Bioquímica estrutural para bioinorgânicos Prof. Fernando R. Xavier

UDESC 2018

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Em linhas gerais, a bioquímica pode ser descrita como um campo da ciência e

tecnologia que estuda e aplica a química da vida e os processos químicos que

ocorrem nos organismos vivos.

Ela pode ser dividida no estudo das proteínas (proteômica), enzimas (enzimologia) e da

biologia celular como um todo (carboidratos, lipídios e ácidos nucleicos).

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Moléculas importantes ao nosso estudo (bioinorgânica):

• Aminoácidos;

• Peptídeos;

• Proteínas;

• Enzimas. Tirosina (tyr, Y)

Leu-ser-ala (LSA)

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Moléculas importantes ao nosso estudo (bioinorgânica):

• Nucleotídeos;

• Ácidos nucleicos (DNA e RNA);

• Ribozimas;

• Coenzimas (NAD, FAD, etc...)

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Aminoácidos (AA): São as unidades básicas construtoras das proteínas e enzimas.

Possuem obrigatoriamente as funções químicas amina e ácido carboxílico

• R é conhecido como cadeia lateral e é específica para cada tipo de AA.

• Os seres vivos utilizam/produzem α-AA, ou seja, ambos os grupos funcionais estão

ligados no mesmo carbono (α à carbonila).

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Aminoácidos podem ser compostos quirais pois podem possuir carbono assimétrico.

• Somente L-AA (R) são constituintes das

proteínas. Há indícios que tal fato ocorra

devido a L-AA serem levemente mais

solúveis que D-AA (questão evolutiva).

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Uma vez que AA possuem grupamentos ácidos e básicos, estas moléculas são

consideradas anfóteras podendo então formar zwitteríons.

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São 20 (vinte) os aminoácidos encontrados nos seres vivos. Estes podem ser

classificados preliminarmente em essenciais e não-essenciais.

• AA essenciais são aqueles que os seres vivos

necessitam para construir proteínas porém não

são sintetizados por estes organismos.

Devem ser obtidos de fontes externas

(alimentação).

• Leucina

• Isoleucina

• Lisina

• Arginina

• Metionina

• Triptofano

• Valina

• Treonina

• Fenilalanina

• Histidina

• AA não-essenciais por outro lado, são aqueles

que os seres vivos produzem internamente

através de sua própria biossíntese.

• Glutamina

• Glicina

• Aspartato

• Serina

• Tirosina

• Alanina

• Asparagina

• Prolina

• Cisteína

• Glutamato

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Aminoácidos hidrofóbicos

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Aminoácidos polares

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Aminoácidos ácidos (carregados negativamente)

Aminoácidos básicos (carregados positivamente)

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Polimerização de aminoácidos: A formação de peptídeos

A consequente condensação de múltiplos AA poderá originar, di-, tri-, oligo- ou

polipeptídios.

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Por convenção, cadeias peptídicas são “lidas” do ponto “N-terminal” para o “C-terminal”. A

maioria dos polipeptídios naturais possui entre 50 e 2000 resíduos de AA.

• A maior proteína conhecida (tintin)

consiste de 27 mil resíduos de AA.

• A maioria das proteínas possui MM entre

5,500 e 220,000 Da.

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O esqueleto de cadeias polipeptídicas é flexível porém conformacionalmente restrito.

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Proteínas

De um ponto de vista químico, as proteínas são biopolímeros, ou seja, longas cadeias

moleculares de resíduos de AA conectados através de ligações peptídicas.

Estrutura primária: Consiste no primeiro nível de organização estrutural. É determinada

literalmente pela sequência linear dos resíduos de AA empregados em sua síntese.

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Estrutura secundária: Consiste em estruturas tridimensionais com certos padrões de

repetição mediadas geralmente por ligações de hidrogênio. Descobertas por Pauling e

Corey no início dos anos 1950.

Alfa-hélices

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Alfa-hélices (condições de ocorrência e tendências)

• Todos os aminoácidos precisam ter o mesmo tipo de

isomeria óptica (L ou D)

• A cadeia lateral pode interferir na capacidade do

aminoácido em formar hélices: O volume e a forma de

Asp, Ser, Thr e Cys podem desestabilizá-la se

estiverem muito próximos entre si; Pro e Gly

dificultam a formação de hélices;

• Relações com o vizinho também são importantes;

• Componentes amino e carbonil formam dipolo

elétrico

• Pro e Gly impedem a formação

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Beta-folhas pregueadas

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Retornos e voltas (“turns” e “loops”)

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Especialidades: Proteínas fibrosas

α-queratina: Principal componente da lã, cabelo e pele. Estas estruturas podem atingir

comprimento de 1000Å (100 nm ou 0,1 μm). Também podem atuar como uma espécie de

“esqueleto celular”.

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Especialidades: Colágeno

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Estrutura terciária: Depende da distribuição tridimensional do conjunto de alfa-hélices,

folhas-beta, turns e loops presentes em um proteína. Este macro arranjo é mantido por

diversas forças (ligações covalentes, forças eletrostáticas, ligações de coordenação a

íons metálicos, ligações de hidrogênio e forças de Van der Waals).

