Biomarcadores moleculares em câncer- implicações para a pesquisa epidemiológica e a saúde pública-2001

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Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 17(3):467-480, mai-jun, 2001

REVISÃO REVIEW

Biomarcadores moleculares em câncer:implicações para a pesquisa epidemiológica e a saúde pública

Molecular biomarkers in cancer: implications for epidemiological research and public health

1 Departamento deEpidemiologia, Faculdade de Saúde Pública,Universidade de São Paulo.Av. Dr. Arnaldo 715,São Paulo, SP 01246-904, [email protected] Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina Social e do Trabalho,Faculdade de Medicina,Universidade de São Paulo.Rua Teodoro Sampaio 115,São Paulo, SP 05405-000, [email protected]

Victor Wünsch Filho 1

Gilka J. Figaro Gattás 2

Abstract Identification of molecular biomarkers is a common result of current cancer epidemi-ological research. Both genetic and molecular epidemiology have enjoyed impressive develop-ments in recent decades, with important repercussions on traditional epidemiological approach-es. In this paper we evaluate the new frontiers of cancer epidemiology, incorporating both genet-ic and molecular biology approaches. We examine the current knowledge of molecular biomark-ers for exposure and susceptibility to cancer, the role of gene mutations in carcinogenesis, andtheir application to epidemiological studies. By exploring the status of relevant biomarkers,these approaches become effective in evaluating exposure and susceptibility and show enormouspotential for elucidating mechanisms of carcinogenesis and the effect of risk factors in cancer.However, these approaches are necessarily more invasive and raise several ethical issues for con-sideration by both researchers in public health and society as a whole.Key words Cancer; Genetics; Molecular Biology; Molecular Epidemiology; Epidemiologic Methods

Resumo O desenvolvimento das áreas de genética e biologia molecular tem sido admirável nasúltimas décadas e isso tem repercutido intensamente na epidemiologia. Neste artigo, discute-sea ampliação das fronteiras da pesquisa epidemiológica em câncer com a incorporação das técni-cas da genética e da biologia molecular. Examina-se o conhecimento atual dos biomarcadores deexposição e de suscetibilidade, o papel das mutações genéticas na carcinogênese, a aplicaçãodestas nos estudos epidemiológicos e implicações para a prevenção. Perscrutando o meio internodos indivíduos, a epidemiologia molecular e a genética representam um avanço tanto para aavaliação da exposição, quanto para a detecção de indivíduos suscetíveis, e possuem imenso po-tencial para ampliar a compreensão dos mecanismos da carcinogênese e dos efeitos de fatores derisco no câncer. Entretanto, por serem necessariamente mais invasivas, essas abordagens reme-tem a importantes questões no campo da ética. A comunidade científica de saúde pública e a so-ciedade devem guardar vigilância sobre os usos e aplicações deste novo conhecimento, avalian-do seus desdobramentos à luz da bioética.Palavras-chave Câncer; Genética; Biologia Molecular; Epidemiologia Molecular; Métodos Epi-demiológicos

José Antonio

Typewriter

WUNSCH FILHO, Victor and GATTAS, Gilka J Figaro.. Biomarcadores moleculares em câncer: implicações para a pesquisa epidemiológica e a saúde pública. Cad. Saúde Pública [online]. 2001, vol.17, n.3, pp. 467-480. ISSN 0102-311X.

WÜNSCH FILHO, V. & GATTÁS, G. J. F.468


Introdução

O objetivo da epidemiologia é identificar po-pulações sob risco de desenvolver doenças epropor ações de prevenção e controle. O pro-cesso de investigação epidemiológica requer adefinição de medidas quantitativas de exposi-ção, bem como da doença estudada e o uso dealgum método de associação dessas variáveis.Para a caracterização de populações com maiorrisco de câncer, a epidemiologia deve operarduas estratégias: obter evidências de exposiçãoa agentes cancerígenos na população e detec-tar indivíduos com maior suscetibilidade quan-do expostos a esses agentes, seja por fatoresherdados ou adquiridos. A compreensão daetiologia dos tumores malignos, ainda desco-nhecida apesar dos avanços realizados na pes-quisa em câncer nas últimas décadas, prova-velmente terá como base o melhor conheci-mento das interações entre as diversas exposi-ções ambientais e os fatores genéticos ligadosà suscetibilidade individual (Vineis, 1998).

O câncer é considerado uma doença genéti-ca que ocorre por um acúmulo de mutações nãoesperadas por recombinação mendeliana, emvirtude, principalmente, de exposição a agentesgenotóxicos do meio ambiente (Vogelstein &Kinzler, 1998). Virtualmente, todos os tumorestêm anormalidades gênicas ou cromossômi-cas. A célula cancerosa passa para sua progêniemensagens sobre o comportamento celular ma-ligno e é este fato que caracteriza o câncer comouma doença letal (Mulvihill & Tulinius, 1987).

