Biomarcadores e imunoterapia: TMB, assinaturas genômicas, PD-L1, TILs

Ellen Caroline Toledo do Nascimento

Ellen Caroline Toledo do Nascimento, MD, PhD

Patologista do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo

Patologista do Hospital Sírio-Libanês

Remark R, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015;191(4):377-390

Microambiente tumoral:- Células T, células B, células

natural killer (NK), células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e mastócitos

- A maioria na transição do tumor/tecido normal e estruturas linfoides terciárias (TLSs)

- TLSs consideradas a porta de entrada para células imunes do sangue para o tumor

- Processo é altamente regulado por receptores de quimiocinas, interleucinas, integrinas e a moléculas de adesão.

Adv Anat Pathol. 2017; 24(6): 311–335.Germain C, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2014;189:832-844.

Imunovigilância

- Células imunes não estão distribuídas randomicamente no tumor

- Alto grau de organização refletido pela presença de folículos linfoides (“tertiary lymphoidstructures – TLSs”)

- Integrinas, moléculas de adesão e quimiocinas provavelmente exercem um papel no recrutamento de células T do sangue para os TLSs

- TLSs impactam no microambiente imune local (alta densidade de TLSs é associada a elevado número de células T CD8 de memória intratumorais

- Correlação entre alta densidade de TLSs e maior sobrevida dos pacientes suportam a ideia de que estruturas linfoides são importantes resposta imune protetora.

Geng Y, et al. Cell Physiol Biochem. 2015;37:1560-1571

Linfócitos T CD8+1) Nível elevado de linfócitos T CD8+ em blocos

tumorais e estroma tumoral é um fator preditor favorável para OS (p<0,001) e DFS (p<0,001)

2) Nível elevado de linfócitos T CD8+ no estroma tumoral significantemente prediz melhor OS (p=0,006)

Nível elevado de linfócitos T CD8+- Melhor OS em pacientes caucasianos (p<0,001)- Longo período do “follow-up” (p=0,002)- Publicações mais recentes (p=0,001)- Amostras com dimensões maiores (p=0,001)

TILs1) Alta densidade de TILs foi associada a PFS favorável em câncer de pulmão (p<0,001) ao invés de OS (p=0,66)

Linfócitos T CD4+1) Alta infiltração por linfócitos CD4+ no estroma tumoral foi acompanhada de melhor OS comparado ao infiltração dos blocos tumorais

Linfócitos Treg FOXP3+1) Alto nível de Treg FOXP3+ no estroma tumoral está associado a pior desfecho em câncer de pulmão

Geng Y, et al. Cell Physiol Biochem. 2015;37:1560-1571

1) Combinação de TILs com efeitos opostos poderia ser útil para predizer prognóstico:- CD3 e FOXP3- CD8 e FOXP3- CD4 e FOXP3

2) Estratificar os subgrupos de linfócitos T de acordo com a localização da infiltração

3) O efeito prognóstico parece ser superior no estroma tumoral comparado aos blocos tumorais

Geng Y, et al. Cell Physiol Biochem. 2015;37:1560-1571

- Níveis elevados de TILs CD8+ são bom prognóstico em relação a sobrevida global (p=0,013), “disease-specific survival” (p=0,004) e sobrevida livre de doença ou recorrência (p=0,001)

- Níveis elevados de linfócitos T CD3+ tem bom prognóstico em relação a sobrevida global (p=0,009) e “disease-specific survival” (p=0,001)

- Níveis elevados de linfócitos T CD4+ tem bom prognóstico em relação a sobrevida global (p=0,005)

- Altos níveis de Tregs FoxP3+ tem pior prognóstico em relação a sobrevida global e sobrevida livre de recorrência (p=0,042 e p=0,001)

Zeng DQ, et al. Oncotarget. 2016;7(12):13765-81

Desafios

- Método semiquantitativo- Diferentes “cut-offs” são utilizados para definir infiltração “leve” e

“acentuada”- Definição de compartimento (blocos tumorais ou estroma tumoral)- Contagem absoluta (análise digital de imagem ou contagem

manual)- Estudos retrospectivos- Avaliação padronizada dos “TILs”- Inclusão de folículos linfóides

Remark R, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015;191(4):377-390

Signaling pathway

PD-L1 is a type 1 transmembrane

protein (B7-H1) that belongs to

the B7 ligands family

PD1 binding with PD-L1 or PD-L2Activation of inhibitory kinases involved in T-cell proliferation, adhesion, and cytokine production/secretion

PD-1–PD-L interaction has been shown to play an important role in limiting the initial response of T cells upon antigen exposure and inducing Tcell tolerance.

