los resultados obtenidos tanto en la caracterización quimiotaxonómica como en la

caracterización genotípica. Estos tests fenotípicos nos ayudan a diferenciar especies que están

muy próximas o que pueden ser consideradas especies nuevas debido a que el porcentaje de

similaridad obtenido crea ciertas dudas. Como se ha dicho anteriormente, 65 de los aislados

podrían ser considerados como especies nuevas. Generalmente estos tests no difieren mucho

entre especies del mismo género, sin embargo, siempre existen ciertas pruebas que

proporcionan elementos diferenciadores que pueden ayudar a mejorar la caracterización del

aislado en comparación con la especie de referencia más próxima filogenéticamente. Sin

embargo, esto son datos de apoyo, nunca definitivos ya que se debería realizar, como se ha

dicho anteriormente, la hibridación DNA:DNA y otras pruebas confirmatorias tales como

menaquinonas, ácidos grasos, tira API-ZYM u otras pruebas que diferenciaran de manera mucho

más clara nuestros aislados de la especie en cuestión.

La segunda parte del trabajo se centra en estudiar la capacidad de biodegradación de

los aislados obtenidos mediante ensayos de biodegradación y la detección molecular del gen

catecol 1,2-dioxigenasa, el cual está implicado en la ruptura del anillo aromático y, por tanto, en

la biodegradación de los compuestos tóxicos naftaleno y fenol.

De los 152 aislados, la mitad de ellos eran capaces de degradar al menos el fenol y/o el

naftaleno. Todas los aislados con esta capacidad pertenecían al suborden Corynebacterineae,

ningún aislado del género Microbacterium o Pseudonocardia degradaba el fenol o el naftaleno.

En la bibliografía consultada, estos dos últimos géneros no destacan como biodegradadores de

derivados del petróleo, sin embargo, la abundancia de las colonias observadas en el momento

del aislamiento podría indicar un papel importante en la planta donde fueron aisladas.

El compuesto tóxico que mejor se degradaba fue el naftaleno. Esto se explica porque el

fenol es un bactericida y puede inhibir la capacidad de degradación de algún aislado.

En la detección molecular del gen de la catecol 1,2-dioxigenasa se observó que solo 31

aislados presentaban dicho gen. Estos 31 aislados también degradaban en placa en los ensayos


181

previamente realizados. Sin embargo, para los 45 aislados restantes que degradaban en placa

no se detectó dicho gen. Esto puede ser debido, según Tánsics et al. (2007), a que los aislados

presenten una ruta de degradación alternativa a la de la catecol 1,2-dioxigenasa, debido a

mutaciones que no permitan la correcta hibridación de los primers o a la transferencia horizontal

de genes.

CONCLUSIONES

Conclusiones

185

1.- Los resultados obtenidos en esta tesis indican que los problemas de espumas en las

plantas de tratamiento estudiadas son causados por una gran diversidad de microorganismos

filamentosos que contienen ácidos micólicos, pertenecientes al suborden Corynebacterineae. La

presencia de ácidos micólicos es necesaria para que el microorganismo sea considerado como

productor de espumas.

2.- De los 152 aislados estudiados en el presente trabajo, el 65.79% (100 aislados)

pertenece al género Gordonia, el 11.18% (17 aislados) al género Mycobacterium, el 10.53% (16

aislados) al género Tsukamurella, el 5.92% (9 aislados) al género Rhodococcus y el 6.58% (10

aislados) restante repartido entre los géneros Corynebacterium, Dietzia, Microbacterium,

Pseudonocardia y Williamsia.

3.- Gordonia amarae es la especie considerada por la bibliografía como la principal

productora de espumas, sin embargo, en el presente trabajo, se demuestra que existe un gran

número de especies dentro de este género con dicha capacidad, ya que de los 100 aislados

pertenecientes al género Gordonia, tan solo el 22% de ellos pertenecen a dicha especie.

4.- Se han encontrado especies patógenas para humanos tales como Dietzia maris,

Gordonia bronchialis, Gordonia sputi o Tsukamurella pulmonis con el consiguiente peligro para la

salud humana que conllevaría el riego de zonas agrícolas con ese tipo de agua depurada.