O enorme progresso realizado na área dabiologia molecular nas décadas recentes mate-rializa-se atualmente no Projeto do GenomaHumano, uma proposta cooperativa entre cen-tros de pesquisas da América do Norte, Europae Japão, cujo objetivo é determinar a seqüênciacompleta do DNA do genoma humano (Ells-worth et al., 1997). Em dezembro de 1999, foianunciado a primeira seqüência completa deum cromossomo humano – o cromossomo 22(Dunham et al., 1999). Em São Paulo, a Funda-ção de Amparo à Pesquisa no Estado de SãoPaulo (FAPESP), juntamente com o InstitutoLudwig de Pesquisa sobre Câncer, está desen-volvendo o Projeto Genoma Humano do Cân-cer, com a intenção de gerar seqüências de ge-nes humanos envolvidas nesse processo, tendocomo base a análise do RNA de certos tumores,e, assim, contribuir com o esforço mundial pa-ra a determinação da estrutura completa dogenoma humano (Simpson, 1999). Esses avan-ços têm profundas implicações na pesquisaepidemiológica e deverão acentuar-se no de-correr do século XXI.

Grande parte do conhecimento acumuladono século XX sobre a etiologia das doenças nãotransmissíveis e sua prevenção pode ser credi-tada ao aprimoramento dos estudos epidemio-lógicos para avaliar a exposição de grupos po-pulacionais a fatores de risco ambientais. O de-senvolvimento de modelos estatísticos aplica-dos à epidemiologia foi essencial nesse proces-so, entretanto, gradativamente, a abordagemda epidemiologia dos fatores de risco (Silva,1990) atinge seus limites, mais diretamente li-gados à causalidade do que propriamente àformulação de hipóteses etiológicas. Após aidentificação de fatores ambientais com riscosrelativos expressivos, os epidemiologistas en-frentam o impasse de riscos relativos tênues ede difícil interpretação (Wynder, 1990). A pri-meira reação para vencer tal obstáculo foiaprofundar os procedimentos de análise, atra-vés de refinadas técnicas estatísticas computa-dorizadas, mas que, em geral, produzem ga-nhos de apenas poucos décimos no risco rela-tivo (Kuller, 1999). Recentemente, os conceitosda biologia e da genética molecular, assim co-mo novas técnicas laboratoriais, vêm-se inte-grando aos métodos epidemiológicos (Ells-worth et al., 1997). Apesar das dificuldades ine-rentes à reaproximação de áreas há muito dis-tantes e com trajetórias independentes, estemovimento capitaliza as vantagens de integrarperspectivas e experiências específicas, o quepoderá ampliar substancialmente a compreen-são dos determinantes epidemiológicos res-ponsáveis pela variação da distribuição dedoenças nos indivíduos e nas populações.

A proposta deste trabalho é examinar comoo conhecimento da biologia molecular tem si-do aplicado nos estudos epidemiológicos, iden-tificar os principais biomarcadores investiga-dos na sua relação com câncer, analisar as difi-culdades da integração dessas disciplinas, par-ticularmente do ponto de vista dos epidemio-logistas, e analisar os desdobramentos éticosque advirão com a expansão do conhecimentoda doença no plano molecular.

Mecanismos da carcinogênese

As neoplasias caracterizam-se por longos pe-ríodos de latência, às vezes tão longos quantocinco ou seis décadas. Experimentos com ani-mais conduziram a um modelo que propõe adivisão da latência em, pelo menos, dois está-gios: iniciação, no qual o agente cancerígenoinduz mutações e altera a velocidade da divi-são celular, e promoção, estágio sucessivo emque o processo evolui até constituir-se num tu-


mor observável. Neste processo, a célula se mo-difica e, tornando-se cancerosa, expande-secom desenvolvimento anômalo formando umacolônia de descendentes denominada clone(Squire et al., 1998).

Evidências epidemiológicas e genéticas su-gerem um processo de multiestágios na carci-nogênese (Pitot, 1996). Os modelos epidemio-lógicos procuram associar o tipo de carcinóge-no e sua ação em diferentes estágios da carci-nogênese com fatores individuais, como a ida-de e a dose e duração da exposição (Day &Brown, 1980; Vainio et al., 1992). Os canceríge-nos seriam, assim, classificados como agentesque podem afetar estágios precoces ou tardiosda carcinogênese. Um carcinógeno atuandoem fases precoces da carcinogênese produzefeito retardado, em relação tanto ao aumentoda incidência de câncer, seja no início ou mes-mo no decorrer da exposição, como à diminui-ção desta incidência após a exposição ter ces-sado. De forma análoga, quando um estágiotardio da proliferação celular é modificado pe-la ação de determinado carcinógeno, as respos-tas, tanto ao início, quanto à cessação da expo-sição, são mais rápidas (Pitot, 1996). Na práti-ca, entretanto, a dificuldade em mensurar a ex-posição e determinar a dose do carcinógenoque atinge o tecido alvo pode dificultar tais in-terpretações (Vainio et al., 1992).

Genética e câncer

Incorporando conhecimentos da biologia mo-lecular e da genética, a epidemiologia mantémseus objetivos originais, porém adquire forçapara obter uma melhor compreensão da etio-logia e da patogênese de doenças, subsidiando,assim, mais efetivamente, o planejamento deestratégias de prevenção (Ellsworth et al., 1997;Khoury, 1998). No final dos anos 70, a epide-miologia genética emergiu como disciplina for-mal (Khoury, 1998). Nos anos 80, outro campodelineou-se na epidemiologia – a epidemiolo-gia molecular (Schulte & Perera, 1993).