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A estrutura terciária de uma proteína pode ser determinada via estudos de difração de

raios-x em monocristal (DRX) ou via ressonância magnética nuclear (RMN).

Apesar da mioglobina possuir muitos

resíduos de AA hidrofóbicos todos estes

estão voltados para o interior da

estrutura proteica. Já os AA polares

estão voltados para seu exterior

fazendo com a proteína seja solúvel em

meio aquoso (biológico).

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Estrutura supersecundária: São arranjos específicos que desempenham algum papel

funcional além de estrutural em proteínas.

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Domínios: São regiões de polipeptídios que foram proteínas se organizam em regiões

compactas que estão conectadas umas as outras por trechos flexíveis de resíduos de AA.

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Estrutura quaternária: Muitas proteínas são compostas de duas ou mais cadeias

polipeptídicas, ou subunidades, cuja associação através de ligações não-covalentes

levam a um arranjo espacial chamado de estrutura quaternária.

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Proteínas com estrutura quaternária podem ser formadas por homo e heterodímeros,

trímeros, tetrâmeros, oligômeros ou ainda multímetros

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Enzimas

Proteínas que possuem arranjo tridimensional (estrutura terciária) podem atuar como

enzimas. Enzimas são, portanto, biomoléculas que atuam como catalisadores de

reações bioquímicas nos sistemas vivos (catalisadores biológicos). São características

típicas destas moléculas:

• Promover reações com altas velocidades;

• Atuar em condições brandas de temperatura e pH;

• Possuir alta especificidade por substratos;

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O local exato onde ocorre a catálise dentro de um enzima é chamado de sítio ativo.

Enzimas podem dispor de mais de um destes em sua estrutura:

ufPAP kbPAP

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Dados cinéticos de algumas enzimas

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Catalisadores poderosos e altamente específicos

A anidrase carbônica pode hidratar até 106

moléculas de CO2 por segundo.

Enzimas proteolíticas ou proteases são

extremamente específicas atuando na clivagem

de ligações peptídicas. Ex.: Tripsina e trombina.

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Classificação quanto a ocorrência

Enzimas intracelulares

• Atuam no interior da célula;

• Catalisam reações de síntese de material celular;

• Catalisam reações catabólicas (quebra de substâncias complexas e

moléculas mais simples);

Enzimas extracelulares

• Atuam fora da célula;

• Executam operações necessárias à penetração de nutrientes para o

interior das células;

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Outras classificações

Enzimas habituais ou constitutivas

• As células expressam (mantêm sua produção) permanentemente ao

longo do tempo;

Enzimas indutivas

• As células expressam sua produção somente quando estão na

presença do substrato;

Isoenzimas

• São enzimas que possuem uma mesma função, ou seja, catalisam

uma mesma reação, porém apresentam estruturas diferentes;

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Por que a catalise enzimática é tão eficiente?

1. Aumento da concentração dos reagentes na superfície da enzima: (“atração”

dos reagentes para interação com a enzima).

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2. Orientação correta dos reagentes (substratos): parte da energia de ativação

representa o posicionamento adequado dos reagentes para que haja contato entre os

átomos corretos. O sítio ativo da enzima favorece o posicionamento correto dos

reagentes.

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3. Aumento da reatividade dos reagentes: as cadeias laterais (R) dos aminoácidos

da enzima ou co-fatores e coenzimas podem interagir diretamente com os substratos,

dando-lhes carga elétrica ou polarizando-os, tornando-os quimicamente mais reativos,

ou ainda cedendo ou transferindo certas funções químicas.

rápido rápido muito rápido!

Sem catálise Catálise ácida Catálise básica Catálise ácido-básica

lento

Cadeias laterais de aminoácidos no sítio ativo de uma enzima hidrolítica

A hidrólise não enzimática de uma ligação peptídica é lenta e requer condições drásticas de pH e temperatura

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4. Indução de deformação física no substrato, por contato com as cadeias laterais

(R) dos aminoácidos das enzimas, que desestabilizam a molécula do substrato e

facilitam o rompimento de ligações covalentes.

J. Mol. Biol. (1996) 259, 737–748

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Algumas proteínas, enzimas em especial, contêm em sua molécula uma porção não

proteica, que é essencial para atividade biológica.

Enzima

holozima

Apoenzima

parte proteica

Grupo

prostético

ativa

Grupo

Prostético inativa

metal

coenzima

cofator

ZnII-CA – Active site

Metaloproteínas (ex. hemoglobina)

Metaloenzimas (ex. catalase)

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Fatores que afetam a atividade enzimática:

1. Condições do meio que afetam estabilidade proteica:

• pH

• Temperatura

Alguns desses fatores são decorrentes da natureza proteica das enzimas, como o efeito

do pH e da temperatura. Para se estudar o efeito isolado de um dos fatores acima, é

necessário que todos os outros fatores sejam mantidos fixos.

2. Concentração dos reagentes:

• Da enzima

• Do substrato

• Do co-fator(es)

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Fatores que afetam a atividade enzimática:

A enzima está pelo menos parcialmente desnaturada em pHs afastados do pH ótimo.