5.- El segundo género más importante en el presente trabajo es el género

Mycobacterium. En comparación con otros estudios realizados en plantas depuradoras de aguas

residuales domésticas, se han aislado un buen número de micobacterias, todas ellas

ambientales, sin embargo, no se descarta la posibilidad de que estuvieran presentes

micobacterias patógenas aunque debido a su lento crecimiento no fue posible aislarlas.

6.- El género Tsukamurella, tercero en importancia en el presente trabajo, presenta

aislados que son reconocidos productores de espumas como Tsukamurella spumae y

Tsukamurella pseudospumae y otros que no han sido relacionados nunca con espumas en

fangos activos como Tsukamurella tyrosinosolvens.

Conclusiones

186

7.- El género Rhodococcus, aislado en otras zonas frecuentemente y reconocido como

uno de los principales productores de espumas, es uno de los géneros con menor incidencia en

las plantas depuradoras estudiadas.

8.- La técnica del análisis del 16S rDNA, que incluye la elaboración de árboles

filogenéticos y matrices de similaridad nucleotídica, ha resultado ser el método más fiable para

identificar los actinomicetos nocardioformes a nivel de especie. La taxonomía polifásica es de

gran ayuda para poder identificar actinomicetos ya que proporciona una mayor información

acerca del conjunto de características genotípicas y fenotípicas.

9.- Se obtiene un porcentaje total de cepas degradadoras del 50.00% (76 aislados),

siendo los géneros Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Rhodococcus y

Tsukamurella los mejores degradadadores de naftaleno y los géneros Corynebacterium,

Gordonia y Rhodococcus los mejores degradadores de fenol.

10.- El gen de la catecol 1,2-dioxigenasa se detecta en el 20.39% de los aislados (31 de

ellos).

11.- Según el criterio propuesto por Stackebrandt y Ebers en 2006, se obtiene un

31.58% (48 aislados) de posibles nuevas especies, un porcentaje muy elevado tratándose de tan

pocas muestras estudiadas.

12.- Se demuestra que existe una gran diversidad de microorganismos que están

implicados en los problemas de espumas biológicas y que un elevado porcentaje tiene la

capacidad de degradar compuestos tóxicos. Esto permitiría optimizar el proceso biológico en

función de las bacterias filamentosas encontradas y mejorar la calidad del efluente, así como

también utilizar la capacidad de biodegradación de esas bacterias en ambientes contaminados y,

por tanto, mejorar el medio ambiente en general.

PROPUESTA DE NUEVA ESPECIE

Propuesta de nueva especie

189

1.- Pseudonocardia hispalensis

Aislado obtenido en la depuradora de aguas residuales de una planta química, dedicada

a la obtención de productos químicos derivados del petróleo, situada en Palos de Frontera

(Huelva, España).

Actinomiceto aerobio, Gram positivo, catalasa positivo, oxidasa negativo y no

acidorresistente que presenta un micelio aéreo y de sustrato ampliamente ramificado y

fragmentado que incluye formas cocáceas y bacilares. Crece en los medios incluidos en el

standard “International Streptomyces Project” (medios ISP 2 - 7) fomando un micelio aéreo de

color blanco pero no produciendo pigmentos difundibles. Crece en un rango de pH de 5 a 10, con

un óptimo de 7 - 8. El rango óptimo de temperatura de crecimiento se encuentra entre los 28 y

los 37º C, no creciendo a una temperatura de 10º C. Crece en presencia de 3% de NaCl. Ureasa

negativo. No degrada adenina, tirosina, xantina ni hipoxantina. No produce ácidos a partir de

glucosa, ramnosa, xilosa, fructosa, trehalosa, celobiosa, manitol, sorbitol, eritritol, maltosa,

lactosa, arabinosa, adonitol ni salicina. Produce leucina y valina arilamidasas. Contiene meso-

DAP en su pared celular y arabinosa y galactosa como azúcares predominantes. El ácido graso

mayoritario es el iso-C16:0 y la menaquinona principal es MK8 (H4). El patrón de lípidos polares

contiene difosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol y

fosfatidilmetilamina. El contenido en G + C del DNA es de 69.7 mol%. El valor de hibridación

DNA:DNA con respecto a Pseudonocardia asaccharolytica es del 38%, formando un único

cluster con ella y mostrando una similaridad, según la matriz de similaridad nucleotídica, del

97.48%.