A concentração familial de casos de câncertem sido descrita como fator de risco para cân-cer (Browson et al., 1997; Hemminki & Vaitti-nen, 1998; Tokuhata & Lilienfeld, 1963; WünschFilho et al., 1995). Esse risco, sugere-se, pode-ria ser decorrente de mutações herdadas emgenes promotores ou supressores de câncer,associadas ou não à capacidade individual demetabolizar substâncias potencialmente carci-nogênicas. Polimorfismos de enzimas metabo-lizadoras de substâncias carcinogênicas sãogeneticamente determinados e é provável que

BIOMARCADORES MOLECULARES EM CÂNCER 469

sejam os mecanismos explicativos da variabili-dade interindividual de suscetibilidade à expo-sição a agentes cancerígenos (Harris, 1987).

Pelo método de análise de segregação, foiobservado um padrão de herança co-dominan-te em famílias com câncer de pulmão, com ostumores tendendo a desenvolverem-se em umaidade mais precoce nos membros de famíliascom indivíduos afetados pela doença (Sellerset al., 1990). Gauderman & Morrison (2000),pesquisando indivíduos que morreram de cân-cer de pulmão e os parentes destes de primei-ro-grau, confirmaram esse fato. Os autores es-timaram que a proporção de pessoas com cân-cer de pulmão portadoras de um locus autos-sômico dominante excede a 90% para indiví-duos com idade abaixo de sessenta anos. Aproporção diminui para aproximadamente10% dos casos cujo início da doença se deu aosoitenta ou mais anos de idade. Essas observa-ções dão suporte à hipótese da presença de umlocus genético de suscetibilidade para o câncerde pulmão.

A identificação molecular de mutações epolimorfismos genéticos traduz-se para a saú-de pública como possibilidade de caracteriza-ção da suscetibilidade individual ao câncer,podendo no futuro conduzir a novas perspecti-vas para a prevenção e o diagnóstico precoce,bem como para o aconselhamento genético e odesenvolvimento de terapêutica gênica. Doponto de vista da pesquisa, representa obterestimativas mais abrangentes dos riscos, em-bora não signifique a geração de novas hipóte-ses etiológicas para o câncer (McMichael, 1994).

Métodos da epidemiologia genética e molecular

Os métodos da epidemiologia genética alicer-çam-se, de um lado, nos modelos clássicos dapesquisa genética, com base em associaçõesentre incidência da doença em diferentes gru-pos étnicos, concordância do evento entre gê-meos monozigóticos quando comparados a di-zigóticos, verificação da incidência da doençanos demais membros da família e associaçãoda doença com sintomas observados em sín-dromes diversas (Wyszynski, 1998). Por outrolado, fundamentam-se nos desenhos epide-miológicos, como estudos transversais, caso-controle e coortes. Khoury (1998) confere par-ticular atenção à utilidade dos estudos caso-controle na pesquisa em epidemiologia genéti-ca. Abordagens epidemiológicas não tradicio-nais têm sido incorporadas crescentemente napesquisa genética, a exemplo dos estudos res-



tritos a casos, cujos controles são definidosdentro do grupo de casos (Yang et al., 1999), edos estudos de casos utilizando parentes comocontroles (Flanders & Khoury, 1996).

Técnicas de epidemiologia molecular indu-zem adaptações nos desenhos epidemiológi-cos para ajustá-los à logística de coleta de ma-terial biológico. Têm sido propostos os estudosde transição, para estabelecer a ligação entreos experimentos laboratoriais e a epidemio-logia de base populacional, caracterizar a va-riabilidade intra e interindividual dos biomar-cadores, avaliar a viabilidade do uso de deter-minado marcador nas condições de pesquisade campo e otimizar o uso de biomarcadores(Schulte & Perera, 1993, 1997).

Biomarcadores moleculares

Qualquer tentativa de sistematizar uma classi-ficação dos biomarcadores moleculares seráinevitavelmente simplificada e estará sempredistante de apreender o verdadeiro papel quecada alteração molecular exerce na carcinogê-nese. Os biomarcadores têm sido categoriza-dos em três tipos principais: de exposição, desuscetibilidade e de resposta. Os biomarcado-res de exposição correspondem à expressão deum agente ambiental ou de seus metabólitosno meio interno dos indivíduos. Os de susceti-bilidade indicam indivíduos mais ou menospropensos a desenvolver câncer quando ex-postos a substâncias cancerígenas. Os biomar-cadores de efeito ou de resposta indicam alte-rações presentes em tumores; são tardios e per-mitem avaliar o prognóstico da doença. Na Fi-gura 1, formula-se a apresentação sucinta des-ses biomarcadores.

Biomarcadores de exposição

A compreensão dos mecanismos da carcinogê-nese depende, pelo menos em parte, da análiselaboratorial dos efeitos de um agente particu-lar na molécula de DNA e nas células. Por ou-tro lado, avaliar a contribuição de um agenteisolado em estágios particulares da carcinogê-nese pode ser difícil, pois interações podemocorrer entre substâncias químicas e outros fa-tores, tais como vírus, radiação e, possivelmen-te, componentes endógenos. Portanto, o co-nhecimento dos mecanismos de carcinogêne-se será sempre, hipoteticamente, incompleto(Vainio et al., 1992).

O mecanismo pelo qual agentes químicos eseus metabólitos cancerígenos causam muta-ções genéticas tem sido intensamente investi-

gado nas duas últimas décadas. O vínculo en-tre químicos e a molécula de DNA se dá pelaformação de ligações covalentes denominadasadutos (Toniolo et al., 1997). Grande númerode adutos foram identificados, incluindo osformados pelos hidrocarbonetos policíclicosaromáticos (HPA), as aminas aromáticas e oscompostos nitrosos. Os adutos HPA-DNA têmsido os mais estudados e, juntamente com osanticorpos desses adutos encontrados no sorohumano, constituem-se em úteis marcadoresda dose biologicamente efetiva da exposição aesta substância nos locais de trabalho, a exem-plo de siderúrgicas, em ambientes poluídos decidades ou no tabagismo (Perera et al., 1988,1992; Philips et al., 1988).