Expressed on dendriticcells, macrophages, mast cells, T-cells andB-lymphocytes andnonhematopoieticcells, includingendothelial, epithelialand tumor cells

PD-L1

PD-L1 immunohistochemistry: challenges

PD-L1 assays:

1) Independently developed

2) Different antibody clones

3) Different immunohistochemistry staining

protocols

4) Scoring algorithms

5) Different cut-offs for determining PD-L1

statusIonescu DN et al. Current Oncology. 2018

In advanced NSCLC:- TPS ⩾1%: around half of

samples evaluated for PD-L1- Differences in PD-L1

expression have been observed in specific phase III clinical trials

- Different antibody clones - Variability across patient

subpopulations

PD-L1 IHQ: challenges

Pre-analytical parameters:

- The time for cold ischemia

- The type and the duration for fixation

- Paraffin section preparation

Analytical decision:

- Choice of antibody clone

- Staining protocol and platform

- Interpretation: different thresholds of

detection PD-L1 expression, biopsy

dimensions and heterogenous expression

Ilie M et al. Virchows Arch. 2016

Guan J et al. Arch Pathol Lab Med. 2017

The level of expression of PD-L1 can vary according to the level of tumour hypoxiaThe time for fixation in formaklehyde can modify the level of expression of PD-L1The different clones of anti-PD-L1 antibodies do not have the same affinity for PD-L1The different clones of anti-PD-L1 antibodies do not recognise the same epitopes on PD-L1The systems for amplification and detection of the signal change the threshold of positivity of the PD-L1 signal

10 a 20% dos paciente com PD-L1 negativo responde a tratamento com anti-PD-L1- Heterogeneidade intratumoral- Baixa associação da expressão de PD-L1 entre biópsias pulmonares e tumores ressecados- Biópsia: adequada e representativa da massa tumoral?- Pequenas biópsias: expressão subestimada ou superestimada?

PD-L1 IHQ: challenges

Shen X, Zhao B. BMJ. 2018

Thunnissen E et al. Lung Cancer. 2017

Ilie M et al. Virchows Arch. 2016

Methods:- 268 casos- 5 “core biopsies” com

diâmetro de 1 mm (TMA)- PD-L1 SP 263 (realizados

nos blocos de TMA e nas secções do tumor “total”)

Alta concordância com a secção “total” do tumor:- Quatro “core biopsy” para o cutoff de 1%- Três “core biopsy” para o cutoff de 50%

104 casos mostraramheterogeneidade na secção“total” e com todas as “core biopsies” presentes: - 93% para o cutoff de 1%- 88% para o cutoff de 50%

Munari E et al. JTO. 2018

IALSC Atlas of PD-L1 immunohistochemistry testing in lung cancer, 2017.

PD-L1: Which clone? Whichthreshold? Which cells?

Ionescu DN et al. CurrentOncology. 2018

IHQ depende:- Epítopo- Concentração do anticorpo primário- Sistema de revelação do sinal (varia entre os diferentes ensaios comerciais)

Thunnissen E et al. LungCancer. 2017

PD-L1: Urothelial Carcinoma

Critérios de inclusão no numerador:- Células tumorais com marcação de membrana completa

ou parcial (≥ 1+) e marcação de membrana ou citoplasmática de linfócitos e macrófagos intratumoraisou imediatamente adjacente ao tumor

- Pelo menos 100 células tumorais viáveis na amostra- Utilizar no máximo o aumento de 200x

PD-L1 IHC 22C3:

PD-L1 IHC SP142:- O escore é definido pela proporção de

área tumoral ocupada por células imunes PD-L1 positivas em qualquer intensidade.

- Pelo menos 50 células tumorais viáveis.

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual – UrothelialCarcinoma (Dako/Agilent)Ventana PD-L1 (SP142) Assay. Interpretation guide for urothelial carcinoma

Indicação: CPS ≥ 10

PD-L1: Gastric or Gastroesophageal Junction(GEJ) Adenocarcinoma and Cervical Cancer

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual – Gastric orGEJ Adenocarcinoma (Dako/Agilent)PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Interpretation Manual – Cervical cancer (Dako/Agilent)

PD-L1: NSCLC

Kerr KM. JTO. 2018

PD-L1: Comparability

studies in NSCLC

Ionescu DN et al. Current Oncology. 2018

Hirsch FR et al. JTO. 2016

Phase 1: viability study39 tumores corados com 4 distintos marcadores: - Dako 28-8 (nivolumab)- Dako 22C3 (pembrolizumab)- Ventana SP263 (durvalumab)- Ventana SP142 (atezolizumab)