El aislado se encuentra depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)

con el número de colección CECT 8030T. “Accession number” (Gen Bank - NCBI): FR695486.

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Direcciones y páginas web de interés:

• Nacional Center for Biotechnology Information (USA): www.ncbi.nlm.nih.gov/

• GenBank: www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/

• BLAST: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

ANEXOS

Anexo 1 – Medios de cultivo empleados

217

Composición de los medios de cultivo empleados referida a un litro de agua destilada. Medio ISP-2 Extracto de levadura 4 g Extracto de malta 10 g Dextrosa 4 g Agar 20 g pH 7.0 Medio GYEA Glucosa 10 g Extracto de levadura 10 g Agar 18 g pH 7.0 Medio CZAPEK modificado NaNO3 2 g K2HPO4 1 g MgSO4·7H2O 0.5 g KCl 0.5 g FeSO4 0.01 g Sacarosa 30 g Extracto de levadura 2 g Agar 18 g pH 7.2 Medio SAUTON Asparagina 5 g Casaminoácidos 2 g Glucosa 15 g Citrato sódico 1.5 g KH2PO4 5 g MgSO4·7H2O 0.5 g K2SO4 0.5 g Citrato amónico férrico 0.01 g Agar 18 g Tiamina 0.05 g Ácido nalidíxico 0.02 g pH 7.2


218

Medio BASAL WILLIAMS Extracto de levadura 3 g Citrato amonio-ferroso 0.05 g Agar 18 g pH 7.2 Medio STEVENSON

Solución 10X Base levadura nitrogenada 67 g Casaminoácidos 0.1 g Agua destilada 1 l

Solución A Fosfato dipotásico (10%) 200 ml

Medio completo Solución 10X + Solución A 100 ml Agar fundido 800 ml Fuente carbono y/o nitrógeno tindalizada 100 ml Medio M9

Na2HPO4 7 g KH2PO4 3 g NaCl 0.5 g NH4Cl 1 g CaCl2 0,02 g MgSO4 0,2 g Agar 18 g

Medio MSM

KH2PO4 1.4 g K2HPO4 1.7 g MgSO4·7H2O 0.5 g NH4NO3 1.5 g CaCl2 . 2H2O 0.04 g FeSO4 . 7H2O 1 mg Agar 18 g


219

Medio BHM

MgSO4·7H2O 0.2 g CaCl2 0.02 g KH2PO4 1 g K2HPO4 1 g NH4NO3 1 g FeCl3 (solución 60%) 2 gotas Agar 18 g

Anexo 2 – Soluciones, Reactivos y Material de Identificación para PCR

220

Tampón TE Tris-CHI 10mM, EDTA 1mM Solución RNAsa RNAsa A (Boehringer) 5 mg NaCl 1M 15 ml Tris 1M (pH 8.3) 6 ml EDTA 0.5M 1.5 ml Agua MilliQ 77 ml Calentar a 100ºC durante 5 min. para inactivar las DNAsas y enfriar. Conservar a –20ºC. Tampón TAE 10X Tris base 48,4 g Na2EDTA·2H2O 7,44 g Ácido acético glacial 11,42 ml Agua MilliQ 1000 ml pH 8,5 Gel de Agarosa Agarosa D-1 Media EEO (Pronadisa) Agarosa D-1 Alta EEO (Pronadisa) Solución de bromuro de etidio 10 mg/ml (IBERLABO) Pesar la agarosa (1-2%) y transferir a un matraz, añadir el tampón TAE 1X, calentar hasta que rompa a hervir, agitar y atemperar hasta 50ºC. Añadir 3µl de bromuro de etidio por cada 50 ml de agarosa y verter en el molde. Marcadores de pesos moleculares Lambda DNA/HindIII (IBERLABO) Low Range III 10µl Tampón de carga 20µl Agua MilliQ estéril 90µl 100pb DNA Ladder (IBERLABO) Marcador L-101 50µl Tampón TE 750µl Tampón de carga 200µl

