BIOGEOGRAFIA DE BACTRIAS CULTURVEIS ASSOCIADAS … · biogeografia de bactÉrias culturÁveis associadas À fruteiras tropicais . samuel tavares dos santos . universidade estadual

BIOGEOGRAFIA DE BACTÉRIAS CULTURÁVEIS ASSOCIADAS À

FRUTEIRAS TROPICAIS

SAMUEL TAVARES DOS SANTOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

DEZEMBRO 2008

i


FRUTEIRAS TROPICAIS


Tese apresentada ao Centro de Biociências e

Biotecnologia, da universidade Estadual do

Norte Fluminense, como parte das exigências

para obtenção do título de Doutor em

Biociências e Biotecnologia.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

DEZEMBRO 2008

ii


FRUTEIRAS TROPICAIS


Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia, da universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia.

Aprovada em dia mês ano

Comissão Examinadora:

___________________________________________________________________

Prof. Nome (Titulo, área de especialização) – Sigla da Instituição.

___________________________________________________________________


___________________________________________________________________


___________________________________________________________________

Prof. Fábio Lopes Olivares (Doutor, Microbiologia) – UENF.

(Orientador)

iii

DEDICATÓRIA

Aos meus Pais (Manoel dos Santos (in memória) e Maria de Lourdes), aos

meus irmãos (Francisco, Humberto, Raquel e Regina) e aos meus sobrinhos (Kaline,

Wesley, Gabriel, Guilherme e Gustavo), pelo carinho e motivação.

iv

AGRADECIMENTOS Ao Dr. Fabio Lopes Olivares (meu orientador), e demais Pesquisadores e

Professores: Dr. José Ivo Baldani, Dra. Vera Lúcia Divan Baldani, Dra. Verônica

Massena Reis, Dr. Gonçalo, Dr. Martelleto. Aos Amigos Juarez, Valéria, Vanessa,

Késsia, Rarume, Marlon. À UENF e à Embrapa – Agrobiologia.

v

Sumário DEDICATÓRIA............................................................................................................iv

AGRADECIMENTOS...................................................................................................v

SUMÁRIO....................................................................................................................vi

ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................viii

ÍNDICE DE FIGURAS...................................................................................................x

RESUMO....................................................................................................................xii

ABSTRACT................................................................................................................xiv

1. Introdução.................................................................................................................1

2. Revisão de Literatura...............................................................................................3

2.1 Panorama da Fruticultura............................................................................3

2.2 Biogeografia de Microrganismos.................................................................5

2.3 Biogeografia de bactérias Associadas a Vegetais......................................6

2.3.1 sítios de colonização de bactérias em vegetais............................7

- A rizosfera.............................................................................................7

- O ambiente epifítico..............................................................................8

- O ambiente endofítico.........................................................................10

2.3.2 formas de disposição: solitária (ou planktônica) x biofilme (ou

agregados):.........................................................................................11

2.4 Biogeografia de Bactérias Diazotróficas...................................................12

2.5 Potencial biotecnológico de bactérias associadas a vegetais...................17

3. Material e Métodos.................................................................................................20

3.1. Isolamento de bactérias diazotróficas associadas a fruteiras..................20

3.2. Isolamento de bactérias não-diazotróficas...............................................23

3.3. Caracterização parcial e estocagem dos isolados...................................24

3.4. Análise dos resultados do número mais provável (NMP) de bactérias

diazotróficas..............................................................................................26

4. Objetivo..................................................................................................................28

4.1. Objetivos Gerais.......................................................................................28

4.2. Objetivos específicos................................................................................28

5. Resultados.............................................................................................................30

5.1. Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número

mais provável (NMP).............................................................................30

5.1.1. o caso do abacaxizeiro...............................................................30

vi

5.1.1.1. maiores valores observados de NMP:.........................30

5.1.1.2. freqüência de detecção...............................................33

5.1.1.3. Diversidade, riqueza e abundância.............................35

5.1.2. o caso da goiabeira..................................................................37

5.1.2.1. maiores valores observados de NMP.........................37

5.1.2.2. frequência de detecção...............................................39

5.1.2.3. Diversidade, riqueza e abundância............................41

5.1.3. o caso do mamoeiro.................................................................43

5.1.3.1. maiores valores observados de NMP.........................43

5.1.3.2. freqüência de detecção..............................................44

5.1.3.3. Diversidade, riqueza e abundância............................47

5.1.4. O caso do maracujazeiro..........................................................49

5.1.4.1. maiores valores de NMP observados.........................49

5.1.4.2. freqüência de detecção...............................................51

5.1.4.3. Diversidade, riqueza e abundância.............................53

5.2. Isolamento de bactérias diazotróficas....................................................55

5.3 Agrupamento dos isolados bacterianos diazotróficas.............................60

5.4 Isolamento de bactérias não diazotróficas..............................................62

5.5 Agrupamento dos isolados bacterianos não diazotróficos baseados

em características morfológicas da colônia.............................................63

6. Discussão............................................................................................................73

6.1 Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número

mais provável (NMP):...........................................................................73

6.2 Isolamento de bactérias diazotróficas.......................................................75

6.7 Considerações quanto aos resultados de isolamento...............................76

7.Referências Bibliográficas.......................................................................................77

Anexos........................................................................................................................85

Anexo I: fotografias das áreas onde se encontram as fruteiras utilizadas no

estudo..............................................................................................................85

Anexo II: Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos...86

Anexo III: Valores de redução de acetileno produzido pelos isolados

bacterianos oriundos das diferentes fruteiras..................................87

Anexo IV: composição dos meios de cultura...................................................89

Anexo V: fotos das colônias de alguns isolados bacterianos diazotróficos.....92

vii

ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias

diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro em diferentes

épocas do ano...........................................................................................32

Tabela 2. Freqüência de detecção de possíveis bactérias diazotróficas associadas a

diferentes sítios do abacaxizeiro durante três colheitas por épocas do ano

...................................................................................................................34

Tabela 3. Diversidade (índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas

associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro........................................36

Tabela 4. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios

do abacaxizeiro..........................................................................................36

Tabela 5. Abundância (NMP x g-1 de tecido fresco) de possíveis bactérias

diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro....................36

Tabela 6. Maiores valores observados do número mais provável de possíveis

bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira em

diferentes épocas do ano..........................................................................38

Tabela 7. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a diferentes

sítios da goiabeira durante três colheitas por épocas do ano...................40


associadas a diferentes sítios da goiabeira...............................................42


da goiabeira...............................................................................................42

Tabela 10. Homogeneidade de possíveis bactérias diazotróficas associadas a

diferentes sítios da goiabeira...................................................................42

Tabela 11. Maiores valores observados do número mais provável de bactérias

diazotróficas associadas a diferentes sítios do mamoeiro em diferentes

épocas do ano.........................................................................................44

Tabela 12. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a

diferentes sítios do mamoeiro durante três colheitas por época do ano.46

Tabela 13. Diversidade (Índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas

associadas a diferentes sítios do mamoeiro............................................48

Tabela 14. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes

sítios do mamoeiro...................................................................................48

viii

Tabela 15. Abundância de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes

sítios do mamoeiro..................................................................................48


diazotróficas associadas a diferentes sítios do maracujazeiro em

diferentes épocas do ano.........................................................................50


diferentes sítios do maracujazeiro durante três colheitas por época do

ano...........................................................................................................52


associadas a diferentes sítios do maracujazeiro.....................................54


sítios do maracujazeiro............................................................................54


sítios do maracujazeiro............................................................................54

Tabela 21. Relação das Bactérias isoladas na Embrapa Agrobiologia oriundas da Fazendinha Agroecológica da Embrapa/UFRRJ/Pesagro (Abacaxi,

Mamão, maracujá) e do Sitio Mazomba (goiaba) durante o Inverno de

2005 e Verão de 2005/2006....................................................................58

Tabela 22. Relação dos Isolados e suas respectíveas plantas e sítios de origem,

meio de cultura onde foram isolados e resultado do agrupamento de

acordo com o perfil protéico e do sequenciamento parcial da região 16S

do DNAr...................................................................................................59

Tabela 23. Relação da distribuição numérica dos isolados bacterianos diazotróficos oriundos dos diferentes sítios de isolamento a partir dos diferentes meios de culturas semi-sólidos..............................................................60 Tabela 24. Número de isolados bacterianos e seus respectivos sítios de origem

obtidos até o momento a partir das diferentes fruteiras a partir de meios

ricos (NB e DYGS)...................................................................................72

Tabela 25. Valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos

oriundos do abacaxizeiro.........................................................................87


oriundos da goiabeira..............................................................................87


oriundos da goiabeira..............................................................................88


oriundos do maracujazeiro.......................................................................88

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Organograma da metodologia de isolamento de bactérias diazotróficas..22 Figura 2. Organograma da metodologia de isolamento de bactérias em meio rico..25

Figura 3. Código para identificação dos isolados (em meio de enriquecimento de

bactérias diazotróficas)..............................................................................27

Figura 4. Código para identificação dos isolados bacterianos obtidos a partir de meio

rico (NB e DYGS)........................................................................................28 Figura 5. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da

colônia de bactérias diazotróficas isoladas a partir da cultura do abacaxi,

goiaba, mamão e maracujá.........................................................................61

Figura 6. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da

colônia de bactérias isoladas em meio DYGS a partir da cultura do

maracujá.....................................................................................................64


colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do

Maracujá.....................................................................................................66


colônia de bactérias isoladas em meio DYGS a partir da cultura do abacaxi

Pérola..........................................................................................................67


colônia de bactérias isoladas em meio DYGS a partir da cultura do abacaxi

Smoth cayenne............................................................................................69


colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do abacaxi

Smoth cayenne............................................................................................71

Figura 14. Fotografia da entrada da Fazendinha Agroecológica

(Embrapa/UFRRJ/Pesagro).....................................................................85

Figura 15. Fotografia da plantação da cultura do mamão onde foi retirada amostras

de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas..........................85

Figura 16. Esquema da plantação da cultura de abacaxi onde foram retiradas

amostras de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas.........85

Figura 17. Esquema da plantação da cultura do Maracujá onde foram retiradas

plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas..............................85

x

Figura 18. Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos (Perin,

2003)........................................................................................................86

xi

Resumo

No presente trabalho foi feito um estudo da biogeografia de bactérias

diazotróficas e não-diazotróficas culturáveis. No caso do estudo de biogeografia de

bactérias diazotróficas, as regiões alvo do estudo foram rizosfera, rizoplano,

histoplano-raiz (interior da raiz), filoplano (sob a forma solitária e formando

biofilmes), histoplano-caule (interior do caule) e histoplano-folha (interior da folha) de

quatro fruteiras tropicais, a saber: abacaxi, goiaba, mamão e maracujá. Isso foi feito

através do uso de duas estratégias básica: (1) estudo do padrão de distribuição de

bactérias diazotróficas culturáveis obtidas em cinco meios semi-sólidos sem

nitrogênio (JMV, JNFb, LGI, LGI-P e NFb), através da técnica de número mais

provável (NMP) e (2) agrupamento e caracterização parcial dos isolados bacterianos

obtidos nos meios semi-sólidos citados acima, através da morfologia da colônia.

Quanto ao estudo de biogeografia de bactérias não diazotróficas, tal estudo foi

baseado no isolamento de bactérias rizosféricas, epifítica (rizoplano, cauliplano e

filoplano) e endofítica (histoplano raiz, histoplano caule e histoplano folha) utilizando-

se dois meios complexos, NB (Nutrient Broth) e DYGS, seguido de agrupamento

baseado em características morfológicas. No caso da biogeografia de bactérias

diazotróficas foram obtidos um total de 44 isolados bacterianos (maracujá, 15 (34%);

abacaxi, 14 (32%); mamão, 10 (23%); e goiaba, 5 (11%) isolados). Quanto ao sítio

de origem, de uma forma geral a rizosfera foi de onde foi obtido o maior número de

isolados, 16 (36%), seguidos do histoplano-raiz, 14 (32%), rizoplano 9 (20%),

histoplano – pseudocaule, 3 (7%), e histoplano – folha, 2 (4%). Quanto à análise dos

dados baseados em NMP (maiores valores de densidades de bactérias

diazotróficas; freqüência de detecção, índice de diversidade, a riqueza e a

abundância), foi observado um padrão aleatório de distribuição bacteriana em

relação ao nicho vegetal ou ao meio de cultura ou mesmo à estação do ano. A

exceção foi o fato de na maioria das vezes os maiores valores de NMP estarem

presentes nos sítios associados às regiões da raiz (rizosfera, superfície da raiz, e

histoplano raiz), e o fato dos maiores valores de NMP serem observados para os

meios JNFb e NFb, meios semi-específicos para bactérias do gênero Azospirillum,

que é sabidamente encontrada em uma grande variedade de culturas. Quanto ao

estudo com não diazotróficos, foi obtido um total de 237 isolados bacterianos, dos

quais 40 (17%) foram isoladas de abacaxi smoth cayenne em meio NB; 25 (10%) de

xii

abacaxi smoth cayenne em meio DYGS; 25 (10%) de abacaxi pérola em meio DYGS

e 65 (27%) isolados oriundos de maracujá amarelo em meio DYGS. No geral, o sítio

a apresentar a fornecer o maior número de isolados foi a rizoplano (52 isolados

(22%)), seguido do filoplano (47 isolados (20%)) e do histoplano raiz (42 isolados

(18%)). O agrupamento preliminar dos isolados, baseada em algumas

características morfológicas das colônias não mostrou nenhuma tendência de

colocar num mesmo grupo microrganismos que pertencentes a um determinado

nicho do vegetal. Contudo, estudos futuro poderão nós dizer quais dos 237 isolados

bacterianos têm potencial biotecnológico.

xiii

Abstract In the present work it was performed a biogeographic study of cultivable

diazotrophic and non-diazotrophic bacteria. For the studies involving biogeography of

diazotrophic bacteria, the micro-environments sampled were rhizosphere, rhizoplane,

histoplane-rhizosphere (inner tissue of root), phylloplane (at solitary and biofilm form)

and histoplane-leaf (inner tissue of leaf) of four tropical fruit plants: pineapple, guava,

papaya and passion fruit. Two strategies were used: (1) study of the distributions

patterns of cultivable diazotrophic bacteria obtained using five N-free semi-solid

medium (JMV, JNFb, LGI, LGI-P and NFb) by the use of most-probable number

(MPN) technique (2) grouping and partial identification of bacteria isolates obtained

on N-free semi-solid medium by colony morphology. In relation to the non-

diazotrophic group, the isolation from bacteria associated to pineapple and passion

fruit was performed based on rhizosphere, epiphytic (rhizoplane, cauliplane and

phylloplane) and endophytic (histoplane-root, histoplane-steam and histoplane-leaf)

using two rich medium, NB and DYGS. In the study with diazotrophic bacteria it were

obtained a total of 44 isolates (passion fruit, 15 isolates (34%), pineapple, 14 isolates

(32%), papaya, 10 isolates (23%), and guava, 5 isolates (11%)). In relation to origin

site, in a general form the rhizosphere was the site that resulted in the majority of

isolates, 16 (36%), followed by histoplano-root, 14 (32%), rhizoplane, 9 (20%),

histoplane-pseudocaule, 3 (7%), and histoplano – leaf, 2 (4%). In relation to NMP

dates, (biggest values of densities of diazotrophic bacteria, detection frequency,

diversity indices, an richness and ABUNDÂNCA), it was observed a random pattern

of distribution of diazotrophic bacteria in relation to the niche vegetal or to the culture

medium or to the yea period. The exception was the fact of the most of the time the

biggest values of NMP were present in the site associated to the root regions

(rhizosphere, root surface, and histoplane-root) and to the fact that the biggest values

of MPN it were observed to JNFb and NFb medium. This medium is semi-specific to

bacteria genera Azospirillum, that is know found in a large variety of crops. In relation

to no diazotrophic study, It was obtained a total of 237 isolated, namely: 40 (17

isolated from pineapple smooth cayenne in NB medium; 25 (10%) from pineapple

smooth cayenne in DYGS medium; 25 (10%) from pineapple pérola in DYGS

medium, and 65 (27) from passion fruit in DYGS medium. At all, the site that showed

the bigger number of isolates was the rhizoplane (52 isolates (22%)), followed by

xiv

xv

phylloplane (47 isolates (20%)) and from histoplane root (42 isolates (22%)). The

preliminary clustering of the isolated based in morphological characteristic of the

colony don’t showed any association with the plant niche that they were isolated.

However futures studies can tell us with this 237 isolates have biotechnological

potential.

1. Introdução

Atualmente o Brasil se apresenta como um dos maiores produtores de frutas

tropicais do mundo, fazendo justiça as suas potencialidades naturais (Simão, 1998).

Produção essa bastante diversificada e distribuída por todas as regiões do país

(Agrianual, 2002), conferindo assim um caráter econômico importante. No caso

específico das culturas do abacaxi, goiaba, mamão e maracujá, tais culturas são

cultivadas em praticamente todo o território, sendo o Brasil um dos grandes

produtores mundiais (Simão, 1998; Amaral, 2000; Souza e Souza, 2000; Aguiar e

Santos, 2001). Apesar disso, a produção brasileira ainda pode crescer muito, uma

vez que sua participação na comercialização no mercado internacional é muito

pequena, pois o que é produzido atualmente no Brasil é utilizado basicamente para

atender a demanda interna (Amaral, 2000; Souza e Souza, 2000; Rossi, 1998;

Aguiar e Santos, 2001).

Associada a potencialidade dessas culturas na geração de divisas para o

país, existe claramente na agricultura mundial, uma demanda por tecnologias

alternativas de produção, que passam necessariamente pela intensificação de

processos biológicos na propriedade agrícola, que possam gerar ganhos

econômicos e ecológicos. Neste sentido, crescem em importância as pesquisas

sobre a população de microrganismos benéficos que colonizam essas culturas.

Microrganismos esses com potencial biotecnológico, como por exemplo, através da

promoção de crescimento. Esses microrganismos interagem com o seu hospedeiro

de diferentes maneiras/intensidades dependendo da região por eles colonizada.

Dessa forma, é possível se verificar diferentes graus de interação planta-bactéria.

Um exemplo seria através da colonização da rizosfera (solo que envolve as raízes e

que sofre constante influência da planta hospedeira através da excreção pelo

vegetal de uma grande diversidade de substâncias que contribuem para a criação de

um micro-ambiente diferenciado do ponto de vista físico-químico e biológico). Tal

micro-ambiente tem sido considerado de transição entre a raiz e o solo (Siqueira e

Franco, 1988), possuindo uma diversidade microbiana bastante diferenciada tanto

das demais regiões do solo, como das regiões da planta hospedeira (Moreira e

Siqueira, 2001; Cardoso e Freitas, 1992).

Outro grupo que interage com os vegetais é o dos microrganismos epífitos

“microrganismos de vida livre que habitam a superfície do vegetal” (Andrews e

1

Harris, 2000). Esses microrganismos estão sujeitos a condições ambientais e

nutricionais completamente diferentes das encontradas na rizosfera e, portanto,

evoluíram sob uma pressão de seleção diferente, resultando numa população

diferenciada com relação às características de superfície do eixo vegetativo da

planta. Embora menos estudados que os microrganismos rizosféricos, no que diz

respeito ao seu potencial agronômico, segundo Andrews e Harris (2000), esses

microrganismos são capazes de desempenhar vários papeis, como por exemplo, a

fixação do nitrogênio e o controle de doenças, o que os torna potenciais alvo de

pesquisa.

E por último, com um grau maior de associação com o seu hospedeiro, do

que os descritos anteriormente estão os microrganismos endofíticos, “bactérias e

fungos que podem ser isolados de tecidos vegetais ou de dentro de plantas cuja

superfície tenha sido previamente desinfestadas, que não apresentem nenhum

efeito danoso à planta” (Hallmann et al., 1997). Embora esse grupo tenha

permanecido esquecido por muito tempo, no final do século XX eles voltaram a ser

alvo de intensos estudos com a descoberta de seu enorme potencial biotecnológico,

principalmente ligado à agricultura (Azevedo, 1997). O fator mais importante no

potencial de utilização desses microrganismos deve-se a sua íntima interação com o

tecido vegetal, uma vez que podem ser encontrados colonizando o interior do

vegetal de forma intercelular ou intracelular (Hallmann et al., 1997), encontrando

assim um meio ‘tamponado’ de modo a lhe proteger das adversidades ambientais,

como estresse hídrico, vento, raios solares e menor competição.