A razão de mensurar adutos carcinógeno-DNA para avaliar exposição é baseada na supo-sição de que a formação de adutos possa serresponsável por mutações em genes críticospara a carcinogênese, se o reparo do DNA nãoocorrer antes da divisão celular. Esse raciocí-nio depende de um modelo causal que envolvaos adutos, as mutações e a indução de tumor(Wild & Pisani, 1997). Mutações em genes en-volvidos no processo da carcinogênese obser-vadas em tumores de animais geralmente sãoconsistentes com o tipo esperado de aduto noDNA decorrente da exposição a um químicoespecífico (Greenblatt et al., 1994). Contudo,em geral, o nível de adutos no DNA reflete a ex-posição passada recente e não a mais remota(Montesano, 1990), fato que representa umobstáculo para a compreensão dos mecanis-mos da carcinogênese química, mas, por hipó-tese, indivíduos expostos cronicamente têmmaior probabilidade de falhas nos mecanis-mos de reparo do DNA. Todavia, não há, ainda,evidências experimentais da seqüência: forma-ção de adutos, mutação e ocorrência de tumor(McMichael, 1994).

Os adutos carcinógeno-DNA podem ser eli-minados por sua instabilidade química e pelaação de enzimas responsáveis nos processosde reparo do DNA (Skipper & Tannenbaum,1990). A variabilidade interindividual da susce-tibilidade humana aos cancerígenos dependenão apenas do estado nutricional e de saúdedo hospedeiro, incluindo doenças pré-existen-tes, mas fundamentalmente da capacidade dereparo do DNA. Esse mecanismo tem intrínse-ca relação, também, com a competência gené-tica individual de síntese de enzimas ativado-ras ou de detoxificação de substâncias cancerí-genas (Vainio et al., 1992).

A identificação a priori do risco aumentadopara o desenvolvimento de câncer pode ser fei-ta, ainda, mediante testes de mutagenicidade,



que visam avaliar a incidência de mutaçõescromossômicas em populações expostas, com-paradas a grupos-controle. Entre os testes comaplicação no homem, destacam-se a análise ci-togenética de linfócitos periféricos e a pes-quisa de micronúcleos em linfócitos ou emepitélios de descamação (Carrano & Natarajan,1988; Fenech et al., 1999). As mutações ouaberrações cromossômicas envolvem modifi-cações na estrutura e no número de cromosso-mos, que podem ser identificadas ao micros-cópio ótico. Esse teste é considerado um indi-cador de genotoxicidade extremamente sensí-vel (Hagmar et al., 1994). Pesquisas epidemio-lógicas recentes confirmaram uma maior inci-

dência de câncer em indivíduos que apresen-tavam, cerca de 15 anos antes do aparecimentoda doença, aumento na freqüência de aberra-ções cromossômicas em linfócitos, indicandohaver efeito mutagênico semelhante no tecidoalvo (Hagmar et al., 1998). Todavia, os autoresnão conseguiram estabelecer a contribuiçãoefetiva de diferentes hábitos de vida e da ocu-pação no aumento da freqüência de aberra-ções cromossômicas e do conseqüente apare-cimento de câncer.

Exposições ocupacionais, ingestão de ál-cool, tabagismo e dieta parecem influir na inci-dência de aberrações cromossômicas (Baraleet al., 1998; Gonsebatt et al., 1997; Hagmar et

Exposições:• Hábitos de vida

TabacoÁlcoolDieta

• Ocupacionais• Ambientais• Iniqüidades• Etc.

Métodos da epidemiologia tradicional

Biomarcadores de resposta

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Figura 1

Abordagens da epidemiologia na pesquisa em câncer.

Biomarcadores de suscetibilidade

Biomarcadores moleculares

Adutos no DNAMutações cromossômicas

Oncogenes e genes supressores de tumores

Enzimas de metabolizaçãode xenobióticos

Biomarcadores de exposição

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Câncer

Métodos da epidemiologia tradicional

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+



al., 1994). O consumo crônico de bebidas al-coólicas tem sido relacionado a diferentes ti-pos de câncer (Jensen et al., 1996) e com o au-mento, estatisticamente significante, na fre-qüência de linfócitos com aberrações cromos-sômicas numéricas e estruturais (Obe & Ander-son, 1987). Isso ocorre mesmo após longos pe-ríodos de abstinência sugerindo uma ação doálcool na capacidade de reparo celular e nasfunções oxidativas da célula (Gattás & Salda-nha, 1997; Matsushima, 1987).

Os efeitos mutagênicos resultantes do usode tabaco apresentam resultados contraditó-rios. Embora alguns autores tenham observadoaumento na freqüência de aberrações cromos-sômicas estruturais em fumantes, resultadosnegativos também foram documentados (Au etal., 1998; Perera et al., 1987; Reuterwall, 1990).A técnica de citogenética com hibridização insitu por fluorescência, FISH (Fluorescence In Si-tu Hybridization), vem se mostrando útil nadetecção de aberrações cromossômicas queocorrem em baixa freqüência. Por meio dessatécnica de citogenética molecular observou-seaumento significativo na freqüência de trans-locações cromossômicas em fumantes (Confor-ti-Froes et al., 1998; Van Diemen et al., 1995).