Anexo 3 – Términos y Abreviaturas empleadas

221

Mycolata Actinomicetos nocardioformes que contienen ácidos micólicos “Foam” Espumas biológicas producidas por mycolata en fangos activos “Foaming” Producción de espumas biológicas por mycolata “Bulking” Aumento de volumen de los sólidos en suspensión producido por

bacterias filamentosas API Instituto Americano del Petróleo BLAST Basic Local Alignment Search Tool CECT Colección Española de Cultivos Tipo cm Centímetro DNA Ácido desoxirribonucleico DAP Ácido diaminopimélico DNTPs Desoxinucleótidos Trifosfato DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen EDAR Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales EDARI Estaciones Depuradoras de Aguas Residuales Industriales EDTA Ácido etilendiaminotetracético FAE Fango Activo en Exceso FAR Fango Activo Recirculado g Gramo G + C Contenido en Citosina + Guanina GALO Gordonia amarae-Like Organism GYEA Glucose Yeast Extract Agar HAP Hidrocarburo Aromático Policíclico IBMCP Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas IVF Índice Volumétrico de Fango ml Mililitro NALO Nocardia amarae-Like Organism NCBI National Center for Biotechnology Information OMS Organización Mundial de la Salud pb Pares de bases PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction) PTLO Pine Tree-Like Organism RNA Ácido ribonucléico rpm Revoluciones por minuto rRNA Ácido ribonucléico ribosómico SDS Dodecil Sulfato Sódico TAE Tris-acético-EDTA TBAH Hidróxido de Tetrabutil Amonio TE Tris-EDTA TLC Thin Layer Cromatography UPV Universitat Politècnica de València USEPA Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos UV Ultravioleta V Voltio WCS Wall Cell Sugar µl Microlitro µm Micrometro

Anexo 4 – Árbol filogenético completo género Corynebacterium

223

Árbol filogenético completo del género Corynebacterium basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.02 sustituciones por posición de nucleótido.

0.020

T.otitidis

C.kroppens

C.camporea

D.maris

T.pauromet

C.ulceribo

C.amycolat

C.sphenisc

C.urealyti

C.coyleae

C.sputi

C.mustelae

C.bovis

C.sphenis

C.kutscher

C.riegelii

C.nuruki

Aislado QB2.1

C.maris

C.doosanen

C.aquilae

C.stationi

C.efficien

C.tubercul

C.diphther

C.terpenot

C.glaucum

M.brevis

C.hansenii

C.aurimuco

C.imitans

C.capitovi

C.halotole

C.suicordi

C.testudin

C.confusum

C.ciconiae

C.aferment

C.pilbaren

C.mucifaci

C.ureicele

C.appendic

C.tuscanie

C.sundsval

C.thomssen

C.lipophil

C.mycetoid

C.auris

C.timonens

C.minutiss

C.singular

C.simulans

C.striatum

C.flavesce

C.phocae

C.propinqu

C.pseudodi

C.cystitid

C.massilie

C.accolens

C.macginle

C.ammoniag

C.casei

C.lubrican

C.pilosum

C.callunae

C.glutamic

C.humiredu

C.marinum

C.pseudotu

C.ulcerans

C.argentor

C.felinum

C.canis

C.freiburg

C.caspium

C.renale

C.atypicum

C.mastitid

C.auriscan

C.resisten

C.falsenii

C.jeikeium

Aislado QB8.1

C.variabil

C.freneyi

C.xerosis

M.tubercul

A.subflavu

R.rhodochr

S.rotundus

G.bronchia

S.piniform

N.asteroid

W.muralis

C.durum

C.matrucho

C.glucuron

C.pyruvici

100

98

64

61

95

63

100

80

97

53

95

97

71

65

93

52

61

100

99

62

56

100

89

98

60

92

65

53

100

60

91

85

55

100

54

100

66

99

83

100

55

79

92

100

55

100

52

100

60

63

100

98

95

97

76

79

100

Anexo 5 – Árbol filogenético completo género Dietzia

225

Árbol filogenético completo del género Dietzia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