Algumas das importâncias no estudo dos microrganismos diazotróficos está

não só na possibilidade de seu uso como promotores de crescimento, através da

disponibilização para a planta de nitrogênio sob uma forma assimilável, mas

também, como tem sido observado recentemente, nos estudos de controle biológico

e no seu uso como vetores de genes, nesse caso mais especificamente através do

uso dos microrganismos endofíticos (Hallmann et al., 1997, Baldani et al., 2002).

No presente trabalho foi objetivado realizar uma analise biogeográfica da

comunidade microbiana diazotrófica e não diazotróficas associado naturalmente ao

longo do eixo vegetativo de quatro fruteiras tropicais (abacaxi, goiaba, mamão e

maracujá). No caso do estudo com bactérias diazotróficas foi utilizada duas

abordagens: 1) estudo do padrão de distribuição das bactérias diazotróficas através

2

da técnica de número mais provável (NMP), e, 2) isolamento em diferentes meios de

cultura, e sua identificação parcial através de características morfológicas.

2. Revisão de Literatura

2.1 Panorama da Fruticultura O Brasil é um dos maiores produtor mundiais de frutas (Marino et al., 2001).

Sua produção é bastante diversificada (apesar do setor citrícola responder por uma

parcela considerável da produção nacional), incluindo além das espécies de clima

tropical, também algumas frutas de clima temperado (como o caso da uva e da

maçã) (Garcia et al., 1999).

Além disso, esse é um setor onde a produção está distribuída por todas as

regiões do Brasil (Agrianual, 2002), como também dependendo da cultura, pode

representar: 1) rentabilidade acima de 180% (Mendes et al., 2002), 2) grande

absorção de mão de obra (Souza e Souza, 2000) e 3) grande adaptabilidade às

condições de trabalho do pequeno e médio produtor (Ide et al, 2001), o que confere

a fruticultura um importante papel sócio-econômico para o país.

Contudo, apesar do bom posicionamento do Brasil no ranking dos países

produtores de frutas, essa é uma área agronômica ainda com grande potencialidade

de expansão. Isso ocorre não só pela ainda baixa participação do Brasil no mercado

externo (menos de 1%) (Silva e Tranquilini, 1999), como também devido à previsão

de aumento da demanda por frutas devido a uma crescente conscientização da

população das qualidades nutricionais das frutas em geral (Aguiar e Santos, 2001).

Assim, embora o agronegócio seja o principal setor da econômica nacional, tendo

sido responsável no ano de 2006, por cerca de 36% da receita obtida pelas

exportação nacionais (49,4 bilhões de dólares), a receita obtida com as exportações

do setor frutícola em específico foi bastante reduzido (471,8 milhões de dólares)

(Brasil, 2007).

No caso específico do estado do Rio de Janeiro, são muitas as características

que favorecem o desenvolvimento da fruticultura no estado. Algumas dessas

características, inicialmente enumeradas por Gardelha et al. (1996) para a cultura do

abacaxi, podem também serem aplicadas para a fruticultura em geral: grande

população consumidora; proximidade a diversos centros consumidores como São

Paulo e Minas Gerais; boa disponibilidade de infra-estrutura de transportes marítimo

3

e aéreo, possibilitando o comercio no mercado internacional. Segundo revisado por

Golynski (2005), outra característica favorável ao desenvolvimento da fruticultura no

estado do Rio de Janeiro seria a elevada renda média per capita da população do

estado.

Segundo levantamento contido no Anuário Estatístico do Estado do Rio de

Janeiro 2001, entre os anos de 1996 e 2000, ocorreram fortes oscilações na área

colhida dessas culturas. Contudo, com a implementação de projetos de fruticultura

irrigada no norte do estado, aliado ao desenvolvimento de pesquisas, que vão desde

o desenvolvimento de sementes melhoradas, melhoria da condição da lavoura, até a

implementação de uma biofábrica de cultura de tecidos, que visa à produção de

milhares de mudas anualmente, essa região pode se tornar mais uma forte

candidata a se transformar num pólo de fruticultura a exemplo do que ocorre no vale

do São Francisco.

As culturas do abacaxi, goiaba, mamão e maracujá, objeto da presente tese,

têm em comum o fato de serem culturas de clima tropical, cultivadas em todas as

regiões do país, e na maioria dos estados (Agrianual, 2002; Aguiar e Santos, 2001).

Além disso, como ocorre para a maioria das demais fruteiras, essas culturas têm sua

produção destinada quase que exclusivamente ao mercado interno (Souza et al.,

2000; Marino et al., 2001), além de terem o Brasil como um dos maiores produtores

(Souza, 2007).

No caso do abacaxi, segundo o revisado por Amaral (2000), três países,

Tailândia, Brasil e Filipinas, são os responsáveis por 40% da produção mundial.

Segundo Souza e Souza (2000), foi na década de 90 que a cultura do abacaxi teve

sua área e volume aumentados, até mesmo na região Norte do país, onde

anteriormente não se apresentava uma grande produção. A principal região

produtora é o Sudeste (sendo o estado de Minas Gerais o principal produtor),

seguido pela região Nordeste, tendo o estado da Paraíba como principal produtor.

A cultura da goiaba tem como seus maiores produtores o Brasil, Índia,

Paquistão, México, Egito e Venezuela (Ide et al., 2001). Para Gonzaga Neto (2001),

será com a divulgação de seus valores nutricionais que se espera que no futuro

ocorra uma elevação de sua venda e do consumo. O destino da goiaba produzida é

bastante variável. Segundo Ide et al., 2001, no caso do estado do Rio de Janeiro,

43,7% da produção vai para os intermediários, 27,5% para cooperativas; 15,4% vai

para a indústria de doces e sorvetes; 8,3% é vendida diretamente pelo produtor e

4

5,1% é utilizado pelos próprios produtores para a fabricação de doces caseiros,

geléias, sorvetes e outros.

Quanto à cultura do Mamão, além do Brasil, que responde por

aproximadamente 45% da produção mundial (Souza, 2007), a Nigéria, o México, a

Índia e a Indonésia são os maiores produtores dessa fruta (Souza, 2001). Em nível

nacional, segundo o levantamento feito por Souza (2007), a Região Nordeste tem se

apresentado como o principal produtor da cultura, seguido pelas regiões Sudeste,

Norte, Centro Oeste e Sul. Os principais estados produtores são Bahia, Espírito

Santo, Ceará e Rio Grande do Norte.

A cultura do Maracujá tem sofrido aumento na sua produção nas últimas

décadas, devido ao aumento de sua produtividade (Gonçalves e Souza, 2006;

Aguiar e Santos, 2001). Sua produção tem sido destinada tanto para o consumo in

natura como para a produção de suco (sendo essa última a principal forma de

comercialização no mercado exterior) (Aguiar e Santos, 2001). Segundo o revisado

por Gonçalves e Souza (2006), a nível nacional os principais estados produtores

são: Bahia; Espírito Santo; São Paulo; Rio de Janeiro e Ceará.

2.2 Biogeografia de Microrganismos: São várias as definições do termo ‘biogeografia’, umas mais e outras menos

abrangentes, de forma que o conhecimento das diferentes definições relatadas em

diversos estudos pode dar uma idéia geral do que trata esse ramo da biologia.

Martiny et al., (2006) define biogeografia como “o estudo da distribuição da

biodiversidade no espaço e no tempo” para descobrir onde os organismos vivem,

qual sua quantidade e porque (encontram-se em dado sítio). Para Andrews e Harris

(2000), o termo biogeografia está relacionado ao estudo da distribuição dos

organismos no espaço e dos fatores responsáveis pelo padrão de distribuição

observado. Já Ramette e Tiedje (2006), definem biogeografia (de procarioto) de

duas formas, uma mais específica e outra mais abrangente. Na primeira esses

autores chamam biogeografia de ‘a ciência que documenta a distribuição espacial de

procariotos no ambiente numa escala local, regional, e continental’. No nível mais

abrangente esses autores definem biogeografia como ‘uma disciplina que examina a

variação de característica dos microrganismos (ex: genética, fenotípica e fisiológica)

em diferentes escalas espaciais’. Embora Posadas et al., (2006) definam de forma

bastante simples biogeografia como ‘o estudo da distribuição geográfica dos

5

organismos’, esses autores separam a biogeografia em dois tipos: biogeografia

descritiva (‘estudo do padrão de distribuição’) e interpretativa (‘estudo das causas do

padrão de distribuição observado’). Esses autores ainda diferenciam biogeografia

interpretativa em ecológica e histórica, que segundo revisado por eles apresentam

como diferença a escala de tempo de estudo, sendo a primeira de escala mais curta,

e a segunda de uma escala de tempo de milhões de anos.

Segundo o revisado por Ramette e Tiedje (2007), a formação de perfil

biogeográfico em microrganismos se deve geralmente a combinação de três

processos:

(1) Especiação: que poderia se dar principalmente pela mutação, recombinação,

transferência lateral de genes e rearranjo genômico, em um ambiente

protegido por barreiras;

(2) Dispersão: Tal processo dependeria da combinação de condições climáticas

favoráveis (ex., ventos e tempestades), vetor de disseminação (ex., correntes

oceânicas, poeira, sementes de plantas) e de existência de estágios no ciclo

de vida bacteriano, que o tornaria mais resistente ao transporte de longas

distancias.

(3) Extinção: para esses autores, esse é o processo mais questionável dos três.

Contudo, segundo os referidos autores, tal processo ocorreria numa condição

onde os microrganismos estariam em uma condição de serem lavados de

seus nichos de origem ou pelo esgotamento de fontes nutricionais.

2.3 Biogeografia de bactérias associadas a vegetais Há décadas, as diferentes formas de interação entre microrganismos e

vegetais, bem como os efeitos daqueles em relação a estes, têm sido alvo de

intensa pesquisa da comunidade científica, de modo que hoje é vasta a quantidade

de informações desde o nível fisiológico até o molecular dessa interação.

Sob o aspecto biogeográfico, o que se sabe hoje é que todo o corpo vegetal, seja a

sua superfície ou seu tecido interior, pode ser colonizado por microrganismos. Essa

colonização pode se dar na raiz, caule, folhas, frutos e flores (Hallmann et al., 1997;

Andrews e Harris, 2000).

Contudo, diferentes espécies de microrganismos têm diferentes graus e

formas de interação com diferentes espécies de plantas. O que pode se dar tanto

através de uma interação indireta, através da colonização da região do solo

6

rizosférico, ou através de um contato direto, com a colonização dos tecidos internos

(microrganismos endofíticos), ou da região superficial do vegetal (microrganismos

epifíticos), como a superfície da raiz (rizoplano); superfície do caule (cauliplano); e

superfície da folha (filoplano). Cada um dos três sítios apresentados acima,

apresenta particularidades quanto à concentração de O2, CO2, pH, disponibilidade

de nutrientes, susceptibilidade a diferentes adversidades ambientais e

conseqüentemente a presença e predominância de deferentes grupos microbianos,

como também níveis de diversidade microbiana e sua afinidade com o hospedeiro

(Andrews e Harris, 2000). Wieland et al. (2001) observaram que o perfil da

comunidade microbiana na rizosfera e no rizoplano é alterado devido tanto a

variações da espécie vegetal como da fase de desenvolvimento da planta. Seldin et

al. (1998) observaram diferença significativa a nível intra-especifico da bactéria da

espécie Paenibacillus azotofixans associadas à cultura do milho, entre os isolados

do rizoplano, rizosfera e de solo não rizosférico, demonstrando assim pressões de

seleção diferenciadas de acordo com o sítio em contato com o vegetal.

Apesar dos microrganismos relacionados às plantas já serem alvo de estudo

há anos, estudos recentes através do uso de meios de cultura, têm revelado a

existência de microrganismos até então não descritos. Muitos destes, pertencentes a

grupos de microrganismos que já se pensava serem bem estudado (Bagwell et al.,

1998, Caballero-Mellado et al., 2007). Isso tem dando respaldo aos estudos de

bactérias presentes no ambiente através de seu isolamento em meio de cultura,

apesar de suas conhecida e já bem relatadas limitações, retratada pela frase ‘a

anormalidade da contagem em placa’ revisada por Amann et al. (1995).

2.3.1 sítios de colonização de bactérias em vegetais: -A rizosfera:

A rizosfera é a região do solo que envolve as raízes e que sofre constante

influência da planta hospedeira através da excreção pelo vegetal de uma grande

diversidade de substâncias, tais como exsudados e lisados radiculares, mucigel,

resíduos de parede celular e células vegetais intactas, que contribuem para a

criação de um micro-ambiente diferenciado do ponto de vista físico-químico e

biológico (Cardoso e Freitas, 1992). Esse fato contribui para o desenvolvimento de

um micro-ambiente diferenciado (e mais estabilizado), tanto em relação ao solo em

volta dela, como com relação às demais regiões do vegetal, no que diz respeito a

7

características química, físicas e biológicas (Moreira e Siqueira, 2002), oferecendo

um ambiente relativamente estabilizado contra as adversidades do meio (efeito

rizosférico). Um exemplo disso é o demonstrado pelos estudos de Lovell et al.

(2001), que avaliando o efeito da aplicação de diferentes tipos de nutrientes na

microbiota da rizosfera de Spatina alterniflora, observaram uma grande estabilidade

na microbiota da rizosfera dessa cultura. Além disso, as substâncias excretadas

presentes nesse sítio estão também intimamente relacionadas às diferentes formas

de sinalização entre as diversas formas de vida presente nesse sitio (Bais et al.,

2006), que podem proporcionar tanto resultados positivos, do ponto de vista vegetal,

como negativo.

A espessura da rizosfera varia entre 0,4 a 5 mm em torno da raiz, o que irá

depender do tipo de solo e da morfo-fisiologia da raiz (Cardoso e Freitas, 1992,

Moreira e Siqueira, 2002). Essa aparente tênue região que separa e, ao mesmo

tempo, faz a união entre o solo e o vegetal, abriga uma diversidade tal de

microrganismos responsável pela realização de inúmeras reações, muitas delas

imprescindível para o bom desenvolvimento do vegetal, tais como decomposição,

mineralização da matéria orgânica, fixação biológica de nitrogênio, nitrificação,

amonificação, agregação e estabilização de agregados do solo, etc (Cardoso e

Freitas, 1992, Moreira e Siqueira, 2002). Dessa forma, nesse sítio é possível ser

encontrada uma grande diversidade de microrganismos, que podem contribuir para

o bom desenvolvimento do vegetal, tanto através da promoção de crescimento,

como através do combate a possíveis patógenos. Segundo Siqueira & Franco

(1988), ‘os microrganismos antagonistas na rizosfera constituem a defesa mais

externa das plantas contra o ataque de patógenos’ resultado da antibiose,

competição, parasitismo e predação. Além disso, segundo os mesmos autores, de

0,1 a 1% da população microbiana da rizosfera é capaz de fixar nitrogênio, alguns

deles na ordem de 100 Kg ha-1ano-1.

-O ambiente Epifítico:

Esse ambiente é a extensão da superficial do vegetal que se estende desde a

coifa até o meristema apical caulinar. Os microrganismos epifíticos têm sido

definidos por Andrews e Harris (2000), como aqueles “microrganismos de vida livre

que habitam a superfície do vegetal excluído os patogênicos”, colonizando a

superfície da raiz (rizoplano); superfície do caule (cauliplano); e superfície da folha

8

(filoplano). Segundo Moreira e Siqueira, 4 a 10% da superfície do sistema radicular

estão colonizadas por microrganismos, sendo que os micro-sítios mais favoráveis à

colonização são as regiões da raiz, onde é abundante a disponibilidade de

exsudados e de matéria orgânica, como por exemplo, as junções das células

epidérmicas ou em aberturas causadas por injúrias. De acordo com Andrews e

Harris (2000), eles são capazes de efetuar uma grande diversidade de reações,

como as envolvidas na fixação biológica de nitrogênio, o que confere a esse habitat

uma grande importância ecológica e conseqüentemente o torna alvo de estudos

para o seu melhor conhecimento, como também para a obtenção de microrganismos

com diferentes características e potenciais agronômicos. Dentre as diferentes partes

da planta, é a sua superfície a parte que se encontra mais susceptível aos mais

variados tipos de adversidades (Andrews e Harris, 2000). Segundo o revisado por

estes autores, o vegetal apresenta diferentes regiões onde ocorre uma grande

variação não só de quantidade de nutriente e água, como também, variação na

exposição a diferentes tipos de adversidade ambientais, tais como

disponibilidade/exposição de ar, sol, vento e chuva, o que deverá influenciar na

população microbiana existente em cada um dessas regiões. Leben e Daft (1966)

avaliaram a variação das populações de bactérias epifíticas de espécies vegetais e

observaram que a população de microrganismos epifíticos era altamente variável

entre as diferentes espécies vegetais, e altamente dependente da precipitação da

região e principalmente do período de tempo em que se tinha água disponível na

superfície do vegetal. Wilson et al. (1999), estudando o comportamento de

microrganismos patogênicos e não patogênicos na superfície de folhas de feijão,

observaram que sob condições de estresse, como por exemplo, com tratamento

com peróxido de hidrogênio, radiação UV ou condições limitantes de umidade, as

bactérias tendiam a se proteger, abrigando-se em sítios estratégicos na superfície

da folha. A superfície de folhas de mangueiras foi estudada por Jager et al. (2001),

que observam que a diversidade e o número das bactérias foram bastante

dependentes não só do estádio de desenvolvimento da folha, como também da

posição da folha na planta, mostrando assim a influencia da incidência dos raios

solares.

9

-O ambiente endofítico: Embora já se conheçam os microrganismos endofíticos desde o início do

século XIX, conforme revisado por Azevedo (1997), até recentemente existia certa

confusão quanto à definição do que (e quem) seria um endófito (Azevedo, 1997;

Hallmann et al., 1997; Saikkomen et al., 1998). Apesar de ainda há pouco tempo

esse termo ter sido aplicado quase que exclusivamente para fungos, como

mencionado por Sturz e Nowak (2000), ele se refere a fungos e bactérias (Chanway,

1996). Hallmann et al. (1997) em sua revisão sobre bactérias endofíticas, encontrou

várias definições para o termo endófito, sendo cada uma mais ou menos

abrangente, como por exemplo: 1) “bactérias que residem dentro do tecido da

planta, sem produzir substâncias danosas ou ter outro benefício que não o sítio de

colonização”; 2) “bactérias que estabelecem simbiose com a planta, pela qual a

planta recebe benefícios da presença desse simbionte, como aumento da tolerância

ao estresse ou promoção do crescimento da planta” e; 3) “bactérias que podem ser

isoladas de superfícies de tecidos vegetais desinfestados ou extraídas de dentro da

planta, que não são visivelmente nocivas à planta e, aquelas bactérias que durante

sua fase epífita, se alternam entre a colonização endófita e epífita". Talvez a

possível causa dessa confusão na definição dos microrganismos endófitos se deva

ao fato de que esses microrganismos só foram realmente alvo de pesquisa a partir

do final dos anos 70, devido à descoberta de que esse grupo de microrganismos

possuía importantes propriedades biotecnológicas a serem exploradas (Azevedo,

1997) e não são apenas simples patógenos latentes ou muito menos uma

contaminação de uma esterilização mal sucedida (Thomas e Graham, 1952,

revisados por Sessitch, 2002). Os microrganismos endofíticos existem em

praticamente todas as plantas terrestres e penetram no tecido vegetal através de

aberturas naturais da planta (como estômatos, lenticelas, hidatódios) ou feridas

(provocadas pela emergência das raízes secundárias; pelo atrito do crescimento das

raízes com o solo; provocadas por insetos ou fungos), tendo como fonte a semente,

o solo rizosférico, o material de propagação vegetal e o filoplano (Hallmann et al.,

1997). Esses microrganismos podem se localizar na semente, tubérculo, raiz, caule,

folha e frutos, tanto no espaço intercelular quanto no intracelular (aqui mais

raramente) ou nos vasos condutores (Hallmann et al., 1997).