Outro teste que também avalia alteraçõescitogenéticas é o teste do micronúcleo (MN).Rápido e econômico, vem sendo aplicado paraa avaliação de populações humanas expostas aagentes mutagênicos e carcinogênicos (Heddleet al., 1991). Os MN são identificados na inter-fase de células em divisão e se apresentam naforma de pequenos corpúsculos citoplasmáti-cos. Correspondem a fragmentos acêntricos re-sultantes de deleções cromossômicas ou cro-mossomos inteiros que se atrasam durante aanáfase da divisão celular. O exame de MN emcélulas epiteliais, primeiramente descrito porStich & Rosin (1984), permite a observação di-reta do tecido alvo, por exemplo da boca, e re-laciona-se à exposição ao álcool, tabagismo eaditivos alimentares, entre outros (Fenech etal., 1999; Ramirez et al., 1999).

Biomarcadores de suscetibilidade

Para dado nível de exposição a um carcinóge-no, somente parte dos indivíduos expostos de-senvolverá câncer. A maior parte das substân-cias potencialmente carcinogênicas requeremativação metabólica no organismo antes de setornarem efetivamente cancerígenas. A susce-tibilidade individual ao câncer parece depen-der, em parte, da capacidade, determinada ge-neticamente, de metabolizar e eliminar essassubstâncias do organismo de forma eficiente.

Evidências apontadas em diferentes estudosindicam que inúmeros sistemas genéticos decontrole e modulação do metabolismo enzi-mático de xenobióticos parecem estar envol-vidos na gênese de diferentes tipos de câncer(d’Errico et al., 1999; Taningher et al., 1999). Ospolimorfismos metabólicos que têm sido asso-ciados de forma mais consistente ao aumentodo risco de câncer incluem o citocromo P450(Kato et al., 1994), a glutationa S-transferase ea N-acetil-transferase (Antilla et al., 1995; Hir-noven et al., 1993).

As reações catalisadas por essas enzimassão divididas basicamente em duas fases. Asenzimas da família do citocromo P450 (CYP)são classificadas como da fase I de metaboliza-ção e parecem estar diretamente relacionadasao processo de ativação de grande parte dosxenobióticos. Na fase II, ocorre a transforma-ção dos xenobióticos em produtos hidrossolú-veis e de fácil excreção, principalmente pelaação das enzimas glutationa-S-transferase(GST) e N-acetil-transferase (NAT) (Awasthi etal., 1994).

Diferenças na freqüência de determinadosalelos enzimáticos foram observadas entre po-pulações de origens étnicas diversas (Arruda etal., 1998; Lin et al., 1994; Stephens et al., 1994).Um exemplo é verificado na enzima CYP2D6.Enquanto a freqüência de indivíduos pobresmetabolizadores situa-se entre 5% e 7% em po-pulações caucasóides, nos chineses correspon-de somente a 1% da população (Wolf & Smith,1999). Diferenças semelhantes explicariam, emparte, a incidência maior ou menor de deter-minados tumores em diferentes grupos popu-lacionais.

O polimorfismo de um ou mais genes quecodificam para estas enzimas levam ao aumen-to da ativação de carcinógenos ou diminuem acapacidade de inativá-los (ou ambas situa-ções), e é provável que indivíduos portadoresdesses polimorfismos tenham risco aumenta-do de câncer quando expostos a cancerígenos.O gene CYP1A1 é de crítica importância para ometabolismo do benzopireno, um hidrocarbo-neto policíclico aromático. Polimorfismos des-te gene têm sido associados a cânceres de pul-mão, esôfago, cabeça e pescoço (Kawajiri, 1999).No Brasil, Sugimura et al. (1994), em estudo napopulação do Rio de Janeiro, não identificaramrelação entre polimorfismo do gene CYP1A1 ecarcinoma broncogênico. Em publicação pos-terior, os autores relataram um outro polimor-fismo do mesmo gene, conhecido como Ile-Val, devido à substituição da isoleucina por va-lina, o qual estaria associado a câncer de pul-mão (Hamada et al., 1995).



A redução na atividade das GST altera a de-toxificação dos HPA e tem sido associada aocâncer de pulmão (Seidegard et al., 1986). Es-tudo de meta-análise que combinou dados de12 estudos caso-controle, a deleção de GSTM1foi associada com aumento de 40% no risco decâncer de pulmão (McWilliams et al., 1995).Também foi observado o efeito modificador dasmutações GSTM1 e NAT2 na associação entreasbesto e mesotelioma (Hirnoven et al., 1995).