T.otitidis

C.diphther

T.pauromet

D.timorens

D.lutea

N.asteroid

D.alimenta

D.aerolata

M.brevis

D.psychral

D.kunjamen

S.piniform

D.natronol

Aislado P26

D.maris

D.schimae

Aislado P46p

D.cercidip

D.cinnamea

D.papillom

R.rhodochr

S.rotundus

M.tubercul

A.subflavu

G.bronchia

W.muralis

100

100

53

100

97

89

52

79

77

66

99

96

53

57

97

100

98

66

Anexo 6 – Árbol filogenético completo género Gordonia

227

Árbol filogenético completo del género Gordonia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

T.otitidis C.diphther

W.muralis

G.kroppens

G.shandong

G.defluvii

G.hirsuta

G.otitidis G.aichiens

G.humi

Aislado CS25.1

Aislado CS21.4

Aislado CS21.3

G.desulfur

Aislado QB7.1

Aislado CS19.2

Aislado QB6.1

Aislado CS17.3

Aislado CS32.3

G.amicalis

Aislado CS16.1

Aislado R5

Aislado D12.2

Aislado QB18.2

Aislado D12.3

Aislado QB16.1

Aislado CS6.1

Aislado CS28.3

Aislado R1

Aislado CS28.4

Aislado D11.2

G.polyisop

Aislado CS9.2

Aislado QB18.1

Aislado CS26.1

Aislado CS28.1

G.westfali

G.neofelif

Aislado C22

Aislado D16.1

Aislado P108

Aislado CS27.1

Aislado Ca3.1

Aislado P2.2

Aislado CS5.1

Aislado CS27.2

Aislado QB8.2

R.rhodochr

Aislado P39

Aislado D8.2

Aislado LR4

Aislado Ca27.1

Aislado CS7.1

Aislado P48B

Aislado CS17.1

G.araii

Aislado QB13.1

S.piniform

Aislado D15.1

Aislado Ca16.1 Aislado D1.1

Aislado CS10.3

S.rotundus

Aislado CS12.3

Aislado Ca17.1

Aislado CS11.2

Aislado L10

G.hydropho

Aislado QB10.1

Aislado C5.6

Aislado Ca19.1

G.bronchia

Aislado P152

Aislado P141

Aislado D15.2

Aislado Ca21.1

Aislado QB21.2

Aislado D13.1


Aislado CS3.1

Aislado CS18.3

G.malaquae Aislado P175 Aislado D7.1

Aislado D2.2 Aislado CS13.1

G.choleste G.sihwensi

Aislado D8.1 Aislado QB21.1


Aislado Ca22.2 Aislado Ca10.1 Aislado P2.3

Aislado Cs10.1 Aislado CS20.4

Aislado CS18.2

Aislado CS16.2

Aislado CS12.1

Aislado CS8.2 G.amarae

Aislado P1.2 Aislado J4.1

Aislado QB22.1 Aislado QB17.2 Aislado CS18.1 Aislado CS8.1

Aislado CS20.3

Aislado CS12.2

Aislado P158

G.effusa Aislado QB19.2 Aislado QB19.1

Aislado D11.1 G.sinesedi

Aislado P54

Aislado CS32.4

Aislado Ca9.1 G.rhizosph

Aislado CS32.1 G.sputi

Aislado E9 Aislado CS20.2

Aislado CS32.2 G.jacobaea

G.hankooke

G.soli

G.lacunae

G.terrae

Aislado C2.1

G.paraffin Aislado CS11.1

Aislado CS6.2

G.namibien

G.rubriper

G.alkanivo G.nitida

N.asteroid M.brevis

D.maris T.pauromet

M.tubercul A.subflavu

100 97

53

57 83

52

71

78

89

99

79

99

73

100 69

51

55

58

62

56

63

60

88

66

81

100

57

82

51

65

100

91

100

100

91

93

55

100

58

100

82

83

60 98

99 97

67

56

65

63

100

58

65

93

93 67

91 100

63

87

66

68

61

62 92

Anexo 7 – Árbol filogenético completo género Microbacterium

229

Árbol filogenético completo del género Microbacterium basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