Na relação microrganismo endófito – planta, o primeiro recebe alimento e

abrigo da planta, onde fica protegido das adversidades ambientais e da competição

10

com uma grande diversidade de microrganismos existentes em ambientes como o

solo. Essa proteção tem sido apontada como uma de suas principais vantagens para

seu uso, tanto como inoculante (Sturz e Nowak, 2000) como vetores de genes

(Hallmann et al., 1997, Baldani et al., 2002). Em troca dessas vantagens os

microrganismos endófitos têm o potencial de promover uma série de benefícios ao

seu hospedeiro.

2.3.2 formas de disposição: solitária (ou planctônica) x biofilme (ou agregados): Os microrganismos apresentam-se colonizando o ambiente em geral sob um

gradiente de disposição que pode variar desde uma única célula, disposição solitária

ou planctônica, até formar uma estrutura bastante complexa e organizada,

denominada de agregado ou biofilme. Tais estruturas organizadas são formadas

principalmente por exopolissacarídeos, proteínas e DNA (Davey e O`Toole, 2000,

Ramey et al., 2000). Segundo um definição bastante simples de O`Toole et al.,

2000, biofimes são “...comunidades de microrganismos que são aderidos a um

superfície” e que “podem ser formados por apenas uma espécie de microrganismos,

ou por múltiplas espécies de microrganismos, e podem se formar numa em

superfícies bióticas ou abióticas”. Ainda segundo esses mesmos autores, tal forma

de organização seria um ‘ponto estável do seu ciclo biológico, que seria formado

pelas etapas de iniciação, maturação, manutenção e dissolução’. Segundo Revisado

por Davey e O`Toole et al. (2000), alguns microrganismos prefeririam a disposição

em biofilme ao invés de uma disposição solitária para se proteger contra as

adversidades do ambiente, para otimizar a disponibilidade de nutrientes, como

também para contribuir com a remoção de metabólicos tóxicos, e para favorecer a

transferências horizontais de genes.

Um exemplo de proteção por biofilme associado à planta foi demonstrado por

Jacques et al., (2005). Nesse estudo, os autores demonstraram que os

microrganismos que formavam biofilmes na superfície da folha eram mais

resistentes as condição de estresse (baixa umidade relativa). Além disso, a

população das bactérias sob essa forma de disposição foram mais estáveis durante

o desenvolvimento do vegetal. Os biofilmes podem estar presentes em várias partes

do vegetal (Davey e O`Toole 2000, Ramey et al., 2004). No caso da superfície da

folha, essa forma de disposição pode responder por até 70% da população

11

bacteriana total (Monier e Lindow, 2004). Nesse caso, sua disposição não parece

ser aleatória, tendo em vista os estudos realizados por Monier e Lindow (Monier e

Lindow, 2004), que objetivaram quantificar a freqüência e o tamanho de agregados

microbianos na região da folha. Segundo o revisado por Ramey et al., 2004, os

biofilmes podem ser formados em diversos sítios da planta, por diversos

microrganismos de conhecida importância agronômica, tais como: rizosfera

(Pseudomonas putida, Azospirillum brasilense, bactérias do grupo dos rizóbios e

Agrobacterium tumefaciens), sementes (Pseudomonas putida), tecidos internos

(Xylella fastidiosa, Ralstonia solanacearum), filoplano (Pseudomonas syringae)

(Ramey et al., 2004).

O escasso número de trabalhos avaliando o potencial agronômico desses

microrganismos (principalmente do cauliplano e filoplano), provavelmente se deva

ao descuido em estudá-lo em separado durante o processo de isolamento, através

da homogeneização do tecido vegetal como um todo (Weber et al., 1999), ou

mesmo do desinteresse da comunidade científica agronômica, caracterizada pela a

eliminação das bactérias que colonizam a superfície do tecido, através de sua

esterilizarão superficial, com o intuído de isolamento exclusivo das bactérias

endofíticas. Contudo, nos parece oportuno, em se tratando de estudo inicial da

diversidade de bactérias associadas às espécies frutíferas em questão, um estudo

mais holístico das bactérias que colonizam as diferentes partes dessas fruteiras,

através da caracterização bacteriológica rizosférica, endofítica e epifítica. No caso

da cultura do abacaxi, relatos da bio-prospecção das bactérias diazotróficas, embora

não tão detalhado quanto o objetivado no presente projeto, servem para mostrar a

potencialidade dessas culturas de figurarem como hospedeiros desse importante

grupo de bactérias (Weber et al., 1999; Cruz et al., 2001).

2.4 Biogeografia de Bactérias Diazotróficas: Algumas revisões recentes que tratam da colonização de plantas não

leguminosas por bactérias fixadoras de nitrogênio, têm revelado um enorme avanço

nas últimas décadas nos estudos voltados para a análise dos diferentes aspectos da

interação planta-microrganismo (James e Olivares, 1997; Baldani et al., 1997;

Muthukumarasamy et al., 2002; Reis et al., 2000; Baldani e Baldani, 2005). Para

isso, a exemplo do que tem ocorrido nos diferentes ramos da microbiologia, a

comunidade científica tem se utilizado de um arsenal de diferentes ferramentas

12

metodológica, como as baseadas no isolamento em meio de cultura, microscopia,

uso de anticorpos e abordagem independentes de cultivo (James e Olivares, 1997;

Reis et al., 2000; Baldani e Baldani, 2005).

A história do estudo dos microrganismos diazotróficos, quanto aos sítios

objeto de estudo, foi divida por Baldani et al., (1998), em três fases:

Fase 1 - essa fase se concentrou na análise da comunidade microbiana que se

encontravam na região do solo e da rizosfera.

Fase 2 e 3 – nessas fases foram analisados os microrganismo endofítico. A

diferença entre elas, é que a primeira se dedicou aos microrganismos endofíticos

facultativos (fase 2), e a segunda foi marcada pelo estudo dos microrganismos

endofíticos então considerados de obrigatório (fase 3).

Quanto ao aspecto ecológico da interação, embora tenham ocorrido estudos

baseados em técnicas independentes de cultivo, a grande maioria das informações

obtidas nessa área tem sido o resultado de estudos que têm como objetivo principal

a bioprospecção e a caracterização de novas espécies bacteriana. Dessa forma, tais

estudos têm proporcionado além da identificação de novas espécies, também o

avanço nos estudos de biogeografia descritiva e interpretativa, e assim tem

contribuído no entendimento do padrão de distribuição microbiano relacionados aos

vegetais no que diz respeito no binômio ‘tempo-espaço’.

Exemplo disso foi o estudo realizado na Índia por Suman et al. (2001), que

tinha como o objetivo principal o isolamento de bactérias diazotróficas capazes de

colonizar naturalmente o interior do tecido da raiz de diferentes genótipos da cultura

da cana-de-açúcar. Os pesquisadores observaram que dependendo do genótipo da

planta em questão, a incidência de bactéria diazotrófica capaz de crescer em meio

LGI-P chegou até 3.86% da população total de bactéria endofítica, alcançando uma

densidade de 105 bactérias por grama de tecido. A analise de diversidade genética

mostrou que alguns dos isolados bacterianos apresentaram grande similaridade com

conhecidas espécies de bactérias diazotróficas como Gluconacetobacter

diazotrophicus, e as pertencente ao grupo dos Azospirillum.

Já Mirza et al., 2001, conseguiram detectar uma população entre 106 e 107

bactéria diazotróficas por grama de tecido do caule e da raiz, respectivamente.

Esses autores conseguiram isolar um total de quatro bactérias diazotróficas,

pertencentes ao grupo das Entobacter sp. Esses isolados também foram capazes de

produzir ácido indolacético. Além disso, estudos de promoção de crescimento

13

mostraram que alguns desses isolados quando inoculados com a cultura da cana-

de-açúcar, foram capazes de proporcionar um aumento significativo em diferentes

parâmetros agronômicos dessas culturas.

Em outro estudo, misto de biogeografia descritiva e interpretativa, realizado

por Brasil et al. (2005), esses autores além de ter tido sucesso no isolamento de

diferentes espécies de bactéria diazotróficas a partir de raiz, parte aérea e solo, de

diferentes espécie de pastagens cultivadas na época de cheia e da seca na região

do pantanal mato-grossense, também observaram o efeito negativo do excesso de

água no solo sobre a população de bactérias associada à raiz.

Perin et al, (2006), em um estudo de biogeografia descritiva, realizaram o

isolamento de 111 isolados bacterianos capazes de fixarem nitrogênio pertencentes

ao gênero Burkholderia a partir das culturas de milho e cana-de-açúcar cultivadas no

Brasil (B. unamae; Burkholderia sp.) e no México (B. tropica; B. unamae e

Burkholderia sp.). Essas bactérias foram isoladas a partir da rizosfera (33), rizoplano

(1), histoplano-raiz (31), histoplano-folha (5) e da porção sem prévia separação entre

as rizosfera e o rizoplano (33 isolados).

Também trabalhando com a cultura do milho, no entanto em um trabalho que

apresentou ambos os enfoques, de biogeografia descritiva e interpretativa, Roesch

et al. (2006) observaram que o número de bactérias diazotróficas apresentou tanto

variação espacial (em função da parte da planta) como variação temporal (em

função do desenvolvimento ontogênico da planta). No primeiro caso, os autores

observaram que o tamanho da população diazotrófica foi menor nos tecidos do caule

e na região da rizosfera e maior na raiz (nesse caso, rizoplano e histoplano-raiz).

Quanto ao efeito do desenvolvimento ontogênico da planta, foi observado que esse

parâmetro só influenciou o número de bactérias diazotróficas da raiz (rizoplano e

histoplano-raíz). Tal efeito deveu-se ao fato de ser na região da raiz onde ocorrem

as maiores oscilações de nitrogênio durante o desenvolvimento do vegetal, o que

não ocorre com o interior do caule, devido à pronta disponibilidade de nutrientes

desse sítio, resultando assim numa menor sensibilidade da sua população às

variações ontogênicas.

Já o trabalho de biogeografia interpretativa (biogeografia histórica ou

biogeografia filogenética) realizado por Caballero-Mellado et al., 1995, teve como

objetivo o estudo da diversidade de representante dessa espécie bacteriana isoladas

de diferentes partes da planta de cana-de-açúcar oriunda de diferentes países

14

(México, Brasil, Uruguai, e Austrália). Nesse estudo, devido ao baixo grau de

similaridade encontrado, os pesquisadores concluíram que essa espécie bacteriana

tem recente origem evolutiva.

Assim, após anos de pesquisas voltadas para a bioprospecção e identificação

de bactérias diazotróficas, a microbiologia ambiental tem presenciado (e se

beneficiado com) o descobrimento de uma comunidade microbiana bastante diversa,

pertencente a diferentes gêneros (Beijerinchia spp., Azospirillum spp.,

Gluconacetobacter spp., Herbaspirillum spp., Burkholderia spp.), e também mais

cosmopolita do que se pensava anteriormente, apresentado-se com capacidade de

colonização de diferentes espécie vegetais (Reis et al., 2000; Muthukumarasamy et

al., 2002; Baldani e Baldani, 2005).

Dessa forma, como se pode constatar acima, os estudos biogeográficos de

bactérias diazotróficas associadas a gramíneas não só são bastante numerosos,

como também se encontram num estágio bastante avançado. Por outro lado, os

estudos voltados para a associação entre esse grupo de bactérias e plantas

frutíferas (ou outras espécies vegetais não leguminosas e não gramíneas) só

recentemente começaram a ser realizados.

Os trabalhos de isolamento e identificação de bactérias diazotróficas a partir

da cultura do café são alguns dos estudos pioneiros (Jimenez-Salgado et al., 1997;

Fuentes-Ramirez et al., 2001). No primeiro deles, que tratou de um estudo de

biogeografia descritiva, onde se objetivou detectar a bactéria Gluconacetobacter

diazotrophicus em associação a diferentes sítios da cultura do café, foram obtidos

isolados bacterianos a partir tanto da rizosfera, como do interior da raiz e do caule

pertencente ao gênero Acetobacter, alguns identificados como Acetobacter

diazotróficas, e outros com características fenotípicas diferentes o suficiente para,

apesar de serem agrupadas no gênero acetobacter, não serem classificados como

aquela espécie. Contudo, anos depois, algumas destas bactérias, juntas com outros

isolados obtidos a partir da rizosfera e do rizoplano da cultura do café, foram

classificado como uma nova espécie, G. johannae e G. azotocaptans (Fuentes-

Ramirez et al., 2001).

Dentre as fruteiras, o abacaxizeiro tem sido uma das mais estudadas. Num

desses trabalhos (Tapia-Hernandez et al., 2000), que teve um aspecto de

biogeografia descritiva, foram obtidos bactérias da espécie G. diazotrophicus a partir

15

das raízes, caules e folhas. Além disso, na análise da freqüência de isolamento

observaram um percentual de isolamento de até oitenta por cento.

Um dos trabalhos pioneiro teve como plantas alvo o abacaxizeiro e a

bananeira realizados por Cruz et al. (1999). Nesse trabalho de isolamento e de

biogeografia descritiva de bactéria diazotróficas, embora os autores não tenham tido

a preocupação de acessar separadamente a comunidade microbiana epifítica e

endofítica, o fato de terem procurado isolar bactérias que colonizam naturalmente

diferentes partes da planta (raiz, caule, folha e fruto), confere uma grande

importância ecológica. A análise da diversidade genética de trinta e oito isolados

bacterianos revelou a presença de bactéria da espécie Herbaspirillum seropedicae,

H. rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis e B. tropicans.

Em um trabalho recente de biogeografia descritiva (Caballero-Mellado et al.,

2007), 54 bactérias fixadoras de nitrogênio pertencentes ao gênero Burkholderia

foram isoladas a partir do rizoplano e da rizosfera de tomate. Dentre esses isolados

foi possível identificar a presença das espécies B. unamae, B. xenovorans, B. tropica

e também de duas outras espécies de bactérias ainda não identificadas.

A espécie de bactéria diazotrófica G. diazotrophicus foi alvo de um estudo de

biogeografia descritiva (Madhaiyan et al., 2004), que embora tenha objetivado isola-

la a partir do interior do tecido de uma vasta diversidade de espécies vegetais (que

variou desde os clássicos cereais (como milho, sorgo), plantas fruteiras (ex: goiaba,

e mamão) plantas ornamentais (ex: hibiscus) e culturas comerciais de grande porte

(ex: coco e café)), só obtive sucesso no isolamento a partir das cultura da cenoura,

rabanete, beterraba e café. Em outro trabalho, onde a bactéria diazotrófica

Gluconacetobacter diazotrophicus era o alvo de estudo (Pinôn et al., 2002), foi

observado que essa bactéria tem capacidade de lisar a parede celular do patógeno

Xanthomonas albilineans.

Pedraza et al., (2007) confirmaram a associação natural da espécie de

bactéria diazotrófica Azospirillum diazotrophicus tanto na superfície, como no interior

da raiz e do estolão, nas seguintes quantidades (4,5x104, 2,5x104 e 2X102) da

cultura do morango. Esses autores também observaram que esses isolados

bacterianos também eram capazes de produzir fitormônios e sideróforos.

Junto a esses estudos que tem contribuído para elucidar o aspecto

biogeográfico da interação planta bactéria diazotrófica, uma bateria de experimento

tem sido realizado, seja no mesmo artigo que aborda biogeografia ou em artigos

16

subseqüentes (Oliveira et al., 2002., Weber et al., 2000, Weber et al., 2003), com o

objetivo de selecionar aqueles isolados bacterianos com potencial biotecnológico.

2.5 Potencial biotecnológico de bactérias associadas a vegetais No campo da promoção do crescimento, a fixação biológica de nitrogênio foi

um tema bastante abordado por Dobereiner et al. (1995ª). Conforme revisado por

Döbereiner et al. (1995a), algumas bactérias diazotróficas (Gluconacetobacter

diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae e H. rubrisubalbicans) têm sido

encontras colonizando endofiticamente o interior de raízes, caule e folhas de cana

de açúcar, o que pode ser o fator responsável pela alta contribuição da fixação

biológica de nitrogênio em cana de açúcar. Olivares et al. (1996), observaram que a

bactéria H. seropedicae é um endófito presente em raízes, caule e folhas de um

grande número de espécies de gramíneas. Também no campo da FBN, Sevilla et al.

(2001) confirmaram pesquisas anteriores sobre os benefícios promovidos pela

bactéria endofítica G. diazotrophicus sobre a cultura da cana de açúcar. Nesse

experimento foi observado que quando plantas de cana de açúcar, cultivadas sob

condição de deficiência de nitrogênio, eram inoculadas com aquela bactéria, tinham

um maior teor de N total ao 60 dias após o cultivo do que as plantas inoculadas com

a mesma espécie de bactéria mutante para o gene Nif (gene estrutural da enzima

nitrogenase) ou do que plantas não inoculadas. Indicando assim que a transferência

do N fixado pela bactéria para a planta de cana de açúcar pode ser o mecanismo

envolvido na promoção de crescimento realizado pela bactéria G. diazotrophicus.

Frommel et al. (1993), observaram que a inoculação de Pseudomonas sp. na cultura

da batata estimulou a emergência da planta e o crescimento das raízes na fase

inicial de seu desenvolvimento, como também antecipou a formação de estolões,

tubérculos e a produção de tubérculos de tamanho comercial. Como esses

estímulos ocorreram concomitantemente com a diminuição da densidade

populacional das bactérias que naturalmente habitam a superfície radicular, esses

autores acreditam que aquele estímulo ao crescimento se deu de forma indireta,

com a possível diminuição de fitopatógenos que ocorrem no solo naturalmente.

Já no campo do controle biológico, Barka et al. (2002) observaram a

ocorrência de inibição do crescimento do fungo patogênico (Botrytis cinerea) na

cultura da uva, quando este era inoculado dois dias depois da inoculação da planta

com a bactéria endófita Pseudomonas sp. estirpe PsJN. Segundo esses autores, a

17

bactéria agiu danificando a parede celular do fungo, e promovendo a sua morte. Em

um estudo feito com o objetivo de observar se as bactérias isoladas do tubérculo de

batata são fonte de controle do patógeno Erwinia carotovora var. atroseptica, Sturz e

Matheson (1996) observaram que essa espécie possui endófitos naturais inibidores

daquele patógeno, e que o genótipo da planta é um fator determinante da

diversidade desses endófitos, de modo que a percentagem de endófitos isolados

variou consideravelmente com as variedades estudadas. Um estudo semelhante ao

anterior foi o desenvolvido por Benchimol et al. (2000). Nesse experimento, os

autores buscaram avaliar o potencial de endófitos naturais isolados da cultura de

pimenta do reino como possível agente de controle biológico contra o patógeno

Fusarium solani f. sp. piperis, através do seu isolamento seguido de sua inoculação

em plantas de pimenta do reino a serem cultivadas em solo na presença do

patógeno. Os resultados mostraram que um dos isolados (Methylobacter

radiobacter) não só foi capaz de controlar a ação do patógeno, reduzindo

significativamente o número de plantas mortas, como também funcionou como

promotor de crescimento na ausência do patógeno. Zehnder et al. (2001), relataram

experimentos realizados com a cultura do pepino onde foi observado que a

aplicação de PGPR (“Plant Growth-Promoting Rhizobacteria”) em plântulas dessa

cultura induziu resistência sistêmica contra a murcha bacteriana, tanto devido à

inibição de um composto naturalmente produzido pela planta, que provavelmente a

tornaria mais palatável para o inseto vetor do patógeno relacionado com a doença,

como pela promoção da síntese de compostos (como por exemplo, fitoalexinas e

outros compostos envolvidos na indução de resistência sistêmica) que atuariam

contra o patógeno após ele ter sido introduzido na planta. Reiter et al. (2002)

observaram que a inoculação do patógeno Erwinia carotovora subsp. atroseptica

promoveu um aumento da diversidade de microrganismos endófitos, pertencentes a

uma grande diversidade de grupos bacterianos, estando muito deles envolvidos na

defesa da planta da ação daquele patógeno. Sharma et al. (1998), observaram que

a bacterização in vitro de plantas de tomates com bactérias Pseudomonas sp.