Results:- 3 ensaios (Dako 28-8/22C3 e Ventana SP263)

produziram similar níveis de expressão de PDL1 nas células tumorais

- Ventana SP142 corou poucas células tumorais- Expressão em células imunes mostrou grande

variação

Phase 2A: validar os achados da fase 1- 81 tumores NSCLC - Grande painel de patologistas (25 de 15

países)- Incluiu Dako 73-10 (avelumab)- Dako 28-8 (nivolumab)- Dako 22C3 (pembrolizumab)- Ventana SP263 (durvalumab)- Ventana SP142 (atezolizumab)

Results:- 3 ensaios (Dako 28-8/22C3 e Ventana SP263) produziram similar níveis de expressão de PDL1 nas células tumorais- Ventana SP142 corou poucas células tumorais- 73-10 corou levemente maior porcentagem de células tumorais- Amostra citológica mostrou boa concordância (TC), porém inferior a comparação de amostras de tecido

Tsao MS et al. J Thorac Oncol. 2018;13(9):1302-1311

Phase 2B: Objectives: - Comparar a expressão de PDL1 em espécimes grandes versus pequenas biópsias e citologias do mesmo tumor.Methods: - 31 tumores de pulmão ressecados: 17 adenocarcinomas, 12 carcinomas de células escamosas e 2 carcinomas de grandes células

Results:- Reafirmam os resultados anteriores- 28-8, 22C3 e SP263 são comparáveis- SP142 apresentou menor escore de células tumorais- 73-10 apresentou maior escore- A concordância entre diferentes amostras do mesmo tumor foi adequada (K-F score > 0.7)- Aspirados não mostraram diferença significativa da biópsia ou do material de ressecção

WCLC 2018. Toronto. wclc2018.ialsc.org

Study Samples Monoclonal Ab Platforms Readers Results

22C3 PD-L1 harmonization studyIli et al.

120 22C3 Dako, Ventana, Leica 3 LDT protocols onDako and Ventana platforms showed analmost 100% concordance

22C3 PD-L1harmonization studyon Ventana’s platformNeuman et al.

41 22C3 Dako, Ventana 2 Ventana’s 22C3 protocols obtainedsimiliar results thanthose using the Dako 22C3 stainingplatform

French harmonizationstudyAdam et al.

41 22C3, 28-8, SP12, SP263, E1L3N

Dako, Ventana, Leica 7 centers 22C3, 28-8 and SP263 assays gave highlyconcordant TC resultsfor ≥ 50% threshold

22C3 PD-L1 harmonization studyRege et al.

77 22C3 Dako, Ventana, Leica 3 LDT protocols providean almost identicalresult to the 22C3 pharmDx kit

Comparison and standardization of different PD-L1 IHC platforms

Ilie M et al. PLoS One. 2017;12:e0183023.Neuman et al. J Thorac Oncol. 2016;11:1863-1868.

Adam J et al. J Thorac Oncol. 2017;12:S11-S12.Roge R et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2017;25:381-385.

Gandhi L et al. N Engl J Med. 2018;378:2078-2092

Conclusion:patients with metastatic nonsquamous NSCLC without

sensitizing EGFR or ALKmutations, the addition of

pembrolizumab to induction therapy with pemetrexed and

a platinum-based drug and to pemetrexed maintenance

therapy

1) significantly longer overall survival

2) significantly progression-free survival

3) higher response rate

4) the survival benefit for pembrolizumab-combination

therapy was observed across all categories of PD-L1

expression.

Patients with previously untreated

metastatic nonsquamous NSCLC without EGFR or ALK mutations

Conclusion:The addition of pembrolizumab to standard chemotherapy1) significantly longer overall survival

2) significantly progression-free survival

3) higher response rate

4) a longer duration of response

5) regardless of the level of PD-L1 expression

Patients with previously

untreated metastatic squamous NSCLC

Paz-Ares L et al. N Engl J Med. 2018;379:2040-2051

Biomarkers: perspectives

- Mismatch repair deficiency and microsatellite instability1) Mismatch repair deficiency (dMMR) leads to the accumulation of

mutation as well as production of potential neoantigen2) Enhanced treatment effect resulting from MSI-H/dMMR is

attributed to increased density of TIL, elevated TMB, upregulated PD-L1 expression, and more potent tumor-specific immune response

Le DT et al. Science. 2017;357:409-413.Yi M et al. Mol Cancer. 2018;17:129.

- Tumor mutation burden1) Accumulated mutations with increased potentiality of neoantigen

results in elevated immunogenicity2) Clonal mutations (shared by all tumor cells) and subclonal mutations

(expressing on a fraction of tumor cells) affect tumor specific immunity differently

3) Single-site biopsy might overestimate level of clonal mutation due to the interference from subclonal mutation which might explain the poor response of some patients with high TMB

Biomarkers: perspectives

McGranahan N et al. Science. 2016;351:1463-1469.Goodman AM et al. Mol Cancer Ther. 2017;16:2598-2608.Yi M et al. Mol Cancer. 2018;17:129.