A.bicolora

M.hatanoni

M.keratano

M.testaceu

M.paraoxyd

M.oleivora

M.terregen

M.luteolum

M.soli

M.profundi

M.pygmaeum

M.halotole

M.saperdae

M.luticoct

M.radiodur

M.insulae

M.aerolatu

M.aoyamens

M.flavum

M.liquefac

M.barkeri

M.ginsengi

M.sedimini

M.xylanily

M.hydrocar

M.humi

M.azadirac

M.arboresc

M.imperial

M.marinila

M.paludico

M.kribbens

M.ulmi

M.gubbeene

M.indicum

M.agarici

M.lindanit

M.aquimari

M.halophil

M.pseudore

M.resisten

M.binotii

M.thalassi

M.hominis

M.mitrae

M.ketosire

M.terrae

M.flavesce

M.trichoth

M.dextrano

M.laevanif

M.chocolat

M.kitamien

M.arabinog

M.esteraro

M.foliorum

M.phyllosp

M.ginseng

M.natorien

M.maritypi

M.oxydans

M.fluvii

M.terricol

M.lacticum

M.scheleif

M.awajiens

M.koreense

M.deminutu

M.pumilum

Aislado CQG-5a

M.invictum

M.aurum

M.lacus

100

54

71

60

90

93

82

60

75

97

66

77

100

99

99

94

100

65

100

68

78

99

91

83

75

72

58

88

64

Anexo 8 – Árbol filogenético completo género Mycobacterium

231

Árbol filogenético completo del género Mycobacterium basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.02 sustituciones por posición de nucleótido.

0.02


A.subflavu

M.gadium

M.conspicu

M.riyadhen

M.porifera

M.pyrenivo

M.lacus

M.goodii M.smegmati

M.szulgai

M.aurum

Aislado C23

M.avium

M.hodleri

M.arosiens

M.austroaf

Aislado C45

M.brisbane

M.concepti

M.malmoens

Aislado P72

M.shinjuku

Aislado PB7

M.neoaurum

M.immunoge

N.asteroid

M.intermed

M.hassiacu

M.pinniped

Aislado D9.1

Aislado C4.1

M.frederik

M.abscesus

M.microti

M.shimoide

Aislado D6.1

M.pseudosh

M.bolletii

Aislado C51A

M.madagasc

M.noviomag

M.rutilum

M.vulneris

M.genavens

Aislado D16.2

M.lentifla

M.celatum

M.marseill

M.vaccae

M.hibernia

M.massilie

M.shottsii

Aislado PA2

M.confluen

M.heckesho

M.chubuens

M.septicum M.porcinum

M.mantenii

M.holsatic

M.phlei

M.flavesce

M.chitae

M.wolinsky

M.aichiens

M.farcinog

M.africanu

M.parafort

M.insubric

M.obuense

Aislado PB6

M.elephant M.pulveris

M.moriokae M.thermore

M.agri M.duvalii

M.doricum M.monacens

M.brumae M.novocast

M.chloroph M.rufum

Aislado RG4B Aislado RG4A

Aislado Ca7.2 M.vanbaale

Aislado CS33.1 M.magerite

M.aromatic M.rhodesia

M.gilvum M.psychrot

M.crocinum M.pallens

M.houstone M.senegale

M.fortuitu M.setense

M.boenicke M.neworlea

M.alvei M.peregrin

M.komossen M.tusciae

M.canarien M.cosmetic M.diernhof M.fluorant

M.aubagnen M.llatzere

M.mucogeni M.phocaicu

M.chelonae M.salmonip

M.murale M.tokaiens

Aislado D3.2 M.fallax

M.arupense M.nonchrom

M.kumamoto M.senuense

M.algericu M.terrae

M.heidelbe M.parmense

M.sherrisi M.simiae

M.montefio M.triplex M.florenti

M.stomatep M.europaeu

M.parascro M.kubicae

M.palustre

M.interjec M.saskatch

M.asiaticu M.gordonae

M.caprae M.tubercul

M.marinum M.ulcerans

M.paraffin M.scrofula

M.paraseou M.seoulens

M.bohemicu M.nebraske

M.gastri M.kansasii

M.chimaera M.intracel

M.bouchedu M.colombie

M.cookii M.triviale

M.branderi M.kyorinen

M.botniens M.xenopi

M.brevis S.piniform

G.bronchia W.muralis

R.rhodochr S.rotundus

D.maris T.pauromet

100

100

98

70

65

54

77

55

96

52

88

91

54

98

76

57

53

84

100

92

98

65

52

92

95

81

51

86

72

81

59

69

51

99

90

88

89

85

52

71

79

93

67

67

100

53

100

100

69

60

93

82

64

100

98

100

100

98

71

56

52

94

99

86

84

72

95

67

96

100

70

90

80

95

51

52

Aislado C51B

Anexo 9 – Árbol filogenético completo género Pseudonocardia

233

Árbol filogenético completo del género Pseudonocardia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