Estirpe PsJN, não só promoveu um maior crescimento da planta de tomate, mas

também promoveu um aumento da resistência da planta contra o fungo verticillium

wild. Sutra et al. (2000), buscando isolar bactérias do grupo das pseudomona

fluorescente da rizosfera da raiz com potencial antagonista a uma doença fungica,

18

obtiveram 58 isolados, dos quais 6 apresentaram capacidade de antagonismo contra

o fungo Cylindrocladium, um patógeno da cultura da bananeira.

Em um estudo feito com o objetivo de avaliar o efeito da inoculação do fungo

endófito Acremonium coenophialum em plantas forrageiras (Arachevaleta et al.,

1989) com respeito a diferentes tipos de estresse ambientais (excesso de água,

diferentes teores de nitrogênio, déficit hídrico), foi constatado que esse fungo foi

capaz não só de estimular o crescimento vegetal, como também induziu resistência

contra uma condição de estresse hídrico. Por outro lado as plantas não infectadas

morreram. Em um outro estudo, Zaurov et al. (2001) avaliaram o efeito da

inoculação de fungos endófitos na indução de resistência da planta contra o estresse

promovido devido altos teores de alumínio. Os resultados mostram que embora o

fungo sozinho não seja o responsável pela indução de resistência a altos teores de

alumínio, em certas combinações planta-fungo, a infecção do endófito pode

contribuir para melhorar sua tolerância.

19

3. Material e Métodos:

3.1. Isolamento de bactérias diazotróficas associadas a fruteiras: As Plantas utilizadas foram obtidas na Fazenda Agroecológica da Embrapa

Agrobiologia, localizado no município de Seropédica (Abacaxi, Mamão e Maracujá) e

numa área de agricultura familiar no sítio Mazomba (Goiaba), localizado no

município de Itaguaí (anexo I). As partes das plantas foram colhidas, empacotadas

em saco plástico e levadas para o laboratório para serem processadas no mesmo

dia de acordo com o descrito a seguir (Figura 1): a coloteta e separação do solo da

rizosfera e do rizoplano foram realizadas através de uma adaptação do protocolo de

Bramwell (Bramwell et al., 1995), onde 10 gramas do solo aderido à raiz foram

retirados manualmente e adicionadas a um recipiente de 250 ml, contendo 90ml de

solução salina (solo da rizosfera) e agitadas por 1h. Paralelamente, para a obtenção

do solo do rizoplano. 10 gramas de raiz, com suas extremidades vedadas com

parafina, foram adicionadas no mesmo tipo de meio e recipiente citado acima,

acrescido de 10 gramas de areia peneira e autoclavada, seguido de agitação como

acima. No caso da população bacteriana do filoplano, essa região foi fracionada em

duas partes, epífitas solitários e epífitas que constituem biofilme. Tal análise foi feita

através de uma modificação do protocolo de Morris et al. (1998), como descrito a

seguir: 10 gramas de folhas, com suas extremidades vedadas com parafina, foram

imersas em recipiente contendo 90 ml de solução salina e agitadas a 120 rpm por 3

minutos. Em seguida a solução foi fracionada em duas alíquotas de 45ml, sendo

cada uma filtrada em filtros de 5 micrômetros. A solução salina filtrada foi juntada

novamente em um único recipiente (fração de bactérias epífitas solitárias). Quanto

aos filtros, estes foram expostos a uma nova etapa de lavagem utilizando-se solução

salina fresca, sendo os filtros reunidos num mesmo recipiente contendo 90 ml de

solução salina e exposto a 2 minutos (1 desligado e dois ligado) de sonicação, num

sonicador tipo banho-maria (fração epifítica que constituem biofilme). Posteriormente

ao fracionamento das bactérias epifíticas, os tecidos sofreram um processo de

desinfestação superficial (Dobereiner et al., 1995), através da sua imersão por 5

minutos em cloramina T (1%), seguido de enxágüe através de imersão em água por

aproximadamente 3 minutos e posterior imersão em tampão fosfato 0,05 M (pH 7.0)

por três minutos e em seguidas lavadas novamente com água destilada. Após a

esterilização, o tecido vegetal foi acrescentado a 90 ml de solução salina (diluição

20

10-1) e triturada utilizando liquidificador, seguido de sua diluição seriada até 10-7. A

partir dessa suspensão de microrganismo, objetivou-se isolar bactérias diazotróficas

predominantes (aquelas presentes em maior numero), salvo nas condições onde o

número total de isolados foi muito baixo, quando foram isoladas todas as bactérias

de colônia contrastante, como também todas as bactérias cultiváveis crescidas em

meio rico. O isolamento das bactérias diazotróficas foi feito de acordo com

Dobereiner et al. (1995), onde alíquotas de 100 µl das diferentes diluições foram

inoculadas em recipientes de 10 ml em triplicata, contendo 5 ml de meio semi-sólido

JMV, JNFb, LGI, LGI-P e NFb (anexo IV) e incubadas a 30ºC por 7 dias. Após a

verificação do crescimento, através da formação de uma película aerotáxica, as

bactérias crescidas em três frascos de maior diluição foram repicadas para novo

meio semi-sólido correspondente, onde cresceram por 5 dias, seguido de

plaqueamento em meio sólido correspondente. Colônias individuais exibindo

diferentes características morfológicas foram repicadas para meio rico (meio Batata)

para verificação da pureza dos isolados. A constatação do caráter diazotrófico foi

confirmado através da técnica de Redução de Acetileno (Anexo III). Para o

isolamento de todas as bactérias cultiváveis (aqui a bactérias do filoplano não foram

diferenciadas em solitária ou em biofilmes), alíquotas de 100µl da primeira diluição

(10-2) foram plaqueadas em dois meios ricos, NB e DYGS, e crescidas a 32º C por 6

dias, com posterior plaqueamento das colônias em meio de cultura correspondente.

As bactérias diazotróficas foram estocadas de três diferentes maneiras: em água,

liofilizadas e em meio batata inclinado imerso em óleo mineral. Quanto às bactérias

isoladas em meio rico, estas foram estocadas em água.

21

Fruteira

Figura 1. Organograma da metodologia de isolamento de bactérias diazotróficas.

10g de Raiz 10g de

Pseudocaule10g de Folha

Leves imersões em tampão

fosfato PORÇÃO

RIZOSFÉRICA

Leves agitos imersos em

tampão fosfato

PORÇÃO RIZOPLANO

Leves agitos imersos em

tampão fosfato + areia

Material que passa pela membrana

Maceração em tampão fosfato

= PORÇÃO SOLITÁRIA Filtragem do tampão em

membrana de 5μm Material retido na membrana

de 5μm

Homogeneização das células pro utrassonicação

Desinfestação da superfície do tecido

vegetal

PORÇÃO BIOFILME Desinfestação da superfície do tecido

vegetal



PORÇÃO ENDOFÍTICA PORÇÃO ENDOFÍTICA PORÇÃO ENDOFÍTICA = HISTOPLANO RAIZ = HISTOPLANO PSEUDOCAULE = HISTOPLANO FOLHA

22

3.2. Isolamento de bactérias não-diazotróficas: Plântulas crescidas por aproximadamente 2 meses formam retiradas

manualmente do substrato, tendo de 1 a 3 g do solo aderido às raízes adicionados a

um tudo tipo Falcon™ contendo solução salina do meio de cultura NFB numa

quantidade equivalente a dez vezes o peso do solo obtido (fração rizosférica). Para

a obtenção das bactérias epífitas de 1 a 3 gramas do tecido vegetal foi acrescentado

no mesmo tipo de meio e recipiente citados acima, com a posterior adição de areia

peneirada e autoclavada. Em seguida todos os frascos contendo as diferentes

partes da planta mais areia autoclavada (e também o recipiente contendo

unicamente amostras de solo rizosférico) foram submetidos a agitação por 1 h, para

a liberação das bactérias epífitas. Após esse período o tecido vegetal foi retirado do

recipiente e sofreu um processo de desinfestação superficial, através da sua

imersão por 30 minutos em álcool etílico (90%), seguido de sua lavagem em água

destilada autoclavada, e por uma nova etapa de desinfestação através de sua

incubação por 15 minutos em cloramina T 1% e de uma lavagem em tampão fosfato

50mM pH 5,8. Sendo em seguida triturado em solução salina estéril (diluição 10-1),

utilizando almofariz e pistilo, seguido de diluição seriada até 10-7. A partir dessa

suspensão de microrganismo, objetivou-se isolar bactérias diazotróficas

predominantes (aquelas presentes em maior número), salvo nas condições onde o

número total de isolados foi muito baixo, quando foram isoladas todas as bactérias

de colônia contrastante, como também todas as bactérias cultiváveis crescidas em

meio rico. Para o isolamento das bactérias diazotróficas, alíquotas (100 µl) das

diferentes diluições foram inoculadas em recipientes de 10 ml em triplicata, contendo

5 ml de meio NFb semi-sólido (anexo I) padrão e NFB semi-sólido modificado

contendo diferentes fontes de carbono na concentração de 5 g.l-1 (glicose, manitol e

sacarose, adicionadas através de filtração), e incubadas a 300C por 7 dias. Após a

verificação do crescimento, através da formação de uma película aerotáxica, as

bactérias crescidas em três frascos de maior diluição foram repicadas para novo

meio semi-sólido contendo a mesma fonte de carbono, onde cresceram por 5 dias,

seguido de plaqueamento em meio NFB sólido contendo a fonte de carbono

correspondente. Colônias individuais exibindo diferentes características morfológicas

foram repicadas para meio rico (meio NB) para verificação da pureza dos isolados.

Para o isolamento de todas as bactérias cultiváveis, alíquotas de 100 µl da primeira

diluição (10-2) foram plaqueadas em dois meios ricos, NB e Dygs, e crescidas a 32º

23

C por 6 dias, com posterior plaqueamento das colônias em meio de cultura

correspondente e estocagem.

3.3.Caracterização parcial e estocagem dos isolados Uma vez purificados, os isolados foram parcialmente caracterizados quanto à

morfologia da célula e da colônia (anexo I) aos 3 dias de crescimento, recebendo

uma designação do tipo UENF (anexo II), seguida de um número que informativo

quanto a origem da do isolado. As mesmas serão guardadas em triplicata em água

estéril, até a aquisição de um liofilizador.Pretende-se nesta etapa do trabalho, iniciar

a criação de uma bacterioteca para trabalhos futuros em programas de inoculação

de fruteiras tropicais.

24

Figura 2. Organograma das etapas envolvidas no processo de isolamento de bactérias em meio rico.

Planta Frutífera

10g de Caule 10g de Raiz 10g de Folha

Leves imersons em tampão

fosfato

Agito imerso em tampão

fosfato + areia

PORÇÃO RIZOSFERA


fosfato + areia


fosfato + areia

PORÇÃO RIZOPLANO

PORÇÃO CAULIPLANO

PORÇÃO FILOPLANIO

Desinfestação do tecido

superficial


superficial


superficial

Masseração Masseração Masseração

PORÇÃO HISTOPLANO RAIZ

PORÇÃO PORÇÃO HISTOPLANO CAULE HISTOPLANO FOLHA

25

3.4. Análise dos resultados do número mais provável (NMP) de bactérias diazotróficas

Devido à grande variação entre as diferentes repetições nos valores de NMP

de bactérias diazotróficas observado para a grande maioria dos tratamentos

estudados (fruteira, época do ano, sítio e meio de cultura), ao invés de uma análise

estatística, a comparação entre os diferentes sítios ao longo do eixo vegetativo das

diferentes culturas quanto à distribuição de bactérias diazotróficas se baseou em

três abordagens:

A - maiores valores de NMP para cada tratamento ao longo de três repetições de

cada estação;

B - observação da freqüência de observações detectadas (número de vezes que é

detectada a presença da bactéria por tratamento);

C - análise da diversidade (Índice de Shannon, riqueza e abundância).

26

CULTIVAR CULTIVA TECIDO VEGETAL MEIO DE CULTURA

DILUIÇÃO ORDEM Z**** W Y N V

Abacaxi -1 Cultivar - 1 -2 Rizosfera -1 X 1, 2, 3, ... Goiaba - 2 Cultivar - 2 JMV - 1 -3 Raiz Mamão - 3 Cultivar - 3 Epífitos -2 JNFb - 2 -4 Maracujá - 4 Cultivar - 4 Agregado -3** LGI -3 -5

Endófitos -4** LGI-P -4 -6 NFb -5 -7 Caule***

Epífitos (lavados com areia)----------a

JMVL -6 NB -8

Endofítico -b DYGS -9 Folha Epífitos -5 Agregados -6 Endófitos -7 Epifítico (lavado com areia)------c*** Pseudocaule-8 (só p/ abacaxi)

UENF VWYXZN

Figura 3. Código para identificação dos isolados (Em meio de enriquecimento de

bactérias diazotróficas)

27

Figura 4. Código para identificação dos isolados bacterianos obtidos a partir de meio rico (NB & DYGS).

CULTURA* V Abacaxi - 1 Goiaba - 2 Mamão - 3 Maracujá - 4

TECIDO VEGETAL

Y Rizosfera -1 Raiz Epífitos -2 Endófitos -3 Caule Epífitos -4 Endófitos -5 Folha Epífitos -6 Endófitos -7 Semente desinfestada -8

CULTIVAR** MEIO DE CULTURA*** W

Cultivar - 1 Cultivar - 2 Cultivar - 3 Cultivar - 4

X NB - 8 DYGS - 9

DILUIÇÃO ORDEM Z N

UENF VWYXYZ

28

4. Objetivo

4.1. Objetivos gerais No presente trabalho, pretendemos realizar tanto um estudo da biogeografia

da comunidade microbiana diazotrófica e não diazotrófica associada ao longo do

eixo vegetativo de diferentes fruteiras por meio de isolamento em diferentes meios

de cultura, como obter um banco de bactérias para uso futuro em programas de

promoção de crescimento.

4.2. Objetivos específicos

- Isolamento de bactérias diazotróficas rizosféricas, epífitas e endofíticas associadas

às raízes e folha de abacaxi (Ananas comosus L.), Goiaba, (Psidium guajava),

mamão (Carica papaya) e maracujá (Passiflora edulis f. edulis; Passiflora edulis f.

flavicarpa; Passiflora alata);

- Isolamento de bactérias em meio NB e Dygs epífitas e endofíticas associadas às

raízes, caule e folha de abacaxi (Ananas comosus L.) e maracujá (Passiflora edulis f.

edulis; Passiflora edulis f. flavicarpa; Passiflora alata);

-Caracterização morfológica dos isolados;

-Caracterização morfológica dos isolados;Agrupamento baseado nas características

morfológicas;

-Geração de uma bacterioteca para uso em futuros programas de inoculação;

Análise biogeográfica da colonização das bactérias diazotróficas ao longo do eixo

vegetativo das fruteiras, bem como a comparação dos padrões biogeográficos entre

os diferentes sítios das diferentes fruteiras em estudo, através da técnica de número

mais provável.

29

5. Resultados: 5.1. Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número mais provável (NMP): 5.1.1. O caso do abacaxizeiro: 5.1.1.1.maiores valores observados de NMP: Apenas no caso da cultura do abacaxi, foi observada uma visível diferença

entre as duas épocas do ano (inverno e verão) no que diz respeito ao padrão de

distribuição dos maiores valores de densidade de bactérias diazotróficas ao longo do

eixo vegetativo (Tabela 1). Tais dados mostram que durante o inverno, os maiores

valores de densidade para um único grupo bacteriano presente no histoplano -

pseudocaule (104 células por grama de tecido fresco) (JMV-, JNFb- e NFb-

dependentes) eram semelhantes àqueles encontrados em alguns sítios associados

à raiz [rizosfera (NFb-dependentes) e histoplano raiz (NFb-dependentes)] ou até

mesmo superior (no caso da rizoplano). Além disso, durante essa estação a

densidade de bactéria no histoplano - folha (103 células por grama de tecido fresco)

(JNFb-, LGI-P- e NFb- dependentes) mostrou-se num mesmo patamar do rizoplano

(LGI-dependentes). Durante o verão, os maiores valores de densidade de bactérias

diazotróficas para um único grupo bacteriano foi observado nos sítios associados à

raiz [rizosfera = 103 (JNFb- e NFb-dependentes); rizoplano = 104 (NFb-

dependentes); histoplano-raiz = 104 (NFb-, LGI-dependentes] do que nos sítios

associados a parte aérea do vegetal (histoplano – folha e histoplano – pseudocaule

= até 102).

Quando é observado o resultado da soma (num universo de três colheitas)

das densidades dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas obtidas numa única

colheita, durante o inverno, a rizosfera, o histoplano-raiz e o histoplano pseudocaule

se apresentam como os sítios a apresentarem as maiores densidades bacterianos

(104), seguidos do rizoplano e do histoplano folha (103). Durante o verão, são o

rizoplano e o histoplano-raiz os sítios a apresentarem a maior densidade (104),

seguido da rizosfera (103) e do histoplano folha e do histoplano pseudocaule (102).

Assim, a semelhança na distribuição das bactérias nos diferentes sítios entre

as duas estações está apenas no fato de que em ambas as estações, algum dos

sítios endofíticos se apresentaram como os de maior densidade: histoplano –

pseudocaule no inverno e histoplano – raiz no verão.

Da mesma forma que aconteceu para a maioria das quatro fruteiras a serem

30

apresentadas abaixo, na cultura do abacaxi também não foi detectada nenhuma

bactéria diazotrófica associada à superfície da folha, seja solitária ou formando

biofilme, independe do sítio, da estação e do meio de cultura.

Quanto aos grupos de bactérias estudadas (determinada de acordo com o

meio em que foi detectada), durante o inverno as maiores densidades observadas

foram as de JMV- (Histoplano – Pseudocaule), NFb – (Histoplano – Raiz e

Histoplano – Pseudocaule), e JNFb – (Histoplano – Pseudocaule), dependentes (104

célula por grama de tecido fresco), seguidas das bactérias LGI-P - e LGI -

dependente (103). Durante o verão, as maiores densidades foram observada para as

bactérias JNFb – (Histoplano-Raiz), NFb – (rizoplano) e LGI – (histoplano-raiz)

dependentes (até 104 células por grama de tecido fresco), seguidas dos demais

grupos: JMV- e LGI-P – dependentes (103 células por grama de tecido fresco).

O ordenamento das maiores densidades dos diferentes grupos microbianos,

resultado da soma (num universo de três colheitas) das densidades de um

determinado grupo microbiano, obtidas a partir dos diferentes sítios numa única

colheita, mostra que durante o inverno as bactérias JMV-, JNFb – e NFb -, foram as

mais numerosas (104), seguida de ambos os grupos de bactérias glicose –

dependente (LGI e LGI-P) (103). Durante o verão essa comparação mostra serem as

bactérias JNFb –, NFb - e LGI – dependentes as que se apresentavam em maiores

densidades (104), seguidas das bactérias JMV – e LGI-P – dependentes (103).

31


diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro em diferentes épocas do

ano.

NMP (x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotrófica nos meios:

Total** JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb*

INVERNO Rizosfera 4,5x102 3,0x102 2,5x102 0,4x102 1,4x104 1,4x104 Rizoplano 2,5x102 7,5x102 1,5x103 Nd 4,5x102 1,9x103

Histoplano-Raiz 4,5x103 2,5x103 0,7x102 2,0x102 1,4x104 2,1X104 Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Histoplano folha 9,5x102 4,5x103 2,0x102 1,1x103 2,5x103 9,3X103

Hist. Pseudocaule 1,1x104 1,4x104 2,0x103 2,5x102 1,1x104 3,8X104 Total*** 1,6X104 2,1X104 3.8X103 1,6X103 4,2X104 VERÃO

Rizosfera 4,5x102 1,4x103 2,5x102 2,5x102 4,5x103 4,6X103 Rizoplano 4,5x103 2,5x103 4,5x102 Nd 4,5x104 5,1X104

Histoplano-Raiz 4,5x103 4,5x104 4,5x104 2,5x103 2,5x103 9,9X104 Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd nd 0 Histoplano Folha 0,9x102 2,5x102 Nd 0,4x102 2,5x102 6,3X102 Hist. Pseudocaule 0,4x102 Nd Nd Nd 0,4x102 0,8X102

Total*** 9,5X103 4,7X104 4,6X104 2,8X103 5,0X104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;

**maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes

cinco grupos de bactérias diazotróficas obtidos para um único sítio/forma de disposição.