As enzimas NAT estão envolvidas nas rea-ções de ativação e inativação de numerosos xe-nobióticos. Nos humanos, os genes NAT1 eNAT2 são responsáveis pela atividade da N-ace-til-transferase. Alelos polimórficos dos NAT1 eNAT2 foram detectados e poderiam estar mo-dificando a suscetibilidade individual ao cân-cer (Hirnoven, 1999). O nível de atividade dasNAT2 determina as taxas de detoxificação ouativação das aminas aromáticas. Ensaios paratipagem de fenótipos ou genótipos têm sidousados para classificar indivíduos em acetila-dores rápidos ou lentos (Ambrosone et al.,1996). Um estudo genético examinou três poli-morfismos do NAT2 responsáveis por cerca de90% a 95% do fenótipo acetilador lento (comdois ou mais alelos mutantes) e indicou um au-mento do risco de câncer entre mulheres napós-menopausa, acetiladoras lentas e fuman-tes de vinte ou mais cigarros por dia, tanto en-tre as que tinham este padrão de consumo hádois ou há vinte anos. A análise por maços/anoindicou um risco aumentado de câncer de ma-ma, cerca de três vezes, entre mulheres na pós-menopausa, acetiladoras lentas e fumantes demais de 365 maços/ano de cigarros. Os autoresdo estudo observaram que, embora o risco decâncer de mama estivesse aumentado com ototal de anos de tabagismo, a intensidade pare-ceu ser mais importante do que a duração parao risco (Ambrosone et al., 1996). Esse potencialefeito dos polimorfismos NAT como modifica-dores de respostas individuais à exposição aagentes ambientais foi também mostrado poroutros dois estudos. O genótipo NAT2, acetila-dor lento, foi relacionado com o aumento dorisco de mesotelioma (Hirnoven et al., 1996), eo genótipo NAT1, com alta atividade, aumen-tou o risco de câncer de pulmão relacionado aotabaco (Bouchardy et al., 1998). Portanto, asevidências do efeito dos polimorfismos NATsão contraditórias e não permitem conclusõesdefinitivas sobre o seu papel na gênese do cân-cer (Hirnoven, 1999).

Os dados disponíveis em muitas situaçõeslevam a interpretações confusas. Um exemploé dado pela hipótese de uma relação entre ocontrole genético do metabolismo da debriso-

quina, um agente anti-hipertensivo, e o riscode câncer de pulmão. A enzima CYP2D6 meta-boliza esta e outras substâncias. Sua atividadeé determinada pela razão de metabolização:administração de debrisoquina e excreção de4-hidroxi-debrisoquina pela urina. Os indiví-duos são classificados em dois fenótipos bási-cos: grandes (extensive metabolizers) ou pobresmetabolizadores (Wolf & Smith, 1999). Os pri-meiros estudos do efeito da metabolização dadebrisoquina revelaram risco seis vezes maiorde câncer de pulmão entre os indivíduos clas-sificados como grandes metabolizadores, quan-do comparados a indivíduos pobres metaboli-zadores (Ayesh et al., 1984; Caporaso et al.,1990). Estudos subseqüentes sobre este tópicorevelaram riscos mais modestos (Amos et al.,1992; Wolf et al., 1992) ou ausência de evidên-cias do excesso de risco de câncer de pulmãorelacionado ao genótipo responsável pelo me-tabolismo da debrisoquina (Shaw et al., 1995).Esses resultados contraditórios dificultam acei-tar a participação do polimorfismo do geneCYP2D6 na causalidade do câncer de pulmão(Wolf & Smith, 1999).

As variações detectadas nos riscos obtidosem diferentes estudos de polimorfismos gené-ticos podem ser a expressão de fatores como aprevalência do polimorfismo investigado, va-riações na acurácia dos métodos laboratoriaisempregados e tamanho da população em estu-do. Está bem estabelecido que vieses podemser causados pelas variações da sensibilidade eespecificidade do teste de acordo com a preva-lência do fator de risco estudado, interferindono cálculo do risco (Rothman et al., 1993). Emsíntese, as evidências epidemiológicas dos efei-tos dos polimorfismos de suscetibilidade po-dem, no atual estágio das pesquisas, ser aceitasapenas como sugestivas mas não como deter-minantes no processo de carcinogênese.

Biomarcadores de efeito

Na maioria dos cânceres, têm sido identifica-das mutações em seqüências de DNA em locicromossômicos específicos (Blot & Fraumeni,1996). As classes de lesões do DNA incluem ba-sicamente as perdas ou deleções, substituiçãode pares de bases, inserções, amplificações,duplicações, inversões e translocações (Green-blatt et al., 1994). Não está claro se tais altera-ções são causa ou conseqüência de câncer. Defato, a história natural da doença parece envol-ver não uma, mas várias mutações genéticas.

O gene p53 está localizado no braço curtodo cromossomo 17 e codifica para uma proteí-na nuclear de 53.000 daltons, razão da designa-



ção p53, com importante função reguladora dociclo celular. As mutações no p53 são eventosgenéticos freqüentemente observados em vá-rios tipos de câncer em humanos e relaciona-dos com o agente ambiental envolvido (Green-blatt et al., 1994). O processo de gênese tumo-ral está intimamente associado à reproduçãocelular, ou seja, aos mecanismos que regem ociclo celular. Para que a cada ciclo duas célu-las-filhas idênticas sejam geradas, é necessárioque ocorra duplicação e subseqüente segrega-ção dos cromossomos e demais componentesda célula. Cromossomos são replicados numafase conhecida como S (síntese) e segregadospara as células-filhas na fase M (mitose) do ci-clo celular. Esse processo ocorre de forma con-tínua, passando de G1-S-G2-M, sendo G1 e G2(gap 1 e 2) fases que antecedem os períodos desíntese e divisão celular. O controle do ciclo ce-lular é feito basicamente por intermédio deproteínas que atuam nas fases G1 e G2, acio-nando mecanismos de reparo ou interrompen-do o processo de divisão celular quando detec-tam mutações no material genético. Grandeparte dos genes supressores tumorais sintetizaproteínas com funções de regulação do ciclocelular, as quais, quando ausentes ou inefi-cientes, podem contribuir para a evolução declones de células tumorais. O p53 é uma dasproteínas que controla o ciclo celular, durantea fase G1, retardando o processo de divisão pa-ra que ocorra o reparo ou mesmo impedindo adivisão celular através de apoptose (morte ce-lular). Por outro lado, mutações no gene p53induzem à formação de proteínas alteradasque não conseguem interromper o processo dedivisão celular e, sem tempo suficiente paraque ocorra o reparo do DNA, a célula carrega odano para as divisões subseqüentes possibili-tando a formação dos tumores (Harris, 1993).