A.oriental

P.artemisi

P.parietis

P.babensis

P.mongolie

P.asacchar

P.endophyt

P.tetrahyd

P.ammoniox

Aislado PC4

P.aurantia

Aislado PB3

P.antarcti

P.halophob

P.kongjuen

P.petroleo

P.chloroet

P.khuvsgul P.thermoph

P.adelaide P.kunminge

P.alaninip P.yunnanen

P.saturnea P.xinjiang

Aislado PB1 Aislado PA3 P.ailaonen

P.oroxyli

P.hydrocar P.sulfidox

P.benzeniv P.dioxaniv

P.autotrop P.compacta

P.nitrific P.tropica

P.alni P.carboxyd P.spinosa

P.spinosis P.acaciae

P.eucalypt

100 98

64

81

92

87

100

71

100

77

54

100

95

82

59 99

99

100

92

56

100

100

97

96

71

56

Anexo 10 – Árbol filogenético completo género Rhodococcus

235

Árbol filogenético completo del género Rhodococcus basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1


M.tubercul

R.coryneba

R.coprophi R.phenolic

R.marinona

R.jostii

R.globerul

R.aetherov

R.percolat

Aislado C55A

W.muralis

R.erythrop

R.opacus

R.rhodochr

Aislado 54B

Aislado D2.3

M.brevis

Aislado P2.1

R.kyotonen

R.quigshen

R.wratisla

R.koreensi R.imtechen

R.tukisamu R.maanshan

R.yunnanen R.fascians

R.jialingi R.baikonur

R.kunminge N.asteroid

R.equi

S.rotundus R.triatoma

R.rhodnii

Aislado P135 R.ruber

Aislado D1.2 R.kroppens

R.pyridini R.gordonia

Aislado P1.1 R.zopfii

Aislado CS26.2 Aislado Ca20.2

G.bronchia S.piniform

D.maris T.pauromet

100

100

79

56

78

54

96

100

72

100

59

94

100

99

100

100

100

61

85

74

50

55

74

63

73

85

56

51

69

Anexo 11 – Árbol filogenético completo género Tsukamurella

237

Árbol filogenético completo del género Tsukamurella basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.1 sustituciones por posición de nucleótido.

0.1

T.otitidis

C.diphther

M.tubercul

D.maris

T.soli

T.strandjo

Aislado QB16.2

Aislado 8V

Aislado N5

N.asteroid

Aislado N4

W.muralis

T.spumae

Aislado N9-1

Aislado N17-4

M.brevis

Aislado P166

T.pulmonis

Aislado N1

Aislado P145

Aislado QB7.2

T.pseudosp

Aislado CS20.1

T.sunchone

Aislado L2

Aislado D2.1

Aislado CS10.2

T.spongiae

T.carboxyd

T.tyrosino

Aislado QB2.2

Aislado N16-9

T.inchonen

T.pauromet

R.rhodochr

S.rotundus

G.bronchia

S.piniform 100

100

57

99

100

73

76

53

81 99

62 89

97

67

Anexo 12 – Árbol filogenético completo género Williamsia

239

Árbol filogenético completo del género Williamsia basado en la comparación de secuencias del 16S rDNA entre los aislados obtenidos y las especies validadas del género. Los porcentajes en los nudos indican los niveles de “bootstrap” significativos basados en 1000 réplicas. Escala: 0.02 sustituciones por posición de nucleótido.

0.02

T.otitidis

C.diphther

M.tubercul

G.bronchia

N.asteoide

R.rhodochr

W.faeni

W.serinede

W.muralis

S.rotundus

Aislado CS1.1

W.marianen

W.deligens

W.maris

M.brevis

S.piniform

D.maris

T.pauromet 100

100

67

59

51

59

100

70

100

76

70

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Biodiversidad de actinomicetos aislados de plantas