***maior valor, num universo de três colheitas por estação, resultado da soma do NMP dos diferentes

sítios da planta obtidos para um único grupo de bactéria diazotrófica.

32

5.1.1.2. freqüência de detecção: Durante o inverno a freqüência de detecção de possíveis grupos unitários

(microrganismos detectados em um determinado meio de cultura) de bactérias

diazotróficas por cada sitio analisado só alcançou 100% (3 detecções em 3

colheitas) para os grupos de bactérias JMV– (histoplano –raiz), JNFb- (rizosfera,

rizoplano e histoplano-raiz), NFb- (rizosfera, rizoplano e histoplano-raiz) (Tabela 2).

A percentagem de detecção dos demais grupos foi de 67; 33% ou não foram

detectadas. Durante o verão, os grupos unitários de bactérias diazotrófica por sitio

analisado a se apresentarem com 100 % foram detectados nos mesmos sítios da

estação anterior.

Quanto a análise da freqüência de detecção sem distinguir o sítio de

isolamento (três tentativas/grupo de bactérias x sete sítios), durante o inverno, o

grupo dos microrganismos a apresentarem o maior percentual de detecção foram os

NFb – dependentes (62%), seguido pelos JNFb – dependentes (57%), JMV –

dependente (48%), LGI - dependentes (38%) e pelas LGI-P – dependentes (29%).

Durante o verão, a percentagem de detecção de cada grupo bacteriano sem

distinguir os sítios, mostrou que os maiores percentuais foram alcançados para o

grupo das bactérias NFb – dependentes (57%), seguidas pelas JNFb - dependentes

(52%), JMV – dependentes (48%), LGI – dependentes (24%) e finalmente pela LGI-

P – dependentes (19%).

Quanto ao sítio como um todo, sem distriguir o grupo da bactérias, durante o

inverno a maior percentagem de detecção de possíveis bactérias diazotrófica foi

obtida no histoplano raiz (87%), seguida pela rizosfera (73%), histoplano – folha

(60%) e rizoplano e histoplano folha (ambos com 53% de detecção, cada). Não

foram detectadas bactérias diazotróficas na superfície das folhas, em nenhuma das

estações estudadas. Durante o verão, os maiores percentuais de detecção foram

observados no histoplano – raiz (87%), seguidos pela rizosfera (73%), rizoplano

(60%), histoplano-folha (47%) e pelos histoplano-pseudocaule (13%).

33

Tabela 2. Freqüência de detecção de possíveis bactérias diazotróficas associadas a

diferentes sítios do abacaxizeiro durante três colheitas por épocas do ano.

Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:

Meios de Cultura* Total** JMV JNFb LGI LGI-P NFb

INVERNO Rizosfera 67 100 67 33 100 73% Rizoplano 33 100 33 Nd 100 53%

Histoplano-Raiz 100 100 67 67 100 87% Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano folha 67 67 33 33 67 53%

Histoplano Pseudocaule 67 33 67 67 67 60% Total*** 48% 57% 38% 29% 62% VERÃO

Rizosfera 67 100 67 33 100 73% Rizoplano 67 100 33 Nd 100 60%

Histoplano-Raiz 100 100 67 67 100 87% Solitário Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 67 67 Nd 33 67 47%

Histoplano Pseudocaule 33 Nd Nd Nd 33 13% Total*** 48% 52% 24% 19% 57%

*Universo de três observações para cada meio de cultura durante cada época do ano; **Universo de 15 observações (5 meios de cultura x 3 colheita); ***Universo de 21 observações (7 sítios/formas de organização x 3 colheitas)

34

5.1.1.3. Diversidade, Riqueza e Abundância:

Durante o inverno, ao longo de três colheitas, os maiores índices de

diversidade (índice de Shannon) foram observados no histoplano folha (0,555241),

seguido pelo histoplano-pseudocaule (0,552358), (ambos na terceira coleta),

rizosfera (0,481521) (na primeira coleta), histoplano raiz (0,397789) (na terceira

coleta) e o rizoplano (0,380529) (na primeira coleta) (Tabela 3). Já durante o verão

tal ordenamento muda, aparecendo o histoplano – raiz como o sítio a apresentar o

maior índice de diversidade (0,516091) (segunda coleta), seguido do histoplano –

folha (5153318) (primeira coleta), rizosfera (0,49319) (primeira coleta), rizoplano

(0,354336) (segunda coleta) e do histoplano-pseudocaule (0,30103) (segunda

coleta).

Quanto a riqueza de bactérias diazotróficas (Tabela 4) (número de grupos

bacterianos detectados), durante o inverno, foi possível se observar que ao menos

em uma colheita, quatro dos sete sítios estudados (rizosfera, histoplano raiz,

histoplano folha e histoplano – pseudocaule) apresentaram a presença de todos os

grupos de bactérias estudados. Durante o verão, apenas nos sítios rizosfera e

histoplano todos os grupos de bactérias diazotróficas estavam presentes numa única

colheita.

Quanto à abundância de possíveis bactérias diazotróficas (somatório dos

diferentes grupos de bactérias diazotróficas) (Tabela 5), durante o inverno, a maior

densidade de bactérias diazotróficas foi observada no histoplano-pseudocaule e no

histoplano-raiz e na rizosfera (104 células por grama de tecido fresco) (ambos na

terceira coleta). Durante o verão a maior densidade de bactérias diazotrófica foi

observada no histoplano – raiz (104 célula por grama de tecido fresco).

35


associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro. Índice de Shannon

Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 0,481521 0,421262 0,049982 0,49319 0,277726 0,041913

Rizoplano 0,380529 0,283054 0,27264 0,190867 0,354336 0,255591

Histoplano-Raiz 0,344498 0,381415 0,397789 0,452916 0,516091 0,276405

Filoplano solitário Nd Nd Nd Nd nd Nd

Filoplano biofilme Nd Nd Nd Nd nd Nd

Histoplano-folha 0 0,174235 0,555241 0,515318 nd 0,440595

Histoplano-Pseudocaule 0,463431 0 0,552358 Nd 0,30103 Nd


do abacaxizeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 5 3 3 5 4 2

Rizoplano 3 2 3 4 3 2

Histoplano-Raiz 5 3 5 5 5 3

Filoplano solitário 0 0 0 0 0 0

Filoplano biofilme 0 0 0 0 0 0

Histoplano-folha 1 2 5 4 0 3

Histoplano-Pseudocaule 3 1 5 0 2 0

Tabela 5. Abundância (NMP x g-1 de tecido fresco) de possíveis bactérias

diazotróficas associadas a diferentes sítios do abacaxizeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 8,60x102 4,30x102 1,43x104 3,90x103 1,70x103 4,59x103

Rizoplano 1,15x103 7,00x102 1,99x103 5,09x104 4,10x103 3,45x103

Histoplano-Raiz 6,75x103 3,90x103 2,13x104 9,95x104 1,19x104 3,15x103



Histoplano-folha 0,40x102 2,90x102 9,30x103 6,30x102 0 5,90x102

Histoplano-Pseudocaule 3,30x102 0,40x102 3,82x104 0 0,80x102 0

36

5.1.2. O caso da goiabeira: 5.1.2.1. Maiores valores observados de NMP: Entre todas as fruteiras essa foi a

que se mostrou com os mais baixos valores de densidade de bactérias diazotróficas

nos sítios da parte superior da planta (Tabela 6). Sendo detectadas tais bactérias, e

em baixa densidade, apenas no histoplano – folha, e apenas nas coletas de verão.

Dessa forma, para ambas as estações, foi essa a cultura a apresentar a mais clara

distinção entre as densidades de bactérias presentes nos sítios superiores e

inferiores da planta. Assim, durante o inverno, o sitio que se apresentou abrigando

os maiores valores de densidade de bactérias diazotróficas foram a rizosfera (104

células por grama de tecido fresco para as duas estações) (JNFb-dependentes),

rizoplano (103 células por grama de tecido fresco) (LGI-, NFb-dependentes) e

histoplano raiz (102 células por grama de tecido fresco). Durante o verão tal

ordenação sofreu uma pequena modificação. Nessa estação as maiores densidade

são encontradas na rizosfera (JNFb-, NFb-dependentes) e no rizoplano (JNFb-. NFb-

dependentes)(104), seguida do histoplano-raiz (JMV-, JNFb-, LGI- e LGI-P-

dependentes) (103) e do histoplano - folha (102 células por grama de tecido fresco).

A análise das maiores densidades de bactérias nos diferentes sítios,

resultados da soma das densidades dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas

obtidas numa única colheita, se mostra com o mesmo ordenamento que o resultado

da análise dos maiores valores observados para um determinado grupo de bactéria,

no caso do inverno e levemente diferente no caso do verão. Nessa última estação,

os maiores valores de soma dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas obtidas

numa única estação, mostram que todos os sítios associados à raiz possuem uma

densidade de bactérias diazotrófica muito próxima (104 células por grama de tecido

fresco) seguido pelo histoplano folha (102).

A diferença na densidade de bactérias diazotróficas entre as duas estações

está na quantidade de nichos onde foram detectadas essas bactérias, cujo maiores

valores de NMP alcançaram até 104 células por grama de tecido fresco. Assim,

embora em ambas as estações o maior número de bactérias diazotróficas obtida

tenha sido de 104 células por grama de tecido fresco, foi o verão a estação onde tal

densidade de células foi obtida em maior número de sítios.

Quanto à densidade dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas,

independente do nicho estudado, no inverno as bactérias JNFb – dependentes

foram obtidas em maior número (104 células por grama de tecido fresco) (rizosfera),

37

seguidas pelas JMV- (rizosfera), LGI- (rizosfera e rizoplano) e NFb- (rizosfera e

rizoplano) dependentes (até 103 células por grama de tecido fresco). Não foi

detectada bactérias LGI-P- dependentes em nenhum sítio durante o inverno. No

verão as maiores densidades de bactérias diazotróficas foram as pertencentes aos

dois grupos de bactérias malato – dependentes [JNFb-dependentes (rizosfera,

rizoplano) e NFb- dependentes (rizosfera, rizoplano)] (104 células por grama de

tecido fresco), seguidos pelas JMV – (histoplano-raiz) e pelos dois grupo de

bactérias glicose – dependentes (LGI- LGI-P-dependentes) (até 103 células por

grama de tecido fresco). Esse ordenamento, tanto para o inverno como para o

verão, permanece o mesmo quando são comparadas as densidades dos diferentes

grupos de bactérias, resultado da soma das densidades de bactérias diazotróficas

obtidas a partir dos diferentes sítios numa única colheita. Tabela 6. Maiores valores observados do número mais provável de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira em diferentes épocas do ano.

Goiaba NMP (x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotróficas nos meios:

JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb* Total** INVERNO Rizosfera 2,0x103 1,4x104 2,5x103 Nd 2,5x103 1,6X104 Rizoplano 0,4x102 4,5x102 2,5x103 Nd 1,5x103 2,5X103

Histoplano-Raiz Nd Nd 2,5x102 Nd 0,3x102 2,5X102 Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histroplano Folha Nd Nd Nd Nd Nd 0

Total *** 2,0X103 1,4X104 2,8X103 0 3,0X103 VERÃO

Rizosfera 0,9x102 1,4x104 2,5x103 2,5x102 1,5x104 3,2X104 Rizoplano 9,5x102 1,4x104 4,5x102 Nd 4,5x104 6,0X104

Histoplano-Raiz 2,5x103 2,5x103 4,5x103 4,5x103 7,5x102 1,3X104 Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histroplano Folha 0,4x102 0,4x102 Nd Nd 0,9x102 1,7X102

Total*** 3,5X103 2,8X104 5,2X103 4,5X103 6,0X104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;





38

5.1.2.2. freqüência de detecção: Os resultados de freqüência de detecção de bactérias diazotróficas (Tabela 7)

mostram uma grande diferença entre as duas estações estudadas: no inverno,

apenas os dois grupos de bactérias malato – dependentes (JNFb-, NFb-

dependentes) (rizosfera), e o grupo das bactérias LGI – dependentes (rizoplano)

apresentaram 100% de detecção em alguns dos sítios estudados, seguidas pelo

grupo de bactéria JMV – dependente, que alcançou um percentual máximo de

detecção de 67% na rizosfera. Durante o verão, os grupos de bactérias JMV –

dependentes (rizoplano), JNFb – dependentes (rizosfera, rizoplano e histoplano

raiz), LGI – dependente (histoplano raiz) e NFb – dependentes(rizoplano) atingiram

100% de detecção. O grupo de bactéria diazotrófica LGI-P – dependentes, atingiram

apenas 33% de detecção (rizosfera e histoplano raiz).

Quando é comparada a freqüência de detecção de bactéria diazotrófica em

cada sítio, sem se distinguir o meio de cultura usado, durante o inverno os sítios que

apresentaram as maiores freqüências foram a rizosfera (67%), seguida do rizoplano

(53%) e do histoplano – raiz (13%). Durante o verão esse ordenamento muda

bastante, sendo o histoplano – raiz o sitio a apresentar a maior freqüência (80%),

seguido pelo rizoplano (73%), rizosfera (60%) e histoplano folha (20%).

A comparação da freqüência dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas

sem distingui os sítios de isolamento, mostra que no inverno as bactérias LGI – e

NFb – dependentes foram detectadas com maior freqüência (33%), seguida das

JNFb – dependentes (28%) e das JMV-dependentes (17%). Durante o verão essa

ordem se altera, sendo o grupo das bactérias JNFb – dependentes (55%) a serem

detectadas com maior freqüência, seguidas do grupo das bactérias JMV – e NFb –

dependentes (44%), LGI – dependentes (39%) e das LGI-P - dependentes (11%).

39

Tabela 7. Freqüência de detecção de bactérias diazotróficas associadas a diferentes

sítios da goiabeira durante três colheitas por épocas do ano.

Goiaba Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:

Meio de cultura* Total** JMV JNFb LGI LGI-P NFb

INVERNO Rizosfera 67 100 67 Nd 100 67% Rizoplano 33 67 100 Nd 67 53%

Histoplano-Raiz Nd Nd 33 Nd 33 13% Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histroplano Folha Nd Nd Nd Nd Nd 0

Total 17% 28% 33% 0 33% VERÃO

Rizosfera 33 100 67 33 67 60% Rizoplano 100 100 67 Nd 100 73%

Histoplano-Raiz 100 100 100 33 67 80% Solitária Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 33 33 Nd Nd 33 20%

Total 44% 55% 39% 11% 44% *Universo de três observações para cada meio de cultura durante cada época do ano; **Universo de 15 observações (5 meios de cultura x 3 colheita); ***Universo de 21 observações (7 sítios/formas de organização x 3 colheitas)

40

5.1.2.3. Diversidade, Riqueza e Abundância: A goiabeira foi não só a cultura a apresentar as menores freqüências de

detecção de possíveis bactérias diazotróficas, como também a apresentar os

menores índices de diversidade. Assim, durante o inverno, enquanto o rizoplano e a

rizosfera compartilham um índice de Shannon bastante semelhante (0,455806 e

0,455154) (Tabela 8), para o histoplano raiz tal índice foi zero. Durante o verão esse

ordenamento se altera bastante, sendo o histoplano raiz o sítio a apresentar o maio

índice de Shannon (0,578701), seguido pelo rizoplano (0,511296), histoplano - folha

(0,441939) e rizosfera (0,421397).

A análise da riqueza dos diferentes grupos de bactérias (Tabela 9) mostra que

durante o inverno, os sítios a apresentarem o maior número de grupos de bactérias

diazotróficas detectadas em uma única colheita foi a rizosfera e o rizoplano (4).

Durante o verão, apenas nos sítios rizosfera e histoplano-raiz foi detectada a

presença de todos os grupos de bactérias diazotróficas.

Quanto à abundância de bactérias diazotróficas total, durante o inverno a

maior densidade de bactérias foi observada na rizosfera (104), seguido pelo

rizoplano (103) e pelo histoplano-raiz (102). Durante o verão os sítios rizosfera,

rizoplano e histoplano-raiz apresentaram a maior densidade de bactérias

diazotróficas (104 células por grama de tecido fresco), pelo histoplano-folha (102).

41


associadas a diferentes sítios da goiabeira. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 0,455154 0,234608 0,228866 0,421397 0 0,209679

Rizoplano 0,455806 0,36171 0 0,283475 0,323918 0,511296

Histoplano-Raiz 0 0 0 0,266096 0,367572 0,578701

Filoplano solitário Nd 0 Nd Nd Nd Nd

Filoplano biofilme Nd 0 Nd Nd Nd Nd

Histoplano-folha Nd 0 Nd Nd Nd 0,441939

Tabela 9. Riqueza de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira.

Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c







Tabela 10. Abundância de possíveis bactérias diazotróficas associadas a diferentes sítios da goiabeira.

Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 6,0 x 103 1,9 x103 1,6 x 104 3,2 x 104 2,0 x 102 5,2 x 103

Rizoplano 8,1 x 102 2,2 x 103 2,5 x 103 6,0 x 104 1,2 x 103 1,2 x 103

Histoplano-Raiz 2,5 x 102 0 0,3 x 102 3,0 x 103 4,2 x 103 1,3 x 104



Histoplano-folha 0 0 0 0 0 1,7 x 102

42

5.1.3. O caso do mamoeiro: 5.1.3.1. Maiores valores observados de NMP: Da mesma forma que o ocorrido com as culturas anteriores, também do caso

do mamoeiro, em ambas as épocas as maiores densidades de bactérias

diazotróficas foram registradas mais nos sítios associados à raiz do que naqueles

associados à parte aérea da cultura (Tabela 11). Esse mesmo padrão geral se

repetiu quando foram analisadas as maiores densidades de bactérias diazotróficas,

sem se distinguir cada grupo particular (Tabela 11). Assim, durante o inverno a

ordem dos sítios em relação às maiores densidades de um determinado grupo

microbiano foi: rizosfera (104 células por grama de tecido fresco) (NFb-

dependentes), seguido pelo rizoplano, histoplano – raiz e histoplano folha e filoplano

sob a forma solitária (102). Esse último sítio foi representado apenas pela

comunidade LGI - dependente. A comparação dos sítios quanto aos maiores valores

de densidade resultado da soma dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas

numa única colheita, mostrou uma pequena variação nesse ordenamento: rizosfera

(104), rizoplano e histoplano folha (103), histoplano raiz e filoplano solitária (102).

Durante o verão, a maior densidade de um determinado grupo de bactérias

diazotróficas foi observada na rizosfera (104) (JNFb-, NFb-dependentes), seguida

pelo rizoplano (JNFb-, LGI-, e NFb-dependentes), e histoplano raiz (JMV-, e JNFb-

dependentes) (103 células por grama de tecido fresco), pelo histoplano folha e

filoplano sob a forma solitária (102 células por grama de tecido fresco). Essa última

representada apenas por bactérias manitol - dependente. Da mesma forma que o

ocorrido para as duas culturas anteriores, também não foi detectada a presença de

bactérias diazotróficas no filoplano organizada sob a forma de biofilme, em nenhuma

das estações. A comparação dos sítios quanto aos maiores valores resultado da

soma das densidades dos diferentes grupos de bactérias detectadas em uma única

colheita mostra que os maiores valores de densidade total de bactérias diazotróficas

é encontrado na rizosfera (104), seguido pelo rizoplano, histoplano raiz e histoplano

folha (103) e pelo filoplano – solitária (102).