A análise do espectro de mutações no p53em determinada exposição ambiental pode serútil para identificar fatores envolvidos na etio-patogênese do câncer. Mutações do p53 nocâncer de pulmão foram relacionadas com ex-posições ocupacionais nas indústrias petroquí-mica e metalúrgica e na exposição ao níquel(Harty et al., 1996). A prevalência de mutaçõesdo gene p53 nos tecidos neoplásicos varia deacordo com o sítio anatômico do tumor, de 0%,em tumores de testículos e da hipófise, a maisde 50%, nos tumores de pulmão e cólon (Green-blatt et al., 1994).

Além de mutações no p53, presente em cer-ca de 20% dos tumores de mama, alteraçõesem outros dois genes supressores de tumor,BRCA1 e BRCA2, têm sido identificadas e con-ferem aumento da suscetibilidade à doença nas

mulheres de famílias portadoras, de acordocom um padrão mendeliano de hereditarieda-de (Moll et al., 1992). Mulheres portadoras demutação herdada BRCA1 têm a suscetibilidadeaumentada para o câncer de mama, e mais de70% deverão desenvolver a doença até os se-tenta anos de idade. A presença de mutaçõesno p53 também é indicativo de pior prognósti-co da doença (Perera, 1996).

Com relação ao proto-oncogene ras, a fre-qüência de mutações em diferentes tumores éda ordem de 20% a 35%. A concepção atual éque as mutações do ras e do p53 são eventoscomuns no câncer que nem sempre ocorremindependentemente (Greenblatt et al., 1994).Os pacientes portadores de câncer de pulmãocom mutações ras têm sobrevida menor doque aqueles com ausência da mutação (Rode-nhuis & Slebos, 1990; Westra et al., 1993).

No atual estágio de conhecimento dos me-canismos celulares do câncer de pulmão, cân-cer dos mais estudados na sua dinâmica mole-cular, sugere-se que as mutações ras estariammais ligadas ao adenocarcinoma, tipo histoló-gico com vínculo menos intenso com o tabaco.Já os polimorfismos CYP e GST parecem termaior prevalência em tumores epidermóides,tipo histológico mais relacionado ao tabagis-mo (Caporaso & Landi, 1994; Slebos et al.,1991). Entretanto, separações rígidas são pou-co produtivas, pois alguns estudos têm mostra-do que mutações ras também parecem ser di-retamente causadas pela exposição aos carci-nógenos presentes no tabaco (Rodenhuis &Slebos, 1992), e já foram identificadas relaçõesentre tabagismo, polimorfismos CYP1A1 e ade-nocarcinoma do pulmão (Nakachi et al., 1995).

Aspectos éticos na epidemiologia genética e molecular

Inúmeras questões éticas emergem nesse con-texto de desenvolvimento da biologia molecu-lar. Algumas dizem respeito à pesquisa epide-miológica per se e aos indivíduos envolvidos.Outras são mais amplas, pois repercutem naprópria vida das pessoas (Hossne, 1998). Emrelação ao primeiro grupo de questões, deve-seconsiderar que até o advento dos progressosrecentes da biologia molecular, a pesquisa epi-demiológica avaliava as exposições ambien-tais, restringindo-se, na prática, à aplicação dequestionários e, em algumas poucas situações,à execução de avaliações ambientais. Com ocrescente uso das técnicas moleculares nos es-tudos epidemiológicos, o que se busca agora étambém obter mensurações de exposição no



meio interno dos indivíduos – doses internas –ou marcadores de suscetibilidade individual(Hunter & Caporaso, 1997).

Uma vez definidos, tais biomarcadores po-deriam ser utilizados, por exemplo, para a sele-ção de indivíduos no mercado de trabalho. Hi-poteticamente, a disponibilidade dessa tecno-logia poderia submeter os trabalhadores du-rante o processo de seleção a avaliações quan-to à sua condição de portadores de determina-dos polimorfismos genéticos. Os resultadosdestes exames indicariam os mais aptos e me-nos propensos a desenvolver a doença quandoexpostos a cancerígenos específicos presentesno ambiente de trabalho. Obviamente, nessasituação, haveria um contingente de margina-lizados do mercado de trabalho por sua incom-petência genética herdada (Rothenberg et al.,1997; Soskolne, 1997).

O impacto social futuro desses novos co-nhecimentos é difícil de ser dimensionado, masa sociedade deve buscar tanto desenvolver me-canismos de controle, quanto fomentar discus-sões sobre os aspectos éticos da utilização des-sas novas técnicas e conhecimentos científicos.Um processo de consulta pública conduzidapelos institutos nacionais de saúde dos Esta-dos Unidos concluiu que os representantes dapopulação no parlamento têm poucas dificul-dades para absorver os aspectos essenciais daciência para a discussão de questões éticas empesquisas com seres humanos (Anonymous,2000). Nos países em desenvolvimento, essecenário talvez seja um pouco diferente, mas abusca para tornar a população cientificamentemais educada deve fazer parte dos objetivos daconstrução de uma sociedade democrática.