Neoantígenos:- Antígenos recentemente formados que

ainda não foram reconhecidos pelosistema imune

- Podem surgir a partir de mutações do tumor

- Serão reconhecidos como estranhos e podem levar à resposta imune

- Tumores com maior carga mutacional(High tumor mutation burden (TMB) e/ou instabilidade de microsatelite ou dMMR- maior produção de neoantígenos

- Maior carga de neoantígenosapresentariam melhor resposta à imunoterapia

TMB- tumor mutation BurdenNEOANTÍGENOS / CARGA MUTACIONAL

*imagem da internet

Como calcular o TMB?

• Ausência de consenso estabelecido

• Variável continua• Qual o corte?

• Dependente do tipo de tumor?

• Quais alterações considerar no cálculo?• Somáticas? Não sinônimas + indels + sinônimas?

• Qual tamanho do exoma tem que sersequenciado? • WES – TAT, R$, tamanho do tecido

• Paineis menores• Entre 1.5-3Mbp pode dar informação adequada

Teste commercial* (F1CDX)

• TMB alto >=20mut/mb• TMB intermediário 6-19 mut/mb• TBM baixo <6 mut/mb

Avaliação de TMB: desafios

Barreiras nas fases pré e pós analítica:- Tamanho da amostra- Qualidade- Rendimento do DNA- Custo com o teste- Plataformas diferentes- Diferentes “pipelines” de bioinformática- Definição de cut-off não padronizada- Padronização do TMB: confiabilidade, reprodutibilidade e utilidade clínica- Tamanho do painel: crucial para acurácia (menor tamanho – maior incerteza na

estimativa do TMB)- Padronização do escore- Interpretação

Galuppini F, et al. Cancer Cell Int. 2019;19:209.

- Gut microbiota1) The alteration of microbiota composition might change the tumor immune microenvironment by

the homing and recirculation of lymphocytes2) analyzing gut microbiota composition would be favorable to predict treatment effect of anti-PD-

1/PD-L1 therapy3) Though the exact modulatory mechanism is unclear, many factors are proposed to enhanced

tumor control

Sivan A et al. observed that fecal microbiome transplantation could d restore the sensitivity to anti-PD-L1 treatment and improve anti-tumor activity in non-responding mice.

Gopalakrishnan V et al. noticed the relationship between high abundance of Faecalibacterium genus and elevated response rate in patients receiving anti-PD-1 treatment.

Dysbacteriosis caused by utilization of antibiotics was proved to influence the efficacy of anti-PD-1/PD-L1 therapy. And the poor response to agents could be reversed by recolonization of Akkermansia muciniphila(Routy B et al, 2018).

Biomarkers: perspectives

Sivan A et al. Science. 2015;350:1084-1089.Gopalakrishnan V et al. Science. 2018;359:97-103.Routy B et al. Science. 2018;359:91-97.Yi M et al. Mol Cancer. 2018;17:129.

- Combining PD-L1 immunohistochemistry with T cell activation measuresmight boost the ability to predict patient response to checkpoint inhibitors

- Multiplex gene expression (NanoString Technologies)

Ionescu DN et al. Current Oncology. 2018

However, whether these newer paradigms will be superior to currently available immunohistochemistry assays is unclear.

Biomarkers: perspectives

Mechanisms of main biomarkerspredicting efficacy of PD-1/PD-L1 inhibitors1) PD-L1 status reflects adaptive

immune resistance which istherapeutic target of PD-1/PD-L1 inhibitors

2) dMMR and MSI-H correlates strongly with high TMB. TMB enhances theimmunogenicity

3) tumor infiltrating lymphocyte(TIL) represents potentialimmune surveillance whichcould be reactivated by agentes. Specific gutmicrobiota promotesdifferentiation of T cell, as well as lymphocyte homingand recirculation

Biomarkers

Yi M et al. Mol Cancer. 2018;17:129.

Kerr KM. JTO. 2018

Despite these reservations, PD-L1 IHC still has the ability to enrich for benefit, and it is currently the only approved and widely applied biomarker in NSCLC for the immunotherapy.

PD-L1 expression on TCs or ICs is heterogeneous, meaning that sampling error during tissue acquisition may be a significant factor that is more likely to lead to underestimation rather

than overestimation of PD-L1 expression.

PD-L1 IHC is not a perfect biomarker. Although PD-L1 is effectively the target of the drugs in question, PD1–PD-L1 interaction is only one of many factors that may determine the eventual

outcome of a potential tumor-directed immune response.

ellen.ctnascimento@hsl.org.br

HC - Central Institute

Heart Institute - InCor

Cancer Institute - ICESP