Quanto aos diferentes grupos de bactérias detectadas, durante o inverno foi

observado que o grupo das bactérias NFb – dependentes (rizosfera) foi a que se

mostrou em maior número (até 104 células por grama de tecido fresco), seguida das

bactérias JNFb –dependentes (rizosfera) (até 103 células por grama de tecido

fresco) e finalmente pelas LGI-, LGI-P- e JMV - dependentes (102 células por grama

43

de tecido fresco). Durante o verão ambos os grupos de bactérias malato –

dependentes [JNFb- (rizosfera) e NFb- dependentes, (rizosfera)] se apresentaram

em maior número (104), seguido das JMV- (histoplano-raiz), e LGI – dependentes

(rizoplano) (103) e pelas LGI-P – dependente (102).

A comparação da densidade dos diferentes grupos de bactérias, sem

considerar o sítio de origem, durante o inverno as maiores densidades de bactérias

encontradas foram as de NFb-dependentes (104), seguido dos grupos de bactérias

JNFb- e LGI – dependentes (103), e pelas JMV-, e LGI-P dependentes (102). Durante

o verão, ambos os grupos de bactérias malato-dependentes (JNFb- e NFb-

dependente) (104) foram as que se apresentaram em maior número, seguidas pelas

JMV- e LGI-dependentes (103) e pela LGI-P – dependentes (102).


diazotróficas associadas a diferentes sítios do mamoeiro em diferentes épocas do

ano.

Mamão Densidade (MPN x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotróficas nos meios:

JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb* Total** INVERNO Rizosfera 0,6x102 2,5x103 9,5x102 Nd 1,4x104 1,5X104 Rizoplano 0,4x102 9,5x102 4,5x102 Nd 9,5x102 2,4X103

Histoplano Raiz 0,3x102 4,0x102 4,0x102 Nd 0,9x102 8,0X102 Solitário Filoplano Nd Nd Nd 4,0x102 Nd 4,0X102 Biofilme Filopano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 2,5x102 2,5x102 0,9x102 0,3x102 9,5x102 1,5X103

Total*** 2,5x102 3,3x103 1,7x103 4,0x102 1,5x104 VERÃO

Rizosfera 0,9x102 1,1x104 4,0x102 Nd 4,5x104 5,6x104 Rizoplano Nd 2,0x103 4,5x103 Nd 2,5x103 7,2x103

Histoplano Raiz 4,5x103 2,5x103 2,5x102 0,9x102 9,5x102 7,9x103 Solitário Filoplano 0,4x102 Nd Nd Nd Nd 0,4x102 Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 2,5x102 4,5x102 2,5x102 Nd 4,5x102 1,4x103

Total*** 4,8x103 1,1x104 4,9x103 0,9x102 4,8x104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;





44

5.1.3.2. Freqüência de detecção: Os únicos grupos de microrganismos a apresentarem 100% de detecção

durante o inverno, foram os pertencentes ao grupo dos microrganismos LGI –

dependentes e JNFb – dependentes (ambos para os sítios rizosfera e rizoplano)

(Tabela 12). Durante o verão foram os dois grupos de microrganismos malato –

dependentes (rizosfera, rizoplano e histoplano raiz, para os dois grupos de

microrganismos), e manitol dependentes no caso do histoplano folha.

Quanto aos diferentes sítios da planta e sem distinguir os grupos de bactérias

diazotróficas, durante o inverno foram a rizosfera e o rizoplano os sítios a

apresentarem os maiores percentuais de detecção (60%), seguidos pelo histoplano

folha (53%), histoplano raiz (27%) e do filoplano solitário (13%). Durante o verão

esse ranquiamento muda consideravelmente, com o histoplano raiz como o sítio a

apresentar o maior percentual de detecção (73%), seguido do histoplano folha

(67%), rizosfera (60%), rizoplano (47%) e do filoplano solitário (7%).

Quanto aos diferentes grupos de bactérias diazotróficas na planta como um

todo (sem distinguir os diferentes sítios de isolamento), durante o inverno o grupo de

bactéria a ser detectado com maior freqüência foram as LGI - e as JNFb –

dependentes (50%), seguidas pela JNFb – dependentes (33%), JMV – dependentes

(28%) e pelas LGI-P – dependentes (17%). Durante o verão essa ordenação é

liderada pelos dois grupo das bactérias malato – dependentes (JNFb- e NFb-

dependentes) (61%), seguido das bactérias LGI – dependentes (44%), JMV –

dependentes (39%) e pelas LGI-P – dependentes (5%).

45


diferentes sítios do mamoeiro durante três colheitas por época do ano.

Mamão Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:

JMV JNFb LGI LGI-P NFb Total INVERNO Rizosfera 33 67 100 Nd 100 60% Rizoplano 33 67 100 Nd 100 60%

Histoplano Raiz 33 33 33 Nd 33 27% Solitário Filoplano Nd Nd Nd 67 Nd 13% Biofilme Filopano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 67 33 67 33 67 53%

Total 28% 33% 50% 17% 50% VERÃO Total

Rizosfera 33 100 67 Nd 100 60% Rizoplano Nd 100 33 Nd 100 47%

Histoplano Raiz 67 100 67 33 100 73% Solitário Filoplano 33 Nd Nd Nd Nd 7% Biofilme Filoplano Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 100 67 100 Nd 67 67%


46

5.1.3.3. Diversidade, riqueza e abundância: Ao logo das três colheitas do inverno o maior índice de diversidade (Tabela

13) foi observado na rizosfera (0,510903), seguido pelo rizoplano (0,484798),

histoplano-folha (0,457852) e pelo histoplano-raiz (0,30103). Durante o verão foi o

histoplano-raíz o sítio a apresentar o maior índice de diversidade (0,597582), vindo

em seguida o histoplano-folha (0,584084), rizoplano (0,338436) e a rizosfera

(0,307264).

Quanto à riqueza (Tabela 14), durante o inverno nenhum dos sítios

mo333straram a presença de todos os grupos de bactérias diazotróficas em uma

única colheita. Nessa estação, os sítios a apresentar o maior número de grupos de

bactérias diazotrófica foram a rizosfera, o rizoplano e o histoplano-folha (quatro

grupos). Durante o verão apenas no sítio histoplano-raiz foi detectada em uma única

colheita todos os grupos de bactérias diazotróficas.

Quanto à abundância de bactérias diazotrófica (Tabela 15), tanto no inverno

como no verão, a maior densidade do conjunto de bactérias diazotróficas observada

em uma única colheita foi detectada na rizosfera.

47

Tabela 13. Diversidade (Índice de Shannon) de possíveis bactérias diazotróficas

associadas a diferentes sítios do mamoeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 0,421262 0,510903 0,10276 0,222191 0,112571 0,307264

Rizoplano 0,441939 0,484798 0,195676 0,338436 0,298344 0,272712

Histoplano-Raiz 0,30103 0 0 0,370707 0,597582 0,408148

Filoplano solitário 0 0 Nd Nd 0 Nd

Filoplano biofilme Nd Nd Nd Nd nd Nd

Histoplano-folha Nd 0,41196 0,457852 0,539985 0,174235 0,584084


sítios do mamoeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c








sítios do mamoeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 4,3 x103 2,9 x103 1,5 x 104 5,6 x 104 4,8 x 103 5,7 x 103

Rizoplano 1,7 x 103 2,4 x 103 5,4 x 102 7,2 x 103 4,5 x 103 1,4 x 103

Histoplano-Raiz 8,0 x 102 0,3 x 102 0,9 x 102 3,8 x 102 5,8 x 102 7,9 x 103

Filoplano solitário 4,0 x 102 0,4 x 102 0 0 0,4 x 102 0


Histoplano-folha 0 3,6 x 102 1,5 x 103 7,9 x 102 2,9 x 102 1,4 x 103

48

5.1.4.O caso do maracujazeiro: 5.1.4.1. maiores valores de NMP observados: Dentre todas as culturas, o maracujazeiro foi aquela que resultou nas

menores densidades de bactérias diazotróficas (103 células por grama de tecido

fresco) (Tabela 16). Apesar disso, ela foi não só a única cultura a apresentar

bactérias diazotróficas no filoplano associadas sob a forma de biofilme (102 células

por grama de tecido fresco), como também a apresentar a maior densidade de

bactérias diazotróficas nesse sitio sob a forma solitária (até 103). Assim,

praticamente não foi observado um gradiente de densidade de bactérias

diazotróficas ao longo do eixo vegetativo da planta. Tal gradiente foi observado

apenas de uma maneira bastante tênue durante o verão.

Assim, durante o inverno praticamente não foi observada variação na

densidade máxima de bactérias diazotróficas entre os diferentes sítios, tendo em

vista que foi constatado na grande maioria dos sítios um valor máximo de densidade

igual a 103 células por grama de tecido fresco. A exceção foi o caso das bactérias do

filoplano, na porção de microrganismos que formam biofilme. Nesse caso a

densidade máxima observada foi de 102 células por grama de tecido fresco (JNFb-,

NFb-dependente). Esse ordenamento permanece igual, quando são observadas as

maiores densidades de bactérias diazotróficas totais, sem distinguir a que grupo

pertence (maiores valores de densidade resultado da soma dos diferentes grupos de

bactérias numa única colheita). Durante o verão, os sítios associados à raiz

[rizosfera (NFb-dependente), rizoplano (LGI-, NFb-dependente) e histoplano raiz

(JNFb-, NFb-dependente)] apresentaram uma densidade máxima de 103 células por

grama de tecido fresco, seguido pelo histoplano folha, que alcançou em cada um

dos sítios até 102 células por tecido fresco. Contudo, a comparação dos maiores

valores de densidade de bactérias diazotróficas totais (maiores valores de densidade

resultado da soma dos diferentes grupos de bactérias numa única colheita), faz do

rizoplano o sítio a apresentar a maior densidade de bactérias diazotróficas (104),

seguido da rizosfera, histoplano raiz, e histoplano folha (103). Não foram detectadas

bactérias (sob a forma solitária ou em biofilme) colonizando a superfície da folha

nessa época do ano.

Quanto aos grupos de bactérias estudadas, durante o inverno foi observado

os maiores valores de densidade para os grupos de bactérias JNFb-dependente

(rizosfera, histoplano-raiz, filoplano-solitária), LGI-P-dependente (histoplano-folha),

49

NFb-dependente (rizosfera, rizoplano, histoplano-raiz) (103 células por grama de

tecido fresco), seguido pelas bactérias JMV – dependentes (rizosfera, histoplano

folha) (102 células por grama tecido fresco) e pela LGI-dependente (rizosfera,

rizoplano, histoplano-raiz, histoplano folha). Durante o verão, com exceção das

bactérias LGI-P – dependentes (102), todos os grupos de bactérias apresentaram os

mesmos valores máximos de densidade máxima em pelo menos um dos sítios de

análise (103).

A comparação da densidade dos diferentes grupos de bactérias obtidos em

uma única colheita, sem considerar os sítios de isolamento, durante o inverno, com

exceção das bactérias JMV-dependente (102), todos os grupos bacterianos alcanção

até 103 células por grama de tecido fresco. Durante o verão, esse ordenamento se

altera profundamente, com o grupo das bactérias NFb – dependentes se

apresentando com a maior densidade total (104), seguida das JMV-, JNFb-, LGI-

dependentes (103), e do LGI-P dependente (102).


diazotróficas associadas a diferentes sítios do maracujazeiro em diferentes épocas

do ano.

Maracujá Densidade (NMP x g-1 de tecido fresco) de bactérias diazotróficas nos meios:

JMV* JNFb* LGI* LGI-P* NFb* Total** INVERNO Rizosfera 0,4x102 2,0x103 4,0x102 Nd 1,1x103 3,5x103 Rizoplano Nd 4,5x102 9,0x102 Nd 4,5x103 4,8x103

Histoplano Raiz Nd 1,5x103 9,0x102 2,5x102 2,5x103 3,8x103 Filoplano Solitária Nd 2,5x103 Nd 0,4x102 4,0x102 2,9x103 Filoplano Biofilme Nd 9,5x102 Nd Nd 2,5x102 9,5x102 Histoplano Folha 2,5x102 9,0x102 2,5x102 2,5x103 4,5x102 3,7x103

Total** 2,9x102 5,8x103 2,2x103 2,8x103 6,4x103 VERÃO

Rizosfera 0,4x102 9,5x102 9,5x102 Nd 7,5x103 7,7x103 Rizoplano 1,1x102 4,5x102 2,0x103 Nd 6,5x103 1,1x104

Histoplano Raiz 4,5x103 2,5x103 9,5x102 Nd 4,5x103 7,2x103 Filoplano Solitária Nd Nd Nd Nd Nd 0 Filoplano Biofilme Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 2,5x102 2,5x102 2,5x102 4,5x102 2,5x102 1,4x103

Total 4,6x103 6,6x103 4,1x103 4,5x102 1,7x104 *maior valor do NMP obtido para cada grupo de bactéria diazotróficas durante três colheitas;





50

5.1.4.2. freqüência de detecção: Quanto à freqüência de detecção, enquanto no inverno apenas os dois grupos

de bactérias malato – dependentes apresentaram – se com 100% de detecção para

pelo menos um dos sítios [JNFb-dependentes (rizosfera); NFb-dependente (rizosfera

e rizoplano)], no verão todos os grupos de bactérias diazotróficas (com exceção das

LGI-P – dependentes) apresentaram com 100% de detecção em pelo menos um dos

sítios estudados (Tabela 17).

Quanto à comparação dos diferentes sítios, sem distinguir os diferentes

grupos de bactérias, durante o inverno é a rizosfera o sítio a apresentar o maior

percentual de detecção (60%), seguida do rizoplano, histoplano folha (47%), do

histoplano raiz (40%), filoplano solitária (33%) e do filoplano biofilme (20%). No

verão o maior percentual de detecção é encontrado no rizoplano, histoplano raiz

(67%), rizosfera (53%) e histoplano folha (47%).

Quanto à comparação dos diferentes grupos de bactérias diazotróficas na

planta como um todo, sem distinguir o sítio de análise, durante o inverno os maiores

percentuais de detecção são observado para as bactérias malato pH 5,8 –

dependente (72%), seguidas das bactérias malato pH 6,5 – dependentes (67%),

glicose pH 6,3 – dependentes (33%) e das manitol – dependentes, glicose pH 5,5 –

dependentes (17%). No verão, os dois grupos de bactérias malato – dependentes

foram as mais detectadas (61%), seguida das manitol – dependentes, glicose pH 6,2

– dependentes (33%) e das glicose pH 5,5 dependentes (5%).

51


diferentes sítios do maracujazeiro durante três colheitas por época do ano.

Maracujá Percentual de detecção de possíveis bactérias diazotróficas:

JMV JNFb LGI LGI-P NFb Total INVERNO Rizosfera 33 100 67 Nd 100 60% Rizoplano Nd 67 67 Nd 100 47%

Histoplano Raiz Nd 67 33 33 67 40% Filoplano Solitária Nd 67 Nd 33 67 33% Filoplano Biofilme Nd 67 Nd Nd 33 20% Histoplano Folha 67 67 33 33 33 47%

Total 17% 72% 33% 17% 67% VERÃO

Rizosfera 33 100 33 Nd 100 53% Rizoplano 33 100 100 Nd 100 67%

Histoplano Raiz 100 100 33 Nd 100 67% Filoplano Solitária Nd Nd Nd Nd Nd 0 Filoplano Biofilme Nd Nd Nd Nd Nd 0 Histoplano Folha 33 67 33 33 67 47%


52

5.1.4.3. Diversidade, riqueza e abundância: Diferente do que ocorreu nos casos anteriores, nas duas estações estudadas

o maior índice de diversidade de bactérias diazotróficas foi observado no histoplano

– folha (Tabela 18). Assim, durante o inverno os maiores valores (num universo de

três amostragens) do índice de Shannon foi o seguinte: histoplano-folha (0,463539),

rizosfera (0,428511), histoplano raiz (0,370707). Durante o inverno, ocorre uma

pequena modificação, passando o ordenamento dos maiores índices de diversidade

a figurar da seguinte forma: histoplano-folha (0,684205), histoplano-raiz (0,523276)

e rizosfera (0,502215).

Quanto à riqueza de bactérias diazotróficas (Tabela 19), tanto no inverno

como no verão, apenas no histoplano-folha foi detectada a presença de todos os

grupos de bactérias diazotróficas em uma única colheita.

Quanto à abundância de bactérias diazotróficas (Tabela 20), durante o

inverno a maior densidade de bactérias diazotróficas foi de 103 células por grama de

tecido fresco. Com exceção do filoplano biofilme, tal densidade foi detectada em

todos os sítios estudados. No verão, o sitio a apresentar a maior densidade de

bactérias diazotróficas foi o rizoplano (104 células por grama de tecido fresco).

53


associadas a diferentes sítios do maracujazeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 0,404521 0,222246 0,428511 0,502215 0,283054 0,052313

Rizoplano 0,268065 0,121201 0,283054 0,399626 0,335866 0,082697

Histoplano-Raiz 0,370707 0 0,108261 0,523276 0,10819 0,338436

Filoplano solitário 0,174235 0,393408 Nd Nd nd Nd

Filoplano biofilme nd 0,30103 0 Nd nd Nd

Histoplano-folha 0 0,463539 0 0,684205 nd 0,30103


sítios do maracujazeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c








sítios do maracujazeiro. Inverno Verão

1c 2c 3c 1c 2c 3c

Rizosfera 3,5 x 103 1,2 x 103 7,8 x 102 2,9 x 103 7,0 x 102 7,7 x 103

Rizoplano 1,3 x 103 4,8 x 103 7,0 x102 7,4 x 103 1,1 x 104 4,7 x 103

Histoplano-Raiz 3,8 x 103 2,5 x 102 1,6 x 103 2,4 x 103 4,8 x 103 7,2 x 103

Filoplano solitário 2,9 x 103 5,4 x 102 0 0 0 0

Filoplano biofilme 0 5,0 x 102 9,5 x 102 0 0 0

Histoplano-folha 9,0 x 102 3,7 x 103 2,5 x 102 1,4 x 103 0 5,0 x 102

54

5.2. Isolamento de bactérias diazotróficas Ao final do processo de isolamento e confirmação da capacidade de fixar

biologicamente o nitrogênio, um total de 44 isolados bacterianos diazotróficos foi

obtido após 24 colheitas (Tabelas 21, 22 e 23). A cultura do maracujá foi a

responsável pela maioria dos isolados obtidos, 15, seguido da cultura do abacaxi,

14, mamão, 10 e finalmente goiaba, com 5 isolados. Quanto aos nichos em estudo,

a quase totalidade dos isolados são originários dos sítios intrinsecamente

relacionados às raízes (rizosfera, rizoplano ou interior do tecido da raiz), com

exceção da cultura do abacaxi, de onde foram obtidos 2 isolados endofítico de folha

e 3 endofíticos do pseudocaule. Ainda no caso do abacaxi, 2 isolados foram obtidos

da rizosfera, 1 do rizoplano e 6 do interior do raiz.

Quanto a cultura da goiaba, apenas foram isoladas bactérias da rizosfera, 4

representantes, e do rizoplano, 1.

No caso do mamão, a maioria dos isolados bacterianos forama obtidos da

rizosfera, 5, seguidos pelo rizoplano, 4, e do histoplo-raiz, 1 isolado.

No caso da cultura do maracujá, a maior parte dos isolados formam obtidos

do histoplano-raiz, 7, seguido da rizosfera, 5, e do rizoplano, cada um com 3

isolados.

Quanto a origem dos isolados no que diz respeito aos meios de cultura

utilizados, a maioria absoluta foram JNFb- e JMV- dependentes (sendo obtidos 18 e

14 isolados, respectivamente). Quanto aos demais isolados, foram obtidos 11 NFb -

dependente, e 1 isolado JMVL- dependente (meios JMV original acrescidos de

20mg/l de extrato de levedura, que entraria na composição do meio apenas com um

fator ‘start’ para o isolamento de bactérias dos gênero das Burkholderia (Reis,

comunicação pessoal)).