Conclusões

A aplicação dos biomarcadores na epidemiolo-gia deverá se acentuar nos próximos anos, em-bora inúmeras questões estejam ainda semresposta, incluindo: problemas de mensuraçãode exposições mais remotas; dificuldades desaber o que o biomarcador está avaliando; pro-babilidade de ocorrência de confundimento emalgumas situações; desconhecimento da rela-ção entre processo da doença e o nível de bio-marcadores; problemas de validade das men-surações laboratoriais; falta de clareza sobre aaplicação dos biomarcadores para as políticasde saúde pública (Pearce & Boffetta, 1997).

O viés de confundimento é uma preocupa-ção em todos os estudos epidemiológicos, in-cluindo aqueles que se utilizam de biomarca-dores. Os biomarcadores de exposição podem

ser importantes para o exame de potenciaisvieses de confundimento. O erro de classifica-ção de uma variável confundidora, entretanto,impede o controle de confundimento. Assim,em um estudo caso-controle com informaçõessobre exposição obtidas por questionários, osbiomarcadores poderiam ser usados para vali-dar as informações conseguidas em um sub-grupo de participantes (casos e não-casos). Poroutro lado, o uso de biomarcadores de exposi-ção não reduz a necessidade de controle para aconfusão de variáveis e, eventualmente, po-dem introduzir confundimento no estudo. Porexemplo, os trabalhadores em um estudo epi-demiológico ocupacional podem ser classifica-dos de acordo com os níveis de adutos HPA-DNA, mas isto irá indicar a exposição total deHPA de todas as fontes, inclusive tabagismo.Portanto, os efeitos dose-resposta poderão es-tar confundidos pelo consumo de cigarros, e ogrupo classificado como com alta exposiçãoaos HPA pode apresentar um maior risco decâncer de pulmão, mas não como decorrênciada exposição aos HPA, mas sim por causa deoutros carcinógenos presentes no tabaco (Pear-ce & Boffetta, 1997).

Os biomarcadores de suscetibilidade per-mitem a oportunidade de identificar intera-ções entre fatores genéticos e ambientais (Hir-noven et al., 1993; Jourenkova-Miranova et al.,1998). Além disso, definidos na cadeia causal,estes biomarcadores podem identificar nas po-pulações os subgrupos com maiores riscos dedesenvolver a doença, permitindo interven-ções mais eficazes e mecanismos de avaliaçãomais adequados (McMichael, 1994).

Algumas mutações, como os genes BRCA1 eBRCA2, têm importância limitada sobre o riscoatribuível de câncer (significância preditiva)decorrente da baixa prevalência na população.Também os polimorfismos genéticos apresen-tam, em geral, prevalência restrita na popula-ção. A pequena fração atribuível de câncer de-corrente destas alterações moleculares podelevar a conclusões com vieses. Diferenças nafreqüência de polimorfismos têm sido detecta-das entre diferentes grupos étnicos e popula-ções, provavelmente como decorrência de ex-posições a carcinógenos específicos ou de ca-racterísticas genéticas herdadas (Greenblatt etal., 1994). A melhor compreensão da associa-ção entre câncer, exposições ambientais e bio-marcadores de suscetibilidade em determina-da região geográfica depende do conhecimen-to da distribuição na população de genes me-tabolizadores de xenobióticos (Conforti-Froeset al., 1998). Na cidade de São Paulo, os poli-morfismos gênicos CYP2E1 e GSTM1 foram es-



tudados em diferentes grupos populacionais eos resultados mostraram menor freqüência dedeleção do gene GSTM1 em mulatos, quandocomparados aos demais grupos (Gattás & Soa-res-Vieira, 2000).

As epidemiologias molecular e genéticanão se emanciparão do modelo clássico da epi-demiologia, pois a obtenção de conclusões vá-lidas exige seguir princípios bem estabelecidosque regem a investigação epidemiológica: sele-ção apropriada de casos e não-casos, controlede variáveis de confundimento e adequado ta-manho de amostras para detectar diferenças

importantes (Greenblatt et al., 1994; Vineis etal., 1999). Para que a história natural do câncere de outras doenças seja melhor compreendidaserá necessária a aproximação de epidemiolo-gistas e biólogos moleculares, procurandocompatibilizar linguagens e métodos de pes-quisa que são distintos. Nos países com lide-rança em pesquisa científica, essa aproxima-ção já é realidade, e grupos híbridos trabalhamativamente em diversos projetos. No Brasil, asiniciativas de aproximação são ainda tímidas,mas seguir essa trajetória plena de dúvidas edesafios será inevitável.

Agradecimentos

Este trabalho foi conduzido dentro do conjunto desuporte financeiro proporcionado pela Comissão Eu-ropéia (RC/98/013077), Fundação de Amparo à Pes-quisa do Estado de São Paulo (Processo 97/7522-8) eUniversidade de São Paulo (Processos 97.1.24410.1.0e 99.1.17693.1.2) – VWF e Laboratório de InvestigaçãoMédica, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medici-na, Universidade de São Paulo – GJFG.

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Documents

Biomarcadores moleculares em câncer- implicações para a pesquisa epidemiológica e a saúde pública-2001