Quando o substrato é uma molécula ionizável, o pH ótimo da enzima também reflete o

seu estado de ionização.

O pH ótimo - reflete variações no estado de ionização de resíduos de aminoácidos do

sítio ativo.

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A estabilidade de uma enzima em relação ao pH depende ainda:

- temperatura;

- força iônica;

- natureza química do tampão;

- concentração de íons metálicos contaminantes;

- concentração de substratos ou cofatores da enzima;

- concentração da enzima.

ENZIMA pH ÓTIMO

Pepsina 1,5

Tripsina 7,7

Catalase 7,6

Arginase 9,7

Fumarase 7,8

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Fatores que afetam a atividade enzimática:

A temperatura pode afetar severamente o desempenho funcional das enzimas, havendo

neste caso também uma faixa ótima de trabalho.

Com o aumento da temperatura dois efeitos podem ocorrer:

• A taxa de reação aumenta;

• a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.

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As proteínas desnaturadas podem voltar

aos estados nativos através de

renaturação, quando o estímulo é retirado.

Renaturação de proteínas

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Lei de Arrhenius e a energia de ativação (Ea)

ATRT

Eak

Aek RTEa

ln1

ln

/

• Ea pode ser determinada medindo-se a

constante de velocidade da reação em ≠

temperaturas.

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Fatores que controlam a atividade enzimática:

Concentração:

• da enzima

• do substrato

• de cofatore(s)

A enzima existe sob duas formas: enzima

livre E e complexo enzima-substrato ES.

No início da reação, a [E] livre cai e a do

complexo [ES] aumenta e atinge um

máximo, em que não há mais [E] livre no

meio. Nessa situação (indicada no

retângulo cinza), diz-se que a enzima está

saturada (só existe no complexo ES). A

velocidade da reação é a máxima.

tempo

co

ncen

traçã

o

O gráfico abaixo ilustra como as

concentrações de E, S e P variam ao

longo do tempo da reação.

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Considerações sobre a influência da concentração da enzima

• Velocidade de transformação do S em P quantidade de E.

Desvios da linearidade ocorrem:

- Presença de inibidores na solução de enzima;

- Presença de substâncias tóxicas;

- Presença de um ativador que dissocia a enzima;

- Limitações impostas pelo método de análise.

• Recomenda-se:

- Enzimas com alto grau de pureza;

- Substratos puros;

- Métodos de análise confiável.

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Catálise enzimática – Aspectos Cinéticos

Objetivos principais:

• Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores;

• Conhecer as condições ótimas da catálise;

• Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;

• Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota

metabólica.

Pioneiro: Victor Henri (1903): E + S ES

Em 1912 – Cinética Enzimática

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Equação de Michaelis-Menten

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Enzimas – ordem da reação

Quando a formação de P for proporcional à

[S] a velocidade da reação é de 1a ORDEM

V

[S]

𝑆 ↓ ∴ 𝑆 ≪ 𝐾𝑀

𝑣 =𝑣𝑚á𝑥[𝑆]

𝐾𝑀 ou 𝑣 = 𝑘[𝑆]

Quando a velocidade da reação

independe da [S] a reação é de

ORDEM ZERO

𝑆 ↑ ∴ 𝑆 ≫ 𝐾𝑀

𝑣 = 𝑣𝑚á𝑥

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O método de Lineweaver-Burk

Consiste em simplesmente efetuar uma linearização da equação de Michaelis-Menten.

Foi muito utilizado no período pré-computacional pois é de fácil tratamento matemático.

Também é chamado de duplo-recíproco.

Eq. de Michaelis-Menten

Eq. Lineweaver-Burk

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Números de “turnover” ou ciclagem catalítica

O valor de velocidade máxima (vmáx) revela o número de turnovers, ou seja, o número

de moléculas de substrato convertido em produtos por uma unidade de enzima.

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Comportamento não-michaeliano: O efeito alostérico

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Inibição enzimática

É qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.

Inibidores

Reversíveis Irreversíveis

Competitivos

Incompetitivos

Não-Competitivos

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Inibição competitiva

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Inibição competitiva

O composto methotrexato se liga ao

sítio ativo da dihidrofolato redutase

com cerca de 1000x mais potência que

seu substrato nativo: O dihidrofolato.

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Inibição incompetitiva

Na inibição incompetitiva, o inibidor

liga-se apenas no complexo enzima-

substrato. Este processo não pode ser

sobrepujado pela adição de mais

substrato.

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Inibição incompetitiva

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Inibição não-competitiva

• Diferentemente da inibição

incompetitiva, a inibição não-

competitiva, o inibidor liga-se tanto na

enzima livre quanto no complexo

enzima-substrato.

• Este processo aumenta a

concentração de enzima não funcional

no meio.

• Este processo também não pode ser

sobrepujado pela adição de mais

substrato.

• Queda no número de turnovers

realizados.

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Inibição não-competitiva

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Inibição irreversível

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Inibição irreversível

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Inibição irreversível

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Inibição irreversível – Inibidores suicidas

O grupo prostético

flavina está presente

na enzima monoamino

oxidase (MAO).