De uma forma geral, como era de se esperar, os sítios relacionados ao

sistema radicular foram aqueles de onde foram obtidas as maiores quantidade de

isolados bacterianos. Assim, o sítio de onde foi obtido o maior número de isolados

bacterianos foi da rizosfera, 16 isolados; seguido do histoplano – raiz, 14 isolados;

rizoplano, 9 isolados; histoplano - pseudocaule, 3 isolados; e histoplano folha, 2

isolados.

Contudo, como será mostrado abaixo através de vários exemplos, embora os

resultados de contagem pela técnica de NMP tenham revelado à presença de

possíveis bactérias diazotróficas na maioria dos sítios das fruteiras em estudo

55

(crescida na maioria dos sítios) através da detecção de uma película aerotáxica, tal

resultado não se traduziu em isolados bacterianos. No caso do abacaxi isso ocorreu

com as bactérias crescidas em meio LGI-dependentes da rizosfera e JNFb-

dependentes do rizoplano, que embora não tenham nenhum representante entre o

grupo dos 44 isolados, tiveram percentual de detecção de 67 e 100% (nas duas

época do ano) e alcançaram um número de 2,5x102 e 2,5x103 células por grama de

tecido fresco/solo, respectivamente. No caso da goiaba, as bactérias NFb -

dependentes do rizoplano tiveram percentual de detecção de 67% no inverno e

100% no verão e os resultados de contagem mostraram que sua população

alcançou até 4,5X104 células por grama de tecido fresco. Bactérias JMV -

dependentes da rizosfera tiveram 67% de detecção no inverno e 33% no verão e

alcançaram uma população de até 2,6x103 célula por grama de tecido fresco.

Quanto ao mamoeiro, as bactérias LGI-dependente do rizoplano tiveram percentual

de detecção de 100% no inverno e 33% no verão, com uma população alcançando

4,5x103 células por grama de tecido fresco. Outro exemplo é o caso das bactérias

JMV- dependentes do histoplano – folha, que alcançaram uma população de até

2,5x102 células por grama de tecido fresco, com uma freqüência de detecção de

67% no inverno e 100% no verão. No caso do maracujazeiro, bactérias LGI-P –

dependentes do histoplano-folha tiveram freqüência de detecção de 33% em ambas

as estações, com a população alcançando até 2,5x103 células por grama de tecido

fresco. Ou o caso das bactérias LGI-dependentes, detectadas no histoplano raiz

com uma freqüência de detecção de 33% em ambas as estações, alcançando uma

população de até 9,5x102 células por grama de tecido fresco.

Se à primeira vista esses resultados parecem ser um tanto quanto

controverso, é importante observamos que na fase da contagem, os resultados de

detecção que nós consideramos positivos podem de fato representar a presença de

bactérias diazotróficas, contudo, na etapa de isolamento e plaqueamento seguinte,

pode ocorrer uma competição diferenciada entre as diferentes espécies bacterianas

que estavam presentes na fase de contagem, atuando assim eliminando alguma

espécie de bactéria que estava presente no meio semi-sólido. Além disso, na etapa

de plaqueamento, a pO2 é bastante diferente daquela em que as diferentes

comunidades estavam presente. Dessa forma, é possível que nessa etapa de

plaqueamento, estejamos perdendo uma grande diversidade de bactérias

diazotróficas ainda não caracterizadas. Uma outra possibilidade seria o fato desses

56

meios estarem constituídas por bactérias saprófitas, que requerem baixo teor de N

(que seria o N advindo do extrato da planta nas primeiras diluições) ou mesmo

devido a aquisição de plasmídeos

57

Tabela 21. Relação das Bactérias isoladas na Embrapa Agrobiologia oriundas da Fazendinha Agroecológica da Embrapa/UFRRJ/Pesagro (Abacaxi, Mamão, maracujá) e do Sitio Mazomba (goiaba) durante o Inverno de 2005 e Verão de 2005/2006.

Nº de ordem

Código Nº de Ordem



Código

7 UENF 111222 46 UENF 312221 72 UENF 112531 97 UENF 41423215 UENF 117221 47 UENF 312501 73 UENF 114511 98 UENF 41452117 UENF 118101 49 UENF 312522 75 UENF 211531 99 UENF 11111120 UENF 118104 51 UENF 411201 76 UENF 311522 101 UENF 11411129 UENF 118611 52 UENF 411202 77 UENF 311531 102 UENF 11411230 UENF 211231 53 UENF 411203 82 UENF 411524 103 UENF 11711131 UENF 211211 54 UENF 411204 84 UENF 105 UENF 31122332 UENF 211511 55 UENF 411211 88 UENF 311212 106 UENF 31422134 UENF 212211 67 UENF 114121 91 UENF 412221 107 UENF 41411642 UENF 311211 69 UENF 114131 92 UENF 414111 108 UENF 41411745 UENF 312201 70 UENF 114132 96 UENF 414115 109 UENF 414118

AZUL=ABACAXI PRETO=GOIABA VERDE= MAMÃO VERMELHO= MARACUJÁ

58

Tabela 22. Relação dos Isolados e suas respectíveas plantas e sítios de origem,

meio de cultura onde foram isolados e resultado do agrupamento de acordo com o

perfil protéico e do sequenciamento parcial da região 16S do DNAr. Código do Isolado Hospedeiro Meio de

origem Grupo protéica

Grupo de 16S

7 UENF 111222 Abacaxi, rizosfera JNFb 15 UENF 117221 Abacaxi, histoplano-folha JNFb 17 UENF 118101 Abacaxi, pseudocaule JMV 20 UENF 118104 Abacaxi, pseudocaule JMV 29 UENF 118611 Abacaxi, pseudocaule JMVL 30 UENF 211231 Goiaba, rizosfera JNFb 31 UENF 211211 Goiaba, rizosfera JNFb 32 UENF 211511 Goiaba, rizosfera NFb 34 UENF 212211 Goiaba, rizoplano JNFb 42 UENF 311211 Mamão, rizosfera JNFb 45 UENF 312201 Mamão, rizoplano JNFb 46 UENF 312221 Mamão, rizoplano JNFb 47 UENF 312501 Mamão, rizoplano NFb 49 UENF 312522 Mamão, rizoplano NFb 51 UENF 411201 Maracujá, rizosfera JNFb 52 UENF 411202 Maracujá, rizosfera JNFb 53 UENF 411203 Maracujá, rizosfera JNFb 54 UENF 411204 Maracujá, rizoplano JNFb 55 UENF 411211 Maracujá, rizosfera JNFb 67 UENF 114121 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 69 UENF 114131 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 70 UENF 114132 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 72 UENF 112531 Abacaxi, rhizoplano NFb 73 UENF 114511 Abacaxi, histoplano-raiz NFb 75 UENF 211531 Goiaba, rizosfera NFb 76 UENF 311522 Mamão, rizosfera NFb 77 UENF 311531 Mamão, rizosfera NFb 82 UENF 411524 Maracujá, rizosfera NFb 84 UENF 412522 Maracujá, rizoplano NFb 88 UENF 311212 Mamão, rizosfera JNFb 91 UENF 412221 Maracujá, rizoplano JNFb 92 UENF 414111 Maracujá, histoplano-raiz JMV 96 UENF 414115 Maracujá, histoplano-raiz JMV 97 UENF 414232 Maracujá, histoplano-raiz JNFb 98 UENF 414521 Maracujá, histoplano-raiz NFb 99 UENF 111111 Abacaxi, rizosfera JMV 101 UENF 114111 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 102 UENF 114112 Abacaxi, histoplano-raiz JMV 103 UENF 117111 Abacaxi, histoplano-folha JMV 105 UENF 311223 Mamão, rizosfera JNFb 106 UENF 314221 Mamão, histoplano-raiz JNFb 107 UENF 414116 Maracujá, histoplano-raiz JMV 108 UENF 414117 Maracujá, histoplano-raiz JMV 109 UENF 414118 Maracujá, histoplano-raiz JMV

59

Tabela 23. Relação da distribuição numérica dos isolados bacterianos diazotróficos oriundos dos diferentes sítios de isolamento a partir dos diferentes meios de culturas semi-sólidos. Cultura Sítio Meio de cultura Total

JMV JNFb LGI LGI-P NFB JMVL** Abacaxi

Rizosfera 1 1 2. Rizoplano 1 1. Hist. Raiz 5 1 6. Filoplano Agr. Folha Hist. Folha 1 1 2. Hist. P-Caule 2 1 3 SUB TOTAL 9 2 2 1 14

Goiaba

Rizosfera 2 2 4. Rizoplano 1 1. Hist. Raiz Filoplano Agr. Folha Hist. Folha SUB TOTAL 3 2 5

Mamão

Rizosfera 3 2 5. Rizoplano 2 2 4. Hist. Raíz 1 1. Filoplano Agr. Folha Hist. Folha SUB TOTAL 6 4 10

Maracujá

Rizosfera 4 1 5. Rizoplano 2 1 3. Hist. Raiz 5 1 1 7. Filoplano Agr. Folha Hist. folha SUB TOTAL 5 7 3 15

*TOTAL 14 18 0 11 1 44 * a essa relação ainda serão acrescentados entorno de 15 isolados que e estão na fase final de isolamento. ** o meio JMVL semi-sólido foi confeccionado, adicionando-se 10 mg de extrato de levedura por litro de meio de cultura JMV semi-sólido (No caso do meio JMV Sólido, foram adicionados 100 mg de extrato de levedura por litro de meio JMV). O meio JMVL semi-sólido não foi utilizado na fase de colheita, mas apenas nas fases de isolamento.

60

5.3 Agrupamento dos Isolados bacterianos diazotróficos A análise de agrupamento dos 44 isolados bacterianos obtidos a partir das quatro fruteiras em estudo resultou na formação de 7 grupos com diferentes números de representante quando avaliada a um grau de similaridade de aproximadamente 90%. Apenas um isolado não se localizou em nenhum grupo (ISOLADO 55) (ver código dos isolados na tabela 1). No grupo ‘a’ foram se posicionaram dois isolados (7 e 31); O grupo ‘b’ foi formado por seis isolados (51, 75, 76, 77, 105 e 106); O grupo ‘c’ foi formado por 4 isolados (52, 54, 72 e 84); O grupo ‘d’ foi formado também por quatro isolados (30, 73, 82 e 91); No grupo ‘e’ se agruparam 5 isolados (15, 34, 42, 46 e 49); O grupo ‘f’ foi maior de todos com 15 isolados (17, 20, 29, 108, 109, 103, 102, 96, 101, 99, 107, 92, 70, 69 e 67), e o grupo ‘g’ o menor de todos com dois isolados (32 e 53).

Coefficient0.75 0.81 0.88 0.94 1.00

101

7

31

51

75

106

105

77

76

52

72

54

84

30

82

73

91

15

42

34

46

49

17

20

29

108

109

103

102

96

101

99

107

92

70

69

67

32

53

55


colônia de bactérias diazotróficas isoladas a partir da cultura do abacaxi, goiaba,

mamão e maracujá.

a

b

c

d

e

f

g

61

5.4 Isolamento de bactérias não diazotróficas Além das bactérias fixadoras de nitrogênio, conforme apresentado no primeiro

capítulo da presente tese, também foram isoladas bactérias que não são

necessariamente fixadoras de nitrogênio, através do uso dos meios ricos NB e

DYGS. Nesse etapa foram obtidos 237 isolados bacterianos (Tabela 24).

Conforme observado na tabela 24, das bactérias isoladas em meio rico, 40

foram isoladas a partir de abacaxi smoth cayenne em meio NB. Quanto a origem dos

isolados (sítios na planta), 15 dos isolados são epífitos de raiz, 3 isolados são

endófitos de raiz, 10 são epífitos de folha e 8 são endófitos de folha;

Ainda a partir da cultura de abacaxi smooth cayenne, usando o meio de

cultura Dygs, foram obtidos 25 isolados. Quanto à origem dos isolados, 5 isolados

são rizosféricos, 9 isolados são epífitos de raiz, 5 isolados são endófitos de raiz, 4

isolados são epífitos de folha e 2 isolados são endófitos de folha.

Foram obtidos 25 isolados a partir da cultura de abacaxi pérola em meio

DYGS. Dentre esses 25, 6 isolados são rizosférico, 7 isolados são epífitos de raiz, 5

isolados são endófitos de raiz, 2 isolados são epífitos de folha e 5 isolados são

endófitos de folha.

Da cultura de maracujá amarelo, usando o meio de cultura NB, foram obtidos

79 isolados, dos quais 7 isolados são epífitos de raiz, 14 isolados são endófitos de

raiz, 11 isolados são epífitos de caule, 15 isolados são endófito de caule, 20 isolados

são epífito de folha, e 12 isolados são endófitos de folha.

Foram obtidos 65 isolados oriundos de maracujá amarelo usando o meio de

cultura DYGS. Quanto a origem desses isolados, 14 isolados são epifíticos de raiz,

15 isolados são endófitos de raiz, 11 isolados são epífitos de caule, 6 isolados são

endófito de caule, 11 isolados são epifíticos de folha e 8 são endófitos de folha.

62

5.5 Agrupamento dos isolados bacterianos não diazotróficos baseados em características morfológicas da colônia.

A Partir do universo de 237 isolados, foram construídos cinco dendogramas

de similaridade baseado em características morfológicas das colônias (anexo II), um

para cada grupo de bactérias oriundas de cada espécie de fruteira (figuras 6, 7, 8, 9

e 10). Uma característica comum de todos os dendogramas foi o alto índice de

similaridades, tendo em vista que a formação de grupos se deu a 90% de

similaridade.

O primeiro dendograma diz respeito aos 65 isolados oriundos da cultura do

Maracujá amarelo, obtidos a partir de meio de cultura DYGS (Figura 6). Esses

isolados foram agrupados em 8 grupos. Grupo ‘a’ comportou 32 isolados (UENF

412921; UENF 412922; UENF 412929; UENF 414925; UENF 413927; UENF






4139213; UENF 414927; UENF 416923); O grupo ‘b’ comportou somente dois

isolados (UENF 415922; UENF 416921); O grupo ‘c’ comportou 11 isolados (UENF



413922); O grupo ‘d’ foi formado apenas por 3 isolados (UENF 412927; UENF

413928; UENF 4139210); O grupo ‘e’ foi formado também apenas por 2 isolados

(UENF 4139215 e UENF 416926); O grupo ‘f’ foi formado por 3 isolados (UENF

4129212; UENF 417924; UENF 417921); O grupo ‘g’ foi formado por 2 isolados,

todos obtidos a partir do cauliplano (UENF 414929; UENF 4149211) e finalmente o

grupo ‘h’ também foi formado por 2 isolados, sendo todos isolados a partir do

rizoplano (UENF 4129213; UENF 4129214). Sete isolados não foram agrupados

(UENF 414924; UENF 416927; UENF 416928; UENF 415925; UENF 417928; UENF

4169212; UENF 4139214; UENF 414926).

63

Coefficient0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

4129210

412921 412922 412929 414925 413927 4139212 412924 4129210 412928 413929 415923 417922 415926 4169211 413926 417926 417923 415921 416924 4149210 414928 4169210 413925 4139211 417927 414923 412923 417925 412926 4139213 414927 416923 415922 416921 412925 413923 413924 414921 4129211 416929 415924 413921 416925 414922 413922 412927 413928 4139210 414924 416927 416928 4139215 416926 415925 417928 4169212 416922 4129212 417924 417921 4139214 414926 414929 4149211 4129213 4129214

Figura 6. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da colônia de bactérias isoladas em meio DYG`S a partir da cultura do Maracujá.

a

b

c

d

e

f

gh

64

O dendograma para análise do grau de diversidade das 79 bactérias isoladas

a partir da cultura do maracujá amarelo, usando-se meio de cultura rico NB (Figura

7), agrupou tais isolados em 4 grupos. No grupo ‘a’, formado por 56 isolados (UENF



417821; UENF 4168220; UENF 4168218; UENF 4178212; UENF4168213; UENF









414826). O grupo ‘b’ comportou 12 isolados (UENF 412826; UENF 4178213; UENF


4138214; UENF 4148210; UENF 415823; UENF 4168221; UENF 412822). O grupo

‘c’ comportou apenas 3 isolados (UENF 414821; UENF 414825; UENF 414822) e o

grupo ‘d’ comportou 10 isolados (UENF 412823; UENF 413826; UENF 4178211;

UENF 415824; UENF 4158210; UENF 417823; UENF 417824; UENF 416823; UENF

416824; UENF 417825). Dois isolados não se agruparam em nenhum grupo (UENF

415822; UENF 415821).

65

Coefficient0.75 0.81 0.88 0.94 1.00

4138210

412821 412824 412825 412829 413821 417829 417826 417827 413822 4168223 417821 4168220 4168218 4178212 4168213 4168212 4168210 4178210 416827 4168219 416821 4158215 4158213 4168217 415829 415826 415825 416822 4148211 4158212 414828 414827 414824 413824 4138213 4138212 4138211 4138210 413829 413828 413827 416829 418325 412822 4168216 4168222 414823 4168215 416825 4158211 415828 4168214 415827 414829 415814 414826 412826 4178213 413823 417828 4168211 416828 416826 4138214 4148210 415823 4168221 412822 414821 414825 414822 412823 413826 4178211 415824 4158210 417823 417824 416823 416824 417825 415822 415821

a


colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do Maracujá.

d

b

c

66

Na Figura 8 está o dendograma de similaridade dos 25 isolados bacterianos a

partir da cultura do abacaxi pérola em meio DYGS. Tais isolados foram agrupados

em cinco grupos bacterianos. No grupo ‘a’ foram agrupados 5 isolados (UENF

121921; UENF 122924; UENF 121922; UENF 121924; UENF 122921). No grupo ‘b’

foram agrupados também 5 isolados ( UENF 123923; UENF 127922; UENF 127924;

UENF 127925). O grupo ‘c’ foi composto por 7 isolados (UENF 121925; UENF


123934). O Grupo ‘d’ foi formado por 5 isolados (UENF 121923; UENF 126921;

UENF 126922; UENF 127926; UENF 122925). O grupo ‘e’ foi formado por 2 isolados

(UENF 123921; UENF 127921). Dois isolados não se agruparam em nenhum grupo

(UENF 122922; UENF 123926).

Coefficient0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

121921

121921

122924

121922

121924

122921

123923

127922

127924

127925

122922

121925

123925

127923

121926

122923

123922

123924

121923

126921

196922

127926

122925

123926

123921

127921

a

b

c

d

e


colônia de bactérias isoladas em meio DYG´S a partir da cultura do abacaxi Pérola.

67

Os 25 isolados da cultura do abacaxi Smoth cayenne, obtidos em meio de

cultura DYGS, se agruparam em 8 grupos distintos (Fugura 9). No grupo ‘a’ foram

agrupados 3 isolados bacterianos (UENF 111925; UENF 113922; UENF 113925).

No grupo ‘b’ foram agrupados 4 isolados (UENF 112922; UENF 116922; UENF

116923; UENF 116924). O grupo ‘c’ foi composto por 5 isolados (UENF 113921;

UENF 113923; UENF 117921; UENF 116921; UENF 117922). O grupo ‘d’ foi

composto por 4 isolados (UENF 111923; UENF 112927; UENF 112921; UENF

112929). O grupo ‘e’ foi composto por 2 isolados (UENF 111924; UENF 112926). O

grupo ‘f’ também foi composto por 2 isolados (UENF 112923; UENF 112924). O

grupo ‘g’ foi composto por 3 isolados (UENF 112928; UENF 1129210; UENF

1129211). Quatro isolados bacterianos não se agruparam em nenhum grupo (UENF

111921; UENF 111922; UENF 112925; UENF 113924).

68

Coefficient0.80 0.85 0.90 0.95 1.00

1129210

111921

111922

112925

111925

113922

113925

112922

116922

116923

116924

113921

113923

117921

116921

117922

111923

112927

112921

112929

111924

112926

112923

112924

113924

112928

1129210

1129211

a

b

c

d

e

f

g

Tabela 9. Dendograma de similaridade baseado em características morfológicas da

colônia de bactérias isoladas em meio DYG`S a partir da cultura do abacaxi Smoth

cayenne.

69

O dendograma de similaridade dos 40 isolados bacterianos oriundos da

cultura do abacaxi Smoth cayenne, isolados em meio de cultura NB resultou em 7

grupos. No grupo ‘a’ estavam presente 12 isolados (UENF 112821; UENF 113826;

UENF 116824; UENF 117822; UENF 116827; UENF 116826; UENF 113827; UENF

112822; UENF 112823; UENF 112824; UENF 112827; UENF 113824); No grupo ‘b’

foram agrupadas 2 representantes (UENF 113825; UENF 117821); O grupo ‘c’ foi

formados por 4 representantes (UENF 112828; UENF 116823; UENF 117828; UENF

1178212); O grupo ‘d’ foi formado por 3 representantes (UENF 112825; UENF

116821; UENF 116825); O grupo ‘e’ foi formado por 10 isolados (UENF 112826;

UENF117824; UENF 1168210; UENF 116828; UENF 116822; UENF 112829; UENF

113821; UENF 113823; UENF 117823; UENF 113822); O grupo ‘f’ foi composto por

6 isolados (UENF 1128210; UENF 117827; UENF 116829; UENF 117825; UENF

1128211; UENF 1128214); O grupo ‘g’ foi composto por apenas 3 isolados (UENF

1128213; UENF 1128215; UENF 117826).

70

Coefficient0.75 0.81 0.88 0.94 1.00

1128210

112821

113826

116824

117822

116827

116826

113827

112822

112823

112824

112827

113824

113825

117821

112828

116823

117828

1128212

112825

116821

116825

112826

117824

1168210

116828

116822

112829

113821

113823

117823

113822

1128210

117827

116829

117825

1128211

1128214

1128213

1128215

117826

a


colônia de bactérias isoladas em meio NB a partir da cultura do abacaxi Smoth

cayenne.

b

c

d

e

f

g

71

Tabela 24. Número de isolados bacterianos e seus respectivos sítios de origem

obtidos até o momento a partir das diferentes fruteiras a partir de meio ricos (NB e

DYGS)

Espécie vegetal Meio de

cultura

Riz

osfe

ra

Riz

opla

no

End.

Rai

z

Cau

lipla

no

End.

Cau

le

Filo

plan

o

End.

Fol

ha

Rai

z nã

o

dese

nf.

P.A

. Não

dese

n.

End´

. P.A

TOTA

L

Abacaxi smoth cayenne

NB 15 3 10 8 40

DYGS 5 9 5 4 2 25

Abacaxi pérola NB

DYGS 6 7 5 2 5 25

Maracujá Amarelo NB 7 14 11 15 20 15 79

DYGS 14 15 11 6 11 8 65

72

6. Discussão A biogeografia de microrganismos é um tema recente que tem gerado uma

grande discussão (Mantiny et al., 2006). Apesar de toda essa discussão a respeito

de tal tema, uma grande parte da comunidade microbiologista concorda com o fato

de que diferentes condições ambientais, tais como pO2, exposição a UV, umidade,

temperatura e disponibilidade de nutrientes ao longo do corpo vegetal (Halmann et

al., 1997; Andrews e Harris, 2000; Ramey et al., 2004) são apropriados para o

desenvolvimento de uma distribuição microbiana não randômica ao longo do eixo

vegetal. Assim, devido ao fato de que a maioria de trabalhos ecológicos com

bactérias diazotróficas não nodulantes (rizosfera, associativa e endofítica) realizados

até agora, têm esquecido de abordar o parâmetro tempo-espaço, e que as perquisar

a cerca da interação bactéria diazotrófica-planta frutífera estão ainda em sua fase

inicial, o presente trabalho objetivou estudar a distribuição de bactérias diazotróficas

cultiváveis ao longo do eixo vegetativo de fruteiras desse estudo, durante duas

estações, inverno e verão.

6.1. Biogeografia de bactérias diazotróficas através da técnica do número mais provável (NMP): Embora a técnica de NMP tenha revelado a presença de bactérias

diazotróficas em todas as fruteiras, épocas do ano e na maioria dos sítios estudados

(tabela 1, 2, 3 e 4), na maioria dos tratamentos a presença de tais bactérias não foi

detectada em todas as três colheitas de uma mesma estação. Existindo muitos

casos, em que não foram detectadas bactérias em nenhuma das colheitas. Tal fato

ocorreu com grande freqüência no caso da superfície da folha. Assim, se por um

lado os resultados de NMP corroboram até certo ponto com os resultados do

número de bactéria isoladas, uma vez que as maiores populações foram daquelas

JNFb - e NFB - dependente, por outro, os resultados de contagem de bactérias nos

diferentes nichos, como também do crescimento nos demais meios semi-sólidos não

refletem o que foi isolado. Como exemplos que melhor refletem essa contradição

podemos observar a detecção de bactérias diazotróficas nos meios JMV, LGI e LGI-

P originários da maioria das culturas ou dos sítios que não estão representados na

população de isolados até aqui.

De uma forma geral o que se pode observar dos resultados das análises da

contagem das bactérias diazotróficas baseado na técnica de NMP, é a inexistência

73

de um padrão lógicos dos diferentes parâmetros analisados: maiores valores de

densidades de bactérias diazotróficas; freqüência de detecção, índice de

diversidade, a riqueza e a abundância. Ou seja esses índices nos diferentes sítios

variaram em ralação a todos os parâmetros estudados: fruteira, sítio, época do ano e

meio de cultura utilizado. Assim, se por um lado não foi observado um padrão

racional de distribuição microbiana entre os diferentes sítios ao longo do eixo

vegetativo da planta, por outro na maioria das vezes (com exceção da cultura do

abacaxi analisada no inverno) os sítios que resultaram nos maiores valores de NMP

são os sitos relacionados à região da raiz (rizosfera, rizoplano e histoplane – raiz),

fato que embora corrabore com o que a literatura tem publicado a respeito da

distribuição microbiana em geral, por outro, não é o que tem se observado nos

pouco trabalhos que objetivaram estudar o padrão de distribuição das bactérias

diazotróficas em ambas as regiões, abaixo (raiz) e acima do solo (parte aérea) ().

Os resultados da densidade máxima de bactérias diazotróficas (104) aqui

apresentados pela técnica de número mais provável, se mostram um pouco

menores do que os encontrados em estudos para outras culturas

(Muthukumarasamy et al., 2007; Roesch et al., 2006) e até mesmo alguns sítios das

mesmas espécie fruteiras estudadas aqui (Weber et al., 1999). Entretanto, a

principal lição que se pode tirar do presente estudo para a maioria das fruteiras

estudadas, foi a clara divisão da planta quanto ao aspecto ecológico nas regiões

abaixo e acima do solo, como ilustrado por Andrews e Harris, 2000. Entretanto,

apesar de acreditarmos na existência de um grande gradiente de densidade

microbiana entre as duas regiões, que seria governado por bióticos e abióticos

(ambientais), a completa ausência de bactérias diazotróficas nos sítios associados a

parte superior do vegetal nos parece amplamente improvável. Isso porque,

recentemente microbiologistas têm sugerido que bactérias diazotróficas poderiam

possuir uma ‘airborne phase’ (Bashan e Holguin, 1997), que poderiam atuar como

um mecanismo passivo de deposição: ‘win and rain splash in the phyllosphere, and

water flow in the rhizosphere’ (Bashan e Holguin, 1997). Além disso, a comunidade

microbiana geral, poderia vencer diferentes condições inóspitas encontradas até

mesmo na superfície de folha, através do uso de diversas estratégias de ação

(Lindow e Brandl, 2003).

No caso de bactérias diazotróficas em específico, a disposição microbiana

sob a forma de biofilme tem sido sugerido na introdução de apresentação do

74

periódico ‘biofilme’ como um disposição microbiana apropriada para abrigar

bactérias diazotróficas, devido à baixa pressão de pO2 no seu interior (Costerton e

Wilson, 2004). Além disso, de acordo com Ramey et al., 2004, Azospirillum

brasilense, uma bactéria diazotrófica ‘ coloniza a região de elongação da raiz e pelos

radiculares, formando densos biofilme’. Assim, o insucesso na adaptação do

protocolo de Morris na obtenção de biofilmes que poderiam colonizar a rizosfera,

pode ter sido a razão de não termos recuperado bactérias diazotróficas sob essa

forma de organização.

6.2. Isolamento de bactérias diazotróficas Embora o número de isolados bacterianos obtidos no presente estudo não

tenha sido alto e não tenham sido obtidos de todos os sítios estudados, dois fatores

contribuem para conferir um importante papel a esse estudo: o primeiro desses

fatores seria a própria escolha das culturas, onde três das quatro fruteiras em estudo

(goiaba, mamão e maracujá) não tinha sido alvo de nenhum estudo de

bioprospecção de bactérias diazotróficas, embora sejam de importante papel

econômica para a fruticultura brasileira; o segundo desses fatores é o fato de terem

sido isolados um grande número de bactérias endofítica (histoplano-raiz, histoplano-

pseudocaule e histoplano-folha) grupo ecológico bacteriano de grande potencial

biotecnológico, e por muito tempo deixado de fora do objetivo principal da grande

maioria dos estudo tanto ecológico como de bioprospecção.

O sucesso no isolamento de bactérias diazotróficas endofíticas associadas a

abacaxi, mamão e maracujá, nos faz concordar com uma das conclusões finais de

Jimenez-Salgado (Jimenez-Salgado, et al., 1997), que procurando por bactérias

diazotróficas associadas a plantas não-gramíneas (café) concluiu: ‘bactérias

diazotróficas endofíticas são mais prevalent do que se pensava previamente’.

Talvez futuros estudos baseados no uso de uma abordagem polifásica,

através do uso de técnicas dependentes e independentes de cultivo, poderiam

contribuir para refinar os aspectos biogeográficos de estudos semelhantes a esse.

Entretanto, o presente trabalho, onde foi realizado uma refinada procura por

bactérias diazotrófica sob o aspecto tempo-espaço através de técnicas clássicas de

contagem e isolamento, em plantas pouco ou ainda não estudadas, representa um

passo inicial muito importante no entendimento da relação planta – bactéria e a

importância desse grupo de bactéria para as plantas frutíferas estudadas aqui.

75

Apesar disso, futuros estudos de reinoculação desses isolados, inicialmente em

casa de vegetação e posteriormente no campo, certamente representarão uma

etapa crucial não só para desvendarmos a interação entre esses isolados e seu

respectivos hospedeiros, como também no potencial biotecnológico desses isolados.

6.7 Considerações quanto aos resultados de isolamento: Vale lembrar que os resultados quantitativos de isolamento tanto dos

microrganismos diazotróficos como daqueles isolados nos meios ricos, não objetiva

comparar a diversidade entre as diferentes fruteiras, nem tão pouco entre os seus

diferentes compartimentos, uma vez que, conforme o revisado por Amann et al.,

1995, apenas uma pequena fração das espécies de bactéria dos mais diferentes

ambientes é capaz de crescer em meio de cultura. Contudo os resultados

apresentados possuem o objetivo prático e aplicado de relatarmos o quantitativo, e

suas respectivas origens natural, dos isolados purificados e caracterizados que

temos em nossa bacterioteca em construção, que serão fruto de futuros estudos no

âmbito da seleção das bactérias com potencial biotecnológico.

76

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84

Anexos

Anexo I: fotografias das áreas onde se encontram as fruteiras utilizadas no estudo:

Figura 14. Fotografia da entrada da Fazendinha Agroecológica (Embrapa/UFRRJ/Pesagro)

Figura 15. Fotografia da plantação de Mamão onde foi retirada amostras de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas.

Figura 16. Esquema da plantação de Abacaxi onde foram retiradas amostras de plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas

Figura 17. Esquema da plantação da cultura do Maracujá onde foram retiradas plantas para o isolamento de bactérias diazotróficas.

85

Anexo II – Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos

(baseado em Perin 2002)

Tamanho: menor que 1 mm, puntiforme e maior que 1 mm, anotar dimensão

Forma: circular ou irregular

Elevação:

Plana lente convexa

Pulvinada umbonada umbilicada

Bordo:

ondulada lobada denteada filamentosa inteira

Superfície:

lisa rugosa papilada

Figura 18. Padrões para identificação morfológica dos isolados bacterianos

(Perin, 2003).

86

Anexo III: Valores de redução de acetileno produzido pelos isolados bacterianos oriundos das diferentes fruteiras: Tabela 25. Valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo do abacaxizeiro.

Código Ordem Tratamento Repetição ARA (ml)ARA (frasco) Média

UENF 111222 7 10 1 20,12 201,2 7 10 2 22,68 226,8 214 UENF 117221 15 11 1 6,6 66 15 11 2 7,5 75 70,5 UENF 118101 17 13 1 13,09 130,9 17 13 2 13,31 133,1 132 UENF 118104 20 15 1 6,43 64,3 20 15 2 23,62 236,2 150,25 UENF 118611 29 16 1 12,42 124,2 29 16 2 7,69 76,9 100,55 UENF114121 67 18 1 8,98 89,8 67 18 2 8,71 87,1 88,45 UENF 114131 69 20 1 2,23 22,3 69 20 2 6,29 62,9 42,6 UENF 114132 70 21 1 10,33 103,3 70 21 2 11,58 115,8 109,55 UENF 112531 72 26 1 4,05 40,5 72 26 2 4,3 43 41,75 UENF 114511 73 27 1 2,12 21,2 73 27 1 2,12 21,2 21,2 UENF 111111 99 22 1 10,94 109,4 99 22 2 12,34 123,4 116,4 UENF 114111 101 23 1 9,72 97,2 101 23 2 8,95 89,5 93,35 UENF 114112 102 24 1 8,75 87,5 102 24 2 10,47 104,7 96,1 UENF 117111 103 25 1 9,22 92,2 103 25 2 10,07 100,7 96,45 Tabela 26. valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo da goiabeira.

Código Ordem Tratamento RepetiçãoARA (ml)

ARA (frasco) Média

UENF 211231 30 4 1 35,62 356,2 30 4 2 24,72 247,2 301,7 UENF 211211 31 5 1 26,86 268,6 31 5 2 32,44 324,4 296,5 UENF 212211 34 6 1 28,25 282,5 34 6 2 33,31 333,1 307,8 UENF 214301 36 3 1 28,35 283,5 36 3 2 26,29 262,9 273,2

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Tabela 27, valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo do mamoeiro.

Código Ordem Tratamento RepetiçãoARA (ml)

ARA (frasco) Média

UENF 311211 42 2 1 39,9 399 42 2 2 43,24 432,4 415,7 UENF 312201 45 4 1 33,9 339 45 4 2 38,58 385,8 362,4 UENF 312221 46 11 1 8,98 89,8 46 11 2 9,31 93,1 91,45 UENF 312522 49 15 1 6,42 64,2 49 15 2 5,17 51,7 57,95 UENF 311522 76 5 1 4,2 42 76 5 2 5,09 50,9 46,45 UENF 311531 77 6 1 1,65 16,5 77 6 2 1,53 15,3 15,9 UENF 311223 105 13 1 4,2 42 105 13 2 7,59 75,9 58,95 Tabela 28, valores de redução de acetileno produzidos pelos isolados bacterianos oriundo do maracujazeiro.

Código Ordem Tratamento Repetição ARA (ml)ARA (frasco) Média

UENF 411201 51 9 1 9,88 98,8 51 9 2 10,14 101,4 100,1 UENF 411202 52 10 1 18,22 182,2 52 10 2 15,68 156,8 169,5 UENF 411203 53 11 1 3,84 38,4 53 11 2 2,17 21,7 30,05 UENF 411211 55 12 1 11,22 112,2 55 12 2 17,32 173,2 142,7 UENF 412221 91 8 1 18,67 186,7 91 8 2 22,75 227,5 207,1 UENF 414111 92 1 1 5,05 50,5 92 1 2 5,56 55,6 53,05 UENF 414232 97 14 1 2,03 20,3 97 14 2 3,6 36 28,15 UENF 414116 107 2 1 4,6 46 107 2 2 10,62 106,2 76,1 UENF 414117 108 3 1 6,69 66,9 108 3 2 6,93 69,3 68,1 UENF 414118 109 4 1 17,57 175,7 109 4 2 13,13 131,3 153,5

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Anexo IV: composição dos meios de cultura: Solução Salina Para Diluição: K2HPO4 (sol. 10%).....................................................1,0ml MgSO4 (sol. 10%)....................................................0,5ml NaCl (sol. 10%)..........................................................0,2ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..................................................0,5ml FeEDTA (sol. 1,64%)................................................1,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura............0,5ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...6,5 (ajustado com sol. de ácido sulfúrico 5%) Meio JMV: Manitol.....................................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%)................................................6,0ml KH2PO4 (sol. 10%)..............................................18,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%)........................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura......2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...5,0 Agar: 25g/l (para meio sólido) (para meio sólido adicionar 100mg/l de extrato de levedura) 1,6g/l(para meio semi-sólido) Meio JMVL: Manitol.....................................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%)................................................6,0ml KH2PO4 (sol. 10%)..............................................18,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%)........................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura......2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Extrato de levedura.................................................20mg Completar para 1000 ml com água destilada pH...5,0-5,4 Agar: 25g/l (para meio sólido) 1,6g/l(para meio semi-sólido)

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Meio JNFb: Ácido Málico...........................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................6,0ml KH2PO4 (sol. 10%)...............................................18,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%)........................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..4,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura..........2,0ml Vitamina para meio de cultura.................................1,0ml KOH.........................................................................4,5ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...5,8 Agar: 17g/l (para meio sólido) (para meio sólido adicionar 20g de extrato de levedura) 1,7g/l(para meio semi-sólido) Meio LGI: Açúcar cristal..........................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................2,0ml KH2PO4 (sol. 10%).................................................6,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Na2MoO4.2H20 (sol. 0,1%).....................................2,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..5,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...6,0-6,2 Agar: 15g/l (para meio sólido) 1,4g/l(para meio semi-sólido) Meio LGI-P: Açúcar cristal......................................................100,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................2,0ml KH2PO4 (sol. 10%).................................................6,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml FeCl3 (sol. 1%)........................................................1,0ml Na2MoO4.2H20 (sol. 0,1%).....................................2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..5,0ml Completar para 1000 ml com água destilada pH..5,5 (ajustados com ácido acético sol. 10%) Agar: 25g/l (para meio sólido) 1,6g/l(para meio semi-sólido)

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Meio NFb: Ácido Málico...........................................................5,0g K2HPO4 (sol. 10%).................................................5,0ml MgSO4 (sol. 10%).................................................2,0ml NaCl (sol. 10%).......................................................1,0ml CaCl2.2H20 (sol. 1%)..............................................2,0ml FeEDTA (sol. 1,64%)..............................................4,0ml Azul de bromotimol sol. 0,5% em 0,2N de KOH..2,0ml Sol. de Micronutrientes para meio de cultura......2,0ml Vitamina para meio de cultura..............................1,0ml KOH.........................................................................4,5ml Completar para 1000 ml com água destilada pH...6,5 Agar: 15g/l (para meio sólido) 1,6g/l(para meio semi-sólido) Meio Batata: Batata……………………………………….................200g Ácido málico………………………………..................2,5g Açúcar cristal………………………………..................2,5g Solução de Micronutriente para Meio de Cultura...........2,0ml Solução de Vitamina para meio de Cultura....................1ml Sólido: 15g/l de ágar Meio Dygs (Modificado): Glicose………………………………………………….2,0g Ácido málico …………………………………….……..2,0g Peptona bacteriológica…………………………….……1,5g Extrato de Levedura.........................................................2.0g K2HPO4............................................................................0,5g MgSO4.7H2O....................................................................0,5g Ácido glutâmico...............................................................1,5g Completar com água destilada para 1000 ml pH 6,4 Sólido: 15g/l

Fonte: Döbereiner et al., 1995.

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Anexo V. Fotos das colônias de alguns isolados bacterianos diazotrófico (ver código

dos diferentes isolados na tabela 1).

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BIOGEOGRAFIA DE BACTRIAS CULTURVEIS ASSOCIADAS … · biogeografia de bactÉrias culturÁveis associadas À fruteiras tropicais . samuel tavares dos santos . universidade estadual